CN105368866B - 改良ATMT在构建深绿木霉T23△Crel中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改良ATMT在构建深绿木霉T23ΔCrel中的应用；以深绿木霉T23的基因组DNA为模板，对crel基因序列进行PCR扩增，获得crel基因的上、下游侧翼序列；再分别导入敲除质粒pC1300qh的上、下游，形成重组质粒pC1300qh‑Δcrel；将重组质粒pC1300qh‑Δcrel转化大肠杆菌感受态，验证、筛选阳性克隆，提取重组质粒pC1300qh‑Δcrel，导入根癌农杆菌AGL1进行改良的ATMT转化，即可。本发明通过改良的ATMT转化技术成功构建了深绿木霉碳代谢抑制因子CRE1敲除突变株，该T23Δcrel菌株具有促进木霉菌细胞壁降解酶分泌及活性，间接提高木霉菌拮抗病原菌的功能。

Description

改良ATMT在构建深绿木霉T23△Crel中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种改良的农杆菌介导ATMT转化方法在构建深绿木霉T23△Crel菌株中的应用。

背景技术

目前，全球对农副产品需求量(数量和质量)逐年提高，传统模式下的农作物种植需要依靠高效的化学农药来预防病原微生物侵袭，以创造稳定、可观的经济效益，而多种化学农药的田间使用所产生的负面效应日益彰显，首先一些病原菌对低剂量的化学农药产生抗药性，杀灭活性受到影响；更重要的是，消费者对于食用健康、安全、无农药残留的农产品及食品关注和重视程度不断提高。因此安全无毒的绿色生防制品的研发势在必行。木霉菌剂成为最具潜力和前景的生防制品，它们具有拮抗和抑制多种植物病源真菌、促进植物生长、提高营养利用效率，诱导植物抗性，激发防御能力和修复农用化肥造成环境污染等系列功能。木霉菌与病原菌互作过程中，拮抗机制中关键因素之一是分解细胞壁水解酶。

已有研究表明：木霉菌碳代谢抑制子CRE1全局性调控细胞生长代谢过程，保障木霉在不同生境中的存活及拮抗病原菌特性。木霉菌分子水平的遗传改造主要通过的是原生质体融合或根癌农杆菌介导的遗传转化(ATMT)等。ATMT转化是目前比较常用、相对简单快捷的方法，其主要利用同源重组的原理实现基因的敲除。在Ti质粒的T-DNA左右边界内构建需要转化的遗传元件，如同源重组敲除框、报告基因表达框等，利用农杆菌与受体菌的分子互作，将T-DNA中的遗传元件导入受体菌细胞核内，进一步整合到受体菌染色体组中，或者通过同源片段的互补配对，实现目的基因的双交换敲除。在构建敲除株的过程中，敲除载体和同源重组敲除框的构建十分关键，结构正确的敲除载体是获得基因敲除突变株的分子基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改良ATMT在构建深绿木霉T23△Crel中的应用。通过改进ATMT介导的遗传转化方法，将深绿木霉菌T23染色体的cre1基因进行敲除，获得的敲除株具有高产细胞壁降解酶的特性，提高了木霉菌拮抗多种病原菌的生防效果。

本发明首先克隆和分析了深绿木霉的碳代谢抑制因子CRE1的编码序列、蛋白结构等，然后从构建敲除载体出发，通过对cre1基因侧翼序列的PCR扩增，再将上下游侧翼序列分别插入敲除质粒pC1300qh潮霉素筛选标记的上下游，形成可以与基因组互补配对的同源臂。然后将构建好的重组质粒导入根癌农杆菌中，利用改进的ATMT转化，得到阳性转化子，再利用PCR和Southern blot等筛选和验证cre1基因敲除突变株。碳代谢抑制因子CRE1抑制了细胞壁降解酶中纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶等酶的表达，间接了影响了生防木霉对植物病原真菌细胞壁等降解过程。因此，T23Δcre1菌株具有高产细胞壁降解酶的高效拮抗菌株，未来可以用于木霉菌剂的研发。

本发明涉及的深绿木霉T23△Crel菌株为深绿木霉(T.atroviride)，已经于2015年11月3日递交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO:11574。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种改良的农杆菌介导ATMT转化方法在构建深绿木霉基因敲除菌株中的应用，所述转化方法采用的诱导培养基为含40mmol/L MES和200μmol/L AS的IM培养基，诱导时间为36h～48h。

