MX2013010872A - Sistemas de expresion genica regulada y construcciones de ellos. - Google Patents

Abstract

La presente divulgación se refiere a composiciones y métodos para la regulación de la expresión sensible al nitrógeno de una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta. Un aspecto proporciona un sistema de expresión sensible al nitrógeno que incluye una región de factor de transcripción que comprende un sitio de unión a NtcA y una región de promotor mínimo que comprende un promotor RuBisCo o un fragmento funcional o variante de él. Otro aspecto proporciona un método para transformar una célula huésped con un sistema de expresión. También se proporcionan casetes de expresión, células huésped transformadas y kits.

Description

SISTEMAS DE EXPRESIÓN GÉNICA REGULADA Y CONSTRUCCIONES DE ELLOS REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional estadounidense No. 61/467,873, presentada el 24 de marzo de 2011, que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia.

MATERIAL INCORPORADO MEDIANTE REFERENCIA El Listado de secuencias, que forma parte de la presente divulgación, incluye una forma legible en forma digital de secuencias de aminoácidos o de nucleótidos de la presente invención. El objeto del listado de secuencias se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Por lo general, la producción de materiales por fermentación a gran escala se ve limitada por los costos asociados a la regulación de la expresión génica. Muchas veces las estrategias empleadas requieren que derivados dé azúcares costosos u otras moléculas pequeñas desencadenen la producción proteica que lleva a los productos deseados.

Los promotores son moléculas de ácido nucleico que comprenden los elementos de regulación 5 ' que desempeñan un rol fundamental en la expresión general de genes en células vivas. Los promotores aislados que funcionan en células u organismos huésped resultan útiles para controlar la expresión de los transgenes enlazados en forma operativa y, como consecuencia, para modificar los fenotipos de la célula u organismo huésped a través de métodos de modificación genética.

NtcA es el controlador principal del reguión de nitrógeno de cianobacterias con una secuencia de unión de ADN (GTAN8TAC) . Según la ubicación respecto a la posición del comienzo de transcripción y al promotor, la unión de NtcA puede bloquear o activar la transcripción (mencionado en Herrero et ál. 2001 y Muro-Pastor et ál. 2005). La relación nitrógeno/carbono influye sobre el control de transcripción mediado por NtcA, con 2 -oxoglutarato como molécula efectora. Emlyn-Jones et ál. (2003) informaron el uso del promotor nitrito reductasa para la expresión de mutS, lo que permite ,el control de la frecuencia de mutación de Synechococcus elongatus PCC 7942 al variar la fuente de nitrógeno.

Se cree que el promotor ribulosa-1 , 5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa (RuBisCo) de las cianobacterias es uno de los promotores conocidos más fuertes, dado que RuBisCo es una de las proteínas que se expresa en forma más abundante en la biosfera .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La provisión de un sistema de expresión sensible al nitrógeno para la expresión de una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta en una célula huésped es uno de los diversos aspectos de la presente invención.

Un aspecto provee un sistema de expresión sensible al nitrógeno. En algunas modalidades, el sistema de expresión incluye una región de factor de transcripción que comprende un sitio de unión a NtcA y una región de promotor mínimo que comprende un promotor RuBisCo o un fragmento funcional o variante de él. En algunas modalidades, la región de promotor mínimo comprende o se encuentra enlazada en forma operativa a la región de factor de transcripción. Algunas modalidades incluyen una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta enlazada en forma operativa a la molécula de ácido nucleico de terminación de la transcripción 3 ' .

Otro aspecto provee un método para expresar una molécula de ácido nucleico en una célula huésped. ; En algunas modalidades, se transforma una célula huésped en forma estable con un sistema de expresión descrito en la presente y se cultiva el huésped, o la progenie que tiene el sistema de expresión, en condiciones en las que se expresa la molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta. El sistema de expresión puede proveer la expresión regulada por nitrógeno de la molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta en una célula huésped. En algunas modalidades, la expresión de la molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta se bloquea cuando el nitrato es una fuente de nitrógeno predominante, y la molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta se expresa cuando urea o amoniaco son la fuente de nitrógeno predominante.

¦ Otro aspecto provee un cásete de expresión. En algunas modalidades, el cásete de expresión incluye (a) una región de factor de transcripción que comprende un sitio de unión a NtcA, (b) una región de promotor mínimo que comprende un promotor RuBisCo o una variante o un fragmento funcional de él, (c) una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta y (d) una molécula de ácido nucleico de terminación de transcripción 3 ' , donde la región de promotor mínimo comprende o se encuentra enlazada en forma operativa a la región de factor de transcripción, la región de promotor mínimo se encuentra enlazada en forma operativa a la molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta, la molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta se encuentra enlazada en forma operativa a la molécula de ácido nucleico de terminación de transcripción 3' y los elementos (a) -(d) se ubican uno respecto a otro de forma tal que la expresión del cásete de expresión en un organismo huésped resulta en la producción de una secuencia de polipéptidos codificada por la molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta. En algunas modalidades, el cásete de expresión incluye una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido NtcA o un polipéptido NtcB en una ubicación tal que la expresión del cásete de expresión en el organismo huésped resulte en la producción del polipéptido NtcA o del polipéptido NtcB.

Otro aspecto provee una célula huésped transgénica. En algunas modalidades, la célula huésped transgénica, o su progenie, incluye un sistema de, expresión descrito en la presente. En algunas modalidades, la célula huésped transgénica es producida mediante el método de expresión de una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta que comprende el sistema de expresión, o su progenie, que se describe en la presente. En algunas modalidades, la célula huésped transgénica incluye el cásete de expresión descrito en la presente.

En algunas modalidades, la célula huésped transgénica expresa la secuencia de polipéptidos codificada por la molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta en presencia de nitrato y bloquea la expresión de la secuencia de polipéptidos codificada por la molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta en presencia de amoniaco.

En algunas modalidades, la célula huésped transgénica expresa la secuencia de polipéptidos codificada por la molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta en presencia de amoniaco y bloquea la expresión de la secuencia de polipéptidos codificada por la molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta en presencia de nitrato.

Otro aspecto provee un kit que incluye uno o más de un sistema de expresión o un cásete de expresión descritos en la presente y, en forma opcional, instrucciones para introducir el cásete de expresión en una célula huésped.

Otros objetos y características serán evidentes en parte y se señalarán en parte a continuación en la presente.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Resultará claro para los expertos en la técnica que las figuras que se describen a continuación son meramente ilustrativas. Las figuras no pretenden limitar el alcance de la presente información en forma alguna.

La Figura 1 es un dibujo que representa la estructura del plásmido pLybAL50, un derivado de pLybAL19, en el que las diferencias principales son que se reemplazó el codón de inicio GTG de asf con el codón ATG más usual y que se agregó una etiqueta His6 al extremo C de asf. En el Ejemplo 3 se proporcionan más detalles vinculados a la metodología.

La Figura 2 es un dibujo en el que se representa el "intercambio RuBisCo". El grupo superior de flechas muestra el operón RuBisCo de Synechocystis sp . PCC 6803.; El grupo inferior de flechas muestra el operón sintético que comprende los genes de Synechocystis sp. PCC 6803 sps y spp tal como se encuentran en el plásmido pLybAL67. El operón sintético de Synechocystis sp. PCC 6803 sps/spp debería tener las mismas señales de inicio y fin de transcripción y traducción que el operón original RuBisCo de Synechocystis sp. PCC 6803. El plásmido pLybAL66 es igual a pLybAL67, salvo por la ausencia del fragmento Xmal/Spel del gen sps. En el Ejemplo 3 se proporcionan más detalles vinculados a la metodología.

La Figura 3 A es una representación de una secuencia de polinucleótidos y gráfica del promotor, de Nostoc sp. PCC 7120. La secuencia abarca la región entre rbcLXS (que comienza 3 pares de bases después del sitio BamHI)' y alll523 (que se transcribe en la dirección opuesta a la del operón rbcLXS), y se muestra en mayúsculas. La numeración depende del sitio de comienzo de la transcripción. Se indican los nucleótidos anteriores y posteriores al núcleo (que contiene el promotor, el inicio de transcripción y los sitios de unión a Factor 2 y NtcA) que fueron eliminados de las diversas construcciones. Las construcciones en las que se ha eliminado' la región posterior al núcleo dejan el sitio de unión ribosomal intacto. En el Ejemplo 4 se proporcionan más detalles vinculados a la metodología. La FIG. 3B muestra la ampliación de una parte de la FIG. 3A.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN : La presente descripción se refiere al uso de una secuencia de regulación genética definida para controlar la expresión de genes funcionales de acuerdo con la composición del medio de cultivo.

La presente descripción se basa, al menos en parte, en el reconocimiento de que la expresión génica con un promotor fuerte, tal como un promotor RuBisCo, puede requerir regulación para que el crecimiento del organismo sea adecuado u óptimo. La presente descripción también se basa, al menos en parte, en el reconocimiento de que un promotor que contiene un sitio de unión a NtcA (por ejemplo, rbcL) puede ser utilizado para regular la expresión del gen diana cuando se bloquea el gen diana si el nitrato es la única fuente de nitrógeno, y cuando se expresa si se cultiva en nitrógeno amoniacal u otras fuentes de nitrógeno reducido no nitratos, tales como la urea. Se entiende que este sistema es un sistema limitado por NtcA. También se entiende que los sistemas de expresión descritos en la presente pueden ser utilizados para regular la expresión del gen diana cuando se expresa el gen diana si el nitrato es la única fuente de nitrógeno, y cuando se bloquea si se cultiva en nitrógeno amoniacal u otras fuentes de nitrógeno reducido no: nitratos, tales como la urea. Se entiende que este sistema es un sistema activado por NtcA. Tal como se informa en la presente, aunque un promotor de nitrito reductasa que contiene un sitio de unión a NtcA puede regular la expresión génica, el promotor nitrito reductasa es relativamente débil, con tendencia a una producción proteica inaceptablemente baja.

