CN104593288B - 一种防治甘蔗黑穗病的生防菌株zhr0及其应用 - Google Patents

一种防治甘蔗黑穗病的生防菌株zhr0及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种菌株，所述菌株为Bacillus amyloliquefaciens ZHR0菌株，并且所述Bacillus amyloliquefaciens ZHR0菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2014577。本发明还公开了一种ZHR0生防菌剂的制备方法，试验表明，由所述制备方法而得的ZHR0生防菌剂对甘蔗黑穗病的防治效果达到53.98％，表明所述Bacillus amyloliquefaciens ZHR0菌株对甘蔗黑穗病的防治具有很好的效果。

Description

一种防治甘蔗黑穗病的生防菌株ZHR0及其应用
技术领域
本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种防治甘蔗黑穗病的生防菌株ZHR0及其应用。
背景技术
甘蔗黑穗病(sugarcane smut)是由甘蔗鞭黑粉菌(Ustiliago scitamineaSydow)引起的一种真菌性病害，1877年在南非纳塔尔首先报道，该病现已成为重要的世界流行病害。染病的种蔗导致萌芽早，分蘖增多，叶片狭窄，淡绿色，蔗茎细小。甘蔗黑穗病典型的症状是在病蔗梢部产生一个长而不分枝的黑色鞭状物(称为黑穗鞭)，长短不一，短的直或稍弯曲，长的向下卷曲。黑穗鞭中心为一条由薄壁组织或维管束组织构成的心柱，心柱外面附着一层黑色的冬孢子，冬孢子成熟后，薄膜破裂，大量黑色粉状的冬孢子随气流飘散。
黑穗病直接降低蔗茎产量，同时降低蔗糖分，严重影响品质，因此甘蔗黑穗病被称为甘蔗的“癌症”。目前，中国甘蔗主栽品种普遍感染黑穗病，田间发病率超过10％，有的田块甚至超过50％，经济损失严重，严重制约了甘蔗产业的发展。
甘蔗黑穗病菌属真菌中的担子菌亚门黑粉菌属甘蔗鞭黑粉菌，Ustiliagoscitaminea Sydow病菌从甘蔗的芽或幼芽的幼嫩分生组织侵入，是一种典型的茎寄生病害，属于系统性寄生病害。虽然对甘蔗黑穗病的认识较早，但对病害的防治一直没有稳定而有效的措施。传统的防治方法如改善栽培措施、蔗种消毒、化学防治、选用抗病品种等。传统育种法很难筛选到高抗基因，而且难以克服抗病性和产量质量性状之矛盾；系统性病害用化学药物难以控制，而且化学防治中病菌易产生抗药性，造成环境污染。因此许多病害尤其是一些土传病害、系统性病害的生物防治和拮抗菌的利用引起了国内外的高度重视。
发明内容
本发明的目的是提供一种防治甘蔗黑穗病的生防菌株ZHR0，对甘蔗产业危害较大的黑穗病进行生物防治。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种菌株，所述菌株为Bacillus amyloliquefaciens(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)ZHR0菌株，并且所述Bacillus amyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2014577。
保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2014年11月24日。
所述Bacillus amyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)菌株在防治甘蔗黑穗病的应用。
所述Bacillus amyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)菌株的筛选方法，包括以下步骤：
(1)取数株甘蔗叶片放入灭菌塑料袋中迅速带回实验室，取5～20g甘蔗叶片经过消毒灭菌处理后剪碎放入灭菌的三角瓶中，加50～200ml无菌水，灭菌玻璃珠5～20g，于摇床上150-180rpm振荡20～45min后，静置5～15min；
(2)吸取上清液稀释至10-4、10-5、10-6三个梯度，从三个梯度稀释液中各吸取0.05～0.2mL液体分别接种在LB固体培养基上，28～32℃恒温培养三天，每个梯度重复三次，根据培养基上菌落大小和形态分离纯化并保存菌种。
一种ZHR0生防菌剂的制备方法，将所述Bacillus amyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)菌株接种在LB液体培养基上，100～300rpm振荡培养12-16h，用灭菌水稀释至活菌总浓度为1×109-1×1010CFU/ml，得到ZHR0生防菌剂。
与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：
本发明得到一种Bacillus amyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)菌株，并通过对峙培养试验和温室桶栽实验证明所述Bacillus amyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)菌株具有较好的防治甘蔗黑穗病的效果，防效可达50％以上。
