CN111909953A - 用于桑黄遗传表达的重组载体及构建方法和遗传转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于桑黄遗传表达的重组载体及构建方法和遗传转化方法。载体序列如SEQ ID No:13所示。构建方法：将双元载体pCAMBIA‑1301的CaMV35S启动子替换为桑黄同源启动子,获得适用于桑黄的双元载体。遗传转化方法：利用冻融法将重组双元载体转入根癌农杆菌，获得阳性菌；利用农杆菌侵染桑黄菌丝，并在培养基上共培养，随后覆盖低熔点PDA培养基；随后将菌落转移至新的培养基，选取长势旺盛的菌落提取DNA，利用PCR技术鉴定阳性菌株。本发明具有操作简单，转化率高等优点，成功实现了桑黄的遗传转化，使得在桑黄中进行同源敲除、过表达、异源表达成为可能，解决了无法建立桑黄遗传转化体系的问题。

Description

用于桑黄遗传表达的重组载体及构建方法和遗传转化方法

技术领域

本发明属于遗传育种领域，具体涉及一种用于桑黄遗传表达的重组载体及构建方法和遗传转化方法。

背景技术

桑黄作为中国著名的传统药用真菌已经有2000多年的历史，最早见于前汉朝的《神农本草经》中的“桑耳”。《本草纲目》记载，桑黄可用于止泻、崩漏带下、脾虚泄泻，此外还能排毒、活血、利五脏。现代研究表明，桑黄具有调节免疫、抑制癌细胞增值、诱导癌细胞凋亡等作用，是目前国际公认的抗癌效果较好的药用真菌之一，其中发挥作用的有效成分主要是多糖、三萜、黄酮和酚类物质。

目前，关于桑黄药用成分的研究主要集中在分离纯化和药理活性上，但是与药用成分有关的基因功能及调控机制的研究还未见报道，其中主要的原因就是缺乏遗传转化方法，导致基因功能的研究受到阻碍，因此建立一个高效稳定的遗传转化体系是解析桑黄药用成分合成机制的关键步骤。

在遗传转化进行前需要一个适宜的载体，启动子是表达载体的重要组成部分，同源启动子可有效提高转化效率。目前桑黄缺少合适的载体，使得桑黄遗传转化很难开展。利用桑黄同源gpd启动子构建双元载体是建立桑黄遗传转化体系的首要任务。

真菌遗传转化的方法很多，如PEG法、基因枪法，农杆菌介导法等。农杆菌介导的遗传转化方法具有操作简单、转化效率较高、外源基因能稳定的整合在寄主染色体上等优点。目前，农杆菌介导的遗传转化法已经在许多真菌中成功应用，但是不同的真菌转化工艺存在差异，参照其他真菌的转化方法无法顺利进行转化。过往一直采用原生质体作为真菌的遗传转化受体，但是原生质体再生周期长，使得潮霉素失效，很难筛选到阳性转化株；并且制备原生质体步骤复杂，成本高污染率高，很难获得阳性转化株。本发明利用根癌农杆菌介导桑黄遗传转化，具有操作简单，转化率高等优点，成功实现了桑黄的遗传转化，使得在桑黄中进行同源敲除、过表达、异源表达成为可能，为利用基因工程手段对桑黄进行遗传改良，探究桑黄药用成分合成机制奠定基础。

发明内容

基于以上不足之处，本发明的目的是提供一种用于桑黄遗传表达的重组双元载体及构建方法，该载体能够在桑黄中表达，可用于研究基因功能和改造桑黄菌株，解决了无法建立桑黄遗传转化体系的问题。

本发明采用如下技术方案：一种用于桑黄遗传表达的重组双元载体1301-SH-gpd，其序列如SEQ ID No:13所示。

本发还具有如下技术特征：

如上所述的一种用于桑黄遗传表达的重组双元载体1301-SH-gpd的构建方法，步骤如下：

(a)以pCAMBIA-1301载体为模板，设计引物组：

HYG-F，其序列如SEQ ID No:1所示，

HYG-R，其序列如SEQ ID No:2所示，

进行PCR扩增，得到带有同源臂的HYG表达盒片段；

(b)将pCAMBIA-1301载体双酶切，切除左边的CaMV35S启动子区和HYG潮霉素区，得到线性化pCAMBIA-1301载体，

(c)利用无缝克隆技术，将步骤a带有同源臂的HYG表达盒片段与步骤b线性化载体连接，得到重组载体1301-HYG，

(d)以桑黄DNA为模板，设计引物组：

gpdZ-F，其序列如SEQ ID No:3所示，

gpdZ-R，其序列如SEQ ID No:4所示，

进行PCR扩增，得到带有1301-HYG载体同源臂的gpd基因启动子片段，其序列如SEQID No:11所示，

(e)将步骤c得到的1301-HYG载体单酶切，得到线性化载体，

(f)将步骤d得到的带有同源臂的gpd启动子和步骤e得到的线性化载体连接，得到重组载体1301-gpd-HYG，

(g)以桑黄DNA为模板，设计引物组：

gpdY-F，其序列如SEQ ID No:5所示，

gpdY-R，其序列如SEQ ID No:6所示，

进行PCR扩增，得到带有1301-gpd-HYG载体同源臂的gpd启动子片段，其序列如SEQID No:12所示，

(h)将步骤f得到的1301-gpd-HYG载体双酶切，切除右边的CaMV35S启动子区，得到线性化载体，

(i)将步骤g得到的带有同源臂的gpd启动子和步骤h得到的线性化载体连接，得到重组双元载体1301-SH-gpd，其序列如SEQ ID No:13所示。

本发明的另一目的在于提供一种根癌农杆菌介导的桑黄遗传转化方法，采用如上所述的一种用于桑黄遗传表达的重组双元载体1301-SH-gpd，本方法简化了操作步骤，降低了污染率，可操作性强，克服了原生质体制备过程复杂、成本高的缺点。

本发明采用如下技术方案：一种根癌农杆菌介导的桑黄遗传转化方法包括以下步骤：

(1)利用冻融法将所述的重组双元载体1301-SH-gpd转入根癌农杆菌AGL-1感受态，培养获得阳性菌，

(2)将培养好的桑黄菌丝无菌条件下粉碎，随后将液体菌丝离心，弃上清，收集沉淀菌丝；

(3)在含不同浓度潮霉素：0μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL的PDA平板上接种桑黄菌丝，得到适用于桑黄遗传转化的潮霉素浓度；

(4)将含有重组双元载体1301-SH-gpd的AGL-1农杆菌菌液加入到100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中；将培养好的菌液离心，弃上清，沉淀用IM培养基重悬，得到侵染液；

