CN114958876B - Iaa-po1基因在诱导平菇原基形成和平菇生长发育抗逆中的应用 - Google Patents

Iaa-po1基因在诱导平菇原基形成和平菇生长发育抗逆中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了IAA‑PO1基因在诱导平菇原基形成和平菇生长发育抗逆中的应用，属于基因工程技术领域。本发明公开的IAA‑PO1基因在诱导平菇原基形成和平菇生长发育抗逆中的应用，IAA‑PO1基因诱导平菇原基提前形成；IAA‑PO1基因参与调控平菇生长过程中温度胁迫、氧化性胁迫、酸碱胁迫，并与平菇细胞壁完整性有关。

Description

IAA-PO1基因在诱导平菇原基形成和平菇生长发育抗逆中的 应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及IAA-PO1基因在诱导平菇原基形成和平菇生长发育抗逆中的应用。
背景技术
平菇是一种适应性广的木腐真菌，与其他食用菌相比，平菇具有生命力强，栽培容易，栽培周期短，基质利用广，生物学效率高，适应性强，栽培区域广阔，营养丰富，口味鲜美的特点，平菇越来越受到人们的青睐，是世界上广泛栽培的食用菌之一，也成为我国菌类栽培面最广的种类且产量682.96 万吨，位居全国第三(中国食用菌协会统计，2020)。但是，在平菇的生产过程中，存在的主要问题是外界环境因素的变化严重影响平菇的产量和质量，影响经济效益；另外，平菇原基有效利用率也是影响平菇高产的主要因素之一。基于此，选育出原基利用率高、抗逆性强的平菇菌株成为平菇生产中亟待解决的问题。
因此，提供IAA-PO1基因在诱导平菇原基形成和平菇生长发育抗逆中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了IAA-PO1基因在诱导平菇原基形成和平菇生长发育抗逆中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
IAA-PO1基因在诱导平菇原基形成和平菇生长发育抗逆中的应用，所述 IAA-PO1基因序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步，所述抗逆的逆境为温度胁迫、氧化性胁迫、酸碱胁迫。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了IAA-PO1 基因在诱导平菇原基形成和平菇生长发育抗逆中的应用，IAA-PO1基因诱导平菇原基提前形成；IAA-PO1基因参与调控平菇生长过程中温度胁迫、氧化性胁迫、酸碱胁迫，并与平菇细胞壁完整性有关。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明野生型菌株和过表达突变株在不同温度条件下的生长情况直观图；
图2为本发明野生型菌株和过表达突变株在不同温度条件下的生长情况统计图；
图3为本发明野生型菌株和过表达突变株在不同温度条件下IAA-PO1 基因的相对表达量；
图4为本发明野生型菌株和过表达突变株的原基形成情况；
其中，A为WT；B为Mutant；
图5为本发明野生型菌株和过表达突变株在不同pH条件下的生长情况直观图；
图6为本发明野生型菌株和过表达突变株在不同pH条件下的生长情况统计图；
图7为本发明野生型菌株和过表达突变株在不同浓度刚果红条件下的生长情况直观图；
图8为本发明野生型菌株和过表达突变株在不同浓度刚果红条件下的生长情况统计图；
图9为本发明野生型菌株和过表达突变株在不同浓度H2O2条件下的生长情况直观图；
图10为本发明野生型菌株和过表达突变株在不同浓度H2O2条件下的生长情况统计图；
图11为标准曲线；
图12为本发明野生型菌株和过表达突变株中H2O2含量；
图13为本发明野生型菌株和过表达突变株在不同浓度H2O2条件下 IAA-PO1基因的相对表达量；
图2、3、6、8、10、12、13中，大写字母表示在P＜0.01条件下呈极显著性差异，小写字母表示在P＜0.05条件下呈显著性差异；误差线为标准差。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1平菇子实体发育过程中IAA合成相关基因的获得
以经10-3mol·L-1和10-8mol·L-1IAA处理的平菇原基期样品为材料，以不经处理的原基期样品为对照，研究平菇ALDH基因家族中各基因的表达情况，发现2762552025号基因在10-3mol·L-1处理条件下表达量最低，在10-8mol·L-1处理条件下表达量最高，作为后续研究的候选基因，该基因命名为IAA-PO1。
IAA-PO1基因的启动子序列如SEQ ID NO.1所示。
ACACATATCAATTCATGGCAAGGACACGACCTCCTATGAGCGCCTC GAATTCATCGGAGATGCCATCCTTGATTTCAGTGTGTACACCCACGCAC TGCTTTAACCGGGGGCACTAATTGGCAATGTCTGAACAGTGGTGATTCG GCATATTTACGACCGCTATCAACAGCTTTCCCCTGGCGGTTTGACTCTT CTCAAGGTCTGGACCTACTCGTGGTGATCATGCAACCCACTAATATTTA ATTTCTCCCCAGGGCGCAATGGTTTCAAACTCGGCGTTAGCGGCGGTCTGCGTTTGGTCTGGTTTGCACAAACATATATTATTGGAGTCACACAATTT ATCAGCGACAATCGATACCTACGTCAATGGGCTTAGTGCGCTGGAAGC TACCGAGCGCGAGGCAGCCAAGTCAGACGGCAGGCCACTGGGTCAATA TTGGCTAGAACTTGAACCACCGAAAGTAAGTCAAGTATCCGAATTGCG ATATGCCCGTTAATAGTCCCCAGGCGCTATCAGATGTTGTGGAGTCAAT AATTGGCGCTATATATCTCTCGGATGACCTTTCTCCGGAAGGAACCGAG CGATTCTTCGACAAAGTCCTCCGACCTTTTTTTGATGGGCACATCACAT TACGAACGCTTTCTCACCATCCGACCAAAACACTGCTTGAGGTATTCCA GGCACATGGTTGTCACCAATTCGAAATCTCCAAAGAGAAGGATGCGAC CCATCCCCATGTTTCTGGTAGGTGGTTTGACAGCGCAGTGTGTTATGTG GAGTAACTGATTCCCCAAAGTTGTGGTTCACAACGTTATTTTAGCCGAC GCACAGGATGCCAATGCATCGTTGGCGGCTAGGCGCGCATCCATCACG GCACTGGATGCATTAGAAGGTGACCCCAACTTTTTGAACAGAGCCTGC