CN115161219B - 一种海洋链霉菌及其在抑制微生物腐蚀中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海洋链霉菌及其在抑制微生物腐蚀中的应用。所述海洋链霉菌OUC‑MDZ 5840，分类命名为链霉菌（Streptomyces），保藏编号为CGMCC No.24457，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）。本发明涉及的海洋链霉菌，分离自南极磷虾，具有易培养，原料价廉易得的优点。本发明的海洋链霉菌用于抑制硫酸盐还原菌（SRB）引起的腐蚀，可有效抑制X65钢在海洋油田采出水环境中的平均腐蚀和局部腐蚀。具有无毒无害、生物活性强等特点，与传统的杀菌剂和缓蚀剂相比，不存在使用后的环境问题，符合环保发展的趋势，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物腐蚀控制技术领域，具体地说，涉及一种具有抑制硫酸盐还原菌（SRB）对金属腐蚀能力的海洋链霉菌及其应用。
背景技术
随着人们对海洋资源的开发利用，服役于海洋环境的基础工程用钢面临着严峻的腐蚀危害，严重制约着海洋经济的发展。海洋环境中微生物是影响金属材料腐蚀非常重要的因素之一，据统计，微生物腐蚀（MIC）占总腐蚀损失的 20％以上，而且往往和应力腐蚀、缝隙腐蚀等协同作用，造成巨大的安全隐患。SRB是诱导 MIC 的主要微生物之一，在所有微生物腐蚀中，SRB引发的腐蚀损失占总体的一半以上。
传统的抑制微生物腐蚀的方法如投加杀菌剂等方法，虽然短时间内能达到很好的效果，但存在细菌的耐药性增强以及带来的环境污染问题，甚至威胁到人类的健康。因此，开发环保、高效、低成本的抑制方法是MIC控制研究中亟待解决的问题。微生物防治法主要是利用不同种群之间的共生、竞争或拮抗作用，通过优势种群的转化或更替来减弱或抑制有害微生物的腐蚀问题。
目前尚无海洋链霉菌用于抑制SRB腐蚀的报道。与陆地相比，海洋环境具有高盐、高压、低温和稀营养的特征。与陆源微生物相比，海洋微生物能长期适应复杂的海洋环境而生存，其代谢物表现出特殊的生物活性，海洋链霉菌的次级代谢产物有较高的抑菌活性，为微生物防治及抗生素研发提供了参考。海洋链霉菌具有强大的酶系统，可以产生生物活性天然产物，具有可持续来源的巨大潜力，利用海洋链霉菌的次级代谢产物，可以抑制腐蚀性微生物SRB活性或与其共同作用以达到抑制腐蚀的效果，其作为一种经济简便环保的抗腐蚀方法，拥有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抑制SRB对X65钢平均腐蚀和局部腐蚀能力的海洋链霉菌及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种海洋链霉菌（Streptomyces），自南极磷虾中分离得到，其分类学特征如下：菌株号为OUC-MDZ 5840，分类命名为链霉菌（Streptomyces），保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No. 24457，保藏日期为2022年3月1日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。经16S rDNA基因序列分析，其序列如SEQ ID NO.1所示。
所述菌株以葡萄糖为碳源，温度25℃，pH为7.5-8.0条件下生长。
所述海洋链霉菌在抑制微生物腐蚀中的应用。
所述微生物腐蚀中的微生物为硫酸盐还原菌，脱硫肠状菌属。
进一步的，所述的海洋链霉菌在抑制硫酸盐还原菌引起的碳钢微生物腐蚀中的应用，所述碳钢为X65钢。
更进一步的，所述海洋链霉菌在抑制SRB对X65钢平均腐蚀和局部腐蚀能力中的应用，其方法是将所述海洋链霉菌用于海洋油田采出水环境，温度25℃。
本发明通过失重法评估了海洋链霉菌对SRB平均腐蚀的抑制效果，结果表明，相比较SRB单独存在的情况下，链霉菌的加入有效降低了X65钢的平均腐蚀速率。
本发明还发现海洋链霉菌具有抑制SRB局部腐蚀的能力，通过对去除腐蚀产物后的X65钢进行表面观察，发现相比较SRB单独存在的情况下，链霉菌加入后，X65钢表面无明显点蚀坑，抑制了SRB引起的局部腐蚀。
