CN108384798B - 一种利用根癌农杆菌转化高山被孢霉菌丝的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用根癌农杆菌转化高山被孢霉菌丝的方法，属于生物工程技术领域。本发明采用高山被孢霉(Mortierella alpina)尿嘧啶营养缺陷型CCFM 501的液体菌丝作为共培养材料，通过带有尿嘧啶筛选标记载体的根癌农杆菌介导的遗传操作技术，成功得到多个转化子。本发明改进了根癌农杆菌介导高山被孢霉的转化方法，对根癌农杆菌介导高山被孢霉的基础理论研究及高山被孢霉高效的遗传改造有重大意义。

Description

一种利用根癌农杆菌转化高山被孢霉菌丝的方法
技术领域
本发明涉及一种利用根癌农杆菌转化高山被孢霉菌丝的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
高山被孢霉是一种应用于工业生产花生四烯酸(AA)的高产油丝状真菌，具有安全、多不饱和脂肪酸(PUFAs)组成合理等特点。
目前对高山被孢霉进行遗传改造所依赖的转化方法主要为根癌农杆菌的介导。到目前为止，根癌农杆菌已经成功应用到超过一百二十多种真菌中，具有受体细胞广泛，包含原生质体、孢子、菌丝或者固体单菌落；转化率高；载体可容纳大片段的异源DNA；基本上为单拷贝随机插入宿主染色体中；转化子遗传稳定等特点。
根癌农杆菌转化高山被孢霉孢子(中国专利申请号201310524221.4)的方法已经构建。该专利阐述根癌农杆菌转化高山被孢霉孢子过程中的关键参数菌液浓度为100μL的根癌农杆菌(OD600＝1.5)和100μL的孢子(108个/mL)混合、共培养温度为23℃，共培养时间为48-96h。高山被孢霉产孢周期长，且产孢量低，使用孢子作为共培养材料的制备周期长且工作量大，而使用菌丝作为共培养材料将简化此转化过程。根癌农杆菌转化丝状真菌的菌丝已有报道，如黑曲霉、镰孢霉等，并且在镰孢霉中使用菌丝作为共培养材料获得的转化子数目是孢子的5倍。然而，菌丝作为转化共培养材料不像孢子般普遍，具有种属特异性，在2005年公开的论文Agrobacterium-mediated transformation as a tool forfunctional genomics in fungi中，总结来自子囊菌、结合菌、担子菌、卵菌属的62种被根癌农杆菌成功转化的真菌，其中只有11种真菌的菌丝能被成功转化，其余均采用孢子、萌发的孢子或者由孢子制得的原生质体作为共培养材料。目前还未见根癌农杆菌对高山被孢霉菌丝实现转化的报道，并且根癌农杆菌与高山被孢霉菌丝的混合比例这一关键因素值得探究。因此，本发明根据根癌农杆菌转化受体细胞广泛的特点首次选取高山被孢霉的菌丝作为受体材料，探究根癌农杆菌转化高山被孢霉菌丝的转化过程。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种根癌农杆菌转化高山被孢霉菌丝的方法，是将根癌农杆菌与破碎后的高山被孢霉菌丝混合，再共培养。
在本发明的一种实施方式中，所述高山被孢霉是通过同源重组及根癌农杆菌转化方法获得的尿嘧啶营养缺陷型菌株，该菌株已于2013年6月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7730，已于申请公布号CN103468581A的专利中公开，其国际专利申请号为PCT/CN 2014/072350。
在本发明的一种实施方式中，所述根癌农杆菌为根癌农杆菌CCFM834，又命名为根癌农杆菌AGL1，已于2003年公开在论文《Efficient transformation ofMedicagotruncatula cv.Jemalong using the hypervirulentAgrobacterium tumefaciensstrainAGL1》中；所述根癌农杆菌又名根瘤土壤杆菌，其含有二元质粒pBIG2-ura5-Its，该质粒已于公开号为CN103571762A的中国专利申请中公开，申请人承诺自申请日起二十年内向公众发放该菌株。
在本发明的一种实施方式中，根癌农杆菌和高山被孢霉菌丝是以悬液形式混合，悬液体积比为1:3～6。
