CN105647817B - 一株分解酸性土壤难溶性磷酸铝的微紫青霉菌及其应用 - Google Patents

一株分解酸性土壤难溶性磷酸铝的微紫青霉菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株分解酸性土壤难溶性磷酸铝的微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)PA01，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2015757。本发明所提供的菌株丰富了野生解磷菌遗传资源，扩大了解磷菌全基因组育种的后备库，该菌能提高酸性土壤中有效磷的含量，提高磷肥利用效率，提高农作物产量，减少水土流失，具有广阔的应用前景。

Description

一株分解酸性土壤难溶性磷酸铝的微紫青霉菌及其应用
技术领域
本发明属于土壤修复和生物技术领域，具体涉及一株微紫青霉菌(Penicilliumjanthinellum)PA01及其对难溶性磷酸铝的溶解作用，可应用于溶解酸性土壤难溶性磷。
技术背景
磷对植物生长发育发挥着重要作用，但土壤中绝大部分的磷不能被植物直接吸收。据调查，全国有74％的耕地土壤缺磷，为满足生产需要，我国绝大部分农田需大量施用磷肥，而施入的磷肥当季利用率仅为5％-25％，大部分磷与土壤中的Ca2+、Fe3+、Al3+等结合，形成难溶性磷酸盐，无法被植物吸收利用，其中酸性土壤中主要以Al-P、Fe-P形式存在。因此，如何使酸性土壤中的难溶性磷酸铝在一定程度上发生溶解，提高其植物有效性，保证较高的磷肥利用率一直是环境工程、植物营养与资源利用领域的研究热点。
大量研究证明，影响土壤中磷利用率的因素很多，其中微生物对土壤中磷的利用率影响最大，解磷微生物能够使难溶性磷转化成为有效磷，供植物体吸收利用。具有解磷作用的微生物种类很多，也比较复杂。目前报道具有解磷作用的微生物包括解磷细菌类、解磷真菌类和放线菌类，其中解磷细菌类数量相对较多，而解磷真菌在数量上远不如解磷细菌多，其种类也少，主要局限于青霉(Penicillium)、曲霉(Aspergillus)、镰刀菌(Fusarium)、小丝核菌(Sclerotium)等几个属种，但其解磷能力通常比细菌强，且解磷真菌遗传较稳定，一般不易失去解磷功能。微紫青霉菌作为青霉属的一种，目前鲜有关于其解磷能力尤其是对酸性土壤难溶性磷溶解能力的报道。
发明内容
本发明的目的是为解决现有技术问题，提供了一种对酸性土壤难溶性磷酸铝具有高效溶解能力的微紫青霉菌菌株及其应用。本发明还提供一种分解酸性土壤难溶性磷酸铝的方法和微生物菌剂。
本发明是这样实现的：
首先利用难溶性磷酸铝筛选培养基从养猪场水泡粪沼渣中筛选得到一株真菌，申请人将其命名为微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)PA01，并于2015年12月15日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为：CCTCCNO：M2015757。
随后采用恒温振荡培养的方式检测微紫青霉菌PA01对难溶性磷酸盐(AlPO4)的溶解作用，具体方法是：采用上述微紫青霉PA01菌株，扩增培养后得到孢子液，将孢子液按1％的接种量接种到含磷酸铝(AlPO4，5g/L)的液体培养基中，于30℃、180rpm振荡培养15天，培养液中可溶性磷含量可达289.7mg/L，解磷效果明显。
微紫青霉菌PA01对酸性土壤，尤其是pH为3～7的酸性土壤中的难溶性磷具有较强的解磷能力，并且在25～35℃温度范围内的解磷能力最强。因此可将该菌株扩增培养后用于分解酸性土壤中的难溶性磷，也可以微紫青霉菌PA01为活性成分，制备用于分解酸性土壤难溶性磷的微生物菌剂。
本发明所提供的菌株丰富了野生解磷菌遗传资源，扩大了解磷菌全基因组育种的后备库。该菌能提高酸性土壤中有效磷的含量，提高磷肥利用效率，提高农作物产量，减少水土流失，具有广阔的应用前景。
更详尽的技术方案见《具体实施方式》所述。
附图说明
图1：菌株PA01～06的15d最大溶磷量比较。
图2：不同温度对菌株PA01溶磷能力的影响。
图3：不同初始pH对菌株PA01溶磷能力的影响。
具体实施方式
以下是结合附图和实施例对本发明作的进一步阐述。需要说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。本发明中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。
本发明所涉及的培养基配方如下：
难溶性磷酸铝固体培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，NaCl0.3g，KCl 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·H2O 0.03g，AlPO4 5g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2，琼脂20g，AlPO4与其他药品分开灭菌后混合。
