CN110643515A

CN110643515A - 转基因絮凝微藻的构建及其制备方法

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Publication number: CN110643515A
Application number: CN201910000963.4A
Authority: CN
Inventors: 郭锁莲; 邹蒙; 张平; 张硕硕
Original assignee: Shenyang University of Chemical Technology
Current assignee: Shenyang University of Chemical Technology
Priority date: 2019-01-02
Filing date: 2019-01-02
Publication date: 2020-01-03

Abstract

转基因絮凝微藻的构建及其制备方法，涉及一种生物基因构建及其制备方法，具体而言，本发明涉及构建可诱导表达絮凝基因的表达载体，将其转入微藻中，获得转基因自絮凝微藻。本发明所获得的转基因藻表现出正常生长，而在收获期通过热诱导表现出自絮凝现状，利于微藻收集以及下游生物炼制的处理。本发明包括诱导型絮凝微藻的构建及其在微藻采收中的应用。本发明成功构建了微藻转化平台。通过本发明能够有效的将酵母絮凝基因FLO1重组到不同藻株中，并通过筛选获得基因突变藻株，实现了微藻转化基因工程技术的重点突破。

Description

转基因絮凝微藻的构建及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物基因构建及其制备方法，特别是涉及一种转基因絮凝微藻的构建及其制备方法。

背景技术

微藻多为单细胞或简单多细胞的光合微生物，可以利用空气中的二氧化碳、工业废气中的二氧化碳或者碳酸盐来生产有机物，因此可用于食品、饲料及精细化学品的生产。随着世界经济的快速发展，能源的消耗和供应不足的矛盾日益突出，以石油为基础的化石燃料已经明显不能满足人类日益增长的能源需求，而且化石燃料的使用是全球温室效应中二氧化碳的主要来源，因此，寻求新型清洁能源的开发和利用对于缓解能源危机-保护环境以及经济的可持续发展具有重要的战略意义。而受技术和资源等因素的限制，核能、风能和太阳能等自然能源，还无法替代石油等传统化石能源。

生物柴油作为近年来再生能源的新生力量，因其热值接近石油，而且对环境友好（N、S含量低），发展迅速，在能源市场所占比例稳步提升，但是原料不足俨然已经成为国内外生物柴油大规模生产的瓶颈。目前主要以大豆、甘蔗以及玉米淀粉等油料作物为原料来炼制生物柴油，由于油料作物油脂面积产油率不高，生物柴油的大规模生产必然会导致这类可食用原料的大面积种植进而影响粮食生产。

同油料作物相比，微藻作为大力发展生物柴油的优质原料具有以下几个优点：（1）微藻生长速度快，多数藻类油脂含量高，多为低不饱和自然脂肪，如栅藻（Scenedesmussp.）油脂含量为20-21%（w/w），油脂产率为41-54（mg/l/天），小球藻（Chlorella sp.）油脂含量为19-22%（w/w），油脂产率在45（mg/l/天）左右；（2）同油料作物相比，微藻培养不需要占用耕地；（3）微藻拥有跟高等植物类似的CO₂固定系统并将其转化成碳水化合物以及脂类，如甘油三酯（TGA）；（4）微藻能吸收工业生产等排放的二氧化碳同时释放氧气，对于降低温室效应维持环境稳定有重要作用。

除了能作为生物柴油的原料外，微藻本身还含有高附值产品。栅藻（Scenedesmussp.）和小球藻（Chlorella sp.）蛋白干重含量分别为50-56%、51-58%。微藻还可以用来发酵生产沼气，丙酮丁醇；从微藻体内提取纯化的ω-3脂肪酸是高价值的食品添加剂；有报道称小球藻内含有大量的色素，而藻株内的色素能作为药膏内的螯合剂以及溃疡和损伤组织的恢复起着重要作用，同时也是食品颜色的添加剂的天然原料；由于藻株本身含有蛋白等多种营养物质，可以作为鱼饵、家禽家畜饲料以及农作物的肥料等。

微藻不仅可以作为生物柴油炼制的优质原料，还是多种高附值产品的加工厂。但目前存在的问题是微藻生物柴油的生产成本过高。其中，微藻采收的成本占生产成本的比重很大，限制了微藻能源及精细化学品的工业化生产。

由于微藻自身特点，如大小约为5到50μm，并且细胞密度低，为15到108g/L，含水量很大，目前微藻采收的方法主要有气浮法，过滤法，离心法及化学絮凝法。气浮法耗能大成本高；过滤法依赖于藻细胞大小，不适用大规模微藻收集；而基于藻密度不同于培养液采用的离心法，沉淀中会含有大量水分，增加下游处理费用；虽然目前化学絮凝能达到较好的微藻收集效果，而且有些已经工业化，但是大量金属离子以及难降解高聚合物的添加无疑是对环境的二次污染；虽然有报道微生物絮凝剂在微藻采收中应用，但生物安全性未知。因此，开发微藻低成本采收方法是进行微藻生物炼制及大规模工业化生产微藻能源的重要保证。

某些微藻具有细胞自絮凝的能力，推测是在培养过程中，藻体合成分泌某种物质从而使自身沉降。同传统絮凝方法相比，微藻细胞的自絮凝无需外源物质加入，无能耗无污染，环境友好。微藻多以非絮凝种类为主，天然絮凝藻株并不多，通过基因工程的方法改造现有的非絮凝藻株让其表现出絮凝形状从而达到微藻收集的目的。利用微藻自絮凝进行微藻采收是有应用前途的微藻收集方法，目前鲜有关于将絮凝基因转入非絮凝微藻的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种转基因絮凝微藻的构建及其制备方法，本发明成功构建了微藻转化平台。通过本发明能够有效的将酵母絮凝基因FLO1重组到不同藻株中，并通过筛选获得基因突变藻株，实现了微藻转化基因工程技术的重点突破。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

转基因絮凝微藻的构建，包括一种表达载体，所述表达载体含有来自酵母的絮凝基因，与所述絮凝基因操作性连接的、位于所述絮凝基因上游的诱导型启动子和筛选标记基因之间；所述絮凝基因选自：

（1）编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和

（2）在严格条件下与（1）所限定的核苷酸序列杂交且编码具有絮凝活性的蛋白质的核苷酸序列。

所述的转基因絮凝微藻的构建，所述载体含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列、HSP70A启动子和氯霉素抗性基因。

所述的转基因絮凝微藻的构建，所述表达载体选自：

（1）SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；和

（2）与SEQ ID NO:3具有至少80％序列相同性的核苷酸序列。

所述的转基因絮凝微藻的构建，所述转基因絮凝微藻的构建包括转基因自絮凝藻类细胞，所述细胞稳定转化了表达载体，并具有可诱导的自沉降性能。

所述的转基因絮凝微藻的构建，所述藻类细胞，藻选自栅藻。

所述的转基因絮凝微藻的构建，所述藻类细胞，藻类细胞为保藏编号为保藏号为CGMCC No. 5905小球藻藻细胞。

一种转基因絮凝微藻的制备方法，所述方法包括：

（1）将如上所述表达载体转入所述微藻；和

（2）筛选具备絮凝性能的微藻。

所述的一种转基因絮凝微藻的制备方法，所述方法包括：

(a) 收集对数生长期的微藻细胞，重悬在渗透缓冲液中；

(b) 热击(1)中获得的细胞热击，于冰上放置；

(c) 将(2)中处理后的细胞与权利要求1-4中任一项所述的表达载体和鲑鱼精DNA混合，并于冰上放置；

(d) 将细胞重悬，对其实施超声波介导法或电击法处理；和

(e) 将步骤（d）的细胞转入新鲜配制的DM培养基中暗培养，然后转入含有抗生素的DM液体培养基中培养，筛选获得所述转基因自絮凝微藻。

所述的转基因絮凝微藻的构建及其制备方法，一种转基因絮凝微藻的表达载体在制备转基因自絮凝藻类细胞中应用。

本发明的优点与效果是：

本发明成功构建了微藻转化平台。通过本发明能够有效的将酵母絮凝基因FLO1重组到不同藻株中，并通过筛选获得基因突变藻株。与现有的技术相比，本发明实现了微藻转化基因工程技术的重点突破，具有如下有益效果：