在本发明的一种实施方式中，根癌农杆菌和高山被孢霉菌丝是以体积比1：5进行混合；所述根癌农杆菌为OD600＝0.2～0.6的菌悬液，菌丝为浓度0.3g/mL的菌丝体悬液。
在本发明的一种实施方式中，在共培养阶段将200μL OD600值为0.2(4×108CFU/mL)、0.4(8×108CFU/mL))、或0.6(12×108CFU/mL)的根癌农杆菌和1mL经分散器打碎的菌丝浓度为0.3g/L高山被孢霉菌丝混合。
在本发明的一种实施方式中，是在共培养阶段将200μL OD600值为0.2、0.4、或0.6的根癌农杆菌和1mL经分散器打碎的菌丝浓度为0.3g/L高山被孢霉菌丝混合。
在本发明的一种实施方式中，是将用IM培养基培养的根癌农杆菌与Broth培养基培养的高山被孢霉菌丝混合。
在本发明的一种实施方式中，所述转化方法具体步骤如下：
(1)根癌农杆菌的培养：
将含有质粒pBIG2-ura5-ITs的根癌农杆菌在含有100μg/mL卡那霉素和100μg/mL利福平的YEP培养基中28℃，培养24-48h，以体积分数1％的接种量转接入MM培养基中，继续在28℃下培养48h～96h，收集菌体，将菌体转移至IM培养基中使OD600值达到0.3，在28℃下培养8～12h后，测定此时菌液的OD600值待用。
(2)高山被孢霉菌丝的制备：
将高山被孢霉菌株的孢子接种至含有0.1g/L尿嘧啶的Broth液体培养基中，在28℃/200rpm下培养24～36h，利用分散器将菌丝球打碎，按照体积比1％的接种量接种到含有0.1g/L尿嘧啶的Broth液体培养基中，28℃/200rpm下培养48h，重复上述传代步骤。
(3)共培养及阳性转化子的筛选：
将步骤(1)的根癌农杆菌的OD600值调整为0.2，0.4，和0.6，分别取200μL根癌农杆菌和步骤(2)制备的菌丝悬液混合均匀,转移至贴有玻璃纸的IM固体培养基中，在23℃下避光培养24至48h，把沾有混合液的玻璃纸转移到SC筛选培养基。
(4)阳性转化子的鉴定：
将生长出来的转化子挑至新的筛选板上，重复此步骤三次，若转化子都能继续生长，将该菌落挑至液体培养基Broth中，传代两次，冻干收集后的菌体，提取基因组，采用通用引物对HisproF2/TrpCR2进行PCR验证，所述引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，阳性结果中将含有389bp和861bp两条带。
本发明所涉及的Broth培养基，其组成为：20g/L葡萄糖，5g/L酵母提取物，1g/L磷酸二氢钾，0.25g/L七水硫酸镁，10g/L硝酸钾,余量为水，pH 6.0。
本发明所涉及的MM固体培养基，其组成为：1.74g/L磷酸一氢钾，1.37g/L磷酸二氢钾，0.146g/L氯化钠，0.49g/L七水硫酸镁，0.078g/L氯化钙，0.0025g/L七水硫酸亚铁，0.53g/L硫酸氨，7.8g/L MES，1.8g/L葡萄糖，0.5％甘油。
本发明所涉及的IM培养基是在MM培养基的基础上添加了200μM的乙酰丁香酮(AS)构成的。
本发明所涉及的SC-CS培养基是添加终浓度为100μg/mL的壮观霉素(Spectinomycin)和终浓度为100μg/mL的头孢噻(Cefotaxime Sodium)的SC固体培养基。SC固体培养基组成为：5g/L酵母氮源提取物，1.7g/L硫酸铵，20g/L葡萄糖，20mg/L腺嘌呤，30mg/L络氨酸，1mg/L甲硫氨酸，2mg/L组氨酸，4mg/L赖氨酸，4mg/L色氨酸，5mg/L苏氨酸，6mg/L异亮氨酸，6mg/L亮氨酸，6mg/L苯丙氨酸，2mg/L精氨酸。
本发明的第二个目的是提供所述方法获得的高山被孢霉菌丝体转化子。
本发明还提供所述方法在基因工程领域中的应用。
有益效果：本发明首次实现了根癌农杆菌对高山被孢霉菌丝的转化，克服了多核菌丝体不适用根癌农杆菌转化的技术偏见，相比于传统的根癌农杆菌转化高山被孢霉孢子，将转化周期由原来的30天缩短至5天，为高山被孢霉的基因操作提供了一种简便的途径，对后续高山被孢霉的基因改造具有重要意义。
附图说明
图1为根癌农杆菌转化高山被孢霉菌丝流程图；