本发明的原理在于：此海洋链霉菌能够分泌独特的代谢产物，抑制SRB活性，在分泌物外层形成的均匀“蜂窝”状组织，有利于细胞组织、各类新陈代谢产物向材料表面的扩散及吸附，形成的生物膜与腐蚀产物膜更加致密，从而起到保护作用。
本发明的有益效果是：
本发明涉及的海洋链霉菌，分离自南极磷虾，具有易培养，原料价廉易得的优点。
本发明的海洋链霉菌用于抑制SRB引起的腐蚀，可有效抑制X65钢在海洋油田采出水环境中的平均腐蚀和局部腐蚀。具有无毒无害、生物活性强等特点，与传统的杀菌剂和缓蚀剂相比，不存在使用后的环境问题，符合环保发展的趋势，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例的海洋链霉菌5840在14d后对SRB的抑制效果图。
图2是本发明实施例的X65钢在含海洋链霉菌5840的海洋油田采出水中浸泡7d后的扫描电子显微镜（SEM）形貌图。
图3是本发明实施例的X65钢在SRB和混合菌体系中的平均腐蚀速率图。
图4是本发明实施例的X65钢在SRB体系中浸泡21d 后去除腐蚀产物的 CLSM 图像。其中，(a) 表面形貌；(b) 3D剖面图；(c)水平方向的腐蚀坑深度；(d)垂直方向的腐蚀坑深度。
图5是本发明实施例的X65钢在混合菌体系中浸泡21d 后去除腐蚀产物的 CLSM图像。其中，(a) 表面形貌；(b) 3D剖面图；(c)水平方向的腐蚀坑深度；(d)垂直方向的腐蚀坑深度。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步详细描述。下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：
一、菌株的分离与培养
称取样品10.0g南极磷虾加入10ml无菌水中研磨成酱备用。取1g虾酱加入10mL无菌水，然后进行超声沉积处理。取上清液1mL，加入到盛有9mL无菌海水的试管中进行样品稀释，作为10-1浓度梯度的样品液，同样操作，则依次得到10-2、10-3、10-4和 10-5浓度的样品溶液。吸取各个浓度梯度下的样品溶液0.3mL至于各个分离培养基上，均匀涂布至整个平板，倒置放于 16 ℃培养箱中培养9-18d。
选取各个分离培养基上长势较好的菌株记录形态并标记，接种环挑取菌落的菌丝或孢子，接于纯化培养基平板上进行平板划线，完成后将平板倒置放置，16℃恒温箱中培养3-5d，观察平板的表面，各个菌落的颜色与形态是否一致。将已纯化菌株转接于30%甘油中，置于-80℃长期保存。
海洋链霉菌进行摇瓶培养：液体培养基，挑选活化的单菌落接种于培养基，28℃，200r/min恒温摇床培养3天得到种子液。SRB培养基溶液调节pH至7.2±0.1后，充N2除氧约20 min，接种后30ºC恒温培养箱中富集培养3 d。所有培养基均在121℃下高压灭菌20 min。
表1链霉菌培养基成分
| 成分 | 葡萄糖 | 淀粉 | 酵母浸膏 | 蛋白胨 | 牛肉膏 | CaCO3 | KH2PO4 | MgSO4 | 海水 |
| 含量 (g/L) | 20 | 10 | 10 | 10 | 3 | 2 | 0.5 | 0.5 | 1L |
表2 SRB培养基成分
| 成分 | MgSO4·7H2O | K2HPO4 | NaCl | YE | 乳酸钠 | Vc | (NH)2Fe(SO4)2 |
| 含量 (g/L) | 0.2 | 0.01 | 10 | 1 | 4mL | 0.1 | 0.2 |
在灭菌后的西林瓶中按1:1加入链霉菌和SRB培养基，对照组接种SRB，实验组接种等量SRB和海洋链霉菌，恒温培养7d。
如图1所示，对照组SRB大量繁殖，其代谢产物H2S与溶液中的Fe2+反应使体系变黑；而接种混合菌体系中SRB产生的代谢产物较少，体系颜色无明显变化，说明海洋链霉菌对SRB的生长繁殖有抑制作用，筛选到一株具有抑制SRB对X65钢腐蚀的海洋链霉菌，命名为OUC-MDZ 5840，其分类命名为链霉菌（Streptomyces），保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No. 24457，保藏日期为2022年3月1日。
挑取适量纯培养物用于总DNA提取及16Sr RNA序列扩增，用SeqMan软件拼接获得16S rRNA基因序列长度为1394 bp，如SEQ ID NO.1所示。将序列在NCBI进行对比分析，其与Streptomyces thermolilacinus序列相似性最高（99.78%），经鉴定为链霉菌属(Streptomycessp.)。
