CN103374527B - 一种哈茨木霉Sch234菌株及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种哈茨木霉Sch234菌剂及制备方法和应用，其步骤：（1）先将哈茨木霉菌株Sch234在PDA平板上于活化，再接种到PDA斜面培养，加入灭菌去离子水，制备孢子悬浮液，添加吐温-20，使孢子悬浮液中的吐温-20的终浓度为0.025%，调整使孢子悬浮液浓度达到1.5×10⁶/ml；（2）将干培养料燕麦片和谷壳混匀，加入水，高压蒸汽灭菌；（3）将制备的孢子悬浮液按10ml/袋的比例接种培养料，培养；晾干粉碎即得菌剂。本发明哈茨木霉菌株Sch234对水稻纹枯病菌和核盘菌的菌丝和菌核均有强烈的寄生作用，生防菌剂在田间栽培条件下，对水稻纹枯病的防效达到了83%，土壤处理的施药方法简单，节约劳动力，并且具有生物农药对人畜安全。

Description

一种哈茨木霉Sch234菌株及制备方法和应用

技术领域

本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及一种用于水稻纹枯病和油菜菌核病生物防治的菌株茨木霉Sch234菌株，同时还涉及一种生防菌哈茨木霉Sch234菌剂的制备方法，还涉及一种哈茨木霉Sch234菌株在制备治疗或预防水稻纹枯病和油菜菌核病药物中的应用。

背景技术

植物在生长过程中会感染多种病害，使产量和质量受到不同程度的降低。引起植物病害的病原菌绝大多数为真菌，它们造成85％以上植物病害，如水稻的稻瘟病、纹枯病、小麦锈病、白粉病、油菜菌核病等重要作物的危害最为严重的病害均由真菌引致。对于植物真菌病害，通常采用抗病品种、种子处理与化学药剂相结合的综合防治措施进行治理，此策略在多数真菌病害的防治中取得了令人满意的效果。但对一些特殊的病害，却难以奏效，如立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)引起的水稻纹枯病和核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的油菜菌核病等。此类病害防治的难题在于，首先，病原菌可以产生抗逆性极强的休眠结构-菌核，菌核在土壤中可以长期存活，难以防除；其次，对此两种病害，寄主群体中均没有可以利用的抗病种质资源；第三两种病害菌发生于作物生长中后期的茎秆，由于生长后期作物封行，人在田中行动不便，为化学农药的施用带来极大的困难，并且药剂难以到达发病部位-茎秆。针对此类对生产危害大、防治困难的病害，生物防治是极有潜力的防治途径。人们尝试使用多种生防真菌寄生土壤中存活的菌核，以降低病害的发生，如王艳丽尝试利用哈茨木霉TC₃和NF₉菌株防治水稻纹枯病(王艳丽等，植物保护细胞，2000，27(2)：97-101)、国内外多名学者报道、应用盾壳霉对油菜菌核病的防治作用(姜道宏等，华中农业大学学报，1996，15(3)229-232；Whipps&Gerlagh，Mycol Res，11：897-907；Jones et al，Mycol Res，2003，107，267-276；Li et al，Eur J Plant Pathol，2006，114，345-355)，营翠玲等初步研究了四种木霉对核盘菌的抑制作用(曹翠玲等，仲恺农业技术学院学报，2005，18(4)：21-24)等。本发明报道一株对水稻纹枯病和油菜菌核病均有显著防治效果的哈茨木霉菌株及其在病害防治水稻纹枯病和油菜菌核病中的应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，在于提供了一种生防菌哈茨木霉Sch234菌株，是分离筛选一种对油菜菌核病病菌核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)和水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)均具有显著寄生作用的生防菌株-哈茨木霉Sch234菌株。使用该菌株制备的菌剂防治大田水稻纹枯病，防治效果可以达到83％。使用微生物菌剂防治植物病害，消弱了化学药剂对环境的破坏以及人类身体健康的影响，可以实现农业、人类和环境的和谐、可持续发展。

本发明的另一个目的在于提供了一种生防菌哈茨木霉Sch234菌剂的制备方法，该方法原材料来源广，制备过程简单，产量高，分生孢子产量可以达到5.2×10¹⁰/g干培养料；制备工艺可以满足规模化生产以实现大田病害防治的需求。