GATTGCCGCACAAATTCCGTGGAAGCGAAGAAGAAGAAAGTGGCTATG GAGGACATGCTTGCGGGGTTGGGAGAGGAAGAGCGTGCCAGAGGGAA TCCGGCGATGACGATCGATCCGTAATATGGGCATTAGTTTGACCGCCGT ATAAATCCCTAAGGACGCAGATGGTTGTTCTAGCTCTATGTGGGCATCA TACGGGCCGCTCGACTCAAAGCTTCTTCATGCACAATGGAATATATGTT GCTCTAAGCCGCAAATGGTCTACAGCGCTTAGAAGTGCCATACATTCTT CTCTAGTTTACGAAGATTTCTTCCTGTCATGGGATTCAGGAAGAGTGAC CATATGGATTGAGAACAAGAACTCACAGTTGGTAGACCGAGGCCACGA CGGGAATGCTGAAGCCAAATAACAAGAAAGAGGTCAACTTGAGGCCA AACGCGGTCTTCTTGTTGCCCGGCCAGGCGAAGGGGAGATGCTAATGT GCCGCCTCAGCGCGCGCCGATATGACGAAAAGCTAACAGAACGTACAT GGTAATCATGGCCAGCAGAGCGGACGGGCGCGGTGGTGTGAATTGATC TGACGCCTGCGGCAGCGGCGCGGCGAGCTACGACTGAAAGGACCATTT TTCTGGAATGCCTGGACAAGACGAGATTTGGTTCTGGATGTTGAGTGAA AGACGAGGCTCCGTTGAGTAACTTCAGTTGCGACTTTGGCCGAGGGGT CATGGGAATGTTTTCCCACGAAAGCTTCCCACGGACCATCTGGTGAACT TAAGTAGAAGTCCGAGGTCCACGGATGTCCTTCAAATATTGTCATATCC GCAGACATGGCTAGCAGCGACTACCGTGGCTCTCGGAAAATTTACCGC AATTTCGACTTTTCAAGGCCTTGGGCAAAAATCCTCAATTGGGCGCAAA CCAGGTGGTACTTAGTCGGACCCTGAATCTAGTCGTGTGTAGTAGCCGA GCTGCCGATGCCCTTCAAAATGCGAGCGCCGCGACTCCGAGTTCTACA GTTGGGGAAGTTGACGGCACGGGTCCAATCAGCTCCCACACATCATCA GCTCCTCTCTATCAGACTCTTATCTACGAGCACG；SEQ ID NO.1。
IAA-PO1的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
ATGGCGCAGAGCACAGTGGTGAAGATCCCGTTGTCGGGCAAGGAG ATCACGGTCCCGACAGGCCTCTTCATCAACAACGAATTTGTGCCTTCAG TCGATTCAAATGAATTCATCAAGTGAGTTAATGTCGGGATCTGTGATCTCGGTGCTAAACGCAATATTTGATAAGACCAGTCAATCCTGCTACGGAA GAAGCTATTTGCTCGGTCGTTGCAGGTGCACGTCGAGTCCCAGTCACAA CCCACGGCGAGAGCTAATACCATCTGGCAGGCTCCGTCAAGGATATTG ATGTGGCGGTAGCTGCTGCTCGCGAAGCGTTCAGGACAACCTGGGGAA AGAATGTGACAGGCTTTGAGCGCTCGAGACTGATCAACAAGCTGGCTG ATTTGATCGAGAGAGATGCACAAGAACTAGCCGAGCTTGAAACACTCA ATAATGGCAAACCTGTCAAAATTGCCAGGTAAAATGTTGGTATCACAC CGTAGAGCTTTCGTTGATGGATTCATTATAAGGGACTTTGACATTGGCG ACACTATCCAGTGCCTTCGCTATTATGCTGGATGGGCTGATAAAATAGT TGGTCAGGTCAGTCCAGTTCTGAATGACAATCCATAGCTTCGCCTATGC GTCTAGTCCTTCATCCGTCTAAGTATCTTATTATCATTCTCACTGCTTAC CTTTTATATGTAGACGATCGAGGTCGATAACAAGACAAAAATTGCGTTC ACTCGACACGAGCCTATTGGAGTTTGTGGGCAAATGTATTTCTTAAGTC TTGTCGGTGGCAATCCTTGTTTGAGATATTTAAATTTCTCTAGCATTCCG TGGAATTATCCGATCAACATGTGGTATGTTGTCGGTATCATTCTCGCCC ACGCATCATAATGAATAATGATCTAGGTCATGGAAAGTTGCACCCGCC CTTGCCTGTGGTTGTACAATAGTAATGAAGCCGTCAGAGGTGACACCG CTGACTGCCCTGGTTCGTCGCCCCCTTCCTGTTACCACCTGTATTTGGTT TTGCTCAGCCACCGGTTTTATCAAAAATAGAAACTTTGTGAACTTGTGA AGGAAGCAGGGTAAGCAACATTACCCTCTCCGTGCTGCTTTCTCGCCTC AGTTGATAATAGCTTTCCTCCGGGAGTCGTCAACACCGTTCCCTCTCTC GGGTCCATCGGCGGTGCTGCCCTCGCCGCGCATCCCGACGTCGATAAA GTGGCCTTCACAGGTTCCACGGTCACTGGTAGGAAAATAATGGAAGCG GCTAAAGGCAACATCAAGAAGGTAATTTATGCGCGACTTTGTTCCCAAT TGAGACAGCGGCAACAGGGTTGATGTTGTTATACATACTTTTTTGACTG CACCCTCCTTCTCGAGAGTGGGTTGGTTGTTTAATTCTTACTCACCGCTGTTGTCCTCGGCTTCGCGCTCAATCTAGCGCTTGCATACGCTTCCCCTTTG ATTCAACCCCATTGGCAATGCGGTTATTAATTCATCGTCTCCGCAGGTC TCTCTGGAACTCGGCGGAAAATCACCTCATATTATTTTCGAATCGGCGG ATTTGGACCAAGGTGCGTGTTATCAATTGAAAATCCCCATCACTACTCC ACCATCTATCGGTACCTTTTCTTGTTCGCTCTTATACGGCGCCTCCGCAC TGGTACTATACTGGATCCAGCACACACATGTGTTACCCGCTTTATCCAT GCAAGGATTTTGCCGAGAGCGTTGTCCACCGTTGCTTCTCTGTCCCAAG CGGGGAATGACAGGGAATGACGTCCTCGATGCGGTCCCTGAAGAGAAT