CN108350474B - 小分子糖基化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在酸性条件下，由葡糖基供体和葡糖基受体，并使用蔗糖磷酸化酶，来制备2‑O‑α‑D‑吡喃葡糖基‑L‑抗坏血酸(AA‑2G)的方法。

Description

小分子糖基化的方法
技术领域
本发明涉及蔗糖磷酸化酶介导产生2-O-α-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸的方法。
背景技术
2-O-α-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)是所有已知L-抗坏血酸衍生物中的一种高度稳定的形式。对L-抗坏血酸的2-位羟基(负责其生物活性和稳定性)的修饰显著提高了L-抗坏血酸(L-AA)的稳定性。L-抗坏血酸的2-位羟基的糖基化提供了一些优于其它衍生物(如磷酸酯和硫酸酯衍生物)的优点。已经合成了L-AA葡糖苷的其它亚型，即3-O-α-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸(AA-3G)、5-O-α-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸(AA-5G)和6-O-α-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸(AA-6G)，但它们都没有显示出与AA-2G一样好的稳定性。
a.AA-2G是极其惰性的形式，不显示任何生物活性和还原能力，因此具有极高的物理和化学稳定性。
b.当AA-2G在由活体分泌的α-葡糖苷酶的作用下水解成L-抗坏血酸和D-葡萄糖时，L-抗坏血酸的性质显示出来，并呈现L-抗坏血酸固有的生物活性。
c.已经证明在某些特定条件下，AA-2G在体内合成和代谢。因此AA-2G被认为是高度稳定的L-AA的最安全形式。
d.由于其在水和油性物质中的高溶解度，AA-2G有利于用在口服和外用制剂中作为维生素C补充剂。
自然界中，糖基转移酶(GT)是负责糖苷合成的酶，而糖基水解酶(GH)发展成了降解糖苷。糖基转移酶和糖基水解酶已成功用于生产各种糖苷。这些酶也已经用于AA-2G的酶促合成。
当麦芽糖和L-AA分别用作供体和受体底物时，属于GH的大鼠肠的α-葡糖苷酶和水稻种子的α-葡糖苷酶产生了AA-2G。但这两种酶总是不可避免地伴随AA-2G同时产生AA-6G、AA-5G亚型。这些酶使用廉价的麦芽糖作为供体底物只产生一种葡糖苷，这对于商业应用是有意义的，但是这些酶并非廉价易得，且亚型的存在使AA-2G的分离和纯化变得困难。来自黑曲霉(A.niger)的α-葡糖苷酶产生大部分的AA-6G和非常少的AA-2G。
属于GT的环糊精葡糖基转移酶(CGTase)是另一种得到充分研究的用于大规模生产AA-2G的酶。EP0425066公开了一种制备AA-2G的方法，其可以在工业规模上进行，允许糖转移酶(例如CGTase)作用于含L-抗坏血酸和α-葡糖基糖类的溶液，以形成AA-2G和副产物。当CGTase与作为供体底物的环糊精(最优选的供体底物)或淀粉一起使用时，由于全部或部分线性麦芽低聚糖转移至L-AA，因此不可避免地形成一些AA-2-麦芽低聚糖副产物。生成的一些具有不同聚合度的副产物经额外的葡糖淀粉酶处理，被进一步消减成AA-2G。使用CGTase总是产生相对较少量的其他亚型，例如AA-3G和AA-6G。这些亚型的存在再次在下游工艺中，尤其在AA-2G与其他亚型分离时带来麻烦。CGTase被设计为接受麦芽糖作为供体底物，以避免数种副产物的形成和额外的葡糖淀粉酶处理，但是成功的很少，并且产量完全没有吸引力(Han et al.参考文献)。
WO2004013344公开了一种使用来自球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)的α-异麦芽糖基葡糖形成酶(IMG)制备AA-2G的方法，其中AA-5G或AA-6G未形成，或形成的量少以致于检测不到它们的形成(以干固体计<0.1％wt/wt)。在该方法中，IMG和CGTase一起用作转糖基酶，且部分淀粉水解产物用作供体底物(以将淀粉分解成寡糖)。这两种酶的组合提高了产量并使形成的AA-5G和AA-6G的含量降低至0.1％以下。然而，并没有避免一些副产物的形成。副产物进一步经葡糖淀粉酶处理以转化为AA-2G。因此这个系统总共需要3种酶来有效地运作整个过程。