Varias modalidades proveen composiciones y métodos que utilizan una fuente de nitrógeno de un medio de cultivo para la regulación génica y la expresión proteica.

Se provee adicionalmente la expresión génica modulada por una- construcción que comprende una región de factor de transcripción sensible al nitrógeno y una región de promotor mínimo, o una variante o fragmento funcional de ella. Tal construcción puede alcanzar niveles elevados de producción de proteínas en el sistema en puntos determinados de un proceso de cultivo. Es posible aplicar varios sistemas descritos en la presente a la producción de materiales proteicos que incluyen, de modo no taxativo, enzimas biosintéticas de azúcar u otras enzimas industriales, tales como hidrolasas de esteres. Puede aplicarse un sistema descrito en la presente a la producción de moléculas pequeñas (que incluyen, de modo no taxativo, i azúcares) derivadas de la acción de las enzimas correspondientes.

I A menos que se indique lo contrario en la presente, las composiciones y los procesos de la presente descripción pueden ser llevados a cabo de acuerdo con las composiciones y los procesos descritos en la publicación de la solicitud estadounidense No. 2009/0181434, presentada el 5 de enero de 2009, que se incorpora en la presente en su totalidad mediante esta referencia.

Un sistema de expresión regulada con nitrógeno tal como se describe en la presente puede resultar particularmente ventajoso cuando se usa junto, con un biorreactor, tal como un biorreactor de fase sólida. Cuando se usa con un biorreactor, es posible lograr la modulación dinámica de la expresión proteica mediante la modificación de la fuente de nitrógeno del proceso. Un biorreactor de fase sólida puede conformar lo descrito en la publicación de la solicitud estadounidense No. 2009/0181434, presentada el 5 de enero de 2009, que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia.

Las siguientes definiciones y métodos se proporcionan para definir mejor la presente invención y para guiar a los expertos en la técnica en la práctica de la presente invención. A menos que se indique de otra manera, los términos deben entenderse según el uso convencional dado por los expertos en la técnica pertinente.

Tal como se usan en la presente, cada uno de los términos "secuencia heteróloga de ADN", "segmento de ADN exógeno" o "ácido nucleico heterólogo" se refiere a una secuencia que se origina en una fuente externa a la célula huésped particular o, si provienen de la misma fuente, que se modifica en su forma original. Por lo tanto, un gen heterólogo en una célula huésped incluye un gen que es endógeno para la célula huésped particular pero que fue modificado, por ejemplo, a través de barajado de ADN. Los términos también incluyen copias múltiples de origen no natural de una secuencia de ADN de origen natural. Por lo tanto, los términos se refieren a un segmento de ADN que es externo o heterólogo a la célula, un homólogo a la célula pero en una posición en el ácido nucleico de la célula huésped en la que el elemento no se encuentra usualmente. Los segmentos de ADN exógenos producen polipéptidos exógenos. Una secuencia de ADN homologa es una secuencia de ADN naturalmente asociada a una célula huésped en la que se introduce.

Normalmente se entiende que vector de expresión, construcción de expresión, plásmido o construcción de ADN recombinante se refieren a un ácido nucleico que fue generado con intervención humana que incluye medios recorhbinantes o síntesis química directa, con una serie de elementos dé ácidos nucleicos específicos que permiten la transcripción o la traducción de un ácido nucleico en particular en, por ejemplo, una célula huésped. El vector de expresión puede ser, parte de un plásmido, un virus o un fragmento de ácido nucleico. Por lo general, el vector de expresión puede incluir un ácido nucleico a ser transcripto enlazado en forma operativa a un promotor.

Usualmente se entiende que un "promotor" es una secuencia de control de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Se entiende que un promotor inducible es un promotor que media la transcripción de un gen enlazado en forma operativa en respuesta a un estimulo particular. Un promotor puede incluir secuencias: de ácido nucleico necesarias cercanas al sitio de inicio de la transcripción, tales · como, en el caso de un promotor de polimerasa tipo II, un elemento TATA.' Un promotor puede incluir opcionalmente elementos bloqueadores o potenciadores distales, que se pueden ubicar hasta a varios miles de pares de bases del sitio de inicio de la transcripción.

Tal como se usa en la presente, una "molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta" se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico capaz de ser transcripta en una molécula de ARN. Se conocen métodos 'para introducir construcciones en una célula de forma tal que la molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta se transcriba en una molécula de ARNm funcional que se traduce y, por lo tanto, se expresa como producto proteico. Las construcciones también pueden ser construidas para tener la capacidad de expresar moléculas de ARN antisentido con el fin de inhibir la traducción de una molécula de ARN de interés específica. Para la práctica de la presente descripción, las composiciones y métodos convencionales para preparar y utilizar construcciones y células huésped son conocidos por los expertos en la técnica :(véase, por ejemplo, Sambrook y Russel (2006) Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879697717; Ausubel et 'ál. (2002) Short Protocols in Molecular Biology, 5a ed., Current Protocols, ISBN-10: 0471250929; Sambrook y Russel (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879695773; Elhai, J. y Wolk, C. P. 1988. Methods in Enzymology 167, 747-754).

El "sitio de inicio de la transcripción" o "sitio de inicio" es la posición alrededor del primer nucleótido que forma parte de la secuencia transcripta, la cual también se define como posición +1. Todas las otras secuencias del gen y sus regiones de control pueden ser numeradas respecto a este sitio. Las secuencias posteriores (es decir, las secuencias proteicas adicionales en dirección 3 ' ) pueden ser denominadas positivas, al tiempo que las secuencias anteriores (en su mayoría regiones de control en dirección 5') son denominadas negativas.

"Enlazado en forma operativa" o "enlazado en forma funcional" se refiere preferiblemente a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un único fragmento de ácido nucleico de forma que la función de uno se vea afectado por el otro. Por ejemplo, se dice que una secuencia reguladora de ADN se encuentra "enlazada en forma operativa a" o "asociada a" una secuencia de ADN que codifica un ARN o polipéptido si ambas secuencias se encuentran ubicadas de forma que la secuencia reguladora de ADN afecte la expresión de la secuencia codificante de ADN (es decir, que la transcripción de la secuencia codificante o ARN funcional es controlada por el promotor) . Las secuencias codificantes pueden estar enlazadas en forma operativa a las secuencias reguladoras en orientación sentido o antisentido. Ambas moléculas de ácido nucleico pueden ser parte de una única molécula de ácido nucleico y pueden encontrarse una junto a la otra. Por ejemplo, un promotor se encuentra enlazado en forma operativa a un gen de interés si el promotor regula o media la transcripción del gen de interés en una célula.

Por lo general se entiende que una "construcción" es cualquier molécula de ácido nucleico recombinante tal como un plásmido, un cósmido, un virus, una molécula de ácido nucleico de replicación autónoma, un fago o una molécula de polinucleótido de ADN o ARN de cadena simple o cadena doble lineal o circular, derivada de cualquier fuente, capaz de integración genómica o de replicación autónoma, que comprende una molécula de ácido nucleico donde una o más moléculas de ácido nucleico factibles de ser transcriptas se han enlazado en forma operativa.

Una construcción de la presente descripción puede contener un promotor unido en forma operativa a una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta enlazada en forma operativa a una molécula de ácido nucleico de terminación de transcripción 3'. Además, las construcciones pueden incluir, de modo no taxativo, moléculas reguladoras de ácido nucleico adicionales de, por ejemplo, la región 3' no traducida (3' UTR) . Las construcciones pueden incluir, de modo no taxativo, las regiones 5' no traducidas (5' UTR) de una molécula de ácido nucleico de ARNm que desempeña un rol importante en el inicio de la traducción y que también puede ser un componente genético en una construcción de expresión. Estas moléculas reguladoras de ácido nucleico anteriores y posteriores pueden derivar de una fuente de origen natural o heteróloga respecto a : los otros elementos presentes en la construcción del promotor. ' El término "transformación" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en el gefioma de una célula huésped que resulta en herencia genéticamente estable. Se hace referencia a las células huésped que contienen fragmentos de ácido nucleico transformado como células "transgénicas" y a los organismos que comprenden células transgénicas como "organismos transgénicos" .

"Transformado", "transgénico" y " recombinante" se refieren a un organismo o célula huésped tal como una bacteria, cianobacteria, animal o planta en la que se introdujo una molécula heteróloga de ácido nucleico. La molécula de ácido nucleico puede integrarse en forma estable al genoma tal como se conoce generalmente en la técnica y se divulga (Sambrook 1989; Innis 1995; Gelfand 1995; Innis · & Gelfand 1999) . Métodos conocidos de PCR incluyen, de modo no taxativo, métodos utilizados para aparear cebadores, cebadores anidados, cebadores únicos específicos, cebadores degenerados, cebadores específicos para un gen, cebadores específicos para un vector, cebadores con coincidencia parcial y similares. El término "no transformado" se refiere a células normales que no han pasado el proceso de transformación. ; "De tipo salvaje" se refiere a un virus u organismo que se encuentra en la naturaleza sin mutaciones conocidas .