AGACTAATGCCTCGTGGCAAGCACATGCCTTCTCGTGTCCGAGGGTGCT AATCTCACCTACTACTTCGCTGCTTCCGCATCGTTAGGGCGCGGCTGAA TTCTGATGAATCATCTACAGCTGCAAACTGGGTGGCGTTGGGCATTGGT TATAACACCGGTCAAGATTGCACTGCGGGATCTCGGCTTTATGTCCAAG AAACTATCTATGACAAGTTTGTCGCGTTGCTGGTTGGGAAGATGAAGG AACTGGTAGTTGGAAACGGGTTCGACGACGCAAGTGGCGCCGGTCCCG TGGTAGGCCCATTTCGCTCAACTATGCTACGAGGTCAGCAACCCGCCTA AACCCCGCGCCTAGGTTTCAAAGACCCAATACGATCGCGTTTGGAGTTA CATTGAAGCTGGGAAACAAGCTGGGGCGAAGGTTGCCGTTGGGGGTGA GAAGCGGCAGGGAAAAGGATACTTCGTTGATCCCACAAGTGAGTTAAT TGGCCTACTCGGATTTTTTTCCATGTCTGACCTAGCTTCCGTTTCCAGTC TTCACCGATATCACCTCCGACATGAAAATTGTGAGGCTCTGAGAGGCA ATGCCTTAGAATTGATATTGATAATTATTTTCTAGGTACAAGAGGAGGT AATTACCGTTCACCTTCAGAACATGCGTCGTTCACCCTTGATGCCGATC TTCCACATGTTTTGCGTCGTGGTGATGTTCGGGACTGACAAACTATTTA GATATTTGGTCCCGTACTTACGGTTGGTCGATTCAAGACAGAAGAAGA AGCAATCTCTCTCGCCAATGACACAACATATGGCTTGGGTGCAGGGCTC CACTCCAGTGTGTATTTCCATTATTTCTCATAGCACAAAGCTCATCATTT CGTCCAGATGATGCGAGTCAGTGCATCAGGGTGTCGTCCGCGCTCGAG GCTGGAACGGTGAGCTATTGGTCTTTTGGTTTCCGTGCCAATGCAGTGT TGATGATTACAATTATATTTATATTTAAGGTCTGGATCAACCAATATAATATTCTCAATAACAACGTTCCCTTTGGAGGAAAGAAACAATCCGGAATT GGTAATATTTCCCTCGTAGGGATTAGCCTGTACTGACCTTCTCCTAGGT CGGGAGCTGGGGAGTTATGCATTGGAGGAATATACGTCGGTAAAGGCG ATCCACTGGAATTTCGGTGAGAAGCTGGCGTGGCCTTTGTGA；SEQ ID NO.2。
实施例2IAA-PO1基因过表达突变株的获得
1)构建p-QDZ载体
(1)扩增启动子基因片段
提取平菇P99菌株基因组DNA，扩增IAA-PO1基因的启动子序列。扩增引物如下：
ALDHIAA-QDZ-up：5’-GCTCTAGAACACATATCAATTCATGGC-3’； Xba1；SEQ ID NO.3；
ALDHIAA-QDZ-down：5’-TCCCCCGGGCGTGCTCGTAGATAAGAG-3’； Sma1；SEQ ID NO.4。
PCR反应体系：PrimeSTAR HS(Premix)12.5μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，基因组DNA 1μL，ddH2O 9.5μL。
PCR反应程序：98℃10s，58℃15s，72℃2min，30个循环。
进行琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收，获得启动子基因片段。将经测序正确的IAA-QDZ启动子片段连接到pMD-18T载体上，命名为T-IAA-QDZ载体，T- IAA-QDZ经Xba1/Sma1酶切后，连接到pCB1532质粒(Xiao Cui,Yi Wei, Xiang-Li Xie,et al.Mitochondrial andperoxisomal Lon proteases play opposing roles in reproduction and growth butco-function in the normal development,stress resistance and longevity ofThermomyces lanuginosus[J],Fungal genetic and biology, 2017,103:42-54.)，连接后的载体命名为p-QDZ载体。
(2)酶切
酶切体系为：
pCB1532质粒5μL，10×buffer 1μL，Xba10.5μL，Sma10.5μL，RNA酶 0.15μL，ddH2O2.85μL；
T-IAA-QDZ载体质粒5μL，10×buffer 1μL，Xba10.5μL，Sma10.5μL， RNA酶0.15μL，ddH2O 2.85μL；
(3)连接
连接体系：
酶切后的启动子基因片段4.5μL，酶切后的pCB1532质粒0.5μL，10×T4 buffer1μL，T4 DNA连接酶1μL，ddH2O 3μL。
获得p-QDZ载体。
2)构建p-IAA-PO1载体
(1)扩增IAA-PO1基因片段
以提取的平菇P99菌株基因组DNA为模板，扩增IAA-PO1的基因序列。
扩增引物如下：
ALDHIAA-PO1-up：5’-TCCCCCGGGATGGCGCAGAGCACAGTG-3’； Sma1；SEQ ID NO.5；
ALDHIAA-PO1-down：5’-AACTGCAGTCACAAAGGCCACGCCA-3’； Pst1；SEQ ID NO.6。
PCR反应体系：PrimeSTAR HS(Premix)12.5μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，基因组DNA 1μL，ddH2O 9.5μL。
PCR反应程序：98℃10s，58℃15s，72℃3min，30个循环。
进行琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收，获得IAA-PO1基因片段。
将经测序正确的IAA-PO1基因片段连接到pMD-18T载体上，命名为T- IAA-PO1，T-IAA-PO1经Sma1/Pst1酶切后，连接到p-QDZ载体上。
(2)酶切
酶切体系为：
p-QDZ载体5μL，10Xbuffer1μL，Sma10.5μL，Pst10.5μL，RNA酶0.15 μL，ddH2O 2.85μL；
T-IAA-PO1载体5μL，10Xbuffer1μL，Sma10.5μL，Pst10.5μL，RNA 酶0.15μL，ddH2O2.85μL；
