CN104039964A - 可调控的基因表达系统及其构建体 - Google Patents

Abstract

用本公开涉及用于对可转录核酸分子的表达进行氮敏感调控的组合物和方法。一个方面提供氮敏感表达系统，所述系统包含：含有NtcA结合位点的转录因子区域；和含有RuBisCo启动子或其变体或功能片段的核心启动子区域。另一方面提供一种通过表达系统来转化宿主细胞的方法。本公开还提供表达盒、转化的宿主细胞以及试剂盒。

Description

可调控的基因表达系统及其构建体

相关申请的交叉引用

本专利申请要求于2011年3月24日提交的美国临时申请序列号61/467,873的优先权权益，该临时申请整体以引用方式并入本文。

以引用方式并入的材料

作为本公开一部分的序列表包括含有本发明核苷酸或氨基酸序列的计算机可读形式。序列表的主题整体以引用方式并入本文。

发明背景

通过发酵大规模产生材料通常受限于与调控基因表达相关的成本。通常，所采用的策略需要昂贵的糖衍生物或其它小分子以触发蛋白的产生，从而得到所需的产物。

启动子是包含5'调控元件的核酸分子，这些元件对活细胞中基因的整体表达起着不可或缺的作用。在宿主细胞或生物中发挥作用的分离的启动子可用于控制可操作地连接的转基因的表达并因而通过基因工程方法修饰宿主生物或细胞表型。

NtcA是具有DNA结合序列(GTAN₈TAC)的蓝细菌氮调节子的主要控制元件。取决于与启动子的相对位置和转录起始位置，NtcA结合可活化或抑制转录（综述于Herrero等2001和Muro-Pastor等2005）。NtcA介导的转录控制受氮碳比的影响，而2-氧代戊二酸则作为效应分子。Emlyn-Jones等(2003)公开了将亚硝酸还原酶启动子用于mutS表达，从而允许通过改变氮源来控制细长聚球藻(Synechococcuselongatus)PCC7942的突变频率。

得自蓝细菌的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCo)启动子被认为是已知最强的启动子之一，因为RuBisCo是在生物圈中以最高的丰度表达的蛋白之一。

发明概述

在本公开的多个方面中提供用于在宿主细胞中表达可转录核酸分子的氮敏感表达系统。

一个方面提供氮敏感表达系统。在一些实施方案中，该表达系统包含：含有NtcA结合位点的转录因子区域；和含有RuBisCo启动子或其变体或功能片段的核心启动子区域。在一些实施方案中，核心启动子区域包含或可操作地连接至转录因子区域。一些实施方案包括可操作地连接至3'转录终止核酸分子的可转录核酸分子。

另一方面提供用于在宿主细胞中表达可转录核酸分子的方法。在一些实施方案中，将宿主细胞通过本文所述的表达系统稳定转化，然后使具有该表达系统的宿主或子代在可转录核酸分子借以表达的条件下生长。该表达系统可提供可转录核酸分子在宿主细胞中的氮调控表达。在一些实施方案中，该可转录核酸分子的表达在硝酸盐为主要氮源时受到抑制而该可转录核酸分子在尿素或氨为主要氮源时得以表达。

另一方面提供表达盒。在一些实施方案中，该表达盒包含：(a)含有NtcA结合位点的转录因子区域；(b)含有RuBisCo启动子或其变体或功能片段的核心启动子区域；(c)可转录核酸分子；和(d)3'转录终止核酸分子；其中核心启动子区域包含或可操作地连接至转录因子区域；核心启动子区域可操作地连接至可转录核酸分子；可转录核酸分子可操作地连接至3'转录终止核酸分子；并且元件(a)-(d)相对于彼此定位使得表达盒在宿主生物中的表达导致产生由可转录核酸分子编码的多肽序列。在一些实施方案中，表达盒包含编码NtcA多肽或NtcB多肽的多核苷酸序列，其位置使得表达盒在宿主生物中的表达导致产生NtcA多肽或NtcB多肽。

另一方面提供转基因宿主细胞。在一些实施方案中，转基因宿主细胞或其子代包含本文所述的表达盒。在一些实施方案中，包含表达系统的转基因宿主细胞或其子代通过表达本文所述的可转录核酸分子的方法产生。在一些实施方案中，转基因宿主细胞包含本文所述的表达盒。

在一些实施方案中，转基因宿主细胞在存在硝酸盐的情况下表达由可转录核酸分子编码的多肽序列；并在存在氨的情况下抑制由可转录核酸分子编码的多肽序列的表达。

在一些实施方案中，转基因宿主细胞在存在氨的情况下表达由可转录核酸分子编码的多肽序列；并在存在硝酸盐的情况下抑制由可转录核酸分子编码的多肽序列的表达。

另一方面提供试剂盒，该试剂盒包含本文所述的表达系统或表达盒的一者或多者以及任选地用于将表达盒引入宿主细胞的说明书。

其它目标和特征在下文将在某种程度上明显并在某种程度上被指出。

附图描述

本领域的技术人员将理解下文所述的附图仅出于示意性目的。这些附图不旨在以任何方式限制本发明教导的范围。

图1是示出质粒pLybAL50（pLybAL19的衍生物）的结构的示意图，其中主要的差异在于asf的GTG起始密码子已被更常规的ATG密码子替换并且His6-标签已附到asf的C端。关于方法的进一步细节在实施例3中公开。

图2是示出“RuBisCo交换”的示意图。上面的一组箭头显示集胞藻属(Synechocystis sp.)PCC6803RuBisCo操纵子。下面一组箭头显示由集胞藻属PCC6803sps和spp基因（如存在于质粒pLybAL67中）构成的合成操纵子。合成的集胞藻属PCC6803sps/spp操纵子应具有与原始集胞藻属PCC6803RuBisCo操纵子相同的转录和翻译起始和终止信号。除了不存在sps基因的XmaI/SpeI片段外，质粒pLybAL66与pLybAL67相同。关于方法的进一步细节在实施例3中公开。

图3A是念珠藻属(Nostoc sp.)PCC7120启动子的图解和多核苷酸序列图示。该序列覆盖rbcLXS（其始于BamHI位点之后3bp）与all1523（其以与rbcLXS操纵子相反的方向转录）之间的区域并以大写字母显示。编号相对于转录起始位点。已从多个构建体缺失的核心（其包含启动子、转录起始位点以及NtcA和因子2结合位点）上游和下游的核苷酸被突出显示。其中核心下游的区域已缺失的构建体的核糖体结合位点保持完整无损。关于方法的进一步细节在实施例4中公开。图3B显示图3A的放大部分。

发明详述

本公开涉及限定的基因调控序列在根据培养基组成来控制功能基因表达方面的用途。

本公开至少部分地基于以下认识：在强启动子（诸如RuBisCo启动子）下的基因表达可能需要调控以提供充分或最佳的生物生长。本公开还至少部分地基于以下认识：含有NtcA结合位点（例如rbcL）的启动子可用于调控靶基因表达，其中靶基因在硝酸盐为唯一的氮源时受到抑制，但当通过氨氮或其它非硝酸盐还原态氮源诸如尿素生长时得以表达。该系统被认为是NtcA抑制型系统。还认识到，本文所述的表达系统可用于调控靶基因表达，其中靶基因在硝酸盐为唯一的氮源时得以表达，但当通过氨氮或其它非硝酸盐氮源诸如尿素生长时受到抑制。该系统被认为是NtcA活化系统。如本文所报道，虽然含有NtcA结合位点的亚硝酸还原酶启动子可调控基因表达，但是亚硝酸还原酶启动子相对弱，从而导致无法接受的低蛋白产量。

多个实施方案提供利用培养基的氮源控制基因调控和蛋白表达的组合物和方法。

还提供了可调节的基因表达，方式是提供包含氮敏感转录因子区域和核心启动子区域或其变体或功能片段的构建体。这样的构建体可在培养过程的限定点在系统中提供高水平的蛋白产生。本文所述的多个系统可适用于产生蛋白材料，包括但不限于糖生物合成酶或其它工业酶，诸如酯水解酶。本文所述的系统可适用于产生通过操作相应酶得到的小分子（包括但不限于糖）。

除非在本文另外指明，否则本公开的组合物和工艺可根据在2009年1月5日提交的美国专利申请公开号2009/0181434中所述的组合物和方法进行，该专利整体以引用方式并入本文。

如本文所述的氮调控的表达系统在结合生物反应器诸如固相生物反应器使用时可尤其有利。当结合生物反应器使用时，可通过改变进料中的氮源而获得蛋白表达的即时调节。固相生物反应器可参照在2009年1月5日提交的美国专利申请公开号2009/0181434中所公开的生物反应器，该专利整体以引用方式并入本文。

提供以下定义和方法以更好地限定本发明并为本领域的普通技术人员在实践本发明时提供指导。除非另外指出，否则术语均应由相关领域的普通技术人员根据常规用法加以理解。

如本文所用的术语“异源DNA序列”、“外源DNA片段”或“异源核酸”都是指源于特定宿主细胞之外的来源或者如果源于相同的来源则与其原始形式相比进行了修饰的序列。因此，宿主细胞中的异源基因包括为特定宿主细胞内源性的但通过例如使用DNA改组而修饰的基因。该术语还包括天然存在的DNA序列的非天然存在的多个拷贝。因此，该术语是指为细胞外源或异源的、或为细胞同源的但在宿主细胞核酸内的位置通常不存在相应元件的DNA片段。外源DNA片段的表达产生外源多肽。“同源DNA”序列是与其引入到的宿主细胞天然相关的DNA序列。

表达载体、表达构建体、质粒或重组DNA构建体通常被认为指代已通过人为干预而生成的核酸，包括通过重组手段或直接化学合成采用允许在例如宿主细胞中转录或翻译特定核酸的一系列指定核酸元件。表达载体可以为质粒、病毒或核酸片段的一部分。通常，表达载体可包含可操作地连接至启动子的待转录核酸。

“启动子”通常被认为是指导核酸转录的核酸控制序列。诱导型启动子通常被认为是响应特定刺激而介导可操作地连接的基因转录的启动子。启动子可包含位于转录起始位点附近的必要核酸序列，诸如就聚合酶II型启动子而言为TATA元件。启动子可任选地包含远侧增强子或抑制子元件，它们与转录起始位点的距离可高达数千个碱基对。

如本文所用的“可转录核酸分子”是指能够转录成RNA分子的任何核酸分子。以将可转录核酸分子转录成得到翻译并因而作为蛋白产物表达的功能mRNA分子的方式将构建体引入细胞的方法是已知的。构建体还可以被构建为能够表达反义RNA分子，以便抑制所关注的特定RNA分子的翻译。对于本公开的实践，用于制备及使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法是本领域技术人员熟知的（参见例如Sambrook and Russel(2006)Condensed Protocols from MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN-10:0879697717;Ausubel等(2002)Short Protocols in MolecularBiology,5th ed.,Current Protocols,ISBN-10:0471250929;Sambrookand Russel(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3d ed.,ColdSpring Harbor Laboratory Press,ISBN-10:0879695773;Elhai,J.andWolk,C.P.1988.Methods in Enzymology167,747-754）。

“转录起始位点”或“起始位点”是围绕作为转录序列一部分的第一核苷酸的位置，其也被定义为位置+1。针对该位点，可对基因的所有其它序列及其控制区域编号。下游序列（即，3'方向的另外蛋白编码序列）可命名为正，而上游序列（5'方向的大部分控制区域）命名为负。

“可操作地连接”或“功能性连接”优选地是指核酸序列在单个核酸片段上相关使得一者的功能受到另一者影响。例如，在以下情况中，则将调控DNA序列称为“可操作地连接至”编码RNA或多肽的DNA序列或与该DNA序列“相关”：两个序列的位置使得调控DNA序列影响编码DNA序列的表达（即，编码序列或功能RNA处于启动子的转录控制下）。编码序列可按有义或反义取向可操作地连接至调控序列。两个核酸分子可以为单个连续核酸分子的一部分并且可以相邻。例如，在以下情况中，启动子可操作地连接至所关注的基因：启动子调控或介导所关注的基因在细胞中的转录。

“构建体”通常被认为是任何重组核酸分子，诸如质粒、粘粒、病毒、自主复制核酸分子、噬菌体或者线性或环状单链或双链DNA或RNA核酸分子，它们衍生自任何来源，能够基因组整合或自主复制，包括其中一个或多个核酸分子已可操作地连接的核酸分子。

本公开的构建体可包含可操作地连接至可转录核酸分子的启动子，而可转录核酸分子可操作地连接至3'转录终止核酸分子。此外，构建体可包含但不限于来自例如3'-未翻译区(3'UTR)的附加调控核酸分子。构建体可包含但不限于mRNA核酸分子的5'未翻译区(5'UTR)，其可在翻译起始中发挥重要作用并且还可以为表达构建体中的遗传组分。这些附加的上游和下游调控核酸分子可衍生自相对存在于启动子构建体上的其它元件为天然的或异源的来源。

术语“转化”是指将核酸片段转移到宿主细胞的基因组中，从而导致基因稳定遗传。包含转化的核酸片段的宿主细胞被称为“转基因”细胞，而包含转基因细胞的生物被称为“转基因生物”。

“转化的”、“转基因的”和“重组的”是指已向其中引入了异源核酸分子的宿主细胞或生物，诸如细菌、蓝细菌、动物或植物。核酸分子可稳定整合到基因组中，如本领域中所熟知和公开(Sambrook1989;Innis1995;Gelfand1995;Innis&Gelfand1999)。已知的PCR方法包括但不限于使用成对引物、巢式引物、单一特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。术语“未转化的”是指未经过转化过程的正常细胞。

“野生型”是指存在于自然界中无任何已知突变的病毒或生物。

表达系统组分

一个方面提供对培养基诸如生长培养基或发酵培养基的氮源敏感的表达调控系统。

在多个实施方案中，表达调控系统包含转录因子区域和可操作地连接至靶序列的核心启动子区域。

可通过改变培养基中的氮源在转录水平上调控可转录核酸分子。例如，可转录核酸分子序列的mRNA转录可在存在硝酸盐的情况下关闭，或在存在还原态氮的非硝酸盐氮源（诸如氨或尿素）的情况下打开。因此，本文所述的表达调控系统可使用低成本的抑制剂硝酸盐和诱导剂铵提供异源基因的可控表达。

作为另一个实例，可转录核酸分子序列的mRNA转录可在存在还原态氮的非硝酸盐氮源（诸如氨或尿素）的情况下关闭，或在存在硝酸盐的情况下打开。因此，本文所述的表达调控系统可使用低成本的诱导剂硝酸盐和抑制剂铵提供异源基因的可控表达。

终止区域控制序列的并入是可选的，如果采用，则选择主要考虑便利性，因为终止区域是相对可互换的。终止区域可以是转录起始区域（启动子）天然的，或者可以是所关注的DNA序列天然的，或者可得自另一来源。

本公开的启动子可以如所述使用标记基因而结合到构建体中，并在稳定的宿主系统中测试基因表达的指标。如本文所用，术语“标记基因”是指任何可转录的核酸分子，可以一定的方式对其表达进行筛选或评定。

转录因子区域

本文提供可包含氮敏感转录因子区域的表达调控系统。使用如本文所述的氮调控系统的实施方案，在培养基（例如发酵液）中从硝酸盐切换到氨氮（或另一非硝酸盐还原形式的氮，诸如尿素）可导致禁止可操作连接的基因表达的抑制状态丧失，从而在培养过程中的限定时间有效打开蛋白的产生。在另一个实施方案中，在培养基中从氨氮（或另一非硝酸盐还原形式的氮，诸如尿素）切换到硝酸盐可导致禁止可操作连接的基因表达的抑制状态丧失，从而在培养过程中的限定时间有效打开蛋白的产生。

本公开至少部分地基于与NtcA相关的观察，NtcA是蓝细菌的氮调节子的主要控制元件。本文展示的结果表明可操作地连接至从集胞藻属PCC6803和细长聚球藻PCC7942分离的亚硝酸还原酶启动子（其包含NtcA结合位点）的基因在硝酸盐为唯一的氮源时得以表达但通过氨氮生长时受到抑制（参见实施例2）。这样的系统符合NtcA活化型启动子系统（参见Hererro2001J Bacteriol183(2)411-425,416）。这些结果证实可通过改变低成本的氮源而实现受控的蛋白表达并因而实现天然产物的产生。虽然之前的报告（诸如Emlyn-Jones等(2003)）已报道了将亚硝酸还原酶启动子用于基因调控，但是本发明人已发现，虽然可以实现一定程度的受控表达，但是在之前系统中的亚硝酸还原酶启动子相对较弱，从而导致无法接受的低蛋白产量（参见实施例2）。

转录因子区域可以可操作地连接至核心启动子区域。本公开还至少部分地基于从可操作地连接至强启动子（诸如RuBisCo启动子）的NtcA结合序列的使用中得出的观察结果。本文展示的结果表明可操作地连接至从念珠藻属PCC7120分离的rbcL启动子（其包含NtcA结合位点）或其功能片段的基因在氨为唯一的氮源时得以表达，但通过氨氮生长时受到抑制（参见实施例2）。这样的系统符合NtcA抑制型启动子系统（参见Hererro2001J Bacteriol183(2)411-425,420）。

