CN108004262A

CN108004262A - 一种根癌农杆菌介导的平菇菌丝遗传转化方法

Info

Publication number: CN108004262A
Application number: CN201810036306.0A
Authority: CN
Inventors: 蔡永萍; 焦小雨; 李国庆; 王燕; 金青; 聂凡; 林毅
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2018-01-15
Filing date: 2018-01-15
Publication date: 2018-05-08

Abstract

本发明提供了一种利用根癌农杆菌介导的平菇菌丝遗传转化方法，属于基因的遗传转化技术领域，包括以下步骤：1)质粒载体改造；2)改造后的质粒载体转化农杆菌，获得阳性菌；3)阳性菌侵染平菇菌丝，共培养得新长出的菌丝；4)将所述新长出的菌丝接种到含有潮霉素和头孢霉素的PDA培养基上选择培养5～7d，分离得到有抗生素抗性的平菇转化菌株；5)对所述平菇转化菌株进行转基因鉴定。本发明方法适用于平菇基因功能的验证及遗传改良育种等研究，具有操作简单、稳定性强、转化率高、成本低廉等优点。

Description

一种根癌农杆菌介导的平菇菌丝遗传转化方法

技术领域

本发明属于基因的遗传转化技术领域，具体涉及一种根癌农杆菌介导的平菇遗传转化方法。

背景技术

平菇(Pleurotus ostreatus)又名糙皮侧耳，隶属于真菌门、担子菌纲、伞菌目、白菇科、侧耳属，是白腐菌最为常见的一种。平菇其味道鲜美，营养丰富，而且还有较高的医疗保健价值，因而是当前我国广泛栽培的食用菌之一。

食用菌的遗传转化技术是运用分子生物学和基因工程等方法将外源基因片段插入到受体食用菌基因组，通过复制、转录、翻译以达到定向改变受体菌株生理生化。目前，较为常用的食用菌遗传转化方法有：聚乙二醇(PEG) 介导转化法、农杆菌介导转化法(ATMT)、电激转化法及基因枪转化法等。相较于PEG法和电激转化法的转化率底，重复性差；基因枪法的昂贵，农杆菌介导转化法(ATMT)法具有重复性高、方便操作，转化效率高，费用少等特点。同时，农杆菌介导法可以以菌丝体作为受体材料，避免了以原生质体为受体材料存在的制备及再生困难等缺点，在实践应用方面具简化操作的作用。

1998年De Groot等首次用农杆菌转化法成功转化多种丝状真菌。但是不同的真菌转化工艺存在差异，这就易造成转化复杂，结果不稳定性、重复性差等问题。目前并没有一种平菇的高效转化方法的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种根癌农杆菌介导的平菇菌丝遗传转化方法，建立简化、稳定性强、成本低、高效的根癌农杆菌介导的平菇遗传转化技术，为平菇基因功能的验证及遗传改良育提供技术支撑。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种根癌农杆菌介导的平菇菌丝遗传转化方法，包括以下步骤：