COMPONENTES DEL SISTEMA DE EXPRESIÓN Un aspecto provee un sistema de regulación de expresión sensible a la fuente de nitrógeno de un medio tal como un medio de cultivo o de fermentación.

En diversas modalidades, un sistema de regulación de expresión incluye una región de factor de transcripción y una región de promotor mínimo enlazada en forma operativa a una secuencia diana.

La secuencia de una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede ser regulada a nivel transcripcional al cambiar la fuente de nitrógeno en el medio. Por ejemplo, puede interrumpirse la transcripción de ARNm de la secuencia de una molécula de ácido nucleico en presencia de nitratos o activada en presencia de una fuente de nitrógeno reducido no nitrato, tal como amoniaco o urea. Por ló tanto, un sistema de regulación de expresión descrito en la presente puede proveer la expresión controlable de un gen heterólogo con amoniaco como inductor y nitrato como represor de bajó co$to.

Como otro ejemplo, la transcripción de ARNm de una secuencia de una molécula de ácido nucleico puede ser detenida en presencia de una fuente no nitrato de nitrógeno reducido, tal como amoniaco o urea, o activada en presencia de nitrato. Por lo tanto, un sistema de regulación de expresión descrito en la presente puede proveer la expresión controlable de un gen heterólogo con amoniaco como bloqueador y nitrato como inductor de bajo costo. ; La inclusión de una secuencia de control de la región de terminación es opcional y si se emplea, la elección es fundamentalmente por razones de conveniencia, dado que, la, región de terminación es relativamente intercambiable. La región de terminación puede ser de origen natural en la región de inicio transcripcional (promotor) , puede ser de origen natural respecto a la secuencia de ADN de interés o puede obtenerse de otra fuente.

Es posible incorporar un promotor de la presente descripción a una construcción con genes marcadores tal como se describe y se evalúa para determinar un indicio de expresión génica en un sistema huésped estable. Tal como se usa en la presente, el término "gen marcador" se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta cuya expresión puede ser determinada o calificada en alguna forma.

.REGIÓN DEL FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN En la presente se provee un sistema de regulación de la expresión que puede incluir una región de factor de transcripción sensible' a nitrógeno. Con una modalidad1 de sistema de regulación de nitrógeno descrito en la presente, el cambio de nitrógeno amoniacal (u otra forma no reducida no nitrato de nitrógeno, tal como urea) en un medio de cultivo (por ejemplo, un caldo de fermentación) puede resultar en la pérdida de expresión de bloqueo prohibitivo de un gen enlazado en forma operativa, lo que inicia la producción proteica e'n momentos específicos del proceso de cultivo. En otra modalidad/ el cambio de nitrógeno amoniacal (u otra forma no reducida no nitrato de nitrógeno, tal como urea) a nitrato en un medio de cultivo puede resultar en la pérdida de expresión de bloqueo prohibitivo de un gen enlazado en forma operativa, lo que inicia la ' producción proteica en' momentos específicos del proceso de cultivo.

La presente descripción se basa, al menos en parte, en observaciones relativas a NtcA, un controlador principal del reguión de nitrógeno de cianobacterias . Los resultados presentados en la presente muestran que los genes enlazados en forma operativa al promotor nitrito reductasa (que contiene un sitio de unión a NtcA) , aislado de Synechocystis sp. PCC 6803 y Synechococcus elongatus PCC 7942, se expresan cuando el nitrato es la única fuente de nitrógeno, pero se bloquean cuando se cultivan con nitrógeno amoniacal (véase el Ejemplo 2) . Tal sistema coincide con un sistema promotor activado con NtcA (ver Hererro 2001 J Bacteriol 183(2) 411-425, 416). Estos resultados demuestran . que la expresión proteica controlada, y por lo tanto la producción de productos naturales, puede lograrse mediante la alteración de fuentes de nitrógeno de bajo costo. Aunque en el pasado, tal como lo hicieron Emlyn-Jones et ál. (2003), se informó el uso del promotor nitrito reductasa para la regulación génica, los inventores encontraron que aunque puede alcanzarse cierto grado de expresión controlada, el promotor nitrito reductasa es relativamente débil en sistemas anteriores, lo que lleva a una producción proteica inaceptablemente baja (ver el Ejemplo 2).

La región de factor de transcripción puede encontrarse enlazada en forma operativa a una región de promotor mínimo. La presente divulgación también se basa, al menos en parte, en las observaciones sobre el uso de una secuencia de NtcA enlazada en forma operativa a un promotor fuerte, tal como un promotor RuBisCo. Los resultados presentados en la presente muestran que los genes enlazados en forma operativa al promotor rbcL (que contiene un sitio de unión a NtcA) , o fragmentos funcionales de él, aislado de Nostoc sp. PCC 7120, se expresan cuando el amoniaco es la única fuente de nitrógeno, pero se bloquean cuando se cultivan con nitrógeno amoniacal (véase el Ejemplo 2) . Tal sistema coincide con un sistema promotor bloqueado con NtcA (ver Hererro 2001 J Bacteriol 183(2) 411-425, 420) .

Una región de factor de transcripción puede tener varias posiciones relativas a una región de promotor mínimo. Por ejemplo, la región de factor de transcripción puede ser anterior o posterior a una región de promotor mínimo. La región de factor de transcripción puede encontrarse próxima a una región de promotor mínimo. La región de factor de transcripción puede encontrarse distanciada de una región de promotor mínimo. La región de factor de transcripción puede encontrarse contenida en una región de promotor mínimo. Por ejemplo, la región de factor de transcripción puede estar integrada en la secuencia de una región de promotor mínimo. i Una región de factor de transcripción puede comprender un factor de transcripción sensible al nitrógeno. Generalmente, los factores de transcripción pueden desempeñar un rol en la regulación de la expresión génica en diversos organismos mediante la activación o la represión de la expresión mediante, por ejemplo, la unión a ADN en sitios usualmente anteriores a un sitio de inicio de transcripción. U factor de transcripción puede llevar a cabo su función al reclutar la polimerasa para la molécula de ADN codificante. Por lo general se entiende que un factor de transcripción, o un factor de unión de ADN especifico para una secuencia, es una proteina que se une a secuencias especificas de ADN, y asi controla la transcripción de información genética de ADN a ARNm. Un factor de transcripción puede llevar a cabo esta función solo o con otras proteínas en un complejo mediante la promoción (activador) o el bloqueo (bloqueador) del reclutamiento de ARN polimerasa, que es la enzima que realiza la transcripción de información genética de ADN a ARN para genes específicos. Una característica de un factor de transcripción es que contienen uno o más dominios de unión de ADN que pueden unirse a secuencias específicas de ADN adjuntas a los genes que regulan.

Un sistema de regulación de expresión sensible al nitrógeno puede incluir un promotor, o un fragmento funcional o variante de él, asociado con un gen relacionado al metabolismo de nitrógeno. Un sistema de regulación de expresión sensible al nitrógeno puede incluir un promotor, o un fragmento funcional o variante de él, de un gen de nitrito reductasa. Por ejemplo, un sistema de regulación de expresión sensible al nitrógeno puede incluir un promotor, o un fragmento funcional o variante de él, de un gen de nitrito reductasa de una cianobacteria . Como ejemplo adicional, un sistema de regulación de expresión sensible al nitrógeno puede incluir un promotor nitrito reductasa regulado con NtcA aislado de Synechocystis o Synechococcus , o una variante o fragmento funcional; de él. Se entiende que el sitio de unión a NtcA en el promotor nitrito reductasa funciona como un sitio activador por su distancia del sitio de inicio de la transcripción (ver Herrero 2001 J Bacteriol 183(2) 411-425). Como ejemplo adicional, un sistema de regulación de expresión sensible al nitrógeno puede incluir un promotor nitrito reductasa regulado con NtcB.

Un sistema de regulación de expresión sensible al nitrógeno puede incluir un promotor, o un fragmento funcional o variante de él, de un gen regulado con nitrógeno. Un sistema de regulación de expresión sensible al nitrógeno puede incluir un promotor, o un fragmento funcional o variante de él, de un gen RuBisCo regulado con nitrógeno. Por ejemplo, un sistema de regulación de expresión sensible al nitrógeno puede incluir un promotor que comprende uno o más de un sitio de uni n a NtcA o una secuencia de consenso de un sitio de unión a NtcA. Otro ejemplo seria un sistema de regulación de expresión sensible al nitrógeno puede incluir un promotor que comprende uno o más de un sitio de unión a NtcB o una secuencia de consenso de un sitio de unión a NtcB. Otro ejemplo seria un sistema de regulación de expresión sensible al nitrógeno que puede incluir un promotor que comprende uno o más de un sitio de unión a NtcA y un sitio de unión a NtcB o una secuencia de consenso de un sitio de unión a NtcA y una secuencia de consenso de un sitio de unión a NtcB.

Como ejemplo adicional, un sistema de regulación de expresión sensible al nitrógeno puede incluir un promotor de un gen RuBisCo regulado con nitrógeno de un alga o una cianobacteria . Como ejemplo adicional, un sistema de regulación de expresión sensible al nitrógeno puede incluir un promotor de un · gen RuBisCo regulado con nitrógeno de Nostoc, Synechocystis o Synechococcus , o una variante o fragmento funcional de él. Se entiende que el sitio de unión a NtcA en el promotor rbcL endógeno de Nostoc funciona como sitio bloqueador por su proximidad al sitio de inicio de la transcripción ( er Herrero 2001 J Bacteriol 183(2) 411-425).