二、表面形貌观察
研究钢种为X65管线钢，将X65钢加工成不同规格的试样，实验前，试样的工作面都要用SiC水相砂纸经400#、800#、1000#、2000#逐级打磨，打磨后依次用去离子水、无水乙醇清洗，冷风吹干后置于干燥器中备用。在无菌超净工作台中组装体系之前，试样用紫外线杀菌30 min，腐蚀介质是油田采出水。用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20 min。
对添加海洋链霉菌5840体系浸泡7d后的表面形貌进行观察，利用戊二醛固定细胞，不同浓度梯度的乙醇进行脱水，进行扫描电子显微镜（SEM）观察。对腐蚀试样表面生物膜以及腐蚀产物混合膜的形貌、致密程度进行观察，以探讨其对基体的保护作用。
如图2所示，通过SEM可以观察到海洋链霉菌膜内、膜外的如气丝、基丝、以及新陈代谢产物互相交联，在分泌物外层形成的均匀“蜂窝”状组织。其表面形成的“蜂窝”形表面利于接下来细胞组织、各类新陈代谢产物以及培养基溶液向材料表面的扩散及吸附。随着浸泡时间的延长，蜂窝状膜层会变得更加致密，材料表面有更多的菌类及新陈代谢产物聚集，最终形成较厚的膜层。
三、失重试验
采用失重法测定 X65 钢在SRB单独存在及混合时中的平均腐蚀速率。在细菌不同生长阶段设置浸泡周期为7 d、14 d、21 d。每个实验条件下设三个平行样以减小失重误差。浸泡结束后，取出试样，在除锈液中放入试样约5 min，除去表面的锈和污垢，依次用蒸馏水和无水乙醇将试样表面冲洗干净，最后用高纯度N2烘干。根据试样腐蚀前后的重量差计算得出X65钢的腐蚀速率：
(g/m2·h)
其中，v为试样的平均腐蚀速率（g/m2·h）；m1和m2分别是失重实验前、后试样的质量（g）；s为测试试样的表面积（m2）；t为实验浸泡周期（h）。
失重结果如图3所示，SRB体系腐蚀速率较高，混合菌体系中腐蚀速率显著下降，这可能是由于在细菌生长前期，链霉菌与SRB存在营养物质、生存空间的竞争，导致SRB数量及活性有所下降，从而延缓了碳钢腐蚀。14d后，随着腐蚀产物的积累，SRB体系腐蚀速率仍维持较高水平。混合菌体系腐蚀速率变化不大，随着细菌代谢产物的相互作用，在碳钢表面形成了较为致密的生物矿化膜，减缓了碳钢腐蚀。随着浸泡时间的延长，代谢产物的累积和腐蚀产物膜的脱落，SRB体系的腐蚀速率显著增加，混合菌体系略微增加，显著低于SRB体系，这可能与腐蚀产物膜的致密程度以及链霉菌代谢产物对SRB的抑制有关。
四、激光共聚焦扫描显微镜观察
为进一步探究链霉菌对SRB点蚀的抑制效果，对各体系浸泡21d后的X65钢进行激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）观察，在不同的放大倍率下对X65钢基体表面的局部腐蚀参数（如点蚀坑数量、点蚀密度、平均点蚀直径、最大坑深等）进行分析，探究链霉菌对SRB局部腐蚀的抑制效果。
表3 X65钢在SRB体系中浸泡21d 后的腐蚀坑参数
表4 X65钢在混合菌体系中浸泡21d 后的腐蚀坑参数
如图3所示，在SRB体系中浸泡21d后，X65钢表面均出现了不同程度的点蚀坑。如表3所示，随着浸泡时间延长，点蚀坑数量增加，最大腐蚀坑深度在第21d时达到26.12μm，平均腐蚀坑深度为3.59μm，导致了严重的局部腐蚀。在加入链霉菌后的混合菌体系中，如图5所示，可以观察到金属表面的腐蚀坑数量显著降低。如表4所示，最大腐蚀坑深度在第21d时减小到5.42μm，平均腐蚀坑直径以及腐蚀坑深度均明显减小，点蚀得到了显著抑制。
序列表
<110> 中国海洋大学
<120> 一种海洋链霉菌及其在抑制微生物腐蚀中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1394
<212> DNA
<213> 海洋链霉菌5840(Streptomyces thermolineatus)
<400> 1
accatgcagt cgaacgatga acccacttcg gtgggggatt agtggcgaac gggtgagtaa 60
cacgtgggca atctgccctg cactctggga caagccctgg aaacggggtc taataccgga 120
