CN107058160B - 一株花生根际解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Y14，已于2016年11月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.13258。本发明的菌株对白绢病的病原菌具有良好的抑制效果，而且可以诱导植物系统抗性，为花生提供铁营养，还可以改善土壤菌群结构，为花生的生产提供了有力保障。

Description

一株花生根际解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株花生根际解淀粉芽孢杆菌及其应用，具体涉及一株能够防治花生白绢病，同时具有促生功能、改善花生铁营养和根际微生物群落结构的解淀粉芽孢杆菌，属于生物技术领域。

背景技术

花生白绢病的病原菌为齐整小核菌(Selerotium rolfsii Sacc.)，依靠菌核、菌丝体或受感染的植物残骸进行传播，致使植物根茎腐烂，可侵染多种植物，是世界性流行的土传病害。在我国花生白绢病发病严重，各大花生的产区均有发生，花生白绢病能引起花生茎腐、果腐，严重威胁花生的产量和品质。目前生产上主要通过栽培措施、选育抗病品种、化学药剂等措施防治花生白绢病，化学药剂使用最广，但也造成了农药残留、环境破坏、产生抗药性等危害。近几年利用有益微生物控制白绢病成为防治研究的重点方向之一。

解淀粉芽孢杆菌是芽孢杆菌的一个种，在酶工业、食品工业和农业中具有广泛的应用。其中，在农业应用中，尽管已有解淀粉芽孢杆菌对多种病原真菌具有活性的报道，但目前为止，有关解淀粉芽孢杆菌防治花生白绢病的报道很少，专利CN105316266A公开了一株从河南驻马店花生种植地块采集的土壤样品中分离的解淀粉芽孢杆菌，其对花生白绢病具有较好的防治效果。但该菌株仅涉及单一抑菌功能的研究，而具有促生、产生铁载体、诱导植物抗性和防治花生白绢病等多种促生机制和生物防治功能的解淀粉芽孢杆菌还未见报道，因此，筛选具有多种促生机制和生物防治功能的菌株在花生生产中具有十分重要的意义。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。该菌株对白绢病的病原菌具有良好的抑制效果，而且可以诱导植物系统抗性，为花生提供铁营养，还可以改善土壤菌群结构，为花生的生产提供了有力保障。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一株解淀粉芽孢杆菌，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Y14，已于2016年11月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，菌种保藏号为CGMCC NO.13258。

该菌株是从花生根际土壤中分离得到，该菌株的菌落及菌体特征为：在LB培养基上37℃培养48h，菌落表面干燥褶皱，不透明，微黄色，边缘不规则或近圆形。显微镜观察菌体形态特征为杆状，单细胞，革兰氏染色为阳性，有芽孢。

该菌株的生理生化特征为：接触酶实验阳性，V-P实验阳性，明胶液化实验阳性，硝酸盐利用实验阳性，葡萄糖发酵实验阳性，蔗糖发酵实验阳性，L-阿拉伯糖发酵实验阳性，D-木糖发酵实验阳性，D-甘露糖发酵实验阳性。

根据本发明的第二方面，提供一种生防制剂，其活性成分为上述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Y14的发酵产物。

优选的，所述生防制剂为液态菌剂。

进一步的，所述生防制剂中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Y14的含量大于或等于1×10⁸cfu/mL。

本发明还提供上述生防制剂的制备方法，包括如下步骤：发酵上述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Y14，得到发酵产物。

上述制备方法中，发酵采用的培养基为LB培养基。

所述LB培养基的组成为：酵母浸膏，5g；蛋白胨，10g；氯化钠，10g；蒸馏水，1000mL；琼脂，15-20g；121℃灭菌20min；pH7.0。

上述制备方法中，发酵的条件为：温度：37℃；转速：180rpm。

根据本发明的第三方面，提供上述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)Y14和/或生防制剂在防治花生白绢病中的应用。

上述应用中，所述防治花生白绢病体现在抑制白绢病病原菌的菌核形成，同时抑制白绢病原菌菌丝的生长。

根据本发明的第四方面，提供上述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)Y14和/或生防制剂在促进花生增产、增强花生的系统抗性、改善花生根际土壤微生物群落结构和/或高产铁载体，为花生植株提供铁营养中的应用。

本发明还提供一种能防治花生白绢病，同时能促进花生增产、增强花生的系统抗性、改善花生根际土壤微生物群落结构的产品，其活性成分为上述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Y14或上述生防制剂。