1)将转染用质粒载体的启动子改造为平菇同源启动子，获得改造后的质粒载体；所述转染用质粒载体为含有两个CaMV35S启动子的质粒载体；

2)将步骤1)得到的所述改造后的质粒载体转化入根癌农杆菌感受态中，培养1～3d，获得阳性菌；

3)将步骤2)得到的所述阳性菌侵染平菇菌丝，共培养2～4d，得新长出的菌丝；

4)将步骤3)得到的所述新长出的菌丝接种到含有潮霉素和头孢霉素的 PDA培养基上选择培养5～7d，分离得到有抗生素抗性的平菇转化菌株。

优选的，步骤1)所述改造为将质粒载体的两个CaMV35S启动子改造为平菇同源sdi和gpd启动子。

优选的，步骤1)所述改造的步骤包括：

a.质粒载体双酶切切除第一CaMV35启动子区，设计带有酶切位点的引物；

b.利用步骤a所述引物克隆扩增平菇sdi的启动子基因片段；

c.连接步骤a双酶切后的质粒载体与步骤b得到的sdi启动子基因片段，构建质粒载体-SDI质粒；

d.将步骤c构建成功的质粒载体-SDI质粒双酶切，切除第二CaMV35启动子区，根据切除第二CaMV35启动子区后的质粒载体-SDI质粒设计引物；

e.利用步骤d所述引物克隆扩增平菇gpd的启动子基因片段，

f.连接步骤d所述双酶切后的质粒载体-SDI载体与步骤e得到的所述gpd 启动子基因片段，得到改造后的质粒载体。

优选的，步骤2)所述培养为暗培养。

优选的，步骤3)所述平菇菌丝为菌丝球。

优选的，所述菌丝球的制备方法包括：将平菇菌丝体的菌块置于PDA液体培养基中接种培养3～4d。

优选的，所述接种培养的条件包括恒温摇床，160～200r/min，22～28℃下避光培养。

优选的，步骤3)所述共培养用培养基为含有终浓度为200μmol/L的乙酰丁香酮的PDA培养基，所述共培养的条件包括在PDA培养基上，22～28℃下避光培养。

优选的，步骤4)所述选择培养的条件包括：22～28℃下暗培养。

优选的，步骤4)得到所述平菇转化菌株后还包括转基因鉴定。

本发明提供了一种根癌农杆菌介导的平菇菌丝遗传转化方法，本发明构建含平菇同源启动子的表达质粒载体，使得检测时可通过GUS染色、切片、显微镜观察鉴定转化子，结果稳定，重复性强；侵染更容易获得的平菇菌丝，且平菇菌丝在共培养时再生能力更强，利用本发明的方法，从菌丝到获得平菇转化菌株，其转化周期在18天左右，操作简化；简化程序，降低成本转化率高。试验结果表明，转到筛选培养基中的40个转化子中有27个在潮霉素筛选培养基上生长比野生型快，转化率为67.5％。

附图说明

图1为质粒pCambia 1304-SDI-GPD的构建图谱；

图2为部分农杆菌浸染后菌丝球共培养3天后的菌落形态；

图3为部分平菇转化子在潮霉素筛选培养基上的筛选；

图4为平菇野生型菌株及随机挑选的转化子GUS染色肉眼和显微观察，其中，左图为肉眼观察；右图为显微观察，右上图为转化菌株；右下图为野生菌株；

图5为平菇转化菌株进行PCR分子验证结果，其中M为2000bp的Mark， 1～7为随机挑选的平菇转化菌株。

具体实施方式

在本发明中，所述改造将质粒载体的两个CaMV35S启动子替换为平菇同源sdi和gpd启动子。所述质粒载体为pCambia 1304，改造后质粒的结构如图1所示。在本发明中，所述改造的步骤包括：

b.利用步骤a所述引物克隆扩增平菇sdi的启动子基因片段；

d.将步骤c构建成功的质粒载体-SDI质粒双酶切，切除第二CaMV35启动子区，根据切除第二CaMV35启动子区后的质粒载体-SDI质粒和gpd启动子区基因序列设计引物；

e.利用步骤d所述引物克隆扩增平菇gpd的启动子基因片段，

本发明质粒载体双酶切切除第一CaMV35启动子区，设计带有酶切位点的引物。在本发明中，所述双酶切优选的选择HindIII与NocI酶切位点，所述双酶切的体系为质粒定量3μg，根据质粒浓度计算需加入的相应质粒体积，两个酶HindIII和NocI分别2μl，10*Kbuffer 5μl，BSA 5μl，ddH₂O补足到 50μl，所述双酶切的过程为37℃酶切3h，跑凝胶电泳，收集需要的条带，得到切除第一CaMV35启动区的pCambia 1304质粒；根据切除第一CaMV35启动区的pCambia 1304质粒和sdi启动子区基因序列设计带有HindIII，NcoI 酶切位点的引物，所述sdi启动子区基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述引物均是用Primer Premier5.0软件设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，所述引物序列如SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3所示：

SEQ ID NO.2：5’-CCCAAGCTTCTGCCAACGACTACGCTTATGCGTA T-3’，其中加粗部分为HindIII的酶切位点；

SEQ ID NO.3：5’-CATGCCATGGGGTTCAATGATTTGTGTGTTCCCG G-3’，其中加粗部分为NcoI的酶切位点。

得到带有酶切位点的引物后，本发明中利用上述引物克隆扩增平菇sdi的启动子基因片段。所述扩增优选的为利用PCR进行扩增，所述PCR的体系为：

所述PCR的程序优选的为：

PCR扩增后，本发明中连接上述双酶切后的质粒载体与上述得到的sdi 启动子基因片段，构建质粒载体-SDI质粒。本发明中，所述连接优选的为用连接酶进行连接；所述连接酶优选为T4连接酶，连接后即构建完成pCambia 1304-SDI质粒。在本发明中，对所述T4连接酶的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的T4连接酶的常规市售产品即可。

