CN107974427A - 一株具有抑菌活性的海洋链霉菌 - Google Patents

一株具有抑菌活性的海洋链霉菌 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株具有抑菌活性的海洋链霉菌，属于微生物技术领域。所述海洋链霉菌为链霉菌（Streptomyces chumphonensis）AM‑4，已于2017年10月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.14843。链霉菌AM‑4对柑橘炭疽病菌、柑橘青霉病菌、柑橘绿霉病菌和柑橘褐色蒂腐病菌均具有较好的抑制效果，具有被开发为生物农药的潜能。

Description

一株具有抑菌活性的海洋链霉菌
技术领域
本发明涉及一株具有抑菌活性的海洋链霉菌，属于微生物技术领域。
背景技术
柑橘果实采收后，在贮藏运输过程中可发生20多种病害，由真菌引起的侵染性病害主要有青霉病、绿霉病、炭疽病、蒂腐病、黑腐病、酸腐病等。目前有效防治柑橘贮藏期病害以咪唑类、双胍盐类和2，4-D三种化学杀菌剂混配为主。众所周知，化学农药长期不当使用，会造成生态平衡的破坏、环境的污染、病原菌的抗药性、果实中农药残留超标等严重后果。因而开发研究防治柑橘贮藏期病害新的生物农药非常有必要。
农用抗生素作为生物农药的一个重要部分，具有不污染环境，对人畜安全，选择性高，易被土壤微生物分解等优点，因而开发新的农用抗生素应用于柑橘贮藏期病害的防治具有较好的前途。目前广泛应用的许多重要农用抗生素都是从放线菌分离得到的，而这些放线菌主要来源于陆源环境，由于不断的重复分离筛选，很难再筛选出具有新型抗病基质的放线菌。因此，人们逐渐把目光转向微生物资源丰富的海洋，期望从海洋环境中筛选出具有新型抗病机制的微生物，用于植物病虫害的防治。海洋作为一个巨大的生物资源库，由于其特殊的生存环境，如高盐度、高压力、低温及特殊光照决定了海洋生物不同于陆地生物的多样性和独特性，目前尚有约99%的海洋微生物未被认识，随着生物技术的发展，越来越多的海洋微生物被开发利用，它们的次生代谢产物为生物防治提供了新的来源。因此分离海洋放线菌，再从海洋放线菌代谢产物中提取活性物质应用于柑橘贮藏期病害的防治，是思路新颖，切实可行新途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一株具有抑菌活性的海洋链霉菌，该菌株对柑橘炭疽病菌、柑橘青霉病菌、柑橘绿霉病菌和柑橘褐色蒂腐病菌等多种病原菌具有明显的抑制作用，具有被开发为生物农药的潜能。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供的一株海洋链霉菌，为链霉菌（Streptomyces chumphonensis）AM-4，已于2017年10月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.14843，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明提供了所述的海洋链霉菌的应用，即链霉菌（Streptomyces chumphonensis）AM-4在抑制柑橘贮藏期病害中的应用，所述柑橘贮藏期病害为柑橘炭疽病、柑橘青霉病、柑橘绿霉病和柑橘褐色蒂腐病。
本发明还提供了所述的海洋链霉菌（Streptomyces chumphonensis）AM-4在制备生物农药中的应用。
所述链霉菌（Streptomyces chumphonensis）AM-4是从浙江省台州市大陈岛海域盛产的海螺体内分离获得的，该菌株的培养特征、形态特征、生理生化特征、16S rDNA序列和菌种分类结果如下：
1、链霉菌AM-4的培养和形态特征：链霉菌AM-4在供试的7种培养基上生长情况见表1，除在燕麦粉琼脂培养基上不生长，在其他6种培养基上均可生长，除在营养琼脂上无气生菌丝体产生，在其余5种培养基上均有白色气生菌丝体产生；链霉菌AM-4在可生长的6种培养基上基质菌丝体均为浅黄色，除在酵母精麦芽糖琼脂和营养琼脂产生可溶性色素生成外，其他均无可溶性色素。链霉菌AM-4在高氏合成1号培养基上生长茂盛，在光学显微镜下观察其孢子丝直，长链状，孢子椭圆形表面粗糙。
表1 菌株的培养特征
2、链霉菌AM-4的生理生化特征：测试6种碳源中，链霉菌AM-4仅可利用葡萄糖作为碳源。可使淀粉水解、牛奶凝固胨化和硝酸盐还原，不使明胶液化，不产生H2S和黑色素，具体见表2。
表2 链霉菌AM-4的生理生化特性
