JP6560527B2

JP6560527B2 - 抗菌作用および植物生長促進作用に優れた新規微生物

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Publication number: JP6560527B2
Application number: JP2015089809A
Authority: JP
Inventors: 佐々木　進; 進佐々木; 山口　司; 司山口
Original assignee: 武井勤
Priority date: 2015-04-24
Filing date: 2015-04-24
Publication date: 2019-08-14
Anticipated expiration: 2035-04-24
Also published as: JP2016202107A

Description

本発明は、抗菌作用および植物生長促進作用に優れた新規微生物に関し、詳細には、トリコデルマアトロビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）に属する新規微生物ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅＳ・Ｒ−０６株ならびにその培養物および／または菌体を有効成分とする微生物農薬および植物生長促進剤に関する。

トリコデルマ属の微生物は、土壌中に広く見出される糸状菌であり、他の菌類等の生育を妨げる性質や植物の生長を促進する性質を有することから、主として農業の分野で用いられる微生物製剤として利用されている。

従来、トリコデルマ属の微生物を利用した製剤としては、例えば、トリコデルマハルジアナムＳＫ−５５を有効成分とする植物病害防除剤（特許文献１）や、トリコデルマ・ヴィリデＴ−３菌株、トリコデルマ・ヴィレンスＴ０４３９８菌株、トリコデルマ・ヴィレンスＴ０４４０１菌株、トリコデルマ・ヴィレンスＴ０４４６４菌株またはそれらの変異株を有効成分とする、ダイズにおける茎疫病の防除剤（特許文献２）、トリコデルマ・アトロビリデＳＫＴ−１菌株、トリコデルマ・アトロビリデＳＫＴ−２菌株、トリコデルマ・アトロビリデＳＫＴ−３菌株から選ばれる少なくともひとつを有効成分とする植物種子発芽率向上剤（特許文献３）が開示されている。

特許第３０４６１６７号公報特許第５０５２８７３号公報特開２００６−１２４２８０号公報

しかしながら、これらの微生物製剤の効果は未だ十分なものでは無く、より抗菌作用や植物生長促進作用に優れたトリコデルマ属微生物が求められていた。そこで、本発明は、抗菌作用や植物生長促進作用に優れたトリコデルマ属の微生物ならびにその培養物および／または菌体を有効成分とする微生物農薬および植物生長促進剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意研究の結果、北海道日高支庁静内町の土壌から単離した菌株が、トリコデルマアトロビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）に属する新規微生物であり、トリコデルマ属微生物の基準株などと比較して、菌糸伸長速度が顕著に速く、広範な種類の病原体に対して高い生育抑制効果を奏すること、および植物の生長を顕著に促進することを見出し、下記の各発明を完成した。

（１）本発明に係る新規微生物は、ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅＳ・Ｒ−０６株（受託番号：ＮＩＴＥＰ−０２０２９）である。

（２）本発明に係る微生物農薬は、ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅＳ・Ｒ−０６株（受託番号：ＮＩＴＥＰ−０２０２９）の培養物および／または菌体を有効成分とする。

（３）本発明に係る植物生長促進剤は、ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅＳ・Ｒ−０６株（受託番号：ＮＩＴＥＰ−０２０２９）の培養物および／または菌体を有効成分とする。

ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅＳ・Ｒ−０６株によれば、広範な種類の病原体に対して効果的にその生育を抑制することができる。したがって、ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅＳ・Ｒ−０６株は、植物病害を防除するための微生物農薬の有効成分とすることができるほか、人畜の病気を予防ないし治療するための医薬の製造に利用することができる。

また、ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅＳ・Ｒ−０６株によれば、植物の生長を顕著に促進することができる。したがって、ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅＳ・Ｒ−０６株は、植物生長促進剤の有効成分として利用することができる。

さらに、トリコデルマ属の微生物は土壌中に普通に見出される菌であることから、ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅＳ・Ｒ−０６株によれば、環境負荷が小さく、安全性が高い、微生物農薬や植物生長促進剤などの微生物製剤を製造することができる。