转录因子区域可具有与核心启动子区域相关的多个位置。例如，转录因子区域可位于核心启动子区域的上游或下游。转录因子区域可邻近核心启动子区域。转录因子区域可在核心启动子区域的远侧。转录因子区域可包含在核心启动子区域内。例如，转录因子区域可整合在核心启动子区域的序列内。

转录因子区域可包含氮敏感转录因子。在多种生物中转录因子通常可在调控基因表达中发挥重要作用，方式是通过例如在通常位于转录起始位点上游的位点结合到DNA而活化或抑制表达。转录因子可通过将聚合酶募集到编码DNA分子而发挥它们的功能。转录因子或序列特异性DNA结合因子通常被认为是结合到特定DNA序列的蛋白，从而控制从DNA到mRNA的遗传信息转录。转录因子可单独地或与复合物中的其它蛋白一起执行此功能，方式是促进（活化剂）或阻断（抑制剂）RNA聚合酶的募集，而RNA聚合酶是执行从DNA到RNA到特定基因的遗传信息转录的酶。转录因子的一个特征在于它们包含一个或多个DNA结合域，这些结合域可附接到邻近它们所调控的基因的DNA的特定序列。

氮敏感表达调控系统可包含与氮代谢相关基因相关联的启动子或其功能片段或变体。氮敏感表达调控系统可包含亚硝酸还原酶基因的启动子或其功能片段或变体。例如，氮敏感表达调控系统可包含得自蓝细菌的亚硝酸还原酶基因的启动子或其功能片段或变体。作为另一个实例，氮敏感表达调控系统可包含从集胞藻属(Synechocystis)或聚球藻属(Synechococcus)分离的NtcA调控亚硝酸还原酶启动子或其功能片段或变体。内源亚硝酸还原酶启动子中的NtcA结合位点被认为经过其与转录起始位点的距离而起到活化位点的作用（参见Herrero2001J Bacteriol183(2)411-425）。作为另一个实例，氮敏感表达调控系统可包含NtcB调控的亚硝酸还原酶启动子。

氮敏感表达调控系统可包含氮调控基因的启动子或其功能片段或变体。氮敏感表达调控系统可包含氮调控RuBisCo基因的启动子或其功能片段或变体。例如，氮敏感表达调控系统可包含含有NtcA结合位点或NtcA结合位点共有序列的一者或多者的启动子。作为另一个实例，氮敏感表达调控系统可包含含有NtcB结合位点或NtcB结合位点共有序列的一者或多者的启动子。作为另一个实例，氮敏感表达调控系统可包含含有NtcA结合位点和NtcB结合位点或NtcA结合位点共有序列和NtcB结合位点共有序列的一者或多者的启动子。作为另一个实例，氮敏感表达调控系统可包含得自藻类或蓝细菌的氮调控RuBisCo基因的启动子。作为另一个实例，氮敏感表达调控系统可包含得自念珠藻属(Nostoc)、集胞藻属(Synechocystis)或聚球藻属(Synechococcus)的氮调控RuBisCo基因的启动子或其功能片段或变体。得自念珠藻属(Nostoc)的内源rbcL启动子中的NtcA结合位点被认为通过靠近转录起始位点而起到抑制位点的作用（参见Herrero2001J Bacteriol183(2)411-425）。

NtcA被认为是在多个结合域结合到氮调控基因的启动子的螺旋-转角-螺旋转录调节因子（参见Su等2005Nucleic Acids Research33(16),5156-5171;Llacer等2010Proc Natl Acad Sci USA107(35),15397-402）。在内源性蓝细菌NtcA调节子中，其中铵是优选的氮源，同化其它氮源的基因的表达在铵充足的环境中受到抑制；而在铵有限的环境中，涉及吸收和代谢替代氮源的基因可通过NtcA结合到所述基因启动子区域中的顺式调控元件而受到诱导。

转录因子区域可包含NtcA氮敏感转录因子结合位点、NtcB氮敏感转录因子结合位点或其变体或功能片段的一者或多者。转录因子区域可包含NtcA氮敏感转录因子结合位点和NtcB氮敏感转录因子结合位点或其变体或功能片段的至少一者。例如，转录因子区域可包含存在于SEQ ID NO:279（该序列是可操作地连接至NtcA和NtcB的NirA启动子）中的NtcA氮敏感转录因子结合位点和NtcB氮敏感转录因子结合位点或其片段，或与其具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性的序列。

转录因子区域可包含以下多核苷酸，所述多核苷酸具有包含NtcA结合位点共有序列或NtcB结合位点共有序列的序列。转录因子区域可包含以下多核苷酸，所述多核苷酸具有同时包含NtcA结合位点共有序列和NtcB结合位点共有序列的序列。转录因子区域可包含以下多核苷酸，所述多核苷酸具有同时包含存在于SEQ ID NO:279（该序列是可操作地连接至NtcA和NtcB的NirA启动子）中的NtcA结合位点共有序列和NtcB结合位点共有序列的序列、或其片段、或与其具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性的序列。

本文所述的构建体的Ntca结合位点序列可具有与下述NtcA结合序列相同或相似（例如至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性）的序列，所述NtcA结合序列与诸如念珠藻属(Nostoc)、集胞藻属(Synechocystis)或聚球藻属(Synechococcus)的生物的氮调控基因在功能上相关。例如，本文所述的构建体的NtcA结合位点序列可具有与下述NtcA结合序列相同或相似（例如至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性）的序列，所述NtcA结合序列与氮调控基因（例如氮调控蓝细菌基因）的启动子区域在功能上相关。nir操纵子，nirB-ntcB、ntcA、glnA、glnB、amtl、urt操纵子，ntcB、hetC、devBCA、icd、rpoD2-V、nrtP、glnN、nifP、petH、nifH、nifORF1、vnfDG和nifHDK的启动子区域被认为或经预测起到NtcA活化型启动子的作用（参见Herrero2001J Bacteriol183(2)411-425,417,418）。rbcL、hanA gor、gifA和gifB被认为或经预测起到NtcA抑制型启动子的作用（参见Herrero2001J Bacteriol183(2)411-425）。其它包含NtcA结合位点的启动子区域包括xisA、glbN和nifH。包含NtcA结合位点的任何上述序列或其变体或功能片段均可包含在本文所述的表达系统中。

例如，本文所述的构建体的NtcA结合位点序列可具有与nirA的启动子区域（SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:32）在功能上相关的NtcA结合序列相同或相似的序列，或与其具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性的序列、或其片段。

例如，本文所述的构建体的NtcA结合位点序列可具有与以下基因组一个或多个中的NtcA结合位点相同或相似（例如至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性）的序列：无类囊体蓝藻(Gloeobacter violaceus)PCC7421(PCC7421)、念珠藻属PCC7120(PCC7120)、海洋原绿球藻(Prochlorococcus marinus)CCMP1375(PCC1375)、海洋原绿球藻(Prochlorococcus marinus)MED4(MED4)、海洋原绿球藻(Prochlorococcus marinus)MIT9313(MIT9313)、细长聚球藻PCC6301(PCC6310)、聚球藻属(Synechococcus sp.)WH8102(WH8102)、集胞藻属PCC6803(PCC6803)和绵长热聚球藻属(Thermosynechococcus elongates)BF-1（嗜热聚球藻）。作为另一个实例，本文所述的构建体的NtcA结合位点序列可具有与Su等2005Nucleic Acids Research33(16),5156-5171中所公开的NtcA结合位点相同或相似（例如至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性）的序列，该参考文献以引用方式并入本文。作为另一个实例，本文所述的构建体的NtcA结合位点序列可具有与Jiang等1997Biochem J327,513-517中所公开的NtcA结合位点相同或相似（例如至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性）的序列，该文献以引用方式并入本文。

作为另一个实例，本文所述的构建体的NtcA结合位点序列可具有与得自念珠藻属PCC7120的RuBisCo启动子序列中所含的NtcA结合位点相同或相似（例如至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性）的序列。作为另一个实例，本文所述的构建体的NtcA结合位点序列可具有与以下任一者中所含的NtcA结合位点相同或相似（例如至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性）的序列：SEQ ID NO:180、SEQ IDNO:181、SEQ IDNO:182、SEQ ID NO:183（Nsp7120rbc启动子）、SEQ ID NO:227（Ssp6803RuBisCo启动子）、SEQ ID NO:231（Selo7942RuBisCo启动子）或SEQ ID NO:234（Nsp7120rbc启动子）。

作为另一个实例，本文所述的构建体的NtcA结合位点序列可具有与以下质粒中所含的NtcA结合位点相同或相似（例如至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性）的序列：pLybDB2(SEQ ID NO:188)、pLybDB3(SEQ ID NO:189)、pLybDB4(SEQ IDNO:190)、pLybDB5(SEQ ID NO:191)、pLybDB6(SEQ ID NO:235)、pLybDB7(SEQ ID NO:236)或pLybDB9(SEQ ID NO:237)。作为另一个实例，本文所述的构建体的NtcA结合位点序列可具有与质粒pLybDB4(SEQ ID NO:190)中所含的NtcA结合位点相同或相似（例如至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性）的序列。

作为另一个实例，本文所述的构建体的NtcA结合位点序列或NtcB结合位点序列可具有与质粒pLybAL106(SEQ ID NO:272)或pLybAL107(SEQ ID NO:273)中所含的NtcA结合位点相同或相似（例如至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性）的序列。例如，本文所述的构建体的NtcA结合位点序列可具有与质粒pLybAL106(SEQ ID NO:272)中所含的NtcA结合位点相同或相似（例如至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性）的序列。

转录因子区域可包含以下多核苷酸，所述多核苷酸具有包含GTAN₁₁C共有序列的序列，所述共有序列为NtcA的经典结合位点共有序列。GTA三元组被视为此共有序列的最保守区域。作为本发明所公开的表达系统的组分，NtcA结合位点共有序列的位置可使得NtcA的结合实现对可转录核酸分子的表达的控制。例如，GTAN₁₁C域已知在转录起始位点上游的39.5至40.5个核苷酸处居中，并且还可在上游位置-109.5和-180.5处存在于一些启动子中。应当理解，这样的定位为示例性的并且设想了保持功能性的其它位置。

转录因子区域可包含下述多核苷酸，所述多核苷酸具有包含GTAN₈TAC共有序列的序列。GTAN₈TAC结合域被视为NtcA的经典结合位点共有序列。

转录因子区域可包含下述多核苷酸，所述多核苷酸具有包含GTAN₈TGC共有序列的序列。

转录因子区域可包含下述多核苷酸，所述多核苷酸具有包含GTN₁₀AC共有序列的序列。

转录因子区域可包含下述多核苷酸，所述多核苷酸具有包含TGTN₉ACA共有序列的序列。转录因子区域可包含下述多核苷酸，所述多核苷酸具有包含TGTN₁₀ACA共有序列的序列。

转录因子区域可包含附加结合域，诸如TAN₃T/A形式的-10样盒(-10like box)。例如，转录因子区域可以包含TAN₃T结合域。作为另一个实例，转录因子区域可以包含TAN_3A结合域。这样的结合域可以类似于TAN₃T形式的-10,大肠杆菌σ⁷⁰-样盒，而Ntca结合位点（其可以如上所述）替换存在于大肠杆菌σ⁷⁰-3型启动子中的-35盒（参见Su等2005Nucleic Acids Research33(16),5156-5171）。在一些实施方案中，-10样盒可存在于Ntca活化型启动子构建体中（参见Herrero2001J Bacteriol183(2)411-425,418,419）。TAN₃T盒结合域可位于例如转录起始位点上游的五至六个核苷酸。TAN₃T盒结合域可位于例如NtcA结合位点共有序列上游的22或23个核苷酸。TAN₃T盒结合域可位于例如NtcA结合位点共有序列上游的约21、约22、约23或约24个核苷酸（参见Herrero2001J Bacteriol183(2)411-425,419）。

在一些实施方案中，如上所讨论的NtcA结合位点可为-10样盒下游的约21至约24个例如22或23个核苷酸，例如，在其中NtcA结合作为活化因子的构建体中。在一些实施方案中，如上所讨论的NtcA结合位点可位于转录起始位点的附近或与-10样盒重叠，例如，在其中NtcA结合作为抑制子的构建体中。

转录因子区域可包含NtcA结合位点序列或NtcA结合位点共有序列的一者或多者。例如，转录因子区域可包含上述任何NtcA结合位点序列或NtcA结合位点共有序列的至少两者、至少三者、至少四者或更多。

在包含氮敏感转录因子区域的表达控制系统的实施方案中对用于诱导剂和抑制剂的氮源的选择可参照已知通过该转录因子发挥功能的化合物（参见以引用方式并入本文的Herrero等2001J Bacteriol183(2),411-425）。例如，在一些实施方案中，在存在硝酸盐（具有+5的氮氧化态）的情况下，可转录核酸分子的表达可在可操作地连接至NtcA活化型启动子系统时发生；而在存在还原态氮源诸如氨（具有-3的氮氧化态）的情况下，这样的系统的表达受到抑制。反之，在其它实施方案中，在存在硝酸盐（具有+5的氮氧化态）的情况下，可转录核酸分子的表达可在可操作地连接至NtcA抑制型启动子系统时受到抑制；而在存在还原态氮源诸如氨（具有-3的氮氧化态）的情况下，这样的系统的表达得以活化。因此，在一些实施方案中，具有比硝酸盐低的氧化态的氮源可具有对NtcA调控系统的相反作用。换句话讲，具有比硝酸盐低的氧化态的氮源（例如氨、尿素）可在NtcA活化型启动子系统中用作表达抑制剂；并且具有比硝酸盐低的氧化态的氮源（例如氨、尿素）可在NtcA抑制型启动子系统中用作表达诱导剂。

硝酸盐可包括其盐，诸如硝酸钾或硝酸钠。具有比硝酸盐低的氧化态的氮化合物可包括但不限于尿素、氰酸化物、氨、硫酸铵、氨基酸、二氧化氮、一氧化氮或一氧化二氮。优选地，具有比硝酸盐低的氧化态的氮化合物为可溶性氮化合物，诸如氨或尿素。

氮调节子调控蛋白

在一些实施方案中，向系统添加过量的氮调节子调控蛋白可在非诱导条件下进一步降低或消除表达。如上所讨论，表达调控系统可包含对氮调节子调控蛋白（例如硝酸盐诱导型氮调节子调控蛋白）敏感的氮敏感转录因子区域。在一些实施方案中，添加过量的氮调节子调控蛋白（例如NtcA或NtcB）可在非诱导条件下进一步降低或消除靶核苷酸序列的表达（参见例如实施例9）。

本文所述的构建体可包含编码NtcA和/或NtcB的一个或多个拷贝的核苷酸序列。例如，本文所述的构建体可包含SEQ ID NO:279的核苷酸序列，或其包含编码NtcA和/或NtcB的部分的片段，或具有与SEQ ID NO:279至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性并编码NtcA和/或NtcB的核苷酸，或其片段。作为另一个实例，包含含有编码NtcA或NtcB的部分的核苷酸的构建体可以为pLybAL98(SEQ ID NO:265)。

编码NtcA或NtcB的一个或多个拷贝的核苷酸序列可以处于转录因子区域的上游。编码NtcA或NtcB的一个或多个拷贝的核苷酸序列可以处于转录因子区域的下游。

编码NtcA或NtcB的一个或多个拷贝的核苷酸序列可位于本文所述的构建体内使得构建体的表达导致NtcA多肽或NtcB多肽的表达。编码NtcA或NtcB的一个或多个拷贝的核苷酸序列可以处于核心启动子区域的上游。编码NtcA或NtcB的一个或多个拷贝的核苷酸序列可以处于核心启动子区域的下游。例如，编码NtcA或NtcB的一个或多个拷贝的核苷酸序列可以处于nirA启动子的下游（参见例如实施例9）。

核心启动子区域

本文提供可包含核心启动子区域的氮敏感表达调控系统。使用如本文所述的氮调控系统的实施方案，可操作地连接至转录因子区域（例如以Ntca抑制构型的NtcA结合序列）的核心启动子区域（例如得自RuBisCo启动子）可导致可转录核酸分子的调控表达，其中培养基（例如发酵液）中的硝酸盐可有效关闭表达并且非硝酸盐还原态氮源诸如氨氮或尿素可在培养过程中的限定时间有效打开蛋白的产生。在其它实施方案中，

在另一个实施方案中，可操作地连接至转录因子区域（例如以NtcA活化构型的NtcA结合序列）的核心启动子区域可在将培养基（例如发酵液）中的非硝酸盐氮源诸如氨氮或尿素切换到硝酸盐时导致可转录核酸分子的调控表达，从而在培养过程中的限定时间有效打开蛋白的产生。

本公开至少部分地基于从强RuBisCo启动子的使用中得出的观察结果。虽然之前的报告已报道了强RuBisCo启动子的用途，但是本发明人已发现，RuBisCo启动子在不存在调节子（诸如NtcA调节子）的情况下导致以宿主细胞生长和活力为代价的可转录核酸分子的不受控表达。本文展示的结果表明可操作地连接至集胞藻属PCC6803或细长聚球藻PCC7942RuBisCo启动子的基因得到强表达，但是宿主生物表现出极慢的生长并随着时间的推移丧失活力（参见实施例4）。

本公开还至少部分地基于从可操作地连接至强启动子（诸如RuBisCo启动子）的NtcA及其DNA结合序列的使用中得出的观察结果。通过包含NtcA结合位点的完整RuBisCo启动子开展的初步实验导致很少的或没有靶基因表达。本文展示的结果表明可操作地连接至（非截短）念珠藻属PCC7120RuBisCo启动子的基因提供很少的或没有靶基因表达（参见实施例6）。

令人吃惊的是，据发现，包含NtcA结合位点的RuBisCo启动子的上游或下游截短可导致明显的氮源调控靶基因表达。本文展示的结果表明可操作地连接至念珠藻属PCC7120RuBisCo启动子（启动子序列的先导或尾部区域缺失，即上游或下游截短）的基因分别地证实了在存在氨的情况下明显的靶基因表达（参见实施例6）。

但是，包含NtcA结合位点的RuBisCo启动子的上游和下游区域的同时截短导致很少的或没有靶基因表达。本文展示的结果表明可操作地连接至念珠藻属(Nostoc sp.)丧失序列的两个侧翼区域的（即，上游和下游截短的）PCC7120RuBisCo启动子提供了很少或没有靶基因表达（参见实施例6）。

核心启动子区域可以可操作地连接至转录因子区域。例如，核心启动子区域可位于转录因子区域的上游或下游。核心启动子区域可包含转录因子区域。例如，转录因子区域可整合在核心启动子区域的序列内。转录因子区域相对于核心启动子区域的位置可影响在存在还原态氨的情况下系统为活化型还是抑制型系统，如本文进一步所述。例如，如果转录因子区域为邻近核心启动子区域的NtcA结合位点，如在rbcL启动子中，则表达系统可以为NtcA抑制系统，如果存在还原态氮源，诸如氨或尿素，则可打开可操作地连接的可转录核酸分子的表达，而在存在硝酸盐的情况下可关闭表达。

核心启动子区域可包含RuBisCo启动子序列或其变体或功能片段。

核心启动子区域可具有与诸如念珠藻属、集胞藻属或聚球藻属的生物的RuBisCo启动子序列相同或相似（例如至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性）的序列。例如，本文所述的构建体的核心启动子区域可具有与以下基因组一个或多个中的RuBisCo启动子序列相同或相似（例如至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性）的序列：无类囊体蓝藻PCC7421(PCC7421)、念珠藻属PCC7120(PCC7120)、海洋原绿球藻CCMP1375(PCC1375)、海洋原绿球藻MED4(MED4)、海洋原绿球藻MIT9313(MIT9313)、细长聚球藻PCC6301(PCC6310)、聚球藻属WH8102(WH8102)、集胞藻属PCC6803(PCC6803)和绵长热聚球藻属BF-1（嗜热聚球藻）。

作为另一个实例，本文所述的构建体的核心启动子区域可具有与念珠藻属PCC7120中的RuBisCo(rbcLS)启动子序列相同或相似（例如至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性）的序列。作为另一个实例，本文所述的构建体的核心启动子区域可具有与集胞藻属PCC6803中的RuBisCo(rbcLS)启动子序列相同或相似（例如至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性）的序列。作为另一个实例，本文所述的构建体的核心启动子区域可具有与细长聚球藻PCC7942中的RuBisCo(rbcLS)启动子序列相同或相似（例如至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性）的序列。作为另一个实例，本文所述的构建体的核心启动子区域可具有与鱼腥藻属PCC7120中的RuBisCo(rbcLS)启动子序列相同或相似（例如至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性）的序列。作为另一个实例，本文所述的构建体的核心启动子区域可以为RuBisCo(rbcLS)启动子序列的变体或功能片段。

本文所述的构建体的核心启动子区域可具有与RuBisCo(rbcLS)启动子序列或其变体或功能片段相同或相似的序列（例如至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性）。例如，本文所述的构建体的核心启动子区域可具有与念珠藻属PCC7120的rbc启动子区域（诸如SEQ ID NO.180、SEQ ID NO.181、SEQ ID NO.182或SEQ ID NO.183）相同或相似（例如至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性）的序列。作为另一个实例，本文所述的构建体的核心启动子区域可具有与如下的SEQ ID NO:234的Nsp7120rbc启动子区域相同或相似（例如至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性）的序列：

例如，本文所述的构建体的核心启动子区域可具有与SEQ ID NO:234、SEQ ID NO.180、SEQ ID NO.181、SEQ ID NO.182或SEQ IDNO.183中任一者至少约86%、至少约87%、至少约88%、至少约89%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%以及至少约99%的序列同一性。

本文所述的构建体的核心启动子区域可具有与以下质粒中所含的核心启动子区域相同或相似（例如至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性）的序列：pLybDB2(SEQ ID NO:188)、pLybDB3(SEQ ID NO:189)、pLybDB4(SEQ ID NO:190)、pLybDB5(SEQ ID NO:191)、pLybDB6(SEQ ID NO:235)、pLybDB7(SEQ IDNO:236)或pLybDB9(SEQ ID NO:237)。

本文所述的构建体的核心启动子区域可以是本文所讨论的任何启动子序列的功能片段。例如，本文所述的构建体的核心启动子区域可以是RuBisCo（例如rbcLS）启动子序列的功能片段。RuBisCo启动子序列的功能片段可以是具有得自RuBisCo启动子序列（例如得自念珠藻属PCC7120的rbcLS启动子）的至少约50、至少约75、至少约95、至少约100、至少约125、至少约150、至少约175、至少约200、至少约250、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、至少约500、至少约550、至少约600、至少约650、至少约700、至少约750或至少约800个连续碱基的核酸序列，这些碱基保持启动子活性。

本文所述的构建体的核心启动子区域可以是RuBisCo（例如rbcLS）启动子序列的截短形式。例如，本文所述的构建体的核心启动子区域可以是得自念珠藻属PCC7120的氮调控RuBisCo启动子序列的截短形式。

RuBisCo启动子序列的截短可以是上游截短。例如，得自念珠藻属PCC7120的RuBisCo启动子序列可以从第-319至-162位在上游截短（编号相对于转录起始位点，参见图3）（参见实施例6、实施例7）。得自念珠藻属PCC7120的RuBisCo启动子序列的上游截短可以通过约第-300位、约第-250位、约第-200位、约第-190位、约第-180位、约第-170位、约第-160位、约第-150位、约第-140位、约第-130位、约第-120位、约第-110位、约第-100位、约第-90位或约第-80位发生。如图3中所示的念珠藻属PCC7120的第-319至-162位对应于SEQID NO:234的第1至176位。

RuBisCo启动子序列的截短可以是下游截短。例如，得自念珠藻属PCC7120的RuBisCo启动子序列可以从第+26至+491位在下游截短（编号相对于转录起始位点，参见图3）（参见实施例6、实施例7）。得自念珠藻属PCC7120的RuBisCo启动子序列的下游截短可在约第+10位、约第+20位、约第+30位、约第+40位、约第+50位、约第+60位、约第+70位、约第+80位、约第+90位、约第+100位、约第+150位、约第+200位、约第+250位、约第+300位、约第+350位、约第+400位、约第+450位、约第+480或约第+490位发生。得自念珠藻属PCC7120的RuBisCo启动子序列的下游截短可通过例如存在于rbcL的第一密码子处或附近的限制性位点发生（例如，在第+499位的BamHI限制性位点）。如图3中所示的念珠藻属PCC7120的第+26至+491位对应于SEQ ID NO:234的第353至818位。

可转录核酸分子

如本文所述，诸如可转录核酸分子的靶核苷酸序列可以可操作地连接至对培养基（诸如生长培养基或发酵培养基）的一种或多种组分敏感的表达调控系统。例如，可转录核酸分子可以可操作地连接至对存在于培养基中的氮源敏感的表达调控系统。

结合到本公开构建体中的示例性可转录核酸分子包括例如得自宿主物种之外的物种的核酸分子或基因，或甚至起源于或存在于相同物种但通过非经典繁殖或培育技术的遗传工程方法结合到受体细胞中的基因。外源基因或遗传元件旨在表示引入受体细胞中的任何基因或核酸分子。包括在外源核酸分子中的核酸分子的类型可包括已存在于宿主细胞中的核酸分子、得自另一生物的核酸分子、得自不同生物的核酸分子或在外部生成的核酸分子，诸如包含基因的反义消息的核酸分子，或编码基因的人工或修饰形式的核酸分子。

可转录核酸分子可以是编码所关注多肽的任何序列。例如，可转录核酸分子可以是编码具有特定的所关注活性的多肽的基因。

可转录核酸分子可编码具有蔗糖生物合成活性的多肽。可转录核酸分子可编码具有磷酸蔗糖合酶活性的多肽。可转录核酸分子可编码具有磷酸蔗糖磷酸酶活性的多肽。可转录核酸分子可编码具有磷酸蔗糖合酶活性和磷酸蔗糖磷酸酶活性的多肽。

可转录核酸分子可以为得自细长聚球藻PCC7942的活性sps/spp融合(asf)基因，这种聚球藻产生asf基因产物ASF，其同时具SPS和SPP生物合成功能（参见例如美国专利申请公开号2009/0181434，实施例5）。在一些实施方案中，编码靶ASF的核苷酸序列从其天然来源克隆（例如细长聚球藻PCC7942）。在一些实施方案中，可转录核酸分子包含SEQ ID NO:1的asf多核苷酸。在一些实施方案中，可转录核酸分子包含编码SEQ ID NO:2的ASF多肽的核苷酸序列。在另外的实施方案中，可转录核酸分子包含具有与SEQ ID NO:1至少约80%序列同一性的核苷酸序列，或编码具有sps和spp活性和与SEQID NO:2至少约80%序列同一性的多肽的核苷酸序列。例如，可转录核酸分子可包含具有与SEQ ID NO:1至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%序列同一性的核苷酸序列，其中表达的序列表现出ASF、SPS或SPP活性。例如，可转录核酸分子可包含编码具有与SEQ ID NO:2至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中表达的序列表现出ASF、SPS或SPP活性。作为另一个实例，可转录核酸分子可包含在严格条件下在SEQ ID NO:1的整个长度上杂交到SEQ ID NO:1并且编码活性SPS/SPP融合(ASF)多肽的核苷酸序列。作为另一个实例，可转录核酸分子可包含任何上述序列的互补序列。

在一些实施方案中，可转录核酸分子包含磷酸蔗糖合酶(sps)（参见例如编码sps基因的SEQ ID NO:3和编码SPS多肽的SEQ ID NO:4）或其同源物。例如，可转录核酸分子可包含具有SEQ ID NO:3的序列的核苷酸，以便表达磷酸蔗糖合酶。作为另一个实例，可转录核酸分子可包含具有与编码具有磷酸蔗糖合酶活性的多肽的SEQ IDNO:3至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%百分比同一性的核苷酸。作为另一个实例，可转录核酸分子可包含编码具有与SEQ ID NO:4至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中表达的序列表现出SPS活性。

在一些实施方案中，可转录核酸分子包含磷酸蔗糖磷酸酶(spp)（参见例如编码spp基因的SEQ ID NO:5和编码SPP多肽的SEQ IDNO:6）或其同源物。例如，可转录核酸分子可包含具有SEQ ID NO:5的序列的核苷酸，以便表达磷酸蔗糖磷酸酶。作为另一个实例，可转录核酸分子可包含具有与编码具有磷酸蔗糖磷酸酶活性的多肽的SEQ ID NO:5至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%百分比同一性的核苷酸。作为另一个实例，可转录核酸分子可包含编码具有与SEQ ID NO:6至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中表达的序列表现出SPP活性。

在一些实施方案中，可转录核酸分子可包含asf、sps或spp的一者或多者。例如，可转录核酸分子可包含asf和sps、asf和spp、sps和spp或者asf、sps和spp。

可转录核酸分子可编码具有磷酸海藻糖合活性或磷酸海藻糖磷酸酶活性、磷酸葡糖甘油合酶活性或磷酸葡糖甘油磷酸酶活性或者磷酸甘露糖果糖合酶活性或磷酸甘露糖果糖磷酸酶活性的多肽。

在一些实施方案中，可转录核酸分子包含磷酸海藻糖合酶(tps)（参见例如编码tps基因的SEQ ID NO:76和编码TPS多肽的SEQ IDNO:77）或其同源物。例如，可转录核酸分子可包含具有SEQ ID NO:76的序列的核苷酸，以便表达磷酸海藻糖合酶。作为另一个实例，可转录核酸分子可包含具有与编码具有磷酸海藻糖合酶活性的多肽的SEQ ID NO:76至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%百分比同一性的核苷酸。作为另一个实例，可转录核酸分子可包含编码具有与SEQ ID NO:77至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中表达的序列表现出TPS活性。

在一些实施方案中，可转录核酸分子包含磷酸海藻糖磷酸酶(tpp)（参见例如编码tpp基因的SEQ ID NO:78和编码TPP多肽的SEQ IDNO:79）或其同源物。例如，可转录核酸分子可包含具有SEQ ID NO:78的序列的核苷酸，以便表达磷酸海藻糖磷酸酶。作为另一个实例，可转录核酸分子可包含具有与编码具有磷酸海藻糖磷酸酶活性的多肽的SEQ ID NO:78至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%百分比同一性的核苷酸。作为另一个实例，可转录核酸分子可包含编码具有与SEQ ID NO:79至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中表达的序列表现出TPP活性。

在一些实施方案中，可转录核酸分子包含磷酸葡糖甘油合酶(gps)（参见例如编码gps基因的SEQ ID NO:80和编码GPS多肽的SEQID NO:81）或其同源物。例如，可转录核酸分子可包含具有SEQ IDNO:80的序列的核苷酸，以便表达磷酸葡糖甘油合酶。作为另一个实例，可转录核酸分子可包含具有与编码具有磷酸葡糖甘油合酶活性的多肽的SEQ ID NO:80至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%百分比同一性的核苷酸。作为另一个实例，可转录核酸分子可包含编码具有与SEQ ID NO:81至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中表达的序列表现出GPS活性。

在一些实施方案中，可转录核酸分子包含磷酸葡糖甘油磷酸酶(gpp)（参见例如编码gpp基因的SEQ ID NO:82和编码GPP多肽的SEQ ID NO:83）或其同源物。例如，可转录核酸分子可包含具有SEQID NO:82的序列的核苷酸，以便表达磷酸葡糖甘油磷酸酶。作为另一个实例，可转录核酸分子可包含具有与编码具有磷酸葡糖甘油磷酸酶活性的多肽的SEQ ID NO:82至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%百分比同一性的核苷酸。作为另一个实例，可转录核酸分子可包含编码具有与SEQ ID NO:83至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中表达的序列表现出GPP活性。

在一些实施方案中，可转录核酸分子包含磷酸甘露糖果糖合酶(mps)（参见例如编码mps基因的SEQ ID NO:84和编码MPS多肽的SEQ ID NO:85）或其同源物。例如，可转录核酸分子可包含具有SEQID NO:84的序列的核苷酸，以便表达磷酸甘露糖果糖合酶。作为另一个实例，可转录核酸分子可包含具有与编码具有磷酸甘露糖果糖合酶活性的多肽的SEQ ID NO:84至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%百分比同一性的核苷酸。作为另一个实例，可转录核酸分子可包含编码具有与SEQ ID NO:85至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中表达的序列表现出MPS活性。

在一些实施方案中，可转录核酸分子包含磷酸甘露糖果糖磷酸酶(mpp)（参见例如编码mpp基因的SEQ ID NO:86和编码MPP多肽的SEQ ID NO:87）或其同源物。例如，可转录核酸分子可包含具有SEQID NO:86的序列的核苷酸，以便表达磷酸甘露糖果糖磷酸酶。作为另一个实例，可转录核酸分子可包含具有与编码具有磷酸甘露糖果糖磷酸酶活性的多肽的SEQ ID NO:86至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%百分比同一性的核苷酸。作为另一个实例，可转录核酸分子可包含编码具有与SEQ ID NO:87至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中表达的序列表现出MPP活性。

作为另外一种选择，可转录核酸分子可通过编码导致内源基因的表达受到靶向抑制的RNA分子而产生宿主细胞或生物表型，例如借助反义、抑制性RNA(RNAi)或共抑制介导的机理。RNA可以是经工程改造以裂解所需的内源mRNA产物的催化性RNA分子（即核糖酶）。因此，编码蛋白的任何核酸分子或表达所关注的表型或形态变化的mRNA可用于实践本公开。

宿主

宿主生物或宿主细胞可用下述构建体转化，所述构建体包含可操作地连接至对一种或多种培养基组分敏感的表达调控系统的可转录核酸分子。例如，宿主细胞可用下述构建体转化，所述构建体包含可操作地连接至对存在于培养基中的氮源敏感的表达调控系统的可转录核酸分子。

本文所述的构建体可以基于质粒或整合到宿主基因组中。例如，本文所述的构建体（例如质粒pLybDB4，SEQ ID NO:190）可作为质粒存在于宿主中（参见例如实施例11）。作为另一个实例，本文所述的构建体（例如质粒pLybAL98，SEQ ID NO:265）可整合到宿主（例如株系LYB511）的基因组中（参见例如实施例9、实施例11、实施例12）。在一些实施方案中，整合到宿主基因组中可增加靶核苷酸的诱导型表达（比较实施例11和实施例12）。

可对转化的宿主生物或宿主细胞分析所关注基因的存在性以及通过本公开的表达系统赋予的表达水平或表达谱。本领域的技术人员知道可用于分析转化宿主的许多方法。例如，宿主分析方法包括但不限于Southern印迹或northern印迹、基于PCR的途径、生物化学分析、表型筛选方法和免疫诊断测定。

宿主生物可以是真核或原核生物。

宿主生物可以是光合微生物。宿主生物可以是例如天然光合微生物，诸如蓝细菌，或经工程改造的光合微生物，诸如人工光合细菌。为天然光合的或可经工程改造成光合的示例性微生物包括但不限于细菌；真菌；古生菌；原生生物；微生植物，诸如绿藻；和动物，诸如浮游生物、真涡虫和变形虫。天然存在的光合微生物的实例包括但不限于：极大螺旋藻(Spirulina maximum)、钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)、盐生杜氏藻(Dunaliella salina)、布朗葡萄藻(Botrycoccusbraunii)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)、羊角月芽藻(Serenastrum capricomutum)、四尾栅藻(Scenedesmus auadricauda)、紫球藻(Porphyridium cruentum)、尖胞栅列藻(Scenedesmus acutus)、杜氏藻属(Dunaliella sp.)、斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)、项圈藻属(Anabaenopsis)、管链藻属(Aulosira)、筒孢藻属(Cylindrospermum)、聚球藻属(Synechoccus sp.)、集胞藻属(Synechocystis sp.)或单歧藻属(Tolypothrix)。

优选地，宿主光合微生物为蓝细菌。也称为蓝绿藻的蓝细菌是一大类氧光合自养生物。宿主蓝细菌可以是得自蓝藻门的任何光合微生物。宿主蓝细菌可具有单细胞或集落（例如丝状、片状或球状）形态。优选地，宿主蓝细菌为单细胞蓝细菌。可以为宿主生物的蓝细菌的实例包括但不限于以下属：集胞藻属(Synechocystis)、聚球藻属(Synechococcus)、嗜热聚球藻属(Thermosynechococcus)、念珠藻属(Nostoc)、原绿球藻属(Prochlorococcu)、微囊藻属(Microcystis)、鱼腥藻属(Anabaena)、螺旋藻属(Spirulina)和粘杆菌属(Gloeobacter)。优选地，宿主蓝细菌为集胞藻属(Synechocystis spp.)或聚球藻属(Synechococcus spp.)。更优选地，宿主蓝细菌为细长聚球藻PCC7942(ATCC33912)或集胞藻属(Synechocystis spp.)PCC6803(ATCC27184)。

宿主细胞或生物可包含内源氮控制系统。宿主细胞或生物的基因组可编码NtcA多肽。宿主细胞或生物可根据氮控制系统表达NtcA多肽。作为另外一种选择，宿主细胞或生物可经工程改造以根据氮源编码NtcA多肽或表达NtcA多肽。

如本文所述，可转录核酸分子的非调控表达可降低宿主细胞或生物的生长速率或降低宿主细胞或生物的活力（参见实施例4）。本文所述的表达系统的多个实施方案可提供可转录核酸分子表达的氮敏感调控，从而与未调控表达相比提供转化宿主增加的生长速率或活力。使用本文所述的表达系统，转化宿主细胞或生物可具有比相同或基本相似条件下的非转化宿主细胞或生物低约20%的生长速率（例如，低于不足约15%、10%或5%的生长速率）。使用本文所述的表达系统，转化的宿主细胞或生物可具有比相同或基本相似条件下生长的通过非调控构建体转化的宿主细胞或生物高约5%的生长速率（例如高于超过约10%、15%或20%的生长速率）。以上讨论等同地适用于活力，其中用活力替换生长速率。

试剂盒

本发明还提供试剂盒。此类试剂盒可包含本文所述的试剂或组合物并在某些实施方案中包含施用说明书。此类试剂盒可提升本文所述方法的性能。当作为试剂盒提供时，可将组合物的不同组分包装在单独的容器中，然后就在使用前混合。组分包括但不限于本文所述的表达系统或表达盒或其组分或序列。组分的这种单独包装可在需要时存在于可容纳一个或多个含有组合物的单位剂型的包或分配器装置中。包可以例如包括金属或塑料箔，诸如泡罩包装。组分的这种单独包装也可在某些情况下允许长期储存而不丧失组分的活性。

试剂盒还可以在单独的容器中包含试剂，诸如待添加到单独包装的冻干活性组分中的无菌水或盐水。例如，密封的玻璃安瓿可包含冻干组分并在单独的安瓿中包含无菌水、无菌盐水，或者其无菌的每一者都已在中性非反应性气体诸如氮气下包装。安瓿可由任何合适的材料组成，诸如玻璃、有机聚合物，诸如聚碳酸酯、聚苯乙烯、陶瓷、金属或通常用于容纳试剂的任何其它材料。合适的容器的其它实例包括可通过与安瓿类似的物质制成的瓶子，以及可由箔衬里的内部诸如铝或合金组成的包膜。其它容器可包括试管、小瓶、烧瓶、瓶子、注射器等。容器可具有无菌进入口，诸如具有可通过皮下注射针刺入的塞子的瓶子。其它容器可具有通过容易移除的膜分开的两个隔室，而膜在移除后允许组分混合。可移除的膜可以为玻璃、塑料、橡胶等。

在某些实施方案中，试剂盒可以提供有说明性材料。说明可印刷在纸张或其它基材上，或者可以作为电子可读介质提供，诸如软盘、mini-CD-ROM、CD-ROM、DVD-ROM、Zip盘、录像带、录音带等。详细说明可以不与试剂盒物理相关；相反，可指导用户访问试剂盒制造商或经销商指定的互联网。

分子工程

具有上述所需的百分比同一性并保持表达多肽的所需活性的变体核苷酸及其编码的多肽的设计、产生和测试在本领域的技术范围内。例如，突变体的定向进化和快速分离可以依照包括但不限于以下参考文献中所述的方法：Link等(2007)Nature Reviews5(9),680-688;Sanger等(1991)Gene97(1),119-123;Ghadessy等(2001)Proc NatlAcad Sci USA98(8)4552-4557。因此，本领域的技术人员能够根据本领域的常规方法生成具有例如与本文所述的参考序列至少95-99%同一性的大量核苷酸或多肽变体，并筛选此类变体的所需表型。一般来讲，可在任何位置进行保守取代，只要保持所需的活性即可。

核苷酸或氨基酸序列百分比同一性(%)被认为是：当将两个序列进行最佳比对时（采用在比较窗口上总计小于参考序列约20%的合适插入、缺失或空位），在与候选序列中的核苷酸或氨基酸残基相同的核苷酸或氨基酸残基与参考序列相比的百分比。为了确定百分比同一性，将序列进行比对并在必要时将空位引入以实现最大的百分比序列同一性。确定百分比同一性的序列比对程序是本领域技术人员熟知的，并包括诸如以下工具：Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源比对算法、Pearson和Lipman的寻找相似性方法，并优选地通过这些算法的计算机化具体实施形式（GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA）而进行。通常，将公共可用的计算机软件诸如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)软件用于比对序列。本领域的技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括需要在进行比较的序列的全长上实现最大比对而需要的任何算法。当对序列进行比对时，给定序列A相对、与或针对给定序列B的百分比序列同一性（其作为另外一种选择可描述为具有或包含相对、与或针对给定序列B的某一百分比序列同一性的给定序列A）可如下进行计算：百分比序列同一性=X/Y100，其中X为通过A和B的序列比对程序或算法的比对而评定为相同匹配的残基数，Y为B中的残基总数。如果序列A的长度不等于序列B的长度，则A相对B的百分比序列同一性将不等于B相对A的百分比序列同一性。

如本文所用，术语“实质性百分比序列同一性”是指以下百分比序列同一性：至少约基70%序列同一性、至少约80%序列同一性、至少约90%序列同一性或甚至更高的序列同一性，诸如约98%或约99%序列同一性。因此，一个实施方案为具有与本文所述的核酸分子至少约70%序列同一性、至少约80%序列同一性、至少约90%序列同一性或甚至更高序列同一性，诸如约98%或约99%序列同一性的核酸分子。能够调控可操作地连接的可转录核酸分子的转录并具有与本文提供的表达系统的核酸序列实质性百分比序列同一性的核酸分子被包括在本公开的范围内。

“高严格性杂交条件”被定义为在65℃下在6X SSC缓冲液（即，0.9M氯化钠和0.09M柠檬酸钠）中杂交。给定这些条件，可以通过计算两条序列之间的DNA双链体的熔融温度(Tm)而确定给定的一组序列是否将会发生杂交。如果特定的双链体在6X SSC的盐条件下具有低于65℃的熔融温度，则两条序列将不会发生杂交。在另一方面，如果在相同的盐条件下熔融温度高于65℃，则序列将会发生杂交。一般来讲，任何杂交的DNA:DNA序列的熔融温度可使用下式加以确定：T_m=81.5℃+16.6(log₁₀[Na⁺])+0.41(组分G/C含量)-0.63(%甲酰胺)-(600/1)。此外，DNA:DNA杂交体的T_m在核苷酸同一性每降低1%时将降低1-1.5℃（参见例如Sambrook and Russel,2006）。

宿主细胞可使用本领域已知的多种标准技术进行转化（参见例如Sambrook and Russel(2006)Condensed Protocols from MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN-10:0879697717;Ausubel等(2002)Short Protocols in MolecularBiology,5th ed.,Current Protocols,ISBN-10:0471250929;Sambrookand Russel(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3d ed.,ColdSpring Harbor Laboratory Press,ISBN-10:0879695773;Elhai,J.andWolk,C.P.1988.Methods in Enzymology167,747-754）。此类技术包括但不限于病毒感染、磷酸钙转染、脂质体介导的转染、基因枪介导的递送、受体介导的摄入、细胞融合、电穿孔等。可对转染的细胞加以选择并繁殖以提供包含稳定整合在宿主细胞基因组中的表达载体的重组宿主细胞。

根据本文所述的方法开发的宿主株可通过本领域已知的多种手段加以评估（参见例如Studier(2005)Protein Expr Purif.41(1),207-234;Gellissen,ed.(2005)Production of Recombinant Proteins:NovelMicrobial and Eukaryotic Expression Systems,Wiley-VCH,ISBN-10:3527310363;Baneyx(2004)Protein Expression Technologies,Taylor&Francis,ISBN-10:0954523253）。

下调或沉默基因的方法是本领域已知的。例如，可使用反义寡核苷酸、蛋白适配子、核苷酸适配子和RNA干扰(RNAi)（例如小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)和微RNA(miRNA)）下调或消除表达的蛋白的活性（参见例如Fanning and Symonds(2006)Handbook Exp Pharmacol.173,289-303G，描述锤头状核酶和小发夹RNA；Helene,C.,等(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660,27-36;Maher(1992)Bioassays14(12):807-15，描述靶向脱氧核糖核苷酸序列；Lee等(2006)Curr Opin Chem Biol.10,1-8，描述适配子；Reynolds等(2004)NatureBiotechnology22(3),326-330，描述RNAi；Pushparaj and Melendez(2006)Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology33(5-6),504-510，描述RNAi；Dillon等(2005)Annual Review of Physiology67,147-173，描述RNAi；Dykxhoorn and Lieberman(2005)Annual Reviewof Medicine56,401-423，描述RNAi）。RNAi分子可从多种来源商购获得（例如Ambion,TX；Sigma Aldrich,MO；Invitrogen）。使用多种算法的若干siRNA分子设计程序是本领域已知的（参见例如Cenix算法，Ambion；BLOCK-iT^TMRNAi Designer，Invitrogen；siRNAWhitehead Institute设计工具，Bioinformatics&Research Computing）。在限定最优siRNA序列中有影响力的特性包括siRNA末端的G/C含量、siRNA特定内部结构域的Tm、siRNA长度、靶序列在CDS（编码区）内的位置以及3'悬垂的核苷酸含量。

提供本文所述的定义和方法以更好地限定本公开并为本领域的普通技术人员在实践本公开时提供指导。除非另外指出，否则术语均应由相关领域的普通技术人员根据常规用法加以理解。

在一些实施方案中，用于对本公开的实施方案进行描述并提出权利要求的表达成分、性质（诸如分子量）、反应条件等的量的数字应被理解为在一些情况下通过术语“约”来修饰。在一些实施方案中，术语“约”用于指明某一值包括用于确定该值的设备或方法的平均值标准偏差。在一些实施方案中，在书面说明书和所附权利要求书中所示的数字参数为近似值，其可以根据待通过特定实施方案获得的所需性质而变化。在一些实施方案中，数字参数应按照所报告的有效数位并通过应用惯常的四舍五入法而加以解释。尽管本公开的一些实施方案以宽范围示出的数字范围和参数为近似值，但是在具体实例中所示的数值尽可能可行地加以精确报告。在本公开的一些实施方案中展示的数值可包含因存在于其相应测试测量中的标准偏差而必然导致的某些误差。本文对值的范围的列举仅仅是为了用作单独提及落在该范围内的每个单独数值的快捷方法。除非本文另外指明，否则每个单独的值均包括在本说明书中，就像在本文中单独列举一样。

在一些实施方案中，在描述特定实施方案背景下（尤其是在以下某些的背景下）使用的术语“一”、“一个/种”、“该/所述”和类似的提法可被理解为涵盖单数和复数，除非另外具体指明。在一些实施方案中，如本文（包括权利要求书）所用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确表示仅指代备选项或备选项相互排斥。

术语“包含/含有”、“具有”和“包括”是开放式系动词。这些动词一者或多者的任何形式或时态诸如“包含”、“含有”、“具有”、“包括”也是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的任何方法不限于只具有那一个或多个步骤，并且还可以涵盖其它未列出的步骤。相似地，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个特征的任何组合物或装置不限于只具有那一个或多个特征并可以涵盖其它未列出的特征。

除非本文另外指明或上下文明显冲突，否则本文所述的所有方法可以按任何合适的顺序执行。相对于本文的某些实施方案提供的任何和所有实例或示例性语言（例如，“诸如”）的使用仅是为了更好地阐述本公开并且不对本公开的范围加以限制，而本公开的范围仅由权利要求书限定。本说明书中的语言不应理解为是表示实施本公开所必需的任何不受权利要求书保护的要素。

在本文所公开的本公开的备选要素或实施方案的分组不应视为限制性的。每个组的成员可单独地或与组中的其它成员或本文中的其它要素进行任意组合而提及和提出权利要求。出于便利或专利性的原因，组的一个或多个成员可包括在一个组内或从该组内删除。当出现任何此类包括或删除时，在本文将说明书视为包括如此修改的组，从而满足所附权利要求书中所用的所有马库什组的书面说明。

本专利申请中列出的所有出版物、专利和专利申请以及其它参考文献出于所有目的整体以引用方式并入本文，直到每份单独的出版物、专利或专利申请和其它参考文献具体并单独地表示为出于所有目的整体以引用方式并入的程度。本文参考文献的引用不应被视为承认此为本公开的现有技术。

已经详细地描述了本公开，将显而易见的是，在不脱离所附权利要求书限定的本公开范围的情况下，修改、变型和等同实施方案是可能的。此外，应当认识到，在本公开中的所有实例均作为非限制性实例提供。

实施例

提供以下非限制性实施例以进一步阐述本公开。本领域的技术人员应当认识到，以下实施例中公开的技术代表发明人在实施本公开时发现的能够很好地发挥作用的方法并因此可视为构成其实践模式的实施例。然而，本领域的技术人员根据本公开应当认识到，在不脱离本公开精神和范围的情况下，在所公开的具体实施方案中可作出许多改变并仍能获得相同或相似的结果。

实施例1：从细胞中去除转化酶活性

为了蓄积蔗糖，将集胞藻属PCC6803进行了工程改造以从细胞中去除转化酶（β-呋喃果糖苷酶）活性，因为转化酶会将蔗糖水解成将再次进入细胞内的正常代谢供能的葡萄糖和果糖。使编码转化酶的基因lim17(SEQ ID NO:140)从ATCC27184(LYB426)中缺失得到LYB471。其还从野生型株系(LYB467)中缺失得到LYB472。随着时间的推移，这些株系之间产生了差异，使得LYB426的运动性丧失(Kamei等2001)。

首先使用新霉素抗性标记使编码转化酶的基因lim17从LYB426中缺失生成LYB443。使用顺序PCR，在lim17(SEQ ID NO:140)中产生缺失，留下大段侧翼DNA。使用Sspinvdel-F(SEQ ID NO:142)和Sspinvdel-R(SEQ ID NO:143)作为引物，对LYB426全细胞基因组DNA模板进行了第一PCR反应。再次使用LYB426全细胞基因组DNA作为模板，将该反应的产物（Ssp6803转化酶缺失PCR1；SEQID NO:144）用作采用Sspinvdel-R2(SEQ ID NO:145)的第二反应中的引物，形成Ssp6803转化酶缺失PCR2(SEQ ID NO:146)。将第二PCR产物通过XbaI和SphI消化，然后连接至相似地消化的pUC19(SEQ ID NO:139)中，从而产生pLybAL38(SEQ ID NO:147)。将包含氨基葡糖苷3'-磷酸转移酶基因(aph)和得自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168(Bs upp aph PCR)(SEQ ID NO:220)的尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因(upp)的DNA片段由质粒pLybAL8f(SEQ ID NO:69)通过寡核苷酸bsuppkanmcs-F和bsuppkanPstI-R进行扩增。将该PCR产物用SalI和PstI消化，然后连接至已用存在于lim17(SEQ ID NO:140)侧翼序列之间的SbfI和SalI消化的pLybAL38(SEQ ID NO:147)中，从而产生pLybAL41(SEQ ID NO:221)。然后将质粒pLybAL41通过存在于pUC19(SEQ ID NO:139)主链内的AatII进行限制性核酸内切酶消化而线性化，再通过Eaton-Rye(2004)方案加以少量修改而转化进LYB426。具体地讲，将转化混合物直接铺到琼脂板上，而不是覆盖在琼脂板上的膜上。然后通过提起琼脂、将抗生素加到培养皿的底部再将琼脂放回培养皿中而施加抗生素。进行此唯一的修改将所需的琼脂板数量减少到三分之一。在含有25μg/ml新霉素的BG11-A板上对整合进行选择。通过使用寡核苷酸Sspinvdelscreen-F和Sspinvdelscreen-R由全细胞扩增基因组DNA，分析了集落的正确整合和所有染色体拷贝中的完全分离(complete segregation)。野生型扩增产生2.8kbp的产物，而具有新霉素抗性标记和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)upp基因的lim17(SEQ ID NO:140)缺失产生3.7kbp产物。

然后，将LYB443中的新霉素抗性标记用壮观霉素抗性标记进行交换（将添加的upp基因也一并移除），并使转化酶从LYB467中缺失。将壮观霉素抗性标记通过寡核苷酸specSalI-F和specSbfI-R由质粒pBSL175(Alexeyev等1995)进行扩增。然后将该反应的产物用SalI和SbfI消化，再连接至相似地进行消化的pLybAL41中以生成pLybAL58。如上所述通过株系LYB443和LYB467进行了双同源重组，分别得到株系LYB471和LYB472。在含有25μg/ml壮观霉素的BG11-A板上对整合进行选择。同样通过使用寡核苷酸Sspinvdelscreen-F和Sspinvdelscreen-R由全细胞扩增基因组DNA，检查了集落的正确整合和完全分离。具有壮观霉素抗性标记的lim17(SEQ ID NO:140)的缺失产生2.6kbp产物。

转化酶的缺失实现了蔗糖的蓄积，如通过以下两方面所证实：1)在相同的盐暴露条件下运行的LYB426（野生型）与LYB443之间的比较导致了在野生型中无可测的蔗糖但对于LYB443而言相比背景增加了3倍，以及2)用asf基因转化并在功能启动子控制下运行的LYB443表明蔗糖已在细胞内和培养基中蓄积。

实施例2：降低表多糖表达

此外，已知的是，集胞藻属PCC6803响应培养的正常老化或在对细胞的环境胁迫条件下产生大量的表多糖(EPS)(Panoff等1988)。大量的EPS代表了可分流到蔗糖产生的大量碳分配和总体代谢通量。虽然已经选择了EPS突变体，但在集胞藻属PCC6803中产生的表多糖的遗传学相对不为人们所知(Panoff and Joset1989)。内源质粒pSYSM上的大簇基因（差不多18kbp大）已基于它们与已知基因的同源性而被推测主要负责EPS的产生(Kaneko等2003)。为此，将被视为负责与EPS生物合成相关的关键生物合成通路的推定基因从LYB472中移除产生LYB476。

将类似于使转化酶缺失的策略用于使假定的EPS基因座缺失。与上文相似，通过第一寡核苷酸epsko-F和epsko-R然后通过第二聚核苷酸pSYSM-R2进行了顺序PCR。将第二PCR产物用XbaI和SphI消化，然后连接至相似地进行消化的pLybAL41中，得到pLybAL61。将得自质粒pE194(Horinouchi and Weisblum1982)的红霉素抗性标记通过寡核苷酸MLSSalI-F和MLSSbfI-R进行扩增。将所得的产物通过SalI和SbfI进行消化，再连接至相似地进行消化的pLybAL61中，从而得到pLybAL62。如上所述进行了与线性化pLybAL62的LYB472双同源重组，从而产生了LYB476。通过寡核苷酸EPSKOscreen-F和EPSKOscreen-R对全细胞DNA进行PCR分析了集落的正确整合。缺失产生了3.2kbp产物，而不是野生型株系的18.7kbp产物。3.2kbp缺失可容易地观察到，但扩增18.7kbp野生型产物存在困难，使得扩增不适合用于确定是否存在完全分离。相反，完全分离使用寡核苷酸对EPSKOscreen-F/EPSKOint-R1、EPSKOint-F2/EPSKOint-R2、EPSKOint-F3/EPSKOint-R3、EPSKOint-F4/EPSKOint-R4和EPSKOint-F1/EPSKOscreen-R通过多个PCR产物的丧失来评估，对于这些寡核苷酸对，一个或两个寡核苷酸存在于缺失区内。通过这些寡核苷酸扩增野生型DNA分别得到产物EPS KO Sreen_Border1、EPS KO int PCR2、EPS KO int PCR3、EPS KO int PCR4和EPS KOSreen_Border2。

结果表明，上述EPS基因的缺失产生了新的工程改造生物，如通过Panoff and Joset,1989以及Laurentin and Edwards,2003所述的提取和比色测定法测定，这种生物显示出>80%的EPS产生损失。此外看来，具有减少的EPS生物合成的修饰生物在生长速率或总体活力方面无降低。

实施例3：通过亚硝酸还原酶启动子的ASF表达

以下实施例显示通过集胞藻属PCC6803或细长聚球藻PCC7942亚硝酸还原酶启动子的ASF表达。

将LYB476（集胞藻属）的株系，具有在asf基因(pLybAL18)前包含得自细长聚球藻PCC7942的亚硝酸还原酶启动子的质粒，但EPS表达降低）在50ml通过5mM HEPES缓冲液调至pH8.0的BG11培养基中培养，该培养基补充有25μg/ml的氯霉素和替代硝酸钾作为氮源的4mM氯化铵。（质粒pLybAL18及其生成如美国专利申请公开号2009/0181434中所述，其以引用方式整体并入本文。将质粒pLybAL18通过也如美国专利申请公开号2009/0181434中所述的三亲本接合引入LYB476）。在白光LED的100μE照明下，在250RPM的摇瓶中在28℃进行培养。在发酵四天后，将细胞通过无菌离心收获、用1x体积的无菌去离子水洗涤一次。将沉淀的细胞重新分散到50ml含20mM硝酸钾和25mg/ml氯霉素的新鲜BG11培养基(pH9.0)中。将培养物在100mE照明下以250RPM和28℃振荡24小时。将培养基通过离心与细胞分离，使用基于酶的比色法（Biovision蔗糖测定试剂盒#K626）测定培养基中的蔗糖浓度。使细胞经受洗涤剂裂解，使用上述基于酶的方法测定澄清的上清液中的蔗糖浓度。

通过pLybAL18质粒而具有asf基因的LYB476在培养基中表达了蔗糖，占原始培养物中细胞干生物质的30到50重量%。经裂解从细胞中释放的蔗糖的浓度对应于培养物中观测到的总蔗糖的低于10重量%。

LYB476可替代地通过不同的质粒pLybAL16转化，该质粒在asf基因前携带有得自集胞藻属PCC6803的亚硝酸还原酶启动子，然后在50ml通过5mM HEPES缓冲液调至pH8.0的BG11培养基中培养，该培养基补充有25μg/ml的氯霉素和替代硝酸钾作为氮源的4mM氯化铵。（质粒pLybAL16及其生成如美国专利申请公开号2009/0181434中所述，其以引用方式整体并入本文。将质粒pLybAL16通过也如美国专利申请公开号2009/0181434中所述的三亲本接合引入LYB476）。在白光LED的100μE照明下，在250RPM的摇瓶中在28℃进行培养。在发酵四天后，将细胞通过无菌离心收获、用1x体积的无菌去离子水洗涤一次。将沉淀的细胞重新分散到50ml含20mM硝酸钾和25mg/ml氯霉素的新鲜BG11培养基(pH9.0)中。将培养物在100mE照明下以250RPM和28℃振荡24小时。将培养基通过离心与细胞分离，使用基于酶的比色法（Biovision蔗糖测定试剂盒#K626）测定培养基中的蔗糖浓度。使细胞经受洗涤剂裂解，使用上述基于酶的方法测定澄清的上清液中的蔗糖浓度。

得自具有质粒pLybAL16的LYB476的结果表明，主要在培养基中观察到了蔗糖，占原始培养物中细胞干物质的30到50重量%。经裂解从细胞中释放的蔗糖的浓度对应于培养物中观测到的总蔗糖的低于10重量%。

实施例4：通过集胞藻属PCC6803或细长聚球藻PCC7942RuBisCo启动子的ASF表达以及通过集胞藻属PCC6803RUBISCO启动子的SPS和SPP共表达

得自蓝细菌的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCo)启动子被认为是已知最强的启动子之一，因为RuBisCo是在生物圈中以最高的丰度表达的蛋白之一。成功地完成并确认了从集胞藻属PCC6803和细长聚球藻PCC7942分离和克隆此启动子并置于产蔗糖的asf基因之前。结果表明，通过在RuBisCo启动子控制下表达asf而产生蔗糖导致生长抑制，这可能是由于将资源过度分配给了蔗糖的产生。这些结果还表明，需要在生物质聚集期间调控蔗糖的产生。

将得自质粒pLybAL19（如美国专利申请公开号2009/0181434中所述）的λ_PR启动子和CI替换为得自集胞藻属PCC6803和细长聚球藻PCC7942的RuBisCo启动子。将集胞藻属PCC6803和细长聚球藻PCC7942RuBisCo启动子分别使用寡核苷酸对SsprbcL-F/SsprbcL-R和SelorbcL-F/SelorbcL-R从全细胞基因组DNA进行扩增。将PCR产物通过XbaI和AflII进行消化，然后连接至相似地进行消化的pLybAL19，从而对于集胞藻属PCC6803和细长聚球藻PCC7942RuBisCo启动子分别得到pLybAL42和pLybAL43。

将三亲本接合（如美国专利申请公开号2009/0181434）中所述）用于将质粒pLybAL42和pLybAL43插入株系LYB472。但是，转化结合子将会出现然后变为棕色并在重新划线接种时相继死去，以将具有质粒的株系从大肠杆菌供体和辅助株系中纯化出来。据认为，这可能是由于过度的蔗糖产生所致。

还产生了同源重组蔗糖产生系统，其中在集胞藻属PCC6803RuBisCo操纵子(rbcLXS)(SEQ ID NO:233)的背景下将集胞藻属PCC6803sps和spp基因置于集胞藻属PCC6803RuBisCo启动子之后，并通过假定的rbcLXS终止子终止。C端His₆-标签sps开放阅读框始于rbcL的开始，结束于rbcX的末端。C端His₆-标签spp开放阅读框替换了rbcS。为了组装此构建体，合成了具有侧翼XbaI和PmeI位点的人工操纵子（不包括sps内的1.3kbp XmaI/SpeI片段）(Blue Heron,Bothell,WA)。将此XbaI/PmeI片段置入质粒pLybAL50（pLybAL19的衍生物），用XbaI和ClaI（用T4DNA聚合酶钝端化）消化，从而产生了质粒pLybAL66。将sps的XmaI/SpeI片段通过PCR从LYB467全细胞基因组DNA用寡核苷酸Ssp6803spsXS-F和Ssp6803spsXS-R进行扩增。将产物用XmaI和SpeI消化，然后连接至相似地进行消化的pLybAL66中，从而产生了pLybAL67。

通过三亲本接合将pLybAL66和pLybAL67转移到了LYB472中。pLybAL66的转化结合子（具有不完整的sps）似乎是健康的。但是，pLybAL67的转化结合子（具有完整的sps）的表现与pLybAL42和pLybAL43的那些转化结合子相同。几个具有pLybAL67的LYB472绿色集落确实随着时间的推移而出现。使其中一些在含有25μg/ml氯霉素的BG11-A中生长。将质粒DNA通过Wizard Plus SV小提试剂盒(Promega,Madison,WI)进行了纯化，其中在重悬沉淀后在珠磨器中用玻璃珠额外进行了1分钟的处理。将少量纯化的质粒DNA通过转化进大肠杆菌NEB5alpha(NEB,Ipswich,MA)进行扩增。再次小量提取DNA，然后接受限制酶切分析，其中一些分离物不与原始质粒DNA匹配。通过限制酶切分析视为正确的分离物大概包含非常少的缺失/插入或点突变。在任一种情况下，不继续对这些质粒的序列进一步分析。

然而，对一些pLybAL67转化结合子定量分析了蔗糖产生。简而言之，使用无菌拉制玻璃细管从琼脂板上收获了具有质粒pLybAL66或pLybAL67的LYB472的小分离集落，然后转移到补充了氯霉素的50微升BG11A培养基中。然后将该微量培养物作为超过1ml的无细胞培养基混合物的悬滴置于无菌多孔盘中，以便放置悬滴溶液的蒸发损失。在7天后，收集液滴，通过离心去除生物质，测定上清液（用过的培养液）中蔗糖的存在性。在生长具有pLybAL67的LYB472的培养物中观察到了强比色反应，而无质粒的LYB472或LYB472pLybAL66的培养物显示出无明显的反应。鉴于样品中极低水平的生物质，在这些样品中定量测定蔗糖是不可能的，然而定性分析表明，对于具有pLybAL67的LYB472，通过asf基因上游的全功能RuBisCo启动子观察到了大量的蔗糖产生。尝试规模化具有pLybAL67的LYB472导致了极低的生长，在数天后停止，产生了似乎随时间的推移而丧失活力的浅黄色至白色细胞。

实施例5：通过念珠藻属PCC7120RuBisCo启动子的变型形式的酯酶表达

以下实施例显示通过念珠藻属PCC7120RuBisCo启动子的变型形式的酯酶表达。

pLybAL42、pLybAL43、pLybAL66和pLybAL67的结果表明RuBisCo启动子可能能够合成用于产生蔗糖的足够酶，但是产生需要在生物质蓄积阶段下调（参见实施例3）。此外，调控应当为低成本的，以经济地产生商品。虽然之前的报告已表明NtcA用于控制表达（参见例如Jiang等1997;Herrero等,2001;Muro-Pastor等,2005），但是用在集胞藻属PCC6823中尚未报道。

首先对集胞藻属PCC6823中的Ntca系统在能够容易地进行测定的简单酶系统嗜热羧酸酯酶上进行了测试。将嗜热羧酸酯酶基因通过PCR从质粒pCE020R用寡核苷酸E020-F和E020-R进行扩增，其还将C端His₆-标签附接到开放阅读框。将PCR产物用NdeI和ClaI进行消化，然后连接至相似地进行消化的pLybAL50，从而形成pLybAL68，其中LybAL50的asf基因被酯酶基因替换。

接下来，将CI和λPR启动子用念珠藻属PCC7120rbcLXS启动子的各种片段替换。制备了四个不同的不构建体，它们包含整个区域、核心加下游区域、核心加上游区域以及仅核心。这些片段通过念珠藻属PCC7120纯化染色体DNA(ATCC#27893D-5)分别采用寡核苷酸对Nsp7120rbcprom-F1/Nsp7120rbcprom-R1、Nsp7120rbcprom-F2/Nsp7120rbcprom-R1、Nsp7120rbcprom-F1/Nsp7120rbcprom-R2和Nsp7120rbcprom-F2/Nsp7120rbcprom-R2进行PCR扩增而获得。将PCR产物用SbfI和BamHI进行消化，然后连接至相似地进行消化的pLybAL68中分别形成pLybAL69、pLybAL70、pLybAL71和pLybAL72。

将质粒通过三亲本接合（如美国专利申请公开号2009/0181434中所述）引入LYB476。

将具有质粒pLybAL69（在LYB E020基因之前的得自念珠藻属PCC7120的氮调控RuBisCo启动子序列）的集胞藻属(LYB476)在50ml通过5mM HEPES缓冲液调至pH8.0的BG11培养基中培养，该培养基补充有25μg/ml的氯霉素和替代硝酸钾作为氮源的4mM氯化铵。在白光LED的100μE照明下，在250RPM的摇瓶中在28℃进行培养。在发酵四天后，将细胞通过无菌离心收获、用1x体积的无菌去离子水洗涤一次。将沉淀的细胞重新分散到最少的无菌水中，等分，然后分别接种到25ml pH8.0或pH9.0的新鲜BG11培养基中，该培养基含有4mM氯化铵或20mM硝酸钾和25mg/ml氯霉素。将培养物在100mE照明下以250RPM和28℃振荡24小时。将培养基通过离心而与细胞分离，使细胞经受洗涤剂裂解，然后使用对硝基酚乙酸比色测定法测定澄清上清液的酯酶活性。简而言之，将100μM对硝基酚乙酸（得自1mM的乙腈储备液）分散到50mM磷酸缓冲液pH7中。将反应通过添加0.1μl粗裂解物而引发，然后在348nm（硝基酚/硝基酚酯离子的等吸收点）处跟踪水解反应释放的对硝基酚酯的形成。

将具有质粒pLybAL70（在LYB E020基因之前的得自念珠藻属PCC7120的氮调控RuBisCo启动子序列）的集胞藻属(LYB476)株系在50ml通过5mM HEPES缓冲液调至pH8.0的BG11培养基中培养，该培养基补充有25μg/ml的氯霉素和替代硝酸钾作为氮源的4mM氯化铵。在白光LED的100μE照明下，在250RPM的摇瓶中在28℃进行培养。在发酵四天后，将细胞通过无菌离心收获、用1x体积的无菌去离子水洗涤一次。将沉淀的细胞重新分散到最少的无菌水中，等分，然后分别接种到25ml pH8.0或pH9.0的新鲜BG11培养基中，该培养基含有4mM氯化铵或20mM硝酸钾和25mg/ml氯霉素。将培养物在100mE照明下以250RPM和28℃振荡24小时。将培养基通过离心而与细胞分离，使细胞经受洗涤剂裂解，然后使用如上所述的对硝基酚乙酸比色测定法测定澄清上清液的酯酶活性。

将具有质粒pLybAL71（在LYB E020基因之前的得自念珠藻属PCC7120的氮调控RuBisCo启动子序列）的集胞藻属(LYB476)株系在50ml通过5mM HEPES缓冲液调至pH8.0的BG11培养基中培养，该培养基补充有25μg/ml的氯霉素和替代硝酸钾作为氮源的4mM氯化铵。在白光LED的100μE照明下，在250RPM的摇瓶中在28℃进行培养。在发酵四天后，将细胞通过无菌离心收获、用1x体积的无菌去离子水洗涤一次。将沉淀的细胞重新分散到最少的无菌水中，等分，然后分别接种到25ml pH8.0或pH9.0的新鲜BG11培养基中，该培养基含有4mM氯化铵或20mM硝酸钾和25mg/ml氯霉素。将培养物在100mE照明下以250RPM和28℃振荡24小时。将培养基通过离心而与细胞分离，使细胞经受洗涤剂裂解，然后使用如上所述的对硝基酚乙酸比色测定法测定澄清上清液的酯酶活性。

将具有质粒pLybAL72（在LYB E020基因之前的得自念珠藻属PCC7120的氮调控RuBisCo启动子序列）的集胞藻属(LYB476)株系在50ml通过5mM HEPES缓冲液调至pH8.0的BG11培养基中培养，该培养基补充有25μg/ml的氯霉素和替代硝酸钾作为氮源的4mM氯化铵。在白光LED的100μE照明下，在250RPM的摇瓶中在28℃进行培养。在发酵四天后，将细胞通过无菌离心收获、用1x体积的无菌去离子水洗涤一次。将沉淀的细胞重新分散到最少的无菌水中，等分，然后分别接种到25ml pH8.0或pH9.0的新鲜BG11培养基中，该培养基含有4mM氯化铵或20mM硝酸钾和25mg/ml氯霉素。将培养物在100mE照明下以250RPM和28℃振荡24小时。将培养基通过离心而与细胞分离，使细胞经受洗涤剂裂解，然后使用如上所述的对硝基酚乙酸比色测定法测定澄清上清液的酯酶活性。

结果表明，羧酸酯酶基因对应于经克隆和工程改造而在多肽的羧基末端上包含6X组氨酸标签的嗜热酯酶。该酶极其稳定，并表明在重组生物的宿主中作为高溶解性活性酶而良好表达。酶活性的比色测定是一种测定蛋白表达产量的极其灵敏的定量手段。为此，对包含NE020基因的质粒构建体的测试提供了对所测试构建体的总体蛋白表达的明显反应。使用与每个系统中测量的总蛋白相关的酶变化初始速率提供了所产生的酶的度量。此外，使用针对附接到蛋白的6XHis标签的抗体对裂解的生物质进行Western印迹分析提供了对每个样品中表达的蛋白水平的认识，还提供了验证动力学测定数据的手段。

实施例6：通过念珠藻属PCC7120RUBISCO启动子的变型形式的ASF表达

以下实施例显示通过念珠藻属PCC7120RuBisCo启动子的变型形式的ASF表达。

将得自质粒pLybAL69、pLybAL70、pLybAL71和pLybAL72的羧酸酯酶(E020)基因用得自质粒pLybAL50的asf基因（具有C端His6-标签）替换。将pLybAL50中的asf基因通过用BamHI和ClaI消化而移除，然后置于相似地进行消化的pLybAL69、pLybAL70、pLybAL71和pLybAL72中分别产生pLybDB2(SEQ ID NO:188)、pLybDB3(SEQ ID NO:189)、pLybDB4(SEQ ID NO:190)和pLybDB5(SEQ ID NO:191)。

将质粒通过三亲本接合（如美国专利申请公开号2009/0181434中所述）引入LYB476。

将具有质粒pLybDB2(SEQ ID NO:188)（在asf基因之前的得自念珠藻属PCC7120的氮调控RuBisCo启动子序列）的集胞藻属(LYB476)在50ml通过5mM HEPES缓冲液调至pH8.0的BG11培养基中培养，该培养基补充有25μg/ml的氯霉素和替代硝酸钾作为氮源的4mM氯化铵。在白光LED的100μE照明下，在250RPM的摇瓶中在28℃进行培养。在发酵四天后，将细胞通过无菌离心收获、用1x体积的无菌去离子水洗涤一次。在白光LED的100μE照明下，在250RPM的摇瓶中在28℃进行培养。在发酵四天后，将细胞通过无菌离心收获、用1x体积的无菌去离子水洗涤一次。将沉淀的细胞重新分散到最少的无菌水中，等分，然后分别接种到25ml pH8.0或pH9.0的新鲜BG11培养基中，该培养基含有4mM氯化铵或20mM硝酸钾和25mg/ml氯霉素。将培养物在100mE照明下以250RPM和28℃振荡48小时。将细胞从培养基中分离，使用得自Biovision的偶联酶生物测定法分析了用过的培养基中的蔗糖含量。将用过的培养基中的蔗糖的量与在培养的生物质蓄积阶段采用的含氨用过培养基的保留样品上进行的相似蔗糖测量进行比较。进行对照实验，以在最终诱导培养及最终细胞沉淀的后续裂解之后测量细胞内的残余蔗糖含量。

将具有质粒pLybDB3(SEQ ID NO:189)（在asf基因之前的得自念珠藻属PCC7120的截短氮调控RuBisCo启动子序列）的集胞藻属(LYB476)在50ml通过5mM HEPES缓冲液调至pH8.0的BG11培养基中培养，该培养基补充有25μg/ml的氯霉素和替代硝酸钾作为氮源的4mM氯化铵。在白光LED的100μE照明下，在250RPM的摇瓶中在28℃进行培养。在发酵四天后，将细胞通过无菌离心收获、用1x体积的无菌去离子水洗涤一次。在白光LED的100μE照明下，在250RPM的摇瓶中在28℃进行培养。在发酵四天后，将细胞通过无菌离心收获、用1x体积的无菌去离子水洗涤一次。将沉淀的细胞重新分散到最少的无菌水中，等分，然后分别接种到25ml pH8.0或pH9.0的新鲜BG11培养基中，该培养基含有4mM氯化铵或20mM硝酸钾和25mg/ml氯霉素。将细胞从培养基中分离，使用得自Biovision的偶联酶生物测定法分析了用过的培养基中的蔗糖含量。将用过的培养基中的蔗糖的量与在培养的生物质蓄积阶段采用的含氨用过培养基的保留样品上进行的相似蔗糖测量进行比较。进行对照实验，以在最终诱导培养及最终细胞沉淀的后续裂解之后测量细胞内的残余蔗糖含量。

将具有质粒pLybDB4(SEQ ID NO:190)（在asf基因之前的得自念珠藻属PCC7120的截短氮调控RuBisCo启动子序列）的集胞藻属(LYB476)在50ml通过5mM HEPES缓冲液调至pH8.0的BG11培养基中培养，该培养基补充有25μg/ml的氯霉素和替代硝酸钾作为氮源的4mM氯化铵。在白光LED的100μE照明下，在250RPM的摇瓶中在28℃进行培养。在发酵四天后，将细胞通过无菌离心收获、用1x体积的无菌去离子水洗涤一次。将沉淀的细胞重新分散到最少的无菌水中，等分，然后分别接种到25ml pH8.0或pH9.0的新鲜BG11培养基中，该培养基含有4mM氯化铵或20mM硝酸钾和25mg/ml氯霉素。将培养物在100mE照明下以250RPM和28℃振荡48小时。将细胞从培养基中分离，使用得自Biovision的偶联酶生物测定法分析了用过的培养基中的蔗糖含量。将用过的培养基中的蔗糖的量与在培养的生物质蓄积阶段采用的含氨用过培养基的保留样品上进行的相似蔗糖测量进行比较。进行对照实验，以在最终诱导培养及最终细胞沉淀的后续裂解之后测量细胞内的残余蔗糖含量。

将具有质粒pLybDB5(SEQ ID NO:191)（在asf基因之前的得自念珠藻属PCC7120的截短氮调控RuBisCo启动子序列）的集胞藻属(LYB476)在50ml通过5mM HEPES缓冲液调至pH8.0的BG11培养基中培养，该培养基补充有25μg/ml的氯霉素和替代硝酸钾作为氮源的4mM氯化铵。在白光LED的100μE照明下，在250RPM的摇瓶中在28℃进行培养。在发酵四天后，将细胞通过无菌离心收获、用1x体积的无菌去离子水洗涤一次。将沉淀的细胞重新分散到最少的无菌水中，等分，然后分别接种到25ml pH8.0或pH9.0的新鲜BG11培养基中，该培养基含有4mM氯化铵或20mM硝酸钾和25mg/ml氯霉素。将培养物在100mE照明下以250RPM和28℃振荡48小时。将细胞从培养基中分离，使用得自Biovision的偶联酶生物测定法分析了用过的培养基中的蔗糖含量。将用过的培养基中的蔗糖的量与在培养的生物质蓄积阶段采用的含氨用过培养基的保留样品上进行的相似蔗糖测量进行比较。进行对照实验，以在最终诱导培养及最终细胞沉淀的后续裂解之后测量细胞内的残余蔗糖含量。

得自念珠藻属PCC7120的RuBisCo启动子序列的结构参照表1。表1：念珠藻属PCC7120启动子的区域（参见图3）

元件	位置
		所示区域	-327至+509
SbfI位点	-327至-320
		BamHI位点	+499至+504
上游缺失	-319至-162
		下游缺失	+26至+491
转录起点	+1
		-10共有	-11至-6
启动子	-34至-6
		翻译起点(rbcL)	+507
翻译起点(all1523)	-310
		NtcA共有位点1	-5至+9
NtcA结合位点1	-10至+12
		NtcA共有位点2	-54至-42
NtcA结合位点2	-54至-42
		因子2结合位点	-77至-15

图3中所示的区域从通过rbcL（RuBisCo大亚基）的第一密码子引入SbfI位点的点开始。DNA序列取自公布的基因组(Kaneko等2001DNA Res8,205-213)。编号相对于转录起点(+1)。小写字母表示产生的突变以引入SbfI和BamHI限制性内切酶位点。鉴定为启动子的序列覆盖通常会被鉴定典型大肠杆菌型σ70启动子的区域。-10共有序列(TATAAT)可相对于转录起点加以鉴定。DNA足迹分析用于表明NtcA在两个位置结合DNA（参见Kaneko等2001DNA Res8,205-213）。图3中突出显示的NtcA共有位点1为GTN₁₀AC。图3中突出显示的NtcA共有位点2为GTN₉AC。两者都具有侧翼As和Ts。DNA足迹分析表明第二蛋白（因子2）结合到启动子区（参见Ramasubramanian等1994J Bacteriol176,1214-1223）。

对无细胞的用过培养基进行了蔗糖测量，然后归一化到总干生物质，并针对各样品中的背景蔗糖进行了校正。

结果表明，由围绕氮调控RuBisCo启动子的整个片段区域组成的启动子构建体产生了很少的或没有可检测的蔗糖，这是因为构建体失去了序列的两个侧翼区域。先导或尾部区域缺失的构建体单独地证实了大量的蔗糖产生（0.15到0.9克糖/克干生物质）。经证实蔗糖产量依赖于培养基中的氮源，含氨的培养物与由硝酸盐构成的培养液相比提供了3-5倍的糖产量提高。为了检测asf（含6X组氨酸标签）蛋白的存在性而进行的Western印迹分析证实了对于单个先导或尾部序列区域截短的构建体而言产生了可测数量的蛋白，这与蔗糖产生的发现结果一致。其中使用含氨或硝酸盐的培养基的对照实验证实了生物耐氮源切换，而生物的生长特性无明显的变化。

实施例7：通过念珠藻属PCC7120RuBisCo启动子的变型形式的SPS/SPP双基因操纵子表达

将得自质粒pLybAL69、pLybAL70、pLybAL71和pLybAL72的羧酸酯酶(E020)基因用得自质粒pLybAL67的其操纵子结构中的sps和spp基因（均具有C端His6-标签）替换。将具有sps和spp基因的片段通过PCR从pLybAL67模板用寡核苷酸SPSSPP正向#2和SPSSPP反向进行扩增。将PCR产物通过BglII和NarI消化，然后置于已通过BamHI和ClaI消化的质粒pLybAL69、pLybAL70和pLybAL72中，以分别形成质粒pLybDB6(SEQ ID NO:235)、pLybDB7(SEQ ID NO:236)和pLybDB9(SEQ ID NO:237)。将被命名为pLybDB8的质粒pLybAL71(E020)和pLybDB4(SEQ ID NO:190)(asf)的sps/spp等同形式被抛弃，因为在其构建中遇到了困难。

将质粒通过三亲本接合（如美国专利申请公开号2009/0181434中所述）引入LYB476。

将具有质粒pLybDB6(SEQ ID NO:235)（在集胞藻属PCC6803sps/spp基因之前的得自念珠藻属PCC7120的氮调控RuBisCo启动子序列)的集胞藻属(LYB476)在50ml通过5mM HEPES缓冲液调至pH8.0的BG11培养基中培养，该培养基补充有25μg/ml的氯霉素和替代硝酸钾作为氮源的4mM氯化铵。在白光LED的100μE照明下，在250RPM的摇瓶中在28℃进行培养。在发酵四天后，将细胞通过无菌离心收获、用1x体积的无菌去离子水洗涤一次。将沉淀的细胞重新分散到最少的无菌水中，等分，然后分别接种到25ml pH8.0或pH9.0的新鲜BG11培养基中，该培养基含有4mM氯化铵或20mM硝酸钾和25mg/ml氯霉素。将培养物在100mE照明下以250RPM和28℃振荡48小时。将细胞从培养基中分离，使用得自Biovision的偶联酶生物测定法分析了用过的培养基中的蔗糖含量。将用过的培养基中的蔗糖的量与在培养的生物质蓄积阶段采用的含氨用过培养基的保留样品上进行的相似蔗糖测量进行比较。进行对照实验，以在最终诱导培养及最终细胞沉淀的后续裂解之后测量细胞内的残余蔗糖含量。

将具有质粒pLybDB7(SEQ ID NO:236)（在集胞藻属PCC6803sps/spp基因之前的得自念珠藻属PCC7120的截短氮调控RuBisCo启动子序列)的集胞藻属(LYB476)在50ml通过5mM HEPES缓冲液调至pH8.0的BG11培养基中培养，该培养基补充有25μg/ml的氯霉素和替代硝酸钾作为氮源的4mM氯化铵。在白光LED的100μE照明下，在250RPM的摇瓶中在28℃进行培养。在发酵四天后，将细胞通过无菌离心收获、用1x体积的无菌去离子水洗涤一次。将沉淀的细胞重新分散到最少的无菌水中，等分，然后分别接种到25ml pH8.0或pH9.0的新鲜BG11培养基中，该培养基含有4mM氯化铵或20mM硝酸钾和25mg/ml氯霉素。将培养物在100mE照明下以250RPM和28℃振荡48小时。将细胞从培养基中分离，使用得自Biovision的偶联酶生物测定法分析了用过的培养基中的蔗糖含量。将用过的培养基中的蔗糖的量与在培养的生物质蓄积阶段采用的含氨用过培养基的保留样品上进行的相似蔗糖测量进行比较。进行对照实验，以在最终诱导培养及最终细胞沉淀的后续裂解之后测量细胞内的残余蔗糖含量。

将具有质粒pLybDB9(SEQ ID NO:237)（在集胞藻属PCC6803sps/spp基因之前的得自念珠藻属PCC7120的截短氮调控RuBisCo启动子序列)的集胞藻属(LYB476)在50ml通过5mM HEPES缓冲液调至pH8.0的BG11培养基中培养，该培养基补充有25μg/ml的氯霉素和替代硝酸钾作为氮源的4mM氯化铵。在白光LED的100μE照明下，在250RPM的摇瓶中在28℃进行培养。在发酵四天后，将细胞通过无菌离心收获、用1x体积的无菌去离子水洗涤一次。将沉淀的细胞重新分散到最少的无菌水中，等分，然后分别接种到25ml pH8.0或pH9.0的新鲜BG11培养基中，该培养基含有4mM氯化铵或20mM硝酸钾和25mg/ml氯霉素。将培养物在100mE照明下以250RPM和28℃振荡48小时。将细胞从培养基中分离，使用得自Biovision的偶联酶生物测定法分析了用过的培养基中的蔗糖含量。将用过的培养基中的蔗糖的量与在培养的生物质蓄积阶段采用的含氨用过培养基的保留样品上进行的相似蔗糖测量进行比较。进行对照实验，以在最终诱导培养及最终细胞沉淀的后续裂解之后测量细胞内的残余蔗糖含量。

对无细胞的用过培养基进行了蔗糖测量，然后归一化到总干生物质，并针对各样品中的背景蔗糖进行了校正。

根据通过asf构建体观察到的结果，由围绕sps/spp基因上游的氮调控RuBisCo启动子的整个片段区域构成的启动子构建体提供了很少的可检测蔗糖。序列的两个侧翼区域均缺失的构建体产生了适度的蔗糖，这与通过asf构建体得到的结果不一致。

将生成序列的先导片段缺失的构建体；然而，序列的尾部缺失区域产生了大量的蔗糖（0.15到0.3克糖/克干生物质）。经证实蔗糖产量对氮源不敏感，硝酸盐和氨氮源均提供了相似水平的糖产生。蔗糖的产量在sps/spp构建体中相对显著地降低，并且总体调节控制得以有效实现。

实施例8：质粒构建

将制造商描述为约20个拷贝/细胞的低拷贝载体pSMARTGC LK(Lucigen,Middleton,WI)(SEQ ID NO:192)用在初始质粒中作为在大肠杆菌NEB5α(NEB,Ipswich,MA)中进行构建的主链。之后，将pSMARTGC LK替换为pLG338(SEQ ID NO:202)（6至8个拷贝/细胞）。所有PCR扩增均采用Phusion聚合酶如制造商(NEB,Ipswich,MA)所述而完成。

将集胞藻属PCC6803的upp基因座通过PCR从基因组DNA用寡核苷酸Sspuppins-F(SEQ ID NO:193)和Sspuppins-R(SEQ ID NO:194)进行扩增，然后如制造商所述克隆进pSMARTGC LK载体，从而产生pLybAL73f(SEQ ID NO:195)。将基因分开，通过用FspI和KpnI消化pLybAL73f然后将磷酸化的退火寡核苷酸SspuppMCS-F(SEQ ID NO:196)和SspuppMCS-R(SEQ ID NO:197)插入而添加多个克隆位点，从而得到质粒pLybAL74f(SEQ ID NO:198)。然后由pLybAL74f通过用FspI和SphI消化pLybAL74f然后连接在磷酸化的退火寡核苷酸Selo7942rbcTerm-F(SEQ ID NO:199)和Selo7942rbcTerm-R(SEQ ID NO:200)中而制备了质粒pLybAL75f(SEQ ID NO:201)。这将细长聚球藻PCC7942rubisco操纵子转录终止子置于多克隆位点的前面，以防止由通过upp启动子产生的读出转录物(read-through transcript)表达asf(SEQ IDNO:1)。然后尝试了与得自pLybDB3(SEQ ID NO:189)和pLybDB4(SEQ ID NO:190)的相应启动子一起将asf克隆进pLybAL75f，使得可将它们的相应产物线性化然后转化进LYB476以整合进染色体，但总是没有得到正确的产物。

然后选择拷贝数甚至更低的载体pLG338(SEQ ID NO:202)（6-8个拷贝/个细胞）。通过以下步骤由pLG338构建了质粒pLybAL78A(SEQ ID NO:203)：用SphI部分消化，然后用EcoRV消化，用T4聚合酶处理使SphI位点钝化，然后连接5.4kbp载体。然后将质粒pLybAL78A用PshAI和NheI消化，再将具有集胞藻属PCC6803upp基因座（带有得自pLybAL75f(SEQ ID NO:201)的居间转录终止子和多克隆位点）的HindIII（用T4聚合酶进行了处理）-XbaI片段插入，从而产生pLybAL79(SEQ ID NO:204)。然后成功地将具有asf的SphI–ClaI（用T4聚合酶进行了处理）片段与得自pLybDB3(SEQ ID NO:189)和pLybDB4(SEQ ID NO:190)的相应启动子一起插入了用SphI和NotI（用T4聚合酶进行了处理）消化的pLybAL79，分别产生pLybAL80(SEQ ID NO:205)和pLybAL81(SEQ ID NO:206)。

为了允许通过抗生素抗性标记的共整合进行选择，通过以下方法分别由pLybAL79、pLybAL80和pLybAL81制备了pLybEA8(SEQ IDNO:238)、pLybEA9(SEQ ID NO:239)和pLybEA10(SEQ ID NO:240)：将使用寡核苷酸asfcmlint-F(SEQ ID NO:242)和asfcmlint-R(SEQ ID NO:243)扩增并用SacII进行消化的得自pKD32(SEQ ID NO:241)的氯霉素乙酰转移酶插入SacII位点。这产生了其中asf基因和下游氯霉素乙酰转移酶基因会聚转录而无居间转录终止子的质粒。将以与质粒pLybEA8、pLybEA9和pLybEA10中相反的取向含有氯霉素抗性标记的质粒通过SacII消化并重新连接而进行了构建，从而分别产生质粒pLybAL84(SEQ ID NO:244)、pLybAL85(SEQ ID NO:245)和pLybAL86(SEQ ID NO:246)。

用于在转化酶基因座处进行整合的载体构建始于质粒pLybAL87b(SEQ ID NO:247)。通过将具有转化酶基因座（带有居间多克隆位点）的PCR产物插入而由pLybEA8制备了质粒pLybAL87b。通过以下方法制备了PCR产物：用寡核苷酸Sspinvint-F(SEQ ID NO:248)和Sspinvint-R(SEQ ID NO:249)对集胞藻属PCC6803野生型染色体DNA进行连续PCR，然后使用第一反应的产物和寡核苷酸Sspinvint-R2(SEQ ID NO:250)作为引物进行二次扩增。将该最终PCR产物用EcoRI进行消化，然后将1.4kbp产物插入pLybEA8的4.9kbpEcoRI片段，从而将upp基因座与其居间多克隆位点和氯霉素抗性标记一起替换。同样，将细长聚球藻PCC7942rubisco操纵子转录终止子置于多克隆位点的上游，以防止通过上游启动子对asf的读出转录。将质粒pLybAL87b用NotI和SphI进行消化，然后将磷酸化退火寡核苷酸Selo7942rbcTerm-F2(SEQ ID NO:251)和Selo7942rbcTerm-R2(SEQ ID NO:252)插入，从而产生pLybAL88b(SEQ ID NO:253)。为了防止通过在最终构建体中置于asf基因之前的启动子发生氯霉素抗性标记不必要的额外表达，还将转录终止子置于质粒pLybAL85(SEQID NO:245)中的asf基因与氯霉素抗性标记之间。将质粒pLybAL85用SacII和BamHI两者进行了部分消化，然后将含有细长聚球藻PCC7942psbAII转录终止子的磷酸化退火寡核苷酸Selo7942AIITerm-F(SEQ ID NO:254)和Selo7942AIITerm-R(SEQ ID NO:255)插入了9.5kbp载体，从而产生pLybAL89(SEQ ID NO:256)。将质粒pLybAL88b和pLybAL89合并制得pLybAL90(SEQ ID NO:257)。将得自pLybAL89的3.9kbp SphI-KpnI片段连接至得自pLybAL88b的6.3kbp SphI-KpnI片段。将得自质粒pLybAL86的0.37kbp SphI-BamHI片段与得自质粒pLybAL90的9.6kbp SphI-BamHI片段合并，产生pLybAL91(SEQ ID NO:258)。质粒pLybAL91含有通过转录终止子分开的转化酶基因座，得自pLybDB4的念珠藻属PCC7120rubisco启动子片段，asf，另一转录终止子，然后是其自身的启动子以与asf相同的方向转录的氯霉素抗性标记。

将质粒pLybAL88b的转化酶基因座分两步用表多糖基因座交换。首先，将集胞藻属PCC6803野生型染色体DNA用寡核苷酸SspEPSint-F(SEQ ID NO:259)和SspEPSint-R(SEQ ID NO:260)进行扩增。将该反应的0.67kbp产物用EcoRI和NotI进行消化，然后连接至相似地进行消化的pLybAL88b的5.7kbp片段，从而形成pLybAL93(SEQ ID NO:261)。其次，将集胞藻属PCC6803野生型染色体DNA用寡核苷酸SspEPSint-F2(SEQ ID NO:262)和SspEPSint-R2(SEQ ID NO:263)进行扩增。将该反应的1.1kbp产物用EcoRI和KpnI进行消化，然后连接至相似地进行消化的pLybAL93的5.6kbp片段，从而形成pLybAL94(SEQ ID NO:264)。然后通过将pLybAL94的6.7kbp SphI-KpnI片段与相似地进行消化的pLybAL91的3.6kbp片段相连接形成了质粒pLybAL98(SEQ IDNO:265)。质粒pLybAL98含有通过转录终止子分开的表多糖基因座，得自pLybDB4的念珠藻属PCC7120rubisco启动子片段，asf，另一转录终止子，然后是其自身的启动子以与asf相同的方向转录的氯霉素抗性标记。

将质粒pLybAL94的表多糖基因座分两步用集胞藻属PCC6803的sps基因座交换。首先，将集胞藻属PCC6803野生型染色体DNA用寡核苷酸Sspspsint-F(SEQ ID NO:266)和Sspspsint-R(SEQ ID NO:267)进行扩增。将该反应的1.3kbp产物用RsrII和KpnI进行消化，然后连接至相似地进行消化的pLybAL94的5.6kbp片段，从而形成pLybAL95(SEQ ID NO:268)。其次，将集胞藻属PCC6803野生型染色体DNA用寡核苷酸Sspspsint-F2(SEQ ID NO:269)和Sspspsint-R2(SEQ ID NO:270)进行扩增。将该反应的0.92kbp产物用MreI和NotI进行消化，然后连接至相似地进行消化的pLybAL95的6.3kbp片段，从而形成pLybAL96(SEQ ID NO:271)。

构建了质粒pLybAL106(SEQ ID NO:272)和pLybAL107(SEQ IDNO:273)以与卡那霉素抗性标记一起分别将硝酸盐诱导型氮调节子调控蛋白和转化酶基因整合进集胞藻属PCC6803的sps的基因座。首先，通过用MluI消化并重新连接8.7kbp片段而使pLybAL90的抗性标记缺失，从而产生pLybAL100(SEQ ID NO:274)。然后将pLybAL100的氯霉素抗性标记用得自pKD13(SEQ ID NO:275)的卡那霉素抗性标记替换。将得自pKD13的卡那霉素抗性标记用寡核苷酸neoflpint-F(SEQ ID NO:276)和asfcmlint-R(a)(SEQ ID NO:277)进行扩增。将1.3kbp产物用PacI和SacII进行消化，然后连接至相似地进行消化的pLybAL100的7.7kbp片段，从而产生pLybAL101(SEQ ID NO:278)。通过Blueheron(Bothell,WA)合成了含有以下部分的片段：得自细长聚球藻PCC7942的nirA启动子(SEQ ID NO:32)，然后是得自细长聚球藻PCC7942的ntcA和ntcB(PnirA_ntcA_ntcB)(SEQ ID NO:279)或转化酶(PnirA_lim17)(SEQ ID NO:280)基因。使用了得自细长聚球藻PCC7942的基因，而不是得自集胞藻属PCC6803的那些基因，以限制错误的染色体重组。将这些片段（1.9和1.7kbp）用SbfI和PmeI进行消化，然后置入pLybAL101的6.2kbp片段，分别形成pLybAL102(SEQ ID NO:281)和pLybAL103(SEQ ID NO:282)。将得自pLybAL102和pLybAL103的硝酸盐诱导型基因和卡那霉素抗性标记与pLybAL96合并，以整合进sps基因座。将得自pLybAL102和pLybAL103的3.2和3.1kbp SbfI-SacII片段连接至相似地进行消化的pLybAL96的7.2kbp片段，分别得到pLybAL106(SEQ ID NO:272)和pLybAL107(SEQ ID NO:273)。

实施例9：整合

为了整合进集胞藻属PCC6803的株系，使细胞在BG11-A（通过pH8.0的HEPES或pH9.0的CHES缓冲）中生长到约0.4的OD₇₃₀，通过离心而沉淀，然后重悬在新鲜培养基中达到2.5的OD₇₃₀。当通过pH9.0的CHES缓冲时观察到了更好的生长，但是当将培养基补充碱敏感的化合物如新霉素和5-氟尿嘧啶时，使用了pH8.0的HEPES。通过将2-10μg DNA（通过AflII和MluI线性化）与500μl该细胞悬液混合而进行了转化，在透明塑料管中在光照下孵育3小时，混合，然后再孵育3小时。然后将细胞悬液施加到含有0.3%硫代硫酸钠的BG11-A琼脂板。将板在恒定照明下孵育过夜。细胞铺板后24小时，将板上的琼脂提起，再将50%抗生素施加到琼脂的下面。另外50%抗生素在36小时后施加。氯霉素、新霉素和5-氟尿嘧啶的最终浓度分别为25、25和1μg/ml。将候选细胞重新划线接种到含抗生素的板上，然后通过菌落PCR进行筛选。将重复该过程，直到观察到完全分离。完全分离后，将候选细胞再次划线接种，这次不存在抗生素。将再次通过菌落PCR对候选细胞进行筛选，以确定保持了完全分离。

通过PCR用重组区域之外的寡核苷酸分析了整合。用寡核苷酸Sspuppintscrn-F(SEQ ID NO:283)和Sspuppintscm-R(SEQ ID NO:284)对upp基因座处的整合进行了筛选。存在于株系LYB476中的野生型upp将产生0.89kbp产物。与pLybAL81(SEQ D NO:206)、pLybEA8(SEQ ID NO:238)、pLybEA10(SEQ ID NO:240)、pLybAL84(SEQ IDNO:244)和pLybAL86(SEQ ID NO:246)的正确整合将分别产生3.4、2.0、4.5、2.0和4.5kbp的产物。用寡核苷酸Sspinvdelscreen-F(SEQ IDNO:153)和Sspinvdelscreen-R(SEQ IDNO:154)对转化酶(lim17)基因座处的整合进行了筛选。由株系LYB476扩增转化酶基因座将产生2.6kbp产物。与pLybAL91(SEQ I DNO:258)的正确整合将产生5.3kbp的产物。用寡核苷酸EPSKOscreen-F(SEQ I DNO:167)和EPSKOscreen-R(SEQ ID NO:168)对表多糖基因座处的整合进行了筛选。由株系LYB476扩增表多糖基因座将产生3.2kbp产物。与pLybAL98(SEQ ID NO:265)的正确整合将产生5.6kbp的产物。用寡核苷酸Ssp6803spsscreen-F(SEQ ID NO:285)和Ssp6803spsscreen-R(SEQ ID NO:286)对sps基因座处的整合进行了筛选。存在于株系LYB476中的野生型sps将产生4.0kbp产物。与质粒pLybAL106(SEQID NO:272)和pLybAL107(SEQ ID NO:273)的正确整合将分别产生5.6kbp和5.4kbp的产物。

将质粒pLybAL106和pLybAL107线性化并转化进株系LYB476分别得到LYB509和LYB510。将质粒pLybAL98线性化并转化进LYB509和LYB510分别得到LYB511和LYB512。

upp基因座处的asf整合。

尝试了使用pLybAL81将asf整合进集胞藻属PCC6803upp基因座，但是未成功。将质粒pLybAL81(SEQ D NO:206)用AflII和MluI线性化，转化进LYB476，然后在含有1μg/ml5-氟尿嘧啶的BG11-A板上对转化体进行选择。使用寡核苷酸Sspuppintscm-F(SEQ ID NO:283)和Sspuppintscrn-R(SEQ ID NO:284)通过从其基因组DNA进行PCR扩增而对候选细胞进行了筛选。正确的整合将产生3.4kbp的PCR产物，而不是野生型0.89kbp。从所得的5-氟尿嘧啶抗性候选细胞进行的基因组DNA扩增的PCR产物具有野生型DNA的大小。这些候选细胞可能通过在upp基因座或另一基因座处的5-氟尿嘧啶抗性突变体的自发选择而产生，而不是asf整合。然而，未对它们进行表征。

决定使用质粒pLybEA8(SEQ ID NO:238)和pLybEA10(SEQ IDNO:240)通过抗生素抗性标记的共整合来选择upp基因座处的asf整合。质粒pLybEA8只含氯霉素抗性标记，而pLybEA10还含有从存在于质粒pLybDB4(SEQ ID NO:190)中的念珠藻属PCC7120rubisco启动子片段转录的asf基因。仅从线性化pLybEA8进行的LYB476转化中得到了集落，这种质粒没有asf基因。使用引物sspuppintscrn-F(SEQ ID NO:283)和sspuppintscm-R(SEQ ID NO:284)通过PCR分析了upp基因座。正确的整合应产生2.0kbp的DNA片段，而不是野生型0.89kbp。对野生型和整合体片段均进行了检测，表明不完全的分离。通过抗生素选择进行的重复划线接种未能产生完全分离。对于pLybEA10转化物（含asf的质粒），未得到集落。

为了确保对于获得asf整合而言氯霉素抗性标记的正确表达不是问题，将质粒pLybEA8和pLybEA10的标记的取向分别在pLybAL84(SEQ ID NO:244)和pLybAL86(SEQ ID NO:246)中颠倒。据推测，asf的强表达可能导致下游会聚cat基因的表达削弱。然而，得到了类似的结果。

在转化酶和表多糖基因座处的asf整合。

将upp基因座处的整合抛弃，以有利于转化酶和表多糖基因座处的整合，对于它们而言，从之前的工作中已知的是这些基因缺失的完全分离不是问题。将LYB476用线性化pLybAL91(SEQ ID NO:258)和pLybAL98(SEQ ID NO:265)转化，以将asf基因整合进染色体上的转化酶(lim17)基因座和位于大质粒pSYSM上的表多糖基因座。整合程序提供了随后将会开始出现但迅速死亡的非常小的集落。

修饰宿主中转化酶和表多糖基因座处的asf整合。

据怀疑，不能成功整合是由于通过ASF产生了蔗糖，ASF即使在含硝酸盐的培养基中生长时也会表达。通过质粒pLybDB4(SEQ IDNO:190)在之前获得的结果表明在非诱导条件下表达未完全关闭。这导致了尝试通过以下方法降低蔗糖毒性（其可能是由严重的渗透压失衡所致）：降低asf表达的基础水平（添加过量的NtcA和NtcB），或降解导致毒性的蔗糖（添加转化酶活性）。将编码这些蛋白的基因置于细长聚球藻PCC7942nirA启动子之后，这一启动子在硝酸盐上生长时得以诱导，但在氨上生长时受到抑制。将质粒pLybAL106(SEQID NO:272)和pLybAL107(SEQ ID NO:273)用于在sps基因座处整合这些构建体，从而产生株系LYB509和LYB510。这些株系的构建毫无困难。

株系LYB509和LYB510与质粒pLybAL91(SEQ ID NO:258)在转化酶基因座处的asf整合仍未成功。然而，这些株系与质粒pLybAL98(SEQ ID NO:265)在表多糖基因座处的asf整合分别得到了LYB511和LYB512。

根据从具有质粒pLybDB4(SEQ ID NO:190)的LYB476获得的之前数据，表明响应尿素的诱导蔗糖的产生增加。尿素诱导的细胞分泌的蔗糖是在硝酸盐中生长的细胞的大约3倍。我们的结果表明，LYB511asf整合体也响应尿素诱导而分泌蔗糖。LYB511显示出响应尿素分泌的蔗糖比响应硝酸盐分泌的蔗糖增加4-5倍。有趣的是，用尿素处理的LYB511所分泌的蔗糖是用尿素处理的具有pLybDB4的LYB476的4倍。此外，用硝酸盐处理的LYB511所分泌的蔗糖也达用硝酸盐处理的具有pLybDB4的LYB476的3倍。这些结果表明，asf整合体产生的蔗糖总体上比质粒的外源asf的表达多。通过细胞裂解物得到的蔗糖的量在所有样品之间相似。这些结果表明，细胞在分泌前只能容许有限浓度的内部蔗糖。蔗糖测定结果还推断出asf基因的稳定内源表达。

LYB512株系未显示出响应尿素的蔗糖产生增加。附加转化酶表达的氮调节控制必定为渗漏的(leaky)，或者转化酶随时间的推移非常稳定。

实施例10：在液态光生物反应器中的整合氮调控蔗糖产生

将株系LYB511在BG11琼脂培养基上培养，然后将单一集落转移到50ml液体BG11培养基中，在50μE白光下在250RPM、30℃振荡，直到经确定培养物进入对数期生长，如通过730nm处的光密度测定（通常为3-4天）。将对数期培养物无菌转移到500ml经搅拌的维持在30℃的BG11培养液中，在150μE白色荧光下每分钟充入1升经过滤的空气。一旦培养物达到对数中期生长后，通过离心无菌收获细胞，并用去离子水洗涤一次。将细胞沉淀分散到10ml去离子水中，将5ml引入500ml BG11培养液，培养液补充有20mM硝酸钠或10mM尿素。培养物在搅拌下在30℃生长，在150μE白色荧光下每分钟充入1升空气。在4天的过程中每天取出10ml培养液，测量pH、生物质密度和蔗糖浓度。

结果表明，对于包含硝酸钠作为氮源的培养物，在4天试验中的生物质蓄积增加了2.25倍，峰值蔗糖浓度为9.3微摩尔。对于包含尿素作为氮源的培养物，在4天试验中的生物质蓄积仅增加了1.2倍，峰值蔗糖浓度为83微摩尔。在两培养物中，pH从7缓慢增至7.8。

实施例11：在固态光生物反应器中的基于质粒的氮调控蔗糖产生

将具有质粒pLybDB4的株系LYB476在BG11琼脂培养基上培养，然后将单一集落转移到50ml液体BG11培养基中，在50μE白光下在250RPM、30℃振荡，直到经确定培养物进入对数期生长，如通过730nm处的光密度测量值而测定（通常为3-4天）。将对数期培养物无菌转移到3000ml经搅拌的维持在30℃的BG11培养液中，在150μE白色荧光下每分钟充入1升经过滤的空气。

一旦培养物达到对数中期生长后，将细胞无菌转移到无菌槽中。将尺寸为6英寸的方形固态光生物反应器（如美国专利申请20090181434中所述）织物浸入槽中，并将其在室温下于暗处孵育过夜。将织物无菌安装到连接有气体和培养基管件的固态光生物反应器中。气源为经过滤的环境空气并以0.1升/分钟引入。将培养基以4小时的定期间隔按0.2ml/min的流速主动泵送15分钟而引入反应器。培养物在30℃和150μE白色荧光下生长。初始培养基由BG11与作为氮源的20mM硝酸钠组成，在5天后转变为含10mM尿素作为氮源的BG11，发酵继续进行7天。在试验过程中每天取出10ml培养液，测量pH和蔗糖浓度。在培养期间，收集的流出物中pH维持在7.2。

结果表明，在硝酸盐进料期间的峰值蔗糖产生提供了0.16毫摩尔，蔗糖浓度为8.8mM。在尿素进料期间的峰值蔗糖产生提供了0.94毫摩尔，蔗糖浓度为52mM。

实施例12：在固态光生物反应器中的整合氮调控蔗糖产生

将株系LYB511在BG11琼脂培养基上培养，然后将单一集落转移到50ml液体BG11培养基中，在50μE白光下在250RPM、30℃振荡，直到经确定培养物进入对数期生长，如通过730nm处的光密度测量值所测定（通常为3-4天）。将对数期培养物无菌转移到3000ml经搅拌的维持在30℃的BG11培养液中，在150μE白色荧光下每分钟充入1升经过滤的空气。一旦培养物达到对数中期生长后，将细胞无菌转移到无菌槽中。将尺寸为6英寸×6英寸的固态光生物反应器（如美国专利申请20090181434中所述）织物浸入槽中，并将其在室温下于暗处孵育过夜。将织物无菌安装到连接有气体和培养基管件的固态光生物反应器中。气源为经过滤的环境空气并以0.1升/分钟引入。将培养基以4小时的定期间隔按0.2ml/min的流速主动泵送15分钟而引入反应器。培养物在30C和150μE白色荧光下生长。初始培养基由BG11与作为氮源的20mM硝酸钠组成，在5天后转变为含10mM尿素作为氮源的BG11，发酵继续进行7天。在试验过程中每天取出10ml培养液，测量pH和蔗糖浓度。在培养期间，收集的流出物中pH维持在7.2。

结果表明，在硝酸盐进料期间的峰值蔗糖产生提供了0.32毫摩尔，蔗糖浓度为18mM。在尿素进料期间的峰值蔗糖产生提供了1.6毫摩尔，蔗糖浓度为91mM。

参考文献

acggctgcat actaaccgct tcatacatct cgtagatttc tctggcgatt gaagggctaa840

attcttcaac gctaactttg agaatttttg taagcaatgc ggcgttataa gcatttaatg900

cattgatgcc attaaataaa gcaccaacgc ctgactgccc catccccatc ttgtctgcga960

cagattcctg ggataagcca agttcatttt tctttttttc ataaattgct ttaaggcgac1020

gtgcgtcctc aagctgctct tgtgttaatg gtttcttttt tgtgctcata cgttaaatct1080

atcaccgcaa gggataaata tctaacaccg tgcgtgttga ctattttacc tctggcggtg1140

ataatggttg catcttaaga aggaggatcc atatggtacc acagaa1186

<210>36

<211>31

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer for amplifying Synechocystis spp.PCC6803dnaK

(SphI/KpnI)

<400>36

gccccagcat gcaccagtaa acataaatct c31

<210>37

<211>30

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer for amplifying Synechocystis spp.PCC6803dnaK

(SphI/KpnI)

<400>37

attggtggta ccgaggtcaa tcccaacaac30

<210>38

<211>895

<212>DNA

<213>Synechocystis PCC6803

<400>38

gccccagcat gcaccagtaa acataaatct ccccggcgac gcaaaaaacg ggtgaccatc60

aagccggtgc gcttcggcat ttttctgctt tgcctagcag gcattgtggg gggggcaact120

gccctaatta tcaatcgtac tggcgatccc ctaggtgggt tgctagaaga ccccctagat180

Claims (20)

1.一种氮敏感表达系统，其包含：

含有NtcA结合位点的转录因子区域；和

含有RuBisCo启动子或其变体或功能片段的核心启动子区域；

其中所述核心启动子区域包含或可操作地连接至所述转录因子区域。

2.根据权利要求1所述的表达系统，其进一步包含：

可转录核酸分子和3'转录终止核酸分子；

其中，

所述核心启动子区域可操作地连接至所述可转录核酸分子；并且

所述可转录核酸分子可操作地连接至所述3'转录终止核酸分子。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的表达系统，其中所述转录因子区域包含以下至少一者：GTAN₁₁C共有序列；GTAN₈TAC共有序列；GTAN₈TGC共有序列；GTN₁₀AC共有序列；TGTN₉ACA共有序列；或TGTN₁₀ACA共有序列。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的表达系统，其中所述转录因子区域包含TAN₃T/A盒中的至少一者。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的表达系统，其中所述核心启动子区域包含RuBisCo启动子的聚合酶结合位点。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的表达系统，其中所述核心启动子区域与得自念珠藻属PCC7120；集胞藻属PCC6803；或鱼腥藻属PCC7120的RuBisCo(rbcLS)启动子序列或其功能片段具有至少约70%的序列同一性。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的表达系统，其包含分离的核酸分子，所述分离的核酸分子具有启动子活性和与SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183或SEQ ID NO:234中任一者至少约70%的序列同一性。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的表达系统，其包含分离的核酸分子，所述分离的核酸分子具有启动子活性和

(a)SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:182、SEQ IDNO:183或SEQ ID NO:234中任一者的至少95个连续碱基；或

(b)SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:182、SEQ IDNO:183或SEQ ID NO:234中任一者的功能片段。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的表达系统，其包含

(a)编码NtcA多肽或NtcB多肽的多核苷酸序列，其中所述NtcA多肽或所述NtcB多肽可操作地连接至所述构建体的所述核心启动子区域；或

(b)编码可操作地连接至所述核心启动子区域的NtcA多肽和NtcB多肽的SEQ ID NO:279的多核苷酸序列。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的表达系统，其包含：

具有启动子活性的SEQ ID NO:234的第177至836位核苷酸或与其具有至少约70%序列同一性的分离的核酸分子；

具有启动子活性的SEQ ID NO:234的第1至352位核苷酸或与其具有至少约70%序列同一性的分离的核酸分子；或

具有启动子活性的SEQ ID NO:234的第177至352位核苷酸或与其具有至少约70%序列同一性的分离的核酸分子。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的表达系统，其中所述可转录核酸分子编码具有以下活性的多肽：磷酸蔗糖合酶活性；磷酸蔗糖磷酸酶活性；磷酸蔗糖合酶和磷酸蔗糖磷酸酶活性；磷酸海藻糖合酶活性；磷酸海藻糖磷酸酶活性；磷酸葡糖甘油合酶活性；磷酸葡糖甘油磷酸酶活性；磷酸甘露糖果糖合酶活性；或磷酸甘露糖果糖磷酸酶活性。

12.根据权利要求1-10中任一项所述的表达系统，其中所述可转录核酸分子包含：

SEQ ID NO:1或与其至少80%的序列同一性并且编码具有磷酸蔗糖合酶和磷酸蔗糖磷酸酶活性的多肽；或

编码具有磷酸蔗糖合酶和磷酸蔗糖磷酸酶活性的SEQ ID NO:2的多肽或与其至少80%相似的多肽的核酸序列。

13.一种在宿主细胞中表达可转录核酸分子的方法，其包括：

通过权利要求1-12中任一项所述的表达系统稳定转化宿主细胞；以及

使包含所述表达系统的所述宿主细胞或其子代在所述可转录核酸分子借以表达的条件下生长；

其中所述可转录核酸分子的表达在硝酸盐为主要氮源时受到抑制而所述可转录核酸分子在尿素或氨为主要氮源时得以表达。

14.根据权利要求13所述的方法，其中

所述转化的宿主生物的生长速率低于未转化的宿主生物在相同或基本相似条件下的生长速率不超过约20%；或

所述转化的宿主生物的生长速率高于在相同或基本相似条件下生长的通过非调控构建体转化的宿主生物的生长速率超过约5%（例如，高于超过约10%、15%或20%的生长速率）。

15.根据权利要求13-14中任一项所述的方法，其中

(a)所述宿主细胞在氮控制系统下内源表达NtcA多肽或NtcB多肽；

(b)所述宿主细胞经工程改造以在氮控制系统下表达NtcA多肽或NtcB多肽；

(c)所述表达系统包含编码NtcA多肽或NtcB多肽的多核苷酸序列并且所述NtcA多肽或所述NtcB多肽可操作地连接至所述构建体的所述核心启动子区域。

16.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞为光合微生物。

17.根据权利要求13-16中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞为选自以下的光合微生物：极大螺旋藻、钝顶螺旋藻、盐生杜氏藻、布朗葡萄藻、普通小球藻、蛋白核小球藻、羊角月芽藻、四尾栅藻、紫球藻、尖胞栅列藻、杜氏藻属、斜生栅藻、项圈藻属、管链藻属、筒孢藻属、聚球藻属、集胞藻属和单歧藻属。

18.一种表达盒，其包含：

(a)含有NtcA结合位点的转录因子区域；

(b)含有RuBisCo启动子或其变体或功能片段的核心启动子区域；

(c)可转录核酸分子；

(d)3'转录终止核酸分子；和

(e)任选的编码NtcA多肽或NtcB多肽的多核苷酸序列；

其中，

所述核心启动子区域包含或可操作地连接至所述转录因子区域；

所述核心启动子区域可操作地连接至所述可转录核酸分子；

所述可转录核酸分子可操作地连接至所述3'转录终止核酸分子；

元件(a)-(d)相对于彼此定位使得所述表达盒在宿主生物中的表达导致产生由所述可转录核酸分子编码的多肽序列；并且

元件(e)在存在时定位使得所述表达盒在所述宿主生物中的表达导致产生所述NtcA多肽或所述NtcB多肽。

19.一种转基因宿主细胞：其

包含权利要求1-12中任一项所述的表达系统；

由权利要求13-17中任一项所述的方法产生，或其子代，包含所述表达系统；或

包含权利要求18所述的表达盒；

其中

由所述可转录核酸分子编码的所述多肽序列的表达在存在硝酸盐时受到抑制；以及

由所述可转录核酸分子编码的所述多肽序列的表达在存在尿素或氨时受到诱导。

20.一种试剂盒，其包含权利要求1-13中任一项所述的表达系统或权利要求18所述的表达盒以及至少一种用于将所述表达盒引入宿主细胞的试剂和任选地用于将所述表达盒引入宿主细胞的说明书。