KR20180072705A

KR20180072705A - 소분자 글리코실화 방법

Info

Publication number: KR20180072705A
Application number: KR1020187011643A
Authority: KR
Inventors: 라마 크리쉬나 구디민치; 베른트 니데츠키
Original assignee: 아시브 게엠베하
Priority date: 2015-09-25
Filing date: 2016-09-22
Publication date: 2018-06-29
Also published as: CN108350474A; JP7000327B2; JP2018535693A; EP3353311B1; WO2017050920A1; EP3353311A1; ES2886572T3; US20180291410A1; CN108350474B

Abstract

본 발명은 글루코실 공여체 및 글루코실 수용체로부터 산성 조건 하에 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산(AA-2G)을 생산하는 방법 및 수크로스 포스포릴라아제의 용도에 관한 것이다.

Description

소분자 글리코실화 방법

본 발명은 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산의 수크로스 포스포릴라아제 매개 생산 방법에 관한 것이다.

알려진 모든 L-아스코르브산 유도체 중에서, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산은 매우 안정적인 형태이다. L-아스코르브산의 2-위치에서 하이드록실기(이의 생물학적 활성 및 안정성에 중요함)의 변형은 L-아스코르브산(LAA)의 안정성을 유의적으로 개선시켰다. L-아스코르브산의 2-위치에서 하이드록실기의 글리코실화는 포스페이트 및 설페이트 유도체와 같은 다른 유도체보다 몇몇의 이점을 제공한다. 3-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 (AA-3G), 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 (AA-5G) 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 (AA-6G)과 같은 L-AA 글루코시드의 다른 아이소폼이 합성되었지만, 이들 중 어느 것도 AA-2G와 같이 좋은 안정성을 나타내지 않았다.

a. AA-2G는 어느 생물학적 활성 및 환원력도 나타내지 않으면서, 극도로 불활성인 형태이므로, 극도의 물리적 및 화학적 안정성을 가지고 있다.

b. 생체에 의해 분비되는 α-글루코시다아제 효소의 작용에 의해 AA-2G가 L-아스코르브산 및 D-글루코스로 가수분해되고, L-아스코르브산에 내재된 생물학적 활성을 나타낼 때, L-아스코르브산의 특성이 드러난다.

c. AA-2G는 몇몇의 특정한 조건 하에 생체 내에서 합성되고 대사되는 것이 입증되었다. 따라서, AA-2G는 매우 안정화된 L-AA의 가장 안전한 형태로 알려져 있다.

d. AA-2G의 물 및 유성 물질에서의 높은 용해성 때문에, AA-2G는 비타민 C 보충제로서, 경구 및 국소 제제로 유리하게 사용된다.

글리코실 트랜스퍼라제(GTs)는 자연계에서 글리코시드의 합성에 관여하는 효소인 반면에, 글리코실 하이드로라아제(GHs)는 이들을 분해하기 위해 진화해왔다. 글리코실 트랜스퍼라제 및 글리코실 하이드로라아제 모두 매우 다양한 글리코시드 들의 생산을 위해 성공적으로 사용되어 왔다. 이들 효소는 또한 AA-2G의 효소적 합성에 사용되어 왔다.

GHs에 속하는, 래트 장(intestinal) 및 벼 종자의 α-글루코시다아제는, 말토스 및 L-AA가 각각 공여체 및 수용체 기질로서 사용되었을 때, AA-2G를 생산하였다. 그러나, 이들 두개의 효소는 항상 AA-2G와 함께, AA-6G, AA-5G 아이소폼을 불가피하게 생산한다. 효소들은 상업적 용도로 흥미있는 저렴한 말토스를 공여체 기질로 사용하여 하나의 글루코시드만을 생산하지만, 효소들은 값싸게 이용 가능하지 않고, 아이소폼의 존재는 AA-2G의 분리 및 정제를 어렵게한다. A. niger로부터의 α-글루코시다아제는 AA-6G를 대다수 생산하였고, AA-2G는 거의 생산하지 않았다.

GTs에 속하는 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라제(CGTase)는 AA-2G의 대규모 생산에 대하여 잘 연구된 또 다른 효소이다. EP0425066는 CGTase와 같은 당류-전달 효소가 L-아스코르브산 및 α-글루코실 당류를 함유하는 용액 상에서 AA-2G 및 부산물을 형성하기 위해 작용하도록 하는 산업적 규모에서 수행될 수 있는, AA-2G를 생산하는 과정을 개시한다. CGTase는 공여체 기질로서 사이클로덱스트린(가장 선호되는 공여체 기질) 또는 녹말과 함께 사용될 때, 선형의 말토올리고당류의 전체 또는 일부가 L-AA에 전달되기 때문에, 몇몇의 AA-2-말토올리고당류 부산물이 불가피하게 형성되었다. 상이한 중합도를 가지는 생성된 몇몇의 부산물은 추가적인 글루코아밀라아제 처리에 의해 AA-2G로 더 다듬어졌다. CGTase의 사용은 항상 AA-3G 및 AA-6G와 같은 다른 아이소폼을 상대적으로 적은 양으로 생산하였다. 이러한 아이소폼들의 존재는 다른 아이소폼으로부터 AA-2G의 분리에 있어 특히 하위 과정에서 다시 복잡한 결합을 도입하였다. CGTase는 몇몇의 부산물의 형성 및 추가적인 글루코아밀라아제 처리를 피하기 위해, 공여체 기질로서 말토스를 수용할 수 있도록 조작되었지만, 거의 성공을 달성하지 못하였고, 수율이 전혀 매력적이지 않았다(Han et al. 참조).