难溶性磷酸铝液体培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，NaCl0.3g，KCl 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·H2O 0.03g，AlPO4 5g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2，AlPO4与其他药品分开灭菌后混合。
实施例1解磷微生物的初步筛选
称取10g武汉市天健农业发展有限公司生猪养殖场提供的水泡粪沼渣于装有90mL无菌生理盐水的三角瓶中，在28℃恒温摇床上180r/min恒温振荡30min，使样品均匀分散于蒸馏水中，静置20分钟后取上清液，得到稀释倍数为10-1菌悬液，依次稀释得到10-3、10-5、10-7倍稀释度的菌悬液，分别取各浓度梯度的菌悬液0.1ml均匀地涂布在含磷酸铝固体培养基上(AlPO4，5g/L)，每个浓度作3个重复，放入恒温培养箱中，在30℃恒温条件下培养5～7d后。观察培养基上长出的菌落，选出菌落周围产生明显的颜色变化并有透明圈的菌株，依次命名为PA01、PA02、PA03、PA04、PA05、PA06。
实施例2解磷微生物的复筛
将初筛得到的菌株分别接种到100mL含磷酸铝的无机磷液体培养基中(AlPO4，5g/L)，30℃，180rpm，培养15天，同时以不加任何菌的液体解磷培养基作为对照组。将培养液以5000r/min离心10min后，取上清液，稀释到合适浓度，通过钼锑抗比色法测定可溶性磷含量。结果如图1所示，本发明筛选到的上述6株菌均具有一定的解磷效果，能将培养基中的难溶磷(AlPO4)分解成溶解性磷，其中PA01菌株的解磷效率最高，溶解性磷含量高达289.7mg/L。因此，该菌株可做成解磷菌剂，可广泛应用于农业生产中。
实施例3菌株PA01的鉴定
(1)菌株PA01的菌落形态
菌落为白色，质地绒状，边缘圆形、整齐；菌落背面无色或中央略带黄色。菌落正面有大量的分生孢子，有浅黄色渗出液；菌丛呈白色，菌丝发达，分生孢子梗呈管状，其上产生分生孢子，分生孢子为圆形。
(2)菌株PA01的分子生物学鉴定
采用分子生物学方法对上述筛选得到的PA01菌株进行鉴定，将该菌株的18SrDNAITS序列通过PCR扩增，获得600bp左右长度的扩增产物，扩增产物经测序公司进行序列测定，将所测序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对，结果表明，该菌株与微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)的相似度为99％以上。结合形态特征、培养特征及18SrDNAITS序列分析，该菌株确定为微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)。
实施例4不同培养温度对菌株PA01解磷能力的影响
先将上述菌株PA01接种到PDA固体培养基上，28℃培养5～7天，待已产生大量孢子后，用适量无菌水洗下，并用无菌水将孢子液浓度调节至2×109CFU/ml，4℃存储备用。接种1mL孢子液到装有100ml难溶性磷酸铝液体培养基的250ml三角瓶中，以加入相同体积的难溶性磷酸铝液体培养基不接种为对照(CK)。分别于25℃、28℃、30℃、35℃五个温度下，180r/min振荡培养7天，每个处理三瓶重复，每天取样测定培养中可溶性磷含量及pH值。结果如图2所示。
由图2可以看出，菌株PA01在25～35℃之间都具有很好的适应性，并且具有较强的解磷能力。在30℃时解磷效果最好，最大溶磷量为235.32mg/L。最大溶磷量大小依次为30℃>28℃>25℃>35℃。各温度下培养液pH变化与溶磷量变化呈现显著负相关性，随着pH下降，溶磷量逐渐升高，在pH降至最低值时，溶磷量达到最高值。
实施例5不同初始pH对菌株PA01解磷能力的影响
实验方法与实施例4相同，分别调节培养液初始pH值为3.0、5.0、7.0、9.0，于30℃，180r/min振荡培养7天。以加入相同体积的难溶性磷酸铝液体培养基不接种为对照(CK)，每个处理三瓶重复，每天取样测定培养中可溶性磷含量及pH值。结果如图3所示。
由图3可以看出，菌株PA01在pH3～7范围内都具有很强的适应性，并且具有较强的解磷能力。在pH值为9时，PA01溶磷能力较弱。在pH值为3时溶磷量最高，影响最大溶磷量大小的培养液初始pH值依次为pH3>pH5>pH7>pH9。说明菌株PA01能很好适应偏酸性环境。如今后接种于酸性土壤，将对其难溶性磷具有很好的溶解能力。

Claims (4)

1.一株分解酸性土壤难溶性磷酸铝的微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)PA01，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2015757，该菌株在pH为3、温度为30℃时具有最强的解磷能力。
2.权利要求1所述的微紫青霉菌PA01在分解酸性土壤难溶性磷酸铝中的应用。
3.一种分解酸性土壤难溶性磷酸铝的方法，其特征在于：采用权利要求1所述的微紫青霉菌PA01，扩增培养后得到孢子液，然后将孢子液接种至酸性土壤中，并控制pH为3、温度为30℃。
4.一种分解酸性土壤难溶性磷酸铝的微生物菌剂，其活性成分是权利要求1所述的微紫青霉菌PA01。
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