构建得到pCambia 1304-SDI质粒后，本发明中将所述pCambia 1304-SDI 质粒进行双酶切，所述双酶切切除第二CaMV35启动子区，根据切除第二 CaMV35启动子区的pCambia 1304-SDI质粒和gpd启动子区基因序列设计引物。在本发明中，所述gpd启动子区基因序列如SEQ ID NO.4所示；所述双酶切优选的选择XbaI和XhoI酶切位点，所述双酶切的体系为：粒定量3μg，根据质粒浓度计算需加入的相应质粒体积，两个酶XbaI和XhoI分别2μl， 10*M buffer 5μl，ddH2O补足到50μl；所述双酶切的过程为37℃酶切3h，跑凝胶电泳，收集需要的条带，得到切除第二CaMV35启动子区的质粒载体；

本发明中，所述引物优选的携带有XbaI和XhoI酶切位点，所述引物的序列如SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示：

SEQ ID NO.5：5’-GCTCTAGATCGAGGCTACCTCGCTACTG-3’，其中加粗部分为XbaI的酶切位点；

SEQ ID NO.6：5’-CCGCTCGAGTTCAAGGCCGTTGTATTAGT-3’，其中加粗部分为XhoI的酶切位点。

所述引物均是用Primer Premier 5.0软件设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，切除CaMV35启动子区后，本发明中，利用上述引物克隆扩增平菇gpd的启动子基因片段。所述扩增优选的为利用PCR进行扩增，扩增体系为：

所述PCR的程序优选的为：

平菇gpd的启动子基因片段扩增完成后，本发明中连接上述双酶切后的 pCambia1304-SDI载体与上述gpd启动子基因片段构建改造后的载体。本发明中，所述连接优选的为用连接酶进行连接；所述连接酶优选为T4连接酶，连接后即构建完成pCambia 1304-SDI-GPD质粒。

构建得到pCambia 1304-SDI-GPD质粒后，本发明优选的在pCambia 1304-SDI-GPD质粒上连接潮霉素抗性基因，所述潮霉素的基因序列如SEQ ID NO.7所示；所述潮霉素基因优选的通过特异性引物扩增获得，所述特异性引物优选的带同源臂和XhoI酶切位点，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.8 和SEQ ID NO.9所示：

SEQ ID NO.8：5’-ACAACGGCCTTGAACTCGAGATGAAAAAGCCTG AACTCACCGC-3’，其中加粗部分为XhoI的酶切位点，画底线部分为同源臂；

SEQ ID NO.9：5’-TTATTATGGAGAAACTCGAGCTATTTCTTTGCCCT CGGA-3’，其中加粗部分为XhoI的酶切位点，画底线部分为同源臂；

所述引物均是用Primer Premier 5.0软件设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成将所述特异性引物扩增后获得潮霉素抗性基因片段，扩增体

所述扩增的程序为：

本发明将所述特异性扩增产物与pCambia 1304-SDI-GPD质粒利用重组酶进行连接，所述重组酶优选的为在南京诺唯赞生物科技有限公司购买的 II重组克隆试剂盒，所述连接的体系为：

在本发明中，由于原pCambia 1304载体上有两个XhoI位点，用XbaI和 XhoI双酶切有极大的可能会将潮霉素抗性基因也切除，所以构建好的 pCambia 1304-SDI-GPD载体如切除了潮霉素抗性基因要重新连接潮霉素抗性基因。在本发明中，鉴定潮霉素抗性基因是否被切除的方法优选的包括菌液 PCR验证和酶切验证，所述菌液PCR验证的方法设计的引物序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示：