WO2004013344는 AA-5G 또는 AA-6G가 형성되지 않거나 검출될 수 없을 정도의 작은 양으로 형성되는(<0.1% wt/wt 건조 고체 기준 상에서), 아르드로박터 글로비포르미스(Arthrobacter globiformis)로부터의 α-아이소말토실 글루코당류(α-isomaltosyl glucosaccharide) 형성 효소(IMG)를 사용하여 AA-2G를 생산하는 과정을 개시한다. 이 과정에서, IMG는 공여체 기질로서의 부분적인 녹말 가수분해물 및 CGTase와 함께 글리코실전이 효소로서 사용되었다(녹말을 올리고당류로 분해하기 위함). 이들 두개의 효소의 조합은 수율을 개선시켰고 0.1% 이하로 AA-5G 및 AA-6G 함량의 형성을 감소시켰다. 그러나, 몇몇의 부산물의 형성은 피할 수 없었다. 부산물들은 AA-2G로 전환되기 위해 추가로 글루코아밀라아제로 처리되었다. 따라서, 이 시스템은 전체 과정을 효율적으로 운영하기 위해서 총 3개의 효소를 필요로 했다.

현재 이용 가능한 효소적 방법은 AA-2G를 대규모로 생산할 수 있다. 몇몇의 부산물 및 반응의 끝에서 상이한 아이소폼의 존재는 여전히 전체 과정에 있어 장애이고, AA-2G 분리 및 정제에 있어 방해가 된다. 부산물은 글루코아밀라아제 처리에 의해 AA-2G로 전환될 수 있고, AA-2G는 강한-산성 양이온 교환 수지를 사용하여 L-AA 및 글루코스로부터 쉽게 분리될 수 있다. 그러나, AA-2G와 함께 형성되는 AA-5G 및 AA-6G 아이소폼은 용해도 및 크로마토그래피 특성에 있어 그들의 유사성으로 인해 거의 분리되지 않는다. EP0539196은 이들의 환원력으로부터 기인한 이들의 산화능(oxidizability)을 유리하게 이용하여, AA-2G로부터 AA-5G 및 AA-6G를 분리하는 방법을 개시하였다. 이 과정은 AA-5G 및 AA-6G를 산화시키지만, AA-2G의 수율을 감소시키도록 AA-2G에 영향을 줄 수 있는 과도한 산화를 허용하지 않는, 반응 조건의 정확한 조절을 필요로 한다.

따라서, 고수율로 AA-2G의 생산을 위한 개선된 공정에 대한 필요성이 여전히 존재한다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 AA-2G의 대규모 제조를 위한 효율적인 원-스텝 생산 공정을 제공하는 것이다.

상기 목적은 본 발명의 주제에 의해 해결된다.

본 발명에 따르면, 다음의 순차적인 단계를 포함하는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산(AA-2G)을 생산하는 방법을 제공한다:

a. 글루코실 공여체 및 글루코실 수용체를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계;

b. 수크로스 포스포릴라아제와 상기 혼합물을 인큐베이션(incubation)하는 단계;

c. 인큐베이션 동안 pH 7.0 이하로 유지하는 단계; 및

d. 반응 동안에 추가적인 글루코실 공여체 및/또는 수크로스 포스포릴라아제를 선택적으로 투여하는 단계; 및

e. 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산을 분리 및/또는 정제하는 단계.

도 1은 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산(AA-2G)의 화학 구조를 나타낸다.
도 2는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)의 수크로스 포스포릴라아제 효소의 AA-2G 형성 활성에 대한 pH의 효과를 나타낸다.
도 3은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)의 수크로스 포스포릴라아제 효소의 AA-2G 형성 활성에 대한 온도의 효과를 나타낸다.
도 4는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)의 수크로스 포스포릴라아제 효소의 AA-2G 형성 활성에 대한 공여체(수크로스) 및 수용체(L-AA) 기질 농도의 효과를 나타낸다.
도 5는 다른 수크로스 포스포릴라아제에 의해 촉매된 L-아스코르브산의 트랜스글루코실화를 나타낸다.

구현예의 상세한 설명

본 발명은 다음의 순차적인 단계를 포함하는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 생성을 위한 신규하고 개선된 방법을 제공한다:

b. 수크로스 포스포릴라아제와 함께 상기 혼합물을 인큐베이션하는 단계;

c. 인큐베이션 동안 pH 7.0 이하로 유지하는 단계; 및

d. 반응 동안에 수크로스 포스포릴라아제 뿐만 아니라 추가적인 글리코실 공여체를 선택적으로 투여하는 단계; 및

따라서, 공여체 기질로서 단순하고 값싼 이당류 또는 단당류를 이용할 수 있고, L-AA의 2-위치에서만 트랜스글리코실화를 수행할 수 있는 효소를 발견하는 것이 목적이었다.

GT 및 GT 부류 중에, 글리코사이드 포스포릴라아제(GPs)는 몇몇의 부분에 있어 특별하다. GPs는 α- 및 β-D-글리코사이드, 주로 다양한 중합도의 이당류 및 올리고- 또는 다-당류를 포함하는 글루코사이드(Glc-OR)의 가인산분해 반응을 촉진시킨다. 포스페이트는 일반적으로 α-D-글루코스-1-포스페이트(Glc-1-P)를 초과하는 대규모로 존재하기 때문에, 포스페이트(Pi)로의 글루코실 전이는 생체내에서 열역학적으로 선호된다. 그러나, GP-촉매 반응의 열역학적 평형 상수(Keq)는 GTs (Keq <<1) 및 GHs (Keq >>1)의 반응에 대한 Keq 값 사이로 떨어진다. 상대적으로 유리한 Keq 및 대부분의 GTs에 의해 필요로 되는 포스포-활성화된 당류는 뉴클레오티드-활성화된 당류보다 덜 비싸다는 사실은, GPs를 글루코사이드의 입체- 및 위치특이적 합성을 위한 흥미로운 생체 촉매가 되도록 한다.