(3)连接
连接体系：
酶切后的IAA-PO1基因片段4.5μL，酶切后的p-QDZ载体0.5μL，10×T4 buffer1μL，T4 DNA连接酶1μL，ddH2O 3μL。
将检验正确的过表达载体命名为p-IAA-PO1。
3)原生质体转化
P99原生质体制备方法：
①5mm平菇P99菌块接于150ml PD液体培养基中培养5d，无菌打碎机打碎后接到新鲜的150ml PD液体培养基中培养1d。
②在超净工作台中，将菌丝经铺有两层无菌滤膜的无菌漏斗中过滤，用无菌去离子水漂洗，然后用protoplastbuffer漂洗并过滤；
③称取0.3g的融壁酶溶解于3mL Novozyme buffer中，并用0.25μm的滤器过滤除菌；
④将过滤收集到的菌丝加入到过滤除菌的融壁酶溶液及17mL的protoplastbuffer的150ml三角瓶中，于28℃，80rpm振荡孵化4.5h，1h后开始境检原生质体的形成情况，当大多数菌丝被消化后停止振荡孵化；
⑤通过六层擦镜纸把原生质体过滤到一个新的无菌的50ml离心管中，加入30mL0.6M的KCl溶液，充分混匀；于3000×g，4℃，离心10min；
⑥弃上清液，用10mL STC溶液充分悬浮，于3000×g，4℃，离心10min，此步骤重复一次；
⑦显微镜下计数，并调整原生质体在STC中的终浓度达到1×106/mL，并始终置于冰上；
如需储存，加入7％DMSO，每管分装200μL于2ml EP管中，储存于-80℃备用。
原生质体转化法的具体步骤如下：
(1)将200μL 1×106/mL的p99原生质体与1-5μg线性化的p-IAA-PO1 载体DNA充分混匀，置于冰上孵化30min；
(2)将步骤(1)中的原生质体(含有目的DNA)吸取到50ml EP管中央，加入500μLPEG转化液中，转动离心管轻轻混匀，再加入500μL PEG转化液，置于28℃培养箱中10min，然后于室温放置20min；
(3)吸取200μL步骤(2)中的混合液于TB3(蔗糖200g/L，酵母浸粉 3g/L，酸水解酪蛋白3g/L，琼脂7.5g/L)(无任何抗生素)平板中，转动平板使混合液铺满整个平板，置于28℃培养箱中培养14h，再倒入约10ml加有 200μg/ml氯嘧磺隆的TB3培养基，待凝固后置于28℃培养箱中避光培养；
(4)待TB3上层培养基中出现单菌落时(约铺氯嘧磺隆上层板后两天，注意每天观察)，挑转化子于PDA固体培养基中培养，提取DNA进行验证。
原生质体转化法将经Xba1酶切的线性化的p-IAA-PO1载体转入到P99原生质体中，挑取抗氯嘧磺隆转化子，提取各抗性转化子基因组DNA，以 SUR-F/SUR-R为扩增引物，各抗性转化子基因组DNA为模板，进行PCR扩增。
其中，SUR-F/SUR-R的引物序列如下：
SUR-F：5’-CTCCCATGGCCGACGCTCTTG-3’；SEQ ID NO.7；
SUR-R：5’-CCACTACGCTCGGCCCTCTCATAA-3’；SEQ ID NO.8；
PCR反应体系：DNA模板1μL，TaqPCRMasterMix聚合酶12.5μL，上下游引物(10μmolL-1)各1μL，超纯水4.5μL。
PCR扩增程序：94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环； 72℃10min。经PCR扩增及测序验证，可得到阳性过表达突变株。
实施例3IAA-PO1基因功能验证
(一)IAA-PO1基因参与平菇基本生长条件的调控
1)IAA-PO1基因参与平菇高温/低温胁迫
(1)将直径5mm的P99菌株(WT)及过表达突变株(Mutant)接种到 PDA培养基上，分别置于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃培养箱中培养6天，照相并记录其菌落直径，结果见图1-图2。结果表明：与野生型菌株相比，过表达突变株在20℃、30℃、35℃培养条件下生长速度极显著性增快，且在15℃培养条件下，与野生型菌株相比，菌丝变得致密。
(2)提取不同温度培养条件下野生型菌株及过表达突变株的RNA，反转录为cDNA，以P99菌株及过表达突变株cDNA为模板，以 qALDHIAA-PO1-up/qALDHIAA-PO1-down为扩增引物，进行qRT-PCR扩增， Actin为内参。
其中，IAA-PO1的CDS序列如SEQ ID NO.9所示。
ATGGCGCAGAGCACAGTGGTGAAGATCCCGTTGTCGGGCAAGGAG ATCACGGTCCCGACAGGCCTCTTCATCAACAACGAATTTGTGCCTTCAG TCGATTCAAATGAATTCATCAAACCAGTCAATCCTGCTACGGAAGAAGCTATTTGCTCGGTCGTTGCAGGCTCCGTCAAGGATATTGATGTGGCGGT AGCTGCTGCTCGCGAAGCGTTCAGGACAACCTGGGGAAAGAATGTGAC AGGCTTTGAGCGCTCGAGACTGATCAACAAGCTGGCTGATTTGATCGA GAGAGATGCACAAGAACTAGCCGAGCTTGAAACACTCAATAATGGCAA ACCTGTCAAAATTGCCAGGGACTTTGACATTGGCGACACTATCCAGTGC CTTCGCTATTATGCTGGATGGGCTGATAAAATAGTTGGTCAGACGATCG AGGTCGATAACAAGACAAAAATTGCGTTCACTCGACACGAGCCTATTG GAGTTTGTGGGCAAATCATTCCGTGGAATTATCCGATCAACATGTGGTC ATGGAAAGTTGCACCCGCCCTTGCCTGTGGTTGTACAATAGTAATGAAG CCGTCAGAGGTGACACCGCTGACTGCCCTGAAACTTTGTGAACTTGTGA AGGAAGCAGGCTTTCCTCCGGGAGTCGTCAACACCGTTCCCTCTCTCGG GTCCATCGGCGGTGCTGCCCTCGCCGCGCATCCCGACGTCGATAAAGTG GCCTTCACAGGTTCCACGGTCACTGGTAGGAAAATAATGGAAGCGGCT AAAGGCAACATCAAGAAGGTCTCTCTGGAACTCGGCGGAAAATCACCT CATATTATTTTCGAATCGGCGGATTTGGACCAAGCTGCAAACTGGGTGG CGTTGGGCATTGGTTATAACACCGGTCAAGATTGCACTGCGGGATCTCG GCTTTATGTCCAAGAAACTATCTATGACAAGTTTGTCGCGTTGCTGGTT GGGAAGATGAAGGAACTGGTAGTTGGAAACGGGTTCGACGACGCAAG TGGCGCCGGTCCCGTGGTTTCAAAGACCCAATACGATCGCGTTTGGAGT