目前可用的酶促方法可以大规模制备AA-2G。在反应结束时存在的一些副产物和不同的亚型仍然是整个工艺的瓶颈，并且干扰AA-2G的分离和纯化。通过葡糖淀粉酶处理可以将副产物转化为AA-2G，而使用强酸性阳离子交换树脂可以容易地从L-AA和葡萄糖中分离出AA-2G。然而，由于其溶解度和色谱性质的相似性，几乎不能分离与AA-2G一起形成的AA-5G和AA-6G亚型。EP0539196公开了有利地利用AA-5G、AA-6G和AA-2G的源自其还原能力的可氧化性，将AA-5G和AA-6G与AA-2G分离开的方法。但是该方法需要精确控制反应条件，以仅仅氧化AA-5G和AA-6G而不会过度氧化，过度氧化会影响AA-2G，从而导致AA-2G产率降低。
因此，仍然需要改进的方法用于高产率制备AA-2G。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效的一步式制备方法用于大规模制造AA-2G。
本发明的目的是通过本发明的主题来实现的。
根据本发明，提供了一种制备2-O-α-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的方法，该方法包括以下连续的步骤：
a.提供包含葡糖基供体和葡糖基受体的混合物；
b.将所述混合物与蔗糖磷酸化酶一起孵育；
c.在孵育期间保持pH在7.0以下；
d.任选地，在反应期间加入额外的葡糖基供体和/或蔗糖磷酸化酶；和
e.分离和/或纯化2-O-α-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸。
附图说明
图1示出了2-O-α-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的化学结构。
图2示出了pH对长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)的蔗糖磷酸化酶的AA-2G形成活性的影响。
图3示出了温度对长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶的AA-2G形成活性的影响。
图4示出了供体(蔗糖)和受体(L-AA)底物浓度对长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶的AA-2G形成活性的影响。
图5示出了由不同蔗糖磷酸化酶催化的L-抗坏血酸的转葡糖基化。
具体实施方式
本发明提供了一种制备2-O-α-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸的新颖的且得到改进的方法，该方法包括以下连续的步骤：
a.提供包含葡糖基供体和葡糖基受体的混合物；
b.将所述混合物与蔗糖磷酸化酶一起孵育；
c.在孵育期间保持pH在7.0以下；
d.任选地，在反应期间加入额外的糖基供体以及蔗糖磷酸化酶；和
e.分离和/或纯化2-O-α-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸。
因此，目的在于找到可以利用简单且成本低的二糖或单糖作为供体底物并且仅在L-AA的2-位进行转糖基化的酶。
在GT和GH类中，糖苷磷酸化酶(GP)在某些方面是特殊的。GP催化α-和β-D-糖苷，主要是包括二糖和具有不同聚合度的寡糖或多糖的糖苷(Glc-OR)的磷酸化。葡糖基转移至磷酸盐(Pi)在体内是热力学有利的，因为磷酸盐通常比α-D-葡萄糖-1-磷酸(Glc-1-P)大大过量的存在。然而，GP催化反应的热力学平衡常数(Keq)落在GT(Keq<<1)和GH(Keq>>1)的反应Keq值之间。相对有利的Keq以及磷酸活化的糖比核苷酸活化的糖(这是大多数GT所需的)更廉价这一事实，使得GP成为用于立体和区域特异性合成糖苷的感兴趣的生物催化剂。
蔗糖磷酸化酶(SPase；EC 2.4.1.7)，一种葡糖基磷酸化酶，催化蔗糖和磷酸转化为D-果糖和α-D-葡萄糖-1-磷酸(Glc 1-P)。已经从许多细菌源中分离出了SPase。已经从不同的细菌克隆出了编码SPase的基因并进行了异源表达(Kawasaki H等，Biosci.Biotech.Biochem.(1996)60：322-324；Kitao S和Nakano E，J.Ferment.Bioeng.(1992)73：179-184；van den Broek LAM等，AppL.Microbiol.Biotechnol.(2004)65：219-227)。根据糖基水解酶(GH)和糖基转移酶(GT)的基于序列的系统分类，SPase属于GH13家族(Glan GH-H)，通常称为α-淀粉酶家族。最近已经解开了来自青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)的SPase的三维结构，揭示了(β/α)8桶式(barrel)折叠和催化位点，其中两个羧基可能实现亲核体(Asp192)和广义酸/碱(Glu232)的作用。
