CN101235359A

CN101235359A - 一种抗硫酸盐还原菌的微生物菌剂及其制备方法

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Publication number: CN101235359A
Application number: CNA2008100469911A
Authority: CN
Inventors: 陈悟; 曾庆福; 陈洪高; 陈海英; 李海燕; 夏东升; 王军
Original assignee: Wuhan University of Science and Engineering WUSE
Current assignee: Wuhan University of Science and Engineering WUSE
Priority date: 2008-03-04
Filing date: 2008-03-04
Publication date: 2008-08-06

Abstract

本发明涉及抗硫酸盐还原菌的微生物菌剂，是一种由能够分泌抗生素的细菌即粘细菌、链霉菌和芽孢杆菌中的一种或几种，经过培养形成单个或混合的菌液产品，或发酵后形成单个或混合发酵液及其提取浓缩液产品。该微生物菌剂的制备方法是：将粘细菌、链霉菌以及芽孢杆菌中的一种或几种的菌株经斜面活化后，接种到优化培养基中培养，再通过工程驯化、放大培养后得到；或者，将所述的菌株经纯培养条件下发酵或混合培养条件下发酵得到。该微生物菌剂能够完全抑制膜垢中有害细菌的生长；可减少化学药剂的使用，利于生态环境的保护；特别适用于油田回注水系统、各种循环水系统、中央空调冷却水系统中的硫酸盐还原菌腐蚀的防治；并且制备工艺简单，易于实施。

Description

一种抗硫酸盐还原菌的微生物菌剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种能够抑制或杀灭金属管道中硫酸盐还原菌的生物学产品，特别是涉及一种高效抗硫酸盐还原菌的微生物菌剂及其制备方法。

背景技术

在油田回注水系统、各种循环水系统、中央空调冷却水系统中，存在一定数量的有害细菌和适合它们生长的各种营养源。特别是在油田注水系统中危害最大的细菌主要有3类，即硫酸盐还愿菌(Sulfate-reducing Bacteria，SRB)、铁细菌(Iron Bacteria，IB)及腐生菌(TGB)。这三类细菌利用存在于管壁上钙垢、铁垢等结垢产物，并互相利用各自的代谢产物、腐蚀产物在金属管壁或器壁上形成生物膜垢。由腐蚀产物和结垢产物的形成的膜垢为菌类的生长繁殖提供了场所，细菌的大量繁殖可加速管线、设备的腐蚀及结垢，而管线、设备的腐蚀和结垢又会进一步促进菌类的大量的繁衍。

为了减少这类腐蚀所带来的巨大损失，人们已经开发出大量的化学杀菌剂，例如：季铵盐类、季鏻盐类、锍盐、胍盐、异噻唑啉酮类、甲硝唑类、醛类、二硫氰基甲烷等等。但是，由于这类细菌极强的适应环境的能力，以及膜垢的天然屏障作用。一旦有了生存环境，它们又很快生长并大量繁殖。因此，使用化学药剂不但使加药量越来越大，防治成本越来越高，而且造成污染环境，很难取得预期的防治效果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种抗硫酸盐还原菌的微生物菌剂，以利于金属防腐、环境保护和水处理，同时还提供该微生物菌剂的一种容易推广的制备方法。

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：

本发明提供的抗硫酸盐还原菌的微生物菌剂是由能够分泌抗生素的细菌即粘细菌、链霉菌和芽孢杆菌中的一种或几种，经过培养形成单个或混合的菌液产品，或发酵后形成单个或混合发酵液及其提取浓缩液产品。

根据Postgate J.R.在1979年发表的文章(The sulfate-reducing bacteria)中所提到的对SRB有抑制作用的抗生素种类，本发明对其中的绝大部分抗生素进行静止状态下的抑菌圈实验，所用的抗生素均是医药级用品，通过实验了解到其中的链霉素、多粘菌素B、多粘菌素E、杆菌肽、短杆菌肽S抑制SRB的效果较好，除了链霉素以外，其它几种又与文献报道的效果相符合。从各种途径我们获得了相关菌株，利用细菌培养基进行分类培养和组合培养，通过单独或混合发酵提取液对SRB的抑制实验，以及直接用一种菌株和组合菌群同SRB菌株的一起培养实验，实验方法包括在有氧条件下或无氧条件下的抑菌实验，包括不同培养基环境下的抑菌实验，不同加菌数量的抑菌实验等等，进一步确定了这几种细菌对SRB的协同抑制作用。