tacgaccact tcaggcatct gatggtggtg gaaagctccg gcggtgcagg atgagcccgc 180
ggcctatcag cttgttggtg aggtaacggc tcaccaaggc gacgacgggt agccggcctg 240
agagggcgac cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 300
tggggaatat tgcacaatgg gcgaaagcct gatgcagcga cgccgcgtga gggatgacgg 360
ccttcgggtt gtaaacctct ttcagcaggg aagaagcgaa agtgacggta cctgcagaag 420
aagcgccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg tagggcgcaa gcgttgtccg 480
gaattattgg gcgtaaagag ctcgtaggcg gcttgtcgcg tcggatgtga aagcccgggg 540
cttaaccccg ggtctgcatt cgatacgggc aggctagagt tcggtagggg agatcggaat 600
tcctggtgta gcggtgaaat gcgcagatat caggaggaac accggtggcg aaggcggatc 660
tctgggccga tactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc 720
tggtagtcca cgccgtaaac gttgggaact aggtgtgggc gacattccac gtcgtccgtg 780
ccgcagctaa cgcattaagt tccccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct aaaactcaaa 840
ggaattgacg ggggcccgca caagcggcgg agcatgtggc ttaattcgac gcaacgcgaa 900
gaaccttacc aaggcttgac atacaccgga aacacccaga gatgggtgcc cccttgtggt 960
cggtgtacag gtggtgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc 1020
cgcaacgagc gcaacccttg tcccgtgttg ccagcaggcc cttgtggtgc tggggactca 1080
cgggagaccg ccggggtcaa ctcggaggaa ggtggggacg acgtcaagtc atcatgcccc 1140
ttatgtcttg ggctgcacac gtgctacaat ggccggtaca aagagctgcg ataccgtgag 1200
gtggagcgaa tctcaaaaag ccggtctcag ttcggattgg ggtctgcaac tcgaccccat 1260
gaagtcggag tcgctagtaa tcgcagatca gcattgctgc ggtgaatacg ttcccgggcc 1320
ttgtacacac cgcccgtcac gtcacgaaag tcggtaacac ccgaagccgg tggcccaacc 1380
ccttgtggga ggga 1394
Claims (4)
1.一种海洋链霉菌，其特征在于，其菌株号为OUC-MDZ 5840，分类命名为链霉菌（Streptomyce），保藏编号为CGMCC No.24457，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的海洋链霉菌在抑制硫酸盐还原菌引起的碳钢微生物腐蚀中的应用。
3.如权利要求2所述的海洋链霉菌在抑制硫酸盐还原菌引起的碳钢微生物腐蚀中的应用，其特征在于，所述碳钢为X65钢。
4.如权利要求1所述的海洋链霉菌在抑制硫酸盐还原菌引起的X65钢平均腐蚀和局部腐蚀中的应用。
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