KR102613913B1 - 트리코데르마 아트로비리데 배양 추출물을 포함하는 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물 - Google Patents
트리코데르마 아트로비리데 배양 추출물을 포함하는 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 트리코데르마 아트로비리데 배양 추출물을 포함하는 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 탈모 예방 또는 발모 개선 효과가 우수한 트리코데르마 아트로비리데 sw-1 배양 추출물을 포함하는 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물 및 이를 이용한 제품에 관한 것이다.
Description
본 발명은 트리코데르마 아트로비리데 배양 추출물을 포함하는 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 탈모 예방 또는 발모 개선 효과가 우수한 트리코데르마 아트로비리데 sw-1 배양 추출물을 포함하는 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물 및 이를 이용한 제품에 관한 것이다.
탈모증은 크게 두 종류가 있는데 그중 첫째는 남성형 탈모증(androgen alopecia)으로 중년 남성에게 흔히 볼 수 있고, 탈모가 전두부와 두정부에서 시작된다. 둘째로는 원형 탈모증(alopecia areata)이라고 불리는 것으로 원형 내지 타원형의 비교적 경계가 명확한 탈모를 보이며 청소년기에 발생할 수 있는 탈모증이다.
발모와 탈모의 정확한 기전이 현재까지 완전하게 밝혀지지 않았다. 탈모는 모낭의 성장주기 중 성장기의 모낭에서 자라는 모발보다 퇴행기 또는 휴지기의 모낭에서 자라는 모발의 비율이 높아져, 여러 원인으로 인하여 정상탈락 모발수보다 많은 모발이 탈락하는 상태를 말한다. 이러한 탈모의 원인으로는 모발 주기 조절과 관련된 모유두세포(dermal papilla cell)와 모모세포(germinal matrix cell)의 기능저하 또는 증식억제, 남성호르몬의 과잉작용, 두피로의 혈류량 저하, 피지분비 과잉, 과산화물 및 세균 등에 의한 두피기능 저하, 유전적 요인, 노화, 스트레스에 따른 신경증 등이 있으며, 다양한 원인이 단독 또는 복합적으로 작용하는 것으로 알려져 있다.
최근, 현대인들에게 대기오염과 같은 환경적 요인과 정신적인 스트레스 등으로 인하여 탈모증의 발생이 증가하고 있으며 발생 연령도 점차 낮아지고 있다. 이와 같은 탈모증은 당사자들에게 심각한 스트레스를 유발하고 대인관계에 지장을 초래할 수 있어 그 치료 및 예방에 대한 관심은 증대되고 있다.
탈모증의 치료 및 예방에 있어 현재까지 다양한 시도가 이루어져 왔는데 외관적인 방법으로는 두피피판술, 탈모부위 축소술, 및 조직확장술에 의한 두피성형술과 최근에 발전된 자가모발 이식술이 있다. 이러한 외과적 방법은 비록 그 효과 면에서는 우수하더라도 수술에 대한 환자의 경제적 및 정신적 부담이 매우 크므로 널리 이용되기 어렵다는 단점이 있다.
이에 탈모증을 치료 및 예방하기 위한 약제로 미국 FDA 승인을 받은 업존사의 미녹시딜 함유 제제가 있고, 최근에는 머크사에서 Type 2의 5알파-환원효소(5α-reductase)의 작용을 저해하여 디하이드로테스토스테론의 생성을 억제하는 피나스테라이드(finasteride, proscar)가 주성분인 프로페시아(Propecia)가 발매되어 사용되고 있다. 그러나, 미녹시딜의 경우 가려움증, 자극 등의 부작용이 나타나는 문제점이 있고, 피나스테라이드의 경우에도 사용을 중단하면 2개월 안에 원상태로 돌아가는 문제점과 성욕감퇴, 발기부전 등의 부작용이 발생하며 여성은 기형아 출산 위험이 있기 때문에 복용할 수 없다는 단점이 존재한다.
따라서, 이러한 인체에 대한 부작용이 없는 천연물질들로부터 유래된 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물 및 이를 포함하는 제품이 필요하다.
본 발명에 대한 배경기술로 대한민국 공개특허 제10-0960054호에 탈모방지 및 두피개선을 위한 두발 화장품 조성물이 개시되어 있다.