수크로스 포스포릴라아제(SPase; EC 2.4.1.7), 글루코실 포스포릴라아제는 수크로스 및 포스페이트의 D-프록토스 및 α-D-글루코스-1-포스페이트(Glc 1-P)로의 전환을 촉매시킨다. SPase는 많은 박테리아 근원으로부터 분리되었다. SPase를 코딩하는 유전자는 상이한 박테리아로부터 클로닝되었고, 이종유래로 발현되었다(Kawasaki H et al., Biosci. Biotech. Biochem. (1996) 60:322-324; Kitao S and Nakano E, J. Ferment. Bioeng. (1992) 73:179-184; van den Broek LAM et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2004) 65:219-227). 글리코실하이드로라아제(GH) 및 글리코실트랜스퍼라제(GT)의 조직적인 서열-기반의 부류에 따르면, SPase는 GH13(Clan GH-H) 군에 속하고, 종종 α-아밀라아제 군으로서 지칭된다. 2개의 카르복실기가 친핵체(Asp192) 및 일반적인 산/염기(Glu232)의 역할을 아마도 만족시키는, (베타/알파) 8 배럴 폴드 및 촉매 부위를 밝히며, 비피도박테리움 아돌센티스(Bifidobacterium adolescentis)로부터의 SPase의 3-차원적 구조는 최근에 해명되었다.

본 발명에서 사용된 바와 같이, "수크로스 포스포릴라아제"는 EC 2.4.1.7 부류의 효소뿐만 아니라, 이의 기질 및 산물에 관하여 동일한 특성을 나타내는 분자 또는 이의 기능적 등가물을 지칭한다. 본 발명의 범위 내에서, "기능적 등가물" 또는 효소의 유사체는, 바람직한 생물학적 기능 또는 활성, 예를 들어 효소 활성을 더욱이 가지는, 이의 다양한 폴리펩타이드이다.

본 발명의 하나의 구현예는 AA-2G를 생산하는 방법에 관한 것이고, 여기에서 SPase는 메타지노믹스, 미생물 또는 박테리아 기원이다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, "메타지노믹스"는 환경적 시료로부터 직접적으로 회수되는 유전 물질을 지칭한다.

본 발명의 또 다른 구현예는 AA-2G를 생산하는 방법에 관한 것이고, 여기에서 SPase는 미생물 또는 박테리아 기원, 바람직하게는 박테리아 기원이다.

호모다이머(homodimeric) 효소는 2개의 동일한 분자에 의해 형성된 효소 복합체를 지칭한다. 몇몇의 SPase는 호모다이머를 형성할 수 있다. 호모다이머 SPase의 예시는 비피도박테리움 아돌센티스, 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans), 비피도박테리움 롱검으로부터 유래된 것들이 있다. 놀랍게도, 호모다이머 SPase는 L-AA의 글리코실화에서 높은 위치-선택성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 하나의 구현예에서, 수크로스 포스포릴라아제는 호모다이머 수크로스 포스포릴라아제이다. 호모다이머 SPase의 높은 위치선택성 때문에, 실질적으로는 AA-6G 부산물이 형성되지 않는다. 따라서, 본 발명의 하나의 구현예에서, AA-2G를 생성하는 방법이 제공되고, 여기에서 실질적으로 부산물이 형성되지 않는다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 실질적으로 AA-3G, AA-5G 또는 AA-6G는 인큐베이션 단계 동안 형성되지 않는다.

본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "부산물"은 임의의 바람직하지 않은 산물, 구체적으로 AA-3G, AA-5G 또는 AA-6G를 지칭한다. 용어 "실질적으로 부산물이 없는 것"은 부산물의 함량이 25% 중량 미만, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 중량 미만인 것을 의미한다.

본 발명의 하나의 구현예는 7 이하의 pH, 바람직하게는 6 이하의 pH, 더 바람직하게는 5 이하의 pH, 가장 바람직하게는 4 이하의 pH에서 높은 안정성을 나타내는 수크로스 포스포릴라아제에 관한 것이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 수크로스 포스포릴라아제는 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0 및 7.0으로부터 선택되는 pH 및 60 °C에서 48시간 동안의 인큐베이션 후에, 0시간(인큐베이션 개시 전)의 수크로스 포스포릴라아제 활성과 비교하여 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82%, 84%, 86%, 90%, 92% 또는 적어도 94%의 잔여 수크로스 포스포릴라아제 활성을 가진다. 바람직한 구현예에서, 인큐베이션 pH는 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 또는 7.0이다. 보다 더 바람직한 구현예에서, 인큐베이션 pH는 5.2이고, 잔여 활성은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 적어도 82%이다.

SPase 활성은 30 °C에서 연속적인 연결된 효소 분석법(continuous coupled enzymatic assay)을 사용하여 측정되었고, 실시예 2에 기재된 바와 같이, 수크로스 및 무기 인산으로부터의 Glc 1-P의 생성은 포스포글루코뮤타아제(PGM) 및 글루코스-6-포스페이트 디하이드로지나아제(G6P-DH)의 존재 하에, NAD+의 환원과 연결되었다.

본 발명의 하나의 구현예는 환경적 시료로부터 직접적으로 수득된 유전 물질을 사용하여 재조합적으로 생성된 수크로스 포스포릴라아제에 관한 것이다.

미생물 수크로스 포스포릴라아제를 이용하는 것의 이점은 단순한 생성과 분리 및 이들 효소의 안정성이다. 이들은 자연적으로 또는 재조합적으로 SPase를 발현하는 미생물로부터 수득될 수 있다.

본 발명의 하나의 구현예는 아그로박테리움 비티스(Agrobacterium vitis), 비피도박테리움 아돌센티스, 비피도박테리움 롱검, 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli), 바람직하게는 에쉐리키아 콜라이 06(Escherichia coli 06), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 델브루에키이 아종 락티스(Lactobacillus delbrueckii subs. Lactis), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 슈도모나스 퓨트리파시엔스(Pseudomonas putrefaciens), 슈도모나스 사카로필리아(Pseudomonas saccharophila), 로도피렐룰라 발티카(Rhodopirellula baltica), 슈와넬라 발티카(Shewanella baltica), 슈와넬라 프리기디마리나(Shewanella frigidimarina), 솔리박터 우시타투스(Solibacter usitatus), 스트렙토코쿠스 무탄스 또는 시네초코커스 종(Synechococcus sp.)으로부터 수득되는 수크로스 포스포릴라아제에 관한 것이다.