本发明的有益效果：

本发明从花生根际土壤中分离得到一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)Y14，该菌株具有促生、产生铁载体、诱导植物抗性和防治花生白绢病等多种促生机制和生物防治功能。

首先，菌株Y14能明显抑制白绢病病原菌生长，抑菌率为48.07％，而且，不同于其他解淀粉芽孢杆菌对白绢病病原菌的抑制作用，菌株Y14对白绢病病原菌菌丝体有致畸作用，特别是对菌核的抑制效果更加显著，抑制率可达88.91％以上，有研究发现白绢病病原菌的菌核在土壤中可存活一年甚至几年仍具有侵染活力，为白绢病的防治带来挑战，而本发明筛选分离的菌株Y14对白绢病病原菌的菌核形成有强烈的抑制作用，为白绢病的防治提供了新的思路。

其次，菌株Y14在防治白绢病的同时，还能显著提高花生生物量、叶绿素含量及根系活力，增加花生根际微生物的种类及丰度，改善微生物群落结构，提高有益菌数量。

第三，菌株Y14还是高产铁载体的菌株，其铁载体除满足自身利用外，还可以增加花生植株铁的摄入量改善铁营养，同时与病原菌竞争铁营养，也可能是防病促生的机制之一。

综上，菌株Y14不仅可以产生次级代谢物抑制白绢病的发生，还能诱导植物系统抗性，达到防病促生的效果，同时可以改善花生铁营养和根际微生物群落结构，是一株具有巨大应用潜力的PGPR菌株。

附图说明

图1：CAS平板上Y14菌落周围形成橙色变色圈；

图2：菌株Y14拮抗实验效果图；

图3：菌株Y14发酵液对白绢病病原菌菌丝生长及菌核形成的抑制作用，图中，A、B、C、D是3d时发酵液浓度为0，5％，10％，15％的PDA平板；E、F、G、H是14d时发酵液浓度为0，5％，10％，15％的PDA平板；

图4：菌株Y14对白绢病病原菌菌丝体的影响；

图5：菌株Y14对花生白绢病的盆栽防治效果；

图6A-图6C：不同时期各处理的花生叶片防御酶活性；

图7A-图7D：不同生长期各处理花生农艺性状；

图8：不同生长期各处理花生叶片叶绿素含量。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1：菌株的分离、筛选

1.菌株的分离与筛选：

(1)菌株的分离

该菌种从花生根际土壤筛得，土壤样品采自山东省泰安市郊区花生种植地。将花生根际土壤小心抖落到无菌袋里，放于低温保鲜盒，带回实验室后立即进行处理。称取根际土壤样品10g，放入90mL无菌水中，振荡30min后制成微生物悬浮液。分别吸取1mL悬浮液，按照10倍比例梯度稀释后，各取10^-4、10^-5和10^-6倍稀释液200μL涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，静置10min后倒置于37℃恒温培养箱中培养约24h。挑选代表性菌落于平板上再通过三区划线法纯化，纯化后的微生物分离物保存于斜面中备用。

(2)菌株的筛选

将花生根际土壤中分离得到的菌株用无菌牙签点接在CAS平板上，在37℃恒温培养箱里培养3d，观察菌落周围橙黄色变色圈的产生及大小，筛选出铁载体产生菌。挑选出的产铁载体细菌重复检验2次，并记录菌落大小及产生的变色圈大小。

通过CAS平板(CAS平板制备：①取0.012g CAS溶于10mL双蒸水中，并与2mL1mmol/L的FeCl₃溶液混匀，得溶液a；

②取0.015gHDTMA溶于8mL双蒸水中，得溶液b；

③将a溶液缓慢加入b溶液中，充分混匀即得染液c；

④将10×MM9盐溶液(Na₂HPO₄ 30g，KH₂PO₄ 1.5g，NaCl 2.5g，NH₄Cl 5g,双蒸水500mL)20mL哌嗪二乙醇磺酸(pipes，Sigma公司出品)6.04g加入盛有150mL双蒸水的洁净三角瓶里，混匀后用50％ NaOH调节pH至6.8，再加入琼脂粉3.2g，得培养基d；

⑤将染液c、培养基d、及1mmol/L CaCl₂、1mmol/L MgSO₄·7H₂O、20％葡萄糖、10％水解酪素分别灭菌(115℃，20min)后，置于50℃水浴锅内保温待用；