优选的，采用的选择性培养基为含200μg/mL潮霉素和300μg/mL特美汀的IM固体培养基。其中，IM固体培养基：10mM K₂HPO₄,10mM KH₂PO₄,2.5mM NaCl,2mM MgSO₄,0.7mMCaCl₂,9mM FeSO₄·7H₂O,4mM(NH₄)₂SO₄,10mM葡萄糖,40mM MES(pH 5.3),200μM AS,0.5％甘油，1.4％琼脂。传统的选择性培养基由CYA培养基或PDA加抗生素组成，不含诱导剂，因此在筛选过程中不产生诱导作用，而转化诱导时间仅36h，对深绿木霉而言，诱导时间不足，ATMT转化效率低；将传统选择性培养基优化为IM培养基，并加入200μg/L潮霉素，诱导剂与抗生素同时作用，实现边诱导边筛选，抗生素的存在避免了孢子形成，而诱导剂诱导时间延长，提升了转化效率。300μg/mL特美汀添加更大程度抑制农杆菌的生长。此方法减少农杆菌在侵染过程中阻力，增加其侵染效率，与传统的ATMT方法相比，能够显著提高转化效率及转化子的稳定性。

优选的，所述转化方法中进行诱导培养时，采用的深绿木霉孢悬液中分生孢子的浓度为8×10⁶个/mL。

优选的，所述深绿木霉基因敲除菌株为敲除深绿木霉T23基因组中的Crel基因而得的深绿木霉T23△Crel菌株；所述深绿木霉T23△Crel菌株为深绿木霉(T.atroviride)CGMCC NO:11574。

优选的，所述转化方法包括如下步骤：

A1、在前期诱导共培养时，在所述诱导培养基中放入玻璃纸，再在玻璃纸上均匀涂布导入重组质粒pC1300qh-Δcre1的根癌农杆菌的菌液和深绿木霉T23孢悬液的等体积混合液，于25℃培养箱共培养36～48h；

A2、待白色菌丝铺满玻璃纸表面而未产孢的临界时期将玻璃纸转移至所述选择性培养基，于25℃培养5～7d，长出转化子；

A3、挑选可能的转化子到含300μg/mL的头孢与200μg/mL的潮霉素的PDA培养基，验证后在300μg/mL特美汀的PDA平板上传3代后，单孢分离再传一代后，用含潮霉素的平板验证，再经PCR验证得到阳性的转化子。

其中，重组质粒pC1300qh-Δcre1的构建是以提取的深绿木霉T23的基因组DNA为模板，分别对cre1基因侧翼序列进行PCR特异性扩增，获得cre1基因的上、下游侧翼序列；将上、下游侧翼序列分别导入敲除质粒pC1300qh的上、下游而形成的。

优选的，所述构建深绿木霉基因敲除菌株包括如下步骤：

S1、获取深绿木霉T23的cre1基因序列；

S2、重组质粒pC1300qh-Δcre1的构建：以提取的深绿木霉T23的基因组DNA为模板，对cre1基因序列进行PCR特异性扩增，获得cre1基因的上、下游侧翼序列；将上、下游侧翼序列分别导入敲除质粒pC1300qh的上、下游，形成重组质粒pC1300qh-Δcre1；

S3、将所述重组质粒pC1300qh-Δcre1转化大肠杆菌感受态，验证、筛选阳性克隆提取重组质粒pC1300qh-Δcre1，导入根癌农杆菌AGL1进行ATMT转化，获得所述深绿木霉T23△Crel菌株。

优选的，步骤S1中，所述获取包括：根据cre1蛋白检索号检索深绿木霉T23的cDNA全序列，截取同源片段检索全基因组序列查得所述深绿木霉T23的cre1基因序列。

优选的，步骤S2中，扩增cre1基因序列上游的引物为pcre1-F和pcre1-R；所述pcre1-F的序列如SEQ ID NO.1所示，所述pcre1-R的序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，获得的上游侧翼序列的长度为711bp。

优选的，步骤S2中，扩增cre1基因序列下游的引物为dcre1-F和dcre1-R；所述dcre1-F的序列如SEQ ID NO.3所示，所述dcre1的序列如SEQ ID NO.4所示。

优选的，步骤S2中，所述导入包括如下步骤：

B1、分别用限制性内切酶Hind III和Pst I酶切cre1基因上游侧翼序列cre1-up和敲除质粒pC1300qh，纯化酶切产物，用T4连接酶连接酶切产物，进行大肠杆菌转化；取阳性克隆，以单菌落为模板进行菌落PCR，筛选阳性克隆提取质粒pC1300qh::cre1-up::hyg；