アポロンＤＢ−ＦＵ（ＩＴＳ）データベースＶｅｒ７．０におけるＢＬＡＳＴ検索の結果、ＳＩＩＤ１３８１９株のＩＴＳ領域の塩基配列と相同率が高かった上位３０を示す表である。国際塩基配列データベースにおけるＢＬＡＳＴ検索の結果、ＳＩＩＤ１３８１９株のＩＴＳ領域の塩基配列と相同率が高かった上位３０を示す表である。ＳＩＩＤ１３８１９株のＩＴＳ領域の塩基配列、および、図１において※で示した株のＩＴＳ領域の塩基配列を用いて作成した分子系統樹を示す図である。ＳＩＩＤ１３８１９株のコロニーを示す写真である。ＳＩＩＤ１３８１９株の栄養菌糸を示す写真である。ＳＩＩＤ１３８１９株の分生子柄を示す写真である。ＳＩＩＤ１３８１９株の分生子柄を示す写真である。ＳＩＩＤ１３８１９株の分生子柄を示す写真である。ＳＩＩＤ１３８１９株の分生子形成細胞を示す写真である。ＳＩＩＤ１３８１９株の分生子形成細胞を示す写真である。ＳＩＩＤ１３８１９株の分生子を示す写真である。ＳＩＩＤ１３８１９株の厚膜胞子を示す写真である。１５℃、２０℃、２５℃、３０℃および３５℃の各温度条件下で培養したＳＩＩＤ１３８１９株のコロニーを示す写真、ならびに、コロニー径および色素産生の有無を示す表である。種々の病原体と拮抗菌（Ｓ・Ｒ−０６株および１０１７７６株）との対峙培養を行い、病原体に対する生育抑制効果を評価した結果を示す写真である。種々の病原体と拮抗菌（Ｓ・Ｒ−０６株および１０１７７６株）との対峙培養を行い、病原体に対する生育抑制効果を評価した結果を示す写真である。

以下、ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅＳ・Ｒ−０６株ならびに本発明に係る微生物農薬および植物生長促進剤について詳細に説明する。ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅＳ・Ｒ−０６株（以下、単に「Ｓ・Ｒ−０６株」という場合がある。）は、後述の実施例１に示すように、平成２７年３月２７日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥＰ−０２０２９として寄託したため、この機関より入手することができる。

Ｓ・Ｒ−０６株は、寒天培地において２０〜３０℃で数日間、静置培養することにより、培養ないし増殖させることができる。寒天培地としては、例えば、ＰｏｔｅｔｏＳｕｃｒｏｓｅＡｇａｒ（ＰＳＡ培地）、ＣｏｒｎｍｅａｌＤｅｘｔｒｏｓｅＡｇａｒ（ＣＭＤ培地；Ｓａｍｕｅｌｓｅｔ．ａｌ．、１９９８年）、ポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ培地；「ダイゴ」日本製薬社）、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｓｃｈｅｒｎａｈｒｓｔｏｆｆａｒｍｅｒａｇａｒ（ＳＮＡ培地；Ｎｉｒｅｎｂｅｒｇ、１９７６年）などを用いることができる。

ここで、ＰＳＡ培地は次の手順で作成することができる。まず、ジャガイモを水道水で洗浄した後、皮をむいて１ｃｍ角に切り、水道水で素早く洗浄する。続いて、ジャガイモ（皮をむいて切った１ｃｍ角に切ったもの）２００ｇ当たり１Ｌの蒸留水で２０分間ゆでる。これを潰した後、綿布の袋（ｍｕｓｌｉｎｂａｇ）に入れて絞り、液体分を回収する。ここにスクロース２０ｇを加えて溶解する。ｐＨを５．６に調整した後、寒天２０ｇを加えて、最終容量が１Ｌとなるよう蒸留水を加える。これを、オートクレーブ（高圧蒸気滅菌器）に供して１２１℃で１５分間滅菌する。

また、Ｓ・Ｒ−０６株は、液体培地において２０〜３０℃で数日間、振盪培養することにより、培養ないし増殖させることもできる。液体培地としては、例えば、ポテト−デキストロース液体培地（ＤＩＦＣＯ社）や、麦芽エキス培地（麦芽エキス２０ｇ、ペプトン１ｇ、ブドウ糖２０ｇ、蒸留水１０００ｍｌ）やブドウ糖ブイヨン培地（肉エキス１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、ペプトン１０ｇ、ブドウ糖１０ｇ、蒸留水１０００ｍｌ）などを用いることができる。