如本文所用的“蔗糖磷酸化酶”不仅指EC 2.4.1.7类的酶，还指它的呈现出涉及其底物和产物的相同性质的分子或功能等同物。在本发明的范围内，酶的“功能等同物”或类似物是它的各种多肽，这些多肽也具有所需的生物学功能或活性，例如，酶活性。
本发明的一个实施方式涉及制备AA-2G的方法，其中SPase是宏基因组、微生物或细菌来源的。如本文所用，术语“宏基因组”指从环境样品直接回收的遗传物质。
本发明的另一个实施方式涉及制备AA-2G的方法，其中SPase是微生物或细菌来源的，优选是细菌来源的。
同型二聚体酶是指由两个相同的分子形成的酶复合物。一些SPase能够形成同型二聚体。同型二聚体SPase的实例尤其来源于青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、变形链球菌(Streptococcus mutans)或长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)。令人惊讶地是，同型二聚体SPase在L-AA的糖基化中表现出高位点选择性。因此，在本发明的一个实施方式中，蔗糖磷酸化酶是同型二聚体的蔗糖磷酸化酶。由于同型二聚体SPase具有高位点选择性，因此基本上不形成AA-6G副产物。因此，本发明的一个实施方式提供了制备AA-2G的方法，其中基本不形成副产物。根据本发明的另一个实施方式，在孵育步骤期间基本不形成AA-3G、AA-5G或AA-6G。
如本文所用，术语“副产物”是指任何不希望的产物，具体是指AA-3G、AA-5G或AA-6G。术语“基本上无副产物”是指按重量计副产物的含量不超过25％，不超过20％、15％、10％、5％或不超过1％。
本发明的一个实施方式涉及蔗糖磷酸化酶，其在7以下的pH，优选6以下的pH，更优选5以下的pH，最优选4以下的pH，显示出高稳定性。
在具体的实施方式中，相对于0小时(在孵育开始之前)的蔗糖磷酸化酶活性，本发明的蔗糖磷酸化酶在60℃，和在选自2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0的pH下孵育48小时之后，具有至少50％，优选至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、82％、84％、86％、90％、92％或至少94％的残余的蔗糖磷酸化酶活性。在优选的实施方式中，孵育pH为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5或7.0。在甚至更优选的实施方式中，孵育pH为5.2，且残余的活性为至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或至少82％。
如实施例2所述，使用连续偶联酶分析法在30℃测定SPase活性，其中在葡萄糖磷酸变位酶(PGM)和葡萄糖6-磷酸脱氢酶(G6P-DH)存在下，自蔗糖和无机磷酸盐生成Glc 1-P并伴有NAD+减少。
本发明的一个实施方式涉及使用从环境样品直接获得的遗传物质重组产生的蔗糖磷酸化酶。
使用微生物蔗糖磷酸化酶的优点在于这些酶的生产和分离简单且具有稳定性。它们可以从天然或重组表达SPase的微生物中获得。
本发明的一个实施方式涉及获自葡萄土壤杆菌(Agrobacterium vitis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、大肠杆菌(Escherichia coli)(优选大肠杆菌06)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)、肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、单核细胞增多性李司忒氏菌(Listeria monocytogenes)、腐败假单胞菌(Pseudomonas putrefaciens)、嗜糖假单胞菌(Pseudomonassaccharophila)、波罗的红小梨形菌(Rhodopirellula baltica)、波罗的希瓦氏菌(Shewanella baltica)、冷海希瓦氏菌(Shewanella frigidimarina)、Solibacterusitatus、变形链球菌(Streptococcus mutans)或聚球藻(Synechococcus sp)的蔗糖磷酸化酶。