본 발명의 목적은 인체에 대한 부작용을 최소화할 수 있으며, 탈모 예방 또는 발모 개선 효과가 우수한 천연 추출물을 유효성분으로 포함하는, 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인체에 대한 부작용을 최소화할 수 있으며, 탈모 예방 또는 발모 개선 효과가 우수한 천연 추출물을 유효성분으로 포함하는, 탈모 예방 또는 발모 개선용 외용제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인체에 대한 부작용을 최소화할 수 있으며, 탈모 예방 또는 발모 개선 효과가 우수한 천연 추출물을 유효성분으로 포함하는, 탈모 예방 또는 발모 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인체에 대한 부작용을 최소화할 수 있으며 탈모 예방 또는 발모 개선 효과가 우수한 천연 추출물을 유효성분으로 포함하는, 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물을 효율적으로 제조할 수 있는 탈모 예방 또는 발모 개선용 외용제 조성물 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 상세한 설명의 기재로부터 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
일 측면에 따르면, 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride) 균주 배양 추출물을 포함하는, 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물이 제공된다.
일 실시예에 따르면, 상기 트리코데르마 아트로비리데 균주는 기탁번호 KCTC 18858P의 트리코데르마 아트로비리데 sw-1(Trichoderma atroviride sw-1) 균주일 수 있다.
다른 측면에 따르면, 본원에 기재된 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물을 포함하는, 탈모 예방 또는 발모 개선용 외용제 조성물이 제공된다.
또 다른 측면에 따르면, 본원에 기재된 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물을 포함하는, 탈모 예방 또는 발모 개선용 화장료 조성물이 제공된다.
또 다른 측면에 따르면, i) 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride) 균주를 1 내지 10일 동안 배양하는 단계; ii) 배양된 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양물의 상등액을 얻는 단계; 및 iii) 배양된 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양물의 상등액을 첨가하는 단계;를 포함하는, 탈모 예방 또는 발모 개선용 외용제 조성물의 제조 방법이 제공된다.
일 실시예에 따르면, 본원의 탈모 예방 또는 발모 개선 조성물은 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride) 균주 배양 추출물인 천연추출물을 유효성분으로 포함하여 인체에 대한 부작용을 최소화할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 본원의 탈모 예방 또는 발모 개선 조성물을 이용하면, 인체에 대한 부작용을 최소화하면서, 우수한 탈모 예방 또는 발모 개선 효과가 있는 탈모 예방 또는 발모 개선용 외용제 조성물을 제공할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 본원의 탈모 예방 또는 발모 개선 조성물을 이용하면, 인체에 대한 부작용을 최소화하면서, 우수한 탈모 예방 또는 발모 개선 효과가 있는 탈모 예방 또는 발모 개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 인체에 대한 부작용을 최소화하면서, 우수한 탈모 예방 또는 발모 개선 효과가 있는 탈모 예방 또는 발모 개선용 외용제 조성물을 효율적으로 제조할 수 있다.
도 1a 내지 도 1c는 본 발명의 일 실시예에 의한 트리코데르마 아트로비리데 sw-1 동정 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 트리코데르마 아트로비리데 sw-1 배양 추출물의 세포 독성 실험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3a 내지 도 3c는 본 발명의 일 실시예에 의한 탈모 예방 또는 발모 개선 효과를 보여주는 사진이다.
도 4a 내지 도 4c는 본 발명의 트리코데르마 아트로비리데 sw-1 배양 상등액에 포함된 사포닌계열 대사체 성분 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 트리코데르마 아트로비리데 sw-1 배양 추출물의 항균 활성 실험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 트리코데르마 아트로비리데 sw-1 배양 추출물의 세포 독성 실험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3a 내지 도 3c는 본 발명의 일 실시예에 의한 탈모 예방 또는 발모 개선 효과를 보여주는 사진이다.
도 4a 내지 도 4c는 본 발명의 트리코데르마 아트로비리데 sw-1 배양 상등액에 포함된 사포닌계열 대사체 성분 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 트리코데르마 아트로비리데 sw-1 배양 추출물의 항균 활성 실험 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해 편의상 특정 용어를 본원에 정의한다. 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 본 명세서에 사용되는 용어 "포함"은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라, 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
일 측면에 따르면, 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride) 균주 배양 추출물을 포함하는, 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물이 제공된다.