图2为转化高山被孢霉所用二元质粒pBIG2-ura5s-ITs的示意图；
图3为鉴定的重组菌株琼脂糖凝胶电泳图；M：核酸Marker；1：pBIG2-ura5s-ITs阳性对照；2：野生型高山被孢霉；1～16：转化子；
图4为鉴定的重组菌株琼脂糖凝胶电泳图；M：核酸Marker；1：pBIG2-ura5s-ITs阳性对照；2：野生型高山被孢霉；17～22：转化子；
图5为阳性转化子与野生型高山被孢霉的菌落形态对比。
具体实施方式
培养基：
YEP培养基：10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，5g/L氯化钠，余量为水。涉及到固体培养基时添加20g/L琼脂。
MM固体培养基：1.74g/L磷酸一氢钾，1.37g/L磷酸二氢钾，0.146g/L氯化钠，0.49g/L七水硫酸镁，0.078g/L氯化钙，0.0025g/L七水硫酸亚铁，0.53g/L硫酸氨，7.8g/LMES，1.8g/L葡萄糖，0.5％甘油。
IM培养基：在MM培养基的基础上添加了200μM的乙酰丁香酮(AS)。
GYU培养基：20g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，2g/L硝酸钾，1g/L磷酸二氢钠，3g/L七水硫酸镁，0.1g/L尿嘧啶，20g/L琼脂。
Broth培养基：20g/L葡萄糖，5g/L酵母提取物，10g/L硝酸钾，0.25g/L七水硫酸镁，1g/L磷酸二氢钾，0.1g/L尿嘧啶。
SC培养基是添加终浓度为100μg/mL的壮观霉素(Spectinomycin)和终浓度为100μg/mL的头孢噻(Cefotaxime Sodium)的SC固体培养基。SC固体培养基组成为：5g/L酵母氮源提取物，1.7g/L硫酸铵，20g/L葡萄糖，20mg/L腺嘌呤，30mg/L络氨酸，1mg/L甲硫氨酸，2mg/L组氨酸，4mg/L赖氨酸，4mg/L色氨酸，5mg/L苏氨酸，6mg/L异亮氨酸，6mg/L亮氨酸，6mg/L苯丙氨酸，2mg/L精氨酸。
脂肪酸组成及含量的测定方法：①向上述粗脂中分别加入l00μL 2.02mg/mL内标C15：0和l mL 10wt％的盐酸甲醇，60℃水浴3h，每隔30min振荡l min；②冷却至室温后加入1mL正己烷和l mL饱和氯化钠溶液，震荡混匀，3000xg离心3min，吸出正己烷层，再加入l mL正己烷，震荡混匀，3000×g离心3min，吸出并合并正己烷；③37℃氮气吹干后，加入1mL正己烷，混匀，转入气相瓶，得到脂肪酸甲酯溶液；④脂肪酸甲酯分析采用GC-2010(ShimadzuCo.,Japan)，色谱柱为DB-Waxetr(30m×0.32mm,0.22μm)。氢火焰离子检测器检测，汽化室和检测器温度分别为240℃和260℃，分流方式进样lμL，分流比10:1，载气为氮气。程序升温：初始温度120℃保持3min，以5℃/min升到190℃，再以4℃/min升到220℃，保持20min。通过与商业化的脂肪酸甲酯标准品(37种脂肪酸甲酯混标,Supe1co,USA)和加入内标C15:O的质量比较，定性、定量分析样品中脂肪酸组分，其中总脂肪酸含量用单位菌体中总脂肪酸的质量表示。
实施例1：根癌农杆菌的培养
将保存于-80℃的含有质粒pBIG2-ura5-Its的根癌农杆菌CCFM834甘油管菌液在含有100μg/mL卡那霉素和100μg/L利福平的YEP固体培养基平板划线，28℃倒置避光培养48h。挑取单克隆接种至20mL含有100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的液体YEP培养基中28℃，200rpm避光培养24-48h。随后按照1％的接种量将菌液转接入20mLMM培养基中，继续在28℃下培养48h，测定此时菌液的OD值，按照计算体积将一定量的根癌农杆菌转接入IM培养基中使OD值达到0.3，在28℃下培养8～12h后，测定此时菌液的OD值待用。
实施例2：高山被孢霉菌丝的制备