1．本发明证明了HSP70A启动子在栅藻中可启动外源基因的表达。

2．在筛选标记方面，本发明的实验证明淡水栅藻藻株对氯霉素敏感，采用一种可行的选择标记基因和报告基因组合是本发明的一技术特点。

3．本发明构建了酵母絮凝基因的微藻表达载体pSLG06，并实现了外源基因在栅藻和小球藻中的稳定表达。

附图说明

图1显示表达载体构建的示意图；

图2显示克隆获得酵母絮凝基因FLO1；

图3显示抗生素筛选转化子；

其中，1：野生型栅藻细胞；2：转入pCAMBIA 1302-HSP的转化子；3：转入pCAMBIA 1302-HSP-FLO1的转化子。

图4显示扫描电镜观察栅藻细胞表型变化；

1,4：野生型栅藻细胞；2,5：转入pCAMBIA 1302-HSP的转化子；3,6：转入pCAMBIA 1302-HSP-FLO1的转化子。

图5显示荧光电镜观察栅藻表型变化；

其中，左：野生型栅藻细胞；中：转入pCAMBIA 1302- HSP的转化子；右：转入pCAMBIA1302- HSP -FLO1的转化子。

图6显示PCR 和 RT-PCR 分析酵母絮凝基因FLO1在转基因栅藻细胞中的表达。

其中，左图为PCR分析酵母絮凝基因 FLO1在转基因栅藻细胞中表达情况；右图为RT-PCR酵母絮凝基因 FLO1在转基因栅藻细胞中表达情况。图中，M：1kb ladder marker(TaKaRa Bio Inc., Japan)；W：野生型栅藻细胞；T, T1转入pCAMBIA 1302-HSP-FLO1的栅藻细胞；C：转入pCAMBIA 1302-HSP的栅藻细胞；P：质粒pCAMBIA 1302-HSP-FLO1。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

本发明的目的是建立微藻改造平台及其在微藻采收中的应用。

本发明首先将酵母絮凝基因FLO1重组到诱导型启动子和报告基因gfp基因之间，然后插入含有选择标记基因的质粒中，构建转化用的载体，通过电转的方法转质粒入示例性的非絮凝淡水小球藻，经过抗生素筛选和荧光检测，获得阳性转化子。

本发明所获得的转基因藻表现出正常生长，而在收获期通过热诱导表现出自絮凝现状，利于微藻收集以及下游生物炼制的处理。本发明建立的转化平台转化效率高，适用于不同藻株，而且所获得的基因工程藻株具有遗传稳定性。

因此，本发明第一方面提供一种诱导型的表达载体，所述表达载体含有来自酵母的絮凝基因，与所述絮凝基因操作性连接的、位于所述絮凝基因上游的诱导型启动子和抗性筛选标记基因。

在一个具体实施例中，所述来自酵母的絮凝基因是酵母絮凝基因FLO1、FLO5、FLO9或FLO10。在一个具体实施例中，所述酵母絮凝基因如CN 200910200097.X的SEQ ID NO:1所示。

在一个具体实施例中，所述絮凝基因选自：

（1）编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和

在一个具体实施例中，所述载体含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列、HSP70A启动子和氯霉素抗性基因。

在一个具体实施例中，所述表达载体选自：

（1）SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；和

（2）与SEQ ID NO:3具有至少80％序列相同性的核苷酸序列。

本发明第二方面提供一种转基因自絮凝藻类细胞，所述细胞稳定转化了本发明所述的表达载体，并具有自沉降性能。

在一个具体实施例中，所述藻选自小球藻。

在一个具体实施例中，所述藻类细胞为保藏编号为CGMCC No. 5905的淡水小球藻细胞。

本发明第三方面提供一种制备转基因自絮凝微藻的方法，所述方法包括：

（1）将本发明所述的表达载体转入所述微藻；和

（2）筛选具备絮凝性能的微藻。

在一个具体实施例中，本发明制备转基因自絮凝微藻的包括：

(a) 收集对数生长期的微藻细胞，重悬在渗透缓冲液中；

(b) 热击(1)中获得的细胞热击，于冰上放置；

(c) 将(2)中处理后的细胞与本发明所述的表达载体和鲑鱼精DNA（否）混合，并于冰上放置；

(d) 将细胞重悬，对其实施超声波介导法或电击法处理；和

本发明第四方面提供本发明所述表达载体在制备转基因自絮凝藻类细胞中的应用。

本发明的絮凝基因包括酵母絮凝基因FLO1（SEQ ID NO:1）、FLO5、FLO9和FLO10。在一个具体实施例中，所述酵母絮凝基因如CN 200910200097.X的SEQ ID NO:1所示。在一具体实施例中，本发明的絮凝基因编码本申请SEQ ID NO:2或CN 200910200097.X的SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列。

本发明包括与本发明絮凝基因高度同源的核苷酸序列，或在严格条件下与本发明絮凝基因杂交的核苷酸序列。提到核苷酸序列时，本文所用的“高度同源”可以指与所提及序列的相同性为至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%的核苷酸序列。本发明的核苷酸序列可以是本发明絮凝基因（例如本发明的SEQ ID NO：1和CN 200910200097.X的SEQ ID NO:1）的简并变异体。如本文所用，“简并变异体”在本发明中是指编码包含本发明SEQ ID NO：2或CN 200910200097.X的SEQ ID NO:2的氨基酸序列，但与本发明SEQ ID NO：1或CN 200910200097.X的SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列有差别的核苷酸序列。

在相同性分析中可辅助使用易于获得的计算机程序，如ALIGH、Dayhoff、M.O.(Atlas of Protein Sequence and Structure、M.O.Dayhoff编辑，5 Suppl.，3：353-358，National Biomedical Research Foundation，Washington，DC)，它适用于Smith和Waterman分析肽用的局部同源性算法(Advances in Appl. Math.，2：482-489，1981)。可从Wisconsin Sequence Analysis Package(第8版，从Genetics Computer Group，Madison，WI获得)获得测定核苷酸序列同源性的程序，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，这些程序也依赖于Smith和Waterman算法。使用制造者建议的和上述Wisconsin Sequence AnalysisPackage所述的默认参数可容易地使用这些程序。例如，可使用Smith和Warerman的同源性算法的默认计分表和6个核苷酸位置的间隔罚分(gap penalty)测定的核苷酸序列与参比序列的同源性百分数。

本发明还涉及本发明絮凝基因（如本发明SEQ ID NO:1或CN 200910200097.X的SEQ ID NO:1）的变异体，其编码与本发明SEQ ID NO：2或CN 200910200097.X的SEQ ID NO:2有相同的氨基酸序列的絮凝基因的片段、类似物、衍生物和变异形式。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码本发明脂肪酶的多核苷酸。

本发明还包括与本发明絮凝基因对应的RNA序列，和在严格条件下与本发明絮凝基因或所述RNA序列杂交的分子。

如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1%SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50%，优选55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更优选是95%以上时才发生杂交。例如，所述序列可为(a)中所限定序列的互补序列，或者可以是与(a)中所限定序列的互补性为至少50%、优选55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更优选是95%以上的序列。

“编码序列”或“编码”选定多肽的序列，是指当处于适当的调节序列的控制下时，一种核酸分子在体外或体内被转录(对于DNA)和翻译(对于mRNA)成一种多肽。该编码序列的界限可由5'(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子来确定。转录终止序列可以位于该编码序列的3'端。