(5)取步骤(4)得到的侵染液侵染步骤(2)得到的桑黄菌丝，共培养36h；

(6)在步骤(5)得到的共培养菌丝上覆盖低熔点PDA培养基培养，长出新菌落，随后将菌落转移至新的含有适用于桑黄遗传转化浓度的潮霉素的PDA培养基培养，选取长势旺盛的菌落提取DNA，利用PCR技术鉴定阳性菌株。

本发明还具有如下技术特征：

1、如上所述的适用于桑黄遗传转化的潮霉素浓度为4μg/mL。

2、如上步骤(6)利用PCR技术鉴定阳性菌株的方法如下：

设计引物：

J1-F，其序列如SEQ ID No:7所示

J1-R，其序列如SEQ ID No:8所示

和

J2-F：其序列如SEQ ID No:9所示

J2-R:其序列如SEQ ID No:10所示；

以重组双元载体1301-SH-gpd、转化子和野生型DNA为模板进行PCR扩增，结果显示，从转化子和重组双元载体1301-SH-gpd都能扩增出253bp和1013bp的预期DNA片段，但野生型中没有扩增产物，说明重组双元载体上的外源DNA片段已经整合到了桑黄转化子的基因组中。

3、如上步骤(1)中重组双元载体1301-SH-gpd转入根癌农杆菌AGL-1感受态，28℃培养1-2天。

4、如上步骤(2)菌丝匀浆20s，随后将菌丝置于离心管，5000rpm离心10min，收集沉淀菌丝。

5、如上步骤(3)将桑黄菌丝进行暗培养，培养温度为25℃。

6、如上步骤(4)培养至OD₆₀₀为0.5-0.6，将培养好的菌液5000rpm离心10min弃上清，沉淀用IM培养基含有200μmol/L乙酰丁香酮和20μL 25％吐温80，重悬至OD₆₀₀为0.6-0.7。

7、如上步骤(5)侵染液侵染步骤(2)的桑黄菌丝20min后，5000rpm离心10min，收集沉淀，0.2g沉淀物用1mL侵染液重悬，取200μL混合液体接种于含有200μmol/L乙酰丁香酮的Co-IM培养基，每个培养基约含有1.6×10⁵个菌丝片段，共培养36h，培养温度为25℃。

8、如上步骤(6)首先将低熔点PDA培养基溶化后，冷却至29-30℃，在步骤(5)得到的共培养菌丝上覆盖含有4μg/mL潮霉素和300μg/mL头孢噻肟钠的低溶点PDA培养基，培养3-4天，长出新菌落，随后将菌落转移至新的含有4μg/mL潮霉素的PDA培养基，培养5-7天，选取长势旺盛的菌落提取DNA，利用PCR技术鉴定阳性菌株。

本发明的有益效果及优点如下：本发明构建的双元载体1301-SH-gpd可以在桑黄中表达，而且此载体可以利用NcoI单酶切，利用无缝克隆技术在桑黄gpd启动子后面添加目的基因构建重组载体，可用于研究基因功能和改造桑黄菌株。使用本发明的1301-SH-gpd载体构建表达外源基因的重组载体的过程简便、快速、经济、高效，可以快速完成基因表达载体的构建，具有很好的应用前景。首次将潮霉素作为筛选标记用于桑黄遗传转化，并测定出桑黄菌丝对潮霉素的筛选浓度为4μg/mL。本发明利用菌丝作为遗传转化受体，可以降低试验成本，并且本发明将菌丝匀浆，可以使菌丝产生较多的伤口，简化操作步骤的同时更有利于农杆菌的侵染。且菌丝再生能力强、速度快，从收集菌丝到获得转化株，桑黄菌丝遗传转化周期为9-13天。共培养过后，直接将低熔点PDA培养基(4μg/mL潮霉素，300μg/mL头孢噻肟钠)覆盖在共培养菌丝上，无需将菌丝转移和脱菌，简化了操作步骤，降低了污染率。本操作流程简单，可操作性强，不要求操作者拥有丰富的分子生物学实验的操作经验，克服了原生质体制备过程复杂、成本高的缺点。

附图说明

图1为1301-SH-gpd双元载体构建图；

图2为桑黄菌丝对潮霉素敏感性测试图；

图3为桑黄转化子在潮霉素筛选培养基上的筛选图；

图4为桑黄转化子PCR验证结果图，其中M为2000bp的Mark，1为野生型，2为转化子，3为载体1301-SH-gpd。

具体实施方式

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实验所用的原始质粒pCAMBIA-1301购买于生物技术公司，常见于市面。载体的克隆、冻融法转化步骤见分子克隆实验指南。

本发明中，所述桑黄遗传转化体系的构建方法，包括以下步骤(图1)：

步骤一：桑黄双元载体1301-SH-gpd构建

①以pCAMBIA-1301载体为模板，用引物(画线部分为pCAMBIA-1301载体同源臂)：

HYG-F：GGTACCGAGCTCGAATTCATGAAAAAGCCTGAACTCACCGC

HYG-R：CATTATTATGGAGAAACTCGAGCTATTTCTTTGCCCTCGGAC

进行PCR扩增。得到带有同源臂的HYG表达盒片段。

②将pCAMBIA-1301载体在XhoI和EcoRI酶的作用下进行酶切，得到酶切后的线性pCAMBIA-1301载体。

③将所述步骤①得到的线性pCAMBIA-1301载体和所述步骤②得到带有同源臂的HYG表达盒片段连接。

表1连接体系

得到1301-HYG载体。

④以桑黄总DNA为模板，用引物(画线部分为1301-HYG载体同源臂)：

gpdZ-F：GGGTACCGAGCTCGAATTCAAGTGGCTTGAGTTTCGTCGTTGT

gpdZ-R:GGTGAGTTCAGGCTTTTTCATCACACAGAAAGTAAGCGCACATCG

进行PCR扩增，得到带有1301-HYG载体同源臂的gpd基因启动子片段，序列如SEQID No.11所示。

⑤将1301-HYG载体在EcoRI酶的作用下进行酶切，得到酶切后的线性载体。

⑥将所述步骤④得到的带有同源臂的gpd启动子和所述步骤⑤得到的线性载体连接。

表2连接体系

得到1301-gpd-HYG载体。

⑦以桑黄总DNA为模板，以序列(画线部分为1301-gpd-HYG载体同源臂)

gpdY-F：ACCTGCAGGCATGCAAGCTTAAGTGGCTTGAGTTTCGTCG

gpdY-R:TTACCCTCAGATCTACCATGGCACACAGAAAGTAAGCGCACATCG

进行PCR扩增，得到带有1301-gpd-HYG载体同源臂的gpd启动子片段，序列如SEQID No.12所示。

⑧将1301-gpd-HYG载体在HindIII和NcoI酶的作用下进行酶切，得到酶切后的线性载体。

⑨将所述步骤⑦得到的带有同源臂的gpd启动子片段和所述步骤⑧得到的线性载体连接。

表3连接体系

得到桑黄双元载体1301-SH-gpd，序列如SEQ ID No.13所示。

⑩本发明将所述步骤⑨得到的1301-SH-gpd载体转化入根癌农杆菌感受态中，培养1-2d，获得阳性菌。在本发明中，所述农杆菌转化优选的为冻融法。所述根癌农杆菌优选的为AGL-1，本发明对农杆菌感受态的来源没有任何限定。