⑥分别量取上述1mmol/L CaCl₂ 0.2mL、1mmol/L MgSO₄·7H₂O 4mL、20％葡萄糖2mL及10％水解酪素6mL加入培养基d中，再沿瓶壁加入染液c，充分摇匀(勿产生气泡)，即得蓝色定性检测培养基。然后按每皿20mL到入培养皿中，待凝固后备用。)筛选出多株铁载体产生菌，菌株Y14生长和出圈快(图1)，培养12h菌落周围便出现变色圈，2d时变色圈与菌落直径比值达到1.72:1，多次传代产铁载体能力稳定。在SA限铁培养基(1L培养基中含蔗糖，20.0g；L-天门冬酰氨，2.0g；K₂HPO₄，0.5g；MgSO₄.7H₂O，0.5g。)培养(37℃，180rpm)36h后，测定铁载体活性单位高达86.75，属于超强螯和能力的铁载体。

2.菌株Y14的形态及生理生化特征测定

(1)菌落特征及菌体形态

该菌株的菌落及菌体特征为：在LB培养基上37℃培养48h，菌落表面干燥褶皱，不透明，微黄色，边缘不规则或近圆形。显微镜观察菌体形态特征为杆状，单细胞，革兰氏染色为阳性，有芽孢。

(2)生理生化特征

该菌株的生理生化特征为：接触酶实验阳性，V-P实验阳性，明胶液化实验阳性，硝酸盐利用实验阳性，葡萄糖发酵实验阳性，蔗糖发酵实验阳性，L-阿拉伯糖发酵实验阳性，D-木糖发酵实验阳性，D-甘露糖发酵实验阳性。

3.菌株Y14的16S rDNA序列测定与分析

对Y14菌株16S rDNA序列进行PCR扩增，得到1455bp的PCR产物，其核苷酸序列表中SEQ ID NO.1所示。

将Y14的16S rDNA序列提交GenBank，所得收录号为JQ579621.1。将其16S rDNA序列进行BLAST比对，结果显示Y14与芽孢杆菌属的多个不同种的相似性均在99％以上，结合菌株的形态、培养特征及生理生化分析结果，初步鉴定菌株Y14为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

该菌株Y14，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Y14，已于2016年11月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，菌种保藏号为CGMCCNO.13258。

实施例2：菌株Y14生防制剂的制备

具体制备方法如下：

Y14发酵液的制备方法：将斜面保存的解淀粉芽孢杆菌Y14转接到装有10mL液体LB培养基的试管中，放在恒温摇床中培养12h(温度：37℃；转速：180rpm)。将活化好的菌液按1％(体积百分数)接种量接入到200mL液体LB培养基中，放入摇床培养24h(温度：37℃；转速：180rpm)即得Y14菌株的发酵液；作为生防制剂使用时将发酵液加适量无菌水稀释至1×10⁸cfu/ml即可。

实施例3：菌株Y14抑制白绢病病原菌生长的测定

1.平板对峙试验

(1)材料与方法：

采用平板对峙试验，利用无菌打孔器切取的活化后的花生白绢菌丝块接种在PDA平板中心，28℃培养1d，在距白绢菌丝体边缘约3cm处接种拮抗菌Y14，以只接种病原菌作为对照，培养3d后观察抑菌效果。同时，挑取对峙边缘的白绢病菌丝体，以未加拮抗菌的白绢菌丝体为对照，在显微镜下观察菌丝体的生长与形态变化。

(2)试验结果：

通过平板对峙培养，发现菌株Y14对花生白绢病原菌拮抗效果显著(图2)，对照板(A)菌丝生长旺盛迅速铺满全板，拮抗板(B)菌株Y14与病原菌之间形成了非常明显的抑菌带，抑菌率为48.07％。

2.菌株Y14对白绢病病原菌的菌丝体形态的影响

(1)材料与方法

分别取5mL，10mL，15mL的菌株Y14培养24h的发酵液(实施例2制备)加入到100mLPDA培养基中，混匀高温灭菌后倒入培养皿中，以不加发酵液的PDA培养基为对照，在培养皿中央接种白绢病病原菌菌丝块，28℃培养。4d时观察菌丝扩展情况，计算不同浓度发酵液的菌丝生长抑制率。14d观察各平板产生的菌核数，计算不同浓度发酵液处理对菌核的抑制率。