生理盐水冲洗保存在GYU斜面的尿嘧啶营养缺陷型的高山被孢霉菌株的孢子并接种至Broth液体培养基(含有0.1g/L尿嘧啶)中，在28℃/200rpm下培养24～36h，利用分散器将菌丝球打碎并按照1％(体积)接种量接种到新的Broth液体培养基(含有0.1g/L尿嘧啶)中，28℃/200rpm下培养48h，重复上述传代步骤一次，再在28℃/200rpm下培养48h后按照2％(体积)接种量接种到新的Broth液体培养基(含有0.1g/L尿嘧啶)中，28℃下培养24h，用分散器打碎后备用。
实施例3：共培养及阳性转化子的筛选
根据测定根癌农杆菌的OD值把菌液依次稀释为0.2，0.4，0.6三个梯度，取200μL体积的各OD值的根癌农杆菌和1mL上述制备好的菌丝混合菌液混合均匀,吸取150μL混合液到贴有玻璃纸的IM固体培养基中，在23℃下避光培养24～48h，把沾有混合液的玻璃纸转移到SC筛选培养基(加有壮观霉素和头孢噻肟钠)上。
实施例4：阳性转化子的鉴定
用镊子将在SC筛选培养基(加有100μg/mL壮观霉素和100μg/mL头孢噻肟钠)上生长出来的转化子挑至新的筛选板上，重复此步骤三次，若转化子都能继续生长，将该菌落挑至液体培养基Broth中，传代两次，冻干收集后的菌体。利用基因组提取试剂盒进行基因组提取，并用载体的通用引物对HisproF2/TrpCR2进行PCR验证。HisproF2/TrpCR2序列如下。
HisproF2(SEQ ID NO.1)：GTGTTCACTCGCATCCCGC
TrpCR2(SEQ ID NO.2)：AGGCACTCTTTGCTGCTTGG
阳性结果中将含有389bp和861bp两条带。所得阳性转化子的电泳图结果如图3-4所示。电泳图说明4-22号转化子中除5号外，其余均为二元表达载体成功整合入高山被孢霉基因组中的阳性转化子。
所用基因组提取试剂盒BioFlux的Biospin Fungus Genomic DNAExtractionKit。
20μLtaq验证体系：10μL 2×Taq mix，1μL上游引物HisproF2，1μL下游引物TrpCR2，2μL基因组提取液，1μL Taq聚合酶，5μL无酶水。
PCR程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸50s扩增，进行循环35次后72℃温度下保持10min。
实施例5：阳性转化子的脂肪酸提取
(1)将高山被孢霉野生型菌株与实施例4筛选获得的其中任意3株高山被孢霉回补型菌株接种于Broth培养基中，28℃，200rpm摇床培养7天。
(2)收集菌体，真空冷冻干燥至恒重,称量菌体重量,计算生物量。
(3)将菌体研磨成粉末,称取50mg，加入2mL4mol/L盐酸。
(4)80℃水浴1h，-80℃放置15min。重复一次。80℃水浴1h。
(5)冷却至室温，加入1mL甲醇，混匀。
(6)加入1mL氯仿，震荡10min。3000xg离心3min。收集氯仿。
(7)重复(6)两次。
(8)合并氯仿(3mL)，加入1mL饱和氯化钠，混匀，3000xg离心3min。收集氯仿层于新瓶。剩余液体加入1mL氯仿，3000xg离心3min。合并氯仿(4mL)。
(9)氮吹干燥，加入1mL乙醚，转移至洁净的已经称重的瓶中。氮吹干燥。
将阳性转化子的生物量和总脂肪酸质量进行测定，从表1中可以看出，3株阳性转化子的生物量和野生型菌株相比无明显差异；表2中可以看出，转化子的脂肪酸组成和含量较野生型菌株相比，无明显差异，表明可以采用此转化方法对高山被孢霉脂肪酸产量无明显影响，可以采用此方法对高山被孢霉脂肪酸合成通路中的关键基因进行改造。
表1高山被抱霉野生型菌株与三株基因工程菌株生物量比较
Figure BDA0001579285920000061
表2高山被抱霉野生型菌株与三株基因工程菌株脂肪组成比较
Figure BDA0001579285920000062
实施例6：阳性转化子的菌丝形态的鉴定
将高山被孢霉野生型菌株和任意3株转化子的菌丝挑取到GY固体培养基上，在28℃环境下恒温培养48h，再挑取同样大小的菌落接种到GY固体培养基上，在28℃温度下静置培养4天。拍照菌落表型，见图5。结果可以看出阳性转化子与野生型高山被孢霉在菌落形态上基本类似。
实施例7：阳性转化子的产孢能力的鉴定