步骤二：遗传转化受体制备

①将桑黄菌种接种到PD培养基中，180rpm，25℃振荡培养12天。

②将所述步骤①培养好的菌丝用匀浆仪无菌条件下粉碎20s，以10％的接种量接种于PD培养基中25℃静置培养8d，期间间或摇匀。

③将所述步骤②培养好的菌丝丝用匀浆仪无菌条件下粉碎20s，将液体置于50mL无菌离心管中，5000rpm离心10min，收集沉淀菌丝。

步骤三：桑黄菌丝对潮霉素敏感性测试

取步骤二沉淀菌丝，每0.2g菌丝用1mL蒸馏水重悬，取200μL重悬后的菌液接种在含不同浓度潮霉素：0μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL的PDA平板上接种桑黄菌丝，观察菌丝生长情况，确定潮霉素(HYG)最佳浓度4μg/mL(图2)。

步骤四：农杆菌培养

①将含有1301-SH-gpd载体的AGL-1农杆菌在含有25μg/mL利福平和50μg/mL卡那霉素的PDA平板培养基画线，28℃培养2d。挑取PDA培养基上的单菌落接种到含有25μg/mL利福平和50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，150rpm，25℃震荡培养1天。

②取所述步骤①培养好的菌液1mL加入到100mL LB液体培养基(50μg/mL卡那霉素)中，培养至OD₆₀₀为0.5-0.6。

③将所述步骤②培养好的菌液5000rpm离心10min弃上清，用含有200μmol/L乙酰丁香酮和20μL 25％吐温80的IM培养基重悬至OD₆₀₀为0.6-0.7，得到侵染液。

步骤五：侵染和共培养

①取所述步骤二③菌丝与步骤四③获得的侵染液混合，侵染20min。

②将所述步骤①液体离心，随后收集菌丝，每0.2g菌丝用1mL侵染液重悬，得到共培养液。

③取所述步骤②获得的共培养液200μL于含有200μmol/L乙酰丁香酮的Co-IM培养基中，每个培养基约含有1.6×10⁵个菌丝片段，用无菌涂布棒涂抹均匀，置于25℃培养36h。

步骤六：筛选阳性转化子

①首先将低溶点PDA培养基溶化后，冷却至29-30℃，在所述步骤五的共培养菌丝上覆盖含有4μg/mL潮霉素和300μg/mL头孢噻肟钠的低溶点PDA培养基，冷却至35℃，置于25℃培养3-4天，长出新菌落(图3)。

②将所述步骤①菌落转移至新的含有4μg/mL潮霉素的PDA培养基，置于25℃培养5～7天，选取长势旺盛的菌丝转入PDA培养基，置于25℃培养7～9天。

③提取所述步骤②菌丝的基因组DNA，用引物：

J1-F：GATCGTTCAAACATTTGGCAATA

J1-R：GATCTAGTAACATAGATGACACCG和

J2-F：CTATGATGATGATGATAGTTACAGA

J2-R:CGGTAGGAGTTGGCCCCAATCCAGT

以双元载体1301-SH-gpd、转化子和野生型DNA为模板进行PCR扩增。PCR结果显示，从转化子和双元载体1301-SH-gpd都能扩增出253bp和1013bp的预期DNA片段，但野生型中没有扩增产物(图4)。说明双元载体上的外源DNA片段已经整合到了桑黄转化子的基因组中。

本发明所述培养基配方为：

PDA培养基：马铃薯200g/L；葡萄糖20g/L；agar 18g/L。

PD培养基：PDA培养基不加agar。

低溶点PDA培养基：马铃薯200g/L；葡萄糖20g/L；低溶点agar 5g/L。

IM培养基(1L)：K-buffer(KH₂PO₄ 14.5g/100mL；K₂HPO₄ 20g/100mL)10mL；M-Nbuffer(NaCl 3g/100mL；MgSO₄·7H₂O 3g/100mL)20mL；20％Glucose(W/V)5mL；0.01％FeSO₄(W/V)10mL；20％(NH₄)₂NO₃(W/V)2.5mL；1％CaCl₂·2H₂O(W/V)1mL；50％Glycerol 10mL；1MMES 40mL；ZnSO₄·7H₂O 0.001g/L；CuSO₄·5H₂O 0.001g/L；MnSO₄·H₂O 0.001g/L；NaMoO₄·2H₂O 0.001g/L；H₃BO₃ 0.001g/L。

CO-IM培养基：K-buffer(KH₂PO₄ 14.5g/100mL；K₂HPO₄ 20g/100mL)10mL；M-Nbuffer(NaCl 3g/100mL；MgSO₄·7H₂O 3g/100mL)20mL；20％Glucose(W/V)2.5mL；0.01％FeSO₄(W/V)10mL；20％(NH₄)₂NO₃(W/V)2.5mL；1％CaCl₂·2H₂O(W/V)1mL；50％Glycerol10mL；1M MES 40mL；ZnSO₄·7H₂O 0.001g/L；CuSO₄·5H₂O 0.001g/L；MnSO₄·H₂O 0.001g/L；NaMoO₄·2H₂O 0.001g/L；H₃BO₃ 0.001g/L；agar 18g/L。

序列表

<110> 东北林业大学

<120> 用于桑黄遗传表达的重组载体及构建方法和遗传转化方法

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtaccgagc tcgaattcat gaaaaagcct gaactcaccg c 41

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cattattatg gagaaactcg agctatttct ttgccctcgg ac 42

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggtaccgag ctcgaattca agtggcttga gtttcgtcgt tgt 43

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggtgagttc aggctttttc atcacacaga aagtaagcgc acatcg 46

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acctgcaggc atgcaagctt aagtggcttg agtttcgtcg 40

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tttaccctca gatctaccat ggcacacaga aagtaagcgc acatcg 46

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gatcgttcaa acatttggca ata 23

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gatctagtaa catagatgac accg 24

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctatgatgat gatgatagtt acaga 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cggtaggagt tggccccaat ccagt 25

