CN113174390A - 香蕉枯萎病菌FoNpp1基因在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了香蕉枯萎病菌FoNpp1基因在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。本发明通过构建基因敲除载体，将FoNpp1基因导入香蕉枯萎病菌原生质体；利用同源重组方法将该基因从香蕉枯萎病菌中敲除，获得敲除突变体；通过构建基因回补载体，利用随机插入的方法将该基因回补到敲除突变体中，获得回补突变体。敲除突变体在生长发育方面不存在缺陷，对高渗胁迫、氧化胁迫等不敏感。致病性测定结果表明，与香蕉枯萎病菌野生型相比，敲除突变体镰刀菌酸含量及对巴西蕉的致病力显著降低。表明FoNpp1基因是香蕉枯萎病菌的致病相关基因，FoNpp1是香蕉枯萎病菌致病性所必需的，在防控香蕉枯萎病中具有较大的应用前景。

Description

香蕉枯萎病菌FoNpp1基因在调控香蕉枯萎病菌致病力中的 应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，更具体地，涉及香蕉枯萎病菌FoNpp1基因在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。

背景技术

香蕉枯萎病(Fusarium wilt)是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporumf.sp.cubense，Foc)引起的一种土传维管束坏死的系统性病害，是目前制约我国香蕉生产的最重要因素。根据Foc对不同香蕉品系或者属种的致病性差异，将其划分为3个生理小种；危害我国植蕉区的主要有1号生理小种(Foc1)和4号生理小种(Foc4)。其中，Foc4对我国香蕉的危害最大，几乎能侵染所有品种的香蕉。研究表明，香蕉枯萎病菌成功侵染香蕉依赖于一系列致病因子，主要包括各种酶类、毒素、生长调节物质、分泌蛋白等。例如：中国专利CN110656116A公开了基因FoCWM在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用，中国专利CN110669773A公开了基因FoPDCD5在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用，中国专利CN111560384A公开了基因FoRnt在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用，中国专利CN110656116A公开了基因FoCWM在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。充分挖掘Foc致病相关基因并开展其功能研究，对于香蕉枯萎病的防控具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供香蕉枯萎病菌FoNpp1基因在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

本发明公开了香蕉枯萎病菌基因FoNpp1及其编码蛋白FoNpp1的新功能。所述香蕉枯萎病菌基因FoNpp1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白FoNpp1的序列如SEQID NO：2所示。发明人团队前期在香蕉枯萎病菌分泌蛋白质组学研究中，鉴定到一个未知蛋白(Uncharacterized protein，命名为FoNpp1)；经SignalP、Target P、WoLF PSORT、GPIModification Site Predication和TMHMM软件预测分析，该蛋白含有N-端信号肽，定位在细胞外，无GPI锚定位点和跨膜结构域，属于经典的分泌蛋白，但是未明确该蛋白在香蕉枯萎病菌中的生物学功能。本发明通过构建基因敲除载体，将其导入香蕉枯萎病菌原生质体；利用同源重组方法将该基因从香蕉枯萎病菌中敲除，获得敲除突变体ΔFoNpp1；通过构建基因回补载体，将其导入ΔFoNpp1原生质体；利用随机插入的方法将该基因回补到敲除突变体中，获得回补突变体ΔFoNpp1-com。该突变体在生长发育方面不存在缺陷，对高渗胁迫、氧化胁迫等不敏感。致病性测定结果表明，与香蕉枯萎病菌野生型相比，敲除突变体ΔFoNpp1镰刀菌酸含量及对巴西蕉的致病力显著降低。以上试验证明，FoNpp1基因是香蕉枯萎病菌的致病相关基因，FoNpp1是香蕉枯萎病菌致病性所必需的。基于此，本申请首先请求保护关于FoNpp1基因或FoNpp1蛋白的如下用途：