“可操作性连接”指元件的排列，其中所述成分被排成一定的形状，以便执行它们所需的功能。因而，可操作性连接于编码序列的给定的启动子，在正确的转录因子等存在时，能使该编码序列有效表达。该启动子不需要与该编码序列邻接，只要它起到指导该序列表达的功能即可。因此，例如不参与翻译但转录的序列可存在于启动子序列和编码序列之间，与可转录的内含子一样；并且仍可认为该启动子序列“可操作性连接”于该编码序列。

本发明的载体除含有编码序列外，还可含有各种控制元件。“控制元件”指帮助与其连接的编码序列表达的多核苷酸序列。该术语包括启动子、转录终止序列、上游调节结构域、聚腺苷酸化信号、非翻译区域(包括5'-UTR和3'-UTR)，适当时还有前导序列和增强子，这些序列共同地为宿主细胞中的编码序列的转录和翻译创造条件。

“启动子”在本文中指能结合宿主细胞中的RNA聚合酶并启动与之操作性连接的下游(3'方向)编码序列的转录的DNA调节区域。用于本发明的启动子序列包括以高于背景值的可检测的水平启动感兴趣的基因的转录所需的最小数量的碱基或元件。在该启动子序列中有转录启始位点以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。真核细胞启动子常常(但不总是)含有“TATA”框和“CAT”框。本发明使用的表达载体的启动子可为HSP，它的使用使目的基因在微藻中可诱导表达。

控制序列在RNA聚合酶结合启动子序列时“指导转录”细胞中的编码序列，并将该编码序列转录成mRNA，之后该mRNA被翻译成由该编码序列编码的多肽。

本文中，“表达盒”或“表达构建物”指能指导感兴趣的序列或基因的表达的装配。该表达盒包括上述控制元件，如操作性连接于感兴趣的序列或基因(以指导其转录)的启动子，该表达盒还常常包括多腺苷酸化序列。在本发明的某些实施例中，在此所述的表达盒可被包含在本发明的表达载体（即质粒构建物）中。除了该表达盒的组分外，该质粒构建物还含有一种或多种可选择的标记物、使该质粒构建物以单链DNA(如M13复制源)存在的信号、至少一个多克隆位点和“哺乳动物”复制源(如SV40或腺病毒复制源)。

“转化”在本文中指将外源多核苷酸（例如本发明所述的表达载体）插入宿主细胞中。可用本领域熟知的各种基因送递的方法，将包含感兴趣的核苷酸序列的核酸分子稳定地整合入宿主细胞基因组中或在合适的宿主细胞中的稳定的附加型元件上维持。参见如美国专利No.5,399,346。表达载体导入受体微藻细胞的方法可包括电击法、超声法等方法。

“宿主细胞”是已被转化的细胞，或者能被外源DNA序列转化的细胞。各种藻类细胞可用于本发明，包括但不限于微藻类，如绿藻门小球藻属中的蛋白核小球藻（Chlorellapyrenoidosa），普通小球藻（Chlorella vulgaris），椭圆小球藻（Chlorellaellipsoidea），Chlorella emersonii，Chlorella sorokiniana，Chlorellasaccharophila，Chlorella regularis，Chlorella minutissima，Chlorellaprotothecoides，Chlorella zofingiensis，以及绿藻门中的Brachiomonassubmarina，Chlamydobonasreinhardtii，Chlamydomonasacidophila，Haematococcuspluvialis，Haematococcuslacustris，Scenedesmusobliquus，Spongiococcum exetriccium，Tetraselmis suecica，Tetraselmis chuii，Tetraselmis tetrathele，Tetraselmisverrucosa， Micractinium pusillum；硅藻门的Cylindrotheca fusiformis，Nitzschialaevis，Nitzschia alba，Nitzschia fonticola，Navicula incerta，Naviculapelliculosa；蓝藻门的Anabaena variabilis；金藻门的Poterioochromonasmalhamensis；甲藻门的Amphidinium carterae，Crypthecodinium cohnii；裸藻门的Euglena gricilis；和红藻门的Galdieria sulphuraria。适用于本发明的微生物还包括被孢霉属（Mortierella），破囊壶菌属（Thraustochytrium），裂殖壶菌属（网粘菌纲）（Schizochytrium（Labyrinthulomycetes）），吾肯氏壶藻属（Ulkenia）等。本发明特别优选的是栅藻（Scenedesmus sp.）和小球藻（Chlorella sp.）。

本发明中，一旦制备或分离了编码序列，就可将这些序列克隆入任何合适的载体或复制子中。对本领域技术人员而言，各种克隆载体是已知的，且适当的克隆载体的筛选只是选择问题。合适的载体包括(但并非限制于)：质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体或当与适当的控制元件结合时能复制的病毒。

然后将克隆序列置于合适的控制元件的控制下，这取决于用于表达的系统。因此，可以将编码序列置于启动子、核糖体结合位点(用于细菌表达)和任选地操纵子的控制下，从而由合适的转化体将感兴趣的DNA序列转录到RNA中。该编码序列可以包含或不包含信号肽或前导序列(随后可由宿主在翻译后加工除去)。

除了控制序列外，可以添加调节序列，从而可以相对于宿主细胞的生长调节序列的表达。调节序列是本领域技术人员已知的，其实例包括那些能导致应答化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)启动或关闭基因表达的调节序列。载体中还可存在其它类型的调节元件。例如，可以使用增强子元件以增加构建物的表达水平。实例包括SV40早期基因增强子(Dijkema等(1985)EMBO J.4:761)；从Rous肉瘤病毒的长末端重复序列(LTR)衍生的增强子/启动子(Gorman等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6777)；和从人CMV衍生的元件(Boshart等，(1985)Cell 41:521)，如CMV内含子A序列中包括的元件(美国专利No.5,688,688)。表达盒中还可包括在合适的宿主细胞中自主复制的复制起点、一种或多种可选择的标记物、一个或多个限制酶切位点、高拷贝数量的势能和强启动子。

构建表达载体，使具体的编码序列位于该具有适合调节序列的载体中，与控制序列有关的编码序列的位置和取向使编码序列在控制序列的“控制”下转录(即，结合于控制序列中DNA分子的RNA聚合酶转录该编码序列)。可能需要对编码感兴趣分子的序列进行修饰来实现此目的。例如，在一些情况中可能需要修饰该序列，从而使其连接于适合取向的控制序列，即维持读框。在插入到载体之前，控制序列和其它调节序列可能连接于编码序列。或者，可以将编码序列直接克隆入已包含控制序列和合适的限制酶切位点的表达载体中。

在其它实施例中，适用于本发明的酵母菌的絮凝基因可包括FLO1（SEQ ID NO：1）、FLO5、FLO9、FLO10（ZhaoXQ, Li Q, He LY, Li F, Que WW, Bai F, Exploration of anatural reservoir of flocculating genes from various Saccharomyces cerevisiaestrains and improved ethanol fermentation using stable genetically engineeredflocculating yeast strains, Process Biochemistry, 2011.in press, FranziskaHeine, Frank Stahl, Heike Str äuber, Claudia Wiacek, Dirk Benndorf, CorneliaRepenning, Frank Schmidt, Thomas Scheper, Martin von Bergen, Hauke Harms,Susann Müller. Prediction of flocculation ability of brewing yeast inoculatesby flow cytometry, proteome analysis, and mRNA profiling. Cytometry Part A2009.75A: 140-147.）等基因或者序列相似的功能基因，例如，如前文所述具有一定序列相同性或在严格条件下与这些絮凝基因杂交的核苷酸序列，这些基因编码可糖基化的絮凝蛋白。可用这些絮凝基因来构建本发明的表达载体，然后转入藻类细胞中，筛选得到稳定表达絮凝蛋白、具有絮凝性能的藻类细胞。