菌丝生长抑制率(％)＝100x(CK菌落直径-发酵液处理菌落直径)/CK菌落直径。

(2)试验结果

菌株Y14发酵液对白绢病病原菌具有明显的抑制作用(图3)，向含有Y14发酵液浓度为5％，10％，15％的PDA平板中心接种白绢病病原菌菌丝块，培养4d时对照平板上病原菌菌丝扩展到全板，处理板上菌丝生长缓慢抑菌率分别为1％，26.44％，39.08％；培养14d时对照平均每板产生菌核151粒，其他加不同发酵液浓度的处理板产生菌核数分别为123.5粒，47.5粒，16.75粒，都与对照达到极显著差异(P<0.01)，分别将菌核数降低了18.21％、68.54％、88.91％，且单个菌核质量变小。有研究发现白绢病病原菌的菌核在土壤中可存活一年甚至几年仍具有侵染活力，为白绢病的防治带来挑战，而Y14发酵液中含有的抑菌物质，随浓度的增加抑菌效果增强，不但抑制白绢菌丝生长，对菌核的抑制效果更加显著，为防治白绢病提供了新思路。此外，Y14抑菌物质可以耐受高温灭菌，具有良好的稳定性适合用于商品菌剂的开发。

另外，取对峙平板上的病原菌菌丝显微镜下观察，发现菌株Y14对花生白绢病病原菌菌丝有致畸作用(图4)，对照菌丝体大小均匀健壮，伸展良好且菌丝节较长(A)；而拮抗菌作用下的菌丝体则显示出各种畸状：菌丝分隔增多、隔间变短(B)，产生畸形分支(B、G)，断裂现象严重，部分发生变形，扭曲缠结(D、H)，菌丝体顶端膨大(F、G)，同时，细胞壁破裂，形成椭圆形，念珠状(E)，原生质消解、外溢而丧失活力，造成空壳菌丝体出现(C)。说明菌株Y14对能够干扰花生白绢病原菌的正常代谢，引起细胞膜通透性改变，细胞内物质外溢，造成细胞代谢紊乱，导致细胞结构发生变化，最终抑制菌丝的生长和扩展。

实施例4：菌株Y14对白绢病防治的盆栽试验

1.材料与方法：

(1)盆栽试验设计：

盆栽试验在山东农业大学校本部日光温室进行，设置3个处理①拮抗菌Y14、②药剂对照、③发病对照，每处理10盆花生(共20株)。

齐苗后选择长势一致的花生苗，拮抗菌Y14处理：每盆花生取20mL菌浓度为1×10⁸CFU/mL的菌株Y14的菌液稀释成200mL浇灌；

药剂对照采用50％多菌灵可湿性粉剂1000倍稀释液浇灌处理，每盆200mL；

发病对照接入等量清水。

播种30d后重复以上处理，1d后将配制好的带白绢病病原菌的牙签插于各处理花生根部，每株8根，按照温室常规管理。

(2)白绢病防治效果调查：

接种病原菌后每隔7d对花生白绢病发病情况进行调查，统计各处理花生的发病时间、发病级数、发病株数，计算病情指数及相对防效(％)。花生白绢病害分五级，0级：植株无症状；1级：仅在茎基部产生病斑；2级：茎基部产生缢缩症状，整株的三分之一以下表现系统症状(枯萎、死亡、萎蔫等)；3级：整株的三分之二以下表现系统症状；4级：整株的三分之二以上表现系统症状。

病情指数＝100×∑病级代表值×该病级株数/(最高病级代表值×调查总株数)；

相对防效＝100％(CK病情指数-处理病情指数)/CK病情指数。

(3)花生叶片抗逆酶活的测定：

接种病原菌后3d、7d、14d、28d、60d、90d时，取各处理花生主茎顶端展开的功能叶片，测定诱导植物系统抗性相关指标超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性。

(4)菌株Y14对花生促生作用的测定：

播种一个月后开始测定花生株高、侧枝长、分支数、下针数等农艺性状及叶绿素含量，播种期结束测定植株鲜重、干重、及花生产量等生物量，亚甲烯蓝法测定植株根系活力。

(5)花生根际土壤微生物群落结构分析：

生收获后，小心取各处理根际土壤混合均匀，利用Soil DNA Kit试剂盒提取土壤总DNA，进行微生物群落结构分析，各处理三次生物学重复。细菌多样性测定选取16SrDNA的V4区PCR扩增(引物信息：520F 5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′；802R 5′-TACNVGGGTATCTAA TCC-3′)，真菌多样性测定选取ITS的ITS1区进行扩增(引物信息：5′-TCCGTAGGTGAACC TGCGG-3′；5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)，以扩增产物为模板采用Illumina MiSeq测序的方法分析，测序工作委托派森诺生物科技有限公司完成。