<210> 11

<211> 1462

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gggtaccgag ctcgaattca agtggcttga gtttcgtcgt tgtgattttg tggttatatt 60

actcacctat gcgatatgcg atatgccata tgattgaagt ttgtgtgtat gtaggttcgg 120

tatgcgatcg attatttatg agagaaccac tatccttccg tgtgttgata tgatattgag 180

gagcgatcaa tttccttttc cgccagtgaa gtaaagagaa tgtcatgata gcgagagtat 240

gatttatgac atcggatcgt atatcgatag tgtaagagag gtatggcagt ggaaccaagc 300

agcgcgtcca gctcgtggtg gctaaagatc aagtcgtcag gccagaatct gtggatctca 360

aaattgtcaa accgtcgaca cgatcacgtg gataccaaaa tagatgcaaa caaagagggg 420

tcattggata accatgtaaa ggaattggaa ttgttagcta atgattgact cgtatcattc 480

cgtatagccg aggcttactc gatgagagat ggaatgatgc atgctcggag tccgacgggt 540

gaacgtggtt gcagtacgta gcatatgatt caggttcgtc gtcgtcgacg agagcttgat 600

gtatcgtcag acggctcatc agggcttcat cgtggtaaga ttgggaggag actccgaatc 660

cgagcgtttc gcatctgctc gtcgtgcaga tgcggagata gaacagtaag agttatttcg 720

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gaagtaagtt cggggatatg gacatcgcca tcgctcatgc tcgggtggcg gctctcgagc 840

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catcgggtcg aataccggtt cacaacatca tcataactca agttaaaaaa tcgacaaaaa 1080

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cagaaggagt cgagggaagg gacgagaaac acgtttaatc cggtttcata cgatccaacg 1200

gcgcggcgtc ggccgtgaac cgtgagccgt gacctcagtg accccccccc aacgcataca 1260

atacacaatg cgcatatata aagccctaac ccctctcgtc ccttcttgtc ctcgagcatc 1320

caccacattc tacagctcat tcatctactt tctatagact tgcatccata tcatcatggt 1380

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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acctgcaggc atgcaagctt acctgcaggc atgcaagctt aagtggcttg agtttcgtcg 60

ttgtgatttt gtggttatat tactcaccta tgcgatatgc gatatgccgt atgattgaag 120

tttgtgtgta tgtaggttcg gtatgcgatc gattatttat gagagaacca ctatccttcc 180

gtgtgttgat atgatattga ggagcgatca atttcctttt ccgccagtga agtaaagaga 240

atgtcatgat agcgagagta tgatttatga catcggatcg tatatcgata gtgtaagaga 300

ggtatggcag tggaaccaag cagcgcgtcc agctcgtggt ggctaaagat caagtcgtca 360

ggccagaatc tgtggatctc aaaattgtca aaccgtcgac acgatcacgt ggataccaaa 420

atagatgcaa acaaagaggg gtcattggat aaccatgtaa aggaattgga attgttagct 480

aatgattgac tcgtatcatt ccgtatagcc gaggcttact cgatgagaga tggaatgatg 540

catgctcgga gtccgacggg tgaacgtggt tgcagtacgt agcatatgat tcaggttcgt 600

cgtcgtcgac gagagcttga tgtatcgtca gacggctcat cagggcttca tcgtggtaag 660

attgggagga gactccgaat ccgagcgttt cgcatctgct cgtcgtgcag atgcggagat 720

agaacagtaa gagttatttc gagcatagat gggacggaag tagttcctta tgcacgttcg 780

tcgcggttcg gagacggagg tgaagtaagt tcggggatat ggacatcgcc atcgctcatg 840

ctcgggtggc ggctctcgag ccgttgatgc gttgagtcag catacgcaat aattttcttt 900

cgtactctcc tggacgctcg gaattaaaga atagggtgag tgataacacc acttggtgag 960

aaacggccgc atgtgcaccg acgcggtacg ggcgccgagg aggtagagac tgagagggtc 1020

ggccgtcgag taacaacgga acatcgggtc gaataccggt tcacaacatc atcataactc 1080

aagttaaaaa atcgacaaaa atgaagaata aaatgtacgc tggtcgacgt gcaataggag 1140

gctcaataca ttaattcgcc agaaggagtt gagggaaggg acgagaaaca cgtttaatcc 1200

ggtttcatac gatccaacgg cgcggcgtcg gccgtgaacc gtgagccgtg acctcagtga 1260

ccccccccaa cgcatacaat acacaatgcg catatataaa gccctaaccc ctctcgtccc 1320

ttcttgtcct cgagcatcca ccacattcta cagctcattc atctactttc tatagacttg 1380

catccatatc atcatggtga gtgatatgtt gggccgggat gtgctgatgg ctcgcgatgt 1440

gcgcttactt tctgtgtgcc atggtagatc tgagggtaaa 1480

<210> 13

<211> 12837

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gatctgaggg taaatttcta gtttttctcc ttcattttct tggttaggac ccttttctct 60