因此，本申请提供一种获得转基因自絮凝微藻的方法，该方法包括：（1）从絮凝酵母克隆絮凝基因，并用所述絮凝基因构建表达载体；和（2）将表达载体（通过例如电击处理）转化入微藻细胞中；从而可获得转基因自絮凝微藻。

进一步的，本发明的方法还可包括：（3）复苏和确认转基因絮凝微藻；和任选的，（4）采收转基因絮凝微藻的细胞。

絮凝基因的克隆包括从酵母菌或者其他生物细胞中扩增具有细胞自絮凝功能的絮凝基因，本发明以从絮凝酵母中克隆的FLO1基因为例进行絮凝基因表达载体的构建（具体可参见CN 200910200097.X，本文以引用的方式将该文纳入本文）。

表达载体可包括pCAMBIA1301等植物基因工程表达载体，以及其他可在微藻中使用的表达载体，表达载体的必要遗传学元件包括启动子，抗性基因，多克隆位点等。本发明使用的为含有以pCAMBIA1301为基础改造的含有HSP 诱导型启动子，GFP报告基因，氯霉素抗性基因CAT的表达载体。

表达载体导入受体微藻细胞的方法可包括电击法、超声法等方法。本发明提供一种微藻（例如小球藻）的遗传转化方法或转基因自絮凝微藻的制备方法，具体步骤包括：

(a) 收集对数生长期的微藻细胞，重悬在渗透缓冲液中；

(b) 热击(1)中获得的细胞热击，于冰上放置；

(d) 将细胞重悬，对其实施超声波介导法或电击法处理；和

本发明使用的渗透缓冲液可以是本领域常用的渗透缓冲液。示例性的渗透缓冲液含有例如0.2M-0.3M的甘露醇，0.2M-0.3M的山梨醇和10-15%甘油。通常以大约107-108个细胞每毫升的细胞密度重悬微藻细胞。

热击通常在例如38-45℃的温度下进行。在一具体实施例中，在42℃进行热击。热击时间通常控制在大约1-10分钟左右。热击后于冰上放置数分钟（例如3-8分钟，例如5分钟）。

然后，将冰上放置数分钟的细胞与本发明的表达载体和鲑鱼精DNA混合。混合的量可根据实际情况选择。在一具体实施例中，将大约400微升的细胞溶液与大约10μg/mL的本发明表达载体以及大约25μg/mL的鲑鱼精DNA混合，混合后通常置于冰上数分钟（例如3-8分钟，例如5分钟）。

然后，将细胞重悬，对其实施电击法处理。对于电击处理，可吸取适量（例如0.4-1mL）重悬的细胞放入预冷电击小杯中，按照设置的各种条件组合进行电击.在其它条件不变的情况下，分别梯度改变高渗缓冲液浓度、表达载体、脉冲电压和脉冲持续时间这4个参数，对电击参数进行优化。一种优化的电击转换条件为：表达载体浓度50g/mL，高渗缓冲液浓度0.2 mol/L，脉冲距离为2 mm，脉冲电压为2 Kv，脉冲持续时间为3ms。

电击法处理后，将细胞转入适量（例如10-30 毫升）新鲜配制的DM培养基中，在25℃下进行暗培养，培养时间大约18-36（例如24小时）小时，然后转入含有抗生素例如（50 μg/mL氯霉素）的DM液体培养基中。

示例性的中DM培养基的成分为(克/升)：Ca(NO3)2•4H2O, 1.00; KH2PO4, 0.26;MgSO4•7H2O, 0.55; KCl, 0.25; FeSO4•7H2O, 0.02; EDTA•2Na, 0.2; H3BO3, 0.0029;ZnCl2, 0.00011; MnCl2•4H2O, 0.00181; (NH4)6Mo7O24•4H2O, 0.000018; CuSO4•5H2O,0.00008。

转基因絮凝微藻的复苏和确认包括将转化后的微藻涂布在含有氯霉素的平板上，调取单克隆，在含有氯霉素的液体培养基中培养7-14天，此时细胞为绿白色，然后转入不含有抗生素的液体培养基中继续培养7-14天，细胞生长状态可逐渐转变成活跃，细胞转绿，并可观察到絮凝性状，此时再更换培养基，转化子的絮凝性状逐渐增强，可明显观察到絮凝细胞团（可见图4）。由于报告基因可监测转化效率，在荧光显微镜下可观察到，含有绿色荧光蛋白的空载体在栅藻细胞中发出绿色荧光，证明转化成功，此外，可观察到絮凝细胞团内的绿色荧光（图6），证明酵母菌絮凝基因的表达。

微藻的自絮凝采收包括将含有自絮凝基因的微藻细胞，在45℃处理30min细胞聚集成团迅速自沉降，而对照游离藻种在同样的处理条件下没有出现自沉降现象，因此证明构建获得诱导表达的转基因絮凝藻，可通过细胞自沉降采收，方便而简单。

实施例1：絮凝基因的克隆和表达载体的构建

（1）目的基因克隆（可参见CN 200910200097.X中实施例1和3的方法）

根据实验室絮凝酵母SPSC01的絮凝基因 FLO1序列设计引物：

Infusion3_F: GGACTCTTGACCATGGATGACAATGCCTCATCGCTATATG（SEQ ID NO:4）；和

Infusion3_R: CTCACATCTACCATGGTTAAATAATTGCCAGCAATAAGGAC（SEQ ID NO:5）。

PCR反应程序如下: 95℃变性5 min, 95℃变性30, 55℃退火30 s, 72°C延伸5min，10 个循环, 随后进行20个如下的循环95°C变性30 s, 60℃退火30 s72℃延伸5min, 最后 72℃延伸10 min,用的是全式金的 Taq High Fidelity (HiFi) PCRSuperMix Ⅱ(TransGenBiotech, Beijing, China)。如图3所示克隆获得5.2 Kb酵母絮凝基因FLO1（SEQ ID NO:1）。

（2）表达载体的构建

本研究采用植物中广泛应用的表达载体pCAMBIA1302作为载体骨架，其基因序列中含有强启动子HSP70A及报告基因gfp，在原核生物中的筛选标记卡那抗性基因，真核中的筛选标记潮霉素抗性基因。经过小球藻的敏感性测试，发现其对氯霉素敏感，因此通过Infusion方法将pCAMBIA1302载体上潮霉素抗性基因替换成氯霉素抗性基因，随后又将酵母的絮凝基因连接到载体强启动子HSP70A下游，报告基因gfp上游，具体流程如图1所示。

实施例2：表达载体通过电击处理转化入微藻细胞

目前应用于微藻转化方法有激光微束穿孔法、电击法、基因枪法、农杆菌侵染法、微玻璃珠研磨法等，本研究分别使用了超声波介导法和电击法对微藻进行了转化。

电击法转化栅藻

I.受体材料的准备

取培养到指数期的非絮凝小球藻培养液150 mL，5000 rpm离心10 min，收集藻细胞。用预冷的高渗缓冲液(0.2 mo1/L甘露醇，0.2 mo1/L山梨醇，10%甘油)洗藻体3次，最后一次冰上放置1 h，5000 rpm离心10 min，收集藻细胞，加电击缓冲液调细胞数至108个/ml，42℃热击10 min,冰浴5 min后，加入终浓度为50 g/mL的实施例1所构建的表达载体与25μg/mL的鲑精DNA混合均匀，冰上放置5-10 min，待超声或电击处理。

II.电击处理

吸取0.4 mL混合好的培养细胞放入预冷电击小杯中，按照设置的各种条件组合进行电击，每种处理重复三次。

电击参数的优化实验：在其它条件不变的情况下，分别梯度改变高渗缓冲液浓度、表达载体、脉冲电压和脉冲持续时间这4个参数。

优化后，电击转化条件的各种处理组合为：实施例1制备的表达载体浓度50 g/mL，高渗缓冲液浓度0.2 mol/L，脉冲距离为2 mm，脉冲电压为2 Kv，脉冲持续时间为3 ms。