SEQ ID NO：1所示FoNpp1基因或SEQ ID NO：2所示FoNpp1蛋白在调控香蕉枯萎病菌的致病力和/或镰刀菌酸的含量中的应用。

进一步地，为在降低香蕉枯萎病菌致病力和/或镰刀菌酸含量中的应用。

进一步地，为在降低香蕉枯萎病菌对香蕉的致病力中的应用。

优选地，所述香蕉枯萎病菌为香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc4)。

由于FoNpp1基因是香蕉枯萎病菌致病性所必需的，因而可将FoNpp1基因作为靶标基因，研制防治香蕉枯萎病菌的杀菌剂。因此本发明还提供SEQ ID NO：1所示FoNpp1基因或SEQ ID NO：2所示FoNpp1蛋白作为防治靶标在制备防治香蕉枯萎病菌的杀菌剂中的应用。

本发明还提供一种防治香蕉枯萎病的杀菌剂，含有阻断或抑制香蕉枯萎病菌FoNpp1基因表达的制剂。

优选地，所述制剂为与香蕉枯萎病菌FoNpp1基因的靶RNA具有互补序列的反义RNA。

进一步优选地，所述反义RNA为siRNA或shRNA。

本发明还提供一种防治香蕉枯萎病的方法，通过该阻断或抑制香蕉枯萎病菌FoNpp1基因的表达。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了香蕉枯萎病菌4号小种一个未知蛋白基因FoNpp1及其编码蛋白FoNpp1的新功能。所述基因FoNpp1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白FoNpp1的序列如SEQ ID NO：2所示。本发明将FoNpp1基因从香蕉枯萎病菌中敲除，所得到的香蕉枯萎病菌FoNpp1基因敲除突变体在孢子形态、菌丝形态、抗高渗透、氧化胁迫等方面与野生型相比没有显著性差异；但FoNpp1的缺失导致了其镰刀菌酸的含量及致病力的显著降低；表明FoNpp1基因是香蕉枯萎病菌的致病相关基因，FoNpp1是香蕉枯萎病菌致病性所必需的，在防控香蕉枯萎病中具有较大的应用前景。

附图说明

图1为香蕉枯萎病菌基因FoNpp1敲除载体的构建示意图。

图2为香蕉枯萎病菌基因FoNpp1回补载体示意图。

图3为部分潮霉素抗性转化子目的基因FoNpp1的PCR扩增。M：DNA Marker；泳道WT：香蕉枯萎病野生型；泳道1-6：转化子1-6。

图4为部分潮霉素抗性转化子hph基因的PCR扩增。M：DNA Marker；泳道WT：香蕉枯萎病野生型；泳道1-6：转化子1-6。

图5为部分博来霉素抗性转化子FoNpp1的PCR扩增。M：DNA Marker；泳道WT：香蕉枯萎病菌野生型；泳道1-4：回补转化子。

图6为敲除突变体△FoNpp1抗高渗透压能力分析。

图7为敲除突变体△FoNpp1氧化胁迫分析。

图8为香蕉枯萎病菌敲除突变体△FoNpp1的致病性分析。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1

1、实验材料

1.1供试菌株及植物

香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc4)，供试香蕉品种为巴西蕉Cavendish(AAA)。

1.2宿主菌及质粒载体

宿主菌为大肠杆菌DH5α，克隆载体为pMD18-T，基因敲除载体为双元载体pCT74，基因回补载体为pCTZN(由本实验室在pCT74质粒基础上改造得来，即将pCT74上的SGFP和hph基因替换成博来霉素Zeocin基因)，该质粒也在专利“201910986131.4、基因FoPDCD5在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用”中公开。

2、实验方法

2.1FoNpp1基因上下游同源片段的扩增

申请人前期在香蕉枯萎病菌分泌蛋白质组学研究中，鉴定到一个未知蛋白(Uncharacterized protein，命名为FoNpp1)，其编码基因FoNpp1的序列如SEQ ID NO：1所示，其所编码的蛋白FoNpp1的序列如SEQ ID NO：2所示。