3、链霉菌AM-4的16S rDNA序列：链霉菌AM-4的16S rDNA的序列如SEQ ID NO:1所示。将所得序列于美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站上进行Blast比对分析发现，所测序列与Genbank中链霉菌属的多个种均具有较高的同源性，其中与Streptomyces chumphonensis具有最高同源性，其序列相似性达99.9%。
4、菌种分类结果：根据链霉菌AM-4的形态特征、培养特征、生理生化特征及16SrDNA序列，将链霉菌AM-4鉴定为Streptomyces chumphonensis。链霉菌Streptomyces chumphonensis为Phongsopitanun W等于2014年新报道的一个链霉菌新种，国内尚未有对应的中文名称，因此将该发明的菌株命名为链霉菌（Streptomyces chumphonensis）AM-4。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果为：
（1）本发明提供的海洋链霉菌AM-4来自于浙江省台州市大陈岛海域所产的海螺体内分离获得，关于从海洋海螺体内分离拮抗链霉菌应用于柑橘贮藏期病害鲜有报道，且Streptomyces chumphonensis为近年新发现命名的链霉菌新种，关于该菌种的相关研究较少。
（2）本发明所述的海洋链霉菌AM-4的发酵产物提取物对多种柑橘贮藏期病害具抑菌活性，与目前所用的化学保鲜剂相比，具有高效、低毒、低残留、无污染和不易产生抗药性的特征。
（3）海洋链霉菌AM-4对柑橘炭疽病菌、柑橘青霉病菌、柑橘绿霉病菌和柑橘褐色蒂腐病均具有较好的抑制效果。
（4）链霉菌AM-4易于培养，其发酵产物及提取物易于提取制备。因此海洋链霉菌AM-4在被开发为生防菌制剂用于对柑橘贮藏期保鲜上，具有良好的市场应用前景。
附图说明
图1为链霉菌（Streptomyces chumphonensis）AM-4在高氏合成1号培养基上的培养特征。
图2为光学显微镜下观察的链霉菌（Streptomyces chumphonensis）AM-4的菌丝和孢子丝特征。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
一株具有抑菌活性的海洋链霉菌，菌种命名为链霉菌AM-4，分类命名：Streptomyces chumphonensis，其保藏编号：CGMCC No.14843，保藏日期：2017年10月30日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例1：海洋链霉菌的分离培养
1、生物材料及培养基：从浙江省台州市大陈岛周边海域取样，样品包括鱼类、贝类、虾类以及潮间带的泥沙，将采集的样品放入装有冰块的保温箱，24 h内带回实验室进行放线菌的分离，分离培养基共选用6种分离培养基，成分如表3， 其中人工海水是采用Sigma公司生产的海盐40 g加入1000 mL的纯净水溶解而成。6种培养基中均加入萘啶酮酸15 μg/mL、制霉菌素50 μg/mL和放线菌酮50 μg/mL。
表3 6种分离培养基的成分
2、样品处理：采集的样品分两种处理方法进行分离。处理方法A：取1 g样品，放入4 mL的无菌水中，55℃热激10 min，剧烈摇动，再将样品1:4稀释，取20 µL稀释液均匀涂布于6种分离培养基平板上，28℃培养2-6周，待放线菌长出，挑取菌丝进行转接纯化，纯化培养的菌株再接种到含分离培养基的试管中培养，然后放于4℃冰箱保存备用。处理方法B：取1 g样品，溶于20 mL的无菌人工海水中，加入20个直径3-5 mm的玻璃珠，42℃剧烈震荡培养30min；用无菌人工海水梯度稀释100、10-1、10-2、10-3。选择10-1、10-2、10-3三个浓度涂板，28℃培养2-6周，待放线菌长出。
3、放线菌培养：挑取培养基上生长的单菌落进行转接纯化，根据菌株的形态特征和培养特征，去除重复的菌株，最后共计分离获得56株海洋放线菌菌株。对已纯化的菌株，接种于高氏合成1号（配方为：可溶性淀粉20 g、KNO3 1 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01 g、NaCl 0.5 g、琼脂 20 g、蒸馏水1000 mL，pH7.2-7.4）斜面培养基中，于28℃恒温培养箱中培养5~7 d后，置于4℃冰箱保存备用。
实施例2：海洋链霉菌拮抗菌株的筛选