Ｓ・Ｒ−０６株は、後述の実施例に示すように抗菌作用および植物生長促進作用に優れることから、その培養物や菌体を、微生物農薬や植物生長促進剤などの、主として農業の分野で用いられる微生物製剤の有効成分として利用することができる。すなわち、本発明に係る微生物農薬および植物生長促進剤は、Ｓ・Ｒ−０６株の培養物および／または菌体を有効成分とする。

本発明に係る微生物製剤（微生物農薬、植物生長促進剤）の製造の手順は特に限定されないが、例えば、下記の手順により製造することができる。まず、ふすまに等量の水を加えて１２０℃加熱殺菌を行ってふすま培地を作成する。これを常温まで冷却した後、上述の方法で培養ないし増殖させたＳ・Ｒ−０６株を種菌として加える。続いて、Ｓ・Ｒ−０６株を加えたふすま培地を、５ｃｍ以下の深さとなるようトレーに平坦に入れ、２５℃にて７日間培養する。その後、４０℃以下の除湿空気で水分が８％以下となるまで乾燥を行う。続いて、８０メッシュパスの粒度まで粉砕して、得られた粉末を微生物製剤（微生物農薬、植物生長促進剤）とする。この手順で製造した粉末状の微生物製剤１ｇ中には、通常、１×１０^８〜１×１０^１１個の分生子が含まれる。

本発明に係る微生物製剤（微生物農薬、植物生長促進剤）の製造の手順として、他には、Ｓ・Ｒ−０６株を上述の寒天培地にて培養し、形成した分生子を滅菌した蒸留水に懸濁して、これを液体状の微生物製剤（微生物農薬、植物生長促進剤）としてもよい。

次に、本発明に係る微生物製剤（微生物農薬、植物生長促進剤）の施用手順もまた、特に限定されないが、例えば、下記の手順により施用することができる。すなわち、粉末状の微生物製剤であれば所要量を水に懸濁して、液体状の微生物製剤であればそのまま、対象となる植物を生育させるための土壌に散布する。ここで、本発明に係る微生物製剤の所要量は少量である場合が多く、均一に散布することが困難であるため、必要に応じて、水や土、肥料、土壌改良材などに希釈し、全体量を増量させた上で散布することが好ましい。固体を用いて希釈ないし増量させた場合は、本発明に係る微生物製剤を散布した後に水を散布して、Ｓ・Ｒ−０６株の土壌への定着を促すことが望ましい。なお、本発明に係る微生物製剤の所要量としては、粉末状であれば土壌１ｍ^２当たり３〜５ｇを、液体状であれば土壌１ｍ^２当たり１×１０^９個の分生子量を、それぞれ目安にすることができる。

本発明に係る微生物製剤（微生物農薬、植物生長促進剤）の施用手順として、他には、土壌に散布することに代えて、対象となる植物の種子に混合し、これを播種することにより施用してもよい。

以下、ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅＳ・Ｒ−０６株ならびに本発明に係る微生物農薬および植物生長促進剤について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。

＜実施例１＞菌株の単離および同定
（１）菌株の単離
北海道日高支庁静内町の土壌から、ツチアオカビの形態を有する菌を単離し、これをＳＩＩＤ１３８１９株とした。

（２）ＩＴＳ領域の塩基配列を用いた同定
株式会社テクノスルガ・ラボに委託して、ＳＩＩＤ１３８１９株の内部転写スペーサー領域（ＩｎｔｅｒｎａｌＴｒａｎｓｃｒｉｂｅｄＳｐａｃｅｒｒｅｇｉｏｎ；ＩＴＳ領域）の塩基配列を解析し、帰属の同定を行った。具体的には、下記の試薬、装置およびプログラムを用いて解析を行った。

ＤＮＡ抽出；物理的破壊およびＭａｒｍｕｒ（１９６１年）の改変法
ＰＣＲ；ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）
サイクルシーケンス；ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇｋｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）
配列決定；ＣｈｒｏｍａｓＰｒｏ１．５（ＴｅｃｈｎｅｌｙｓｉｕｍＰｔｙＬｔｄ．社）
解析ソフトウェア；アポロン２．０（テクノスルガ・ラボ社）
相同性検索；ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（ＮＣＢＩｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）
検索データベース；アポロンＤＢ−ＦＵ（ＩＴＳ）データベースＶｅｒ７．０（テクノスルガ・ラボ社）；国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）