香蕉枯萎病菌FoNpp1基因敲除载体的构建如图1所示。在FoNpp1基因的上游和下游各选取长度大小约为1500bp左右的序列(分别命名为同源臂A片段和同源臂B片段，即FoNpp1-A和FoNpp1-B)，并设计引物(表1)。

表1 FoNpp1基因同源臂A片段和B片段的扩增引物

用真菌DNA提取试剂盒(OMEGA Fungal DNA Kit)，提取Foc4基因组DNA；以该基因组DNA为模板，用引物FoNpp1-AF和FoNpp1-AR进行PCR扩增，获得FoNpp1基因的同源臂A片段(FoNpp1-A)；用引物FoNpp1-BF和FoNpp1-BR进行PCR扩增，获得FoNpp1基因的同源臂B片段(FoNpp1-B)。

具体的PCR反应体系为：

PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应30s，55℃反应30s，72℃反应1min，共30个循环；72℃反应10min。用OMEGA Cycle Pure Kit试剂盒，对PCR扩增产物进行清洁回收。

2.2 FoNpp1基因敲除载体的构建

参考pMD 18-T Vector Cloning Kit(TakaRa公司)试剂盒说明书，将FoNpp1-A和FoNpp1-B分别与T载体连接，获得重组质粒pMD18T-FoNpp1-A和pMD18T-FoNpp1-B。具体为：取1μL pMD 18-T载体，分别加入4μL上述PCR回收产物(同源臂A片段或同源臂B片段)和5μLsolution I，于16℃连接过夜。取连接产物加入到100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰上放置30min；于42℃水浴热击90s，冰上冷却5min；加入800μL LB液体培养基，于37℃、150rpm振荡培养45min；再于4000rpm离心5min，弃上清，留100μL菌液与沉淀混匀，涂布于LB固体培养基(含50μg/mL Amp)；于37℃下培养8-12h。

挑取具有Amp抗性的阳性转化子，提取重组质粒DNA，并进行测序鉴定。用EcoRI和XbaI分别对pMD18T-FoNpp1-B和pCT74载体进行双酶切，回收B片段和pCT74载体。用T4 DNA连接酶将B片段与pCT74连接，转化大肠杆菌DH5α；获得重组质粒pCT74-FoNpp1-B。按同样程序，用KpnI和ApaI双酶切pMD18T-FoNpp1-A和重组质粒pCT74-FoNpp1-B，回收A片段和重组质粒。用T4DNA连接酶将A片段与pCT74-FoNpp1-B连接，转化大肠杆菌DH5α；经酶切鉴定，获得基因敲除载体pCT74-FoNpp1-KO。

2.3 Foc4基因NPP1回补载体上下游片段的扩增

FoNpp1基因回补载体的构建如图2所示。在FoNpp1基因的上游选取长度约为1500bp的启动子序列，下游选取长度约为500bp的终止子序列，并设计引物(分别命名为comFoNpp1-F和com FoNpp1-R)(表2)。

表2 FoNpp1基因回补片段的扩增引物

用真菌DNA提取试剂盒(OMEGA Fungal DNA Kit)，提取香蕉枯萎病菌基因组DNA；以该基因组DNA为模板，用引物com FoNpp1-F和com FoNpp1-R进行PCR扩增，获得FoNpp1基因的回补片段。

具体的PCR反应体系为：

PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应30s，58℃反应30s，72℃反应4min，共30个循环；72℃反应10min，即获得PCR扩增产物。用OMEGA Cycle Pure Kit试剂盒，对PCR扩增产物进行清洁回收。

2.4 Fo4基因FoNpp1回补载体的构建

用KpnI和SalI分别对com FoNpp1和pCTZN载体进行双酶切，回收comFoNpp1片段和pCTZN载体。用T4 DNA连接酶将com FoNpp1片段与pCTZN连接，转化大肠杆菌DH5α；获得重组质粒pCTZN-FoNpp1-com。经酶切鉴定，获得基因回补载体pCTZN-FoNpp1-com。