本发明的再一个目的是在于提供了一种哈茨木霉Sch234菌株在制备治疗或预防水稻纹枯病和油菜菌核病药物中的应用，在水稻插秧前一个月，按每亩800g制备的菌剂拌细土撒施稻田，进行土壤处理，可以获得理想的发病效果；其优点在于省时省工，无需在水稻拔节后下稻田进行施药处理。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

一种哈茨木霉菌株的分离与获得，其步骤如下：

从四川省达州地区感染菌核病的油菜茎秆中采集核盘菌菌核，将菌核在无菌水中浸泡1min，然后半浸入灭菌的湿沙中，25℃孵育20天。将菌核上长出的真菌孢子在PDA平板上进行划线培养，并进行单孢纯化；根据形态学特征和ITS DNA序列进行鉴定。

一种哈茨木霉Sch234菌剂的制备方法，其步骤如下：

(1)先将哈茨木霉菌株Sch234在PDA平板上于26-30℃活化2-4d，再接种到PDA斜面，27-29℃培养4-6d，加入灭菌去离子水，制备孢子悬浮液，添加吐温-20，使孢子悬浮液中的吐温-20的终浓度为0.025％，调整使孢子悬浮液浓度达到1.5×10⁶/ml；

(2)将干培养料燕麦片(商购，含水量不超过8％)和谷壳(商购)以体积比为1∶1混匀，加入适量水使最终含水量至50％，装入长35cm、宽20cm的培养袋，800g/袋，121℃高压蒸汽灭菌29-31min；

(3)将制备的孢子悬浮液按10ml/袋的比例接种培养料，27-29℃培养6-8d；晾干粉碎即得菌剂；其中分生孢子含量为5.2×10¹⁰/g。

其中

所述的PDA培养基的组分及配方如下：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂10g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min；

本发明四川省达州地区感染菌核病的油菜茎秆中核盘菌菌核上分离筛选获得一种适用于油菜菌核病和水稻纹枯病防治的生防真菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌株Sch234，该菌株于2012年3月5日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(英文简称CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO：M2012055。

通过上述的制备方法获得了菌株，该菌株在PDA培养基上可以产生大量分生孢子，适宜的生长温度为25-30℃，适宜的生长pH值为5-6，对核盘菌和纹枯菌的菌丝和菌核有强烈的寄生能力，其发酵液和分生孢子悬浮液对油菜种子的萌发没有显著的抑制作用。

一种生防菌哈茨木霉Sch234菌株在制备治疗或预防水稻纹枯病和油菜菌核病药物中的应用，其步骤是：在水稻插秧前一个月，按每亩800g菌剂的用量拌细土撒施稻田，进行土壤处理，一月后，按正常操作栽培水稻。

申请人应用上述微生物菌剂对田间栽培条件下的水稻纹枯病进行了生物防治试验，达到了预期的效果，从而完成了本发明的任务。

与已有技术相比，本发明的积极效果是：

1.本发明哈茨木霉菌株Sch234对水稻纹枯病菌和核盘菌的菌丝和菌核均有强烈的寄生作用，实施例的研究表明，本发明的生防菌剂在田间栽培条件下，对水稻纹枯病的防效达到了83％；

2.本发明所提供的哈茨木霉菌株Sch234菌剂生产技术简单，土壤处理的施药方法简单，节约劳动力，并且具有生物农药对人畜安全的优点。

附图说明

图1.为一种哈茨木霉菌株Sch234分生孢子梗形态示意图。示树状分枝分生孢子梗，初级分枝与主轴成近90°，2～3个一组成漩涡状排列，次级分枝2～4个，也成漩涡状。瓶梗较短，成安瓿状，基部有明显的缢缩，中间膨大，顶部骤然变细；分生孢子球形或卵圆形。

图2.为一种温度对Sch234菌株生长的影响示意图。示25-30℃为其适宜的生长温度。

图3.为一种环境pH值对Sch234菌株生长的影响示意图。示pH5-6为其适宜的生长pH值环境。

图4.为一种哈茨木霉菌株Sch234对核盘菌菌核(A)及菌丝(B)的寄生作用示意图。A示Sch234菌株寄生半浸于灭菌湿沙中的核盘菌菌核；B示Sch234菌株菌丝(箭头所示)缠绕、寄生核盘菌的菌丝。