B2、分别用限制性内切酶Kpn I和EcoR I酶切下游侧翼序列cre1-down和质粒pC1300qh::cre1-up::hyg，经T4连接酶将cre1基因下游侧翼序列导入质粒pC1300qh::cre1-up::hyg的下游多克隆位点。

优选的，步骤B1中，大肠杆菌转化后筛选阳性克隆采用的培养基为含有卡那霉素的LB培养基，培养条件为37℃培养过夜。

本发明还涉及一种深绿木霉T23△Crel菌株，敲除深绿木霉T23基因组中的Crel基因；所述深绿木霉T23△Crel菌株为深绿木霉(T.atroviride)CGMCC NO:11574。

优选的，所述敲除包括如下步骤：

S1、获取深绿木霉T23的cre1基因侧翼序列；

S2、重组质粒pC1300qh-Δcre1的构建：以提取的深绿木霉T23的基因组DNA为模板，分别对cre1基因侧翼序列进行PCR特异性扩增，获得cre1基因的上、下游侧翼序列；将上、下游侧翼序列分别导入敲除质粒pC1300qh的上、下游，形成重组质粒pC1300qh-Δcre1；

S3、将所述重组质粒pC1300qh-Δcre1转化大肠杆菌感受态，验证、筛选阳性克隆提取重组质粒pC1300qh-Δcre1，导入根癌农杆菌AGL1进行ATMT转化。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)深绿木霉作为重要生防菌株，其有效的拮抗植物病原菌的特性使其在木霉生防菌剂中应用越来越为广泛。高效的生防特性是木霉菌与病原菌互作中的关键，本发明通过ATMT转化技术成功构建了深绿木霉碳代谢抑制因子CRE1敲除突变株，发现cre1基因与深绿木霉的生长和产孢有关。cre1基因敲除后，突变株较野生株菌丝生长变慢，产孢明显滞后。CRE1抑制了几丁质酶、葡聚糖酶编码基因的转录从而降低了其酶活水平，同时还抑制了纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶等酶的活性。说明木霉菌碳代谢抑制基因Cre1抑制木霉菌与病原菌互作中关键细胞壁降解酶的分泌，而工程株T23Δcre1菌株具有促进，对木霉菌细胞壁降解酶分泌及活性，间接提高木霉菌拮抗病原菌的功能。

2)改良的ATMT技术，包括改进筛选培养基，将传统的利用PDA作为选择性培养基改为IM诱导培养基，添加300μg/mL的头孢霉素和200μg/mL的潮霉素，延长了诱导剂作用时间；此外，增加了木霉菌分生孢子浓度，木霉菌孢子浓度从1×10⁶提升到8×10⁶，改良后的方法适用于细胞壁较厚的深绿木霉，提升了转化效率及同源双交换发生几率。通过改变筛选培养基为IM培养基，延长了诱导培养时间，边诱导边筛选；同时加上200ug/mL的潮霉素进行抗性筛选，辅以300ug/mL特美汀抑制农杆菌的生长。改进的方法减少农杆菌在侵染过程中阻力，增加其侵染效率，提高转化效率及转化子的稳定性。经筛选鉴定，在10个阳性的转化子中，经鉴定1个是同源重组，9个是T-DNA插入，成功构建了深绿木霉敲除株T23Δcre1。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为深绿木霉cre1基因侧翼序列克隆电泳结果示意图；其中，泳道M：DNAMarker2000；泳道1：cre1基因下游侧翼片段cre1-down；泳道2：cre1上游侧翼片段cre1-up；

图2为cre1敲除载体pC1300qh-Δcre1的构建示意图；

图3为敲除载体pC1300qh-Δcre1阳性克隆PCR鉴定示意图；其中，泳道M：DNAMarker 2000；泳道1：敲除载体阳性克隆pC1300qh-Δcre1上游片段cre1-up扩增鉴定；泳道2：敲除载体pC1300qh-Δcre1阳性克隆下游cre1-down片段扩增鉴定；

图4为cre1敲除质粒pC1300qh-Δcre1双酶切验证示意图；其中，泳道M：DNAMarker 2000；泳道1：敲除载体pC1300qh-Δcre1用Hind III和Pst I双酶切cre1-up；泳道2：敲除载体pC1300qh-Δcre1用EcoR I和Kpn I双酶切cre1-down；泳道3：敲除载体pC1300qh-Δcre1用Hind III和EcoR I双酶切cre1-up::hyg::cre1-down；