2.5 Foc4原生质体的制备

将Foc4接种到查氏培养基(硝酸钠3g，三水合磷酸氢二钾1g，氯化钾0.5g，七水合硫酸镁0.5g，七水合硫酸亚铁0.018g，蔗糖30g，蒸馏水定容至1L，pH为6.0)中，于28℃、150rpm振荡培养3d；将培养液用200目细胞筛过滤，于4℃下10000×g离心10min，弃上清。用CM培养基(葡萄糖10g，蛋白胨2g，水解酪蛋白1g，酵母浸粉1g，20×硝酸盐50mL，1000×维生素1mL，1000×微量元素1mL，定容至1L，pH 6.5)重悬沉淀并进行稀释后，制得Foc4分生孢子悬浮液。将制备好的分生孢子悬浮液接种于CM培养基中，使分生孢子终浓度为1×10⁶个/mL；于28℃下120rpm震荡培养11～12h，用200目细胞筛过滤，并用0.8mol/L NaCl溶液(渗透压稳定剂)冲洗3～5次，获得新鲜菌丝体。按酶液与菌丝比例(体积质量比10:1)，加入适量15mg/mL溶壁酶和15mg/mL崩溃酶酶混合液，于30℃下120rpm条件下酶解3h，得到原生质体酶解液。于4℃下400×g离心10min，弃上清。加入1mL预冷的STC溶液(含10mmol/L Tris-Hcl(pH 7.5)，1.2mol/L山梨醇，50mmol/L CaCl₂)重悬沉淀；离心，弃上清。再加入10～20mL预冷的STC将沉淀重悬，得到Foc4原生质体悬液，使原生质体终浓度约为1×10⁷个/mL。

2.6 Foc4原生质体的转化

用KpnΙ对敲除载体pCT74-FoNpp1-KO进行单酶切，获得A-hph-gfp-B片段。将3～5μg的重组片段A-hph-gfp-B片段与200μL的Foc4原生质体混匀，或者，将3～5μg的pCTZN-FoNpp1-com质粒与200μL香蕉枯萎病菌敲除突变体原生质体混匀；冰浴15min。逐滴加入新鲜配制的PSTC转化缓冲液(40％PEG4000，1.2mol/L山梨醇，50mmol/L CaCl₂，10mmol/LTris-HCl，pH7.5)1mL，混匀后冰上放置15min。加入10mL预冷的STC，混匀；于4℃下4000rpm离心15min；去掉6mL上清，用3mL PSB再生培养基(马铃薯200.0g，蔗糖273.6g，蒸馏水定容至1L)重悬沉淀，于28℃、100rpm震荡培养12h～16h。于4℃下4000rpm离心15min，去掉5mL上清，加入12mL PSA再生培养基(PSB再生培养基中加入0.9％琼脂粉、150μg/mL潮霉素)，混匀倒板，于28℃黑暗培养2～3d；挑取潮霉素抗性转化子，转移到含有150μg/mL潮霉素的PDA培养基(含马铃薯200.0g，无水葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，蒸馏水定容至1L)，于28℃黑暗培养3～4d，挑取单菌落用于鉴定。

2.7 Foc4敲除突变体的PCR验证分析

按照真菌DNA提取试剂盒(OMEGA Fungal DNA Kit)说明书，提取上述潮霉素阳性转化子的基因组DNA，进行PCR验证分析。分别用引物FoNpp1-F/FoNpp1-R进行FoNpp1基因片段的PCR扩增；用引物hph-F/hph-R进行hph基因片段的PCR扩增分析。

