CN105039168B - 一株橘绿木霉及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株橘绿木霉(Trichoderma citrinoviride)P‑T 7987，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10646。本发明的橘绿木霉P‑T 7987对生境适应性强、生长速度快、产孢量大，可用于抑制灰葡萄孢、核盘菌、瓜果腐霉、辣椒疫霉和立枯丝核菌，并重寄生灰葡萄孢、核盘菌、瓜果腐霉、辣椒疫霉和立枯丝核菌的菌丝，迅速、有效将植病菌降解。本发明的橘绿木霉具有潜在的、可开发的生物防治价值。

Description

一株橘绿木霉及其用途

技术领域

本发明属于微生物领域，更具体地，涉及一株橘绿木霉及其在植物病害生物防治领域的用途。

背景技术

病原物是影响植物生长发育导致作物减产的一大“杀手”，自波尔多液发明至今，化学防控一直是控制植物病害发生、流行、为害、成灾的最主要的措施；然而多次大量地施药增加了化学农药造成环境污染的风险，因此，利用生物物种之间的相互作用进行病害的生物防治已经成为植物病害防治和生态环境保护的发展方向。

自1932年Weindling首次发现木素木霉(Trichoderma lignorum)能够寄生某些植物植病菌并降低其危害程度以来，相关研究进展加速。据不完全资料统计，木霉属至少对18个属29种植物病原菌(以下简称植病菌)具有不同程度的拮抗作用。由于木霉的广泛适应性、广谱性及多机制性，长期以来，一直是植病生物防治学家研究的重点对象，已经有不少成功应用的案例。近年来，随着生物化学和分子生物学技术的发展，多种商品化的木霉制剂相继研发并推广应用，使得木霉在植物病害生物防治领域发挥着重要的作用，目前，这些木霉制剂主要是利用T.harzianum、T.longibrachiatum、T.asperellum、T.koningii等菌株或复合菌株制备而成的，因此,深入发掘可利用的木霉属新菌株具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一株橘绿木霉，该菌株生境适应性强、生长速度快、产孢量大，且还可重寄生灰葡萄孢、核盘菌、瓜果腐霉、辣椒疫霉和立枯丝核菌的菌丝，迅速、有效地将其降解；有效地抑制灰葡萄孢、核盘菌、瓜果腐霉、辣椒疫霉和立枯丝核菌的生长和进一步扩展，具有植物病害防控的用途。

本发明提供了橘绿木霉菌株(Trichoderma citrinoviride)P-T 7987，该菌株已于2015年3月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10644。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

所述的橘绿木霉P-T 7987菌株分离自吉林蛟河庆岭的腐木上，该菌株具有以下特性：

分类学地位：真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，粪壳纲(Sordariomycetes)，肉座菌目(Hypocreales)，肉座菌科(Hypocreaceae)，木霉属(Trichoderma)。

本发明所述的橘绿木霉P-T 7987的分生孢子或菌丝体。

本发明所述的橘绿木霉P-T 7987抑制灰葡萄孢、核盘菌、瓜果腐霉、辣椒疫霉和立枯丝核菌生长的用途。

本发明所述的橘绿木霉P-T 7987重寄生灰葡萄孢、核盘菌、瓜果腐霉、辣椒疫霉和立枯丝核菌的用途。

本发明还提供一种产品，其活性成分为本发明所述的橘绿木霉P-T7987，所述产品具有如下至少一种用途：

1)抑制灰葡萄孢、核盘菌、瓜果腐霉、辣椒疫霉和立枯丝核菌生长的用途；

2)重寄生灰葡萄孢、核盘菌、瓜果腐霉、辣椒疫霉和立枯丝核菌的用途。

本发明提供了一株橘绿木霉P-T 7987，该菌株能明显抑制灰葡萄孢菌、核盘菌、瓜果腐霉菌、辣椒疫霉菌、立枯丝核菌的生长，在与上述植病菌对峙培养过程中，生长迅速，能有效地竞争有限的空间和营养，覆盖植病菌菌落，产生大量的分生孢子，同时，该菌株具有明显的重寄生作用，迅速降解植病菌的菌丝体，是一个具有良好生防潜力的微生物资源。

附图说明

图1橘绿木霉P-T 7987在CMD培养基上，25℃培养8天的菌落形态；

图2橘绿木霉P-T 7987在PDA培养基上，25℃培养8天的菌落形态；

图3橘绿木霉P-T 7987在SNA培养基上，25℃培养8天的菌落形态；

图4橘绿木霉P-T 7987的分生孢子梗；

图5橘绿木霉P-T 7987的分生孢子；

图6橘绿木霉P-T 7987在25℃条件下与灰葡萄孢对峙培养3天菌落形态；a为灰葡萄孢单独培养的菌落形态，A为灰葡萄孢与橘绿木霉P-T 7987对峙培养形态(左侧为灰葡萄孢、右侧为橘绿木霉P-T 7987)；

图7橘绿木霉P-T 7987在25℃条件下与对峙培养30天菌落形态；a为灰葡萄孢单独培养的菌落形态，A为灰葡萄孢与橘绿木霉P-T 7987对峙培养形态(左侧为灰葡萄孢、右侧为橘绿木霉P-T 7987)；