TACATTGAAGCTGGGAAACAAGCTGGGGCGAAGGTTGCCGTTGGGGGT GAGAAGCGGCAGGGAAAAGGATACTTCGTTGATCCCACAATCTTCACC GATATCACCTCCGACATGAAAATTGTACAAGAGGAGATATTTGGTCCC GTACTTACGGTTGGTCGATTCAAGACAGAAGAAGAAGCAATCTCTCTC GCCAATGACACAACATATGGCTTGGGTGCAGGGCTCCACTCCAATGAT GCGAGTCAGTGCATCAGGGTGTCGTCCGCGCTCGAGGCTGGAACGGTC TGGATCAACCAATATAATATTCTCAATAACAACGTTCCCTTTGGAGGAA AGAAACAATCCGGAATTGGTCGGGAGCTGGGGAGTTATGCATTGGAGG AATATACGTCGGTAAAGGCGATCCACTGGAATTTCGGTGAGAAGCTGG CGTGGCCTTTGTGA；SEQ ID NO.9。
qALDHIAA-PO1-up/qALDHIAA-PO1-down的引物序列如下：
qALDHIAA-PO1-up：5’-GCTATTATGCTGGATGGGCT-3’；SEQ ID NO.10；
qALDHIAA-PO1-down：5’-TTCACAAAGTTTCAGGGCAGT-3’；SEQ ID NO.11；
内参基因的引物序列如下：
Actin-F：5’-CCGTCCCCATCTATGAAGGT-3’；SEQ ID NO.12；
Actin-R：5’-GGTATCCTCGCTCCATCAAAT-3’；SEQ ID NO.13；
qRT-PCR反应体系为：cDNA模板1μL，5×SYBR Green Mix 5μL，上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，超纯水3μL。反应程序为：95℃预变性1min， 95℃10s，55℃30s，72℃30s，40个循环。
qRT-PCR结果见图3，图3结果表明，随着培养温度的不断升高，IAA-PO1 基因的表达量随之提高，35℃培养条件下，野生型菌株基因表达量是最适培养温度(25℃)下的4.3倍，过表达突变株基因表达量是野生菌株的1.41倍。
(3)将25℃培养7d至满板的P99野生型菌株及过表达突变株放置于15℃培养箱中培养10天后，发现过表达突变株原基提前形成，见图4。
2)IAA-PO1基因参与调控平菇菌丝生长所需酸性/碱性环境
将直径5mm的P99菌株及过表达突变株接种到pH分别为4、5、6、7、8、 9的PDA培养基上，置于25℃培养箱中培养6天，照相并测量其菌落直径，结果见图5-图6。结果表明：与野生型菌株相比，过表达突变株除了在最适pH为 6的PDA培养基上培养无显著性差异之外(P＞0.05)，在pH为4、5、7、8、 9的PDA培养基上生长速度均极显著性变快，且更适宜在pH为9的PDA培养基上生长，表明IAA-PO1基因更耐碱性环境。
(二)IAA-PO1基因参与平菇细胞壁完整性及氧化性胁迫反应
以平菇P99 IAA-PO1过表达突变株为研究对象，测定平菇菌丝体在不同浓度的刚果红(0ppm、100ppm、200ppm、300ppm)、H2O2(0μM、5μM、10μM)胁迫条件下，P99菌株的过表达突变株菌落生长速度的变化情况，确定IAA-PO1是否参与了平菇细胞壁完整性及氧化性胁迫的调控。
1)IAA-PO1基因影响平菇细胞壁完整性
刚果红，是一种能够与细胞壁中的β-1,4葡聚糖相结合的化学试剂，通常用来检测细胞壁的完整性。
将经活化后直径5mm的P99菌株及过表达突变株分别接种到含有0ppm、 100ppm、200ppm、300ppm刚果红的PDA培养基上，置于25℃培养箱中培养 6天，照相并记录菌落生长状况，结果见图7-图8。结果表明：相对于野生型菌株，过表达突变株在100ppm、200ppm、300ppm刚果红的PDA培养基上生长速度极显著性增快(P＜0.01)，且菌丝变得致密，对刚果红抗性增强，因此， IAA-PO1基因参与平菇细胞壁完整性应答反应。
2)IAA-PO1基因参与调控平菇氧化性胁迫
(1)将经活化后直径5mm的P99菌株及过表达突变株分别接种到含有0 μM、5μM、10μM H2O2的PDA固体培养基上，置于25℃培养箱中避光培养 6天，照相并记录菌落生长状况，结果见图9-图10。结果表明：与野生型菌株相比，添加不同浓度外源H2O2对菌丝生长速度影响差异显著，当添加5μM、 10μM的H2O2时，过表达突变株菌丝生长速度极显著变快(P＜0.01)。
(2)将经活化后直径为5mm的P99菌株及过表达突变株分别接种到PD 液体培养基中，置于25℃摇床中150rpm避光培养6天，分别称取3g经摇床培养6天且在吸水纸上吸干的野生型及过表达突变株的菌丝于研体内，加入3ml 4℃预冷的丙酮研磨成匀浆后，转入15ml离心管中4000r/min离心 15min，将上清液转至新的15ml离心管中，获得样品提取液。用1ml移液器吸取各样品提取液1ml，各管中分别加入0.1ml 5％硫酸钛和0.2ml浓氨水， 3000r/min离心10min，弃去上清液，留下沉淀，于各管中加入5ml的2M 硫酸，待沉淀完全溶解后于415nm波长下测各管中的吸光值，按照公式：过氧化氢含量＝C×Vt/FW×V1(C：标准曲线(图11)上查得样品中过氧化氢含量，Vt：样品提取液总体积，V1：测定时用样品提取液体积，FW：组织鲜重)，计算过氧化氢含量，结果见图12。结果显示：野生型菌株H2O2的含量为12.5 μmol/g，过表达突变株H2O2的含量为8.4μmol/g，与野生型菌株相比，过表达突变株H2O2含量极显著性降低。
(3)将经活化后直径为5mm的P99菌株及过表达突变株分别接种到分别含有0μM、2μM、3μM、4μM、5μM H2O2的铺有玻璃纸的PDA固体培养基上，于25℃培养箱中避光培养6天，6天后，从玻璃纸上刮取各菌株的菌丝，迅速放置到液氮中并提取野生型菌株和过表达突变株的RNA，反转录成cDNA后，以qALDHIAA-PO1-up/qALDHIAA-PO1-down为扩增引物，进行 qRT-PCR扩增，Actin为内参。
qRT-PCR反应体系为：cDNA模板1μL，5×SYBR Green Mix 5μL，上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，超纯水3μL。
反应程序为：95℃预变性1min，95℃10s，55℃30s，72℃30s，40 个循环。qRT-PCR结果见图13。
结果表明：经H2O2处理后，野生型菌株及过表达突变株的IAA-PO1基因表达量均上调表达，且过表达突变株IAA-PO1基因表达量极显著高于野生型(P ＜0.01)，分别是野生型的1.29、1.24、1.21、1.24倍。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所