实施例3：转基因微藻的复苏和确认

(1) 转基因微藻的复苏

转化完毕，用培养液清洗两次，取0.4 mL混合细胞吸入内含新鲜液体培养基的锥形瓶中，其中一瓶置于适宜条件下连续光照培养18-24 h，另一瓶置于适宜条件下黑暗培养18-24 h。

(2) 转基因絮凝微藻的筛选

b₁将复苏培养的部分藻液转入含适合浓度抗生素的新鲜液体培养基中，另取少量藻液离心后涂布于含适合浓度的抗生素的固体培养基；一个月后挑取第一次在抗性平板上长出的转化子藻落，转接于含有适合浓度的液体培养基扩增培养后，接种于无抗生素的固体培养基上，每过一个月挑取单克隆，把单克隆的一半在无抗生素的液体培养基中扩大培养，另一半接种于无抗生素的固体培养基上，筛选稳定的转基因微藻。

从图4中可以看出野生型的小球藻不能在含有抗生素的培养基中生长，转基因栅藻可以在含有抗生素的培养基正常生长；转入pCAMBIA 1302-HSP-FLO1的转化子培养14天在45℃处理出现了细胞絮凝性状，而转入pCAMBIA 1302-HSP的转化子同样条件下处理并没有此现象，说明酵母絮凝基因FLO1在pCAMBIA 1302-HSP-FLO1的转化子中表达，并引起絮凝这一现象产生。

（3）转基因絮凝微藻的确认

扫描电镜观察转基因絮凝微藻的表型变化

从图4中可以看出培养14天在45℃热处理30min,野生型的栅藻和转入pCAMBIA 1302-HSP的转化子藻细胞呈分散状态存在，而转入pCAMBIA 1302-HSP-FLO1的转化子细胞聚集在一起形成一个较大颗粒与肉眼可见的细胞絮凝性状相一致，从放大倍数较大的图片中可以看出，在细胞表面有层物质，推测这种物质与细胞絮凝性状有关。

荧光显微镜观察转基因絮凝微藻情况

利用荧光显微镜进行观察，培养14天45℃热处理30min的藻株，在蓝光激发下，野生型未转化的藻细胞由于自身叶绿体的荧光呈红色；转基因微藻由于报告基因gfp的表达呈绿色，图5中3的现象是由于未转化的藻细胞粘附在成功表达絮凝基因的转化子上，这种现象与宏观肉眼看到的以及扫描电镜观察到的结果完全一致，进一步证明了絮凝基因的表达。

分子鉴定絮凝基因的表达

在六个月的培养过程中，每两周进行无抗培养，进而得到稳定的转化子。提取野生型栅藻细胞、转基因藻细胞的DNA和RNA，进行PCR及RT-PCR分析。得到的结果如图6所示，在PCR和RT-PCR的电泳图中，转入pCAMBIA1302-HSP-FLO1的转化子有和质粒pCAMBIA 1302-HSP-FLO1同样大小的电泳条带。结果表明酵母基因FLO1只在转入pCAMBIA 1302-HSP-FLO1的转化子有表达，而野生型藻细胞和转入pCAMBIA 1302-HSP的转化子没有表达。