Se entiende que NtcA es un regulador transcripcional hélice-giro-hélice que se une a promotores de los genes regulados con nitrógeno en diversos dominios de unión (véanse, Su et ál. 2005 Nucleic Acids Research 33(16), 5156-5171; Llacer et ál. 2010 Proc Nati Acad Sci EÜA 107(35), 15397-402) . Se elimina la expresión de genes para la asimilación de otras fuentes de nitrógeno en un reguión < de NtcA cianobacteriano, donde el amonio es una fuente preferida de nitrógeno, en un entorno repleto de amonio, al tiempo que en entornos con amonio limitado es posible inducir los genes involucrados en la absorción y el metabolismo de fuentes alternativas de nitrógeno a través de la unión de NtcA a los elementos cis-reguladores en las regiones promotoras de los genes .

Una región de factor de transcripción puede comprender uno o más de un sitio de unión al ; factor de transcripción sensible a nitrógeno NtcA, un sitio de unión al factor de transcripción sensible al nitrógeno NtcB o una variante o fragmento funcional de ellos. Una región dé factor de transcripción puede comprender uno tanto de un sitio de unión al factor de transcripción sensible a nitrógeno NtcA como de un sitio de unión al factor de transcripción sensible al nitrógeno NtcB o una variante o fragmento funcional de ellos. Por ejemplo, una región de factor de transcripción puede comprender el sitio de unión al factor de transcripción sensible al nitrógeno NtcA y el sitio de unión al factor de transcripción sensible al nitrógeno NtcB presente en la SEQ ID NO: 279 (cuya secuencia es un promotor NirA enlazada a NtcA y NtcB en forma operativa) , o un fragmento de ellos, o una secuencia gue tiene, al menos alrededor de 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % p 99 % de identidad de secuencia con ellos.

Una región de factor de transcripción puede comprender un polinucleótido que tiene una secuencia que incluye una secuencia de consenso de un sitio de unión a NtcA o una secuencia de consenso de un sitio de unión a NtcB. Una región de factor de transcripción puede comprender un polinucleótido que tiene una secuencia que incluye tanto una secuencia de consenso de un sitio de unión a NtcA como una secuencia de consenso de un sitio de unión a NtcB. Una región de factor de transcripción puede comprender un polinucleótido que tiene una secuencia que incluye tanto una secuencia de consenso de un sitio de unión a NtcA como una secuencia de consenso de un sitio de unión a NtcB presente en la SEQ ID NO: 279 (cuya secuencia es un promotor NirA enlazado a NtcA y NtcB en forma operativa) , o un fragmento de ellos, o una secuencia que tiene al menos- alrededor de 70 %, 75 %, 80 , 85 %,· 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con ellos.

Una secuencia de sitio de unión a Ntpa. de una construcción descrita en la presente puede tener una( secuencia igual o similar (por ejemplo, al menos alrededor de 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia) a una secuencia de unión a NtcA funcionalmente asociada a genes regulados con nitrógeno de organismos tales como Nostoc, Synechocystis o Synechococcus . Por ejemplo, una secuencia de sitio de unión a NtcA de una construcción descrita en la presente puede tener una secuencia igual o similar (por ejemplo, al menos alrededor de 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia) . a una secuencia de unión a NtcA funcionalmente asociada a regiones promotoras de genes regulados con nitrógeno (por ejemplo, genes cianobacterianos regulados con nitrógeno) . Se entiende o predice que las regiones promotoras para el operón nir , nirB-ntcB, ntcA, glnA, glnB, amtl , operón urt , ntcB, hetC, devBCA, icd, rpoD2-V, nrtP, glnN, nifP, petH, nifH, niíORFl, vnfOG y nifHDK actuarán como promotores activados con NtcA (ver Herrero 2001 J Bacteriol 183(2) 411-425, 417, 418). Se entiende o predice que las regiones promotoras para rbcL, hanA gor, qifh y gifB actuarán como promotores bloqueados con NtcA (ver Herrero 2001 J Bacteriol 183(2) 411-425,). Otras regiones promotoras que contienen un sitio de unión a NtcA incluyen xísA, glbN y nifH. Cualquiera de las ; secuencias anteriores, o una variante o fragmento funcional de ellas que contiene un sitio de unión a NtcA, puede ser incluida en un sistema de expresión descrito en la presente.

Por ejemplo, una secuencia de sitio de unión a NtcA de una construcción descrita en la presente puede tener una secuencia igual o similar a una secuencia de unión a NtcA funcionalmente asociada a regiones promotoras de nirA (SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO; 32), o una secuencia que tiene al menos alrededor de 70 %, 75 %, 80 , 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con ellas, o un fragmento de ellas.

Por ejemplo, una secuencia de sitio de unión a NtcA de una construcción descrita en la presente puede tener una secuencia igual o similar (por ejemplo, al menos alrededor de 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia) a un sitio de unión a NtcA en uno o más de los siguientes genomas: Gloeobacter violaceus PCC 7421 (PCC7421) ; Nostoc sp. PCC 7120 (PCC7120) ; Prochlorococcus marinus CC P1375 (PCC1375) ; Prochlorococcus marinus MED4 (MED4 ) ; Prochlorococcus marinus MIT9313 (MIT9313 ) ; Synechococcus elongatus PCC 6301 (PCC6310 ) ; Synechococcus sp. WH8102 (WH8102 ) ; Synechocystis sp. PCC 6803 ( PCC6803 ) y Thermosynechococcus elongates BF-1 (thermosynechococcus) . Como otro ejemplo, una secuencia de sitio de unión a NtcA de una construcción descrita en la presente puede tener una secuencia igual o similar (por ejemplo, al menos alrededor de 70 %, 75 %, 80 %, 8'5 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia) a un sitio de unión a NtcA descrito en Su et ál. 2005 Nucleic Acids Research 33(16), 5156-5171, que se incorpora en la presente mediante esta referencia. Como otro ejemplo, una secuencia de sitio de unión a NtcA de una construcción descrita en la presente puede tener una secuencia igual o similar (por ejemplo, al menos alrededor de 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia) a un sitio de unión a NtcA descrito en Jiang et ál. 1997 Biochem J 327, 513-517, que se incorpora a la presente mediante esta referencia.

Como ejemplo adicional, una secuencia de sitio de unión a NtcA de una construcción descrita en la presente puede tener una secuencia igual o similar (por ejemplo,' al menos alrededor de 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia) a un sitio de unión a NtcA contenido en una secuencia de promotor RuBisCo de Nostoc sp. PCC 7120. Como otro ejemplo, una secuencia de sitio de unión a NtcA de una construcción descrita en la presente puede tener una secuencia igual o similar (por ejemplo, al menos alrededor de -70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia) a un sitio de unión a NtcA contenido en cualquiera de las SEQ ID NO: 180, SEQ IDNO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183 (promotor Nsp7120 rbc), SEQ ID NO: 227 (promotor RuBisCo Ssp6803) , SEQ ID NO: 231 (promotor RuBisCo Selo7942) o SEQ ID NO: 234 (promotor rbc Nsp7120) .

Como otro ejemplo, una secuencia de sitio de unión a NtcA de una construcción descrita en la presente puede tener una secuencia igual o similar (por ejemplo, al menos alrededor de 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia) a un sitio de unión a NtcA contenido en los plásmidos pLybDB2 (SEQ ID NO: 188), pLybDB3 (SEQ ID NO: 189), pLybDB4 (SEQ ID NO: 190), pLybDB5 (SEQ ID NO: 191), pLybDB6 (SEQ ID NO: 235), pLybDB7 (SEQ ID. NO: 236) o pLybDB9 (SEQ ID NO: 237). Como otro ejemplo, una secuencia de sitio de unión a NtcA de una construcción descrita en la presente puede tener una secuencia igual o similar (por ejemplo, al menos alrededor de 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia) a un sitio de unión a NtcA contenido en el plásmido pLybDB4 (SEQ ID NO: 190) .

Como otro ejemplo, una secuencia de sitio de unión a NtcA o una secuencia de sitio de unión a NtcB de una construcción descrita en la presente puede tener una secuencia igual o similar (por ejemplo, al menos alrededor de 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia) a un sitio de unión a NtcA contenido en los plásmidos pLybAL106 (SEQ ID NO: 272) o pLybAL107 (SEQ ID NO: 273) . Por ejemplo, una secuencia de sitio de unión a NtcA de una construcción descrita en la presente puede tener una secuencia igual o similar (por ejemplo, al menos alrededor de 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia) a un sitio de unión a NtcA contenido en el plásmido pLybAL106 (SEQ ID NO: 272) .