2.试验结果：

(1)菌株Y14对花生白绢病的盆栽防治效果：

结果见表1。

表1：菌株Y14对花生白绢病的防治效果

(2)菌株Y14对花生系统抗性的影响

菌株Y14诱导花生叶片过氧化氢酶(CAT酶)活性，见图6A。接种白绢病病原菌后，测定了不同处理3～90d花生叶片的CAT酶活性。拮抗菌Y14诱导处理后花生叶片CAT酶活迅速提高，在第7d达到酶活力峰值，为1918.33U/(g·min)，分别是施药处理和发病CK的1.59倍和1.50倍。除第60d外各时期Y14处理组酶活明显高于其他两组，与发病CK组在第3d，7d，14d，28d时均达到极显著差异(P<0.01)，在42d和90d达到显著差异(P<0.05)，与多菌灵处理组在第3d，7d，28d和42d达到极显著差异(P<0.01)，在14d和90d达到显著差异(P<0.05)。而施药处理与发病CK酶活互有高低，仅在第14d时达到显著差异(P<0.05)。说明菌株Y14可持续诱导花生CAT酶的分泌，增强花生的抗逆性。

菌株Y14诱导对花生叶片过氧化物酶(POD酶)活性，见图6B。拮抗菌Y14诱导能促进花生POD酶的分泌，拮抗菌Y14处理组在第3d时POD酶活迅速提高，是多菌灵处理组的1.43倍，是发病CK的1.55倍；之后POD酶活力开始下降，至第14d达到最小值后开始上升，但高于施药处理和发病CK(60d除外)，与发病CK在第3d，7d，42d和60d均达到极显著差异(P<0.01)，与多菌灵处理在第3d，7d和42d达到极显著差异P<0.01)，60d和90d达到显著差异P<0.05)，说明Y14诱导有利于POD基因的表达。在60d时，发病CK的酶活明显高于其他两组，根据发病情况调查结果(表1)，60d发病CK病情指数19.31接近处理A的两倍，也高于多菌灵处理，此时发病差异最显著，发病CK酶活高可能是受病害胁迫严重导致的，同理致使CAT及SOD酶活在60d时均高于其他两组。

菌株Y14诱导花生叶片超氧化物歧化酶(SOD酶)活性，见图6C。受病害胁迫后，各组处理SOD活性迅速升高，呈先升后降的趋势，并且在前期拮抗菌Y14诱导对酶活提高效果显著，与发病CK在第3d，7d和14d均达到极显著差异(P<0.01)，酶活力分别是发病CK的1.46倍、2.25倍、1.41倍，与多菌灵处理在组第3d，7d和14d均达到极显著差异(P<0.01)，90d时达到显著差异(P<0.05)，酶活分别多菌灵处理组的1.64倍、1.96倍、1.32倍、1.39倍。说明菌株Y14诱导可以提高SOD基因的表达。

(3)菌株Y14对花生的促生效果

由图7可知，接种菌株Y14的花生较其他两组更具优势，Y14处理组株高在整个生长期均比多菌灵处理组、发病CK组要好，且在播种38d，45d，52d时均达到显著差异(P<0.05)，在第38d比其他两组分别高出10.52％，8.44％；Y14处理组侧枝长相比于其他两组虽差异不显著，但仍表现出一定的生长优势；分支数在整个生长期三组处理均无多大差别；下针数在45d、52d时Y14处理组均高于多菌灵处理组、发病CK组，在45d时达到显著差异(P<0.05)，比处理B提高66.67％，比处理C提高59.09％，并且多菌灵处理组开花期早于其他两组。由此可见，接种拮抗菌Y14对花生早期的生长发育起到明显的促进作用，能够促进花生株高和侧枝的增长，增加下针数，这将有利于产量的提高。

菌株Y14使花生生物量及产量提高，从表2可以看出，施加拮抗菌Y14对花生生物量的影响较大，Y14处理组植株鲜重和百果鲜重分别比发病CK高出41.33％、19.56％，达到显著差异(P<0.05)，荚果鲜重高出32.09％，达到极显著差异(P<0.01)，花生增产量为32.03％；同时各项指标均高于多菌灵处理，比之花生产量增加12.92％。