본 발명의 하나의 구현예는 재조합적으로 생산된 수크로스 포스포릴라아제, 바람직하게는 전-장 단백질 또는 이의 촉매 활성 단편 또는 융합 단백질에 관한 것이다. 효소들의 재조합 생산을 위한 방법은 당업계의 기술자에게 알려져 있다(예를 들어, Sambrook J. et al. Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6).

본 발명에서 사용된 바와 같이, "전-장 단백질"은 예를 들어 상기에 나열된 유기체와 같은, 유기체로부터 유래된 유전자에 의해 코딩되는 수크로스 포스포릴라아제 단백질을 지칭한다. 상기 자연적으로 발생하는 유전자, 특히 상기 유전자의 수크로스 포스포릴라아제를 코딩하는 영역은 SPase의 재조합 생산을 위해 직접적으로 이용된다.

수크로스 포스포릴라아제의 "촉매 활성 단편"은 천연 SPase와 동일하거나 실질적으로 동일한 활성 및 기질 특이성을 갖는 수크로스 포스포릴라아제의 단백질 단편을 지칭한다. 단편이 천연 수크로스 포스포릴라아제와 동일하거나 유사한 기질 특이성을 가질 것이고, 동일한 산물의 형성을 촉매시킬 것이라는 것을 전제로, 단편의 길이는 중요하지 않다.

용어 "융합 단백질"은 적어도 하나의 추가적인 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 재조합적으로 융합된 수크로스 포스포릴라아제 또는 이의 촉매 활성 단편을 지칭한다. 상기 적어도 하나의 추가적인 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 임의의 종류(예를 들어, 효소)일 수 있다.

본 발명의 범위 내에서, 수크로스 포스포릴라아제의 기능적 변이체(즉, 결실, 치환 및 삽입을 포함한 돌연변이)를 포함하며, 이들 기능적 변이체는 천연 수크로스 포스포릴라아제와 동일하거나 실질적으로 동일한 활성을 가짐을 전제로 하는 것은 주목되는 점이다.

그러나, 자연적으로 상기 수크로스 포스포릴라아제를 생산하는 유기체로부터 직접적으로 수득된 수크로스 포스포릴라아제를 사용하는 것도 물론 가능하다.

SPase는 부분적으로 정제될 필요가 없을 수 있는 세포-없는 효소, 개선된 세포막 투과성(투과도) 및 기계적 안정성을 위해 물리적으로 또는 화학적으로 전-처리된 전-세포 시스템, 상기 유리 효소 또는 전-세포 시스템이 바람직하게는 젤-유사 구조로 또는 담체 상에서 고정화된 것으로 포획된 캡슐화된 촉매로서, 인큐베이션 단계에서 적용될 수 있다. 유리하게도 SPase는 바람직하게는 고체 지지체인 담체 상에서 고정화된다. 담체는 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피 수지, 양이온 교환 크로마토그래피 수지, 친화성 크로마토그래피 수지(예를 들어, 고정화된 SPase 특이적 항체를 포함하는) 및 소수성 반응 크로마토그래피 수지로 이루어진 군으로부터 선택되는, 바람직하게는 크로마토그래피 수지이다.

본 발명의 SPase는 효소의 효소적 활성이 이의 기질 특이성을 변화시키거나 낮은 전환율으로 이의 활성을 감소시키는 방식으로 영향을 주지 않는다는 전제로, 임의의 담체, 바람직하게는 입자(예를 들어, 비드), 특히 크로마토그래피 수지 상에서 고정화될 수 있다(일시적으로 또는 공유결합적으로).

본 발명의 또 다른 구현예에서, 수크로스 포스포릴라아제는 전-세포, 무세포 추출액의 형태, 가공하지 않은, 정제된 또는 고정화된 형태로서 사용된다.

SPase의 반응은 아노머성 입체배치의 순보존(net retention)으로 진행되고, 배열과 관련하여 반전하는 두 단계: 글루코실 공여체의 탄소-산소 결합의 절단 및 공유결합 β-글루코실-효소(β-Glc-E) 중간체의 형성; 및 Glc 1-P을 수확하는 포스페이트와 중간체의 반응을 수반하는 이중 변위 메커니즘을 통해 일어난다. 부반응(side reaction)에서, β-Glc-E 중간체는 가수분해를 일으키는 물에 의해 방해될 수 있다. 수크로스의 가수분해 전환은 비가역적이지만, 가인산분해 반응보다 거의 두 자릿수 정도로 느리게 진행된다. SPase는 또한 가수분해와 경쟁적으로 일어나는 트랜스글루코실화 반응을 촉매시키고, 이로 인하여 β-Glc-E 중간체는 외부의 친핵체에 의해 공격을 받고, 새로운 α-D-글루코사이드가 생성된다.

생화학적 연구는 SPase가 글루코실 모이어티를 전달하는데 엄격하게 특이적이고, 에피머화 및 탈산소화를 포함한 글루코피라노실 고리 상의 구조적 변형을 허용하지 않음을 보여주었다.

본 발명의 방법에서 적용되는 글루코실 공여체는 SPase에 의해 촉매되는 트랜스글리코실화 반응을 위한 기질로서 역할을 하는 임의의 것이 될 수 있다.

SPase에 대한 알려진 글루코실 공여체의 목록은 간단하다: 수크로스, Glc 1-P 및 α-D-글루코스 1-플루오라이드. 세개의 알려진 글리코실 공여체 중에서, 수크로스는 저렴하고 매우 안정적인 고-에너지 글루코실 공여체이며, SPase에 의해 약하게 가수분해된다.