图8橘绿木霉P-T 7987在25℃条件下与核盘菌对峙培养3天菌落形态；b为核盘菌单独培养的菌落形态，B为核盘菌与橘绿木霉P-T 7987对峙培养形态(左侧为核盘菌、右侧为橘绿木霉P-T 7987)；

图9橘绿木霉P-T 7987在25℃条件下与核盘菌对峙培养30天菌落形态；b为核盘菌单独培养的菌落形态，B为核盘菌与橘绿木霉P-T 7987对峙培养形态(左侧为核盘菌、右侧为橘绿木霉P-T 7987)；

图10橘绿木霉P-T 7987在25℃条件下与瓜果腐霉对峙培养3天菌落形态；c为瓜果腐霉单独培养的菌落形态，C为瓜果腐霉与橘绿木霉P-T 7987对峙培养形态(左侧为瓜果腐霉、右侧为橘绿木霉P-T 7987)；

图11橘绿木霉P-T 7987在25℃条件下与瓜果腐霉对峙培养30天菌落形态；c为瓜果腐霉单独培养的菌落形态，C为瓜果腐霉与橘绿木霉P-T 7987对峙培养形态(左侧为瓜果腐霉、右侧为橘绿木霉P-T 7987)；

图12橘绿木霉P-T 7987在25℃条件下与辣椒疫霉对峙培养3天菌落形态；d为辣椒疫霉单独培养的菌落形态，D为辣椒疫霉与橘绿木霉P-T 7987对峙培养形态(左侧为辣椒疫霉、右侧为橘绿木霉P-T 7987)；

图13橘绿木霉P-T 7987在25℃条件下与辣椒疫霉对峙培养30天菌落形态；d为辣椒疫霉单独培养的菌落形态，D为辣椒疫霉与橘绿木霉P-T 7987对峙培养形态(左侧为辣椒疫霉、右侧为橘绿木霉P-T 7987)；

图14橘绿木霉P-T 7987在25℃条件下与立枯丝核菌对峙培养3天菌落形态；e为立枯丝核菌单独培养的菌落形态，E为立枯丝核菌与橘绿木霉P-T 7987对峙培养形态(左侧为立枯丝核菌、右侧为橘绿木霉P-T 7987)；

图15橘绿木霉P-T 7987在25℃条件下与立枯丝核菌对峙培养30天菌落形态；e为立枯丝核菌单独培养的菌落形态，E为立枯丝核菌与橘绿木霉P-T 7987对峙培养形态(左侧为立枯丝核菌、右侧为橘绿木霉P-T 7987)；

图16橘绿木霉P-T 7987对灰葡萄孢的重寄生作用图；

图17橘绿木霉P-T 7987对核盘菌的重寄生作用图；

图18橘绿木霉P-T 7987对瓜果腐霉的重寄生作用图；

图19橘绿木霉P-T 7987对辣椒疫霉的重寄生作用图；

图20橘绿木霉P-T 7987对立枯丝核菌的重寄生作用图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。

实施例1菌株的分离、纯化、鉴定和保藏

1、木霉菌株的单孢分离、纯化

在无菌的比色皿凹槽内滴入75％乙醇和无菌水，挑取1个成熟子座置于比色皿中的酒精内进行表面消毒，经无菌水漂洗后，用无菌镊子将子座碾碎，将含有子囊的子囊壳挑入另一比色皿中，进一步将子囊搅碎，充分搅拌，将悬浮液均匀涂布于水琼脂培养基上，室温培养。隔一天置于解剖镜下观察，用无菌解剖针挑取萌发的单个孢子，转接至含有氨苄青霉素(2mg/L)的PDA培养基上，置于25℃下黑暗培养，待木霉的子囊孢子萌发后，菌落生成时，将培养物活跃生长的部分转接至PDA试管，当斜面长满菌落并产生孢子时，置于4℃冰箱短期保存。

2、木霉菌株的物种鉴定

生物学特性：在CMD培养基上，菌落生长速度快速，25℃培养3天半径为58mm，4天铺满平板。气生菌丝极少，放射状，向远边扩散；产孢簇密集，初期为白色，后变为淡黄绿色；分生孢子梗宽度大约为2–4μm；甁梗2–3螺旋状排列，烧瓶形或安瓿形，中部膨大，4–6×2–3μm，基部宽1.5–2μm。分生孢子黄绿色，光滑，柱形或椭球形，很少球形，3–3.5×2–2.5μm；4天后可见厚垣孢子，间生或顶生，球形、椭球形或梨形，8–16×8–12μm。在PDA培养基上，菌落生长速度较快，25℃培养3–4天铺满平板(直径为90mm)，气生菌丝浓密，棉絮状，黄白色至黄绿色，产孢簇大量，前期聚集于平板中部。在SNA培养基上，生长速度适中，25℃培养3天菌落半径为50mm；菌落5天铺满平板。以上三种培养基上，菌落自溶现象不明显，无特殊气味，PDA培养基上产生黄色色素，以上特征与橘绿木霉吻合。