1、指示菌平板的制备：柑橘绿霉病的病原菌由本实验室从发病的柑橘果实上分离并保存。将保存的柑橘绿霉病菌转接于PDA培养基（配制方法为：称取新鲜去皮的马铃薯200 g，切碎加水1000 mL煮沸半个小时，纱布过滤，取滤液定容至1000 mL，再加20 g葡萄糖和20 g琼脂，加热充分溶解后分装至锥形瓶或玻璃试管中，121℃，高压灭菌20 min）平板上，置于28℃的微生物培养箱培养，待菌落产生孢子后，往培养皿内加入10 mL无菌水收集孢子，用无菌纱布过滤后，用无菌水调整孢子悬浮液浓度至104个孢子/mL，用移液器吸取20µL孢子悬浮液均匀涂布于PDA平板上待用。
2、具抑制活性菌株的筛选：将实施例1中分离获得的海洋放线菌接种于高氏合成1号培养基平板上，28℃培养7 d后，在有菌生长处用打孔器取直径5 mm的菌饼，置于接种有指示菌平板的中央，然后于28℃的微生物培养箱培养。48 h后，观察菌饼周围透明抑菌圈的有无和大小，据此判定放线菌的拮抗活性。
通过以上方法，从分离获得的56株海洋生放线菌中筛选出1株对柑橘绿霉病菌、柑橘青霉病菌、柑橘炭疽病菌和柑橘褐色蒂腐病均有较强抑制活性的菌株，将其命名为链霉菌AM-4。
实施例3：链霉菌（Streptomyces chumphonensis）AM-4发酵液粗提物的制备
1、菌株的活化培养：将分离保存的链霉菌AM-4移至高氏合成1号培养基平板上于28℃培养箱培养7 d。
2、菌株的发酵培养：取高氏合成1号培养基上活化的链霉菌AM-4，接种到高氏合成1号液体发酵培养基（100 mL培养基/250 mL锥形瓶，配方同高氏合成1号固体培养基，不含琼脂）中，28℃下摇床200 rpm/min振荡培养4 d。
3、发酵液粗提物的制备：取发酵液经由无菌滤纸抽滤，分别获得上清液和菌丝体。取上清液，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，得上清液的乙酸乙酯萃取液。菌丝体用80%丙酮水溶液浸泡过夜后，用超声波破碎提取3次，合并提取液，并将提取液减压浓缩至无丙酮后，所得水相再用等体积的乙酸乙酯萃取3次，得菌丝体的乙酸乙酯萃取液。将上清液和菌丝体的乙酸乙酯萃取液合并，减压浓缩至干，得到该菌株的乙酸乙酯萃取物。称取1 g萃取物加入少量二甲基亚砜溶解，再加入无菌水定容至10 mL即为链霉菌AM-4发酵液粗提物。
实施例4：链霉菌（Streptomyces chumphonensis）AM-4发酵液粗提物对植物病原菌的抑菌效果
1、供试菌株及培养基：供试植物病原真菌包括柑橘炭疽病菌、柑橘青霉病菌、柑橘绿霉病菌、柑橘褐色蒂腐病菌。用于植物病原真菌培养所用培养基为马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，其具体配方如实施例2中所述。
2、供试菌株的活化：将PDA培养基分别加热溶解后倒入直径为9 cm的无菌培养皿中，制备得到培养基平板。用无菌接种针挑取保存于4℃冰箱斜面培养基中的各真菌的菌块接种于PDA培养基平板上，置于28℃恒温培养箱中培养活化。
3、抑菌活性的测定：取实施例3中获得的链霉菌（Streptomyces chumphonensis）AM-4的发酵产物。用移液器吸粗提物溶液1 mL于直径9 cm培养皿内，加入9 mL的PDA培养基（培养基温度50℃左右）迅速混合均匀制成带药平板。将上述活化好的柑橘炭疽病菌、柑橘青霉病菌、柑橘绿霉病菌和柑橘褐色蒂腐病菌，用直径5 mm的打孔器打取菌块置于带药平板的中央，以无菌水作对照，重复3次，接种后将带药平板置于28℃恒温培养箱培养5 d。采用十字交叉测量菌落直径，计算菌落直径平均值和菌丝生长抑制率，菌丝生长抑制率计算公式如下：
菌丝生长抑制率(%)=[1-(处理菌落直径-菌饼直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)]×100。
试验结果见表4。从表4看出，链霉菌（Streptomyces chumphonensis）AM-4发酵液粗提物对柑橘炭疽病菌、柑橘青霉病菌、柑橘绿霉病菌和柑橘褐色蒂腐病菌4种病原菌的抑制率均在78/%以上，效果显著。
表4 链霉菌（Streptomyces chumphonensis）AM-4发酵液粗体物对植物病原菌的抑制率
实施例5：链霉菌（Streptomyces chumphonensis）AM-4发酵液粗提物对柑橘果实的保鲜试验