图5.为成功导入敲除载体pC1300qh-Δcre1的根癌农杆菌阳性克隆PCR鉴定。其中，泳道1：农杆菌阳性克隆cre1上游侧翼序列cre1-up PCR扩增；泳道M：DNA Marker 2000；泳道2：农杆菌阳性克隆cre1下游侧翼序列cre1-down PCR扩增；

图6为ATMT转化过程优化示意图；

图7为改进后ATMT转化子在筛选平板中生长状态示意图；

图8为不同分生孢子浓度下ATMT转化得到的转化子数示意图；

图9为cre1基因敲除深绿木霉菌PCR鉴定示意图；其中，泳道M：DNAMarker 2000；泳道1：T-DNA插入单交换转化子同源重组引物(Δcre1-F/Δcre1-F)扩增；泳道2：T-DNA插入单交换转化子T-DNA插入引物(tDNA-F/Hph-R)扩增；泳道3：同源重组双交换转化子同源重组引物(Δcre1-F/Δcre1-F)扩增；泳道4：同源重组双交换转化子T-DNA插入引物(tDNA-F/Hph-R)扩增；

图10为利用改良的ATMT转化方法得到的深绿木霉碳代谢抑制因子CRE1敲除突变株Δcre1的平板型图；

图11为野生株和突变株几丁质和葡聚糖酶活测定示意图；其中，A为T23和T23Δcre1几丁质酶活性平板测定，B为液体发酵几丁质酶活和葡聚糖酶活，C为平板测定β-1,3-葡聚糖酶酶活。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明涉及的专用名词的术语解释如下：

拮抗木霉菌：木霉菌在工业和农业生防领域扮演重要的角色。在工业中，以里氏木霉为代表的工业重要底盘细胞，常用于工业生产纤维素酶等酶制剂等产品；而在农业生防领域，主要是以深绿木霉、哈茨木霉为代表的生防菌剂的开放和应用。拮抗木霉菌在植物病原真菌的生物防治中主要通过重寄生作用，与病原微生物竞争营养和生长环境、产生毒性物质抑制病原菌生长、分泌细胞壁降解酶降解病原菌细胞壁组分，产生激发子诱导寄主植物抗性等过程拮抗植物病原菌，促进植物生长。木霉菌可产生多种代谢产物，其中初级代谢产物主要是一些细胞壁降解酶类，如有几丁质酶(chitinases)、β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanases)、蛋白酶(proteinases)、纤维素酶(cellulases)、木聚糖酶(xylanaes)等等，而木霉菌分泌的细胞壁降解酶类则恰恰能够高效降解真菌细胞壁等结构，使病原菌失去侵染性或者引起死亡，有效防治植物病害。

碳代谢抑制：当环境中存在多种碳源时，微生物会优先选择利用利用某一种优先碳源，如葡萄糖、果糖等，同时在碳代谢抑制蛋白参与下抑制其他碳源的代谢和利用。这种机制保证了微生物可以在复杂环境中提升竞争力和环境适应能力，使得其能在复杂生境处于一个较为优势生态位这种全局性的碳代谢利用调控机制称作是碳代谢抑制(CarbonCatabolite Repression,CCR)或者葡萄糖抑制。碳代谢抑制蛋白普遍存在于各种微生物中，具有多种多样的调控模式和途径，主要发生在转录层面的激活/抑制，以及转录后的翻译控制，调节碳源转运蛋白活性或碳代谢抑制效应蛋白复合物稳定性等方式。

碳代谢抑制因子cre1：木霉菌中的CCR机制并不像细菌中由细胞中的cAMP水平介导的，而是通过一种直接的DNA结合蛋白抑制基因的转录等方式实现的对不同碳源利用的调控。在很多子囊菌类的真菌中，是由一种Cys₂His₂型转录调控因子CreA/CRE1所介导的抑制，通过对creA或者Cre1基因敲除株，很多代谢酶类如纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等酶的编码基因均被发现受Cre蛋白调控。

实施例

本发明是利用改良的农杆菌介导的遗传转化技术(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)敲除拮抗深绿木霉T.atroviride 23的碳代谢抑制因子CRE1。通过比较突变株(Δcre1)与野生株(wide type,WT)的生长性状，探明cre1基因对深绿木霉的生长和代谢的调控作用。研究发现cre1基因沉默后，Δcre1较WT菌丝生长变慢，产孢滞后。但其调控的多种木霉菌分泌的细胞壁降解酶(几丁质酶，β-1,3-葡聚糖酶，纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶)等活性提高，进而能够提高木霉菌拮抗多种植物病原菌的效果。

