CN105543109B - 一种维持菰黑粉菌菌丝体外生长的培养基 - Google Patents

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Abstract

一种维持菰黑粉菌菌丝体外生长的培养基，属于培养基技术领域。该培养基包括以下组分：K2HPO40.85‑1.15 g/L，MgSO4·7H2O 0.45‑0.55g/L，FeSO4·7H2O 0.008‑0.012g/L，KCl 0.45‑0.55g/L，酵母粉2‑3g/L，蛋白栋4‑6g/L，蔗糖3‑4g/L，组氨酸4.5‑5.9g/L，琼脂10‑15g/L。上述的一种维持菰黑粉菌菌丝体外生长的培养基，配伍合理，在基础培养基中加入最佳碳氮源，使得该培养基能够维持菰黑粉菌菌丝体的体外生长。

Description

一种维持菰黑粉菌菌丝体外生长的培养基
技术领域
本发明属于培养基技术领域，具体涉及一种维持菰黑粉菌菌丝体外生长的培养基。
背景技术
菰黑粉菌属于担子菌亚门黑粉菌属，是一种典型的二型态真菌，与玉米瘤黑粉菌近源。目前为止，茭白是其所知的唯一寄主，而茭白孕茭是茭白植株与该专一性地寄生在体内的菰黑粉菌共同作用的结果。田间，茭白受到多种病虫害威胁，主要的病害为胡麻斑病和锈病，主要的虫害是螟虫，包括二化螟、稻纵卷叶螟等。现今农药防治还是田间病虫害的主要防控措施，而田间应用发现在病害控制过程中，杀菌剂的使用对茭白的产量具有显著影响，例如田间常用的三唑酮，若施用剂量或者时间不当，就会导致当季茭白植株无法孕茭，使农民遭受重大损失。这与杀菌剂对菰黑粉菌的毒力作用密切相关。因此进行杀菌剂对菰黑粉菌的毒力测定试验对田间农药的种类及用量选择具有重要的指导意义。而杀菌剂对菰黑粉菌的室内毒力测定需要保证菰黑粉菌菌丝在体外可以正常生长。虽已有报道显示菰黑粉菌可以在体外进行培养并产生菌丝，但在YEPS培养基(2%蛋白胨，2%蔗糖，1%酵母粉)上培养的菰黑粉菌菌丝与丝状真菌菌丝在形态上具有较大差异，并且不能进行长期的菌丝生长。因此我们通过对培养条件的摸索研究，获得了一种能够维持菰黑粉菌菌丝体外生长的培养基。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种维持菰黑粉菌菌丝体外生长的培养基的技术方案。
所述的一种维持菰黑粉菌菌丝体外生长的培养基，其特征在于包括以下组分：K2HPO4 0.85-1.15 g/L，MgSO4·7H2O 0.45-0.55g/L，FeSO4·7H2O 0.008-0.012g/L，KCl0.45-0.55g/L，酵母粉2-3g/L，蛋白胨4-6g/L，蔗糖3-4g/L，组氨酸4.5-5.9g/L，琼脂10-15g/L。
所述的一种维持菰黑粉菌菌丝体外生长的培养基，其特征在于包括以下组分：K2HPO4 0.95-1.05g/L，MgSO4·7H2O 0.48-0.52g/L，FeSO4·7H2O 0.009-0.011g/L，KCl0.48-0.52g/L，酵母粉2.2-2.8g/L，蛋白胨4.4-5.6g/L，蔗糖3.2-3.8g/L，组氨酸4.8-5.5g/L，琼脂12-14g/L。
所述的一种维持菰黑粉菌菌丝体外生长的培养基，其特征在于包括以下组分：K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，KCl 0.5g/L，酵母粉2.5g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖3.42g/L，组氨酸5.2g/L，琼脂10g/L。
上述的一种维持菰黑粉菌菌丝体外生长的培养基，配伍合理，在基础培养基中加入最佳碳氮源，使得该培养基能够维持菰黑粉菌菌丝体的体外生长。