ttttattttt ttgagctttg atctttcttt aaactgatct attttttaat tgattggtta 120

tggtgtaaat attacatagc tttaactgat aatctgatta ctttatttcg tgtgtctatg 180

atgatgatga tagttacaga accgacgact cgtccgtcct gtagaaaccc caacccgtga 240

aatcaaaaaa ctcgacggcc tgtgggcatt cagtctggat cgcgaaaact gtggaattga 300

tcagcgttgg tgggaaagcg cgttacaaga aagccgggca attgctgtgc caggcagttt 360

taacgatcag ttcgccgatg cagatattcg taattatgcg ggcaacgtct ggtatcagcg 420

cgaagtcttt ataccgaaag gttgggcagg ccagcgtatc gtgctgcgtt tcgatgcggt 480

cactcattac ggcaaagtgt gggtcaataa tcaggaagtg atggagcatc agggcggcta 540

tacgccattt gaagccgatg tcacgccgta tgttattgcc gggaaaagtg tacgtatcac 600

cgtttgtgtg aacaacgaac tgaactggca gactatcccg ccgggaatgg tgattaccga 660

cgaaaacggc aagaaaaagc agtcttactt ccatgatttc tttaactatg ccggaatcca 720

tcgcagcgta atgctctaca ccacgccgaa cacctgggtg gacgatatca ccgtggtgac 780

gcatgtcgcg caagactgta accacgcgtc tgttgactgg caggtggtgg ccaatggtga 840

tgtcagcgtt gaactgcgtg atgcggatca acaggtggtt gcaactggac aaggcactag 900

cgggactttg caagtggtga atccgcacct ctggcaaccg ggtgaaggtt atctctatga 960

actcgaagtc acagccaaaa gccagacaga gtctgatatc tacccgcttc gcgtcggcat 1020

ccggtcagtg gcagtgaagg gccaacagtt cctgattaac cacaaaccgt tctactttac 1080

tggctttggt cgtcatgaag atgcggactt acgtggcaaa ggattcgata acgtgctgat 1140

ggtgcacgac cacgcattaa tggactggat tggggccaac tcctaccgta cctcgcatta 1200

cccttacgct gaagagatgc tcgactgggc agatgaacat ggcatcgtgg tgattgatga 1260

aactgctgct gtcggctttc agctgtcttt aggcattggt ttcgaagcgg gcaacaagcc 1320

gaaagaactg tacagcgaag aggcagtcaa cggggaaact cagcaagcgc acttacaggc 1380

gattaaagag ctgatagcgc gtgacaaaaa ccacccaagc gtggtgatgt ggagtattgc 1440

caacgaaccg gatacccgtc cgcaaggtgc acgggaatat ttcgcgccac tggcggaagc 1500

aacgcgtaaa ctcgacccga cgcgtccgat cacctgcgtc aatgtaatgt tctgcgacgc 1560

tcacaccgat accatcagcg atctctttga tgtgctgtgc ctgaaccgtt attacggatg 1620

gtatgtccaa agcggcgatt tggaaacggc agagaaggta ctggaaaaag aacttctggc 1680

ctggcaggag aaactgcatc agccgattat catcaccgaa tacggcgtgg atacgttagc 1740

cgggctgcac tcaatgtaca ccgacatgtg gagtgaagag tatcagtgtg catggctgga 1800

tatgtatcac cgcgtctttg atcgcgtcag cgccgtcgtc ggtgaacagg tatggaattt 1860

cgccgatttt gcgacctcgc aaggcatatt gcgcgttggc ggtaacaaga aagggatctt 1920

cactcgcgac cgcaaaccga agtcggcggc ttttctgctg caaaaacgct ggactggcat 1980

gaacttcggt gaaaaaccgc agcagggagg caaacaagct agccaccacc accaccacca 2040

cgtgtgaatt acaggtgacc agctcgaatt tccccgatcg ttcaaacatt tggcaataaa 2100

gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga 2160

attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg agatgggttt 2220

ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg 2280

caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg gaattaaact 2340

atcagtgttt gacaggatat attggcgggt aaacctaaga gaaaagagcg tttattagaa 2400

taacggatat ttaaaagggc gtgaaaaggt ttatccgttc gtccatttgt atgtgcatgc 2460

caaccacagg gttcccctcg ggatcaaagt actttgatcc aacccctccg ctgctatagt 2520

gcagtcggct tctgacgttc agtgcagccg tcttctgaaa acgacatgtc gcacaagtcc 2580

taagttacgc gacaggctgc cgccctgccc ttttcctggc gttttcttgt cgcgtgtttt 2640

agtcgcataa agtagaatac ttgcgactag aaccggagac attacgccat gaacaagagc 2700

gccgccgctg gcctgctggg ctatgcccgc gtcagcaccg acgaccagga cttgaccaac 2760

caacgggccg aactgcacgc ggccggctgc accaagctgt tttccgagaa gatcaccggc 2820

accaggcgcg accgcccgga gctggccagg atgcttgacc acctacgccc tggcgacgtt 2880

gtgacagtga ccaggctaga ccgcctggcc cgcagcaccc gcgacctact ggacattgcc 2940

gagcgcatcc aggaggccgg cgcgggcctg cgtagcctgg cagagccgtg ggccgacacc 3000

accacgccgg ccggccgcat ggtgttgacc gtgttcgccg gcattgccga gttcgagcgt 3060

tccctaatca tcgaccgcac ccggagcggg cgcgaggccg ccaaggcccg aggcgtgaag 3120

tttggccccc gccctaccct caccccggca cagatcgcgc acgcccgcga gctgatcgac 3180