ＢＬＡＳＴ検索の結果、ＳＩＩＤ１３８１９株のＩＴＳ領域の塩基配列（配列番号１）と相同率が高かった上位３０を、図１（アポロンＤＢ−ＦＵ（ＩＴＳ）データベースＶｅｒ７．０）および図２（国際塩基配列データベース）に示す。また、ＳＩＩＤ１３８１９株のＩＴＳ領域の塩基配列（配列番号１）と、図１において※で示した株のＩＴＳ領域の塩基配列とを用いて作成した分子系統樹を図３に示す。

図１〜３に示すように、ＳＩＩＤ１３８１９株のＩＴＳ領域の塩基配列（配列番号１）は、Ｈｙｐｏｃｒｅａａｔｒｏｖｉｒｉｄｉｓおよびトリコデルマアトロビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）のものと１００％一致し、これらの種と同じ分類群に帰属した。なお、Ｈｙｐｏｃｒｅａａｔｒｏｖｉｒｉｄｉｓとトリコデルマアトロビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）とは、テレオモルフ（有性時代）とアナモルフ（無性時代）の関係にある。

（３）形態観察による同定
ＳＩＩＤ１３８１９株を、ＣｏｒｎｍｅａｌＤｅｘｔｒｏｓｅＡｇａｒ培地（Ｓａｍｕｅｌｓｅｔ．ａｌ．、１９９８年；以下「ＣＭＤ培地」という）、ポテトデキストロース寒天培地（ダイゴ；日本製薬社；以下「ＰＤＡ培地」という）およびＳｙｎｔｈｅｔｉｓｃｈｅｒｎａｈｒｓｔｏｆｆａｒｍｅｒａｇａｒ（Ｎｉｒｅｎｂｅｒｇ、１９７６年；以下「ＳＮＡ培地」という）において、２５℃で７日間培養し、光学顕微鏡（ＢＸ５１；オリンパス社）を用いて形態観察を行った。なお、マウント液はラクトフェノール液およびラクトフェノールコットンブルー液を用いた。コロニーの観察結果を図４に、栄養菌糸の観察結果を図５に示す。また、無性生殖器官の観察結果として、分生子柄の観察結果を図６〜８に、分生子形成細胞の観察結果を図９および１０に、分生子の観察結果を図１１に、厚膜胞子の観察結果を図１２に、それぞれ示す。なお、ＳＩＩＤ１３８１９株を同条件にて約４週間培養した結果、有性生殖器官の形成は認められず、無性時代であることが明らかになった。

図４に示すように、ＣＭＤ培地、ＰＤＡ培地およびＳＮＡ培地のいずれにおいても、コロニーの直径は６５〜７０ｍｍであり、表面性状はビロード状であった。また、コロニーの色調は、ＣＭＤ培地およびＰＤＡ培地では、深緑色（Ｄｅｅｐｇｒｅｅｎ；２７Ｅ−８）および緑色（Ｇｒｅｅｎ；２７Ｂ−８）ないし白色（Ｗｈｉｔｅ；２７Ａ−１）であり、ＳＮＡでは緑色および黄緑色（Ｌｉｇｈｔｇｒｅｅｎ；２７Ａ−５）ないし白色（Ｗｈｉｔｅ；２７Ａ−１）であった。ここで、（）内の数値は、ＫｏｒｎｅｒｕｐａｎｄＷａｎｓｃｈｅｒ（１９７８年）で用いられている、「色」のコード番号を示す。また、いずれの培地においても、可溶性色素の産生は観察されなかった。

また、図５に示すように、栄養菌糸は、寒天表面上もしくは寒天内に形成された。菌糸の形状は細い形ないしやや太く膨らんだ形であり、菌糸の幅は１．５〜５μｍで、菌糸の色調は無色であった。また、有隔壁菌糸の形成が認められた。

また、図６および図７に示すように、分生子柄は栄養菌糸より直立し、規則または不規則的に分岐していた。また、図８に示すように、分生子柄は、集合して羊毛上の塊（房）を形成するのが認められた。