附图说明
图1为菰黑粉菌单菌落形态（A）及其显微图（B）；
图2为菰黑粉菌在菌丝生长培养基（GM）及YEPS培养基上培养2、4、6、15天后菌落形态显微观察图；
图3为不同碳氮源培养基上菰黑粉菌菌丝生长观测图；
图4为菰黑粉菌在不同筛选培养基上培养2天后菌丝生长情况图，其中A-I分别代表组合1-9；
图5为菰黑粉菌在不同筛选培养基上培养3天后菌丝生长情况，其中A-I分别代表组合1-9。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。
实施例1：菰黑粉菌菌丝体外生长的培养基与YEPS培养基进行菰黑粉菌菌丝培养的对比试验
菰黑粉菌菌丝生长培养基（GM）配方(1 L)：K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01g，KCl 0.5 g，酵母粉2.5 g，蛋白胨5 g，蔗糖3.42 g，组氨酸5.2 g，琼脂10 g；
YEPS培养基配方(1 L)：蛋白胨20g，蔗糖20g，酵母粉10g。
1）采用研磨法分离茭白中的菰黑粉菌，在PDA固体培养基上28℃培养6天后得到纯培养的菌落（图1A），菌落呈现不规则边缘，但未见明显白色菌丝。对图1A中的菌落进行显微观察，发现不规则边缘是菌丝（图1B为图1A中箭头所指菌落的显微观察图），但是菌丝体外生长不能长期维持从而无法产生白色气生菌丝（PDA培养基培养无法实现白色气生菌丝生长）。
2）挑取菌落，加入少量灭菌水稀释后取1微升于菌丝生长培养基或YEPS培养基上28℃培养，2天后都可观察到白色气生菌丝，如图2所示，随着培养时间的延长，菌落逐渐增大，YEPS培养基上的气生菌丝逐渐减少，相反，在菌丝生长培养基上的气生菌丝一直保持正常生长。
从该实施例可知，菰黑粉菌菌丝生长培养基能够维持菰黑粉菌菌丝体外生长，而YEPS培养基则不能。
实施例2：培养基主要成分筛选（筛选最佳碳氮源）：蔗糖、组氨酸
为了筛选最佳的菌丝生长碳氮源，我们在基础培养基（K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01g，KCl 0.5 g，琼脂10 g，1 L）中添加不同的碳氮源，检测其对菌丝生长的影响，筛选其中对菌丝生长具有促进作用的成分。在碳氮源筛选过程中，分别选用半乳糖，葡萄糖，果糖，山梨醇，甘露醇，蔗糖，乳糖，麦芽糖作为碳源；硝酸钾，硝酸铵，硫酸铵，谷氨酸钠，甲硫氨酸，精氨酸，尿素，组氨酸作为氮源；其中碳源以C6为单位，浓度为20 mm/L，氮源以N1为单位，浓度为100 mm/L。以硝酸钾为氮源，首先将菰黑粉菌在不同碳源培养基上培养。发现在蔗糖、麦芽糖、果糖及甘露醇培养基上菰黑粉菌菌丝生长状况较好（图3A）。另外，以蔗糖为碳源，在不同的氮源培养基上进行融合实验，结果如图3B所示，组氨酸、谷氨酸钠、精氨酸及尿素培养基能促进菌丝生长。
由上图对比YEPS培养基和蔗糖培养基中菌丝生长状态，我们发现YEPS基础营养蛋白胨和酵母粉对菌丝生长具有促进作用，因此在基础培养基中添加营养丰富的蛋白胨和酵母粉成分，作为菌丝生长的基础培养基，再分别添加筛选得到的有利于菌丝生长的不同碳氮源培养基，其中碳源以C6为单位，浓度为20 mm/L，氮源以N1为单位，浓度为100 mm/L，组合如表1。
表1 菌丝生长培养基筛选组合
通过光学显微镜和体式显微镜观察不同培养基中菌丝长期生长状态，在培养2天时通过光学显微镜观察菌丝生长，我们发现所有组合中的菌丝均开始生长，但是某些培养基明显不利于菌丝维持，伸长的菌丝端已开始进行芽殖，例如组合4，而在组合1、组合2和组合9的培养基上菌丝生长及维持都较好（图4）。