图5.为一种哈茨木霉菌株Sch234发酵液及孢子液对油菜种子萌发的影响。

图中A：无菌水对照；B：发酵液原液；C：发酵液稀释10倍；D：发酵液稀释20倍；E：发酵液稀释50倍；F：发酵液稀释100倍；G：10⁴/ml孢子液；H：10⁵/ml孢子液；I：10⁶/ml孢子液；J：10⁷/ml孢子液。

具体实施方案

在下面的实施例中，申请人研究了哈茨木霉菌株Sch234的形态学特征、生理生化特性和遗传学特性，验证了Sch234菌株对水稻纹枯病菌(Rizoctonia solani)和油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)菌核的寄生作用，对该菌株进行发酵培养，同时将制备的生防菌剂进行水稻纹枯病的田间防治试验，确定了其对水稻纹枯病的防治作用。

实施例1：

一种哈茨木霉Sch234菌剂的制备方法，其步骤如下：

(1)先将保藏号为CCTCC NO：M2012055的哈茨木霉菌株Sch234在PDA平板上于26或27或28或29或30℃活化2或3或4d，再接种到PDA斜面，27或28或29℃培养4或5或6d，加入灭菌去离子水，制备孢子悬浮液，添加吐温-20，使孢子悬浮液中的吐温-20的终浓度为0.025％，调整使孢子悬浮液浓度达到1.5×10⁶/ml；

(2)将干培养料燕麦片(商购，含水量不超过8％)和谷壳(商购)以体积比为1∶1混匀，加入适量水使最终含水量至50％，装入长35cm、宽20cm的培养袋，800g/袋，121℃高压蒸汽灭菌29或30或31min；

(3)将制备的孢子悬浮液按10ml/袋的比例接种培养料，27或28或29℃培养6或7或8d；晾干粉碎即得菌剂；其中分生孢子含量为5.2×10¹⁰/g。

其中

所述的PDA培养基的组分及配方如下：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂10g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min。

菌株的分离及鉴定

1、菌株的分离地点及分离方法

本发明的一株适用于水稻纹枯病和油菜菌核病防治的生防真菌哈茨木霉菌株Sch234分离筛选于四川省达州地区感染菌核病的油菜茎秆中采集的核盘菌菌核。具体方法如下：从四川省达州地区感染菌核病的油菜茎秆中采集核盘菌菌核，将菌核在无菌水中浸泡1min，然后半浸入灭菌的湿沙中，25℃孵育20天。将菌核上长出的真菌孢子在PDA平板上进行划线培养，挑取并观察单菌落形态。该菌株已于2012年3月5日送交用于专利程序保藏的位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCCNO：M2012055。

2、菌株菌学特征

(1)哈茨木霉菌株Sch234形态学：

在PDA培养基上的形态观察，按照张天宇等(中国真菌志(第十六卷)链格孢属，北京，科学出版社，2003)滤纸片法进行，剪取与载玻片大小的滤纸片，在滤纸片的中央剪出一个长2cm宽5cm的方孔。将滤纸片和载玻片于121℃高压灭菌30min，将灭菌后的滤纸片用无菌蒸馏水湿润后贴在载玻片上。从PDA平板上28℃培养2d的木霉菌株边缘挑取菌丝块，用接种针将其均匀涂在方孔边缘的滤纸片上。将载玻片置于铺有吸水纸的无菌培养皿中，28℃保湿培养，2天即可产生分生孢子，同时菌落变成深绿色。无明显气味或者有微弱的土腥味。分生孢子梗成树状分枝，初级分枝与主轴成近90°，2～3个一组成漩涡状排列，次级分枝通常2～4个，也成漩涡状。瓶梗较短，成安瓿状，基部有明显的缢缩，中间膨大，顶部骤然变细；分生孢子球形或卵圆形(见图1)。