本发明中的细菌群是由好氧菌或兼性厌氧菌组成。包括粘细菌、链霉菌、芽孢杆菌等属中的一种或几种组成。粘细菌中的纤维堆囊菌是从筛选抗癌药物环氧噻酮epothilones的过程中得到的两株菌种，这两株菌无论是菌体还是发酵提取液对SRB均有很好的抑制作用。链霉菌的确定是在对普通抗生素的杀灭SRB的效果过程中得出的。通过对不同种类的链霉菌进行相同条件下的效果比较时发现：链霉菌中的几株东方链霉菌分泌的万古霉素杀菌效果最好，也选作为本专利的候选菌株。芽孢杆菌分泌的杆菌肽或多粘菌素对SRB有较好的拮抗作用，从油田地面污水分离得到的一株枯草芽孢杆菌能够产生杆菌肽，一株多粘芽孢杆菌能够产生抗敌素即多粘菌素E，一株地衣芽孢杆菌产生的是多胜菌素甲，这几类细菌产生的均是多肽类化合物，对革兰氏阴性菌有较强的抗菌活性，在本专利的实施例中也有很好的抑制回注水中有害细菌的作用。

本发明提供的制备上述抗硫酸盐还原菌的微生物菌剂的方法是：将粘细菌、链霉菌以及芽孢杆菌中的一种或几种的菌株经斜面活化后，接种到优化培养基中培养，再通过工程驯化、放大培养后得到的单个或混合的菌液产品；或者，将所述的菌株经纯培养条件下发酵或混合培养条件下发酵所得的单个或混合发酵液及其提取浓缩液产品。

本发明的人工诱变方法主要是指复合因子处理方法，即用两种以上的诱变因子共同诱发菌体突变。由于DNA分子上的不同基因位点对各种诱变剂吸收阈值有较大差异，用多因子复合处理，可以取长补短，动摇DNA分子上多种基因的遗传稳定性，以弥补某种不亲和性或热点饱和现象，容易得到更多突变菌株。本发明的多因子方法包括紫外线光复合交替处理方法，同一种诱变剂连续重复使用，不同诱变剂交替使用，以及多个诱变剂同时处理等方法。本发明涉及多个菌属，不同菌种诱变方法差别较大，通过一系列的诱变方法复合处理，选育得到符合要求的优良菌株。

本发明的细菌群富集培养组方和培养时间：将野生菌株进行优化后，其中分泌的抗生素量大于野生菌；但由于细菌群中含有普通细菌、放线菌和粘细菌中的一种和几种，而这几类细菌的营养源成分各不相同，生长速度也不一样。根据我们实验结论，得出细菌群富集培养组方为：培养基按质量百分比为：K₂HPO₄(0.05～0.1％)，MgSO₄·7H₂O(0.01～0.05％)，CaCl₂(0.05～0.1％)，酵母粉(0.1～0.2％)，蛋白胨(0.1～0.3％)，葡萄糖(0.1～0.3％)调pH为6.8～7.2。培养时间在细菌群中不含有链霉菌的情况下为2～5天；在含有链霉菌时培养时间为3～7天。

本发明的工程菌群驯化方法：通过混合培养基将细菌群进行扩大培养后，为了适合油田回注水的生长条件，缩短细菌群在注水系统中的生长滞留期，必须给这些投加细菌群进行工程驯化。驯化方法包括：将需要处理的油田回注水按5～85％的比例逐级稀释到混合培养基中，每级按5％的稀释度投加，按照细菌群中细菌的种类选择每次培养时间2～7天，得到可以直接加入回注水中的混合工程菌群。

本发明的工程菌群加入回注水的方式：将驯化工程菌群放大培养，使得菌量达到10¹¹个/mL以上后，直接用瓶口较长且细的桶分装，加入石蜡油密封，在5～20天内，在控制回注水5～20mm/s流量的情况下，冲击式加入驯化菌群，使得起始回注水的菌体含量为10⁴～10⁷个/mL。根据注水管长度决定加菌的时间，一般为15～120min。也可以在保证注水全线回注水中含有工程菌的情况下，封闭管道1～2天，以保证工程细菌群在管壁或器壁上有足够的附着量。