继续培养观察，3天后可以明显看到组合1、2和9中的菌丝生长良好，而组合4、5中菌丝无法维持，其余组合中菌丝生长较慢（图5）。继续培养10天后肉眼观察发现只有组合9中的菌落布满白色气生菌丝，组合1中有部分白色菌丝，其余组合中菌丝生长区已呈乳黄色光滑，在体式显微镜下观察发现组合1、2、3、6、8还可见明显菌丝，但是菌丝周围已密布酵母型菌株形态，而组合4、5、7已基本看不到菌丝形态，只有组合1中菌丝形态明显且未见明显酵母型菌株形态出现（图5），可见组氨酸和蔗糖对菌丝生长和维持具有良好的作用，两者连用可以达到稳定的维持菌丝生长的效果。因此，确定蔗糖和组氨酸为最佳碳氮源。
实施例3
取K2HPO4 0.85 g，MgSO4·7H2O 0.45g，FeSO4·7H2O 0.008g，KCl 0.45g，酵母粉2g，蛋白胨4g，蔗糖3g，组氨酸4.5g，琼脂10g加入1L水配制得到维持菰黑粉菌菌丝体外生长的培养基。
将菰黑粉菌培养至上述培养基中，在培养2天时通过光学显微镜观察菌丝生长，培养基上菌丝生长及维持都较好，继续培养观察，3天后可以明显看到菌丝生长良好，继续培养10天后肉眼观察菌落布满白色气生菌丝。
由此可见该培养基能够维持菰黑粉菌菌丝体外生长。
实施例4
取K2HPO41.15 g，MgSO4·7H2O 0.55g，FeSO4·7H2O 0.012g，KCl 0.55g，酵母粉3g，蛋白胨6g，蔗糖4g，组氨酸5.9g，琼脂15g加入1L水配制得到维持菰黑粉菌菌丝体外生长的培养基。
将菰黑粉菌培养至上述培养基中，在培养2天时通过光学显微镜观察菌丝生长，培养基上菌丝生长及维持都较好，继续培养观察，3天后可以明显看到菌丝生长良好，继续培养10天后肉眼观察菌落布满白色气生菌丝。
由此可见该培养基能够维持菰黑粉菌菌丝体外生长。
实施例5
取K2HPO4 0.95g，MgSO4·7H2O 0.48g，FeSO4·7H2O 0.009g，KCl 0.48g，酵母粉2.2g，蛋白胨4.4g，蔗糖3.2g，组氨酸4.8g，琼脂12g加入1L水配制得到维持菰黑粉菌菌丝体外生长的培养基。
将菰黑粉菌培养至上述培养基中，在培养2天时通过光学显微镜观察菌丝生长，培养基上菌丝生长及维持都较好，继续培养观察，3天后可以明显看到菌丝生长良好，继续培养10天后肉眼观察菌落布满白色气生菌丝。
由此可见该培养基能够维持菰黑粉菌菌丝体外生长。

Claims (3)

1.一种维持菰黑粉菌菌丝体外生长的培养基，其特征在于由以下组分组成：K2HPO4 0.85-1.15 g/L，MgSO4·7H2O 0.45-0.55g/L，FeSO4·7H2O 0.008-0.012g/L，KCl 0.45-0.55g/L，酵母粉2-3g/L，蛋白胨4-6g/L，蔗糖3-4g/L，组氨酸4.5-5.9g/L，琼脂10-15g/L。
2.如权利要求1所述的一种维持菰黑粉菌菌丝体外生长的培养基，其特征在于由以下组分组成：K2HPO4 0.95-1.05g/L，MgSO4·7H2O 0.48-0.52g/L，FeSO4·7H2O 0.009-0.011g/L，KCl 0.48-0.52g/L，酵母粉2.2-2.8g/L，蛋白胨4.4-5.6g/L，蔗糖3.2-3.8g/L，组氨酸4.8-5.5g/L，琼脂12-14g/L。
3.如权利要求1所述的一种维持菰黑粉菌菌丝体外生长的培养基，其特征在于由以下组分组成：K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，KCl 0.5g/L，酵母粉2.5g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖3.42g/L，组氨酸5.2g/L，琼脂10g/L。
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