1、深绿木霉碳代谢抑制因子CRE1

通过NCBI网站查到已经登录发表的里氏木霉CRE1蛋白序列(GenebankAccession:AAB01677)，检索已测序发表的深绿木霉全基因组蛋白序列获取cre1蛋白检索号，根据检索号检索深绿木霉cDNA全序列，然后截取同源片段检索全基因组序列查到深绿木霉的cre1基因序列。

2、cre1敲除载体构建

根据cre1测序结果，设计引物扩增cre1基因上下游侧翼序列的引物pcre1-F,pcre1-R和引物dcre1-F,dcre1-R(序列详见表1)，并以提取的深绿木霉T23的基因组DNA为模板，对进行PCR特异性扩增，获得cre1基因的上下游侧翼序列，电泳结果如图1所示。将PCR产物纯化后，连接T载体pMD 18-T vector(Takara宝生物大连公司购买)，转化大肠杆菌，送往上海生工测序。测序结果表明，本实验选取的特异性扩增上游片段长度为711bp，下游片段长度为843bp，电泳结果与此一致。在获得cre1上下游侧翼序列后，利用限制性酶切和酶连将上下游片段分别导入敲除质粒pC1300qh(本实验室)，构建cre1基因敲除框，形成cre1基因敲除载体pC1300qh-Δcre1，载体构建如图2所示。首先胶回收cre1基因上下游侧翼序列，用Hind III和Pst I限制性内切酶(Fermentas上海前尘生物科技有限公司)酶切上游片段cre1-up和载体质粒pC1300qh(载体自带抗卡那霉素基因)，用DNA纯化试剂盒纯化酶切产物，然后用T4(Takara宝生物大连公司)连接酶切产物，构建cre1-up::hyg将转化完成大肠杆菌涂布于含有卡那霉素的LB平板中，37℃培养过夜。第二天挑取阳性克隆，用扩增上游片段的引物pcre1-F和pcre1-R(序列详见表1)以单菌落为模板进行菌落PCR，筛选成功导入上游片段的大肠杆菌，如图3所示。将阳性克隆进行液体扩大培养，用质粒小提试剂盒提取阳性克隆的质粒pC1300qh::cre1-up::hyg，作为导入cre1基因下游片段的载体质粒。用与上游同源臂构建相同的方法，用限制性内切酶Kpn I和EcoR I(Fermentas上海前尘生物科技有限公司)酶切后经T4连接酶将cre1基因下游片段导入含cre1-up片段的载体pC1300qh的下游多克隆位点，形成cre1基因敲除框cre1-up::hyg::cre1-down，构建重组质粒pC1300qh-Δcre1,如图3所示(已添加cre1-down)。将连接产物转化大肠杆菌感受态，挑取阳性克隆PCR鉴定，液体培养阳性克隆大量扩增cre1敲除载体pC1300qh-Δcre1。用质粒提取试剂盒提取质粒，进行双酶切验证(图4)，同时送往上海生工测序。根据测序结果和PCR、酶切验证结果，确保敲除载体序列正确结构正确无误后，将构建成功的cre1敲除载体pC1300qh-Δcre1利用CaCl2介导的感受态转化导入根癌农杆菌AGL1菌株感受态中，并筛选阳性克隆进行PCR鉴定(图5)。得到正确含有cre1敲除载体的农杆菌后，进而利用ATMT转化技术，通过同源重组，进行深绿木霉碳代谢抑制因子cre1基因敲除。

表1 菌株、质粒和引物

3、根瘤农杆菌介导的cre1基因的敲除、筛选和验证

参考ATMT在里氏木霉中的遗传改造的方法，对于ATMT转化过程中的诱导和筛选进行优化。

3.1 ATMT转化过程优化

诱导时间是影响ATMT转化效率的关键因子，针对不同受体细胞特点，诱导时间存在较大差异。如在木霉菌中，里氏木霉、哈茨木霉等孢子壁较薄，诱导时间相对较短，而深绿木霉孢子壁厚，农杆菌毒性蛋白作用时间延长，或者是T-DNA在深绿木霉细胞中存在形式中有效重组的形式较少，引起效率下降，因此必须提供较长的诱导时间，才有可能获得转化子。深绿木霉在IM培养基中由于营养贫瘠，产孢较快。孢子的产生又抑制ATMT转化。