SEQ ID NO.10：CCGCTCGAGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGC；

SEQ ID NO.11：CCGCTCGAGCTATTTCTTTGCCCTCGGA；

所述菌液PCR的程序为：

所述酶切验证优选的为利用XhoI进行酶切验证，所述验证的体系为：质粒定量1.5μg,根据质粒浓度计算需加入的相应质粒体积，酶XhoI 2μl，10* H buffer 2.5μl，ddH₂O补足到25μl。加好样后，37℃酶切3h，跑凝胶电泳，观察除载体条带外，是否有大约1000bp的条带。若菌液PCR和酶切都有带说明潮霉素抗性基因没有被切除，反之则说明被切除。本发明对切除潮霉素抗性基因的质粒载体进行连接，所述连接优选的包括设计带同源臂和XhoI酶切位点的特异性引物扩增获得潮霉素抗性基因片段，利用重组酶进行连接，保证连接方向的正确性，最终获得改造后的pCambia 1304-SDI-GPD载体。

得到pCambia 1304-SDI-GPD载体后，本发明将上述得到的改造后的质粒载体转化入根癌农杆菌感受态中，培养1～3d，获得阳性菌。在本发明中，所述转化优选的为电转化方法；所述电转化的步骤优选的包括：改造后的质粒 1μl+69μl ddH₂O+30μl农杆菌感受态轻轻混合，转入电击杯，使混合物均匀进入点击杯底部，设定电击参数电压为2400V，电容为25μF，电阻为200Ω。所述根癌农杆菌优选的为EHA105；本发明对农杆菌感受态的来源没有任何限定。

在本发明中，所述培养的时间优选为2天，所述培养优选的为暗培养。

在本发明中，所述暗培养结束后优选挑取根癌农杆菌单菌落于LB培养液中，于28℃、200r/min的摇床上培养12～20h，得到阳性菌；在本发明中，所述LB培养基中优选的包含有抗生素，更优选的包含有卡那霉素和/或利福平，最优选的为包含有卡那霉素和利福平，所述卡那霉素和利福平优选的浓度相同，优选的为50μg/ml；将摇匀的菌液做菌液PCR，引物同sdi启动子引物， PCR有条带的为阳性菌。

得到阳性菌后，本发明将上述得到的阳性菌侵染平菇菌丝，共培养2～4d，得新长出的菌丝。在本发明中，优选的将阳性菌经扩大培养和悬浮培养，得到根癌农杆菌转化菌液后再进行侵染，所述扩大培养优选的为将所述阳性菌接种到LB液体培养基上进行培养，所述LB培养基含有抗生素，所述抗生素为卡那霉素和利福平，所述卡那霉素和利福平的浓度优选的为50μg/ml。在本发明中，所述阳性菌的用量优选为25～50μl每25ml LB培养基；所述扩大培养优选的在28℃、200r/min的摇床上震荡培养，所述扩大培养的时间优选的为20～24h，此时的菌液为橘黄色；本发明将所述菌液在5000r/min离心10min，收集菌体，弃上清。

在本发明中，所述悬浮培养优选的为利用PDA培养基将所述扩大培养得到的菌体进行悬浮，所述PDA培养基中优选的包含有乙酰丁香酮，所述乙酰丁香酮的浓度优选的为200μmol/L，利用所述PDA培养基调节菌液浓度，所述调节后菌液的浓度优选的为OD₆₀₀＝0.4～0.5，此时在28℃、200r/min震荡培养，所述震荡培养的时间优选的为3～8h，更优选的为6h，得到根癌农杆菌转化菌液。

在本发明中，所述平菇菌丝优选的为平菇菌丝球，所述平菇菌丝球的制备方法优选的包括：将平菇菌丝体的菌块置于PDA液体培养基中接种培养 3～4d。所述菌块优选的利用打孔器打取；所述接种培养的条件包括恒温摇床， 160～200r/min，22～28℃下避光培养，避光培养3～4天后，在培养基内出现大量菌丝球则可停止摇菌，用无菌水冲洗并收集平菇菌丝球，用于遗传转化。在本发明中，所述PDA液体培养基的制备方法优选为：马铃薯(去皮)200g，400ml水煮沸20～30min，纱布过滤留马铃薯液，加蔗糖20g，溶解后蒸馏水定容到1000ml，121℃，24min高温灭菌。

在本发明中，所述侵染优选的为将菌丝球浸入上述根癌农杆菌转化菌液中，所述浸入的时间优选的为20～30min，然后吸除菌丝球表面多余菌液，将菌丝球接种到PDA共培养培养基上。所述吸除优选的为用滤纸吸除，所述滤纸优选的为灭菌滤纸，所述PDA共培养培养基优选的含有终浓度为200μmol/L 的乙酰丁香酮。