また、図９および図１０に示すように、分生子形成細胞であるフィアライドの形状はアンプル形（紡錘形）で先端部が細く、大きさは長径６〜１０μｍ×短径１．８〜３μｍであり、分生子柄の先端部に形成される様子が観察された。

また、図１１に示すように、分生子はフィアロ型で、色調は無色〜緑色であった。また、形は球形〜亜球形で、１細胞であった。また、大きさは長径２．５〜３．５μｍ×短径２〜３μｍであり、表面は平滑であった。

また、図１２に示すように、厚膜胞子は栄養菌糸の先端あるいは途中に形成され、形は球形〜亜球形、色調は無色で、１細胞性であった。

以上の本実施例１（３）で観察された形態的特徴は、トリコデルマアトロビリデの特徴（Ｄｏｄｄｅｔａｌ．、２００３年、ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａＯｎｌｉｎｅ）にほぼ一致していた。

以上の本実施例１（２）および（３）の結果から、ＳＩＩＤ１３８１９株は、子嚢菌門フンタマカビ綱ボタンタケ亜綱ボタンタケ目ボタンタケ科トリコデルマ属トリコデルマアトロビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）に属することが明らかになった。

（４）生育温度試験
ＳＩＩＤ１３８１９株をＰＤＡ培地に接種し、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃および３５℃の各温度条件下で培養し、培養３日目にコロニー径の測定および色素産生の有無について観察を行った。その結果を図１３に示す。

図１３に示すように、１５℃、２０℃、２５℃および３０℃ではコロニーが生育したが、３５℃ではコロニーの生育が認められなかった。また、コロニー径は、１５℃では３０〜３２ｍｍ、２０℃では５５ｍｍ、２５℃では６０ｍｍ、３０℃では５０〜５５ｍｍであった。色素産生は、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃および３５℃のいずれの温度条件下でも認められなかった。すなわち、ＳＩＩＤ１３８１９株は、３５℃でコロニーの生育が認められなかった点で、トリコデルマアトロビリデの特徴（Ｄｏｄｄｅｔａｌ．、２００３年、ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａＯｎｌｉｎｅ）と相違していた。この結果ならびに本実施例１（２）および（３）の結果から、ＳＩＩＤ１３８１９株は、トリコデルマアトロビリデに属する新規菌株であることが明らかになった。

そこで、ＳＩＩＤ１３８１９株をｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅＳ・Ｒ−０６と命名し、平成２７年３月２７日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥＰ−０２０２９として寄託した。以下、ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅＳ・Ｒ−０６を「Ｓ・Ｒ−０６株」と略記する場合がある。

＜実施例２＞菌糸伸長速度の評価
Ｓ・Ｒ−０６株とトリコデルマアトロビリデの有性時代の基準株であるＨｙｐｏｃｒｅａａｔｒｏｖｉｒｉｄｉｓＮＢＲＣ１０１７７６（以下、「１０１７７６株」という。）とで、菌糸伸長速度の比較を行った。具体的には、Ｓ・Ｒ−０６株と１０１７７６株とを、ＰＤＡ培地にて２７℃で３日間平面培養した。続いて、コロニーの先端部分を直径６ｍｍのコルクボーラーで打ち抜き、ＰＤＡ培地に置いて、２７℃で２日間培養した。培養１日目および２日目にコロニーの半径を測定し、培養２日目のコロニー半径から１日目のコロニー半径を減じた値を、１日当たりの菌糸伸長速度（ｍｍ／日）とした。同様の実験を５回行い、平均値を算出した。その結果を表１に示す。

表１に示すように、菌糸伸長速度の平均値は、Ｓ・Ｒ−０６株では２１．４ｍｍ／日であったのに対して、１０１７７６株では１８．０ｍｍ／日であった。すなわち、Ｓ・Ｒ−０６株の菌糸伸長速度は、１０１７７６株の菌糸伸長速度と比較して、２０％近く大きかった。この結果から、ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅＳ・Ｒ−０６は、トリコデルマ属微生物の基準株と比較して、菌糸の伸長が顕著に速いことが明らかになった。ここで、菌糸伸長速度は、病原体の生育抑制にあたっての重要な因子であり、菌糸伸長速度が大きいほど病原体の生育抑制能が高く、抗菌作用に優れていると考えられる。このことから、ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅＳ・Ｒ−０６は、トリコデルマ属微生物の基準株と比較して病原体の生育抑制能が高く、抗菌作用に優れていると考えられた。