具体实施方式
实施例1
所述Bacillus amyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)菌株是2013年9月份在甘蔗叶片中分离得到的一株解淀粉芽孢杆菌。
一种菌株的筛选方法，所述菌株为Bacillus amyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)菌株，该方法包括以下步骤：
(1)取数株甘蔗叶片放入灭菌塑料袋中迅速带回实验室，取5g甘蔗叶片经过消毒灭菌处理后剪碎放入灭菌的三角瓶中，加50ml无菌水，灭菌玻璃珠5g，于摇床上150-180rpm振荡30min后，静置10min；
(2)吸取上清液稀释至10-4、10-5、10-6三个梯度，从三个梯度稀释液中各吸取0.1mL液体分别接种在LB固体培养基上，30℃恒温培养三天，每个梯度重复三次，根据培养基上菌落大小和形态分离纯化并保存菌种。
所述Bacillus amyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)菌株的基本生物学特性为：革兰氏染色阳性，菌体杆状，芽孢卵圆形，最适生长温度28-32℃，最适生长PH6.0-7.0。
通过16S rDNA测序及NCBI比对，所述Bacillus amyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)菌株的16S rDNA序列与解淀粉芽孢杆菌的同源性达到99％。
将所述Bacillus amyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2014577。
实施例2
所述Bacillus amyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)与甘蔗黑穗病菌的第一组对峙培养试验，具体方法如下：
先在含PDA培养基的平板底部中央处画两条相互垂直的直线，用灭菌枪头吸取5ul在LB液体培养基上过夜培养的所述Bacillus amyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)菌株接种在平板中心；再吸取5ul甘蔗黑穗病菌液(1X106CFU/ml，正负担孢子1:1)沿两条垂直线滴于距中心2cm处，置于28℃培养箱中培养3天。平板中心的菌落为所述Bacillus amyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)菌株，四周为甘蔗黑穗病菌的四个菌落。
由甘蔗黑穗病菌的菌落形状能够看出黑穗病菌在接近ZHR0一侧生长受到明显抑制，这表明所述Bacillus amyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)菌株在PDA培养基平板上具有对甘蔗黑穗病较强的拮抗作用。
本实施例中，所述PDA培养基的主要成分为马铃薯浸粉、葡萄糖和琼脂，购于Hopebiol，青岛；所述LB液体培养基的主要成分为酵母粉、胰蛋白胨和氯化钠，购于Sangon，上海。
实施例3
所述Bacillus amyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)与甘蔗黑穗病菌的第二组对峙培养试验，具体方法如下：
(1)将在含PDA培养基的平板均分为1、2、3和4四个区域；
(2)第一试验组：在区域1中央处画两条相互垂直的直线，用灭菌枪头吸取5ul在LB液体培养基上过夜培养的所述Bacillus amyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)菌株接种于两条相互垂直的直线的交点处；再吸取5ul甘蔗黑穗病菌液(1X106CFU/ml，正负担孢子1:1)沿两条垂直线滴于距交点1cm处；
(3)第一对照组：在区域3中央处画两条相互垂直的直线，在两条相互垂直的直线的交点处接种5ul无菌水；再吸取5ul甘蔗黑穗病菌液(1X106CFU/ml，正负担孢子1:1)沿两条垂直线滴于距交点1cm处；
(4)在区域2中进行与区域1中完全相同的重复操作，作为第二试验组；在区域4中进行与区域3中完全相同的重复操作，作为第二对照组；
(5)置于28℃培养箱中培养4天，结果如下：
从第一试验组或第二试验组中可以看出，在所述Bacillus amyloliquefaciensZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)菌株的影响下，甘蔗黑穗病菌的菌落较小；从第一对照组或第二对照组中可以看出，在没有所述Bacillus amyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)菌株的影响下，甘蔗黑穗病菌的菌落较大，长势很好；特别的对于区域4中左下角的甘蔗黑穗病菌的菌落由于受到区域3中生长过来的所述Bacillus amyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)菌株的影响，在靠近左边一侧几乎无法生长，只能向右边无所述Bacillus amyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)菌株的一侧生长。本实施例进一步说明了所述Bacillus amyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)菌株在PDA培养基平板上具有对甘蔗黑穗病较强的拮抗作用。