在本发明中，所述共培养的温度优选的为25℃，所述共培养的方式优选的为暗培养，所述共培养的时间优选的为2～4d，更优选的为3d；共培养3d 后，随机挑选新长出的菌丝。

得到新长出的菌丝后，本发明将上述新长出的菌丝接种到含有潮霉素和头孢霉素的PDA培养基上选择培养5～7d，分离得到有抗生素抗性的平菇转化菌株。在本发明中，所述新长出的菌丝在接种前优选进行清洗，所述清洗优选的为用ddH₂O清洗；更优选的清洗时，首先将新长出的菌丝浸入到含头孢霉素的ddH₂O中清洗，在后再用ddH₂O冲洗菌丝3～5次。在本发明中，所述头孢霉素的浓度优选的为500μg/ml；所述含头孢霉素的ddH₂O中清洗优选的为在25℃下180r/min震荡清洗，所述震荡清洗的时间优选为30min。清洗完成后，本发明用无菌滤纸吸干多余水分，得到洗净的菌丝；

在本发明中将所述洗净的菌丝接种到含有潮霉素和头孢霉素的PDA培养基上选择培养5～7d，进行筛选。所述潮霉素的终浓度优选的为50μg/ml，所述头孢霉素的终浓度优选的为400μg/ml。在本发明中，所述培养优选的为在 25℃下培养，更优选的为暗培养，观察菌丝生长情况，若菌丝与野生型相比生长更快，则进一步挑取菌丝到新的含有50μg/ml潮霉素的PDA固体培养基再做筛选，经过3轮筛选后在潮霉素筛选培养基生长速度仍比野生型更快的为抗性转化子，分离得到有抗生素抗性的平菇转化菌株。

得到有抗生素抗性的平菇转化菌株后，本发明对上述得到的平菇转化菌株进行转基因鉴定。在本发明中，所述基因鉴定优选的包括GUS组织染色鉴定和菌液PCR验证；所述GUS组织染色鉴定的方法优选的包括：取少量第一轮选择培养基(含有潮霉素和头孢霉素的PDA固体培养基)上新长出的菌丝转移至无菌的2.0ml小离心管中，每管加入新鲜配制的GUS染色液浸没菌丝， 37℃保温过夜染色12h；用清水清洗数次，再将其浸没入含有75％无水乙醇的 FAA固定液中保存，观察组织染色情况，菌丝有染成蓝色的为GUS检测呈阳性的为拟转基因菌株，反之为阴性菌株。所述菌液PCR验证前优选的对平菇转化菌株进行裂解，裂解后，做PCR分子验证，本发明中所述裂解优选的用购自Takara公司菌体裂解液(Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR)裂解，所述裂解的方法包括①取50μl Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR于灭菌的PCR管中；②用灭菌牙签或枪头挑取单菌落，置于PCR中搅动几下后取出(注：牙签置于PCR管中的时间不要过长，否则会影响裂解液的体积，并会影响PCR扩增效果)；③80℃热变性15分钟后，低速离心，取 1～5μl裂解后的上清液作为PCR反应的模板；在本发明中，所述PCR分子验证，优选的通过对载体上的gus基因设计引物，引物序列如SEQ ID NO.12 和SEQ ID NO.13所示：

SEQ ID NO.12：GTCCTGTAGAAACCCCAACCCGTGA

SEQ ID NO.13：TTTGCCTCCCTGCTGCGGTTTTTCA；

所述PCR的反应体系优选的为为：

所述PCR反应程序为：

下面结合实施例对本发明提供的根癌农杆菌介导的平菇菌丝遗传转化方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、实验材料

平菇苏平1号；

根癌农杆菌EHA105；

利用HindIII，NcoI双酶切pCambia 1304后，CaMV35启动子区被切除，克隆平菇sdi基因的启动子，通过粘性末端连接构建pCambia 1304-SDI质粒，之后将构建成功的pCambia 1304-SDI质粒用XbaI和XhoI双酶切，切除 CaMV35启动子区或CaMV35启动子和潮霉素基因，设计带有XbaI，XhoI 酶切位点的引物克隆扩增平菇gpd的启动子基因片段，通过T4连接酶构建成带有平菇gpd启动子基因片段的质粒载体。通过验证，针对不含潮霉素抗性基因的pCambia 1304-SDI-GPD载体设计带同源臂和XhoI酶切位点的特异性引物扩增获得潮霉素抗性基因片段，利用重组酶进行连接，保证连接方向的正确性，最终获得改造后的带有潮霉素抗性基因的pCambia 1304-SDI-GPD载体。