FoNpp1-F：TGCCCAAGATGTGCATTTGA，

FoNpp1-R：GTCCCAACCAACAAGAGGAGC，

hph-F：TGCTGCTCCATACAAGCCAA，

hph-R：GACATTGGGGAGTTCAGCGA；

PCR反应体系如下：

PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应30s，58℃反应30s，72℃反应1min，共30个循环；72℃反应10min，得到扩增产物。

2.8回补突变体ΔFoNpp1-com的PCR验证分析

按照真菌DNA提取试剂盒法(OMEGA Fungal DNA Kit)说明书，提取上述博来霉素阳性转化子的基因组DNA，进行PCR验证分析。用引物FoNpp1-F/FoNpp1-R进行基因片段FoNpp1的PCR扩增。

FoNpp1-F：TGCCCAAGATGTGCATTTGA，

FoNpp1-R：GTCCCAACCAACAAGAGGAGC；

PCR反应体系如下：

PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应30s，58℃反应30s，72℃反应1min，共30个循环；72℃反应10min，得到扩增产物。

2.9 Foc4敲除突变体的Southern blot分析

按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I(Roche公司)说明书，进行Southern blot杂交。用引物FoNpp1-F/FoNpp1-R扩增目的基因探针，用hph-F/hph-R扩增hph基因探针。

FoNpp1-F：TGCCCAAGATGTGCATTTGA，

FoNpp1-R：GTCCCAACCAACAAGAGGAGC，

hph-F：TGCTGCTCCATACAAGCCAA，

hph-R：GACATTGGGGAGTTCAGCGA；

DNA探针的PCR扩增体系如下：

PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应30s，58℃反应30s，72℃反应1min，共30个循环；72℃反应10min，得到扩增产物。

2.10 Foc4敲除突变体的表型观察

(1)菌落形态观察及生长速度测定。将Foc4野生型、敲除突变体ΔFoNpp1和回补突变体ΔFoNpp1-com分别接种于PDA培养基上，于28℃黑暗条件下培养5d。分别在第1d、3d、5d时测量菌落直径，并观察其菌落形态。每个处理设置3个重复。

(2)分生孢子的产生与萌发观察。将Foc4野生型、敲除突变体ΔFoNpp1和回补突变体ΔFoNpp1-com分别接种至查氏培养基，置于28℃、120rpm震荡培养，7d后统计产孢量。将分生孢子悬浮液接种于CM培养基，于28℃、120rpm震荡培养，11h时取样，观察分生孢子的萌发情况。

2.11 Foc4敲除突变体抗胁迫环境能力分析

(1)细胞壁抗高渗透压能力测定

将Foc4野生型、敲除突变体ΔFoNpp1和回补突变体ΔFoNpp1-com分别接种在含有1mol/L NaCl、1mol/L山梨醇、0.02％SDS和200μg/mL刚果红的PDA培养基上，于28℃培养箱倒置培养5d后，观察并测定菌落生长情况。每个处理设置3个重复。

(2)氧化胁迫测定

将Foc4野生型、敲除突变体ΔFoNpp1和回补突变体ΔFoNpp1-com分别接种在含有25、50和75mmol/L H₂O₂的PDA培养基上，于28℃培养箱倒置培养5d后，观察菌落生长情况。每个处理设置3个重复。

2.12 Foc4敲除突变体的致病性分析

采用伤根接种法，分别用Foc4野生型、敲除突变体(ΔFoNpp1、ΔFoNpp1-com)的分生孢子悬浮液(2×10⁵个/mL)接种4叶期的巴西蕉，于25±1℃、光/暗12h/12h交替培养，25d后观察统计香蕉苗叶片和球茎的发病情况。

2.13 Foc4敲除突变体的镰刀菌酸含量测定

将Foc4野生型、敲除突变体ΔFoNpp1、和回补突变体ΔFoNpp1-com分别接种于50mL改良的Richard培养基中，于28℃、120rpm培养9d。将培养液用121℃下高压灭菌18min，再超声处理10min，用双层纱布过滤；将滤液于6000rpm离心30min，取上清；上清液再用等体积乙酸乙酯进行萃取，于50℃下用旋转蒸发仪旋蒸至干；加入50mL无水乙醇复溶，测定268nm下的吸光值。每个样品设置三个重复。