该菌株的保存按周德庆主编的《微生物学实验技术手册》，上海科学技术出版社，1986版介绍的方法操作。

(2)菌株的遗传学特性：

将菌株接种在铺有玻璃纸的PDA平板上，28℃培养1d后刮取菌丝。

取上述菌株Sch234接种在铺有玻璃纸的PDA平板上，28℃培养24h，刮取菌丝。采用CTAB法提取菌株的DNA，参考Sambrook等(1989)。具体步骤如下：称取0.2g菌丝在液氮中研磨成粉末，转入1ml 65℃预热的抽提缓冲液(0.01M Tris-HCl，pH8.0；2％CTAB，W/V；1.4M NaCl，121℃灭菌30min)，65℃温育5～8min，每2min颠倒混匀；加入等体积的苯酚/氯仿(1/1)，振荡器上充分混匀，12,000rpm离心10min，取上清，加入等体积的氯仿再抽提一次；12,000rpm离心15min，取上清，加入0.1倍体积的3M醋酸钠溶液和0.6倍体积的异丙醇轻轻混匀，-20℃静置沉淀30min，12,000rpm离心15min，弃上清，将沉淀用70％(体积比)乙醇洗两遍，置37℃温箱干燥后，加入适量20μl TE溶解，-20℃保存。以真菌ITS通用引物ITS1(5’TCCGTA GGT GAA CCT GCG G 3’)和ITS4(5’TCC TCC GCT TATTGA TAT GC 3’)(White et al.，1999)为引物，上述DNA为模板，对菌株Sch234的ITS rDNA进行PCR扩增。

PCR采用25μl的反应体系：ddH₂O 19.8ul，10mM的10×buffer(含MgCl₂)2.5ul，2.5mM dNTP 0.5μl，10μM的引物ITS10.5μl，10μM的引物ITS40.5μl，Taq酶1U(5U/ul)，DNA模板(50ng/μl)1μl。

反应程序：(1)94℃3min；(2)94℃40s，54℃30s，72℃1min，循环35次；(3)72℃1min延伸。(4)4℃下保存。

应用回收试剂盒将PCR产物回收并连接到pMD18-T(购自TaKaRa公司，中国大连)上进行序列测定。测序后的序列见序列表SEQ ID NO：1。将测序结果与GenBank(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)中已知的ITS rDNA序列进行同源性比较，发现与哈茨木霉Hypocrealixii(序列登录号：GU934533)同源性达到100％，结合菌株菌落形态及分生孢子梗形态等，将菌株Sch234鉴定为哈茨木霉(Trichodermaharzianum即Hypocrea lixii)。

实施例2：本发明的菌株Sch234生物学特性研究

1、温度对Sch234菌株生长的影响

将Sch234接种在PDA培养基上，28℃培养1d后，用打孔器(直径为5mm)从菌落边缘打取带菌丝块，将其转接于含有20ml PDA的培养皿(直径为90mm)中央，分别置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃培养，采用十字交叉法，每隔12小时测量其菌落直径，每个处理设置3个重复。结果见图2，表明Sch234菌株在25℃和30℃条件下生长最快，为适宜的生长温度，20℃其次，10℃、15℃、35℃的生长速度较慢，5℃时不能生长。

2、pH值环境对Sch234菌株生长的影响

pH3-pH5PDA培养基的配制方法为：将PDA培养基灭菌后以灭菌的柠檬酸和柠檬酸钠缓冲液分别调节pH分别为3、4、5；pH6～pH11 PDA的配制方法为：先配制普通的PDB，然后用pH8.8的Tris-HCl溶液、1M的NaOH和浓盐酸调节pH分别为6、7、8、9、10、11，然后加入琼脂粉，比例为10g/1000ml，121℃灭菌30min即可。

将Sch234接种在PDA培养基上，28℃培养1d后，用打孔器(直径为5mm)从菌落边缘打取带菌丝块，将其转接于含有20ml不同pH值的PDA的培养皿(直径为90mm)中央，30℃培养。十字交叉法每隔12小时测定其菌落直径。结果见图3，表明Sch234菌株在pH3～11环境下均可生长，pH5～6时生长速度最快，pH11时生长速度最慢，在酸性条件下的生长速度显著高于碱性条件下的生长速度，表示该菌株偏好酸性环境。