2、平菇菌丝球的制备

用打孔器打取直径相同的糙皮侧耳菌丝体菌块，接种于PDA液体培养基中，放入恒温摇床180r/min 25℃避光培养3～5天，在培养基内出现大量菌丝球则可停止摇菌。

3、根癌农杆菌的转化和培养

采用电转化法将pCambia 1304-SDI-GPD质粒(图1)转化根癌农杆菌。

根癌农杆菌感受态制备：将保存的根癌农杆菌EHA105(具有利福平抗性) 在LB固体培养基上划线活化培养2d，挑单菌落接种到LB液体培养基；

将改造好的pCambia 1304-SDI-GPD质粒通过电击转化到根癌农杆菌 EHA105感受态细胞中。电击后转入1ml无抗LB液体培养基，28℃，200r/min 震荡培养6h，5000r/min离心10min，弃700μl上清，保留300μl，在含有50 mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB平板上划线培养2～3d后挑取阳性克隆置于含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的1ml LB液体培养基中过夜培养。

然后将菌液PCR鉴定成功的菌液按1％的接种量加入25ml双抗培养基 (50μg/mlKan+，50μg/ml Rif+)进行扩大培养，28℃200r/min震荡培养20～24 h至培养液变成橘黄色，5000r/min离心10min，收集菌体；弃上清，用PDA 液体培养基(含200μmol/L的乙酰丁香酮)重新悬浮，并用PDA液体培养基 (含200μmol/L的乙酰丁香酮)调节菌体浓度至OD600＝0.4～0.5，28℃200 r/min震荡诱导培养6h。

4、根癌农杆菌浸染菌丝球及共培养

将制备好的平菇菌丝球浸入根癌农杆菌EHA105(携带pCambia 1304-SDI-GPD质粒)浸染菌液，浸染30min。镊子夹出菌丝球在无菌滤纸上吸尽多余浸染液，然后转接到PDA共培养(含200μmol/L的乙酰丁香酮)培养基上，25℃避光培养3d，菌丝球的菌落形态如图2所示。

5、转化子筛选培养

共培养3d后，挑取新长出的菌丝浸入到含有500μg/ml的头孢霉素的 ddH₂0中25℃180r/min震荡清洗30min；之后用ddH₂0冲洗菌丝3～5次，多余的蒸馏水用无菌滤纸吸干，将洗净后的菌丝转移到含有50μg/ml潮霉素和 400μg/ml头孢霉素的PDA固体培养基上做筛选，野生型做对照，25℃培养 5～7d，观察菌丝生长情况；若菌丝生长比野生型对照快，则进一步挑取相应菌丝到新的含有50μg/ml潮霉素的PDA固体培养基再做筛选，野生型做对照，进行3轮筛选至稳定生长，平菇转化子在潮霉素筛选培养基上的形态如图3 所示。

6、平菇转化子的鉴定

取第一轮筛选培养基(含有潮霉素和头孢霉素的PDA固体培养基)上新长出的菌丝对其进行GUS组织染色鉴定，染色结果如图4所示。

随机取拟平菇转化菌株在裂解液中进行裂解，裂解后的上清液做gus基因的PCR分子验证，所述PCR验证的结果如图5所示。

由以上实施例可知，本发明以更容易获得的平菇菌丝球为受体，且菌丝球在共培养基上的再生能力更强，从菌丝球制备到获得拟转化子，其转化周期在18天左右，操作简化；构建含平菇同源sdi和gpd启动子的表达质粒载体，使得可用GUS染色、切片与显微观察鉴定转化子，使得本方法结果稳定、重复性强；配制含有终浓度为200μmol/LAS的PDA培养基进行共培养，简化程序，降低成本；转到潮霉素筛选培养基中的40个转化子中有27个生长比野生型快，转化率为67.5％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 一种根癌农杆菌介导的平菇菌丝遗传转化方法

