CN102899280B

CN102899280B - 枯草芽孢杆菌has及其在防治甘蔗黑穗病中的应用

Info

Publication number: CN102899280B
Application number: CN 201210452707
Authority: CN
Inventors: 熊国如; 伍苏然; 张树珍; 杨本鹏; 冯翠莲; 蔡文伟; 王俊刚; 王文治
Original assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2012-11-14
Filing date: 2012-11-14
Publication date: 2013-08-21
Anticipated expiration: 2032-11-14
Also published as: CN102899280A

Abstract

本发明涉及一株枯草芽孢杆菌HAS及其在防治甘蔗黑穗病中的应用，该菌株命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS，已于2012年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.6590。本发明所提供的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS的用途是其在防治甘蔗黑穗病中的应用，盆栽试验表明，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS对甘蔗黑穗病的发生有很好的抑制作用，通过浸种，其防效可达100%，表明该菌株是一株在防治甘蔗黑穗病菌上具有潜在意义的生防菌株。

Description

枯草芽孢杆菌HAS及其在防治甘蔗黑穗病中的应用

技术领域

本发明属微生物技术领域，涉及一株菌株及其应用，具体是一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS及其在防治甘蔗黑穗病中的应用。

背景技术

甘蔗黑穗病最早是在1877年南非纳塔尔被发现，随后在其它国家、地区也相继有该病害发生的报道。中国于1932年在广州发现该病害，之后各地也都出现该病。近年来，随着蔗种无性繁殖栽培技术的推广，蔗种频繁引进调运，蔗田长期连作同一品种以及宿根蔗年限的逐渐延长，造成甘蔗黑穗病在我国广西、云南、广东、福建、海南等省蔗区发生日趋严重，造成的损失多达10-30%，严重的甚至导致宿根蔗几乎绝收。

甘蔗黑穗病是由Ustilago scitaminea Sydow. （属担子菌纲黑粉菌属）引起的一种真菌病害，该病菌营养菌丝无色，具分隔分枝功能，在甘蔗的分生组织细胞中生长，菌丝成熟后，形成厚膜孢子堆（冬孢子）。甘蔗黑穗病最明显特征是病蔗梢头具一条向下卷内的黑色鞭状物，长几厘米至数十厘米不等，鞭中央是由薄壁组织或维管束组织构成的心柱，外围包着一层厚垣孢子。染病蔗株的黑穗长短因品种而异，短为几厘米，直或弯曲，长至几十厘米，向下弯曲成圈，有些品种可达1米多。在适宜的环境条件下，感染蔗株在病菌侵染2-4个月开始形成黑穗，在病菌侵染6-7个月黑穗长度可达到顶峰。

甘蔗黑穗病危害严重，但对其的防治效果不理想。目前，控制甘蔗黑穗病的措施主要有抗病品种、轮作、人工拔除发病蔗株、温水处理种蔗及种苗消毒等。生产上栽培的甘蔗品种抗病性较差，有限的抗性基因材料也相当缺乏，而且该病菌致病性存在分化，即有生理小种分化，致使同一抗病品种在一地抗病，在另一地抗性较差。有效的防治措施——轮作却因为对于甘蔗这一作物却难以实施，一是甘蔗种植一般为新植一年，宿根2年或更长，二是甘蔗主要在我国南部热带、亚热带地区生长，多栽种在山地、坡地和旱地，适宜轮作的作物范围有限，因此，轮作很难被完全采用。常用的化学防治（种苗消毒）对新植蔗有一定的防治效果，但随着甘蔗宿根时间的延长，病害的发生越来越严重。

生物防治因对环境友好和易于使用而在其它作物病害上已部分地发挥作用，但用于甘蔗黑穗病病害的防治一直停滞不前。国内外也有利用微生物对甘蔗黑穗病菌孢子进行防治的报道。国外，Sinha和Singh报道四种真菌（Fusarium moniliforme [Gibberella fujikuroi]var. subglutinans, Aspergillus niger, A.flavus and Penicillium sp.）具有对甘蔗黑穗病的黑鞭的产生和对冬孢子萌发的抑制作用。国内，广西大学廖咏梅等采集甘蔗苗期、生长期的甘蔗土壤、健株及病株的种蔗、叶、茎、芽、根和土壤中分离筛选到一些对黑穗病菌有抑制作用的菌株，并利用相关基因序列设计特异性引物，探讨得到相关抑制因子的基因。但未见用生物防治措施有效控制黑穗病的系统报道。

经检索，尚未见到利用微生物及其生防制剂成功用于防治甘蔗黑穗病的报导。

发明内容

本发明的目的是提供一株枯草芽孢杆菌HAS及其在防治甘蔗黑穗病中的应用。

一株枯草芽孢杆菌菌株，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS，已于2012年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号：CGMCC NO.6590。

本发明所提供的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS菌株，分离自我国海南省蔗区的甘蔗根际土壤，经形态学、培养性状、常规生理生化和16S rDNA序列鉴定，该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的一个新菌株，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS。

本发明所提供的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS的基本生物学特性为：革兰氏阳性短杆菌，菌体大小约0.7～0.9×1.8～2.4μm之间，产生芽孢，芽孢中生，圆形，周生鞭毛、具运动性。在LB培养基上初期菌落浅白色，圆形，表面湿润，脓状，难挑起；后期菌落淡黄色，边缘不整，表面褶皱，挑起褶皱带起脓状丝。

本发明所提供的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS的用途是其在防治甘蔗黑穗病中的应用。

以本发明所提供的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS为活性成分的生物制剂也属本发明的保护范围。需要的时候，该制剂可以包含生物制剂制备的常用载体和辅料。