表2：各处理花生生物量及产量

同列数据后不同字母表示差异显著(P<0.05)。

菌株Y14促进了花生根系的生长，促进了根系活力。见表3。

表3：各处理根系发育情况统计表

同列数据后不同字母表示差异显著(P<0.05)。

由表3可知，Y14处理组的植株根部鲜重明显大于多菌灵处理组及发病CK组，并且达到显著差异(P<0.05)，分别增加24.7％和26.4％。甲烯蓝法测定了新鲜植株根系活力，Y14处理的花生总吸收面积(total absorption area of roots，TAAR)和活跃吸收面积(active absorption area of roots，AAAR)分别较发病CK高出76.5％和72.5％，差异显著(P<0.05)，总吸收面积比多菌灵处理高出34.95％，差异显著(P<0.05)。多菌灵处理根系活力优于发病CK，但其促进作用不如Y14明显。

Y14处理组花生幼苗生长后期叶片叶绿素含量增加，由图7可知，在花生生长后期，各处理叶绿素含量变化显著，90d时Y14处理组叶绿素含量为1.979mg/g，与多菌灵处理组及发病CK组均达到极显著差异(P<0.01)，是多菌灵处理组的1.30倍，是发病CK组的1.41倍，在120d时含量为1.74mg/g，是多菌灵处理的1.21倍，是发病CK组的1.43倍，并与发病CK组达到极显著差异(P<0.01)。在种植中后期拮抗菌Y14处理的叶绿素含量明显高于其他两组，这也与其后期叶片浓绿黄化症状较轻的外观现象一致。拮抗菌Y14改善叶绿素缺失的原因可能有两方面，一是白绢病发病之后对植株叶绿素造成损坏，Y14处理组的病情指数较低，白绢病害对叶绿素的破坏较轻。另一方面Y14是一株高产铁载体产生菌，其铁载体满足自身利用外，可以被花生利用，增加铁的摄入量改善铁营养，同时与病原菌竞争铁营养，也是防病促生的机制之一。

(4)菌株Y14对花生根际土壤微生物群落结构的影响

菌株Y14对花生根际土壤微生物群落结构的影响结果见表4。

表4 生物多样性指数表

同列数据后小写字母表示差异显著(P<0.05)，大写字母表示极差异显著(P<0.01)。

试验结果显示施用Y14菌株后，花生根际土微生物丰富度、多样性均得到提高(见表4)，有利于抵抗病原菌。细菌中的有益菌如重要的拮抗菌属(芽孢杆菌属、假单胞属、藤黄单胞菌属和链霉菌属等)和固氮菌属(根瘤菌属、伯克氏菌属、固氮弧菌属)等得到不同程度的提高。真菌中的有益菌如毛壳菌属(Chaetomium)、粘帚霉属(Clonostachys)丰度提高，产生笋顶孢霉属(Acrostalagmus)、Mycoleptodiscus、Septoglomus等特有菌属，植物病原菌Ophiostoma、Athelia等属消失，扁孔腔菌属(Lophiostoma)、土赤壳属(Ilyonectria)丰度降低。通过以上分析我们可以推测枯草芽孢杆菌的施入可以有效抑制病原真菌的种类及数量，改善花生根际生态环境，对花生的生长发育起到积极作用。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一株花生根际解淀粉芽孢杆菌及其应用

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1455

<212> DNA

<213> 菌株Y14

<400> 1

agggggggga gactatacat gcaagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt 60

agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg 120

aaaccggggc taataccgga tggttgtttg aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct 180

tcggctacca cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca 240

ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 300

ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 360

ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag 420

aacaagtgcc gttcaaatag ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 480

actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc 540

gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga 600

gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc 660

ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa 720

ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780

ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc 840

attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg 900

gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg 960

tcttgacatc ctctgacaat cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg 1020

tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1080

caacccttga tcttagttgc cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca 1140

aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca 1200

cgtgctacaa tggacagaac aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa 1260

tctgttctca gttcggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta 1320

atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1380

accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc tttatggagc cagccgccgt 1440

aacggtgatc agagt 1455

Claims (9)

1.一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Y14，其已于2016年11月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.13258。

2.一种生防制剂，其活性成分为权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)Y14的发酵产物。

3.如权利要求2所述的生防制剂，其特征在于，所述生防制剂为液体菌剂。

4.如权利要求3所述的生防制剂，其特征在于，所述生防制剂中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Y14的含量大于或等于1×10⁸cfu/mL。

5.权利要求2-4任一项所述的生防制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：发酵权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Y14，得到发酵产物。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，发酵采用的培养基为LB培养基。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，发酵的条件为：温度：37℃；转速：180rpm培养24h。

8.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Y14或权利要求2所述的生防制剂在防治花生白绢病中的应用。

9.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Y14或权利要求2所述的生防制剂在在促进花生增产、增强花生的系统抗性、改善花生根际土壤微生物群落结构和/或高产铁载体中的应用。