为了克服上述因素条件对转化效率的抑制，本发明着重优化了ATMT转化的实验流程(图6)。在前期诱导共培养时，在IM培养基(加40mmol/L MES和200μmol/L AS)中放入玻璃纸，再在玻璃纸上均匀涂布农杆菌和木霉菌孢悬液的等体积混合液，于25℃培养箱共培养36h左右，待白色菌丝铺满玻璃纸表面而未产孢的临界时期将玻璃纸转移至选择性培养基。传统的选择性培养基由CYA培养基或PDA加抗生素组成，不含诱导剂，因此在筛选过程中不产生诱导作用，而转化诱导时间仅36h，对深绿木霉而言，诱导时间不足，将引起ATMT转化效率下降，平板中几乎没有转化子产生。按照传统的方法20个平板平均筛选到1-2个转化子，大多数时候没有转化子产生，且产生的转化子大多为T-DNA插入，同源双交换发生几率极低。

本发明通过将传统选择性培养基优化为IM培养基，并加入相应浓度的筛选用的抗生素，诱导剂与抗生素同时作用，边诱导边筛选，抗生素的存在避免了孢子形成，而诱导剂起效又提升了诱导时间，转化子长出较多(图7)，一般每个平板长0.8-1个，大大提升了转化效率。用改进后的ATMT转化方法，一般只需要10个平板，便可以筛选到8-10个转化子，而且同源双交换的转化子发生几率提高(表1)。

表1 改进ATMT技术评价

3.2 ATMT转化木霉菌孢子浓度优化

含有敲除载体p1300qhsilent-cre1的农杆菌和深绿木霉T23野生型的孢子共培养2天后。选择不同木霉菌孢子浓度，比较了三个木霉菌孢子浓度1×10⁶，2×10⁶，4×10⁶，6×10⁶，8×10⁶，1×10⁷六个梯度条件下，用IM培养基加抗生素筛选ATMT转化子。将筛选培养基置于25℃培养箱培养7d左右，一般培养4-5天，第一批转化子出现，在后续的5-7天中还会陆续出现更多的转化子。结果表明(图8)：当木霉菌分生孢子浓度为8×10⁶时，转化效率较高，且同源重组的转化子出现几率较大。

综上，本发明采用改进后的ATMT转化法，将选择性PDA培养基替换为含200μg/L潮霉素和300μg/mL特美汀的IM培养基。在选择性培养基上培养4-5天后，开始挑选可能的转化子到选择性PDA培养基(含300μg/mL的特美汀与200μg/mL的潮霉素)，验证后在含300μg/mL特美汀的PDA平板上传3代后，单孢分离再传一代后用含潮霉素的平板验证。进一步通过PCR验证。本研究共进行了2次ATMT，抗生素筛选得到20个转化子。利用tDNA-F，Hph-R引物(见表1)验证T-DNA插入的PCR结果条带长度为1833bp，利用Δcre1-F和Δcre1-R引物(见表1)验证同源重组的PCR结果条带长度应为1720bp，而图9所示的电泳结果，可以认定筛选得到了发生同源重组的转化子，即本实验需要构建的cre1基因敲除突变株。

利用改良的ATMT方法，本发明成功构建了深绿木霉Δcre1敲除株，cre1基因突变后，其作为一个全局性调控因子对深绿木霉生长等表型性状产生了重要的影响，后续对突变株性状和代谢的分析尤为关键，意义非凡。

4、cre1基因突变影响菌丝生长和发育

cre1敲除突变株与野生株共同置于PDA平板上培养10天，观察其在平板上生长情况。图10中可见，cre1基因突变后，菌丝生长受到影响，生长速度明显下降，产孢滞后且产孢量下降。cre1是木霉菌细胞内全局性的碳代谢调控因子，尤其是当葡萄糖存在的条件下，cre1基因调控其各种碳代谢酶类，能够抑制分解其他碳源的水解酶类如几丁质酶、纤维素酶等，从而使细胞优先利用葡萄糖代谢，本研究证实了在葡萄糖存在条件下，野生菌株中cre1基因首先利用葡萄糖代谢生长，而缺失cre1基因的敲除株则失去了优先代谢葡萄糖能力，表现为生长缓慢，菌丝形态纤细和密集。