序列表

<110> 沈阳化工大学

<120> 转基因絮凝微藻的构建及其制备方法

<130> 123

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5217

<212> DNA

<213> 絮凝酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 1

atgacaatgc ctcatcgcta tatgtttttg gcagtcttta cacttctggc actaattaat 60

gtggcctcag gagccacaga ggcgtgctta ccagcaggcc agaggaaaag tgggatgaat 120

ataaattttt accagtattc attgaaagat tcctccacat attcgaatgc agcatatatg 180

gcttatggat atgcctcaaa aactaaacta ggttctgtcg gaggacaaac tgatatctcg 240

attgattata atattccttg tgttagttca tcaggcacat ttccttgtcc tcaagaagat 300

tcctatggaa actggggatg caaaggaatg ggtgcttgtt ctaatagtca aggaattgca 360

tactggagta ctgatttatt tggtttctat actaccccaa caaacgtaac cctggaaatg 420

acaggttatt ttttaccacc acagacgggt tcttacacat tcaagtttgc tacagttgac 480

gactctgcaa ttctatcagt aggtggtgct accgcgttcg actgttgtgc tcaacagcaa 540

ccgccgatca catccacaaa ctttacgatt aacggtatca aaccatgggg tggaagtttg 600

ccacctaatg ttgaaggaac agtctacatg tatgctggat tctactaccc aatgaaggtt 660

gtttactcaa atgctgtttc ttggggtaca cttccaatta gtgtgacact gcctgatggt 720

acagctgtca gtgatgactt cgagggatac gtgtattcct ttgatgatga tttgactcaa 780

tctgattgta ccattccaga tccttcaaac tatactatag caggcctaat caccaccacc 840

actgaaccat ggactggtac tttcacttct acatccactg agatgactac tgtcactggt 900

accaacagtc aaccaactga tgaaaccgtt attgttatca gaactccaac tagtgagggt 960

ttgattacaa ccaccactga accatggact ggcactttca cttctacatc tactgagatg 1020

accaccgtca ccggtaccaa cggtcaacca actgacgaaa ccgtgattgt tatcagaact 1080

ccaactagtg agggtttgat tacaaccacc actgaaccat ggactggtac tttcacttct 1140

acatctactg agatgaccac cgtcaccggt actaacagtc aaccaactga tgaaaccgtt 1200

attgttatca gaactccaac tagtgagggt ttgattacaa ccaccactga accatggact 1260

ggcactttca cttctacatc tactgagatg accaccgtca ccggtactaa cggtcaacca 1320

actgacgaaa ccgtgattgt tatcagaact ccaaccagtg aaggtttgat tacaaccacc 1380

actgaagcat ggactggtac tttcacttct acatctactg agatgaccac cgtcaccggt 1440

accaacggtc aaccaactga cgaaaccgtt attgttatca gaactccaac tagtgagggt 1500

ttgattacaa ccaccactga accatggact ggtactttca cctctacgtc tactgagatg 1560

accaccgtca ccggtactaa cggtcaacca actgatgaaa ccgttattgt tatcagaact 1620

ccaaccagtg aaggtctaat cagcaccacc actgaaccat ggactggcac tttcacttct 1680

acatctactg agatgaccac cgtcaccggt accaacggtc aaccaactga tgaaaccgtg 1740

attgttatca gaactccaac cagtgaaggt ttgattacaa ccaccactga accatggaat 1800

ggcactttca cttcgacttc cactgaggtt accaccatca ctggaaccaa cggtcaacca 1860

actgacgaaa ctgtgattgt cattagaact ccaactagtg agggtttgat tactacaact 1920

accgaaccat ggactggtac tttcacttct acatctactg aggttaccac cgtcaccggt 1980

actaatggtc aaccaactga cgaaaccgtt attgttatca gaactccaac tagtgagggt 2040

ttgattacaa ccgccactga accatggact ggtactttca cttctacatc tactgagatg 2100

accaccgtca ccggtactaa cggtcaacca actgatgaaa ccgttattgt tatcagaact 2160

ccaaccagtg aaggtttgat tacaaccacc actgaaccat ggaatggcac tttcacttcg 2220

acttccactg aggttaccac catcactgga accaacggtc aaccaactga cgaaactgtg 2280

attgtcatta gaactccaac tagtgagggt ttgattacta caactaccga accatggact 2340

ggtactttca cttctacatc tactgaggtt accaccgtca ccggtaccaa cggtcaacca 2400

actgacgaaa ccgttattgt tatcagaact ccaactagtg agggtttgat tacaaccacc 2460

accgaaccat ggactggcac tttcacttcg acttccactg agatgaccac catcaccggt 2520

accaacggtc aaccaactga cgaaactgtg attgtcatta gaactccaac tagtgagggt 2580

ttgattacaa ccaccactga accatggact ggtactttca cttctacatc tactgaggtt 2640

accaccgtca ccggtaccaa cggtcaacca actgacgaaa ccgttattgt tatcagaact 2700

ccaactagtg agggtttgat tacaaccacc actgaaccat ggactggcac tttcacttct 2760

acatctactg agatgaccac cgtcaccggt actaacggtc aaccaactga tgaaactgtg 2820

attgttatca gaactccaac cagtgaaggt ttggttacaa ccaccactga accatggaat 2880

ggtactttca cttctacatc tactgagatg accaccgtca ccggtaccaa cggtcaacca 2940

actgacgaaa ccgtgattgt tatcagaact ccaaccagtg aaggtttggt tgcaaccacc 3000

actgaaccat gggctggcac tttcacctct acatccactg agatgaccac cgtcaccggt 3060

actaacggtc aaccaactga cgaaaccgtg attgttatca gaactccaac cagtgaaggt 3120

ttggttgcaa ccaccactga accatggact ggcactttca cctctacatc cactgagatg 3180

accaccgtca ccggtactaa cggtcaacca actgacgaaa ccgtgattgt tatcagaact 3240

ccaaccagtg aaggtttggt tgcaaccacc actgaaccat ggactggcac tttcacctct 3300

acatccactg agatgaccac catcaccggt actaatggtc aaccaactga cgaaaccgtt 3360

attgttatca gaactccaac tagtgagggt ttgattacaa ccaccaccga accatggact 3420

ggcactttca cttcgacttc cactgagatg accaccatca ccggtaccaa cggtcaacca 3480

actgacgaag ctgtgattgt cattagaact ccaactagtg agggtttggt tactacaact 3540

accgaaccat ggactggtac tttcacttcg acttccactg ggatgaccac cgtcaccggt 3600

actaacggtc aaccaactga cgaaaccgtg attgttatca gaactccaac cagtgaaggt 3660

ttggttacaa ccaccactga accatggact ggtactttta cttcgacttc cactgaaatg 3720

tctactgtca ctggaaccaa tggcttgcca actgatgaaa ctgtcattgt tgtcaaaact 3780

ccaactactg ccatctcatc cagtttgtca tcatcatctt caggacaaat caccagctct 3840

atcacgtctt cgcgtccaat tattacccca ttctatccta gcaatggaac ttctgtgatt 3900

tcttcctcag taatttcttc ctcagtcact tcttctctag tcacttcatc tccagtcatt 3960

tcttcttcat tcatttcttc ctctgtcatt tcttcctcta caacaacctc cgcttctata 4020

ttctctgaat catctaaatc atccgtcatt ccaaccagta gttccacctc tggttcttct 4080

gagagcgaaa cgagttcagc tagttctgcc tcttcttcct cttctatctc ttctgaatca 4140

ccaaagtcta catattcgtc ttcatcatta ccacctgtta ccagtgcaac aacaagtcag 4200

gaaattactt cttccttacc acctgttacc agtgcgacag caagccagga aactgcttct 4260

tcattaccac ctgctaccac tacaaaaacg agcgaacaaa ccactttggt taccgtgaca 4320

tcctgcgaat ctcatgtgtg cactgaatcc atctcctctg cgattgtttc cacggccacc 4380

gttactgtta gcggcgtcac aacagagtat accacatggt gccctatttc taccacagag 4440

acaacaagac aaaccaaagg gacaacagag caaaccacag aaacaacaaa acaaaccacg 4500

gtagttacaa tttcttcttg tgaatctgac atatgctcta aaactgcttc tccagccatt 4560

gtgtctacaa gcactgctac tattaacggc gttaccacgg aatacacaac atggtgtcct 4620

atttccacca cagaatcgaa gcaacaaact acgctagtta ctgttacttc ctgcgaatct 4680

ggtgtgtgtt ccgaaactgc ttcacctgcc attgtttcga cggccacggc tactgtgaat 4740

gatgttgtta cggtctatcc tacatggaga ccacagacta cgaatgaaga gtctgtcagc 4800

tctaaaatga acagtgctac cagtgagaca acaaccaata ctgtagctgc tgaaacgact 4860

accaatactg gagctgctga gacaactacc agtactggag ctgctgagac gaaaacagta 4920

gtcacctctt cgctttcaag atctaatcac gctgaaacac agacggcttc cgcgaccgat 4980

gtgattggtc acagcagtag tgttgtttct gtatccgaaa ctggcaacac caagagtcta 5040

acaagttccg ggttgagtac tatgtcgcaa cagcctcgta gcacaccagc aagtagcatg 5100

gtaggatcta gtacagcttc tttagaaatt tcaacgtatg ctggcagtgc caacagctta 5160

ctggccggta gtggtttaag tgtcttcatt gcgtccttat tgctggcaat tatttaa 5217

<210> 2

<211> 1738

<212> PRT

<213> 絮凝酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 2

Met Thr Met Pro His Arg Tyr Met Phe Leu Ala Val Phe Thr Leu Leu

1 5 10 15

Ala Leu Ile Asn Val Ala Ser Gly Ala Thr Glu Ala Cys Leu Pro Ala

20 25 30

Gly Gln Arg Lys Ser Gly Met Asn Ile Asn Phe Tyr Gln Tyr Ser Leu

35 40 45

Lys Asp Ser Ser Thr Tyr Ser Asn Ala Ala Tyr Met Ala Tyr Gly Tyr

50 55 60

Ala Ser Lys Thr Lys Leu Gly Ser Val Gly Gly Gln Thr Asp Ile Ser

65 70 75 80

Ile Asp Tyr Asn Ile Pro Cys Val Ser Ser Ser Gly Thr Phe Pro Cys

85 90 95

Pro Gln Glu Asp Ser Tyr Gly Asn Trp Gly Cys Lys Gly Met Gly Ala

100 105 110

Cys Ser Asn Ser Gln Gly Ile Ala Tyr Trp Ser Thr Asp Leu Phe Gly

115 120 125

Phe Tyr Thr Thr Pro Thr Asn Val Thr Leu Glu Met Thr Gly Tyr Phe

130 135 140

Leu Pro Pro Gln Thr Gly Ser Tyr Thr Phe Lys Phe Ala Thr Val Asp

145 150 155 160

Asp Ser Ala Ile Leu Ser Val Gly Gly Ala Thr Ala Phe Asp Cys Cys

165 170 175

Ala Gln Gln Gln Pro Pro Ile Thr Ser Thr Asn Phe Thr Ile Asn Gly

180 185 190

Ile Lys Pro Trp Gly Gly Ser Leu Pro Pro Asn Val Glu Gly Thr Val

195 200 205

Tyr Met Tyr Ala Gly Phe Tyr Tyr Pro Met Lys Val Val Tyr Ser Asn

210 215 220

Ala Val Ser Trp Gly Thr Leu Pro Ile Ser Val Thr Leu Pro Asp Gly

225 230 235 240

Thr Ala Val Ser Asp Asp Phe Glu Gly Tyr Val Tyr Ser Phe Asp Asp

245 250 255

Asp Leu Thr Gln Ser Asp Cys Thr Ile Pro Asp Pro Ser Asn Tyr Thr

260 265 270

Ile Ala Gly Leu Ile Thr Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe

275 280 285

Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Ser Gln

290 295 300

Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly

305 310 315 320

Leu Ile Thr Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr

325 330 335

Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp

340 345 350

Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Ile Thr

355 360 365

Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu

370 375 380

Met Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Ser Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val

385 390 395 400

Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Ile Thr Thr Thr Thr

405 410 415

Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr

420 425 430

Val Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile

435 440 445

Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Ile Thr Thr Thr Thr Glu Ala Trp

450 455 460

Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly

465 470 475 480

Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro

485 490 495

Thr Ser Glu Gly Leu Ile Thr Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr

500 505 510

Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly

515 520 525

Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu

530 535 540

Gly Leu Ile Ser Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser

545 550 555 560

Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr

565 570 575

Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Ile

580 585 590

Thr Thr Thr Thr Glu Pro Trp Asn Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr

595 600 605

Glu Val Thr Thr Ile Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr

610 615 620

Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Ile Thr Thr Thr

625 630 635 640

Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Val Thr

645 650 655

Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val

660 665 670

Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Ile Thr Thr Ala Thr Glu Pro

675 680 685

Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr

690 695 700

Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr

705 710 715 720

Pro Thr Ser Glu Gly Leu Ile Thr Thr Thr Thr Glu Pro Trp Asn Gly

725 730 735

Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Val Thr Thr Ile Thr Gly Thr Asn

740 745 750

Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser

755 760 765

Glu Gly Leu Ile Thr Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr

770 775 780

Ser Thr Ser Thr Glu Val Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro

785 790 795 800

Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu

805 810 815

Ile Thr Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser

820 825 830

Thr Glu Met Thr Thr Ile Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu

835 840 845

Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Ile Thr Thr

850 855 860

Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Val

865 870 875 880

Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile

885 890 895

Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Ile Thr Thr Thr Thr Glu

900 905 910

Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val

915 920 925

Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg

930 935 940

Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Val Thr Thr Thr Thr Glu Pro Trp Asn

945 950 955 960

Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly Thr

965 970 975

Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr

980 985 990

Ser Glu Gly Leu Val Ala Thr Thr Thr Glu Pro Trp Ala Gly Thr Phe

995 1000 1005

Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Gln

1010 1015 1020

Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly

1025 1030 1035 1040

Leu Val Ala Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr

1045 1050 1055

Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp

1060 1065 1070

Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Val Ala

1075 1080 1085

Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu

1090 1095 1100

Met Thr Thr Ile Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val

1105 1110 1115 1120

Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Ile Thr Thr Thr Thr

1125 1130 1135

Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr

1140 1145 1150

Ile Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu Ala Val Ile Val Ile

1155 1160 1165

Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Val Thr Thr Thr Thr Glu Pro Trp

1170 1175 1180

Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Gly Met Thr Thr Val Thr Gly

1185 1190 1195 1200

Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro

1205 1210 1215

Thr Ser Glu Gly Leu Val Thr Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr

1220 1225 1230

Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Ser Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly

1235 1240 1245

Leu Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Val Lys Thr Pro Thr Thr Ala

1250 1255 1260

Ile Ser Ser Ser Leu Ser Ser Ser Ser Ser Gly Gln Ile Thr Ser Ser

1265 1270 1275 1280

Ile Thr Ser Ser Arg Pro Ile Ile Thr Pro Phe Tyr Pro Ser Asn Gly

1285 1290 1295

Thr Ser Val Ile Ser Ser Ser Val Ile Ser Ser Ser Val Thr Ser Ser

1300 1305 1310

Leu Val Thr Ser Ser Pro Val Ile Ser Ser Ser Phe Ile Ser Ser Ser

1315 1320 1325

Val Ile Ser Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ala Ser Ile Phe Ser Glu Ser

1330 1335 1340

Ser Lys Ser Ser Val Ile Pro Thr Ser Ser Ser Thr Ser Gly Ser Ser

1345 1350 1355 1360

Glu Ser Glu Thr Ser Ser Ala Ser Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ile

1365 1370 1375

Ser Ser Glu Ser Pro Lys Ser Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Leu Pro Pro

1380 1385 1390

Val Thr Ser Ala Thr Thr Ser Gln Glu Ile Thr Ser Ser Leu Pro Pro

1395 1400 1405

Val Thr Ser Ala Thr Ala Ser Gln Glu Thr Ala Ser Ser Leu Pro Pro

1410 1415 1420

Ala Thr Thr Thr Lys Thr Ser Glu Gln Thr Thr Leu Val Thr Val Thr

1425 1430 1435 1440

Ser Cys Glu Ser His Val Cys Thr Glu Ser Ile Ser Ser Ala Ile Val

1445 1450 1455

Ser Thr Ala Thr Val Thr Val Ser Gly Val Thr Thr Glu Tyr Thr Thr

1460 1465 1470

Trp Cys Pro Ile Ser Thr Thr Glu Thr Thr Arg Gln Thr Lys Gly Thr

1475 1480 1485

Thr Glu Gln Thr Thr Glu Thr Thr Lys Gln Thr Thr Val Val Thr Ile

1490 1495 1500

Ser Ser Cys Glu Ser Asp Ile Cys Ser Lys Thr Ala Ser Pro Ala Ile

1505 1510 1515 1520

Val Ser Thr Ser Thr Ala Thr Ile Asn Gly Val Thr Thr Glu Tyr Thr

1525 1530 1535

Thr Trp Cys Pro Ile Ser Thr Thr Glu Ser Lys Gln Gln Thr Thr Leu

1540 1545 1550

Val Thr Val Thr Ser Cys Glu Ser Gly Val Cys Ser Glu Thr Ala Ser

1555 1560 1565

Pro Ala Ile Val Ser Thr Ala Thr Ala Thr Val Asn Asp Val Val Thr

1570 1575 1580

Val Tyr Pro Thr Trp Arg Pro Gln Thr Thr Asn Glu Glu Ser Val Ser

1585 1590 1595 1600

Ser Lys Met Asn Ser Ala Thr Ser Glu Thr Thr Thr Asn Thr Val Ala

1605 1610 1615

Ala Glu Thr Thr Thr Asn Thr Gly Ala Ala Glu Thr Thr Thr Ser Thr

1620 1625 1630

Gly Ala Ala Glu Thr Lys Thr Val Val Thr Ser Ser Leu Ser Arg Ser

1635 1640 1645

Asn His Ala Glu Thr Gln Thr Ala Ser Ala Thr Asp Val Ile Gly His

1650 1655 1660

Ser Ser Ser Val Val Ser Val Ser Glu Thr Gly Asn Thr Lys Ser Leu

1665 1670 1675 1680

Thr Ser Ser Gly Leu Ser Thr Met Ser Gln Gln Pro Arg Ser Thr Pro

1685 1690 1695

Ala Ser Ser Met Val Gly Ser Ser Thr Ala Ser Leu Glu Ile Ser Thr

1700 1705 1710

Tyr Ala Gly Ser Ala Asn Ser Leu Leu Ala Gly Ser Gly Leu Ser Val

1715 1720 1725

Phe Ile Ala Ser Leu Leu Leu Ala Ile Ile

1730 1735

<210> 3

<211> 15406

<212> DNA

<213> 絮凝酵母(Saccharomyces cerevisiae)

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ttaatgtggc ctcaggagcc acagaggcgt gcttaccagc aggccagagg aaaagtggga 120

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atatggctta tggatatgcc tcaaaaacta aactaggttc tgtcggagga caaactgata 240

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aagattccta tggaaactgg ggatgcaaag gaatgggtgc ttgttctaat agtcaaggaa 360

ttgcatactg gagtactgat ttatttggtt tctatactac cccaacaaac gtaaccctgg 420

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ttgacgactc tgcaattcta tcagtaggtg gtgctaccgc gttcgactgt tgtgctcaac 540

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ccaccactga agcatggact ggtactttca cttctacatc tactgagatg accaccgtca 1440

ccggtaccaa cggtcaacca actgacgaaa ccgttattgt tatcagaact ccaactagtg 1500

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agatgaccac cgtcaccggt actaacggtc aaccaactga tgaaaccgtt attgttatca 1620

gaactccaac cagtgaaggt ctaatcagca ccaccactga accatggact ggcactttca 1680

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aatcaccaaa gtctacatat tcgtcttcat cattaccacc tgttaccagt gcaacaacaa 4200

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cttcttcatt accacctgct accactacaa aaacgagcga acaaaccact ttggttaccg 4320

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ccagagtaaa tgagcaaatg aataaatgag tagatgaatt ttagcggcta aaggaggcgg 8520

catggaaaat caagaacaac caggcaccga cgccgtggaa tgccccatgt gtggaggaac 8580

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gcatcgaggc agaagcacgc cccggtgaat cgtggcaagc ggccgctgat cgaatccgca 8820

aagaatcccg gcaaccgccg gcagccggtg cgccgtcgat taggaagccg cccaagggcg 8880

acgagcaacc agattttttc gttccgatgc tctatgacgt gggcacccgc gatagtcgca 8940

gcatcatgga cgtggccgtt ttccgtctgt cgaagcgtga ccgacgagct ggcgaggtga 9000

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gataccggga agggaaggga gacaagcccg gccgcgtgtt ccgtccacac gttgcggacg 9180

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gcctggtgac ggtatccgag ggtgaagcct tgattagccg ctacaagatc gtaaagagcg 9360

aaaccgggcg gccggagtac atcgagatcg agctagctga ttggatgtac cgcgagatca 9420

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aagtgactga tataaaagag aaaaaaggcg atttttccgc ctaaaactct ttaaaactta 9960

ttaaaactct taaaacccgc ctggcctgtg cataactgtc tggccagcgc acagccgaag 10020

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catcttcata ctcttccgag caaaggacgc catcggcctc actcatgagc agattgctcc 11880

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gcatcatgtc cttttcccgt tccacatcat aggtggtccc tttataccgg ctgtccgtca 12000

tttttaaata taggttttca ttttctccca ccagcttata taccttagca ggagacattc 12060

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tcattttagc catttattat ttccttcctc ttttctacag tatttaaaga taccccaaga 12180

agctaattat aacaagacga actccaattc actgttcctt gcattctaaa accttaaata 12240

ccagaaaaca gctttttcaa agttgttttc aaagttggcg tataacatag tatcgacgga 12300

gccgattttg aaaccgcggt gatcacaggc agcaacgctc tgtcatcgtt acaatcaaca 12360

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agctgttggc tggctggtgg caggatatat tgtggtgtaa acaaattgac gcttagacaa 12600

cttaataaca cattgcggac gtttttaatg tactgaatta acgccgaatt aattcggggg 12660

atctggattt tagtactgga ttttggtttt aggaattaga aattttattg atagaagtat 12720

tttacaaata caaatacata ctaagggttt cttatatgct caacacatga gcgaaaccct 12780

ataggaaccc taattccctt atctgggaac tactcacaca ttattatgga gaaactcgag 12840

cttgtcgatc gacagatccg gtcggcatct actttacgcc ccgccctgcc actcatcgca 12900

gtactgttgt aattcattaa gcattctgcc gacatggaag ccatcacaaa cggcatgatg 12960

aacctgaatc gccagcggca tcagcacctt gtcgccttgc gtataatatt tgcccatcgt 13020

gaaaacgggg gcgaagaagt tgtccatatt ggccacgttt aaatcaaaac tggtgaaact 13080

cacccaggga ttggctgaga cgaaaaacat attctcaata aaccctttag ggaaataggc 13140

caggttttca ccgtaacacg ccacatcttg cgaatatatg tgtagaaact gccggaaatc 13200

gtcgtggtat tcactccaga gcgatgaaaa cgtttcagtt tgctcatgga aaacggtgta 13260

acaagggtga acactatccc atatcaccag ctcaccgtct ttcattgcca tacggagttc 13320

cggatgagca ttcatcaggc gggcaagaat gtgaataaag gccggataaa acttgtgctt 13380

atttttcttt acggtcttta aaaaggccgt aatatccagc tgaacggtct ggttataggt 13440

acattgagca actgactgaa atgcctcaaa atgttcttta cgatgccatt gggatatatc 13500

aacggtggta tatccagtga tttttttctc catatctcat tgccccccgg gatctgcgaa 13560

agctcgagag agatagattt gtagagagag actggtgatt tcagcgtgtc ctctccaaat 13620

gaaatgaact tccttatata gaggaaggtc ttgcgaagga tagtgggatt gtgcgtcatc 13680

ccttacgtca gtggagatat cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg ttggaacgtc 13740

ttctttttcc acgatgctcc tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac tgtcggcaga 13800

ggcatcttga acgatagcct ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg tgccaccttc 13860

cttttctact gtccttttga tgaagtgaca gatagctggg caatggaatc cgaggaggtt 13920

tcccgatatt accctttgtt gaaaagtctc aatagccctt tggtcttctg agactgtatc 13980

tttgatattc ttggagtaga cgagagtgtc gtgctccacc atgttatcac atcaatccac 14040

ttgctttgaa gacgtggttg gaacgtcttc tttttccacg atgctcctcg tgggtggggg 14100

tccatctttg ggaccactgt cggcagaggc atcttgaacg atagcctttc ctttatcgca 14160

atgatggcat ttgtaggtgc caccttcctt ttctactgtc cttttgatga agtgacagat 14220

agctgggcaa tggaatccga ggaggtttcc cgatattacc ctttgttgaa aagtctcaat 14280

agccctttgg tcttctgaga ctgtatcttt gatattcttg gagtagacga gagtgtcgtg 14340

ctccaccatg ttggcaagct gctctagcca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg 14400

ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc 14460

aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt 14520

ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat 14580

gaccatgatt acgaattcga gctcggtacc cggggatcct ctagagtcga cctgcaggca 14640

tgcaagcttg gcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac 14700

ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc 14760

ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatgct agagcagctt 14820

gagcttggat cagattgtcg tttcccgcct tcagtttagc ttcatggagt caaagattca 14880

aatagaggac ctaacagaac tcgccgtaaa gactggcgaa cagttcatac agagtctctt 14940

acgactcaat gacaagaaga aaatcttcgt caacatggtg gagcacgaca cacttgtcta 15000

ctccaaaaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg gcaattgaga cttttcaaca 15060

aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc actttattgt 15120

gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc 15180

catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag 15240

catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat 15300

ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat 15360

ataaggaagt tcatttcatt tggagagaac acgggggact cttgac 15406

Claims

1.转基因絮凝微藻的构建，其特征在于，包括一种表达载体，所述表达载体含有来自酵母的絮凝基因，与所述絮凝基因操作性连接的、位于所述絮凝基因上游的诱导型启动子和筛选标记基因之间；所述絮凝基因选自：

（1）编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和

2.根据权利要求1所述的转基因絮凝微藻的构建，其特征在于，所述载体含有SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列、HSP70A启动子和氯霉素抗性基因。

3.根据权利要求1所述的转基因絮凝微藻的构建，其特征在于，所述表达载体选自：

（1）SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；和

（2）与SEQ ID NO:3具有至少80％序列相同性的核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的转基因絮凝微藻的构建，其特征在于，所述转基因絮凝微藻的构建包括转基因自絮凝藻类细胞，所述细胞稳定转化了表达载体，并具有可诱导的自沉降性能。

5.根据权利要求4所述的转基因絮凝微藻的构建，其特征在于，所述藻类细胞，藻选自栅藻。

6.根据权利要求4所述的转基因絮凝微藻的构建，其特征在于，所述藻类细胞，藻类细胞为保藏编号为保藏号为CGMCC No. 5905小球藻藻细胞。

7.一种转基因絮凝微藻的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）将如上所述表达载体转入所述微藻；和

（2）筛选具备絮凝性能的微藻。

8.根据权利要求7所述的一种转基因絮凝微藻的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

(a) 收集对数生长期的微藻细胞，重悬在渗透缓冲液中；

(b) 热击(1)中获得的细胞热击，于冰上放置；

(d) 将细胞重悬，对其实施超声波介导法或电击法处理；和

9.根据权利要求1或7所述的转基因絮凝微藻的构建及其制备方法，其特征在于，一种转基因絮凝微藻的表达载体在制备转基因自絮凝藻类细胞中应用。