本发明的一个实施方式涉及重组产生的蔗糖磷酸化酶，优选作为它的全长蛋白或催化活性片段，或融合蛋白。用于重组产生酶的方法是本领域技术人员已知的(例如Sambrook J.等，分子克隆：实验指南(Molecular cloning：a laboratory manual).ISBN0-87969-309-6)。
如本文所用，“全长蛋白”是指由来源于例如上述生物体的基因编码的蔗糖磷酸化酶蛋白。所述天然存在的基因(特别是所述基因的蔗糖磷酸化酶编码区)直接用于SPase的重组产生。
蔗糖磷酸化酶的“催化活性片段”是指蔗糖磷酸化酶的蛋白片段，其具有与天然SPase相同或基本相同的活性和底物特异性。片段的长度不重要，只要该片段具有与天然蔗糖磷酸化酶相同或相似的底物特异性并催化形成相同的产物。
术语“融合蛋白”是指蔗糖磷酸化酶或其催化活性片段与至少一种其他蛋白、多肽或肽重组融合。所述至少一种其他蛋白、多肽或肽可以是任何种类(例如酶)。
应注意的是，在本发明的范围内，还包括蔗糖磷酸化酶的功能性变异体(即包括缺失、取代和插入的突变)，只要这些功能性变异体具有与天然蔗糖磷酸化酶相同或基本相同的活性。
然而，当然也可以使用从天然产生蔗糖磷酸化酶的生物体中直接获得的蔗糖磷酸化酶。
在孵育步骤中可以以如下方式使用SPase：无细胞酶(cell-free enzyme)，该无细胞酶(cell-free enzyme)可以是但不必是经部分纯化的；全细胞系统，该全细胞系统经物理或化学预处理以提高细胞膜穿透性(透化)和机械稳定性；经包封的催化剂，在其中所述游离酶或全细胞系统被包封在优选凝胶状结构中，或被固定在载体上。有利地，将SPase固定在载体上，该载体优选是固体支撑体。该载体优选为色谱树脂，优选地选自由阴离子交换色谱树脂、阳离子交换色谱树脂、亲和色谱树脂(例如包含经固定的SPase特异性抗体)和疏水作用色谱树脂组成的组。
本发明的SPase可以(暂时或共价地)固定在任何载体上，优选颗粒(例如珠子)，特别是色谱树脂，只要酶的酶活性不会以改变其底物特异性或使其活性降低至低转化率的方式而受到影响。
在本发明的另一个实施方式中，以全细胞，无细胞提取物，粗提物，经纯化的或经固定的形式使用蔗糖磷酸化酶。
SPase的反应以异头构型的净存留的方式进行，并通过双置换机制发生，其中双置换机制涉及两个构型转化步骤：葡糖基供体的碳-氧键断裂和形成共价的β-葡糖基-酶(β-GLc-E)中间体；及，中间体与磷酸盐反应以产生Glc 1-P。在副反应中，β-Glc-E中间体可能被水拦截，而导致水解。蔗糖的水解转化是不可逆的，但进行的比磷酸化反应慢几乎两个数量级。SPase还催化与水解竞争发生的转葡糖基化反应，由此β-Glc-E中间体被外部亲核试剂攻击并产生新的α-D-葡糖苷。
生物化学研究显示了，SPase严格地特异性转化葡糖基部分且不允许在吡喃葡萄糖环上进行结构修饰(包括差向异构化和脱氧)。
要用于本发明的方法中的葡糖基供体可以是用作由SPase催化的转糖基反应的底物中的任一种。
SPase的已知葡糖基供体的列表很短：蔗糖、Glc 1-P和α-D-葡萄糖1-氟化物(D-glucose1-fluoride)。在三种已知的糖基供体中，蔗糖是廉价且高度稳定的高能葡糖基供体，且被SPase弱水解。
然而，葡糖基供体也可以选自由蔗糖，和其中的果糖基部分已被修饰或被取代为另一个酮基残基的蔗糖类似物，或其他稳定的活化葡糖基供体(例如α-D-葡萄糖-1-叠氮化物)，和/或它们的混合物组成的组。
本发明的一个实施方式涉及制备AA-2G的方法，其中葡糖基供体是蔗糖、Glc 1-P或α-D-葡萄糖1-氟化物，优选地，葡糖基供体是蔗糖或GLc 1-P，更优选是蔗糖。
相比而言，SPase对葡糖基受体的特异性相对宽松。
本发明的一个实施方式涉及制备AA-2G的方法，其中葡糖基受体是抗坏血酸或其功能性变异体。
当甘油受体的摩尔量比蔗糖通常过量≤2.5倍时，以≥90％供体底物转化的高产率获得立体化学纯的甘油葡萄糖苷，且浓度接近1M(250g/L)(Goedl等，Angew Chem Int EdEngL.2008；47(52)：10086-9)。Goedl等对不同研究小组测定的不同SPase酶的受体混杂性进行了很好的评论(Biocatal Biotrans.2010；28(1)：10-21)。使用SPase时，糖基转化反应的最佳pH为6.5～7.5。有趣的是，当乙酸用作葡糖基受体时，用于磷酸盐和对苯二酚的葡糖基化的蔗糖磷酸化酶(来自变形链球菌)的最佳pH 6.5转变为pH 5.0以下，这表明需要受体相互作用的基团的质子化形式来进行葡糖基单元的有效转移。
