CN105154464A - 利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法。本发明属于石油微生物分子生物学技术领域。利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法：首先，利用基因工程遗传学和分子生物学的方法克隆获得能够特异性表达生物类抗菌剂的目的DNA即功能基因片段，然后，通过特异性的载体在体外将功能基因片段导入受体，筛选并获得转化成功的重组子即携带能够特异性表达生物类抗菌剂的好氧成膜菌，最后，使功能基因在好氧成膜菌内高效表达出相应的产物，杀灭成膜菌生物膜包裹在内的或游离态的硫酸盐还原菌，实现抑制和缓解有害菌对管材的腐蚀。本发明具有操作简便，经济实用，处理高效，靶向性强，可在原位持续发挥作用等优点。

Description

利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法
技术领域
本发明属于石油微生物分子生物学技术领域，特别是涉及一种利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法。
背景技术
目前，广泛存在于石油生产厌氧环境中的硫酸盐还原菌(SRB)极易导致钢铁和合金管材等的腐蚀失效，严重干扰了油田的正常生产作业并带来了极大的经济损失，抑制和缓解由SRB导致的腐蚀破坏已日益成为世界油气行业关注的重点问题。
一般使用化学或生物类杀(抗)菌剂作为一种传统的杀灭SRB并缓解由其导致金属腐蚀的方法，但是该方法除了受制于SRB细菌本身对处理药剂的耐受性外，由于SRB特别是由好氧微生物附着于金属表面形成的生物膜所包裹的厌氧环境中的SRB，因杀(抗)菌剂难以透过成膜菌形成生物膜所分泌的胞外多糖等“基质壁垒”而有效作用于靶点，由此导致化学或生物类杀(抗)菌剂对这一部分SRB常常难以达到有效的作用效果。
发明内容
本发明为解决公知技术中存在的技术问题而提供一种利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法。
本发明的目的是提供一种操作简便，经济实用，处理高效，靶向性强，可在原位持续发挥作用，适用范围广等特点的利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法。
一种利用有益成膜菌原位抑制SRB及其导致腐蚀的方法，其特点是：首先利用基因工程遗传学和分子生物学的方法克隆获得能够特异性表达化学或生物类杀(抗)菌剂的目的DNA即功能基因片段，然后通过特异性的载体在体外将功能基因导入受体即好氧成膜菌体内，筛选并获得转化成功的重组子即携带能够特异性表达化学或生物类杀(抗)菌剂的好氧成膜菌，最后在一定的条件下使功能基因在成膜菌内高效表达出相应的产物，通过杀灭成膜菌生物膜包裹在内的(或游离态的)SRB达到抑制和缓解有害菌SRB对钢材腐蚀的目的。
有益成膜菌是指一类好氧或兼性好氧的能够形成生物膜而附着生长的细菌群体如常见的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等，这些细菌群体在经以上基因功能化后而能够表达特异性产物作用于SRB。
组成有益成膜菌生物膜的细菌群体因好氧代谢消耗溶解性的氧，因而造成其膜内的局部且狭小的厌氧区域而有利于SRB的厌氧生长由此导致金属的腐蚀破坏。
有益成膜菌对导致金属腐蚀SRB的原位作用是指经培养后能够表达特异性杀(抗)菌剂的成膜菌对包裹于其生物膜内(原地、原位)的固着于金属表面的厌氧SRB的杀灭或清除效应。
本发明利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法所采取的技术方案是：
一种利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法，其特点是：该方法包括以下过程：
首先，利用基因工程遗传学和分子生物学的方法克隆获得能够特异性表达生物类抗菌剂的目的DNA即功能基因片段，然后，通过特异性的载体在体外将功能基因片段导入受体即好氧成膜菌体内，筛选并获得转化成功的重组子即携带能够特异性表达生物类抗菌剂的好氧成膜菌，最后，使功能基因在好氧成膜菌内高效表达出相应的产物，通过杀灭成膜菌生物膜包裹在内的或游离态的硫酸盐还原菌，实现抑制和缓解有害菌硫酸盐还原菌对管材腐蚀。
本发明利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法还可以采用如下技术方案：
所述的利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法，其特点是：利用基因工程遗传学和分子生物学的方法为运用PCR的分子克隆遗传学手段来获取能够特异性表达生物类抗菌剂的功能基因片段的过程。
所述的利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法，其特点是：功能基因片段进行修饰和处理，增加表达控制元件启动子和分泌序列信号肽。
所述的利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法，其特点是：利用基因工程遗传学和分子生物学的方法为将获得的功能基因片段通过生物转化分子生物学操作手段导入好氧成膜菌体内，采用构建携带功能基因片段的重组载体来实现。
所述的利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法，其特点是：利用基因工程遗传学和分子生物学的方法为筛选转化导入功能基因成功的阳性转化子，即运用筛选方法挑选出重组而携带有能够表达特异性基因片段的阳性成膜微生物。
所述的利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法，其特点是：功能基因包括对应细菌素、胞外酶、抗菌肽类、蛋白酶、RNA降解酶等作用于SRB后起到抑制作用的分子大小和结构不同的DNA片段。
所述的利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法，其特点是：有益成膜菌为好氧或兼性好氧并能够形成生物膜而附着生长的细菌群体。
所述的利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法，其特点是：有益成膜菌为包含常见的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌在内的一类好氧或兼性好氧细菌。
本发明具有的优点和积极效果是：
利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法由于采用了本发明全新的技术方案，与现有技术相比，本发明具有以下明显特点：
(1)本发明应用基因工程手段利用有益成膜菌表达特异性的化学或生物类杀(抗)菌剂来达到对由其生物膜包裹厌氧环境中SRB导致的腐蚀，能够有效解决一般杀(抗)菌剂因不能有效到达靶向位点而失去对SRB的杀灭和缓解腐蚀的目的。
(2)本发明构建的基因工程化的有益成膜菌，能够在其生长位点持续性表达特异性的化学或生物类杀(抗)菌剂，并作用于被其生物膜包裹的SRB，从而达到科学、经济、高效、定点和就地原位解决SRB导致的腐蚀破坏问题。
(3)该基因工程化的有益成膜菌所表达的化学或生物类杀(抗)菌剂，也能分泌到生物膜外，对菌体胞外游离态的SRB也具有积极地杀灭作用，从而缓解金属腐蚀。
附图说明
图1是基因工程化的有益成膜菌在原位抑制SRB及其导致腐蚀的作用示意图；
图2是可在原位抑制SRB及其导致腐蚀的基因工程化的有益好氧成膜菌的工艺流程图。
具体实施方式
为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下：
参阅附图1和图2。
实施例1
一种利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法，运用遗传学和分子生物学的方法设计寡核苷酸引物进行PCR克隆获得表达抗菌多肽(indolicidin)和细菌素的功能基因片段，同时借助组成型碱性蛋白酶启动子和构建重组质粒载体，然后经电转化导入枯草芽孢杆菌BacillussubtilisBE1500和WB600两种受体菌株中，筛选获得转化成功的能够表达目的抗菌物质多肽类和细菌素的阳性转化子，即基因工程化的B.subtilis菌株。经培养后，检测到工程化的B.subtilisBE1500和WB600所形成生物膜内产生的抗菌物质能抑制SRB诱导的对304不锈钢的腐蚀，抑制程度达到相同条件下非工程菌株生物膜内SRB介导的腐蚀程度的12倍，SRB产生的H2S气体和S2-介导的FeS沉淀检测也明显减少。
实施例2
一种利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法，运用遗传学和分子生物学的方法设计寡核苷酸引物进行PCR克隆获得表达细菌素的功能基因片段，为使表达的细菌素能分泌到胞外培养液中特引入了分泌肽apr信号序列，随后借助来源于枯草芽孢杆菌属的质粒DNA构建获得表达细菌素的质粒载体pBE92-Bac。然后化学转化大肠杆菌EscherichiacoliXLI感受态细胞，蓝白斑筛选获得转化成功的E.coli重组菌株。培养重组E.coli菌株再次提取获得多拷贝的质粒DNA载体pBE92-Bac，然后电击转化B.subtilisBE1500菌株，根据不同抗生素筛选标记等手段获得重组了目的基因的B.subtilisBE1500菌株。合适的培养基培养工程化的B.subtilisBE1500菌株后，检测到分泌到培养物中的细菌素浓度达到3μg/mL,浓缩上清液加入到SRB菌株的培养物中，活性测试发现培养了3～5天后的悬浮培养物中SRB活性降低了83％，菌液浊度较培养初期明显变小，说明了工程菌株分泌的细菌素也对游离的SRB具有较好的抑制作用。
本实施例具有所述的操作简便，经济实用，处理高效，靶向性强，可在原位持续发挥作用，适用范围广等积极效果。