本发明通过盆栽试验的方法研究枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS对黑穗病菌孢子的抗性，实验结果表明枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS对甘蔗黑穗病的发生有很好的抑制作用，通过浸种，其防效可达100%。表明该菌株是一株在防治甘蔗黑穗病菌上具有潜在意义的生防菌株。

本发明通过对蔗区甘蔗根际土壤中微生物的筛选分离，获得枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS，经过盆栽试验表明该菌株对甘蔗黑穗病的发生有很好的抑制作用，可以有效地控制甘蔗黑穗病的发生，减少损失，是一株在防治甘蔗黑穗病菌上具有潜在意义的生防菌株，为我国甘蔗产业的发展提供帮助。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。

实施例一、

植物病原真菌拮抗菌的筛选及其鉴定

菌株筛选：称取5克根际土壤（我国海南省临高县甘蔗黑穗病发生严重的地块中甘蔗植株的根际土壤），放入有100ml无菌水的三角瓶中，在摇床上剧烈振荡30min后，静置15min。取1ml稀释至10^-4、10^-5、10^-6浓度梯度，从各浓度梯度悬浮液中取0.1ml，用无菌涂棒涂于LB培养基（配方为：每升含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂粉12g，pH7.0～7.2）平板上，30℃恒温培养箱倒置培养，连续观察3天，挑取菌落形态不同的菌株再次划线纯化保存备用。在倒好的PDA平板表面涂布甘蔗黑穗病菌冬孢子，在超净工作台内晾干后，用无菌牙签点接筛选纯化后的菌株进行对峙培养，筛选抑菌作用最强（抑菌活性最强）的菌株，结果得到一株对甘蔗黑穗病菌有很强拮抗作用的菌株，将该菌株命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS。已于2012年 9月 19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.6590。

菌株的基本生物学特性：革兰氏阳性短杆菌，菌体大小约0.7～0.9×1.8～2.4μm之间，产生芽孢，芽孢中生，圆形，周生鞭毛、具运动性。在LB培养基上初期菌落浅白色，圆形，表面湿润，脓状，难挑起；后期菌落淡黄色，边缘不整，表面褶皱，挑起褶皱带起脓状丝。

菌株16S rDNA保守序列的测定：将筛选得到的菌株（枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS）的基因组DNA为模板，以细菌16S rDNA序列通用引物P₀、P₆作为引物，PCR扩增出约1.5kb左右的产物片段，测序结果表明扩增出的序列长度为1518个碱基；将该序列通过互联网比对( http: / /www. ncbi.nlm. nih. gov/blast/B last. cgi) , 扩增的片段序列与枯草芽孢杆菌的16S rDNA 部分序列的同源性达99%以上，确定该菌株归属为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

实施例二、

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS对甘蔗盆栽苗黑穗病防效的测定

以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS为菌种培养得到生物制剂（以下为重量百分比）：

1、固体培养：将处于保藏状态的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS接种于固体培养基（1%胰蛋白胨，0.5%酵母萃取物，1%NaCl，1.2%琼脂粉，pH7.0.）中，于37℃培养箱中培养1天，使菌株活化。

2、液体培养：将活化的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS接种于装有液体培养基（黄豆粉2.0%，玉米粉1.0%，蔗糖0.5%，蛋白胨0.3%，CaCO₃ 0.2%，(NH₄)₂SO₄ 0.05%，MgSO₄ ^.7H₂O 0.02%，KH₂PO₄ 0.1%,NaOH 0.05%，花生油0.2%，消泡剂0.02%，pH6.8-7.2.）的500ml三角瓶中，每瓶装200ml，在37℃下，转速170rpm的摇床上培养36h，得到液态生物制剂（生防菌液一）。或将上述培养液接至发酵罐中进行发酵生产，获得液态生物制剂（生防菌液二）。

盆栽甘蔗黑穗病防效试验：利用远离甘蔗田的土壤拌入采集到的黑穗病菌孢子，使土壤含菌量达到10⁶/克，然后装入塑料盆（上直径30cm，下直径20cm，高30cm）。种茎来自健康种苗基地，经PCR抽样检测没有检测到含有黑穗病菌。

试验设4个处理，4次重复，每重复5盆，每个盆内植入单芽种茎4段。处理1用生防菌液一稀释10倍液浸泡种茎10分钟，处理2用生防菌液二稀释100倍液浸泡种茎10分钟，处理3用生防菌液一稀释500倍液浸泡10分钟，处理4为对照，用清水浸泡种茎10分钟，之后分别植入上述塑料盆中，浇入清水后进行试验，其后所有管理一样。一个月后统计出苗情况，6个月时统计各处理重复的发病株数（以抽出可以观察到黑穗鞭为准），计算发病率及防治效果，结果见表1。

发病率（%）=发病总株数/出苗总株数×100

防治效果（%）=（对照组发病率-处理组发病率）/对照组发病率×100

表一枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS对甘蔗盆栽苗黑穗病的防治效果

由上表看出，该菌株经发酵培养制备的生物制剂对甘蔗黑穗病的发生有很好的控制作用，通过浸种，其防效可达100%。表明该菌株是一株防治甘蔗黑穗病菌的有潜在意义的生防菌株。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一株枯草芽孢杆菌菌株，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS，已于2012年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.6590。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS在防治甘蔗黑穗病中的应用。

3.一种防治甘蔗黑穗病的生物制剂，其活性成分为权利要求1所述的保藏编号为CGMCC NO.6590的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS。