CN102204465A

CN102204465A - 一种甘蔗黑穗病抗性鉴定方法

Info

Publication number: CN102204465A
Application number: CN 201110099531
Authority: CN
Inventors: 沈万宽; 姜子德; 陈健文; 习平根; 邓海华; 刘睿
Original assignee: South China Agricultural University; Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute
Current assignee: South China Agricultural University; Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute
Priority date: 2011-04-20
Filing date: 2011-04-20
Publication date: 2011-10-05
Anticipated expiration: 2031-04-20
Also published as: CN102204465B

Abstract

本发明涉及植物抗病性鉴定技术领域，提出一种甘蔗黑穗病抗性鉴定方法，首先用微量新鲜甘蔗黑粉菌冬孢子分离培养出甘蔗黑粉菌异型交配型（+、-）单倍体担孢子，然后经过菌株扩大培养、接种、发病率调查、抗性评价等步骤，本发明具有以下突出的实质性特点和显著的进步：1、只需极少量甘蔗黑粉菌冬孢子经分离培养，即可满足接种需要，工作量小；2、异型交配型菌株能够超低温保存，经活化、扩大培养后可作接种源，无需每次鉴定都重新采取菌种并分离培养；3、本发明抗性鉴定历期短、灵敏性高；4、还可利用本发明的方法，鉴别出参试品种所抗感的黑穗病生理小种类型，有效指导甘蔗抗黑穗病育种及蔗区品种合理配置。

Description

一种甘蔗黑穗病抗性鉴定方法

技术领域

本发明涉及植物抗病性鉴定技术领域，尤其涉及一种甘蔗黑穗病的抗性鉴定方法，还涉及到甘蔗黑粉菌的生理小种的鉴定方法。

背景技术

由甘蔗黑粉菌（U. scitaminea）引起的甘蔗黑穗病是一种世界性重要甘蔗病害，也是我国一种经济危害性最严重的甘蔗病害。防控该病害最经济最有效的方法是抗病育种，抗病育种的基础和关键是抗病性鉴定方法，即通过抗病性鉴定方法筛选出甘蔗黑穗病的高抗品种进行育种。我国现在普遍使用的甘蔗黑穗病抗性鉴定方法是利用人工采集的甘蔗黑粉菌混合冬孢子浸渍蔗芽进行甘蔗黑粉菌的接种，然后根据接种材料的黑穗病株发生率，对比黑穗病抗性分级标准（1～5级分类法）进行抗性分级，筛选出高抗的抗病品系以便于育种。该鉴定方法最大的优点是操作简单，经济实用，存在的问题是：

1、需要6个月以上，鉴定历期长；

2、需采集大量黑粉菌冬孢子作为接种源，工作量大；

3、该方法使用的接种源为混合冬孢子，无法鉴别出参试品种抗感甘蔗黑穗病生理小种类型，从而不能有针对性的指导甘蔗抗黑穗病品种选育及蔗区甘蔗品种合理配置，影响了甘蔗抗黑穗病育种效率及病害防控效果。

因此，研究建立高效快速且能鉴别甘蔗黑穗病生理小种类型的甘蔗黑穗病抗性鉴定方法非常重用。

发明内容

本发明目的是针对现有甘蔗黑穗病抗性鉴定存在鉴定历期长、需冬孢子量大、不能鉴别参试品种生理小种类型等不足之处，提出一种甘蔗黑穗病抗性鉴定方法，该方法具有历时短、工作量小、高效快速的特点，还可鉴别参试品种抗感甘蔗黑穗病生理小种类型，优化甘蔗抗黑穗病的育种，提高甘蔗黑穗病防控效果。

本发明的目的通过以下技术方案来实现:一种甘蔗黑穗病抗性鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤A、甘蔗黑粉菌异型交配型（+、-）单倍体担孢子的分离培养

A1．在无菌条件下，取3～10ug新鲜甘蔗黑粉菌冬孢子，用YEPS液体培养基充分稀释成50～100个甘蔗黑粉菌冬孢子/mL的稀释液。

A2．吸取100～200uL稀释液均匀涂板于YEPS固体培养基上，于28～30℃下培养2～3天，得到白色“羊毛状”单菌落。

A3.挑取1个白色“羊毛状”单菌落，用YEPS液体培养基充分稀释成50～100个担孢子/mL的稀释液，然后吸取100～200uL稀释液均匀涂板于YEPS固体培养基上，于28～30℃下培养2～3天，得到“酵母状”单菌落。

A4. 挑取10～15个“酵母状”单菌量菌液落分别于400～500uL的YEPS液体培养基中混匀，然后于28～30℃下振荡培养1～2天，得到OD₆₀₀值为1.0-1.5的菌液。

A5.将A4得到的各个菌液分别吸取1～2uL在YEPS固体培养基上一对一随机配合于28～30℃下培养2～3天，得到 “酵母状” 菌落和“羊毛状”菌落，“酵母状” 菌落为同型（+、+/-、-）交配型单倍体担孢子所形成，“羊毛状”菌落为异型交配型（+、-）单倍体担孢子形成；由此确定A4中至少一对异型交配型菌液。

步骤B、菌株扩大培养

取步骤A4中的一对异型交配型单倍体担孢子菌液，分别用YEPS液体培养基3～5mL于28～30℃扩大培养1～2天，得到OD₆₀₀值达1.0-1.2的2份菌液；

步骤C、接种

将步骤B培养得到的2份菌液等体积混匀；随后用注射器吸取20～30uL混合菌液，注射入事先种植好的甘蔗小苗生长点，接种甘蔗小苗20～30株/品种。

步骤D、发病率调查

将步骤C接种的甘蔗小苗置于25～30℃下生长，自第1株甘蔗发生黑穗病起，定期调查、记录甘蔗黑穗病发生株数，并将记录过的黑穗病发病株连根挖除，调查历期2～3个月，并计算每个参试品种的黑穗病株发生率。

步骤E、抗性评价

根据黑穗病抗性分级标准及参试品种的黑穗病株发生率，评价参试品种的黑穗病抗性水平及所抗感的甘蔗黑粉菌的生理小种。

YEPS液体培养基为酵母菌发酵常用培养基，主要成份为酵母粉（yeast）、蛋白胨(peptone)、蔗糖(sugar)和水，其比例通常为酵母粉10～20g/L、蛋白胨10～20g/L、蔗糖20～40g/L。关于YEPS培养基有如下报道：

食品科技2001年第二期中王岁楼等“某些添加物对红酵母生长及类胡萝卜素合成的影响”中所介绍的基础培养基（YEPS）：酵母粉1%、蛋白胨1%、蔗糖4%。

核技术2003年7月第26卷第7期第510页中刘静等“利用中子活化分析法研究高生物量富铬酵母的培养条件”中介绍的YEPS培养基：酵母粉1%、蛋白胨1%、蔗糖2%。

中国农业科学2006年第9期第1805页中倪深等“基于PCR技术的艳米丝轴黑粉菌侵染率及扩展进程的研究”所介绍的YEPS培养基：酵母粉1%、蛋白胨2%、蔗糖2%、琼脂粉2%）。

西北农业科技大学学报（自然科学板）2007年2月第35卷第2期第174页中菜丽红等“培养基中主要成分对酵母生长及富硒性能的影响”所介绍的发酵培养基（PEYS培养基）：酵母粉（YE）10g/L、蛋白胨（P）10g/L、蔗糖（S）40g/L。

YEPS固体培养基是在YEPS液体培养基再添加1.2～2.0%(m/V)琼脂糖。

本发明步骤A的目的从甘蔗黑粉菌冬孢子中分离出异型交配型（+、-）单倍体担孢子，这些单倍体担孢子加入20%的甘油后，能在超低温（-80℃）下长期保存，需要时取出活化后经步骤B的扩大培养继续做接种源使用，节约时间和劳力。

本发明采取的接种方式为注射接种，这种注射接种加快了参试材料黑穗病的发生，一般在1个月内发生黑穗病，3个月内即可完成抗性鉴定，鉴定期短。

通过本发明的方法在鉴定抗性的同时，还可以根据参试材料黑穗病发生情况推断出参试材料所抗感的黑粉菌生理小种类型，以便有效指导甘蔗抗黑穗病育种及蔗区品种合理配置。

本发明具有以下突出的实质性特点和显著的进步：

1、只需极少量甘蔗黑粉菌冬孢子经分离培养，即可满足接种需要，工作量小；

2、异型交配型菌液能够超低温（-80℃）保存，经活化、扩大培养后可作接种源，无需每次鉴定都重新采取黑粉菌来分离培养；

3、本发明抗性鉴定历期短、灵敏性高；

4、还可利用本发明鉴别出参试品种所抗感的黑穗病生理小种类型，有效指导甘蔗抗黑穗病育种及蔗区品种合理配置。

具体实施方式

一种甘蔗黑穗病抗性鉴定方法，按以下步骤进行：

A1．2010年5月采集刚抽出的甘蔗黑穗病单鞭，在超净工作台上，用枪头挑取少量（大约8ug）新鲜甘蔗黑粉菌冬孢子加入到YEPS液体培养基（1mL）中，经充分振荡成悬浮混浊液，再吸取100uL混浊液与YEPs液体培养基（2 mL）充分稀释，得到均匀的稀释液，每毫升稀释液中有50～100个甘蔗黑粉菌冬孢子。

A2．吸取100uL稀释液均匀涂板于YEPS固体培养基上，于28～30℃下培养2～3天；得到白色“羊毛状”单菌落。

A3．挑取其中1个白色“羊毛状”单菌落,用YEPS液体培养基充分稀释成50～100个担孢子/mL的稀释液，吸取200uL稀释液均匀涂板于YEPS固体培养基上，于28～30℃下培养2～3天，得到若干个“酵母状”单菌落。

A4．挑取10个“酵母状”单菌落，分别

量菌液分别分别于400uL的YEPS液体培养中稀释并混匀，然后于28～30℃下振荡培养1～2天，得到OD₆₀₀值为1.2的菌液。

A5．将A4得到的各个菌液分别吸取1uL于YEPS固体培养基上进行一对一随机相互交叉配合，于28～30℃下培养2～3天，得到 “酵母状” 菌落和“羊毛状”菌落；检查菌落生长情况，形成白色“羊毛状”的菌落为异型交配型菌株；由此确定A4中至少一对异型交配型菌液。

步骤B、菌株扩大培养

取步骤A4中的一对异型交配型单倍体担孢子菌液，分别用YEPS液体培养基4mL于28～30℃扩大培养1～2天，得到OD₆₀₀值达1.2的2份菌液。

步骤C、接种

将步骤B培养得到的2份菌液等体积混匀，用微量注射器吸取20～30uL混合菌液，轻轻注射入事先种植好的新台糖22号和Q171的甘蔗小苗（1心4叶期）的生长点，各接种甘蔗小苗15盆（2株/盆），共30株。

步骤D、发病率调查

将步骤C接种的新台糖22号和Q171甘蔗小苗于温室中自然生长（当时为夏季，广州气温30℃左右，较适合甘蔗生长），接种后第25天发现第一株甘蔗黑穗病，记录后并连根挖除，以后每10天调查一次，记录甘蔗黑穗病发生株数，并将记录过的黑穗病发病株连根挖除，调查历期3个月，新台糖22号的黑穗病发生总株数为18株，黑穗病株发生率为60%，Q171的黑穗病发生总株数为1株，黑穗病株发生率为3.3%。

步骤E、抗性评价结果

根据表1黑穗病抗性分级标准及新台糖22号和Q171的黑穗病株发生率，新台糖22号对接种的黑穗病菌株的抗性类型为高感，Q171对接种的黑穗病菌株的抗性类型为抗病。

本实施例中的YEPS液体培养基和YEPS固体培养基根据以下方法配制，并在121℃下灭菌20min；

YEPS液体培养基的配方为：蔗糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸出物10g/L，PH值为6.5；

YEPS固体培养基的配方为：在YEPS液体培养基再添加1.6%(m/V)琼脂糖。

表1 甘蔗黑穗病抗性分级标准

抗性级别	发病株率(%)	抗性水平
			1	0	高抗
2	0.1～10.0	抗病
			3	10.1～20.0	中抗
4	20.1～30.0	感病
			5	30.0以上	高感

Claims

1.一种甘蔗黑穗病抗性鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：

A1．在无菌条件下，取3～10ug新鲜甘蔗黑粉菌冬孢子，用YEPS液体培养基充分稀释成50～100个甘蔗黑粉菌冬孢子/mL的稀释液；

A2．吸取100～200uL稀释液均匀涂板于YEPS固体培养基上，于28～30℃下培养2～3天，得到白色“羊毛状”单菌落；

A3. 挑取1个白色“羊毛状”单菌落，用YEPS液体培养基充分稀释成50～100个担孢子/mL的稀释液，然后吸取100～200uL稀释液均匀涂板于YEPS固体培养基上，于28～30℃下培养2～3天，得到“酵母状”单菌落；

A4. 挑取10～15个“酵母状”单菌

量菌液落分别于400～500uL 的YEPS液体培养基中混匀，然后于28～30℃下振荡培养1～2天；得到OD₆₀₀值为1.0-1.5的菌液；

A5. 将A4得到的各个菌液分别吸取1～2uL在YEPS固体培养基上一对一随机配合,于28～30℃下培养2～3天，得到 “酵母状” 菌落和“羊毛状”菌落，“酵母状” 菌落为同型（+、+/-、-）交配型单倍体担孢子所形成，“羊毛状”菌落为异型交配型（+、-）单倍体担孢子形成；由此确定A4中至少一对异型交配型菌液；

步骤B、菌株扩大培养

步骤C、接种

将步骤B培养得到的2份菌液等体积混匀；随后用注射器吸取20～30uL混合菌液，注射入事先种植好的甘蔗小苗生长点，接种甘蔗小苗20～30株/品种；

步骤D、发病率调查

将步骤C接种的甘蔗小苗置于25～30℃下生长，自出现第1株甘蔗发生黑穗病起，定期调查、记录甘蔗黑穗病发生株数，并将记录过的黑穗病发病株连根挖除，调查历期2～3个月，并计算每个参试品种的黑穗病株发生率；

步骤E、抗性评价

根据黑穗病抗性分级标准及参试品种的黑穗病株发生率，评价参试品种的黑穗病抗性水平。