5、CRE1抑制木霉菌中细胞壁降解酶等活性提高

比较突变株和野生株中几丁质酶活性，培养基的颜色深浅代表了几丁质酶活性的高低，实验发现，突变株在培养后期培养基颜色有中间向外延逐渐变成紫色，至第8天时平板全部变成深紫色，表明其活性非常高。而野生株则一直是培养基本底颜色并没有变成紫色，且生长速度也较突变株慢。表明CRE1敲除后，几丁质酶活提升，且能够利用几丁质促进菌丝生长，而野生株几丁质酶活很低，几乎不能利用几丁质，生长缓慢。

野生株、cre1敲除突变株的发酵液几丁质酶活如图11所示，当发酵至第六天时，cre1敲除株的几丁质酶活显著高于野生株，与平板活性测定结果一致。其次，对β-1,3-葡聚糖酶活测定，突变株和野生株均没有出现透明圈(图11C)。但突变株的菌丝生长和产孢均成水晕状，平板背面也有明显的纹路，而野生株正面表型不明显，但平板背面也有水晕状纹路。测定第六天的β-1,3-葡聚糖酶活，测定结果如图11B所示。结果表明，cre1基因对于深绿木霉葡聚糖酶的表达的影响和几丁质酶类似。说明在cre1基因敲除后，碳代谢抑制解除，葡聚糖酶表达量上升，酶活上升。

综上所述，深绿木霉作为重要生防菌株，其有效的拮抗植物病原菌的特性使其在木霉生防菌剂中应用越来越为广泛。高效的生防特性是木霉菌与病原菌互作中的关键，本发明通过ATMT转化技术成功构建了深绿木霉碳代谢抑制因子CRE1敲除突变株，发现cre1基因与深绿木霉的生长和产孢有关。cre1基因敲除后，突变株较野生株菌丝生长变慢，产孢明显滞后。CRE1抑制了几丁质酶、葡聚糖酶编码基因的转录从而降低了其酶活水平。说明木霉菌碳代谢抑制基因Cre1抑制木霉菌与病原菌互作中关键细胞壁降解酶的分泌，而工程株T23Δcre1菌株具有促进，对木霉菌细胞壁降解酶分泌及活性，间接提高木霉菌拮抗病原菌的功能。目前，为了提高木霉菌某种细胞壁降解酶活性，通过底物诱导或者酶编码基因的过表达实现，具有单一性，而转录因子的调控是全局性的，调控多种酶同时的合成和分泌，因此本发明利用遗传技术调控转录因子，可以全面提高细胞壁降解酶的表达，从而提高木霉菌的拮抗特性。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (6)

1.一种改良的农杆菌介导ATMT转化方法在构建深绿木霉基因敲除菌株中的应用，其特征在于，所述转化方法采用的诱导培养基为含40mmol/L MES和200μmol/L AS的IM培养基，诱导时间为36h～48h；采用的选择性培养基为添加了200μg/mL潮霉素和300μg/mL特美汀的IM固体培养基；

所述诱导培养基：10mM K₂HPO₄,10mM KH₂PO₄,2.5mM NaCl,2mM MgSO₄,0.7mM CaCl₂,9mMFeSO₄·7H₂O,4mM(NH₄)₂SO₄,10mM葡萄糖,40mM MES,200μM AS,0.5％甘油；

所述IM固体培养基：10mM K₂HPO₄,10mM KH₂PO₄,2.5mM NaCl,2mM MgSO₄,0.7mM CaCl₂,9mM FeSO₄·7H₂O,4mM(NH₄)₂SO₄,10mM葡萄糖,40mM MES,200μM AS,0.5％甘油，1.4％琼脂；

所述转化方法包括如下步骤：

A1、在前期诱导共培养时，在所述诱导培养基中放入玻璃纸，再在玻璃纸上均匀涂布导入重组质粒pC1300qh-Δcre1的根癌农杆菌的菌液和深绿木霉T23孢悬液的等体积混合液，于25℃培养箱共培养36～48h；

A2、待白色菌丝铺满玻璃纸表面而未产孢的临界时期将玻璃纸转移至所述选择性培养基，于25℃培养5～7d，长出转化子；

A3、挑选可能的转化子到含300μg/mL的头孢与200μg/mL的潮霉素的PDA培养基，验证后在300μg/mL特美汀的PDA平板上传3代后，单孢分离再传一代后，用含潮霉素的平板验证，再经PCR验证得到阳性的转化子；