挑选均与一致的甜橙新鲜果实若干，用清水清洗果实表面的灰尘，并用75%酒精进行表面消毒晾干，放入大号保鲜盒，每盒24个果实，每个处理3盒为3次重复。用灭菌解剖刀在果实腰部刺一伤口（3 mm×3 mm），在伤口处滴入30 μL实施例3中的粗提物溶液，同时以含少量二甲基亚砜的无菌水处理作为阴性对照，置于室温放置24 h，再分别接种浓度为104个孢子/mL的柑橘青霉病菌和柑橘绿霉病菌的孢子悬浮液15 μL，用保鲜盒密封放置于28℃ 恒温培养箱保湿培养，在接种后的第7 d统计发病率并计算防效。
链霉菌AM-4发酵液粗提物对甜橙果实保鲜试验结果如表5，从表中看出接种7 d后，发酵液粗提物对绿霉病菌的防效达到72%，对青霉病的防效达到68.84%。链霉菌AM-4发酵液粗提物保鲜试验仅作为初步试验，观察实际保鲜效果。真正的应用仍需要进一步优化链霉菌AM-4发酵培养基，筛选出最适合菌株AM-4的发酵培养基和发酵时间，以提高抗生素的产量。
表5 链霉菌AM-4发酵液粗提物对甜橙保鲜效果
实施例6：链霉菌（Streptomyces chumphonensis）AM-4的培养特征、形态特征及生理生化特征
1、菌株AM-4的培养特征和形态特征：采用国际通用的培养基，分别为无机盐淀粉琼脂（ISP-4，配方为：可溶性淀粉 10 g、K2HPO4 1 g、MgSO4·7H2O 1 g、NaCl 1 g、(NH4)2SO4 2g、CaCO3 2 g、FeSO4·7H2O 0.001g、MnCl2·7H2O 0.001 g、ZnSO4·7H2O 0.001g、琼脂 20g、蒸馏水 1000 mL，pH7.0-7.4）、葡萄糖天门冬素琼脂（ISP-5，配方为：L-天门冬氨酸 1 g、甘油 10 g、K2HPO4 1 g、微量元素溶液 1 mL、琼脂 20 g、蒸馏水 1000 mL，pH 7.2，微量元素溶液：FeSO4·7H2O 0.1 g、MnCl2·4H2O 0.1 g、ZnSO4·7H2O 0.1 g）、燕麦粉琼脂（ISP-3，配方为：燕麦粉 20 g、琼脂20 g、微量元素溶液 1 mL，pH 7.2，微量元素：FeSO4·7H2O 0.1g、MnCl2·4H2O 0.1 g、ZnSO4·7H2O 0.1 g）、酵母精麦芽糖琼脂（ISP-2，配方为：酵母膏 4g、麦芽汁 10 g、葡萄糖 4 g、琼脂 20 g、蒸馏水 1000 mL，pH 7.0）、营养琼脂（NA，配方为：蛋白胨 10 g、牛肉膏 3 g、氯化钠 5 g 、琼脂 20 g、蒸馏水 1000mL，pH7.3 ）、和高氏合成1号培养基（配方如实施例1所述），将菌株AM-4接种到以上培养基上，然后置于28℃恒温倒置培养，1周后观察菌株AM-4的气生菌丝、基内菌丝生长情况及可溶性色素的产生情况。
结果发现，菌株AM-4除在燕麦粉琼脂培养基上不生长，在其他6种培养基上均可生长；除在营养琼脂上无气生菌丝体产生，在其余5种培养基上均有白色气生菌丝体产生；链霉菌AM-4在可生长的6种培养基上基质菌丝体均为浅黄色，除在酵母精麦芽糖琼脂和营养琼脂产生可溶性色素生成外，其他均无可溶性色素。链霉菌AM-4在高氏合成1号培养基上生长茂盛（如附图1示），在光学显微镜下观察其孢子丝直，长链状，孢子椭圆形表面粗糙（如附图2示）。
2、菌株AM-4的生理生化特征：参照《放线菌快速鉴定与系统分类》（阮继生，黄英.放线菌快速鉴定与系统分类[M]. 北京：科学出版社，2011）和《链霉菌鉴定手册》（中国科学院微生物研究所放线菌分类组. 链霉菌鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，1975）中所述的方法，对链霉菌AM-4的生理生化特性如碳源利用、黑色素产生、H2S产生、明胶液化、淀粉水解、牛奶凝固、硝酸盐还原等指标进行测定。
结果表明，测试6种碳源中，链霉菌AM-4仅可利用葡萄糖作为碳源。可使淀粉水解、牛奶凝固胨化和硝酸盐还原，不能使明胶液化，不产生H2S和黑色素。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江省柑桔研究所
<120> 一株具有抑菌活性的海洋链霉菌
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1391
<212> DNA
<213> 链霉菌（Streptomyces chumphonensis.）
<400> 1
tgcagtcgac gatgaagccg cttcggtggt ggattagtgg cgaacgggtg agtaacacgt 60