实施例3：本发明的菌株Sch234寄生菌核能力研究

1、Sch234寄生核盘菌菌丝能力的测定

自活化的哈茨木霉Sch234菌株、核盘菌Ep-1PNA367菌株(Liuet al，Journal of Virology，2009，1981-1991)和纹枯菌WH-1菌株(Xieet al，BMC Evolutionary Biology，2008，8：87)边缘，用5mm的打孔器打取菌丝块，将二者的菌丝块接种在铺有玻璃纸的PDA平板上，之间相距5cm，20℃培养。对峙培养24h后，Sch234与核盘菌和纹枯菌的菌丝相接触；36h后可以观察到明显的寄生现象，Sch234菌丝遇到核盘菌和纹枯菌的菌丝与其平行生长，同时朝菌丝方向形成特殊的分枝，并产生环状结构，进行寄生，图4显示Sch234菌株对核盘菌菌丝的寄生。

2、Sch234寄生菌核能力的测定

在铺有玻璃纸的PDA平板上接种Sch234的菌丝块，培养5d后，收集孢子；用无菌水将各菌株的孢子稀释为10⁶孢子/ml的孢子悬浮液。取大小均匀一致的核盘菌Ep-1PNA367菌核(Liu et al，Journal ofVirology，2009，1981-1991)和纹枯菌WH-1菌株(Xie et al，BMCEvolutionary Biology，2008，8：87)的菌核，70％(体积比)乙醇消毒5min，然后用无菌水洗3次，将菌核在Sch234的悬浮液中浸泡30min，后半浸入装有灭菌细沙的培养皿中，每皿沙盘放菌核8～10粒，设3个重复。20℃培养30d后，记录Sch234对菌核的寄生致腐作用。

菌核腐烂程度分级如下：0级，菌核表面无Sch234菌丝；1级，菌核表面有Sch234菌丝，但无大量的分生孢子梗；2级，菌核表面有大量的分生孢子梗，但表层不腐烂；3级，菌核表层腐烂、内部变色变软；4级，整个菌核糜烂。按病情指数计算公式来计算菌核腐烂指数(姜道宏等，华中农业大学学报，1996，15(3)：229-232)。

菌核病情腐烂指数＝∑(菌核病级株数×病级代表数值)/(菌核数总和×发病最重级的代表数值)

结果见图4，Sch234菌株对核盘菌和纹枯菌的菌核均有极强的寄生能力，30天后对核盘菌和纹枯菌菌核的腐烂指数均达到了100％。

实施例4：本发明的菌株Sch234对油菜萌发的影响

将活化的菌株Sch234菌丝块接种于含有100ml PDB培养基的三角瓶中，每个三角瓶中接种1块。28℃，150rpm摇培5d，细菌过滤器过滤后获得菌株发酵液，分别稀释10、20、50和100倍。制备浓度分别为10⁴、10⁵、10⁶、10⁷的孢子悬浮液。每稀释度发酵液和每浓度孢子液分别取20ml分别装入150ml的小三角瓶中，挑选大小一致的油菜(中油821)种子，每三角瓶中90颗，将三角瓶置于25℃摇床，50rpm处理24h，将种子和孢子液转入铺有滤纸片的无菌培养皿中，每个培养皿30颗种子，每处理设置3个重复，置于28℃恒温箱中培养，48h后测量种子的发芽率以及萌芽种子鲜重。结果表明各稀释浓度的发酵液和各浓度的孢子液对油菜的萌发均没有显著的抑制作用(见表1和图5)。

表1Sch234菌株孢子液对油菜萌发的影响

实施例5：本发明的菌株Sch234水稻纹枯病大田防效试验

为了验证本发明的菌株Sch234菌剂的防病效果，申请人选择湖北省大冶市金湖街道办事处栖杆村二组陈春生的面积为800m²的机插水稻田(鄂汕杂1号)，进行水稻纹枯病的田间防治试验。

试验药剂：本发明实施例5制备的菌株Sch234菌剂，分生孢子含量为5.2×10¹⁰/g；

试验设计：哈茨木霉菌剂在插秧前一个月施用，每亩800g拌细土撒施稻田，设3个重复，每重复133.4m²，对照设3个重复，同等面积；

取样及调查方法：于水稻黄熟期调查纹枯病的发生情况。每处理的每次重复对角线5点取样，每点调查相邻5蔸，共调查25蔸。根据以下水稻纹枯病的分级标准调查各个处理水稻纹枯病的病情，计算病株率和病情指数。