3、结果与分析

3.1 FoNpp1基因敲除载体和回补载体的构建

3.1.1基因敲除载体构建。采用PCR扩增方法，分别克隆获得FoNpp1基因同源臂A片段和同源臂B片段；分别将其与T载体连接，经转化大肠杆菌、Amp抗性筛选、质粒提取与测序鉴定，获得重组质粒pMD18T-FoNpp1-A和pMD18T-FoNpp1-B。将pMD18T-FoNpp1-B与pCT74质粒连接，获得重组质粒pCT74-FoNpp1-B；将其与pMD18T-FoNpp1-A进行双酶切，经DNA连接、大肠杆菌转化、酶切鉴定，获得基因敲除载体pCT74-FoNpp1-KO(图1)。

3.1.2基因回补载体的构建。采用PCR扩增方法，克隆获得FoNpp1基因回补片段；将其与pCTZN载体连接，经大肠杆菌转化、Amp抗性筛选、质粒提取与测序鉴定，获得重组质粒pCTZN-FoNpp1-com(图2)。

3.2敲除突变体ΔFoNpp1的筛选

3.2.1基因片段FoNpp1的PCR验证

利用同源重组方法，将基因敲除载体转化香蕉枯萎病菌原生质体，获得了8个潮霉素阳性转化子。经DNA的提取，利用FoNpp1基因特异性引物，对8个潮霉素阳性转化子进行了PCR验证分析。结果表明，有2个阳性转化子可扩增到目的基因片段，说明这2个转化子仍含有FoNpp1基因；有6个转化子没有扩增到FoNpp1基因，初步鉴定这6个转化子为阳性转化子(图3)。

3.2.2基因片段hph的PCR验证

以上述6个没有扩增到FoNpp1基因的转化子基因组DNA为模板，利用hph特异性引物进行PCR扩增；结果表明，上述没有扩增到FoNpp1基因6个转化子，都扩增到了约1000bp的目的片段，进一步说明这6个转化子为阳性转化子(图4)。

3.2.3敲除突变体△FoNpp1的Southern blot验证

选取上述没有扩增到FoNpp1基因、而扩增到hph基因的3个阳性转化子，进行Southern blot分析。结果表明，以目的基因作为探针进行杂交，3个转化子均未有杂交条带。以hph为探针进行杂交，发现这3个转化子均有单拷贝条带出现。上述试验证明这3个转化子为阳性转化子。

3.3回补突变体△FoNpp1-com的筛选

利用随机插入的方法，将基因回补载体转化△FoNpp1原生质体，获得了6个博来霉素阳性转化子。经基因组DNA的提取，利用FoNpp1基因特异性引物，对6个博来霉素阳性转化子进行了PCR验证分析。结果表明，4个阳性转化子可扩增到目的基因片段，说明这4个转化子含有FoNpp1基因，鉴定为阳性转化子(图5)。

3.4 △FoNpp1的菌落形态和生长速率测定

将△FoNpp1-2和△FoNpp1-com(ΔNpp1-2-com)接种于PDA培养基中，结果发现△FoNpp1-2和△FoNpp1-com的菌落形态和生长速率与Foc4野生型没有明显区别。

3.5 △FoNpp1产孢量及孢子萌发分析

将△FoNpp1-2和△FoNpp1-com接种于查氏培养基，7d后进行产孢量分析。结果表明，△FoNpp1和△FoNpp1-com的产孢量与Foc4野生型相比无显著性差异。分生孢子在CM培养基中培养11h后的观察结果表明，△FoNpp1和△FoNpp1-com的分生孢子萌发率与Foc4野生型相比也没有明显差异，说明敲除FoNpp1后不影响Foc4的分生孢子产生与萌发。