트리코데르마 속(Trichoderma spp)은 다양한 종류의 곰팡이균에 의해 야기되는 식물병에 가장 잘 이용되는 미생물 방제제 중 하나이며, 세포 외 가수분해효소의 생산은 트리코데르마(Trichoderma)가 곰팡이 병원체에 미치는 생물학적 방제 기작 중 하나이다. 세포 외 키틴분해효소를 생산함으로써, 병원성 진균의 성장을 방해하는 생물학적 기작이 있으며, 이는 곰팡이 세포벽의 키틴 중합체를 분해시킨다고 알려져 있다.
본 발명자는 상기 트리코데르마 속(Trichoderma spp)에 속하는 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride) 균주 배양 추출물이 우수한 탈모 예방 또는 발모 개선 효과가 있는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다. 본원의 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride) 균주 배양 추출물은 사포닌을 포함하여 두피의 피지성분과 각질세포를 제거할 수 있어, 탈모 예방 또는 발모 개선 효과가 있을 수 있다. 또한, 본원의 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride) 균주 배양 추출물은 사포닌과 펩타이드를 포함하여, 두피 청결과 두피열 강하 효능에 의해 탈모 예방 또는 발모 개선 효과가 있을 수 있다. 나아가, 본원의 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride) 균주 배양 추출물은 사포닌, 펩타이드, 및 단당류를 포함하여, 발모 세포 활성화 및 모발 탄력 강화 효과가 있을 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 상기 단당류는 프락토오스, 에리트로스 등을 포함할 수 있다. 나아가 본원의 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride) 균주 배양 추출물을 이용하면 어린 애모의 발모뿐만 아니라, 애모가 성모로 발달하는 데도 기여할 수 있어, 진정한 발모 개선 효과가 있다 할 것이다.
일 실시예에 따르면, 상기 트리코데르마 아트로비리데 균주는 기탁번호 KCTC 18858P의 트리코데르마 아트로비리데 sw-1(Trichoderma atroviride sw-1) 균주일 수 있다.
본 발명자들은 자연(야생버섯 속의 야생버섯 공생균)으로부터 분리한 티로시나아제 억제 활성 균주로 선별된 sw-1 균주를 동정하였다. 도 1a 내지 도 1c에 나타난 바와 같이, 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride)의 ITS와 99% 일치되는 결과로 나타나 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride)로 동정되었으며, 트리코데르마 아트로비리데 sw-1(Trichoderma atroviride sw-1)으로 명명하였다.
상기 트리코데르마 아트로비리데 sw-1(Trichoderma atroviride sw-1)는 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2020년 10월 29일자로 기탁되어, 2020년 11월 09일에 기탁번호 KCTC 18858P를 부여받았다.
본원의 트리코데르마 아트로비리데 sw-1(Trichoderma atroviride sw-1)인 기탁번호 KCTC 18858P의 균주 배양 추출물은 미백 효과 이외에 탈모 예방 또는 발모 개선 효과가 우수한 것을 확인하여 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물의 유효성분으로 유용하게 활용될 수 있다.
본원의 트리코데르마 아트로비리데 sw-1(Trichoderma atroviride sw-1)인 기탁번호 KCTC 18858P의 균주는 탈모 예방 또는 발모 개선 효과뿐만 아니라 항균활성도 우수하여 복합 기능성 조성물의 유효성분으로 유용하게 활용될 수 있다.
본원에 있어서, 배양 추출물은 트리코데르마 아트로비리데 균주를 배양하여 얻어진 배양배지, 상기 배양배지에서 균체를 제거한 무세포 배양배지, 및 이의 농축물을 모두 포함하는 것이나, 균체를 제거한 무세포 액상 배양배지 내지 상등액이 적합할 수 있다.