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1287

<212> DNA

<213> Pleurotus ostreatus

<400> 1

ctgccaacga ctacgcttat gcgtattggc gggacaaagt ccggcagcgg attcacaagg 60

tcgagctcgt agagaaactt gcccctacca tcaagatgca tccctttggg acgaagcgtc 120

cagctttgga gcaggtgagt ggcccgaatg gcttctatta tctttgcaat ctgacaccaa 180

gcgccgttag cacctttacg aagcctttaa ccaagataat gtcaccttgg ttgacctcaa 240

cgaaagcccc attgatgaga ttacatctac tggggttcgt accaaggatg ggacagaata 300

tgctctcgac ctgttggtca tggccacggg gttcgatatg ggaactggtg gctataagga 360

catcgaaatc gtagggacaa acggggccgt ctttcgcgat aaatgggcca atggggtaaa 420

atcatatctg ggcatgttgg cgtctgggtt tccaaacatg tttatggtat acggccctca 480

tgcacccagc ggctttacca atgcacctac atgcgctgtg agtagctctt cattgacttt 540

acggtgggca tcggtaattc tgacgaaacg gttaggaatt gcaagttgat tggataacca 600

actgcattga atatatgatg aagaattcgc tcgctcgcat cgaagcaagt aacaaagcgg 660

aactggattg gactcaacga atagatgaaa tcggtgccag ggggctttgg aatcgggcaa 720

actcgtggta cagaggtgcg aacgtcccag gcaaggttat ggagcatatg ttttgggctg 780

gaggatgtcc gtcgtatcaa aagatttgcg aagaagtcgt cgaaagtgga tacgatggaa 840

tcatgttcat aaagacgccc tgactaccct ctcagggtaa caacaatatg tatcgtctgc 900

tcacgtacct tgagacttcc taggtgctcc tacatgtacg cctcactatt gaagggagta 960

cgattgacgc aaagattatc gattgtctcg tatcgttatt cttctgtctt actttattgt 1020

ccatcaaagt aacgctggat gtgtatcatc tactactcaa taccccaatt ctacatgtac 1080

ttctcctggc ctggaaccaa atacgaagcc tatgaacttc ccttaagtcc accggcattt 1140

tccgaagagt aacacacccc ttctgattgg tccgggccac gagccttccc gctccgctcc 1200

cgaattcacg cgatcccgcc gcagaattga catttctcct cttcaccatc gtcgacgacg 1260

tcccgggaac acacaaatca ttgaacc 1287

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> Pleurotus ostreatus

<400> 2

cccaagcttc tgccaacgac tacgcttatg cgtat 35

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> Pleurotus ostreatus

<400> 3

catgccatgg ggttcaatga tttgtgtgtt cccgg 35

<210> 4

<211> 1500

<212> DNA

<213> Pleurotus ostreatus

<400> 4

tcgaggctac ctcgctactg tctttgctcc attcttctcc aaaactggag gagattgaag 60

tccacggtgt ttttcaagat agcaccatag atgtctccta gttgccccag attcggcttc 120

ccaacctctc aaatatatat atcggtgcca atgccctggg agtctctgcc attctagccc 180

acatagaatg tccacttgat gcaaaggtca cgttcgaaaa tacagaccct caccacggag 240

agcctgacct ttcaggtttg gtcacaatat gtggtcgcct cgccaaaacc ggctctcccc 300

cacttgactt cgttctactc gacggctcgc ttgacggcgg attccaattg aacgttcggg 360

gtggcgacag aacatatatt ctcctcagat tacgcgtaga agaacgctat taccctatgc 420

tcggcttagc ggtgtgctca gccttgccaa tcaaacataa ctccaccttg atgatggaag 480

ggtttggaga gatgacacag acggaatggg cgaacgcgtt ccgcagctgg gaacgagtgc 540

ataccctcca tctggttgac atcaatatag gtgccctcat ggctctgatg aaaccatcat 600

ccgaggaccc cccattgtct aaactgcaca ccctttatct ctctttctgc catttgtcaa 660

gggggcgtgg tagcaacgat agatcagagt ttcacattgt caagaatctc cttgaggaac 720

gcaagcacct cggcattccg ataacgaagg tctcaatcaa agactgcacc attctcaaag 780

aagacgttga tgacctcatg gagttggcgg atattgattg ggactacgac gatggaggct 840

cgcctgagga agcgtactgg accgactcta gctttggatc agacatgtaa actgattctt 900

ccgatgaaat tattgccata cctatggtga ccataagtca cgatgttggt ctttgattgt 960

gtttaccatg gactttacag aatcaatctc aagccatgat gcatgaaagt tcgtcgaaac 1020

cctcgaaagt tgtcttgtcg tacatttcaa agtcccacac ttgtactacc ttgtgcggcc 1080

atcattgcag cgatcgtctc ttgagctcaa tctagtcgaa ggacgaacac atcacatgcg 1140

gcactgcagc ctattgaggg acggaccgca cggaccgctc agcccgagtc cctgatatcc 1200

gcactgtgaa ttcactgaaa atcaaatgtg tcttctatcg tagttgggat tgttgaattt 1260