Una región de factor de transcripción puede comprender un polinucleotido que tiene una secuencia que incluye una secuencia de consenso GTANnC que puede ser una secuencia de consenso canónica de un sitio de unión a NtcA. Se considera que el triplete GTA es la región más conservada de esta secuencia de consenso. Como componente del sistema de expresión que se describe, la secuencia de consenso del sitio de unión a NtcA puede ubicarse de forma tal que la unión de NtcA ocasione el control de la expresión de una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta. Por ejemplo, es sabido que el dominio GTAN C se centra a 39.5 a 40.5 nucleótidos antes del sitio de inicio de la transcripción y también puede encontrarse en algunos promotores en posiciones anteriores -109.5 y -180.5. Se entiende que tal ubicación es un ejemplo y se contemplan otras ubicaciones que mantienen la funcionalidad. i Una región de factor de transcripción puede I comprender un polinucleotido que tiene una secuencia que 'incluye una secuencia de consenso GTANgTAC. Se considera que el dominio de unión GTANgTAC es una secuencia de consenso canónica del sitio de unión para NtcA.

Una región de factor de transcripción puede comprender un polinucleótido que tiene una secuencia ¿[ue incluye una secuencia de consenso GTAN8TGC.

Una región de factor de transcripción puede comprender un polinucleótido que tiene una secuencia que incluye una secuencia de consenso GTN10AC.

Una región de factor de transcripción puede comprender un polinucleótido que tiene una secuencia que incluye una secuencia de consenso TGTNgACA. Una región de ¡ factor de transcripción puede comprender un polinucleótido qué tiene una secuencia que incluye una secuencia de consenso TGTN10ACA. í Una región de factor de transcripción puede comprender un dominio de unión adicional, tal como una caja tipo -10 en forma de TAN3T/A. Por ejemplo, una región de: factor de transcripción puede dominio de unión TAN3T . En otro ejemplo, una región de factor de transcripción puede dominio de unión TAN3A.

Tal dominio de unión puede ser similar a una caja tipo E. coli o70 -10 en forma de TAN3T con un sitio de unión a Ntca¡ (que puede ser como se discutió anteriormente) que reemplaza lja caja -35 presente en los promotores de E. coli o70 tipo 3 (véase> Su et ál. 2005 Nucleic Acids Research 33(16), 5156-5171) . En algunas modalidades, la caja tipo -10 puede encontrarse en las construcciones de promotor activado con Ntca (ver Herrero -2001 J Bacteriol 183(2) 411-425, 418, 419) . Un dominio de unión de caja TAN3T puede encontrarse, por ejemplo,- de cinco a seis nucleótidos antes de un sitio de inicio de transcripción. Un dominio de unión de caja TAN3T puede encontrarse, por ejemplo, 22 o 23 nucleótidos antes de una secuencia de consenso de sitio de unión a NtcA. Un dominio de unión de caja TAN3T puede encontrarse, por ejemplo, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23 o aproximadamente 24 nucleótidos antes de una secuencia de consenso de un sitio de unión a NtcA (ver Herrero 2001 J Bacteriol 183(2) 411-425, 419).

En algunas modalidades, un sitio de unión a NtcA tal como se describió anteriormente puede encontrarse de alrededor de 21 a alrededor de 24, por ejemplo, ! .22 ¦ o 23, nucleótidos después de una caja tipo -10, por ejemplo, en construcciones en las que la unión a NtcA actúa como activador. En algunas modalidades, un sitio de unión a NtcA tal como se describió anteriormente puede encontrarse cerca del sitio de inicio de la transcripción o solaparse a la caja tipo -10, por ejemplo, en construcciones en las que la unión a NtcA actúa como bloqueador.

Una región de factor de transcripción puede comprender una o más de una secuencia de un sitio de unión a NtcA o una secuencia de consenso de un sitio de unión a NtcA. Por ejemplo, una región de factor de transcripción puede comprender al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o más de cualquier secuencia de un sitio de unión a NtcA o una secuencia de consenso de un sitio de unión a NtcA.

La selección de la fuente de nitrógeno como inductora o represora en una modalidad del sistema de. control de expresión que comprende una región de factor de transcripción sensible a nitrógeno puede llevarse a cabo de acuerdo a los compuestos de - los que se sabe que funcionan con ese factor de transcripción (ver Herrero et ál. 2001 J Bacteriol 183(2), 411-425, que se incorpora a la presente mediante esta réferencia) . Por ejemplo, en algunas modalidades, en presencia de nitrato (con estado de oxidación de nitrógeno de +5), la expresión de moléculas de ácido nucleico factibles de ser transcriptas puede ocurrir cuando se enlaza en forma operativa a un sistema promotor activado con NtcA; al tiempo que en presencia de una fuente de nitrógeno reducido tal como amoniaco (con un estado de oxidación de nitrógeno de -3) , la expresión de tal sistema se bloquea. Contrariamente, en otras modalidades, en presencia de nitrato (con estado de oxidación de nitrógeno de +5) , la expresión de moléculas de ácido nucleico factibles de ser transcriptas se bloquea cuando se enlaza en forma operativa a un sistema promotor bloqueado con NtcA; al tiempo que en, presencia de una fuente de nitrógeno reducido tal como amoniaco (con un estado de oxidación de nitrógeno de -3), la expresión de tal sistema se activa. Como tal, en algunas modalidades, Una fuente de nitrógeno que tiene un estado de oxidación menor que el nitrato puede tener un efecto opuesto sobre un sistema regulado con NtcA. En otras palabras, una fuente de nitrógeno que tiene un estado de oxidación menor que el nitrato (por ejemplo, amoniaco, urea) puede actuar como un bloqueador de expresión en un sistema promotor activado con NtcA, y una fuente de nitrógeno que tiene un estado de oxidación menor que el nitrato (por ejemplo, amoniaco, urea) puede actuar como un inductor de expresión en un sistema promotor bloqueado con NtcA.

Potencial redox estándar (V) 0.775 1 ,093 0.996 59 1.77 0.275 — NOj ? NÓj ? KNOj ? NO ? N20 ? Nj ^ NH j Un nitrato puede incluir una sal, tal como nitrato de potasio o nitrato de sodio. Un compuesto de nitrógeno que tiene un estado de oxidación menor que el nitrato puede incluir, de modo no taxativo, urea, cianato, amoniaco, sulfato ,de amonio, aminoácidos, dióxido de nitrógeno, óxido nítrico u óxido nitroso. Preferentemente, un compuesto de nitrógeno que tiene un estado de oxidación menor que el nitrato es un compuesto de nitrógeno soluble tal como amoníaco o urea. , PROTEÍNAS REGULADORAS DE REGULÓN DE NITRÓGENO En algunas modalidades, la adición de , proteínas reguladoras de regulón de nitrógeno en exceso al sistema puede reducir adicionalmente o eliminar la expresión en condiciones no inductoras. Tal como se discutió anteriormente, un sistema de regulación de expresión puede incluir una región de; factor de transcripción sensible a proteínas reguladoras de reguión de nitrógeno (por ejemplo, proteína reguladora de reguión de nitrógeno inducible con nitrato) . En algunas modalidades, la adición de proteínas reguladoras de reguión de nitrógeno en exceso (por ejemplo, NtcA o NtcB) puede reducir adicionalmente o eliminar la expresión de la secuencia de nucleótidos diana en condiciones no inductoras (véase por ejemplo, el Ejemplo 9).

Una construcción descrita en la presente puede incluir una secuencia de nucleótidos que codifica una o más copias de NtcA o NtcB, o de ambos. Por ejemplo, una construcción descrita en la presente puede incluir una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 279, o un fragmento de ella que contiene partes que codifican NtcA o NtcB o ambos, o un nucleótido que tiene al menos alrededor de 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad.de secuencia con la SEQ ID NO: 279 y que codifica NtcA o NtcB o ambos, o un fragmento de ellos. Como ' otro ejemplo, una construcción que incluye un nucleótido que contiene las partes que codifican NtcA o NtcB puede ser pLybAL98 (SEQ ID NO: 265) .

Una secuencia de nucleótidos que codifica una o más copias de NtcA o NtcB puede ser anterior a una región de factor de' transcripción. Una secuencia de nucleótidos que codifica una o mas copias de NtcA o NtcB puede ser posterior a una región de factor de transcripción.

Una secuencia de nucleótidos que codifica una o más copias de NtcA o NtcB puede ubicarse en la construcción descrita en la presente de forma tal que la expresión de la construcción resulte en la expresión del polipéptido NtcA o del polipéptido NtcB. Una secuencia de nucleótidos que codifica una o más copias de NtcA o NtcB puede ser anterior a una región de promotor mínimo. Una secuencia de nucleótidos que codifica una o más copias de NtcA o NtcB puede ser posterior a una región de promotor mínimo. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica una o más copias de NtcA o NtcB puede ser posterior a I una región de promotor nirA (véase, por ejemplo, el Ejemplo 9) .

REGIÓN DE PROMOTOR MÍNIMO ' En la presente se provee un sistema de ¡ regulación de la expresión sensible al nitrógeno que puede incluir una región de promotor mínimo. Una región de promotor mínimo (por ejemplo, de un promotor RuBisCo) enlazada en forma operativa a una región de factor de transcripción (por ejemplo, una secuencia de unión a NtcA en una configuración bloqueada con Ntca) puede, con una modalidad de un sistema de regulación de nitrógeno tal como se describe en la presente, resultar en la expresión regulada de una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta, donde el nitrato en un medio de cultivo (por ejemplo, un caldo de fermentación) puede inactivar la expresión en forma eficaz y una fuente de nitrógeno reducido no nitrato, tal como nitrógeno amoniacal o urea, puede activar en forma eficaz la producción proteica en momentos específicos del proceso de cultivo. En otras modalidades: En otra modalidad, una región de promotor mínimo (por ejemplo, una secuencia de unión a NtcA en una configuración activada con NtcA) puede resultar en la expresión regulada de una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta cuando se cambia la fuente de nitrógeno de una fuente no nitrato, tal como nitrógeno amoniacal o urea, a nitrato en un medio de cultivo (por ejemplo, un caldo de fermentación), lo que activa la producción proteica en momentos específicos del procesos de cultivo.