caggaaggcc gcaccgtgaa agaggcggct gcactgcttg gcgtgcatcg ctcgaccctg 3240

taccgcgcac ttgagcgcag cgaggaagtg acgcccaccg aggccaggcg gcgcggtgcc 3300

ttccgtgagg acgcattgac cgaggccgac gccctggcgg ccgccgagaa tgaacgccaa 3360

gaggaacaag catgaaaccg caccaggacg gccaggacga accgtttttc attaccgaag 3420

agatcgaggc ggagatgatc gcggccgggt acgtgttcga gccgcccgcg cacgtctcaa 3480

ccgtgcggct gcatgaaatc ctggccggtt tgtctgatgc caagctggcg gcctggccgg 3540

ccagcttggc cgctgaagaa accgagcgcc gccgtctaaa aaggtgatgt gtatttgagt 3600

aaaacagctt gcgtcatgcg gtcgctgcgt atatgatgcg atgagtaaat aaacaaatac 3660

gcaaggggaa cgcatgaagg ttatcgctgt acttaaccag aaaggcgggt caggcaagac 3720

gaccatcgca acccatctag cccgcgccct gcaactcgcc ggggccgatg ttctgttagt 3780

cgattccgat ccccagggca gtgcccgcga ttgggcggcc gtgcgggaag atcaaccgct 3840

aaccgttgtc ggcatcgacc gcccgacgat tgaccgcgac gtgaaggcca tcggccggcg 3900

cgacttcgta gtgatcgacg gagcgcccca ggcggcggac ttggctgtgt ccgcgatcaa 3960

ggcagccgac ttcgtgctga ttccggtgca gccaagccct tacgacatat gggccaccgc 4020

cgacctggtg gagctggtta agcagcgcat tgaggtcacg gatggaaggc tacaagcggc 4080

ctttgtcgtg tcgcgggcga tcaaaggcac gcgcatcggc ggtgaggttg ccgaggcgct 4140

ggccgggtac gagctgccca ttcttgagtc ccgtatcacg cagcgcgtga gctacccagg 4200

cactgccgcc gccggcacaa ccgttcttga atcagaaccc gagggcgacg ctgcccgcga 4260

ggtccaggcg ctggccgctg aaattaaatc aaaactcatt tgagttaatg aggtaaagag 4320

aaaatgagca aaagcacaaa cacgctaagt gccggccgtc cgagcgcacg cagcagcaag 4380

gctgcaacgt tggccagcct ggcagacacg ccagccatga agcgggtcaa ctttcagttg 4440

ccggcggagg atcacaccaa gctgaagatg tacgcggtac gccaaggcaa gaccattacc 4500

gagctgctat ctgaatacat cgcgcagcta ccagagtaaa tgagcaaatg aataaatgag 4560

tagatgaatt ttagcggcta aaggaggcgg catggaaaat caagaacaac caggcaccga 4620

cgccgtggaa tgccccatgt gtggaggaac gggcggttgg ccaggcgtaa gcggctgggt 4680

tgtctgccgg ccctgcaatg gcactggaac ccccaagccc gaggaatcgg cgtgacggtc 4740

gcaaaccatc cggcccggta caaatcggcg cggcgctggg tgatgacctg gtggagaagt 4800

tgaaggccgc gcaggccgcc cagcggcaac gcatcgaggc agaagcacgc cccggtgaat 4860

cgtggcaagc ggccgctgat cgaatccgca aagaatcccg gcaaccgccg gcagccggtg 4920

cgccgtcgat taggaagccg cccaagggcg acgagcaacc agattttttc gttccgatgc 4980

tctatgacgt gggcacccgc gatagtcgca gcatcatgga cgtggccgtt ttccgtctgt 5040

cgaagcgtga ccgacgagct ggcgaggtga tccgctacga gcttccagac gggcacgtag 5100

aggtttccgc agggccggcc ggcatggcca gtgtgtggga ttacgacctg gtactgatgg 5160

cggtttccca tctaaccgaa tccatgaacc gataccggga agggaaggga gacaagcccg 5220

gccgcgtgtt ccgtccacac gttgcggacg tactcaagtt ctgccggcga gccgatggcg 5280

gaaagcagaa agacgacctg gtagaaacct gcattcggtt aaacaccacg cacgttgcca 5340

tgcagcgtac gaagaaggcc aagaacggcc gcctggtgac ggtatccgag ggtgaagcct 5400

tgattagccg ctacaagatc gtaaagagcg aaaccgggcg gccggagtac atcgagatcg 5460

agctagctga ttggatgtac cgcgagatca cagaaggcaa gaacccggac gtgctgacgg 5520

ttcaccccga ttactttttg atcgatcccg gcatcggccg ttttctctac cgcctggcac 5580

gccgcgccgc aggcaaggca gaagccagat ggttgttcaa gacgatctac gaacgcagtg 5640

gcagcgccgg agagttcaag aagttctgtt tcaccgtgcg caagctgatc gggtcaaatg 5700

acctgccgga gtacgatttg aaggaggagg cggggcaggc tggcccgatc ctagtcatgc 5760

gctaccgcaa cctgatcgag ggcgaagcat ccgccggttc ctaatgtacg gagcagatgc 5820

tagggcaaat tgccctagca ggggaaaaag gtcgaaaagg tctctttcct gtggatagca 5880

cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggaa cccgtacatt gggaacccaa 5940

agccgtacat tgggaaccgg tcacacatgt aagtgactga tataaaagag aaaaaaggcg 6000

atttttccgc ctaaaactct ttaaaactta ttaaaactct taaaacccgc ctggcctgtg 6060

cataactgtc tggccagcgc acagccgaag agctgcaaaa agcgcctacc cttcggtcgc 6120

tgcgctccct acgccccgcc gcttcgcgtc ggcctatcgc ggccgctggc cgctcaaaaa 6180

tggctggcct acggccaggc aatctaccag ggcgcggaca agccgcgccg tcgccactcg 6240

accgccggcg cccacatcaa ggcaccctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac 6300

ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc 6360

agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc 6420

cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg 6480

tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc 6540

gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 6600

ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 6660

acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 6720

cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 6780

caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 6840

gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 6900

tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 6960

aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 7020

ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 7080

cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 7140

tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 7200

tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 7260

ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 7320

aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 7380

aagggatttt ggtcatgcat tctaggtact aaaacaattc atccagtaaa atataatatt 7440

ttattttctc ccaatcaggc ttgatcccca gtaagtcaaa aaatagctcg acatactgtt 7500

cttccccgat atcctccctg atcgaccgga cgcagaaggc aatgtcatac cacttgtccg 7560

ccctgccgct tctcccaaga tcaataaagc cacttacttt gccatctttc acaaagatgt 7620

tgctgtctcc caggtcgccg tgggaaaaga caagttcctc ttcgggcttt tccgtcttta 7680

aaaaatcata cagctcgcgc ggatctttaa atggagtgtc ttcttcccag ttttcgcaat 7740

ccacatcggc cagatcgtta ttcagtaagt aatccaattc ggctaagcgg ctgtctaagc 7800

tattcgtata gggacaatcc gatatgtcga tggagtgaaa gagcctgatg cactccgcat 7860

acagctcgat aatcttttca gggctttgtt catcttcata ctcttccgag caaaggacgc 7920

catcggcctc actcatgagc agattgctcc agccatcatg ccgttcaaag tgcaggacct 7980

ttggaacagg cagctttcct tccagccata gcatcatgtc cttttcccgt tccacatcat 8040

aggtggtccc tttataccgg ctgtccgtca tttttaaata taggttttca ttttctccca 8100

ccagcttata taccttagca ggagacattc cttccgtatc ttttacgcag cggtattttt 8160

cgatcagttt tttcaattcc ggtgatattc tcattttagc catttattat ttccttcctc 8220

ttttctacag tatttaaaga taccccaaga agctaattat aacaagacga actccaattc 8280

actgttcctt gcattctaaa accttaaata ccagaaaaca gctttttcaa agttgttttc 8340

aaagttggcg tataacatag tatcgacgga gccgattttg aaaccgcggt gatcacaggc 8400

agcaacgctc tgtcatcgtt acaatcaaca tgctaccctc cgcgagatca tccgtgtttc 8460

aaacccggca gcttagttgc cgttcttccg aatagcatcg gtaacatgag caaagtctgc 8520

cgccttacaa cggctctccc gctgacgccg tcccggactg atgggctgcc tgtatcgagt 8580

ggtgattttg tgccgagctg ccggtcgggg agctgttggc tggctggtgg caggatatat 8640

tgtggtgtaa acaaattgac gcttagacaa cttaataaca cattgcggac gtttttaatg 8700

tactgaatta acgccgaatt aattcggggg atctggattt tagtactgga ttttggtttt 8760

aggaattaga aattttattg atagaagtat tttacaaata caaatacata ctaagggttt 8820

cttatatgct caacacatga gcgaaaccct ataggaaccc taattccctt atctgggaac 8880

tactcacaca ttattatgga gaaactcgag ctatttcttt gccctcggac gagtgctggg 8940

gcgtcggttt ccactatcgg cgagtacttc tacacagcca tcggtccaga cggccgcgct 9000

tctgcgggcg atttgtgtac gcccgacagt cccggctccg gatcggacga ttgcgtcgca 9060

tcgaccctgc gcccaagctg catcatcgaa attgccgtca accaagctct gatagagttg 9120

gtcaagacca atgcggagca tatacgcccg gagtcgtggc gatcctgcaa gctccggatg 9180

cctccgctcg aagtagcgcg tctgctgctc catacaagcc aaccacggcc tccagaagaa 9240

gatgttggcg acctcgtatt gggaatcccc gaacatcgcc tcgctccagt caatgaccgc 9300

tgttatgcgg ccattgtccg tcaggacatt gttggagccg aaatccgcgt gcacgaggtg 9360

ccggacttcg gggcagtcct cggcccaaag catcagctca tcgagagcct gcgcgacgga 9420

cgcactgacg gtgtcgtcca tcacagtttg ccagtgatac acatggggat cagcaatcgc 9480

gcatatgaaa tcacgccatg tagtgtattg accgattcct tgcggtccga atgggccgaa 9540

cccgctcgtc tggctaagat cggccgcagc gatcgcatcc atagcctccg cgaccggttg 9600

tagaacagcg ggcagttcgg tttcaggcag gtcttgcaac gtgacaccct gtgcacggcg 9660

ggagatgcaa taggtcaggc tctcgctaaa ctccccaatg tcaagcactt ccggaatcgg 9720

gagcgcggcc gatgcaaagt gccgataaac ataacgatct ttgtagaaac catcggcgca 9780

gctatttacc cgcaggacat atccacgccc tcctacatcg aagctgaaag cacgagattc 9840

ttcgccctcc gagagctgca tcaggtcgga gacgctgtcg aacttttcga tcagaaactt 9900

ctcgacagac gtcgcggtga gttcaggctt tttcatcaca cagaaagtaa gcgcacatcg 9960

cgagccatca gcacatcccg gcccaacata tcactcacca tgatgatatg gatgcaagtc 10020

tatagaaagt agatgaatga gctgtagaat gtggtggatg ctcgaggaca agaagggacg 10080

agaggggtta gggctttata tatgcgcatt gtgtattgta tgcgttgggg ggggtcactg 10140

aggtcacggc tcacggttca cggccgacgc cgcgccgttg gatcgtatga aaccggatta 10200

aacgtgtttc tcgtcccttc cctcaactcc ttctggcgaa ttaatgtatt gagcctccta 10260

ttgcacgtcg accagcgtac attttattct tcatttttgt cgatttttta acttgagtta 10320

tgatgatgtt gtgaaccggt attcgacccg atgttccgtt gttactcgac ggccgaccct 10380

ctcagtctct acctcctcgg cgcccgtacc gcgtcggtgc acatgcggcc gtttctcacc 10440

aagtggtgtt atcactcacc ctattcttta attccgagcg tccaggagag tacgaaagaa 10500

aattattgcg tatgctgact caacgcatca acggctcgag agccgccacc cgagcatgag 10560

cgatggcgat gtccatatcc ccgaacttac ttcacctccg tctccgaacc gcgacgaacg 10620

tgcataagga actacttccg tcccatctat gctcgaaata actcttactg ttctatctcc 10680

gcatctgcac gacgagcaga tgcgaaacgc tcggattcgg agtctcctcc caatcttacc 10740

acgatgaagc cctgatgagc cgtctgacga tacatcaagc tctcgtcgac gacgacgaac 10800

ctgaatcata tgctacgtac tgcaaccacg ttcacccgtc ggactccgag catgcatcat 10860

tccatctctc atcgagtaag cctcggctat acggaatgat acgagtcaat cattagctaa 10920

caattccaat tcctttacat ggttatccaa tgacccctct ttgtttgcat ctattttggt 10980

atccacgtga tcgtgtcgac ggtttgacaa ttttgagatc cacagattct ggcctgacga 11040

cttgatcttt agccaccacg agctggacgc gctgcttggt tccactgcca tacctctctt 11100

acactatcga tatacgatcc gatgtcataa atcatactct cgctatcatg acattctctt 11160

tacttcactg gcggaaaagg aaattgatcg ctcctcaata tcatatcaac acacggaagg 11220

atagtggttc tctcataaat aatcgatcgc ataccgaacc tacatacaca caaacttcaa 11280

tcatacggca tatcgcatat cgcataggtg agtaatataa ccacaaaatc acaacgacga 11340

aactcaagcc acttgaattc gagctcggta cccggggatc ctctagagtc gacctgcagg 11400

catgcaagct taagtggctt gagtttcgtc gttgtgattt tgtggttata ttactcacct 11460

atgcgatatg cgatatgccg tatgattgaa gtttgtgtgt atgtaggttc ggtatgcgat 11520

cgattattta tgagagaacc actatccttc cgtgtgttga tatgatattg aggagcgatc 11580

aatttccttt tccgccagtg aagtaaagag aatgtcatga tagcgagagt atgatttatg 11640

acatcggatc gtatatcgat agtgtaagag aggtatggca gtggaaccaa gcagcgcgtc 11700

cagctcgtgg tggctaaaga tcaagtcgtc aggccagaat ctgtggatct caaaattgtc 11760

aaaccgtcga cacgatcacg tggataccaa aatagatgca aacaaagagg ggtcattgga 11820

taaccatgta aaggaattgg aattgttagc taatgattga ctcgtatcat tccgtatagc 11880

cgaggcttac tcgatgagag atggaatgat gcatgctcgg agtccgacgg gtgaacgtgg 11940

ttgcagtacg tagcatatga ttcaggttcg tcgtcgtcga cgagagcttg atgtatcgtc 12000

agacggctca tcagggcttc atcgtggtaa gattgggagg agactccgaa tccgagcgtt 12060

tcgcatctgc tcgtcgtgca gatgcggaga tagaacagta agagttattt cgagcataga 12120

tgggacggaa gtagttcctt atgcacgttc gtcgcggttc ggagacggag gtgaagtaag 12180

ttcggggata tggacatcgc catcgctcat gctcgggtgg cggctctcga gccgttgatg 12240

cgttgagtca gcatacgcaa taattttctt tcgtactctc ctggacgctc ggaattaaag 12300

aatagggtga gtgataacac cacttggtga gaaacggccg catgtgcacc gacgcggtac 12360

gggcgccgag gaggtagaga ctgagagggt cggccgtcga gtaacaacgg aacatcgggt 12420

cgaataccgg ttcacaacat catcataact caagttaaaa aatcgacaaa aatgaagaat 12480

aaaatgtacg ctggtcgacg tgcaatagga ggctcaatac attaattcgc cagaaggagt 12540

tgagggaagg gacgagaaac acgtttaatc cggtttcata cgatccaacg gcgcggcgtc 12600

ggccgtgaac cgtgagccgt gacctcagtg acccccccca acgcatacaa tacacaatgc 12660

gcatatataa agccctaacc cctctcgtcc cttcttgtcc tcgagcatcc accacattct 12720

acagctcatt catctacttt ctatagactt gcatccatat catcatggtg agtgatatgt 12780

tgggccggga tgtgctgatg gctcgcgatg tgcgcttact ttctgtgtgc catggta 12837

Claims (10)