그러나, 글루코실 공여체는 또한 수크로스 및 프럭토실 모이어티가 변형되었거나 또 다른 케토실 잔기에 의해 치환되었던 수크로스의 유사체, 또는 α-D-글루코스-1-아지드와 같은 더욱 안정적이고 활성화된 글루코실 공여체, 및/또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 하나의 구현예는 AA-2G를 생산하는 방법에 관한 것이고, 여기에서 글루코실 공여체는 수크로스, Glc 1-P 또는 α-D-글루코스 1-플루오라이드이고, 글루코실 공여체는 바람직하게는 수크로스 또는 Glc 1-P, 더 바람직하게는 수크로스이다.

반면에, 글루코실 수용체에 대한 SPase의 특이성은 비교적 완화된다.

본 발명의 하나의 구현예는 AA-2G를 생산하는 방법에 관한 것이고, 여기에서 글루코실 수용체는 아스코르브산 또는 이의 기능적 변이체이다.

입체화학적으로 순수한 글루코실글리세롤은 전환된 공여체 기질 ≥90%의 높은 수율로 수득되었고, 글리세롤 수용체가 일반적으로 수크로스를 ≤2.5-배 몰로 초과하였을 때, 농도는 거의 1 M(250 g/L)에 가까웠다(Goedl et al., Angew Chem Int Ed Engl. 2008;47(52):10086-9). 상이한 연구 그룹에 의해 결정된 다른 SPase 효소의 수용체 혼란(promiscuity)은 Goedl 등에 의해 훌륭하게 재조사되었다(Biocatal Biotrans. 2010; 28(1):10-21 ). SPase를 사용한 글리코실 전이 반응을 위한 최적의 pH는 6.5 내지 7.5이다. 흥미롭게도, 아세트산이 글루코실 단위의 효율적인 전달을 위한 수용체의 상호작용 그룹의 양성자가 부가된(protonated) 형태의 요구를 나타내는 글루코실 수용체로서 사용되었을 때, 포스페이트 및 하이드로퀴논의 글루코실화를 위한 수크로스 포스포릴라아제(스트렙토코쿠스 무탄스로부터)의 최적의 pH 6.5는 pH 5.0 이하로 변화되었다.

Kwon 등(Biotechnol Lett. 2007 Apr;29(4):611-615)은 재조합적으로 생산된 비피도박테리움 롱검 수크로스 포스포릴라아제를 사용하여 하나의 단계에서 L-AA 및 수크로스로부터 AA-2G를 생산할 수 있는 가능성을 개시하였다. 사용된 L-AA 및 수크로스의 농도는 각각 0.5 % (w/v) and 30 % (w/v)이었고, 대규모로 시도된 적이 없었다. 결과는 획득된 AA-2G의 농도를 개시하지 않았다. Aerts 등(Carbohydr Res. 2011 Sep 27;346(13):1860-7)은 80개의 추정적인 수용체 상에서 6개의 상이한 SP 효소의 트랜스글루코실화 활성을 비교하였다. 65 mM의 L-AA 및 50 mM의 수크로스가 각각 수용체 및 공여체 기질로서 사용되었을 때, 트랜스글루코실화된 산물은 비피도박테리움 아돌센티스로부터의 수크로스 포스포릴라아제를 사용하여 정확하게 관측될 수 있지만, 트랜스글루코실화 비율은 가수분해의 비율보다 약 100배 더 낮았다. 이에 따라, L-AA는 수크로스 포스포릴라아제의 약한 수용체로 기재되어 있었다. 단백질 공학 접근법은 L-아스코르브산의 트랜스글루코실화를 위해 수크로스 포스포릴라아제에서 단백질 리간드 상호작용을 도입하기 위해 적용되었지만, 성공적이지 않았다. 이러한 연구들은 수크로스 포스포릴라아제의 AA-2G 생산에서의 실용적인 적용을 입증하지 않았다. 상기에 언급된 연구들에서, 반응은 글루코실 단위의 L-AA로의 전달을 위해 전혀 선호되지 않는 37 °C 및 pH 7.0 내지 7.5에서 수행되었다. 산성 pH에서의 가능성을 확인하는 시도들은 없었다.

본 발명의 목적은 SPase를 사용하여 몇몇의 부산물 또는 AA-2G의 아이소폼이 생성되지 않는, 단일 단계에서 AA-2G를 생산하기 위한 L-AA의 글리코실화이었다. 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 아돌센티스, 류코노스톡 메센테로이데스, 락토바실러스 아시도필루스 및 스트렙토코커스 무탄스로부터의 수크로스 포스포릴라아제 효소는 글리코실화 효능 및 L-AA의 특이성을 확인하기 위해 사용되었다. 모든 SPase는 산성 pH에서 L-AA를 글리코실화하는데 있어 성공적이었다. 스트렙토코커스 무탄스, B. 아돌센티스 SPase 및 B. 롱검 SPase는 AA-2G만을 생성하였다. 반응물 농도 및 반응 조건은 고수율의 AA-2G 생산을 표적으로 하여 체계적으로 최적화되었다. 결과적으로, 본 발명의 발명자는 약 pH 5, 40-50°C 사이에서 및 1.5배 초과된 L-AA와 함께 반응이 수행되었을 때, 예상외로 AA-2G가 엄청난 양으로 형성되었음을 발견하였다. 반응의 마지막에, 반응 혼합물에서 AA-2G, L-AA, 수크로스, 프럭토스 및 매우 적은 글루코스가 3 % w/w 미만의 확인되지 않은 불순물과 함께 관측되었다. 다른 부산물 또는 아이소폼은 형성되지 않았거나, 검출될 수 있었던 양으로 형성되지 않았다.