La presente descripción se basa, al menos en parte, en observaciones del uso de un promotor RuBisto fuerte. Aunque se ha informado el uso de un promotor RuBisCo fuerte, los Inventores encontraron que en ausencia de un reguión (tal como el reguión de NtcA) el promotor RuBisCo resulta en la expresión no controlada de una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta a costa de la viabilidad y el crecimiento celular. Los resultados expuestos en la presente demuestran que los genes enlazados en forma operativa a los promotores RuBisCo Synechocystis sp. PCC 6803 o Synechococcus elongatus PCC 7942 se expresan en forma fuerte, pero el organismo huésped exhibe crecimiento extremadamente lento y pérdida de viabilidad con el trascurso del tiempo (véase, el Ejemplo 4).

La presente divulgación también se basa, al menos en parte, en las observaciones sobre el uso de NtcA y su secuencia de unión a ADN enlazada en forma operativa a un promotor fuerte, tal como un promotor RuBisCo. Los experimentos iniciales con un promotor RuBisCo intacto que comprende un sitio de unión a NtcA resultan en poca o ninguna expresión del gen diana. Los resultados expuestos en la presente demuestran que los genes enlazados en forma operativa a un promotor RuBisCo Nostoc sp. PCC 7120 (no trunco) produjeron poca o ninguna expresión génica (véase el Ejemplo 6) .

Sorprendentemente, se ha descubierto que la interrupción anterior o posterior de un promotor RuBisCo que comprende un sitio de unión a NtcA puede resultar en una importante expresión de genes diana regulada por fuentes de nitrógeno. Los resultados expuestos en la presente demuestran que los genes enlazados en forma operativa a un promotor RuBisCo 'Nostoc sp. PCC7120 que tiene la región líder o la región posterior eliminadas (es decir, interrupción anterior o posterior) demostraron en forma individual una expresión de genes diana importante en presencia de amoníaco (véase el Ejemplo 6) .

La interrupción tanto de la región anterior como de la región posterior de un promotor RuBisCo que comprende un sitio de unión a NtcA resulta en poca o ninguna expresión del gen diana. Los resultados expuestos en la presente demuestran que los genes enlazados en forma operativa a un promotor RuBisCo Nostoc sp. PCC 7120 al que le faltan ambas regiones flanqueantes de la secuencia (es decir, con interrupción anterior y posterior) produjeron poca o ninguna expresión génica (véase el Ejemplo 6) .

Una región de promotor mínimo puede estar enlazada en forma operativa a una región de factor de transcripción. Por ejemplo, una región de promotor mínimo puede ser anterior o posterior a una región de factor de transcripción. Una región de promotor mínimo puede comprender una región de factor de transcripción. Por ejemplo, la región de factor de transcripción puede estar integrada en la secuencia de una región de promotor mínimo. La ubicación de la región del factor de transcripción respecto a la región de promotor mínimo puede influir sobre si el sistema es un sistema activado o bloqueado en presencia de amoníaco reducido, tal como se describe más adelante en la presente. Por ejemplo, donde el sitio de unión a NtcA es cercano a una región de promotor mínimo, como en el promotor rbcL, el sistema de expresión puede ser un sistema bloqueador de NtcA en el que la presencia de una fuente de nitrógeno reducido, tal como amoníaco o urea, puede activar la expresión de una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta enlazada en forma operativa y la presencia de nitrato puede ináctivar la expresión. ¡ Una región de promotor mínimo puede comprender una secuencia de promotor RuBisCo o una variante o' fragmento funcional de ella.

Una región de · promotor mínimo puede tener una secuencia igual o similar (por ejemplo, al menos alrededor de 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia) a una secuencia de promotor RuBisCo de organismos tales como Nostoc, Synechocystis o Synechococcus . Por ejemplo, una región de promotor mínimo descrita en la presente puede tener una secuencia igual o similar (por ejemplo,' al menos alrededor de 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia) a una secuencia de promotor RuBisCo en uno o más de los siguientes genomas: Gloeobacter violaceus PCC 7421 (PCC7421) ; Nostoc sp. PCC 7120 ( PCC7120 ) ; Prochlorócoccus marinus CCMP1375 (PCC1375) ;. Prochlorócoccus marinus MED4 (MED4 ) ; Prochlorócoccus marinus MIT9313 (MIT9313) ; Synechococcus elongatus PCC 6301 (PCC6310) ; Synechococcus sp. WH8102 (WH8102) ; Synechocystis sp. PCC 6803 ( PCC6803 ) y Thermosynechococcus elongates BF-1 (thermosynechococcus). : Como otro ejemplo, una región de promotor mínimo descrita en la presente puede tener una secuencia igual o similar (por ejemplo, al menos alrededor de 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia) a una secuencia de promotor RuBisCo (rbcLS) en Nostoc sp . PCC 7120. Como otro ejemplo, una región de promotor mínimo descrita en la presente puede tener una secuencia igual o similar (por ejemplo, al menos alrededor de 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia) a una secuencia de promotor RuBisCo (rbcLS) en Synechocystis sp . PCC 6803. Como otro ejemplo, una región de promotor mínimo descrita en la presente puede tener una secuencia igual o similar (por ejemplo, al menos alrededor de 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia) a una secuencia de promotor RuBisCo (rbcLS) en Synechococcus elongatus sp. PCC 7942. Como otro ejemplo, una región de promotor mínimo descrita en la presente puede tener una secuencia igual o similar (por ejemplo, al menos alrededor de 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia) a una secuencia de promotor RuBisCo (rbcLS) en Anabaena PCC 7120. Como otro ejemplo, una región d promotor mínimo descrita en la presente puede ser una ariánte o fragmento funcional de una secuencia de promotor RuBisCo (rbcLS) .

Una región de promotor mínimo descrita en la presente puede tener una secuencia igual o similar (por ejemplo, al menos alrededor de 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia) a una secuencia de promotor RuBisCo (rbcLS) o una variante o fragmento funcional de 'ella. Por ejemplo, una región de promotor mínimo de una construcción descrita en la presente puede tener una secuencia igual o similar (por ejemplo, al menos alrededor de 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia) con una región de promotor rbc de Nostoc sp. PCC 7120, tal como SEQ ID NO. 180, SEQ ID NO. 181, SEQ ID NO. 182 o SEQ ID NO. 183. Como otro ejemplo, una región de promotor mínimo descrita en la presente puede tener una secuencia igual o similar (por ejemplo, al menos alrededor de 70 %, 75 %, 80 %, 85 % , 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia) a la región de promotor rbc Nsp7120 de la SEQ ID NO: 234 tal como sigue: cctgcaggct ccagccatta gcgaaactga ccaaaggtta atctcagtct tcccttagtt 60 gggatttttt aaacatatgg ggattgggga ttgggaaaag gcagggggca gaggataagt 120 agaggaggca ggggaagt a agaagaatga ctatggacta ttgaccaatg actattggca 180 actgacaact gactcctata cagtcattga tacattttgt aactgattgt taacaaaacg 240 tttaaaactt tatgtaataa caaatttaaa tatgtaagtt aagaactttc aaagaataac 300 i ttatgccatt tcttgatata ttgtgagaca agttacaaat tacgtggtgt gcaatttttt 360 catcttgcgc tgattactct actaaatatc cgtcaagtaa attggctctt agctcgtetc 420 ctgtcaataa aggaggtcgg caagagtgca gaagcgggaa tgtgtgaaaa ctaacccaat 480 i tcattaaata ccccgaaata taggggaatc atctcatact ttccgtaaac cgcgaaggtc 540 gtgaagggat aaaagcaatt tagtgggtga gaagaacaga taaaaaagaa ttttttaact 600 atggcaagag gaaaaagtaa aagcgttaac ttatgcactc ctagatgagc aagacactgg 660 tgaagaggat taccactaaa gctaagtgtt agttgcagaa aggtcgctga cctctaccaa 720 aagattattc ctgtttttct cctggctgat a a ta ggcaattgtg agaggaaatt 780 gtaccaaaac gtgatttgat aagtaaaaag agtgacátct tggaaggatc catatg , 836 Por ejemplo, una región de promotor mínimo de una construcción descrita puede tener al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 87 %, al menos alrededor de 88 % al menos alrededor de 89 %, al menos alrededor de 90 %, ' al menos alrededor de 91 %, al menos alrededor de 92 %, ; al menos alrededor de 93%, al menos alrededor de 94 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 96 %, al menos alrededor de 97 %, al menos alrededor de 98 % y al menos alrededor de 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO. 180, SEQ ID NO. 181, SEQ ID NO. 182 o SEQ ID NO. 183.

Una región de promotor mínimo de una construcción descrita en la presente puede tener una secuencia igual o similar (por ejemplo, al menos alrededor de 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia) a una región de promotor mínima contenida en el plásmido pLybDB2 (SEQ ID NO: 188), pLybDB3 (SEQ ID NO: 189), pLybDB4 (SEQ ID ' NO: 190), pLybDB5 (SEQ ID NO: 191), pLybDB6 (SEQ ID NO: 235), pLybDB7 (SEQ ID NO: 236) o pLybDB9 (SEQ ID NO: 237) .