1.一种用于桑黄遗传表达的重组双元载体1301-SH-gpd，其特征在于：其序列如SEQ IDNo:13所示。

2.根据权利要求1所述的一种用于桑黄遗传表达的重组双元载体1301-SH-gpd的构建方法，其特征在于，步骤如下：

(a)以pCAMBIA-1301载体为模板，设计引物组：

HYG-F，其序列如SEQ ID No:1所示，

HYG-R，其序列如SEQ ID No:2所示，

进行PCR扩增，得到带有同源臂的潮霉素(HYG)表达盒片段；

(b)将pCAMBIA-1301载体双酶切，切除左边的CaMV35S启动子区和HYG潮霉素区，得到线性化pCAMBIA-1301载体，

(c)利用无缝克隆技术，将步骤a带有同源臂的HYG表达盒片段与步骤b线性化载体连接，得到重组载体1301-HYG，

(d)以桑黄DNA为模板，设计引物组：

gpdZ-F，其序列如SEQ ID No:3所示，

gpdZ-R，其序列如SEQ ID No:4所示，

进行PCR扩增，得到带有1301-HYG载体同源臂的gpd基因启动子片段，其序列如SEQ IDNo:11所示，

(e)将步骤c得到的1301-HYG载体单酶切，得到线性化载体，

(f)将步骤d得到的带有同源臂的gpd启动子和步骤e得到的线性化载体连接，得到重组载体1301-gpd-HYG，

(g)以桑黄DNA为模板，设计引物组：

gpdY-F，其序列如SEQ ID No:5所示，

gpdY-R，其序列如SEQ ID No:6所示，

进行PCR扩增，得到带有1301-gpd-HYG载体同源臂的gpd启动子片段，其序列如SEQ IDNo:12所示，

(h)将步骤f得到的1301-gpd-HYG载体双酶切，切除右边的CaMV35S启动子区，得到线性化载体，

(i)将步骤g得到的带有同源臂的gpd启动子和步骤h得到的线性化载体连接，得到重组双元载体1301-SH-gpd，其序列如SEQ ID No:13所示。

3.一种根癌农杆菌介导的桑黄遗传转化方法，采用如权利要求1所述的一种用于桑黄遗传表达的重组双元载体1301-SH-gpd，其特征在于：包括以下步骤：

(1)利用冻融法将所述的重组双元载体1301-SH-gpd转入根癌农杆菌AGL-1感受态，培养获得阳性菌，

(2)将培养好的桑黄菌丝无菌条件下粉碎，随后将液体菌丝离心，弃上清，收集沉淀菌丝；

(3)含不同浓度潮霉素：0μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL的PDA平板上接种桑黄菌丝，得到适用于桑黄遗传转化的潮霉素浓度；

(4)将含有重组双元载体1301-SH-gpd的AGL-1农杆菌菌液加入到100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中；将培养好的菌液离心，弃上清，沉淀用IM培养基重悬，得到侵染液；

(5)取步骤(4)得到的侵染液侵染步骤(2)得到的桑黄菌丝，共培养36h；

(6)在步骤(5)得到的共培养菌丝上覆盖低熔点PDA培养基培养，长出新菌落，随后将菌落转移至新的含有适用于桑黄遗传转化浓度的潮霉素的PDA培养基培养，选取长势旺盛的菌落提取DNA，利用PCR技术鉴定阳性菌株。

4.根据权利要求3所述的一种根癌农杆菌介导的桑黄遗传转化方法，其特征在于：所述的适用于桑黄遗传转化的潮霉素浓度为4μg/mL。

5.根据权利要求3或4所述的一种根癌农杆菌介导的桑黄遗传转化方法，其特征在于：步骤(6)利用PCR技术鉴定阳性菌株的方法如下：

设计引物：

J1-F，其序列如SEQ ID No:7所示

J1-R，其序列如SEQ ID No:8所示

和

J2-F：其序列如SEQ ID No:9所示

J2-R:其序列如SEQ ID No:10所示；

以重组双元载体1301-SH-gpd、转化子和野生型DNA为模板进行PCR扩增，结果显示，从转化子和重组双元载体1301-SH-gpd都能扩增出253bp和1013bp的预期DNA片段，但野生型中没有扩增产物，说明重组双元载体上的外源DNA片段已经整合到了桑黄转化子的基因组中。

6.根据权利要求3或4所述的一种根癌农杆菌介导的桑黄遗传转化方法，其特征在于：步骤(1)中重组双元载体1301-SH-gpd转入根癌农杆菌AGL-1感受态，28℃培养1-2天。

7.根据权利要求3或4所述的一种根癌农杆菌介导的桑黄遗传转化方法，其特征在于：步骤(2)菌丝匀浆20s，随后将菌丝置于离心管，5000rpm离心10min，收集沉淀菌丝。

8.根据权利要求3或4所述的一种根癌农杆菌介导的桑黄遗传转化方法，其特征在于：步骤(4)培养至OD₆₀₀为0.5-0.6，将培养好的菌液5000rpm离心10min弃上清，沉淀用IM培养基含有200μmol/L乙酰丁香酮和20μL 25％吐温80，重悬至OD₆₀₀为0.6-0.7。

9.根据权利要求8所述的一种根癌农杆菌介导的桑黄遗传转化方法，其特征在于：步骤(5)侵染液侵染步骤(2)的桑黄菌丝20min后，5000rpm离心10min，收集沉淀，0.2g沉淀物用1mL侵染液重悬，取200μL混合液体接种于含有200μmol/L乙酰丁香酮的Co-IM培养基，每个培养基约含有1.6×10⁵个菌丝片段，共培养36h，培养温度为25℃。

10.根据权利要求3或4所述的一种根癌农杆菌介导的桑黄遗传转化方法，其特征在于：步骤(6)首先将低熔点PDA培养基溶化后，冷却至29-30℃，在步骤(5)得到的共培养菌丝上覆盖含有4μg/mL潮霉素和300μg/mL头孢噻肟钠的低熔点PDA培养基，培养3-4天，长出新菌落，随后将菌落转移至新的含有4μg/mL潮霉素的PDA培养基，培养5-7天，选取长势旺盛的菌落提取DNA，利用PCR技术鉴定阳性菌株。

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