본 발명의 또 다른 구현예는 AA-2G를 생산하는 방법에 관한 것이고, 여기에서 인큐베이션 단계는 pH 4.0 내지 7.0 범위, 또는 pH 4.0 내지 6.5 범위, 또는 pH 4.5 내지 6.5 범위, 또는 pH 4.8 내지 6.2 범위, 또는 pH 5.0 내지 5.5 범위에서 수행된다. 놀랍게도, 위치 선택성은 약 pH 4.0 내지 7.0 범위, 또는 약 pH 4.5 내지 6.0 범위, 또는 약 pH 4.8 내지 5.5 범위, 또는 약 pH 5.5에서 작용함으로써, 매우 개선된다. 적절하지 않은 pH에서의 반응은 열등한 위치-선택성을 초래할 것이다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 인큐베이션 단계는 약 pH 5.2에서 수행된다.

반응 배지의 pH는 단순한 유기 및 무기 물질을 사용하거나 완충액 혼합물의 상이한 유형을 사용함으로써 조절될 수 있다. pH는 효소 첨가에 의한 반응이 개시되기 전에 조절될 수 있다. pH는 또한 바람직한 pH를 유지하기 위해 반응 동안 조절될 수 있다. pH는 수동으로 또는 자동으로 조절될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예는 AA-2G를 생산하는 방법에 관한 것이고, 여기에서 인큐베이션 단계는 약 30 내지 70 °C의 온도 범위, 또는 약 35 내지 65 °C의 온도 범위, 또는 약 40 내지 60 °C의 온도 범위, 또는 약 40 내지 50 °C의 온도 범위에서 수행된다. 또 다른 구현예에서, 인큐베이션 단계는 약 40 °C의 온도에서 수행된다.

본 발명의 또 다른 구현예는 AA-2G를 생산하는 방법에 관한 것이고, 여기에서 인큐베이션 단계는 적어도 24시간, 바람직하게는 적어도 48시간, 더 바람직하게는 적어도 72시간 동안 수행된다.

본 발명의 또 다른 구현예는 AA-2G를 생산하는 방법에 관한 것이고, 여기에서 글루코실 수용체는 글루코실 공여체에 비해 0.3 내지 3배 몰 초과되어 사용된다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 글루코실 수용체는 글루코실 공여체에 비해 0.5 내지 2.5배 몰 초과 또는 1.0 내지 2배 몰 초과되어 사용된다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 글루코실 수용체는 글루코실 공여체에 비해 1.5배 초과되어 사용된다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 글루코실 수용체는 아스코르브산이고 글루코실 공여체는 수크로스이다.

본 발명의 또 다른 구현예는 AA-2G를 생산하는 방법에 관한 것이고, 여기에서 반응 혼합물에서의 수크로스 포스포릴라아제의 양은 1 U/mL 내지 10,000 U/mL의 범위, 또는 5 U/mL 내지 100 U/mL의 범위, 또는 10 U/mL 내지 50 U/mL의 범위, 또는 20 U/mL 내지 40 U/mL의 범위이다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 수크로스 포스포릴라아제는 약 30 U/mL의 양으로 사용된다.

본 발명의 또 다른 구현예는 AA-2G를 생산하는 방법에 관한 것이고, 여기에서 수크로스 포스포릴라아제를 1 U/mL 내지 10,000 U/mL의 범위, 또는 5 U/mL 내지 100 U/mL의 범위, 또는 10 U/mL 내지 50 U/mL의 범위, 또는 20 U/mL 내지 40 U/mL의 범위, 또는 약 30 U/mL로 유지하고, 수크로스를 100 내지 2,000 mM의 범위, 또는 250 mM 내지 1,000 mM의 범위 또는 약 800 mM으로 유지하기 위해, 추가적인 수크로스 포스포릴라아제 및 수크로스가 인큐베이션 동안에 반응 혼합물에 첨가된다.

본 발명의 또 다른 구현예는 AA-2G를 생산하는 방법에 관한 것이고, 여기에서 상기에 기재된 바와 같이 필요로 되는 양을 유지하기 위해, 수크로스 포스포릴라아제 및 수크로스는 동시에 또는 다른 시점에 반응 혼합물에 첨가된다.

본 발명은 또한 하기의 도 및 실시예에 의해, 이에 제한되지 않으면서, 추가로 설명된다.

도 1은 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산(AA-2G)의 화학 구조를 나타낸다.

도 2는 비피도박테리움 롱검의 수크로스 포스포릴라아제 효소의 AA-2G 형성 활성에 대한 pH의 효과를 나타낸다. AA-2G 합성의 특이한 pH 의존이 관측되었다. pH 7.0 - 7.5에서는 AA-2G가 거의 형성되지 않았다. pH를 낮추면서 활성이 급격히 증가하였고, pH 5.2에서 뚜렷한 최대치에 도달하였다. pH에서 더 낮추면, 활성 손실이 크게 나타났다.

도 3은 비피도박테리움 롱검의 수크로스 포스포릴라아제 효소의 AA-2G 형성 활성에 대한 온도의 효과를 나타낸다. AA-2G 합성의 최적의 온도는 50 °C이다. 그러나, 과정에서 L-아스코르브산의 분해를 최소화하기 위해, 40 °C의 더 낮은 온도가 바람직하다.

도 4는 비피도박테리움 롱검의 수크로스 포스포릴라아제 효소의 AA-2G 형성 활성에 대한 공여체(수크로스) 및 수용체(L-AA) 기질 농도의 효과를 나타낸다. AA-2G 합성은 L-AA 농도가 증가하면서 유의적으로 증가하였다. AA-2G의 농도 및 수율은 1.5배 초과의 L-AA가 반응에 첨가되었을 때, 최대가 되었다.

도 5는 상이한 수크로스 포스포릴라아제에 의해 촉매된 L-아스코르브산의 트랜스글루코실화를 나타낸다. 단백질 군 내에서 서열 및 구조적 다양성으로 나타내는, 선택된 수크로스 포스포릴라아제는 위치-선택성에 있어 명백한 차이를 나타냈다. 결과는 표 1에서 비교된다.