Una región de promotor mínimo de una construcción descrita en la presente puede ser un fragmento funcional de cualquier secuencia promotora descrita en la presente. Por ejemplo, una región de promotor mínimo de una construcción descrita en la presente puede ser un fragmento funcional de una secuencia de promotor RuBisCo (por ejemplo, rbcLS) . Urt fragmento funcional de una secuencia de promotor RuBisCo puede ser una secuencia de ácido nucleico de al menos alrededor de 50, al menos alrededor de 75, al menos alrededor de 95, 1 al menos alrededor de 100, al menos alrededor de 125, al menos: alrededor de 150, al menos alrededor de 175, al menos alrededor de 200, al menos alrededor de 250, al menos alrededor al menos alrededor de 350, al menos alrededor de 400, alrededor de 450, al menos alrededor de 500, al menos alrededor de 550, al menos alrededor de 600, al menos alrededor de 650, al menos alrededor de 700, al menos alrededor de 750 o al menos alrededor de 800 bases consecutivas de una secuencia de promotor RuBisCo (por ejemplo, promotor rbcLS de Nostoc sp. PCC 7120) que retienen la actividad promotora. ', Una región de promotor mínimo de una construcción descrita en la presente puede ser una forma interrumpida de una secuencia, de promotor RuBisCo (por ejemplo, rbcLS) . Por ejemplo, una región de promotor mínimo de una construcción descrita en la presente puede ser una forma interrumpida de una secuencia de promotor RuBisCo regulada con nitrógeno de Nostoc PCC 7120.

La interrupción de la secuencia de promotor RuBisCo puede ser una interrupción anterior. Por ejemplo, una secuencia de promotor RuBisCo de Nostoc sp . PCC 71201 puede presentar una interrupción anterior de la posición -319 a la -162 (numeración relativa al sitio de inicio de la transcripción, véase la FIG. 3) (véanse los Ejemplos 6 y 7) . La interrupción anterior de una secuencia de promotor RuBisCo de Nostoc sp. PCC 7120 puede ocurrir alrededor de la posición -300, alrededor de la posición -250, alrededor de la posición -200, alrededor de la posición -190, alrededor de la posición -180, alrededor de la posición -170, alrededor de la posición -160, alrededor de la posición -150, alrededor de la posición -140, alrededor de la posición -130, alrededor de la posición -120, alrededor de la posición -110, alrededor de la posición -100, alrededor de la posición -90 o alrededor de la posición -80. La posición de -319 a -162 de Nostoc sp. PCC 7120 tal como se representa en la FIG. 3 corresponde a la posición 1 a 176 de la SEQ ID NO: 234.

La interrupción de la secuencia de promotor RuBisCo puede ser una interrupción posterior. Por ejemplo, una secuencia de promotor RuBisCo de Nostoc sp. PCC 7120 puede presentar una interrupción posterior de la posición' +26 a la +491 (numeración relativa al sitio de inicio de la transcripción, véase la FIG. 3) (véanse los Ejemplos 6 y 7). La interrupción posterior de una secuencia de promotor RuBisCo de Nostoc sp. PCC 7120 puede ocurrir alrededor de la posición +10, alrededor de la posición +20, alrededor de la posición +30, alrededor de la posición +40, alrededor de la posición +50, alrededor de la posición +60, alrededor de la posición +70, alrededor de la posición +80, alrededor de la posición +90, alrededor de la posición +100, alrededor de la posición +150, alrededor de la posición +200, alrededor de la posición +250, alrededor de la posición +300, alrededor de la posición +350, alrededor de la posición +400, alrededor de la posición +450, alrededor de la posición +480 o alrededor de la posición +490.

La interrupción posterior de una secuencia de promotor RuBisCo de Nostoc sp. PCC 7120 puede ocurrir, por ejemplo, a través de un sitio de restricción presente en o cerca del primer codón de ri?cL (por ejemplo, sitio de restricción BamHI en la posición +499) . La posición de +26 a +491 de Nostoc sp. PCC 7120 tal como se representa en la FIG. 3 corresponde a la posición 353 a 818 de la SEQ ID NO: 234.

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO FACTIBLE DE SER TRADUCIDA Tal como se describe en la presente, una secuencia de nucleótidos diana, tal como una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta, puede enlazarse en forma operativa a un sistema de regulación de expresión sensible a uno o más componentes de un medio, tal como un medio de cultivo o un medio de fermentación. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede enlazarse en forma operativa a un sistema de regulación de expresión sensible a una' fuente de nitrógeno presente en el medio.

Los ejemplos de moléculas de ácido nucleico factibles de ser transcriptas para ser incorporadas en construcciones de la presente divulgación incluyen, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico o genes de una especie diferente a la especie huésped, o incluso genes que se originan con la misma especie o que se encuentran presentes en la misma especie, pero que se incorporan a las células receptoras mediante métodos de modificación genética, en lugar de las técnicas de reproducción clásicas. Elemento genético o gen exógeno pretende hacer referencia a cualquier gen o molécula de ácido nucleico que se introduce en una célula receptora. El tipo de molécula de ácido nucleico incluida en la molécula de ácido nucleico exogena puede incluir una molécula de ácido nucleico que ya se encuentra presente en la célula huésped, una molécula de ácido nucleico de otro organismo, una molécula de ácido nucleico de un organismo diferente o una molécula de ácido nucleico: generada externamente, tal como una molécula de ácido nucleico que contiene un mensaje antisentido de un gen, o una molécula de ácido nucleico que codifica una versión modificada o artificial de un gen.

Una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede ser cualquier secuencia que codifica un polipéptido de interés. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede ser ún gen que codifica un polipéptido que tiene una actividad de interés particular.

Una molécula de ácido nucleico factible de ser i transcripta puede codificar un polipéptido que tiene una actividad de sacarosa biosintética . Una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede codificar un polipéptido que tiene una actividad de sacarosa fosfato sintasa. Una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede codificar un polipéptido que tiene una actividad de sacarosa fosfato fosfatasa. Una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede codificar un polipéptido que' tiene una actividad de sacarosa fosfato sintasa y actividad _ de sacarosa fosfato fosfatasa.

Una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede ser un gen de fusión activo sps/spp (asf) de Synechococcus elongatus PCC 7942 que produce un producto génico asf, ASF, que tiene tanto funciones biosintéticas SPS y SPP (véanse, por ejemplo, publicación de solicitud estadounidense n.° 2009/0181434, Ejemplo 5). En algunas modalidades, se clona una secuencia de nucleótidos que codifica ASF diana de su fuente original (por ejemplo, Synechococcus elongatus PCC 7942) . En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta comprende un polinucleótido asf de SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido ASF de SEQ ID NO: 2. En modalidades adicionales, una molécula de ácido nucleico factib!le de ser transcripta comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos alrededor de 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad sps y spp, y al menos alrededor de 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID' NO: 2. Como un ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender una secuencia de nucleótidos que tiene al menos alrededor de 85 %, al. menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 % o al menos alrededor de 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, donde la secuencia expresada exhibe actividad ASF, SPS o SPP. Como- un ejemplo, una molécula de ácido nucl'eico factible de ser transcripta puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 % o al menos alrededor de 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, donde la secuencia expresada exhibe actividad ASF, SPS o SPP. Como otro ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender una secuencia de nucleótidos que se híbrida en condiciones restrictivas a la SEQ ID NO: 1 a lo largo de la totalidad de la SEQ ID NO: 1, y que codifica un polipéptido de fusión SPS/SPP activo (ASF) . En un ejemplo adicional, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender el complemento de cualquiera de las secuencias anteriormente mencionadas.

En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta comprende una sacarosa fosfato sintasa (sps) (véanse, por ejemplo, SEQ ID NO: 3 que codifica el gen sps y SEQ ID NO: 4 que codifica el polipéptido SPS), u homólogos de ella. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender un nucleótido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 3 para expresar sacarosa fosfato sintasa. Como otro ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender un nucleótido que tiene al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, 1 al menos alrededor de 95 % o al menos alrededor de 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 que codifica un polipéptidq que tiene sacarosa fosfato sintasa. Como otro ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 % o al menos alrededor de 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 4, donde la secuencia expresada exhibe actividad SPS.

En algunas modalidades, una molécula1 de ácido nucleico factible de ser transcripta comprende una sacarosa fosfato fosfatasa (spp) (véanse, por ejemplo, SEQ ID NO: 5 que codifica el gen spp y SEQ ID NO: 6 que codifica el polipéptido SPP), u homólogos de ella. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta . puede comprender un nucleótido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 5 par.a expresar sacarosa fosfato fosfatasa. Como otro ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender un nucleótido que tiene al menos alrededor de 80 %, ' al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, , al menos alrededor de 95 % o al menos alrededor de 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 5 que codifica un polipéptido que tiene actividad de sacarosa fosfato fosfatasa. Como otro ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender una . secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 % al menos alrededor de 99 % de identidad de secuencia 'con SEQ ID NO: 6, donde la secuencia expresada exhibe actividad SPP.

En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender una o más de asf, sps. o spp. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender asf y sps; asf y spp; sps y spp; o asf, sps y spp.

Una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede codificar un polipéptido que: presenta actividad trehalosa fosfato sintasa o trehalosa fosfato fosfatasa, actividad gluocosilglicerol fosfato sintasa o gluocosilglicerol fosfato fosfatasa; o actividad manosilfructosa fosfato sintasa o manosilfructosa fosfato fosfatasa.