本发明从降低成本和保护环境出发，通过对油田回注水系统金属管道管壁膜垢的形成机理、组成成分、与腐蚀关系、治理方法以及可利用途径等的研究，从直接给管道外加微电流、高频水处理器以及化学阻垢剂来最大限度的减小膜垢的危害，逐步过渡到利用生物膜来构建新的回注水微生态系统，又通过在膜垢上引入新的细菌种群，利用这些细菌源源不断分泌的代谢产物来抑制膜垢里的硫酸盐还原菌的生长所具有的成效，而开发出了这种能够抑制或杀灭水系统中硫酸盐还原菌的微生物菌剂。

本发明提供的微生物菌剂，其抑制或杀灭水系统中硫酸盐还原菌的机理是：自然利用存在于管壁上的生物膜垢对微生物的吸附作用，将能够分泌抗生素的菌体产品加入水系统中，通过这些微生物源源不断产生的化学物质，杀灭同样存在于膜垢中对管壁产生腐蚀的硫酸盐还原菌以及处于游离状态的该类细菌；或者直接利用发酵产品加入到水系统中，抑制硫酸盐还原菌的生长，进而达到保护金属管壁和金属器壁目的。

本发明的创新点在于利用粘细菌、链霉菌、枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、产气芽孢杆菌以及小球菌中的两株或两株以上的菌种加入油田回注水系统的方法；也包括直接利用这几种细菌的代谢物包括多糖、万古霉素、多粘菌素B、多粘菌素E、杆菌肽、短杆菌肽S中的两种或两种以上作用于回注水系统，能够抑制回注水系统有害细菌生长的方法。

本发明提供的微生物菌剂，在处理硫酸盐还原菌腐蚀系统时，主要有以下几个优点：

①能够完全抑制膜垢中有害细菌的生长，达到保护整个金属管壁和器壁的目的；

②最大限度的减少水系统化学药剂的使用，有利于生态环境的保护；

③大大降低水处理成本；

④在用于油田回注水系统中时，通过细菌分泌的各种能溶于水的多糖和各种抗菌肽，能增加水体粘度，并增加注入水与井下油的亲合性，使注入水穿过储油层时，有效提高驱油率；

⑤特别适用于油田回注水系统、各种循环水系统、中央空调冷却水系统中的硫酸盐还原菌腐蚀的防治。

本发明提供的微生物菌剂，其制备方法工艺简单，易于实施。

具体实施方式

本发明提供的抗硫酸盐还原菌的微生物菌剂，其由能够分泌抗生素的细菌即粘细菌、链霉菌和芽孢杆菌中的一种或几种，经过培养形成单个或混合的菌液产品，或发酵后形成单个或混合发酵液及其提取浓缩液产品。

所述的细菌中，粘细菌可以是纤维堆囊菌，链霉菌可以是东方链霉菌，芽孢杆菌可以是枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中的一种或几种。

本发明提供的抗硫酸盐还原菌的微生物菌剂，其制备方法是：将粘细菌、链霉菌以及芽孢杆菌中的一种或几种的菌株经斜面活化后，接种到优化培养基中培养，再通过工程驯化、放大培养后得到的单个或混合的菌液产品；或者，将所述的菌株经纯培养条件下发酵或混合培养条件下发酵所得的单个或混合发酵液及其提取浓缩液产品。

上述的菌液产品可采用包括以下步骤的方法制备：

(1)利用混合培养基对所述菌株富集培养：

混合培养基的各组分的质量含量为：K₂HPO₄ 0.05～0.1％，MgSO₄·7H₂O 0.01～0.05％，CaCl₂ 0.05～0.1％，酵母粉0.05～0.2％，蛋白胨0.05～0.3％，含葡萄糖0.1～0.3％，pH为6.8～7.2；

(2)工程菌群的驯化方法：将需要处理的含有硫酸盐还原菌的微生态系统中的水按混合培养基总质量的5～85％的比例逐级投加到混合培养基中，分别培养3～5天，得到适应在含有硫酸盐还原菌的微生态水环境的驯化菌液；

(3)将驯化菌液放大培养，使得总菌量达到10¹¹个/mL以上后，直接用瓶口较长的桶分装，加入石蜡密封备用。

上述的发酵液及其提取浓缩液产品可采用包括以下步骤的方法制备：

纯培养条件下的发酵产品是将粘细菌、链霉菌以及芽孢杆菌属中的一种菌株在各自培养基培养条件下经纯培养发酵后，得到发酵原液或经过提取浓缩后的浓缩液的产品，或者再将得到的几种发酵液及其提取浓缩液混合后形成的产品；