3.6 △FoNpp1的抗高渗透压能力测定

将△FoNpp1-2和△FoNpp1-com接种于分别含NaCl、山梨醇、SDS和刚果红的PDA培养基中，菌落直径测定结果表明，与Foc4野生型相比，△FoNpp1和△FoNpp1-com对NaCl、SDS、刚果红和山梨醇的敏感性无显著性差异，说明敲除FoNpp1不影响香蕉枯萎病菌抗高渗透压的能力(图6)。

3.7 △FoNpp1的氧化胁迫敏感性测定

将△FoNpp1-2和△FoNpp1-com分别接种于含不同浓度H₂O₂的PDA培养基中，菌落直径测定结果表明，敲除FoNpp1基因后，不影响香蕉枯萎病菌对氧化胁迫的敏感性(图7)。

3.8 △FoNpp1的致病性分析

对巴西蕉的致病性测定结果表明，Foc4野生型接种后的香蕉叶片出现了明显黄化、枯死，球茎出现大面积变褐；而敲除突变体△FoNpp1接种后，香蕉叶片发病较轻，球茎变色面积小。病情指数统计结果表明，敲除突变体的病情指数显著低于野生型(图8)。

3.9 △FoNpp1镰刀菌酸含量的测定

镰刀菌酸含量的测定结果表明，与Foc4野生型相比，△FoNpp1镰刀菌酸含量显著降低，而△FoNpp1-com的则恢复到野生型水平；推测FoNpp1的敲除，降低了Foc4镰刀菌酸的合成，进而影响了其致病性(表3)。

表3敲除突变体△FoNpp1镰刀菌酸含量测定

以上结果表明，FoNpp1基因的的缺失会导致香蕉枯萎病菌镰刀菌酸含量和致病力显著降低；证实FoNpp1基因是香蕉枯萎病菌致病性所必需的。可将FoNpp1基因作为靶标基因，研制防治香蕉枯萎病菌的杀菌剂。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 香蕉枯萎病菌FoNpp1基因在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用

<141> 2021-03-05

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1098

<212> DNA

<213> 尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)

<400> 1

tatgatcaac atgaatgtaa cgtccttgcc caagatgtgc atttgagctg aacccccatg 60

gacgagccgc gatcaaggtg ttgagttgta aaatgttgat ctattcaaga caggaacctg 120

tttccaagag cagcagacac gtataagtac tgcatcatcc accatcagtt taactccatc 180

tcatcaccat cttcatctcc catcacaaca tcaactcaac agccaccatg cagaacaagc 240

tcatcaccgc cgccgccctc ctgagtgcca tggcatcagt ccaggcatct cccgtttcta 300

tttccaagcg agacgttctc acagccctcc ctggaggcgc ttctgacatc gagaacaagt 360

tccagcctgc tcttgacttc gacagcgacg gctgctacca gaccgccgcc attgatcctg 420

atggcaactt gaaccctggt catggcgcca ctggtactcc ccagggagac tgtcgtgatc 480

ctccccagct tgataacagc aacacctatt ctcgcaagcg ctgcaacaat ggcttctgtg 540

ccattatgta tgagacctac tatgagaaag accaagccgt tggtggcagc tttctcggag 600

gtcaccgcca cgactgggag aacatcgtcg ttttcaccca aggcgacaat gtcgtccgcg 660

tcgcaccctc ctgccacgga aaatacgacg gcgccagcaa cgagttcccc agcgacggaa 720

gcacccctct tctcgtttat cacaaggacg gtgccggaac tcactgctac cgctttgcca 780

acgacgatga ccaggccaac cccgagaacc ctactggttc tttcttcaaa gctcctcttg 840

ttggttggga caactggcct gatgttggtc tgcgagacaa gatgctgcag aactggaatg 900

gtggtgttgg acctaagctg gatgatgagt ttggtgattc gctcaaggcg gctgctggtg 960

atggtgttca gggcttcgat ccttacaagg acgagtaaag atggggagga ccaggaaccc 1020

ttgtttacta ctatttagca ttactattga acgttgttga cttcgctaaa tgcatcactg 1080

gagacttttc ccctggag 1098

<210> 2

<211> 256

<212> PRT

<213> 尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)