其中，重组质粒pC1300qh-Δcre1的构建是以提取的深绿木霉T23的基因组DNA为模板，分别对cre1基因侧翼序列进行PCR特异性扩增，获得cre1基因的上、下游侧翼序列；将上、下游侧翼序列分别导入敲除质粒pC1300qh的上、下游而形成的；扩增cre1基因序列上游的引物为pcre1-F和pcre1-R；所述pcre1-F的序列如SEQ ID NO.1所示，所述pcre1-R的序列如SEQ ID NO.2所示；扩增cre1基因序列下游的引物为dcre1-F和dcre1-R；所述dcre1-F的序列如SEQ ID NO.3所示，所述dcre1的序列如SEQ ID NO.4所示；

所述质粒pC1300qh：含有25bp的末端重复序列右边界RB和左边界LB，以右边界为起始位点1，其中依次包含上游多克隆位点：Hind III(268),PstI(986),SacI(993),XbaI(1000)，trpC的启动子PtrpC，潮霉素的开放阅读框hygORF，XhoI(2351)，trpC的终止子TtrpC,下游多克隆位点：BamHI(2610),KpnI(2620),和EcoRI(3472)；在两段多克隆位点分别用HindIII/PstI和KpnI/EcoRI双酶切插入了cre1基因的上、下游侧翼序列cre1-up和cre1-down序列，其中cre1-down序列内部设有BamHI(2825)；构成了pC1300qhsilent-cre1,全部长度共11001bp。

2.根据权利要求1所述改良的农杆菌介导ATMT转化方法在构建深绿木霉基因敲除菌株中的应用，其特征在于，所述转化方法中进行诱导培养时，采用的深绿木霉孢悬液中分生孢子的浓度为8×10⁶个/mL。

3.根据权利要求1或2所述改良的农杆菌介导ATMT转化方法在构建深绿木霉基因敲除菌株中的应用，其特征在于，所述深绿木霉基因敲除菌株为敲除深绿木霉T23基因组中的Crel基因而得的深绿木霉T23△Crel菌株；所述深绿木霉T23△Crel菌株为深绿木霉(Trichoderma.atroviride)CGMCC NO:11574。

4.根据权利要求3所述的改良的农杆菌介导ATMT转化方法在构建深绿木霉基因敲除菌株中的应用，其特征在于，所述构建深绿木霉基因敲除菌株包括如下步骤：

S1、获取深绿木霉T23的cre1基因序列；

S2、重组质粒pC1300qh-Δcre1的构建：以提取的深绿木霉T23的基因组DNA为模板，对cre1基因序列进行PCR特异性扩增，获得cre1基因的上、下游侧翼序列；将上、下游侧翼序列分别导入敲除质粒pC1300qh的上、下游，形成重组质粒pC1300qh-Δcre1；

S3、将所述重组质粒pC1300qh-Δcre1转化大肠杆菌感受态，验证、筛选阳性克隆提取重组质粒pC1300qh-Δcre1，导入根癌农杆菌AGL1进行ATMT转化，获得所述深绿木霉T23△Crel菌株。

5.根据权利要求4所述的改良的农杆菌介导ATMT转化方法在构建深绿木霉基因敲除菌株中的应用，其特征在于，步骤S1中，所述获取包括：通过NCBI网站查到里氏木霉CRE1蛋白序列Genebank Accession:AAB01677，检索已测序发表的深绿木霉全基因组蛋白序列获取cre1蛋白检索号，根据cre1蛋白检索号检索深绿木霉T23的cDNA全序列，截取同源片段检索全基因组序列查得所述深绿木霉T23的cre1基因序列。

6.根据权利要求4所述的改良的农杆菌介导ATMT转化方法在构建深绿木霉基因敲除菌株中的应用，其特征在于，步骤S2中，所述导入包括如下步骤：

B1、分别用限制性内切酶Hind III和Pst I酶切cre1基因上游侧翼序列cre1-up和敲除质粒pC1300qh，纯化酶切产物，用T4连接酶连接酶切产物，进行大肠杆菌转化；取阳性克隆，以单菌落为模板进行菌落PCR，筛选阳性克隆提取质粒pC1300qh::cre1-up::hyg；

B2、分别用限制性内切酶Kpn I和EcoR I酶切下游侧翼序列cre1-down和质粒pC1300qh::cre1-up::hyg，经T4连接酶将cre1基因下游侧翼序列导入质粒pC1300qh::cre1-up::hyg的下游多克隆位点。

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