이에 한정되는 것은 아니나, 상기 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양 추출물을 탈모 예방 또는 발모 개선용 외용제 또는 화장료 조성물 중 5 부피% 이상으로 포함하는 것이 적합할 수 있고, 10 부피% 이상 포함하는 것이 더 적합할 수 있고, 20 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 30 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 40 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 50 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 60 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 70 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 80 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 90 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 95 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 99% 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있다.
상기 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양 추출물을 외용제 또는 화장료 조성물 중 5 부피% 이상으로 포함하는 것이 탈모 예방 또는 발모 개선 효과면에서 적합할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 상기 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양 추출물이 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물 중 5 부피% 미만으로 포함되는 경우, 탈모 예방 또는 발모 개선 효과가 미비할 수 있다.
상기 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양 추출물은 1 내지 10일 동안 배양한 배양 추출물이 탈모 예방 또는 발모 개선 효과면에서 적합할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 상기 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양 추출물은 1일 미만으로 배양한 배양 추출물의 경우 탈모 예방 또는 발모 개선 활성이 미비하고, 10일 초과로 배양한 배양 추출물의 경우 함량이 증가하여도 탈모 예방 또는 발모 개선 활성은 오히려 감소할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 배양기간은 2 내지 10일이 더 적합할 수 있고, 3 내지 10일이 더욱더 적합할 수 있고, 5 내지 10일이 더욱더 적합할 수 있고, 7 내지 10일이 더욱더 적합할 수 있고, 7 내지 9일이 더욱더 적합할 수 있다.
다른 측면에 따르면, 본원에 기재된 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물을 포함하는, 탈모 예방 또는 발모 개선용 외용제 조성물이 제공된다.
상기 외용제 조성물은 유지성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면활성제, 알코올, 유기 안료, 무기 안료, 유기 분체, 산화 방지제, pH 조정제, 색소, 향료 등을 포함할 수 있다. 피부 외용제 조성물은 제형 또는 사용목적 등에 따라 그 성분이 달라질 수 있다.
일 실시예에 의하면, 상기 외용제 조성물은 물, 유분, 계면활성제, 보습제, 점증제, 알코올, 색소, 방부제, 및 향료 중에서 선택된 하나 이상의 성분을 더 포함하는 것이 적합할 수 있다.
일 실시예에 의하면, 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물은 외용제 중 5 부피% 이상 포함하는 것이 적합할 수 있고, 10 부피% 이상 포함하는 것이 더 적합할 수 있고, 20 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 30 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 40 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 50 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 60 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 70 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 80 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 90 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 95 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 99% 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 상기 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물이, 외용제 조성물 중 5 부피% 미만인 경우, 조성물의 유효 약리 성분들의 두피로의 침투량이 적어져 탈모 예방 또는 발모 개선 효과가 저하되는 문제점이 나타날 수 있다.
일 실시예에 의하면, 헥산디올, 카프릴릴 글라이콜, 및 에틸헥실글리세린을 더 포함할 수 있다.
또 다른 측면에 따르면, 본원에 기재된 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물을 포함하는, 탈모 예방 또는 발모 개선용 화장료 조성물이 제공된다. 상기 화장료은 두발제품 화장품이 적합할 수 있다.
일 실시예에 의하면, 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물은 화장료 조성물 중 5 부피% 이상 포함하는 것이 적합할 수 있고, 10 부피% 이상 포함하는 것이 더 적합할 수 있고, 20 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 30 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 40 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 50 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 60 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 70 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 80 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 90 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 95 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있고, 99% 부피% 이상 포함하는 것이 더욱더 적합할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 상기 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물이, 화장품 조성물 중 5 부피% 미만인 경우, 조성물의 유효 약리 성분들의 두피로의 침투량이 적어져 탈모 예방 또는 발모 개선 효과가 저하되는 문제점이 나타날 수 있다.
이에 한정되는 것은 아니나, 본원의 화장료 조성물은 헤어미스트, 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어 에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스, 및 헤어스프레이 중 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
본 발명의 화장품에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양 추출물 이외에 화장품에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 색소 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 더 포함할 수 있다.
본원의 외용제 및 화장품은 탈모 예방 또는 발모 개선효과 뿐만 아니라, 항균 효과도 동시에 도모할 수 있다.