<400> 2

Met Gln Asn Lys Leu Ile Thr Ala Ala Ala Leu Leu Ser Ala Met Ala

1 5 10 15

Ser Val Gln Ala Ser Pro Val Ser Ile Ser Lys Arg Asp Val Leu Thr

20 25 30

Ala Leu Pro Gly Gly Ala Ser Asp Ile Glu Asn Lys Phe Gln Pro Ala

35 40 45

Leu Asp Phe Asp Ser Asp Gly Cys Tyr Gln Thr Ala Ala Ile Asp Pro

50 55 60

Asp Gly Asn Leu Asn Pro Gly His Gly Ala Thr Gly Thr Pro Gln Gly

65 70 75 80

Asp Cys Arg Asp Pro Pro Gln Leu Asp Asn Ser Asn Thr Tyr Ser Arg

85 90 95

Lys Arg Cys Asn Asn Gly Phe Cys Ala Ile Met Tyr Glu Thr Tyr Tyr

100 105 110

Glu Lys Asp Gln Ala Val Gly Gly Ser Phe Leu Gly Gly His Arg His

115 120 125

Asp Trp Glu Asn Ile Val Val Phe Thr Gln Gly Asp Asn Val Val Arg

130 135 140

Val Ala Pro Ser Cys His Gly Lys Tyr Asp Gly Ala Ser Asn Glu Phe

145 150 155 160

Pro Ser Asp Gly Ser Thr Pro Leu Leu Val Tyr His Lys Asp Gly Ala

165 170 175

Gly Thr His Cys Tyr Arg Phe Ala Asn Asp Asp Asp Gln Ala Asn Pro

180 185 190

Glu Asn Pro Thr Gly Ser Phe Phe Lys Ala Pro Leu Val Gly Trp Asp

195 200 205

Asn Trp Pro Asp Val Gly Leu Arg Asp Lys Met Leu Gln Asn Trp Asn

210 215 220

Gly Gly Val Gly Pro Lys Leu Asp Asp Glu Phe Gly Asp Ser Leu Lys

225 230 235 240

Ala Ala Ala Gly Asp Gly Val Gln Gly Phe Asp Pro Tyr Lys Asp Glu

245 250 255

Claims (9)

1.SEQ ID NO：1所示FoNpp1基因或SEQ ID NO：2所示FoNpp1蛋白在调控香蕉枯萎病菌的致病力和/或镰刀菌酸的含量中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，为在降低香蕉枯萎病菌致病力和/或镰刀菌酸含量中的应用。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，为在降低香蕉枯萎病菌对香蕉的致病力中的应用。

4.根据权利要求1～3任一所述应用，其特征在于，所述香蕉枯萎病菌为香蕉枯萎病菌4号生理小种。

5.SEQ ID NO：1所示FoNpp1基因或SEQ ID NO：2所示FoNpp1蛋白作为防治靶标在制备防治香蕉枯萎病菌的杀菌剂中的应用。

6.一种防治香蕉枯萎病的杀菌剂，其特征在于，含有阻断或抑制香蕉枯萎病菌FoNpp1基因表达的制剂。

7.根据权利要求6所述杀菌剂，其特征在于，所述制剂为与香蕉枯萎病菌FoNpp1基因的靶RNA具有互补序列的反义RNA。

8.根据权利要求7所述杀菌剂，其特征在于，所述反义RNA为siRNA或shRNA。

9.一种防治香蕉枯萎病的方法，其特征在于，通过该阻断或抑制香蕉枯萎病菌FoNpp1基因的表达。

Images