＜実施例３＞抗菌作用の評価
病原体および拮抗菌として表２に示すものを用意し、ＰＤＡ培地にて、表２に示す温度および培養日数で平面培養した。

続いて、平面培養した各病原体および拮抗菌のコロニーを直径６ｍｍのコルクボーラーで打ち抜き、ＰＤＡ培地の入った直径９０ｍｍのシャーレの端から３０ｍｍの位置に各病原体を置き、他方の端から３０ｍｍの位置に拮抗菌を置いて、２７℃で５日間、対峙培養を行った。なお、ＲｈｉｚｏｐｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＮＢＲＣ３１９８８（イネ苗立枯病の病原体）については、拮抗菌としてＳ・Ｒ−０６株との対峙培養のみ行った。コントロールとして、病原体のみを置いたものを同様に培養した。その後、各シャーレにおいて病原体が生育している面積（病原体生育面積）を測定し、式１により病原体生育抑制率（％）を算出した。その結果を図１４および図１５に示す。
式１；病原体生育抑制率（％）＝｛（コントロールにおける病原体生育面積−各シャーレにおける病原体生育面積）／コントロールにおける病原体生育面積｝×１００

図１４に示すように、ＦｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍＮＢＲＣ７１５２（植物の萎凋病や腐敗を引き起こす病原体）に対する病原体生育抑制率は、Ｓ・Ｒ−０６株では８０％であったのに対して、１０１７７６株では６４％であった。また、ＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉＮＢＲＣ３０９４４（リゾクトニア病の病原体）、ＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍＮＢＲＣ３０９６５（菌核病の病原体）およびＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍａｃｕｔａｔｕｍＮＢＲＣ３２８５０（炭疽病の病原体）に対する病原体生育抑制率は、Ｓ・Ｒ−０６株および１０１７７６株のいずれも１００％であった。

また、図１５に示すように、ＨｅｌｉｃｏｂａｓｉｄｉｕｍｍｏｍｐａＮＢＲＣ３１６５１（紫モンパ病の病原体）に対する病原体生育抑制率は、Ｓ・Ｒ−０６株では８９％であったのに対して、１０１７７６株では６９％であった。また、ＲｏｓｅｌｌｉｎｉａｎｅｃａｔｒｉｘＮＢＲＣ３２５３８（白モンパ病の病原体）に対する病原体生育抑制率は、Ｓ・Ｒ−０６株では１００％であったのに対して、１０１７７６株では８７％であった。また、ＡｒｍｉｌｌａｒｉａｍｅｌｌｅａＮＢＲＣ３１６２１（ナラタケ病の病原体）に対する病原体生育抑制率は、Ｓ・Ｒ−０６株および１０１７７６株のいずれも１００％であった。また、ＡｔｈｅｌｉａｒｏｌｆｓｉｉＮＢＲＣ３１２１５（白絹病の病原体）に対する病原体生育抑制率は、Ｓ・Ｒ−０６株では７４％であったのに対して、１０１７７６株では７０％であった。また、ＲｈｉｚｏｐｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＮＢＲＣ３１９８８（イネ苗立枯病の病原体）に対するＳ・Ｒ−０６株の病原体生育抑制率は１００％であった。

すなわち、Ｓ・Ｒ−０６株は、ＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉＮＢＲＣ３０９４４（リゾクトニア病の病原体）、ＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍＮＢＲＣ３０９６５（菌核病の病原体）、ＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍａｃｕｔａｔｕｍＮＢＲＣ３２８５０（炭疽病の病原体）およびＡｒｍｉｌｌａｒｉａｍｅｌｌｅａＮＢＲＣ３１６２１（ナラタケ病の病原体）に対しては、１０１７７６株と同様に１００％の病原体生育抑制率を示し、ＦｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍＮＢＲＣ７１５２（植物の萎凋病や腐敗を引き起こす病原体）、ＨｅｌｉｃｏｂａｓｉｄｉｕｍｍｏｍｐａＮＢＲＣ３１６５１（紫モンパ病の病原体）、ＲｏｓｅｌｌｉｎｉａｎｅｃａｔｒｉｘＮＢＲＣ３２５３８（白モンパ病の病原体）およびＡｔｈｅｌｉａｒｏｌｆｓｉｉＮＢＲＣ３１２１５（白絹病の病原体）に対しては、１０１７７６株よりも高い病原体生育抑制率を示した。