水稻纹枯病的分级标准：

0级：全株无病；

1级：第四叶片及其以下各叶鞘、叶片发病(以剑叶为第一叶片)；

3级：第三叶片及其以下各叶鞘、叶片发病(以剑叶为第一叶片)；

5级：第二叶片及其以下各叶鞘、叶片发病(以剑叶为第一叶片)；

7级：剑叶叶片及其以下各叶鞘、叶片发病(以剑叶为第一叶片)；

9级：全株发病，提早枯死。

病株率(％)＝病株数/调查总株数×100％

病情指数＝∑[病级数×该级病株数]/(调查总数×最高病级数)×100

相对防效(％)＝(无菌水处理病情指数-处理病情指数)/无菌水处理病情指数×100％

试验结果见表2，本发明的哈茨木霉Sch234菌剂在插秧前施用处理土壤，对水稻纹枯病的平均防治效果达到了83％，并且该施药方法简单，操作简便，节约劳动力。

表2哈茨木霉Sch234菌剂防治水稻纹枯病病情调查统计表

SEQUENCE LISTING

 

<110>  华中农业大学

 

<120>  一种哈茨木霉Sch234菌株及制备方法和应用

 

<130>  一种哈茨木霉Sch234菌株及制备方法和应用

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  574

<212>  DNA

<213>  哈茨木霉

 

<400>  1

ccaaacccaa tgtgaacgtt accaaactgt tgcctcggcg ggatctctgc cccgggtgcg     60

 

tcgcagcccc ggaccaaggc gcccgccgga ggaccaacca aaactctttt tgtatacccc    120

 

ctcgcgggtt ttttataatc tgagccttct cggcgcctct cgtaggcgtt tcgaaaatga    180

 

atcaaaactt tcaacaacgg atctcttggt tctggcatcg atgaagaacg cagcgaaatg    240

 

cgataagtaa tgtgaattgc agaattcagt gaatcatcga atctttgaac gcacattgcg    300

 

cccgccagta ttctggcggg catgcctgtc cgagcgtcat ttcaaccctc gaacccctcc    360

 

ggggggtcgg cgttggggat cggccctccc ttagcgggtg gccgtctcct aaatacagtg    420

 

gcggtctcgc cgcagcctct cctgcgcagt agtttgcaca ctcgcatcgg gagcgcggcg    480

 

cgtccacagc cgttaaacac ccaacttctg aaatgttgac ctcggatcag gtaggaatac    540

 

ccgctgaact taagcatatc aataagcgga ggaa                                574

 

Claims (5)

1.一种哈茨木霉Sch234菌株，其特征在于：菌株为哈茨木霉（Trichoderma harzianum）Sch234，CCTCC NO：M2012055。

2.权利要求1所述的一种哈茨木霉Sch234菌剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）先将哈茨木霉菌株Sch234在PDA平板上于26－30℃活化2－4d，再接种到PDA斜面，27－29℃培养4－6d，加入灭菌去离子水，制备孢子悬浮液，添加吐温-20，使孢子悬浮液中的吐温-20的终浓度为0.025%，调整使孢子悬浮液浓度达到1.5×10⁶/ml；

（2）将干培养料燕麦片和谷壳以体积比为1：1混匀，加入水使最终含水量至50%，装入长35cm、宽20cm的培养袋，800g/袋，121℃高压蒸汽灭菌29-31min；

（3）将制备的孢子悬浮液按10ml/袋的比例接种培养料，27-29℃培养6-8d；晾干粉碎即得菌剂；其中分生孢子含量为5.2×10¹⁰/g。

3.根据权利要求2所述的一种哈茨木霉Sch234菌剂的制备方法，其特征在于：所述的PDA培养基的组分及配方如下：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂10 g，补充蒸馏水至1000 ml，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30 min。

4.权利要求1所述的一种哈茨木霉Sch234菌株在制备治疗或预防水稻纹枯病药物中的应用。

5.权利要求1所述的一种哈茨木霉Sch234菌株在制备治疗或预防油菜菌核病药物中的应用。