<120> IAA-PO1基因在诱导平菇原基形成和平菇生长发育抗逆中的应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2020
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
acacatatca attcatggca aggacacgac ctcctatgag cgcctcgaat tcatcggaga 60
tgccatcctt gatttcagtg tgtacaccca cgcactgctt taaccggggg cactaattgg 120
caatgtctga acagtggtga ttcggcatat ttacgaccgc tatcaacagc tttcccctgg 180
cggtttgact cttctcaagg tctggaccta ctcgtggtga tcatgcaacc cactaatatt 240
taatttctcc ccagggcgca atggtttcaa actcggcgtt agcggcggtc tgcgtttggt 300
ctggtttgca caaacatata ttattggagt cacacaattt atcagcgaca atcgatacct 360
acgtcaatgg gcttagtgcg ctggaagcta ccgagcgcga ggcagccaag tcagacggca 420
ggccactggg tcaatattgg ctagaacttg aaccaccgaa agtaagtcaa gtatccgaat 480
tgcgatatgc ccgttaatag tccccaggcg ctatcagatg ttgtggagtc aataattggc 540
gctatatatc tctcggatga cctttctccg gaaggaaccg agcgattctt cgacaaagtc 600
ctccgacctt tttttgatgg gcacatcaca ttacgaacgc tttctcacca tccgaccaaa 660
acactgcttg aggtattcca ggcacatggt tgtcaccaat tcgaaatctc caaagagaag 720
gatgcgaccc atccccatgt ttctggtagg tggtttgaca gcgcagtgtg ttatgtggag 780
taactgattc cccaaagttg tggttcacaa cgttatttta gccgacgcac aggatgccaa 840
tgcatcgttg gcggctaggc gcgcatccat cacggcactg gatgcattag aaggtgaccc 900
caactttttg aacagagcct gcgattgccg cacaaattcc gtggaagcga agaagaagaa 960
agtggctatg gaggacatgc ttgcggggtt gggagaggaa gagcgtgcca gagggaatcc 1020
ggcgatgacg atcgatccgt aatatgggca ttagtttgac cgccgtataa atccctaagg 1080
acgcagatgg ttgttctagc tctatgtggg catcatacgg gccgctcgac tcaaagcttc 1140
ttcatgcaca atggaatata tgttgctcta agccgcaaat ggtctacagc gcttagaagt 1200
gccatacatt cttctctagt ttacgaagat ttcttcctgt catgggattc aggaagagtg 1260
accatatgga ttgagaacaa gaactcacag ttggtagacc gaggccacga cgggaatgct 1320
gaagccaaat aacaagaaag aggtcaactt gaggccaaac gcggtcttct tgttgcccgg 1380
ccaggcgaag gggagatgct aatgtgccgc ctcagcgcgc gccgatatga cgaaaagcta 1440
acagaacgta catggtaatc atggccagca gagcggacgg gcgcggtggt gtgaattgat 1500
ctgacgcctg cggcagcggc gcggcgagct acgactgaaa ggaccatttt tctggaatgc 1560
ctggacaaga cgagatttgg ttctggatgt tgagtgaaag acgaggctcc gttgagtaac 1620
ttcagttgcg actttggccg aggggtcatg ggaatgtttt cccacgaaag cttcccacgg 1680
accatctggt gaacttaagt agaagtccga ggtccacgga tgtccttcaa atattgtcat 1740
atccgcagac atggctagca gcgactaccg tggctctcgg aaaatttacc gcaatttcga 1800
cttttcaagg ccttgggcaa aaatcctcaa ttgggcgcaa accaggtggt acttagtcgg 1860
accctgaatc tagtcgtgtg tagtagccga gctgccgatg cccttcaaaa tgcgagcgcc 1920
gcgactccga gttctacagt tggggaagtt gacggcacgg gtccaatcag ctcccacaca 1980
tcatcagctc ctctctatca gactcttatc tacgagcacg 2020
<210> 2
<211> 3016
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atggcgcaga gcacagtggt gaagatcccg ttgtcgggca aggagatcac ggtcccgaca 60
ggcctcttca tcaacaacga atttgtgcct tcagtcgatt caaatgaatt catcaagtga 120
gttaatgtcg ggatctgtga tctcggtgct aaacgcaata tttgataaga ccagtcaatc 180
ctgctacgga agaagctatt tgctcggtcg ttgcaggtgc acgtcgagtc ccagtcacaa 240
cccacggcga gagctaatac catctggcag gctccgtcaa ggatattgat gtggcggtag 300
ctgctgctcg cgaagcgttc aggacaacct ggggaaagaa tgtgacaggc tttgagcgct 360