本实施例中，所述PDA培养基的主要成分为马铃薯浸粉、葡萄糖和琼脂，购于Hopebiol，青岛；所述LB液体培养基的主要成分为酵母粉、胰蛋白胨和氯化钠，购于Sangon，上海。
实施例4
一种ZHR0生防菌剂的制备方法，具体步骤如下：
将所述Bacillus amyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)菌株接种在LB液体培养基中，180rpm振荡培养16h，用灭菌水进行稀释至活菌总浓度为1×109CFU/ml，即制成ZHR0生防菌剂。
实施例5
温室桶栽实验检测ZHR0生防菌剂对甘蔗黑穗病的防效，具体方法如下：
①选取感黑穗病的甘蔗材料福桂1号作为实验对象，将蔗茎砍成单芽，于26-30℃人工气候培养箱催芽至蔗芽长出1-2cm，得到甘蔗幼苗；
②用注射器将10ul实施例3制备的ZHR0生防菌剂注射至步骤①得到的甘蔗幼苗的蔗芽上作为实验组，同时用注射器将10ul无菌水注射至步骤①得到的甘蔗幼苗的蔗芽上作为对照组；将实验组和对照组置于28℃恒温环境中处理24h；
③经过步骤②处理的所有甘蔗幼苗均接种甘蔗黑穗病菌液(1X106CFU/ml，正负担孢子1:1)10ul，置于28℃恒温处理24h，然后种于装有已经过高压灭菌的土壤的温室塑料桶；
④实验组和对照组各处理10株，重复3次，连续四个月统计黑穗病的发病情况，抽出可看见的黑鞭并清除发病植株；并根据式(1)和式(2)计算发病率及防效，结果如表1所示。
发病率＝发病总棵数/调查总棵数×100％ (1)
生防效果＝(对照发病率-处理发病率)/对照发病率×100％ (2)
表1：温室中实施例二制备的ZHR0生防菌剂对甘蔗黑穗病的生防效果
处理 发病率 生防效果
试验组 40.91％ 53.98％
对照组 88.89％ ——
由上表看出，ZHR0生防菌剂对甘蔗黑穗病的防治效果达到53.98％，表明所述菌株为Bacillus amyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)菌株对甘蔗黑穗病的防治具有很好的效果。
实施例6
所述Bacillus amyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)菌株的筛选方法，还可以是以下步骤：
(1)取数株甘蔗叶片放入灭菌塑料袋中迅速带回实验室，取20g甘蔗叶片经过消毒灭菌处理后剪碎放入灭菌的三角瓶中，加200ml无菌水，灭菌玻璃珠20g，于摇床上180rpm振荡45min后，静置15min；
(2)吸取上清液稀释至10-4、10-5、10-6三个梯度，从三个梯度稀释液中各吸取0.2mL液体分别接种在LB固体培养基上，32℃恒温培养三天，每个梯度重复三次，根据培养基上菌落大小和形态分离纯化并保存菌种。
实施例7
一种ZHR0生防菌剂的制备方法，还可以是如下操作：将所述Bacillusamyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)菌株接种在LB液体培养基上，300rpm振荡培养12h，用灭菌水稀释至活菌总浓度为1×1010CFU/ml，得到ZHR0生防菌剂。
实施例8
所述Bacillus amyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)菌株的筛选方法，包括以下步骤：
(1)取数株甘蔗叶片放入灭菌塑料袋中迅速带回实验室，取12g甘蔗叶片经过消毒灭菌处理后剪碎放入灭菌的三角瓶中，加130ml无菌水，灭菌玻璃珠12g，于摇床上170rpm振荡30min后，静置10min；
(2)吸取上清液稀释至10-4、10-5、10-6三个梯度，从三个梯度稀释液中各吸取0.05mL液体分别接种在LB固体培养基上，28℃恒温培养三天，每个梯度重复三次，根据培养基上菌落大小和形态分离纯化并保存菌种。
实施例9
一种ZHR0生防菌剂的制备方法，将所述Bacillus amyloliquefaciens ZHR0(解淀粉芽孢杆菌ZHR0)菌株接种在LB液体培养基上，100rpm振荡培养14h，用灭菌水稀释至活菌总浓度为5×109CFU/ml，得到ZHR0生防菌剂。

Claims (3)

1.一种菌株，其特征在于，所述菌株为Bacillus amyloliquefaciens ZHR0菌株，并且所述Bacillus amyloliquefaciens ZHR0菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2014577。
2.权利要求1所述菌株在防治甘蔗黑穗病的应用。
3.一种ZHR0生防菌剂的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述Bacillusamyloliquefaciens ZHR0菌株接种在LB液体培养基上，100～300rpm振荡培养12-16h，用灭菌水稀释至活菌总浓度为1×109-1×1010CFU/ml，得到ZHR0生防菌剂。
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