Kwon等(Biotechnol Lett.2007Apr；29(4)：611-615)公开了使用重组产生的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)蔗糖磷酸化酶，由L-AA和蔗糖一步制备AA-2G的可能性。所使用的L-AA和蔗糖的浓度分别为0.5％(w/v)和30％(w/v)，但从未尝试过大规模。结果没有公开所实现的AA-2G的浓度。Aerts等(Carbohydr Res.2011Sep 27；346(13)：1860-7)比较了6种不同的SP酶对80种假定受体的转葡糖基化活性。尽管在65mM的L-AA和50mM的蔗糖分别用作受体和供体底物时，使用来自青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)的蔗糖磷酸化酶可以清楚地观察到转葡糖基化产物，但是转葡糖基化速率比水解速率低大约100倍。因此，L-AA被描述为蔗糖磷酸化酶的弱受体。采用了蛋白质工程方法将蛋白质配体相互作用引入蔗糖磷酸化酶中以进行L-抗坏血酸的转葡糖基化，但并未成功。这些研究尚未证明蔗糖磷酸化酶在AA-2G制备中的实际应用。在上述研究中，反应在37℃和pH 7.0～7.5进行，这根本不利于葡糖基单元向L-AA的转移。并没有尝试过酸性pH的可能性。
本发明的目的是使用SPase使L-AA糖基化以一步制备AA-2G，同时不产生一些副产物或AA-2G的亚型。使用来自长双歧杆菌、青春双歧杆菌、肠系膜明串珠菌、嗜酸乳杆菌和变形链球菌的蔗糖磷酸化酶来检验L-AA的糖基化效率和特异性。所有的SPase在酸性pH下都成功地将L-AA糖基化。变形链球菌、青春双歧杆菌SPase和长双歧杆菌SPase只产生AA-2G。为了以高产率制备AA-2G，系统优化了试剂浓度和反应条件。结果，本发明的发明人出乎意料地发现，当反应在约5的pH、40～50℃及1.5倍过量的L-AA进行时，以非常显著的量形成了AA-2G。在反应结束时，在反应混合物中观察到AA-2G、L-AA、蔗糖、果糖和非常少量的葡萄糖，同时伴随少于3％w/w的未确定杂质。没有形成其他副产物或亚型，或其形成的量不足以被检测到。
本发明的另一个实施方式涉及制备AA-2G的方法，其中孵育步骤在4.0～7.0的pH范围内，或在4.0～6.5的范围，或4.5～6.5的范围，或4.8～6.2的范围，或5.0～5.5的范围内进行。令人惊讶地是，在约4.0～7.0范围内的pH，或约4.5～6.0范围内的pH，或约4.8～5.5范围内的pH，或约5.2的pH下进行时，位点选择性得到显著提高。在不合适的pH下反应会导致位点选择性差。在本发明的另一个实施方式中，孵育步骤在约5.2的pH下进行。
可以使用简单的有机和无机材料，或使用不同类型的缓冲混合物来调节反应介质的pH。可以在加入酶起始反应之前调节pH。也可以在反应过程中调节pH以保持所需的pH。可以手动或自动调节pH。
本发明的另一个实施方式涉及制备AA-2G的方法，其中孵育步骤在约30～70℃的温度范围，或在约35～65℃的范围，或在约40～60℃的范围，或在约40～50℃的范围内进行。在另一个实施方式中，孵育步骤在约40℃的温度下进行。
本发明的另一个实施方式涉及制备AA-2G的方法，其中孵育步骤进行至少24小时，优选至少48小时，更优选至少72小时。
本发明的另一个实施方式涉及制备AA-2G的方法，其中所使用的葡糖基受体的摩尔量比葡糖基供体过量0.3～3倍。在本发明的另一个实施方式中，所使用的葡糖基受体的摩尔量比葡糖基供体过量0.5～2.5倍，或过量1.0～2倍。在本发明的另一个实施方式中，所使用的葡糖基受体的摩尔量比葡糖基供体过量1.5倍。在本发明的另一个实施方式中，葡糖基受体是抗坏血酸而葡糖基供体是蔗糖。
本发明的另一个实施方式涉及制备AA-2G的方法，其中反应混合物中的蔗糖磷酸化酶的量在1U/mL～10000U/mL的范围内，或在5U/mL～100U/mL的范围内，或在10U/mL～50U/mL的范围内，或在20U/mL～40U/mL的范围内。在本发明的另一个实施方式中，蔗糖磷酸化酶的用量为约30U/mL。