cgagactgat caacaagctg gctgatttga tcgagagaga tgcacaagaa ctagccgagc 420
ttgaaacact caataatggc aaacctgtca aaattgccag gtaaaatgtt ggtatcacac 480
cgtagagctt tcgttgatgg attcattata agggactttg acattggcga cactatccag 540
tgccttcgct attatgctgg atgggctgat aaaatagttg gtcaggtcag tccagttctg 600
aatgacaatc catagcttcg cctatgcgtc tagtccttca tccgtctaag tatcttatta 660
tcattctcac tgcttacctt ttatatgtag acgatcgagg tcgataacaa gacaaaaatt 720
gcgttcactc gacacgagcc tattggagtt tgtgggcaaa tgtatttctt aagtcttgtc 780
ggtggcaatc cttgtttgag atatttaaat ttctctagca ttccgtggaa ttatccgatc 840
aacatgtggt atgttgtcgg tatcattctc gcccacgcat cataatgaat aatgatctag 900
gtcatggaaa gttgcacccg cccttgcctg tggttgtaca atagtaatga agccgtcaga 960
ggtgacaccg ctgactgccc tggttcgtcg cccccttcct gttaccacct gtatttggtt 1020
ttgctcagcc accggtttta tcaaaaatag aaactttgtg aacttgtgaa ggaagcaggg 1080
taagcaacat taccctctcc gtgctgcttt ctcgcctcag ttgataatag ctttcctccg 1140
ggagtcgtca acaccgttcc ctctctcggg tccatcggcg gtgctgccct cgccgcgcat 1200
cccgacgtcg ataaagtggc cttcacaggt tccacggtca ctggtaggaa aataatggaa 1260
gcggctaaag gcaacatcaa gaaggtaatt tatgcgcgac tttgttccca attgagacag 1320
cggcaacagg gttgatgttg ttatacatac ttttttgact gcaccctcct tctcgagagt 1380
gggttggttg tttaattctt actcaccgct gttgtcctcg gcttcgcgct caatctagcg 1440
cttgcatacg cttccccttt gattcaaccc cattggcaat gcggttatta attcatcgtc 1500
tccgcaggtc tctctggaac tcggcggaaa atcacctcat attattttcg aatcggcgga 1560
tttggaccaa ggtgcgtgtt atcaattgaa aatccccatc actactccac catctatcgg 1620
taccttttct tgttcgctct tatacggcgc ctccgcactg gtactatact ggatccagca 1680
cacacatgtg ttacccgctt tatccatgca aggattttgc cgagagcgtt gtccaccgtt 1740
gcttctctgt cccaagcggg gaatgacagg gaatgacgtc ctcgatgcgg tccctgaaga 1800
gaatagacta atgcctcgtg gcaagcacat gccttctcgt gtccgagggt gctaatctca 1860
cctactactt cgctgcttcc gcatcgttag ggcgcggctg aattctgatg aatcatctac 1920
agctgcaaac tgggtggcgt tgggcattgg ttataacacc ggtcaagatt gcactgcggg 1980
atctcggctt tatgtccaag aaactatcta tgacaagttt gtcgcgttgc tggttgggaa 2040
gatgaaggaa ctggtagttg gaaacgggtt cgacgacgca agtggcgccg gtcccgtggt 2100
aggcccattt cgctcaacta tgctacgagg tcagcaaccc gcctaaaccc cgcgcctagg 2160
tttcaaagac ccaatacgat cgcgtttgga gttacattga agctgggaaa caagctgggg 2220
cgaaggttgc cgttgggggt gagaagcggc agggaaaagg atacttcgtt gatcccacaa 2280
gtgagttaat tggcctactc ggattttttt ccatgtctga cctagcttcc gtttccagtc 2340
ttcaccgata tcacctccga catgaaaatt gtgaggctct gagaggcaat gccttagaat 2400
tgatattgat aattattttc taggtacaag aggaggtaat taccgttcac cttcagaaca 2460
tgcgtcgttc acccttgatg ccgatcttcc acatgttttg cgtcgtggtg atgttcggga 2520
ctgacaaact atttagatat ttggtcccgt acttacggtt ggtcgattca agacagaaga 2580
agaagcaatc tctctcgcca atgacacaac atatggcttg ggtgcagggc tccactccag 2640
tgtgtatttc cattatttct catagcacaa agctcatcat ttcgtccaga tgatgcgagt 2700
cagtgcatca gggtgtcgtc cgcgctcgag gctggaacgg tgagctattg gtcttttggt 2760
ttccgtgcca atgcagtgtt gatgattaca attatattta tatttaaggt ctggatcaac 2820
caatataata ttctcaataa caacgttccc tttggaggaa agaaacaatc cggaattggt 2880