分子生物学鉴定(DNA序列测定)：

1)真菌基因组的提取：采用CTAB法提取真菌基因组。

2)ITS、rpb2和tef1基因片段的扩增及测序：

PCR扩增引物和测序引物见表1(ITS基因的测序引物与扩增引物相同)，PCR反应体系和反应条件分别见表2。反应结束后取2.5μl扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外凝胶成像系统拍照、分析，ABI 3730XL测序仪对扩增产物进行双向测序。

表1PCR扩增引物和测序引物

表2PCR反应体系及反应条件

3)序列分析

利用ClustalX程序和Bioedit等软件对测序结果进行编辑分析。

用引物ITS4、ITS5测序拼接后得到的序列如SEQ ID NO.1所示。

用引物RPB2-F、RPB2-R测序拼接后得到的序列如SEQ ID NO.2所示。

用引物TEF-1和TEF-2测序拼接后得到的序列如SEQ ID NO.3所示。

对序列进行比对分析，结果表明，本发明菌株的ITS序列与多个已知橘绿木霉菌株的序列完全相同，rpb2和tef1序列分别与已知的橘绿木霉菌株S20的相似性高达100％和98％。形态学特征和分子生物学特征的综合分析表明，本发明菌株为橘绿木霉，命名为橘绿木霉(Trichoderma citrinoviride)P-T 7987。3、木霉菌株的保藏

保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2015年3月23日，保藏编号为CGMCC No.10644。

实施例2对峙培养法

在PDA培养基上活化培养橘绿木霉P-T 7987与五种靶标植病菌(灰葡萄孢、核盘菌、瓜果腐霉、辣椒疫霉、立枯丝核菌)，然后分别在菌落边缘取直径为5mm的菌块，在直径线上距两侧皿缘15mm的对称位置分别接种橘绿木霉P-T 7987和植病菌，同时，以只接种植病菌作为空白对照，每处理设置3次重复，25℃恒温培养，逐日观察菌株的生长情况。待对照长满培养皿时，测量靶标菌的对照生长量(菌落半径)和处理生长量(接种木霉菌后的抑制生长半径)，计算抑菌率。

抑菌率(％)＝(对照生长量-处理生长量)/对照生长量×100％

实施结果：连续30d的培养观察发现，橘绿木霉P-T 7987具有很强的生境竞争能力，生长速度快，能迅速抢占有限的空间和营养，覆盖植病菌生长并在其表面产生大量的分生孢子，消解植病菌菌丝，导致其死亡。本发明菌株对五种植病菌抑菌作用均很强，几乎完全抑制了灰葡萄孢、瓜果腐霉和辣椒疫霉的生长，对立枯丝核菌和核盘菌的平均抑菌率分别为89％和88％，但是经过连续30d的对峙培养后，橘绿木霉P-T 7987均能覆盖或包围植病菌，导致植病菌生长受阻直至死亡详见表3，图6至图15。

表3橘绿木霉P-T 7987对五种植病菌的离体抑菌率

实施例3重寄生作用观察

采用载玻片培养法，用灭菌的解剖刀划取15×10mm的PDA薄膜，置于灭菌的载玻片中央，然后挑取等量橘绿木霉P-T 7987和植病菌的菌丝分别接种于PDA膜两平行边的中点，在25℃下恒温保湿培养，逐日镜检观察两个菌的相互作用。

通过载玻片培养法结合光学显微镜观察到了橘绿木霉P-T 7987对植病菌的重寄生过程，橘绿木霉P-T 7987的菌丝能够识别并趋向五种植病菌的菌体生长，并以菌丝卷须的吸附结构附着并逐渐缠绕在植病菌的菌丝上,然后通过分泌的各种酶类及次生代谢物质溶解寄主细胞壁，产生溶解位点或侵入孔，侵入寄生菌丝并在其内生长，最终导致植病菌的菌丝凹陷、崩溃死亡。图16至图20显示了光学显微镜下观察到的橘绿木霉P-T 7987的重寄生作用。

从农业生产角度讲，橘绿木霉P-T 7987菌株可迅速占据这五种植病菌的入侵位点，降低他们侵入植株的机会，从而达到抑菌防病的效果，说明该木霉菌具有潜在的、可开发的生物防治用途。

Claims (5)

1.一株橘绿木霉(Trichoderma citrinoviride)P-T 7987，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10644。

2.权利要求1所述的橘绿木霉P-T 7987的分生孢子或菌丝体。

3.权利要求1所述的橘绿木霉P-T 7987抑制灰葡萄孢、核盘菌、瓜果腐霉、辣椒疫霉和立枯丝核菌生长的用途。

4.权利要求1所述的橘绿木霉P-T 7987重寄生灰葡萄孢、核盘菌、瓜果腐霉、辣椒疫霉和立枯丝核菌的用途。

5.一种制剂，其活性成分为权利要求1所述的橘绿木霉P-T 7987，所述制剂具有如下至少一种用途：

1)抑制灰葡萄孢、核盘菌、瓜果腐霉、辣椒疫霉和立枯丝核菌生长的用途；

2)重寄生灰葡萄孢、核盘菌、瓜果腐霉、辣椒疫霉和立枯丝核菌的用途。