すなわち、ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅＳ・Ｒ−０６は、トリコデルマ属微生物の基準株と比較して、広範な種類の病原体に対して高い生育抑制効果を奏することから、抗菌作用に優れていることが明らかになった。

＜実施例４＞微生物農薬の製造および施用
（１）微生物農薬の製造
Ｓ・Ｒ−０６株を液体培地で振盪培養して種菌を作成した。一方、ふすま１０ｋｇ、水１０Ｌおよび３６％の濃塩酸５０ｍＬを混合し、トロンメル方式の殺菌釜にて１２０℃で３０分間加熱殺菌を行った。ここに、作成したＳ・Ｒ−０６株の種菌１００ｍＬを加えることにより植菌した。これをアルミ製の培養トレー（４５０×７００×８０ｍｍ）２０枚に等量ずつ入れ、２５±１℃、相対湿度９０％の条件下で７日間培養を行った。培養開始から４日目以後は、分生子形成を促すために一日に一回撹拌操作を行った。培養終了後、３５℃に加温した除湿空気下で、水分が４％以下となるまで約１２時間乾燥させて、７．３ｋｇの乾燥物を得た。得られた乾燥物を衝撃式粉砕機に供して、８０メッシュパスの粒度となるまで粉砕を行い、得られた乾燥粉末を微生物農薬とした。この乾燥粉末１ｇ中には、約８×１０^９個の分生子が含まれていた。

（２）微生物農薬の施用
本実施例４（１）の微生物農薬を、水１Ｌ当たり１．５ｇの割合となるよう希釈した。これを、リゾクトニアソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）を病原体とする褐色パッチが発生しているゴルフ場の芝草に、１ｍ^２当たり２Ｌの割合で散布し、経過を観察した。その結果、２日後には病徴の進行は止り、１２日後には完全にもとの状態に回復した。この結果から、ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅＳ・Ｒ−０６を有効成分とする微生物農薬は、植物病害を効果的に防除できることが明らかになった。

＜実施例５＞植物生長促進作用の評価
（１）植物生長促進剤の製造
ＰＤＡ培地にＳ・Ｒ−０６株を塗布し、２５℃で１０日間培養を行い、分生子を形成させた。続いて、分生子を滅菌した蒸留水に懸濁して分生子液を調製し、これを植物生長促進剤とした。

（２）植物生長促進作用の評価
赤玉土７Ｌ、腐葉土２Ｌ、パーミキュライト１Ｌ、石灰１５ｇおよび化学肥料１５ｇを混合して栽培用土を調製し、プランターに入れて、試験区と対照区を設定した。本実施例５（１）の植物生長促進剤を、散布量が１ｍ^２当たり１×１０^９個の分生子となるよう、試験区に散布した。対照区には何も散布しなかった。続いて、試験区および対照区に小松菜種子を播種して、同条件にて２８日間栽培した。その後、各区から小松菜を１０株ずつランダムに採取して草丈を計測し、平均値を算出した。

その結果、対照区の草丈の平均値は１６．８ｃｍであったのに対して、試験区の草丈の平均値は２０．５ｃｍであった。すなわち、本発明に係る植物生長促進剤を散布した区では、散布しなかった区と比較して、小松菜の草丈が顕著に大きかった。この結果から、ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅＳ・Ｒ−０６を有効成分とする植物生長促進剤は、植物の生長を顕著に促進することが明らかになった。

Claims

ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅＳ・Ｒ−０６株（受託番号：ＮＩＴＥＰ−０２０２９）。
ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅＳ・Ｒ−０６株（受託番号：ＮＩＴＥＰ−０２０２９）の培養物および／または菌体を有効成分とする、微生物農薬。
ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅＳ・Ｒ−０６株（受託番号：ＮＩＴＥＰ−０２０２９）の培養物および／または菌体を有効成分とする、植物生長促進剤。