aatatttccc tcgtagggat tagcctgtac tgaccttctc ctaggtcggg agctggggag 2940
ttatgcattg gaggaatata cgtcggtaaa ggcgatccac tggaatttcg gtgagaagct 3000
ggcgtggcct ttgtga 3016
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gctctagaac acatatcaat tcatggc 27
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tcccccgggc gtgctcgtag ataagag 27
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
tcccccggga tggcgcagag cacagtg 27
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
aactgcagtc acaaaggcca cgcca 25
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
ctcccatggc cgacgctctt g 21
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
ccactacgct cggccctctc ataa 24
<210> 9
<211> 1512
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
atggcgcaga gcacagtggt gaagatcccg ttgtcgggca aggagatcac ggtcccgaca 60
ggcctcttca tcaacaacga atttgtgcct tcagtcgatt caaatgaatt catcaaacca 120
gtcaatcctg ctacggaaga agctatttgc tcggtcgttg caggctccgt caaggatatt 180
gatgtggcgg tagctgctgc tcgcgaagcg ttcaggacaa cctggggaaa gaatgtgaca 240
ggctttgagc gctcgagact gatcaacaag ctggctgatt tgatcgagag agatgcacaa 300
gaactagccg agcttgaaac actcaataat ggcaaacctg tcaaaattgc cagggacttt 360
gacattggcg acactatcca gtgccttcgc tattatgctg gatgggctga taaaatagtt 420
ggtcagacga tcgaggtcga taacaagaca aaaattgcgt tcactcgaca cgagcctatt 480
ggagtttgtg ggcaaatcat tccgtggaat tatccgatca acatgtggtc atggaaagtt 540
gcacccgccc ttgcctgtgg ttgtacaata gtaatgaagc cgtcagaggt gacaccgctg 600
actgccctga aactttgtga acttgtgaag gaagcaggct ttcctccggg agtcgtcaac 660
accgttccct ctctcgggtc catcggcggt gctgccctcg ccgcgcatcc cgacgtcgat 720
aaagtggcct tcacaggttc cacggtcact ggtaggaaaa taatggaagc ggctaaaggc 780
aacatcaaga aggtctctct ggaactcggc ggaaaatcac ctcatattat tttcgaatcg 840
gcggatttgg accaagctgc aaactgggtg gcgttgggca ttggttataa caccggtcaa 900
gattgcactg cgggatctcg gctttatgtc caagaaacta tctatgacaa gtttgtcgcg 960
ttgctggttg ggaagatgaa ggaactggta gttggaaacg ggttcgacga cgcaagtggc 1020
gccggtcccg tggtttcaaa gacccaatac gatcgcgttt ggagttacat tgaagctggg 1080
aaacaagctg gggcgaaggt tgccgttggg ggtgagaagc ggcagggaaa aggatacttc 1140
gttgatccca caatcttcac cgatatcacc tccgacatga aaattgtaca agaggagata 1200
tttggtcccg tacttacggt tggtcgattc aagacagaag aagaagcaat ctctctcgcc 1260
aatgacacaa catatggctt gggtgcaggg ctccactcca atgatgcgag tcagtgcatc 1320
agggtgtcgt ccgcgctcga ggctggaacg gtctggatca accaatataa tattctcaat 1380
aacaacgttc cctttggagg aaagaaacaa tccggaattg gtcgggagct ggggagttat 1440
gcattggagg aatatacgtc ggtaaaggcg atccactgga atttcggtga gaagctggcg 1500
tggcctttgt ga 1512
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gctattatgc tggatgggct 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
ttcacaaagt ttcagggcag t 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
ccgtccccat ctatgaaggt 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
ggtatcctcg ctccatcaaa t 21

Claims (1)

1.IAA-PO1基因在诱导平菇原基形成和平菇生长发育抗逆中的应用，其特征在于，所述IAA-PO1基因序列如SEQ ID NO.2所示；所述抗逆的逆境为温度胁迫、氧化性胁迫、酸碱胁迫。
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