gggcaatctg ccctgcactc tgggacaagc cctggaaacg gggtctaata ccggatacga 120
cacaggaagg catcttctct gtgtggaaag ctccggcggt gcaggatgag cccgcggcct 180
atcagcttgt tggtggggtg atggcctacc aaggcgacga cgggtagccg gcctgagagg 240
gcgaccggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 300
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gggttgtaaa cctctttcag cagggaagaa gcgcaagtga cggtacctgc agaagaagca 420
ccggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg tgcgagcgtt gtccggaatt 480
attgggcgta aagagctcgt aggcggcttg tcacgtcgga tgtgaaagcc cggggcttaa 540
ccccgggtct gcattcgata cgggcaggct agagttcggt aggggagatc ggaattcctg 600
gtgtagcggt gaaatgcgca gatatcagga ggaacaccgg tggcgaaggc ggatctctgg 660
gccgatactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta 720
gtccacgccg taaacgttgg gaactaggtg tgggcgacat tccacgtcgt ccgtgccgca 780
gctaacgcat taagttcccc gcctggggag tacggccgca aggctaaaac tcaaaggaat 840
tgacgggggc ccgcacaagc ggcggagcat gtggcttaat tcgacgcaac gcgaagaacc 900
ttaccaaggc ttgacataca tcggaaagcc gtagagatac ggcccccctt gtggtcggtg 960
tacaggtggt gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1020
cgagcgcaac ccttattctg tgttgccagc atgcctttcg gggtgatggg gactcacagg 1080
agactgccgg ggtcaactcg gaggaaggtg gggacgacgt caagtcatca tgccccttat 1140
gtcttgggct gcacacgtgc tacaatggcc ggtacaatga gctgcgatac cgtgaggtgg 1200
agcgaatctc aaaaagccgg tctcagttcg gattggggtc tgcaactcga ccccatgaag 1260
tcggagtcgc tagtaatcgc agatcagcat tgctgcggtg aatacgttcc cgggccttgt 1320
acacaccgcc cgtcacgtca cgaaagtcgg taacacccga agccggtggc ctaaccccct 1380
tgtggggagg a 1391

Claims (4)

1.一株海洋链霉菌，为链霉菌（Streptomyces chumphonensis）AM-4，已于2017年10月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.14843。
2.如权利要求1所述的海洋链霉菌在抑制柑橘储藏期病害中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述柑橘贮藏期病害为柑橘炭疽病、柑橘青霉病、柑橘绿霉病和柑橘褐色蒂腐病。
4.如权利要求1所述的海洋链霉菌在制备生物农药中的应用。
CN201810061444.4A 2018-01-23 2018-01-23 一株具有抑菌活性的海洋链霉菌 Active CN107974427B (zh)

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