分别配制野生型高山被孢霉和转化子的孢子悬液，将其浓度调整为相同的孢子数目，用移液枪吸取1mL菌液到GY斜面上，缓慢转动试管，使孢子均匀的分布于斜面上，在28℃环境下培养15天后，放到4℃冷库，继续培养15天，将所有菌株的孢子分别收集起来，先用衬有一层纱布的50mL离心管过滤，然后使用0.25μm的滤膜过滤，除去菌丝，制备成等体积的孢子悬液，使用血球计数板进行观察计数，结果见表3。
表3产孢情况对比
Figure BDA0001579285920000071
从表3中可以看出，任意选出的3株转化子的产孢能力与野生型相比，均有部分提高。三株转化子在产孢量存在较大差异可能是由于根癌农杆菌T-DNA任意整合入基因组的特点造成的。
表4为根癌农杆菌转化高山被孢霉孢子和菌丝效率对比表，结果显示，使用菌丝作为共培养材料的转化时间更短，转化子数目和孢子相当，可以基本满足转化的要求。
表4根癌农杆菌转化高山被孢霉孢子和菌丝效率对比表
Figure BDA0001579285920000072
注：T-制作共培养材料所需要时间；N-平均每轮转化获得的转化子数
对照例1
按照实施例1～4的操作步骤构建转化子，区别在于实施例3共培养阶段将根癌农杆菌的OD600调整为0.9，制备获得的转化子个数为平均每轮转化子3个。
对照例2
按照实施例1～4的操作步骤构建转化子，区别在实施例3共培养阶段，根癌农杆菌和高山被孢霉菌丝的混合比例调整为1：1或1：10(根癌农杆菌体积与打碎菌丝体积比)，，制备获得的转化子为平均每轮转化子1个和2个。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种利用根癌农杆菌转化高山被孢霉菌丝的方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtgttcactc gcatcccgc 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aggcactctt tgctgcttgg 20

Claims (5)

1.一种根癌农杆菌转化高山被孢霉(Mortierella alpina)菌丝的方法，其特征在于，是将根癌农杆菌与破碎后的高山被孢霉菌丝混合，再共培养，根癌农杆菌和高山被孢霉菌丝是以悬液形式混合，在共培养阶段将8×108～2.4×109CFU根癌农杆菌/3mg高山被孢霉菌丝混合；悬液体积比为1:5，所述根癌农杆菌为OD600＝0.2～0.6的菌悬液，高山被孢霉菌丝为浓度0.3g/mL的菌丝体悬液；
所述高山被孢霉是通过同源重组及根癌农杆菌转化方法获得的尿嘧啶营养缺陷型菌株，该菌株已于2013年6月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7730；所述根癌农杆菌为根癌农杆菌CCFM834。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，是将用IM培养基培养的根癌农杆菌与Broth培养基培养的高山被孢霉菌丝混合。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)根癌农杆菌的培养：将含有质粒pBIG2-ura5-ITs的根癌农杆菌CCFM834在YEP培养基中于25～28℃培养24-48h，收集菌体，将菌体转移至IM培养基中；
(2)高山被孢霉菌丝的制备：将高山被孢霉的孢子接种Broth培养基中，在25～28℃培养24～36h，将菌丝球打碎，获得菌丝悬液；
(3)共培养及阳性转化子的筛选：将步骤(1)的根癌农杆菌的OD600值调整为0.2，0.4，和0.6，分别取200μL根癌农杆菌和步骤(2)制备的菌丝悬液混合均匀，于22～25℃避光培养24～48h；
(4)阳性转化子的鉴定：挑取阳性转化子，提取基因组，采用通用引物对HisproF2/TrpCR2对阳性转化子进行PCR验证。
4.权利要求1-3任一所述方法获得的高山被孢霉菌丝体转化子。
5.权利要求1-3任一所述方法在基因工程领域中的应用。
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