또 다른 측면에 따르면, i) 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride) 균주를 1 내지 10일 동안 배양하는 단계; ii) 배양된 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양물의 상등액을 얻는 단계; 및 iii) 배양된 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양물의 상등액을 첨가하는 단계;를 포함하는, 탈모 예방 또는 발모 개선용 외용제 조성물 또는 화장료 조성물의 제조 방법이 제공된다.
보다 구체적으로 살펴보면, 단계 i)은 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride) 균주를 배양하는 단계이다.
상기 단계 i)에서 상기 트리코데르마 아트로비리데 균주는 기탁번호 KCTC 18858P의 트리코데르마 아트로비리데 sw-1(Trichoderma atroviride sw-1) 균주가 적합할 수 있다.
본원의 균주의 배양 배지는 PDB(Potato Dextrose Broth) 배지 등 공지의 다양한 배지를 이용할 수 있으나, 식용배지를 이용하는 것이 적합할 수 있다. 식용배지를 이용하면 트리코데르마 아트로비리데 (Trichoderma atroviride) 배양 상등액 자체를 독성이 없이 산업적으로 적용시킬 수 있다. 상기 식용배지는 콜라겐 및 감자전분 등이 포함된 곡물배지가 적합할 수 있다.
본원의 균주의 배양은 균주의 배양 효율이란 측면에서, 상대습도를 기준으로 40% 내지 50%의 상대습도 조건 또는 20℃ 내지 40℃의 온도 조건에서 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양 추출물은 1 내지 10일 동안 배양한 배양 추출물이 탈모 예방 또는 발모 개선 효과면에서 적합할 수 있다.
다음, 단계 ii)는 배양된 트리코데르마 아트로비리데 sw-1 균주 배양물의 상등액을 얻는 단계이다. 상기 배양물의 상등액을 얻는 단계는 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 일단 거즈를 이용하여 균사체를 분리한 후, 원심 분리 및 2차 여과하여 상등액을 얻을 수 있다.
다음, 단계 iii)은 상기 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양물의 상등액을 외용제 또는 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분에 첨가하는 단계이다. 외용제 또는 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분은 상술한 바와 같다.
단계 iii)에서 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양물의 상등액은 외용제 조성물 또는 화장료 조성물 중 5 부피% 이상으로 첨가하는 것이 탈모 예방 또는 발모 개선 효과면에서 적합할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 상기 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양 추출물이 외용제 중 5 부피% 미만으로 포함되는 경우, 탈모 예방 또는 발모 개선 효과가 미미할 수 있다.
[실시예]
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 탈모 예방 또는 발모 개선 조성물에 대한 더욱 상세하게 설명한다.
실시예 1. 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물의 제조
1) 티로시나아제 저해 활성 우수 균주 선발
봉화군 백두대간 국립공원에서 채취한 나무껍질 및 버섯 등으로부터 28개의 시료를 채취하였으며 각 시료별 자생 곰팡이를 순수 분리하였다.
순수 분리된 곰팡이를 액체 배양하여 티로시나아제(tyrosinase) 억제 시험을 통해 1차 스크리닝을 진행하였다.
1차 스크리닝된 균주 4종에 대하여 ITS (internal transcribed spacer) region 시퀀싱을 통하여 동정을 하였으며 GF-001, GF-008, GF-018, GF-020 순서대로 트리코데르마 베르티눔(Trichoderma velutinum), 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride), 트리코데르마 에리나세움(Trichoderma erinaceum), Fungal sp(미확인)로 확인되었다. 다음 1차 screening 된 균주들에 대하여 항산화 실험을 통해 최종 균주를 선택하였다.
최종 선택된 균주는 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride)의 its와 99% 일치되는 결과로 나타나 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride)로 동정 되었으며, 트리코데르마 아트로비리데 sw-1(Trichoderma atroviride sw-1)으로 명명하였다(도 1a 내지 도 1c).
2) 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물의 제조
상기 티로시나아제 저해 활성 우수 균주로 선발된 트리코데르마 아트로비리데 sw-1(Trichoderma atroviride sw-1)을 배양하여, 배양 추출물을 수득하여 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물을 제조하였다.