실시예

다음의 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 개시된 것이지만, 본 발명의 범위를 어떤 방식으로든 제한하고자 함은 아니며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 실시예는 통상적인 방법, 예를 들어, 클로닝, 형질주입의 상세한 설명 및 미생물 숙주 세포에서 단백질을 발현시키기 위한 방법의 기본적인 측면을 포함하지 않는다. 이러한 방법은 당업계의 일반적인 기술을 가진 자에게 잘 알려져 있다.

실시예 1: 수크로스 포스포릴라아제 효소의 생산

his-tag 아래에 SPase 유전자가 삽입된 pC21E 벡터를 가지는 이.콜라이 BL21 숙주 균주를 SPase의 생산을 위해 사용하였다. 유전자는 tac1 프로모터 시스템 하에서 클로닝하였고, IPTG로 유도하였다. 글리세롤 스톡으로부터 배양의 적은 양을 마이크로피펫 팁으로 긁어내었고, 암피실린(120 μg/mL)을 함유한 LB 배지의 50 mL 내로 접종시켰다. 플라스크는 약 12시간 동안의 120 rpm에서의 진동기 상에서 하룻밤 동안 30 °C 에서 인큐베이션 하였다. 하룻밤 동안의 배양은 암피실린(120 μg/mL)을 함유한 200 mL LB 배지 내로 접종시켜 0.01의 OD600을 생성시켰다. 플라스크는 37 °C, 120 rpm에서 OD600이 0.8 내지 1.0에 도달할 때까지 몇 시간 동안 인큐베이션 하였다. IPTG는 1 mM의 최종 농도를 만들기 위해 플라스크에 첨가하였다. 플라스크는 거의 20시간 동안 25 °C, 120 rpm에서 진동기 상에서 인큐베이션 하였다. 세포는 5000 rpm에서 15분 동안 원심분리에 의해 수확하였다. 상층액은 가만히 따라놓았고, 펠렛은 100 mM 시트레이트 완충액 pH 5.2로 세척하였다(습식 세포 중량의 각 1g에 대하여 5 mL의 완충액이 사용되었음). 습식 세포의 1g은 5 mL의 용해 완충액(50 mM NaCl + 1 mM EDTA + 0.5 mM DTT를 함유하는 100 mM 시트레이트 완충액 pH 5.2)에서 재부유시켰다. 현탁물은 프렌치 프레스(French press)를 통해 2번 통과시켰다. 생성된 세포 용해물은 깨지지 않은 세포 및 세포 파편으로부터 가용성 부분을 분리하기 위해 8000xg에서 원심분리시켰다. 상층액에서 SPase 효소 활성을 정량화하였고, 정제시켰고, 나중에 사용하기 위해 -20 °C에서 보관하였다.

실시예 2: 효소 분석

SPase 활성은, 수크로스 및 무기 인산으로부터의 Glc 1-P의 생성이 포스포글루코뮤타아제(PGM) 및 글루코스-6-포스페이트 디하이드로지나아제(G6P-DH)의 존재 하에 NAD+의 환원과 연결되는, 연속적인 연결된 효소 분석법을 사용하여 30 °C에서 측정하였다. 다른 곳에 기재된 바와 같이 10 mM EDTA, 10 mM MgCl₂ 및 10 μM α-D 글루코스 1,6-이인산을 함유하는 50 mM 포타슘 포스페이트 완충액, pH 7.0에서, 표준 분석법을 기본적으로 수행하였다. 반응 혼합물은 250 mM 수크로스, 2.5 mM NAD⁺, 3 U/mL PGM, 3.4 U/mL NAD+-의존적인 G6P-DH 및 적절하게 희석된 효소 용액을 함유하였다. 시간이 지남에 따라 NADH의 형성은 340 nm에서 분광측광법을 사용하여 모니터링하였다. SPase 활성의 1 유닛(unit)은 상기에 기재된 조건 하에 분당 NAD⁺의 1 마이크로몰의 환원을 유발하는 효소의 양과 상응한다. 단백질 농도는 표준대로 소 혈청 알부민과 함께 BioRad 염료-결합하는 방법을 사용하여 측정하였다.

실시예 3: 2 -O-α-D- 글루코피라노실 -L-아스코르브산의 합성

물에서 1,200 mM의 L-AA 및 800 mM의 수크로스 또는 글루코스-1-포스페이트 및 30 U/mL 의 SPase를 함유하는, 반응 혼합물을 50 °C 및 300 rpm에서 48 내지 72시간 동안 인큐베이션 하였다. 반응은 어두운 조건 하에 기밀 용기(air tight container)에서 바람직하게 pH 5.2에서 수행하였다. 산물 분석은 BioRad HPX-87H 컬럼을 적용한 HPLC를 사용하여 수행하였고, 피크의 용출 프로파일은 UV 및 RI 검출기로 모니터링하였다. 컬럼은 25 °C로 유지되었고, 20 mM 황산은 0.4 mL/분의 유량에서 용리제로서 사용하였다. 이러한 조건들 하에, L-AA의 > 30 %는 글루코실화되었다. 분리되고 정제된 산물의 NMR 분석은 AA-2G의 α-1-2 글리코시드 결합을 입증하였다.

실시예 4: 2 -O-α-D- 글루코피라노실 -L-아스코르브산의 수율을 개선하는 것

물에서 1,200 mM의 L-AA 및 800 mM의 수크로스 또는 글루코스-1-포스페이트 및 30 U/mL의 SPase를 함유하는 반응 혼합물은 50 °C 및 300 rpm에서 인큐베이션 하였다. 반응 동안에, 수크로스의 고갈 및 SPase의 활성의 손실을 모니터링하였다. 추가적인 수크로스 및 SPase를 수크로스 농도 및 SPase 활성을 이들의 최초의 양인 각각 800 mM 및 30 U/mL로 회복시키기 위해 24시간, 48시간 및 72시간 후에 투여하였다. 이런식으로, 수율은 약 1.5x 증가하였다.

실시예 5: 추가적인 수크로스 포스포릴라아제의 평가

단백질 군내에서 서열 다양성을 나타내는, 비피도박테리움 아돌센티스, 스트렙토코커스 무탄스, 락토바실러스 아시도필루스, 류코노스톡 메센테로이데스로부터의 4개의 추가적인 수크로스 포스포릴라아제를 평가하였다. 호모다이머 수크로스 포스포릴라아제는, 결과적으로 AA-2G 형성하는 2-OH에서의 L-아스코르브산의 글리코실화에 있어, AA-2G 및 AA-6G의 혼합물이 형성되었던 모노다이머 유형에 비하여, 높은 위치-선택성을 나타내었다. 모노다이머 수크로스 포스포릴라아제는 전체 산물의 상당한 부분에 있어서 AA-6G를 방출하였고, 반면에, 호모다이머 단백질은 검출 한계를 넘어서는 AA-6G가 형성되지 않았다. 그러나, pH 7.5에서는 본질적으로 결핍된, pH 5.2에서의 AA-2G 합성은 시험된 모든 수크로스 포스포릴라아제의 본질적인 특성이었다.

수크로스 포스포릴라아제	AA-2G [%]	AA-6G [%]
스트렙토코쿠스 무탄스 ( SmSPase )	100	0
락토바실러스 아시도필루스 ( LaSPase )	77	23
비피도박테리움 롱검 ( BlSPase )	100	0
류코노스톡 메센테로이데스 ( LmSPase )	77	23
비피도박테리움 아돌센티스 ( BaSPase )	100	0

Claims

a. 글루코실 공여체 및 글루코실 수용체를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계;
b. 상기 혼합물을 수크로스 포스포릴라아제와 함께 인큐베이션(incubate)하는 단계;
c. 인큐베이션 동안 7.0 이하의 pH로 유지하는 단계;
d. 반응 동안에 추가적인 글리코실 공여체 및/또는 수크로스 포스포릴라아제를 선택적으로 투여하는 단계; 및
e. 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산을 분리 및/또는 정제하는 단계의 순차적 단계를 포함하는, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산을 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 수크로스 포스포릴라아제는 메타지놈, 미생물, 바람직하게는 박테리아 기원인 것인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 수크로스 포스포릴라아제는 호모다이머인 것인, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수크로스 포스포릴라아제는 pH < 7, 바람직하게는 pH < 6, 보다 바람직하게는 pH < 5, 가장 바람직하게는 pH < 4에서 매우 안정적인 것인, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 수크로스 포스포릴라아제는 아그로박테리움 비티스(Agrobacterium vitis), 비피도박테리움 아돌센티스(Bifidobacterium adolescentis), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli), 에쉐리키아 콜라이 06(Escherichia coli 06), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 델브루에키이 아종 락티스(Lactobacillus delbrueckii subs. Lactis), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 슈도모나스 퓨트리파시엔스(Pseudomonas putrefaciens), 슈도모나스 사카로필리아(Pseudomonas saccharophila), 로도피렐룰라 발티카(Rhodopirellula baltica), 슈와넬라 발티카(Shewanella baltica), 슈와넬라 프리기디마리나(Shewanella frigidimarina), 솔리박터 우시타투스(Solibacter usitatus), 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans) 및/또는 시네초코커스 종(Synechococcus sp.)으로부터 수득되는 것인, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수크로스 포스포릴라아제는 천연 단백질 또는 돌연변이체인 것인, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수크로스 포스포릴라아제는 전-장 단백질 또는 이의 촉매 활성 단편, 또는 융합 단백질로서 재조합적으로 생산되는 것인, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수크로스 포스포릴라아제는 전체-세포, 무세포 추출액, 미정제, 정제된 형태 또는 고정화된 형태로서 사용되는 것인, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글루코실 공여체는 글루코스 1-포스페이트 또는 수크로스인 것인, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글루코실 수용체는 아스코르브산인 것인, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인큐베이션은 pH 범위 4.0 내지 7.0, 바람직하게는 4.5 내지 6.5, 보다 바람직하게는 4.8 내지 6.2, 특히 pH 5.2에서 수행되는 것인, 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인큐베이션 단계는 적어도 24시간, 바람직하게는 적어도 48시간, 보다 바람직하게는 적어도 72시간 동안 수행되는 것인, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인큐베이션은 온도 범위 약 30 내지 70 °C, 바람직하게는 40 내지 60 °C, 보다 바람직하게는 40 내지 50 °C에서 수행되는 것인, 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아스코르브산은 수크로스 보다 0.3 내지 3배 몰 초과로 사용되는 것인, 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 혼합물에서 수크로스 포스포릴라아제의 양은 1 U/mL 내지 10,000 U/mL 범위, 또는 5 U/mL 내지 100 U/mL 범위, 또는 10 U/mL 내지 50 U/mL 범위, 또는 20 U/mL 내지 40 U/mL 범위, 또는 30 U/mL인 것인, 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 수크로스 포스포릴라아제를 1 U/mL 내지 10,000 U/mL 범위, 또는 5 U/mL 내지 100 U/mL 범위, 또는 10 U/mL 내지 50 U/mL 범위, 또는 20 U/mL 내지 40 U/mL 범위, 또는 30 U/mL 로 유지하고, 수크로스를 100 내지 2,000 mM 범위, 또는 250 mM 내지 1,000 mM 범위 또는 800 mM로 유지하기 위해, 인큐베이션 동안 추가적인 수크로스 포스포릴라아제 및 수크로스가 인큐베이션 혼합물에 첨가되는 것인, 방법.
제16항에 있어서, 상기 수크로스 포스포릴라아제 및 수크로스는 동시에 또는 다른 시점에 첨가되는 것인, 방법.