Claims (8)

1.一种利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法，其特征是：该方法包括以下过程：
首先，利用基因工程遗传学和分子生物学的方法克隆获得能够特异性表达生物类抗菌剂的目的DNA即功能基因片段，然后，通过特异性的载体在体外将功能基因片段导入受体即好氧成膜菌体内，筛选并获得转化成功的重组子即携带能够特异性表达生物类抗菌剂的好氧成膜菌，最后，使功能基因在好氧成膜菌内高效表达出相应的产物，通过杀灭成膜菌生物膜包裹在内的或游离态的硫酸盐还原菌，实现抑制和缓解有害菌硫酸盐还原菌对管材的腐蚀。
2.根据权利要求1所述的利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法，其特征是：利用基因工程遗传学和分子生物学的方法为运用PCR的分子克隆遗传学手段来获取能够特异性表达生物类抗菌剂的功能基因片段的过程。
3.根据权利要求2所述的利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法，其特征是：功能基因片段进行修饰和处理，增加表达控制元件启动子和分泌序列信号肽。
4.根据权利要求1所述的利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法，其特征是：利用基因工程遗传学和分子生物学的方法为将获得的功能基因片段通过生物转化分子生物学操作手段导入好氧成膜菌体内，采用构建携带功能基因片段的重组载体来实现。
5.根据权利要求1所述的利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法，其特征是：利用基因工程遗传学和分子生物学的方法为筛选转化导入功能基因成功的阳性转化子，即运用筛选方法挑选出重组而携带有能够表达特异性基因片段的阳性成膜微生物。
6.根据权利要求1所述的利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法，其特征是：功能基因包括对应细菌素、胞外酶、抗菌肽类、蛋白酶、RNA降解酶作用于SRB后起到抑制作用的分子大小和结构不同的DNA片段。
7.根据权利要求1所述的利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法，其特征是：有益成膜菌为好氧或兼性好氧并能够形成生物膜而附着生长的细菌群体。
8.根据权利要求7所述的利用有益成膜菌原位抑制硫酸盐还原菌导致腐蚀的方法，其特征是：有益成膜菌为包含常见的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌在内的一类好氧或兼性好氧菌。
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