보다 구체적으로는 티로시나아제 저해 활성 우수 균주로 선발된 트리코데르마 아트로비리데 sw-1(Trichoderma atroviride sw-1)를 식용배지인 콜라겐 및 감자전분 등이 포함된 곡물배지에서 배양하였다.
이때 배양은 상대습도 45% 및 온도 25℃에서 8일 동안 배양하였다.
배양 추출물은 일단 거즈를 이용하여 균사체를 분리한 후, 원심 분리 및 2차 여과하여 상등액을 수득하여 배양 추출물로 사용하였다.
실험예 1. 세포 독성
트리코데르마 아트로비리데의 세포 독성을 확인하기 위하여, 하기와 같이 세포 독성 실험을 진행하였다.
세포주의 생존율 측정은 MTS (CellTiter 96®AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, USA) 시약을 이용하여 세포의 생존율을 측정하였다. 96 well plate에 세포를 1×104 cells/well의 농도로 분주 후 습도 95%, 5% CO2, 37℃로 조절된 배양기에서 24시간 안정화하였다. 이후 시료를 농도별로 처리하여 습도 95%, 5% CO2, 37℃로 조절된 배양기에서 72시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 MTS 시약 1 ml에 배지(DMEM (21063-029, free phenol red, GIBCO, Grand Island, NY) 9 ml을 넣어 희석한 후 시료처리 완료된 well 당 100 ㎕씩 처리하였다. 37℃에서 60 분간 반응 후 microplate reader (Molecular Devices, VersaMax ELISA Microplate Reader, USA)로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존율은 시료를 처리하지 않은 대조군에 대비한 시료 처리군의 흡광도로 표시하였다.
도 2는 상기와 같은 세포 독성 실험 방법에 따라 본 발명에서 사용된 세포주 B16F0 mouse melanoma cell에 대하여 MTS 방법에 의하여 트리코데르마 아트로비리데 배양 상등액을 농도별로 처리한 결과를 나타낸다. 도 2에 나타난 바와 같이, 대조군인 PDB(potato dextrose broth)와 동일하게 1%부터 10%까지 모든 농도에서 생존율에서 차이를 보이지 않았으며, 따라서 트리코데르마 아트로비리데는 독성이 존재하지 않는 것으로 확인되었다.
실험예 2. 탈모 예방 또는 발모 개선 효과 분석
실시예 1에서 티로시나아제 저해 활성 우수 균주로 선발된 트리코데르마 아트로비리데 sw-1(Trichoderma atroviride sw-1)의 탈모 예방 또는 발모 개선 효과를 확인하기 위하여, 트리코데르마 아트로비리데 sw-1의 8일차 배양 상등액을 이용하였다.
배양 상등액 99%가 되도록 희석하여 탈모 증상이 있는 실험자들에게 1일 1회 1 ml씩 미스트로 3개월 또는 4개월간 분무하였다.
그 결과를 도 3a 내지 도 3c에 나타내었다. 실험자들의 모발의 수가 증가하였을 뿐만 아니라 모발의 굵기 및 탄력도 현저하게 개선되었다.
실험예 3. 저분자 대사체(펩타이드류, 당류 등) 성분분석
경성대학교에 LC-Q-TOF/MS 분석을 의뢰하여 트리코데르마 아트로비리데 배양액에 함유되어 있는 저분자 대사체를 분석하였다. 분석을 위해 트리코데르마 아트로비리데 배양액을 13,000 rpm으로 원심분리한 상등액을 50% 아세토니트릴로 10배 희석하여 시료 전처리를 하였다.
LC 분석조건은 애질런트테크놀로지스사(Agilent 1260, Santa Clara, California, USA) 장비를 사용하였다. 분석컬럼은 ZORBAX XDB-C18 (4.6 × 50 mm, 1.8 μm) 사용하였고 이동상은 0.1% 포름산을 포함한 정제수 (A)와 0.1% 포름산을 포함한 아세토니트릴 (B)를 이용하였으며 유량은 0.5 ml/min이었다. 이동상 조성 B의 비율을 증가시키는 기울기 용리 방법으로 시료 2 ul를 주입하여 분석하였다. Q-TOF/MS는 애질런트테크놀로지스사(Agilent 6530, Santa Clara, California, USA) 장비를 사용하였다. MS 조건은 positive 및 negative 이온화모드에서 capillary 전압은 4.0 kV, neubulizer gas와 drying gas는 각각 10 ml/min과 50 kPa로 설정하였다. fragmenter는 100, 150, 200, collision energy는 10 V, mass range는 100~1,000 m/z 범위로 분석을 진행하였다.