本发明的另一个实施方式涉及制备AA-2G的方法，其中在孵育过程中，将额外的蔗糖磷酸化酶和蔗糖加入到反应混合物中，以将蔗糖磷酸化酶保持在1U/mL～10000U/mL的范围内，或在5U/mL～100U/mL的范围内，或在10U/mL～50U/mL的范围内，或在20U/mL～40U/mL的范围内，或为约30U/mL，且将蔗糖保持在100mM～2000mM的范围内，或在250mM～1000mM的范围内，或为约800mM。
本发明的另一个实施方式涉及制备AA-2G的方法，其中蔗糖磷酸化酶和蔗糖同时或在不同时间点加入到反应混合物中，以保持如上所述的需求量。
通过以下附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，但本发明并不限于此。
图1示出了2-O-α-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的化学结构。
图2示出了pH对长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶的AA-2G形成活性的影响。观察到AA-2G合成时不寻常的pH依赖性。在pH 7.0～7.5时几乎不形成任何AA-2G。降低pH时活性急剧增加，在pH 5.2时达到明显的最大值。进一步降低pH导致强烈的活性丧失。
图3示出了温度对长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶的AA-2G形成活性的影响。AA-2G合成的最佳温度为50℃。然而，为了使该方法中L-抗坏血酸的降解最小化，优选40℃的较低温度。
图4示出了供体(蔗糖)和受体(L-AA)底物浓度对长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶的AA-2G形成活性的影响。随着L-AA浓度的增加，AA-2G的合成显著增加。当向反应中加入1.5倍过量的L-AA时，AA-2G的浓度和产量最大化。
图5示出了由不同蔗糖磷酸化酶催化的L-抗坏血酸的转葡糖基化。所选择的代表蛋白家族内序列和结构多样性的蔗糖磷酸化酶表现出在位点选择性上的明显差异。结果在表1中进行了比较。
实施例
下面给出的实施例是为了帮助理解本发明，而不旨于，也不应该被理解为，以任何方式限制本发明的范围。实施例没有详细描述传统方法，例如克隆、转染和在微生物宿主细胞中表达蛋白质的方法的基本方面。这些方法对于本领域技术人员来说是公知的。
实施例1-蔗糖磷酸化酶的制备
用携带pC21E载体的大肠杆菌BL21宿主菌株来制备SPase，其中pC21E载体具有在his-标签下的SPase基因插入物。将基因克隆在tac1启动子系统下并用IPTG进行诱导。用微量移液管吸头从甘油储备液中刮擦出少量培养物，接种到含氨苄青霉素(120μg/mL)的50mLLB培养基中。将摇瓶在30℃摇床上以120rpm过夜孵育约12小时。将过夜的培养物接种到含氨苄青霉素(120μg/mL)的200mL LB培养基中，以产生0.01的OD600。将摇瓶在37℃、120rpm孵育数小时，直至OD600达到0.8～1.0。将IPTG加入到摇瓶中使其最终浓度为1mM。将摇瓶在25℃的摇床上以120rpm孵育近20小时。5000rpm离心15分钟收集细胞。倒掉上清液并用100mMpH5.2的柠檬酸盐缓冲液(每1g湿细胞重量使用5mL缓冲液)洗涤沉淀块。将1g湿细胞重悬于5mL裂解缓冲液(100mM pH 5.2、含有50mM NaCL+1mM EDTA+0.5mM DTT的柠檬酸盐缓冲液)中。悬浮液通过弗氏细胞压碎器(French press)2次。将得到的细胞裂解物以8000×g离心，以从未破碎的细胞和细胞碎片中分离出可溶级分。定量上清液中的SPase酶活性，分装并保存在-20℃备用。
实施例2：酶分析
使用连续偶联酶分析法在30℃测定SPase活性，其中在葡萄糖磷酸变位酶(PGM)和葡萄糖6-磷酸脱氢酶(G6P-DH)存在下，由蔗糖和无机磷酸盐生成GLc 1-P并伴有NAD+减少。基本上如其他地方所述，在50mM pH 7.0的磷酸钾缓冲液中进行标准分析，其中磷酸钾缓冲液含有10mM EDTA、10mM MgCl2和10μMα-D葡萄糖1,6-二磷酸。反应混合物含有250mM蔗糖、2.5mM NAD+、3U/mL PGM、3.4U/mL NAD+依赖性G6P-DH以及适当稀释的酶溶液。用分光光度法在340nm处监测NADH随时间的形成。1单位的SPase活性对应于，在上述条件下，导致NAD+每分钟减少1微摩尔的酶的量。使用BioRad染料结合法，以牛血清白蛋白作为标准来测定蛋白质浓度。
实施例3：2-O-α-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸的合成