混合培养条件下的发酵产品是将粘细菌、链霉菌以及芽孢杆菌属中的一种以上的菌株在混合培养基中发酵后，得到的混合发酵液或经过提取浓缩后的混合浓缩液的产品。

在工程菌群的驯化过程中，其菌种可以是野生的，也可以是经培养基优化或经诱变的菌种；其中的粘细菌可以是纤维堆囊菌，链霉菌可以是东方链霉菌，芽孢杆菌可以是枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中的一种或几种。

所述的发酵提取液中含有多糖、多肽、万古霉素中的一种或几种；多肽是指杆菌肽、多粘菌素B、多粘菌素E、多胜菌素甲、多杀菌素中的一种或几种。

本发明利用单个或混合菌液产品来杀灭或抑制硫酸盐还原菌生长，防治硫酸盐还原菌对金属储水罐、金属管道和机械水泵或加压泵的腐蚀。

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明。

实施例1.粘细菌的分离、富集和抑菌效果：

从土壤中分离得到的一株粘细菌在混合培养基中培养，混合培养基各组分的质量含量为：K₂HPO₄(0.1％)，CaCl₂(0.1％)，酵母粉(0.2％)，蛋白胨(0.2％)，葡萄糖(1％)，豆芽汁(0.2％)调pH为7.0～7.5。然后，在37℃培养5～7天后，离心得到上清液和菌体，检测结果为最小抑菌量为3mL，最小抑菌值为0.5g。经一系列的培养基优化后得到的菌株其检测结果为最小抑菌量为1mL，最小抑菌值为0.3g。

实施例2.东方链霉菌等菌种单独检测结果：具体结果见表1。

实施例3.混合菌液的混合培养和驯化方法：

将本发明中涉及的有益细菌中的两种或两种以上经诱变或培养基优化的细菌加入到混合培养基中发酵培养，即在K₂HPO₄(0.05～0.1％)，MgSO₄·7H₂O(0.01～0.05％)，CaCl2(0.05～0.1％)，酵母粉(0.1～0.2％)，蛋白胨(0.1～0.3％)，葡萄糖(0.1～0.3％)调pH为6.8～7.2中培养3～7天。接种到驯化培养基中驯化，驯化方法为：将需要处理的油田回注水按5～90％的比例逐级稀释到混合培养基中，每级按5％的稀释度投加，按照细菌群中细菌的种类选择每次培养时间2～7天，得到可以直接加入回注水中的混合工程菌群。

实施例4.不同混合比例的有益混合工程菌群的抑菌效果：

分别取油田地面污水(含菌量为10⁷个/mL)10公斤，加入9种不同菌种比例的驯化工程混合菌群(含菌量为10¹²个/mL)，补加入50mL的乳酸钠和适量的指示剂硫酸亚铁铵，常温静止状态下，测定所需加入的最小抑菌量，结果见表2。

实施例5.有益混合工程菌群对游离状态下的硫酸盐还原菌的抑制效果：

效果评价方法为：取10mL油田地面污水(含菌量为10⁷个/mL)，加到20mL的磨口试管(带磨口塞)中，补加入1mL的乳酸钠和适量的指示剂硫酸亚铁铵(紫外照射灭菌)，分别加入混合工程菌群0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL(含菌量为10¹⁰个/mL)，每天观察试管颜色的变化，试管变黑表明失去抑制效果。结果见表1，从表中可以看出：只要加入有益混合细菌群的量达到一定程度，就能完全抑制SRB的生长。结果见表3。表3中符号“——”表示该试管一直没有变黑。