LC-Q-TOF/MS 결과는 하기 표 1에 나타내었다. 검출된 저분자 대사체 모분자의 분자량 확인, 원소조성 비교 및 매스라이브러리(natural product) 검색을 통해 6종의 저분자 대사체를 확인하였다. 배양액 내 펩타이드류는 Gln-Glu-Pha와 Pro-Ala, 당류는 에리트로스와 프락토오스, 기타 저분자는 피콜린산과 3-아세트아미도프로판올의 저분자 대사체 6종이 함유되어 있음을 확인하였다. 6종의 저분자 대사체 중 미백기능을 가진 물질은 금속 킬레이트제로 알려진 2-피콜린산(2-picolinic acid)이었으며 피콜린산이 티로시나아제 억제 활성을 갖는 것을 확인하였다.
| Name | Formula | Mode | RT (min) |
Mass | m/z | Score |
| Gln Glu Phe (Tripeptide) |
C19H26N4O7 | Positive | 1.041 | 422.1804 | 440.214 | 89.25 |
| Picolinic acid | C6H5NO2 | Positive | 1.051 | 123.0321 | 124.0393 | 87.88 |
| Erythrose | C4H8o4 | Negative | 0.948 | 120.0423 | 119.035 | 87.56 |
| Pro Ala | C8H14 N2O3 | Positive | 0.996 | 186.1005 | 187.1078 | 87.27 |
| 3-Acetamidopropanol | C5H9NO2 | Positive | 0.995 | 115.0633 | 116.070 | 86.95 |
| D-Fructose | C6H12O6 | Positive | 0.949 | 180.0635 | 203.0527 | 86.27 |
실험예 4. 사포닌계열 대사체 성분 분석
경상국립대학교에서 UPLC-ESI-Q-TOF/MS (Vion-MS, Waters, Milford, CT, USA) 분석을 통해 트리코데르마 아트로비리데 배양액에 함유되어 있는 사포닌계열 대사체를 분석하였다. 분석을 위하여 배양액을 동결건조한 뒤 1 g을 칭량하고 10 ml의 80% 에탄올을 넣어준 뒤 90분간 초음파추출하여 전처리 하였다.
분석장비는 워터스사의 UPLC-Q-TOF/MS (Xevo G2-S, Waters, Miford, MA, USA)를 사용하였으며 분석컬럼은 Acquity UPLC BEH C18 column (2.1 × 100 mm, 1.7 μm)을 사용하였다. UPLC 이동상 용리에 0.1% 포름산을 포함한 정제수 (A)와 0.1% 포름산을 포함한 아세토니트릴 (B)를 이용하였으며 유량은 0.35 ml/min이었다. 이동상 조성 B의 비율을 증가시키는 기울기 용리 방법으로 시료 1 ul를 주입하여 분석하였다. MS 분석은 전기분무이온화 (ESI) 조건에서 negative 이온화 모드로 분석하였다. capillary 전압은 3.0 kV, sample cone 전압은 30 V로 설정하였으며 desolvation gas 및 sample cone gas는 He로서 유량은 각각 800 l/h와 30 l/h로 설정하였다. Desolvation 온도와 ion source 온도는 각각 400℃ 및 100℃로 설정하였다. 데이터 수집은 범위 당 0.2초의 시간으로 m/z 50-1500 범위에서 실시하였다.
분석 결과로 도 4a와 같은 BPI(Base Peak Intensity) 그램을 얻었으며 각 피크에서 나타난 개별 매스그램을 확인하여 6~8분에서 나타나는 피크들의 분자량이 1000 이상인 것으로 배양액 내 사포닌계열 대사체가 함유되어 있을 것으로 추정하였다. 도 4a의 사포닌 추정구간에서 나타난 피크 중 7.28분 피크의 매스그램을 확인한 결과 사포닌 계열의 아스파라코사이드로 확인되었다. 도 4b에 7.28분에서 나타난 피크의 매스그램에서 [M-H]- 1003.5103임을 확인하였다. 매스 결과분석은 워터스사의 UNIFI version 5.4.0 소프트웨어를 활용하여 해당 대사체의 원소조성이 C49H80O21임을 알 수 있었고 이는 도 4c에 보이는 구조로 사포닌 일종인 아스파라코사이드의 조성과 잘 일치함을 확인하였다.
실험예 5. 피부 자극 시험
(재) 대구테크노파크 한방산업지원센터에 의뢰하여 트리코데르마 아트로비리데 상등액의 인체피부 일차자극시험을 진행하였다. 국제접촉피부염연구회(ICDRG)의 판정기준과 화장품협회(PCPC)의 안전성 가이드라인을 응용하여 평가를 진행하였다. 평가 부위에 이상이 없는 성인 30명을 대상으로 하였다. 모든 대상자에 대해 트리코데르마 아트로비리데 배양 상등액을 24시간 첩포하고 첩포 제거 후 0.5시간, 24시간, 48시간 후에 나타나는 피부증상을 관찰하였다. 피부 자극 정도는 CTFA(The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association) 안전성 평가 가이드라인을 반영한 기준에 따라 판정하였다.
상기와 같이, 트리코데르마 아트로비리데 상등액의 인체피부 일차자극시험을 진행한 결과 20대 5명, 30대 11명, 40대 4명, 50대 9명, 60대 1명의 모든 연령대에서 첩포전과 0.5시간, 24시간, 48시간 첩포 시 홍반, 발진, 각질, 부종 등에서 변화를 일으키지 않아 무자극(No irritancy)로 판정되었다.
실험예 6. 트리코데르마 아트로비리데 배양 상등액의 항균 활성
트리코데르마 아트로비리데 배양 상등액의 항균 활성은 Escherichia coli, Bacillus cereus, Streptococcus iniae, Salmonella galinarum 그리고 Salmonella typhymurium을 이용하여 microtiter plate 방법으로 MIC (minimal inhibitiory concentration) 분석을 통해 확인하였다 항균 분석을 위해 overnight(O/N)으로 전 배양된 균주는 10^6 CFU/mL로 조정하여 실험에 사용하였다.
MIC 분석에 사용된 트리코데르마 아트로비리데 배양 상등액은 2.5%, 5%, 12.5%, 25%, 50%로 조절하였고, 반응액을 96 well microtiter plate 첨가하여 37℃에서 16시간 배양한 후 microtiter reader (Multiscan GO, Thermo Scientific Co. Ltd., Rochester, NY, USA)로 600nm에서 흡광도를 측정하였다.
상기와 같이, 트리코데르마 아트로비리데 배양 상등액의 병원성 균주 5종 A~E의(Escherichia coli, Bacillus cereus, Streptococcus iniae, Salmonella galinarum, Salmonella typhymurium)에 대하여 항균활성을 평가하기 위하여, microtiter plate 방법으로 minimal inhibitiory concentration(MIC) 분석을 통해 실시한 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 트리코데르마 아트로비리데 배양 상등액은 E. coli를 포함한 모든 균주에서 항균활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC18858P
수탁일자 : 20201029
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시의 태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
Claims (5)
- 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride) 균주 배양 추출물을 포함하는, 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 트리코데르마 아트로비리데 균주는 기탁번호 KCTC 18858P의 트리코데르마 아트로비리데 sw-1(Trichoderma atroviride sw-1) 균주인, 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물. - 제1항 또는 제2항에 기재된 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물을 포함하는, 탈모 예방 또는 발모 개선용 외용제 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 기재된 탈모 예방 또는 발모 개선용 조성물을 포함하는, 탈모 예방 또는 발모 개선용 화장료 조성물.
- i) 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride) 균주를 1 내지 10일 동안 배양하는 단계;
ii) 배양된 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양물의 상등액을 얻는 단계; 및
iii) 배양된 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양물의 상등액을 첨가하는 단계;를 포함하는, 탈모 예방 또는 발모 개선용 외용제 조성물의 제조 방법.
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