将含有在水中的1200mM L-AA和800mM蔗糖或葡萄糖-1-磷酸和30U/mL SPase的反应混合物，在50℃以300rpm孵育48～72小时。优选地，在密封容器中，在黑暗条件下在pH5.2进行反应。使用采用BioRad HPX-87H柱的HPLC来分析产物，并用UV和RI检测器监测峰的洗脱曲线。将柱温保持在25℃，并使用20mM硫酸作为洗脱液，流速为0.4mL/min。在这些条件下，＞30％的L-AA被葡糖基化。对分离和纯化产物的NMR分析证实了AA-2G的α-1-2糖苷键。
实施例4：提高2-O-α-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸的产率
将含有在水中的1200mM L-AA和800mM蔗糖或葡萄糖-1-磷酸和30U/mL SPase的反应混合物在50℃以300rpm孵育。在反应过程中，监测蔗糖的消耗和SPase活性的丧失。在24小时、48小时和72小时后添加额外的蔗糖和SPase，以将蔗糖浓度和SPase活性恢复到其初始量，即分别为800mM和30U/mL。通过这种方式，产量增加了约1.5×。
实施例5：对额外的蔗糖磷酸化酶的评估
已经评估了来自青春双歧杆菌、变形链球菌、嗜酸乳杆菌、肠系膜明串珠菌的、代表蛋白质家族内的序列多样性的4种额外的蔗糖磷酸化酶。与形成AA-2G和AA-6G混合物的单体型相比，同型二聚体蔗糖磷酸化酶显示出在2-OH处对L-抗坏血酸的糖基化的高位点选择性，从而形成AA-2G。单体蔗糖磷酸化酶释放的AA-6G占总产物相当大的比例，而使用同型二聚体蛋白时AA-6G的形成不超过检出限。无论用何种方式，在pH 5.2合成AA-2G而在pH7.5基本无AA-2G合成，这是所有测试的蔗糖磷酸化酶的基本特征。
表1
蔗糖磷酸化酶 AA-2G[％] AA-6G[％]
变形链球菌(SmSPase) 100 0
嗜酸乳杆菌(LaSPase) 77 23
长双歧杆菌(BISPase) 100 0
肠系膜明串珠菌(LmSPase) 77 23
青春双岐杆菌(BaSPase) 100 0

Claims (37)

1.一种制备2-O-α-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸的方法，包括以下连续的步骤：
a.提供包含葡糖基供体和葡糖基受体的混合物，其中所述葡糖基供体是葡萄糖1-磷酸或蔗糖，所述葡糖基受体是抗坏血酸；
b.将所述混合物与蔗糖磷酸化酶一起孵育；
c.在孵育期间保持pH在4.8～5.5的pH范围内；
d.任选地，在反应期间加入额外的糖基供体和/或蔗糖磷酸化酶；和
e.分离和/或纯化2-O-α-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蔗糖磷酸化酶是宏基因组、微生物来源的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蔗糖磷酸化酶是细菌来源。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述蔗糖磷酸化酶是同型二聚体的。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蔗糖磷酸化酶在pH<7时是稳定的。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蔗糖磷酸化酶在pH<6时是稳定的。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蔗糖磷酸化酶在pH<5时是稳定的。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蔗糖磷酸化酶在pH<4时是稳定的。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，细菌的蔗糖磷酸化酶获自葡萄土壤杆菌(Agrobacterium vitis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)、肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、单核细胞增多性李司忒氏菌(Listeriamonocytogenes)、腐败假单胞菌(Pseudomonas putrefaciens)、嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)、波罗的红小梨形菌(Rhodopirellula baltica)、波罗的希瓦氏菌(Shewanella baltica)、冷海希瓦氏菌(Shewanella frigidimarina)、Solibacterusitatus、变形链球菌(Streptococcus mutans)和/或聚球藻(Synechococcus sp)。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述细菌的蔗糖磷酸化酶获自青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)。
11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述细菌的蔗糖磷酸化酶获自长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。
12.根据权利要求9所述的方法，其中，所述细菌的蔗糖磷酸化酶获自变形链球菌(Streptococcus mutans)。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蔗糖磷酸化酶是天然蛋白或突变型变异体。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蔗糖磷酸化酶以全长蛋白或其催化活性片段，或融合蛋白的方式重组产生。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蔗糖磷酸化酶以全细胞，无细胞提取物，粗提物，经纯化的或经固定的形式使用。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗坏血酸是L-抗坏血酸。
17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述孵育在pH 5.2进行。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述孵育步骤进行至少24小时。
19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述孵育步骤进行至少48小时。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述孵育步骤进行至少72小时。
21.根据权利要求1所述的方法，其中，所述孵育在30～70℃的温度范围内进行。
22.根据权利要求1所述的方法，其中，所述孵育在40～60℃的温度范围内进行。
23.根据权利要求1所述的方法，其中，所述孵育在40～50℃的温度范围内进行。
24.根据权利要求1所述的方法，其中，抗坏血酸以比蔗糖过量0.3～3倍的摩尔量来使用。
25.根据权利要求1所述的方法，其中，反应混合物中的蔗糖磷酸化酶的量在1U/mL～10000U/mL的范围内。
26.根据权利要求1所述的方法，其中，反应混合物中的蔗糖磷酸化酶的量在5U/mL～100U/mL的范围内。
27.根据权利要求1所述的方法，其中，反应混合物中的蔗糖磷酸化酶的量在10U/mL～50U/mL的范围内。
28.根据权利要求1所述的方法，其中，反应混合物中的蔗糖磷酸化酶的量在20U/mL～40U/mL的范围内。
29.根据权利要求1所述的方法，其中，反应混合物中的蔗糖磷酸化酶的量为30U/mL。
30.根据权利要求1所述的方法，其中，在孵育期间，将额外的蔗糖磷酸化酶和蔗糖加入孵育混合物中，以使蔗糖磷酸化酶保持在1U/mL～10000U/mL的范围内，并且使蔗糖保持在100mM～2000mM的范围内。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，蔗糖磷酸化酶保持在5U/mL～100U/mL的范围内。
32.根据权利要求30所述的方法，其中，蔗糖磷酸化酶保持在10U/mL～50U/mL的范围内。
33.根据权利要求30所述的方法，其中，蔗糖磷酸化酶保持在20U/mL～40U/mL的范围内。
34.根据权利要求30所述的方法，其中，蔗糖磷酸化酶保持在30U/mL。
35.根据权利要求30-34中任何一项所述的方法，其中，蔗糖保持在250mM～1000mM的范围内。
36.根据权利要求35所述的方法，其中，蔗糖保持在800mM。
37.根据权利要求30-34中任何一项所述的方法，其中，同时或在不同时间点，加入蔗糖磷酸化酶和蔗糖。
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