ctcaactcga tggtccagaa taagttgtag tgtagaagag aaccatcagg gatcatgaac 1320

gtgcgcaaag gaaatatttg ggattggacg cctaatccaa tacccctatg ctcgaaagtc 1380

ccggtccgct tgattccaat tgacaccaag gttgattcaa tgcattccac agatttatcc 1440

gactcctcct ttgattacaa ccgccacctc gacggctgga actaatacaa cggccttgaa 1500

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> Pleurotus ostreatus

<400> 6

gctctagatc gaggctacct cgctactg 28

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> Pleurotus ostreatus

<400> 6

ccgctcgagt tcaaggccgt tgtattagt 29

<210> 8

<211> 1026

<212> DNA

<213> Pleurotus ostreatus

<400> 8

atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 60

agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 120

gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 180

cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 240

ggggagttta gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 300

caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctacaac cggtcgcgga ggctatggat 360

gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 420

atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 480

cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 540

ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 600

tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 660

atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct 720

tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgcca 780

cgactccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac 840

ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga 900

gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc 960

tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag 1020

aaatag 1026

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> Pleurotus ostreatus

<400> 8

acaacggcct tgaactcgag atgaaaaagc ctgaactcac cgc 43

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> Pleurotus ostreatus

<400> 9

ttattatgga gaaactcgag ctatttcttt gccctcgga 39

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> Pleurotus ostreatus

<400> 10

ccgctcgaga tgaaaaagcc tgaactcacc gc 32

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> Pleurotus ostreatus

<400> 11

ccgctcgagc tatttctttg ccctcgga 28

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> Pleurotus ostreatus

<400> 12

gtcctgtaga aaccccaacc cgtga 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> Pleurotus ostreatus

<400> 13

tttgcctccc tgctgcggtt tttca 25

Claims

1.一种根癌农杆菌介导的平菇菌丝遗传转化方法，包括以下步骤：

1)将转染用质粒载体的启动子改造为平菇同源启动子，获得改造质粒载体；所述转染用质粒载体为含有两个CaMV35S启动子的质粒载体；

2)将步骤1)得到的所述改造质粒载体转化入根癌农杆菌感受态中，培养1～3d，获得阳性菌；

4)将步骤3)得到的所述新长出的菌丝接种到含有潮霉素和头孢霉素的PDA培养基上选择培养5～7d，分离得到有抗生素抗性的平菇转化菌株。

2.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤1)所述改造为将两个CaMV35S启动子改造为平菇同源sdi和gpd启动子。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述改造的步骤包括：

b.利用步骤a所述引物克隆扩增平菇sdi的启动子基因片段；

e.利用步骤d所述引物克隆扩增平菇gpd的启动子基因片段；

f.连接步骤d所述双酶切后的质粒载体-SDI载体与步骤e得到的所述gpd启动子基因片段，得到改造后的质粒载体。

4.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤2)所述培养为暗培养。

5.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤3)所述平菇菌丝为菌丝球。

6.根据权利要求5所述的遗传转化方法，其特征在于，所述菌丝球的制备方法包括：将平菇菌丝体的菌块置于PDA液体培养基上接种培养3～4d。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述接种培养的条件包括恒温摇床，160～200r/min，22～28℃下避光培养。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述共培养用培养基为含有终浓度为200μmol/L的乙酰丁香酮的PDA培养基，所述共培养的条件包括：22～28℃下避光培养。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述选择培养的条件包括：22～28℃下暗培养。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)得到所述平菇转化菌株后还包括转基因鉴定。