实施例6.对生物膜下的SRB的抑制效果：

将同样规格的17片A3钢板试片，用金相砂纸打磨，无水乙醇脱脂，干燥后称重并放于紫外灯下灭菌，插入接种有SRB、TGB菌种的加有乳酸钠的普通细菌培养基的500mL广口瓶中(SRB含量为10⁵个/mL)，用石蜡将瓶口封严；置于35℃恒温箱中，培养4天，可观察到试片表面形成了由菌膜和腐蚀产物组成的生物膜。取出其中试片5片，用刷子刷下生物膜并洗干净，干燥后称重，计算相应试片的腐蚀率，并得出每天的平均腐蚀率；将剩下的12个试片取出，放入加有乳酸钠的普通细菌培养基的广口瓶中(与原来培养基配比和量完全一样)，在此瓶中接种混合工程菌群5mL(含量为10¹²个/mL)后；在厌氧培养箱中恒温35℃培养，每隔24小时取出3个试片洗干净、干燥、称重，并计算出当天的平均腐蚀率。表4是所加一组混合工程菌群的平均腐蚀率结果。该混合工程细菌群的比例为：东方链霉菌(45％)、枯草芽孢杆菌(30％)、多粘芽孢杆菌(15％)、粘细菌(10％)。

本发明的实施例中细菌的抑制效果评价方法均是：经过适当的发酵时间以后，将发酵液离心8～10分钟(转速为8000转/分)，取其上清液几毫升与油田地面污水10mL(硫酸盐还原菌10⁷个/mL)作用3小时，用绝迹稀释法检测活菌的数量，以所有测试瓶没有变化的所需上清液的毫升值为最小抑菌量。同时称取离心管底部菌体少许，接种到10mL SRB培养基(该培养基刚刚接种了一定量的硫酸盐还原菌，使得培养基中SRB的含量为10⁵个/mL)的20mL磨口试管中，在30℃左右的恒温培养箱中培养15天，如果试管没有变黑，此时对应的菌体的质量为最小抑菌值。

附表

表1不同菌种的单独检测结果

表2有益混合菌群对硫酸盐还原菌的抑制效果

加入混合工程菌群实验号	1	2	3	4	5	6	7	8	9
加入混合工程菌群实验号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	最小抑菌量(g)	350	420	270	152	240	175	190	163	308

表3有益混合菌群对硫酸盐还原菌的抑制效果

加入混合菌群量(mL)	0.5	1.0	1.5	2.0	2.5	3.0	3.5	4.0
加入混合菌群量(mL)	0.5	1.0	1.5	2.0	2.5	3.0	3.5	4.0	试管变黑经过时(天)	10	--	--	--	--	--	--	--

表4生物膜下的钢片平均腐蚀速率

天数	前四天	第5天	第6天	第7天	第8天
天数	前四天	第5天	第6天	第7天	第8天	平均腐蚀速率(克/天)	0.069	0.014	0.008	0	0

Claims

1.一种抗硫酸盐还原菌的微生物菌剂，其特征是由能够分泌抗生素的细菌即粘细菌、链霉菌和芽孢杆菌中的一种或几种，经过培养形成单个或混合的菌液产品，或发酵后形成单个或混合发酵液及其提取浓缩液产品。

2.根据权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于：粘细菌是指纤维堆囊菌。

3.根据权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于：链霉菌是指东方链霉菌。

4.根据权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于：芽孢杆菌是指枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中的一种或几种。

5.一种抗硫酸盐还原菌的微生物菌剂的制备方法，其特征是：将粘细菌、链霉菌以及芽孢杆菌中的一种或几种的菌株经斜面活化后，接种到优化培养基中培养，再通过工程驯化、放大培养后得到的单个或混合的菌液产品；或者，将所述的菌株经纯培养条件下发酵或混合培养条件下发酵所得的单个或混合发酵液及其提取浓缩液产品。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是采用包括以下步骤的方法制备菌液产品：

(1)利用混合培养基对所述菌株富集培养：

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是采用包括以下步骤的方法制备发酵液及其提取浓缩液产品：

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征是在工程菌群的驯化过程中，其菌种是野生的，或者是经培养基优化或经诱变的菌种；其中的粘细菌是指纤维堆囊菌，链霉菌是指东方链霉菌，芽孢杆菌是指枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中的一种或几种。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征是所述的发酵提取液中含有多糖、多肽、万古霉素中的一种或几种；多肽是指杆菌肽、多粘菌素B、多粘菌素E、多胜菌素甲、多杀菌素中的一种或几种。

10.根据权利要求1所述的抗硫酸盐还原菌的微生物菌剂，其特征是利用单个或混合菌液产品来杀灭或抑制硫酸盐还原菌生长，防治硫酸盐还原菌对金属储水罐、金属管道和机械水泵或加压泵的腐蚀。