En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta comprende una trehalosa fosfato sintasa (tps) (véanse, por ejemplo, SEQ ID NO: 76 que codifica el gen tps y SEQ ID NO: 77 que codifica el polipéptido TPS), u homólogos de ella. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender un nucleótido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 76 para expresar trehalosa fosfato sintasa. Como otro ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender un nucleótido que tiene al menos alrededo'r dé 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 % o al menos alrededor de 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 76 que codifica un polipéptido que tiene trehalosa fosfato sintasa. Como otro ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede ; comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 % o al menos alrededor de 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 77, donde la1 secuencia expresada exhibe actividad TPS.

En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta comprende una1 trehalosa. fosfato fosfatasa (tpp) (véanse, por ejemplo, SEQ ID NO: 78 que codifica el gen tpp y SEQ ID NO: 79 que codifica el polipéptido TPP), u homólogos de ella. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender un nucleótido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 78 para expresar trehalosa fosfato fosfatasa. Como otro ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender un nucleótido que tiene al menos alrededor de. 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %;, al menos alrededor de 95 % o al menos alrededor de 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 78 que codifica un polipéptido que tiene actividad de trehalosa fosfato fosfatasa. Como otro ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 % o al menos alrededor de 99 % de identidad de secuencia con SEQ 'ID NO: 79, donde la secuencia expresada exhibe actividad TPP.

En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta comprende una glucosilglicerolfosfato sintasa (gps) (véanse, por ejemplo, SEQ ID NO: 80 que codifica el gen gps y SEQ ID NO: 81 qüe codifica el polipéptido GPS), u homólogos de ella. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender un nucleótido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 80 para expresar glucosilglicerolfosfato sintasa. Como otro ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender un nucleótido que tiene al menos alrededor de 80 , al menos alrededor de 85 %, 1 al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 % o al menos alrededor, de 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 80 que codifica un polipéptido que tiene glucosilglicerolfosfato sintasa. Como otro ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene' al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, ¡ al menos alrededor de 95 % o al menos alrededor de 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 81, donde la secuencia expresada exhibe actividad GPS.

En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta comprendé una glucosilglicerolfosfato fosfatasa (gpp) (véanse, por ejemplo, SEQ ID NO: 82 que codifica el gen gpp y SEQ ID NO: 83 que codifica el polipéptido GPP), u homólogos de ella. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender un nucleótido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 82 para expresar glucosilglicerolfosfato fosfatasa. ' Como otro ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender un nucleótido que tiene al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 % o: al menos alrededor de 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 82 que codifica un polipéptido que tiene glucosilglicerolfosfato fosfatasa. Como otro ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 % o al menos alrededor de 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 83, donde la secuencia expresada exhibe actividad GPP.

En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta comprende una manosilfructosa fosfato sintasa (mps) (véanse, por ejemplo, SEQ ID NO: 84 que codifica el gen mps y SEQ ID NO: 85 que codifica el polipéptido MPS) , u homólogos de ella. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender un nucleótido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 84 para expresar manosilfructosa fosfato .sintasa. Como otro ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender un nucleótido que tiene al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 % o al menos alrededor de 99 % de identidad de secuencia con SEQ, ID NO: 84 que codifica un polipéptido que tiene manosilfructosa fosfato sintasa. Como otro ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 % o al menos alrededor de 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 85, donde la secuencia expresada exhibe actividad MPS.

En algunas modalidades, una molécula; de ácido nucleico factible de ser transcripta comprende una manosilfructosa fosfato fosfatasa (mpp) (véanse, por ejemplo, SEQ ID NO: 86 que codifica el gen mpp y SEQ ID NO: 87 que codifica el polipéptido MPP), u homólogos de ella. Pór ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender un nucleótido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 86 para expresar manosilfructosa fosfato fosfatasa. < Como otro ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender un nucleótido que tiene al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, ¦ al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 % o al menos alrededor de 99 % de identidad de secuencia con SEQ, ID NO: 86 que codifica un polipéptido que tiene actividad de manosilfructosa fosfato fosfatasa. Como otro ejemplo, una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos alrededor de 85 , al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 % o al menos alrededor de 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 87, donde la secuencia expresada exhibe actividad PP.

De manera alternativa, una molécula '¦¦ de ácido nucleico factible de ser transcripta puede ocasionar el fenotipo de un organismo o célula huésped mediante la codificación de una molécula de ARN que provoca la inhibición de expresión dirigida de un gen endógeno, por ejemplo mediante ARN antiseñtido, ARN inhibidor (RNAi) o mecanismos mediados por cosupresión. El ARN también podría ser una molécula de ARN catalítica (es decir, una ribozima) manipulada para escindir un producto de ARNm endógeno deseado. Por lo tanto, cualquier molécula de ácido nucleico que codifica una proteína o ARNm que expresa un cambio de morfología o fenotipo de interés puede resultar útil en la práctica de la presente divulgación.

HUÉSPEDES Un organismo o célula huésped puede transformarse con una construcción que incluye una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta enlazada en forma operativa a un sistema de regulación de expresión sensible a uno o más componentes del medio. Por ejemplo, un organismo o célula huésped puede transformarse con una construcción que incluye una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta enlazada en forma operativa a un sistema de regulación de' expresión sensible a una fuente de nitrógeno presente en el medio.

Una construcción descrita en la presente puede tener base plásmida o integrarse en el genoma huésped. Por ejemplo, una construcción descrita en la presente (por ejemplo, plásmido pLybDB4, SEQ ID NO: 190) puede encontrarse en el huésped como un plásmido (véase, por ejemplo, el Ejemplo 11) . Como otro ejemplo, una construcción descrita en la presente (por ejemplo, plásmido pLybAL98, SEQ ID NO: 265) puede integrarse en el genoma del huésped (por ejemplo, cepa LYB511) (véanse, por ejemplo, los Ejemplos 9, 11, 12). En algunas modalidades, la integración en el genoma del huésped puede aumentar lá expresión i inducible del nucleótido diana (compare los Ejemplos 11 y 12) .

Una célula huésped u organismo huésped transformado puede ser analizado para determinar la presencia de un gen de interés y el nivel o perfil de expresión conferido por el sistema de expresión de la presente divulgación. Los expertos en la técnica conocen la existencia de diversos métodos disponibles para analizar los huéspedes transformados. Por ejemplo, los métodos de análisis de huéspedes incluyen, de modo no taxativo, Southern blot o Northern blot, enfoques basados en PCR, análisis bioquímicos, métodos de análisis fenotípico y ensayos inmunodiagnosticos.

Un organismo huésped puede ser un organismo procariota o eucariota.

Un organismo huésped puede ser un : organismo fotosintético . Un organismo huésped puede ser, por ejemplo, un microorganismo fotosintético natural, tal como las cianobacterias , o un microorganismo fotosintético modificado, tal como una bacteria artificialmente fotosintética . Los ejemplos de microorganismos que son naturalmente fotosintéticos o que pueden ser modificados para ser fotosintéticos incluyen, de modo no taxativo, bacterias, hongos, arqueobacterias , protistas, plantas microscópicas, tales como las algas verdes, y animales, tales como el pláncton, las planarias y las amebas. Ejemplos de microorganismos fotosintéticos de origen natural incluyen, de modo no taxativo, Spirulina máximum, Spirulina platensis , Dunaliella salina, Botrycoccus braunii , Chlorella vulgaris , Chlorella pyrenoidosa , Serenastrum capricomutum , Scenedesmus auadricauda , Porphyridiu cruentum, Scenedesmus acutus, Dunaliella sp., Scenedesmus obliquus, Anabaenopsis , Aulosira, Cylindrospermum, Synechoccus sp., Synechocystis sp. o Tolypothríx.

Preferentemente, el microorganismo fotosintético huésped es una cianobacteria . Las cianobacterias , también conocidas como algas verdeazuladas , son una amplia gama de fotoautótrofos oxigénicos. La cianobacteria huésped, puede ser cualquier microorganismo fotosintético del filo Cyanophyta . La cianobacteria huésped tiene una morfología unicelular o de colonias (por ejemplo, filamentos, hojas o bolas) . Preferentemente, la cianobacteria huésped es una cianobacteria unicelular. Ejemplos de cianobacterias que pueden ser organismos huésped incluyen, de modo no taxativo, los géneros Synechocystis , Synechococcus , Thermosynechococcus , Nostoc, Prochlorococcu , Microcystis, Anabaena , Spirulina y GÍoeoi>acter . Preferentemente, la cianobacteria huésped es una Synechocystis spp. o Synechococcus spp. Más preferentemente, la cianobacteria huésped es Synechococcus elongatus PCC 7942 (ATCC 33912) o Synechocystis spp. PCC 6803 (ATCC 27184). ' El organismo o célula huésped puede comprender un sistema de control de nitrógeno endógeno. El genoma del organismo o célula huésped puede codificar un polipéptido NtcA. El organismo o célula huésped puede expresar un polipéptido NtcA de acuerdo con un sistema de control de nitrógeno. ¦ De manera alternativa, un organismo o célula huésped puede ser modificado para codificar un polipéptido NtcA o para expresar un polipéptido NtcA de acuerdo con una fuente de nitrógeno.

Tal como se describe en la presente, la expresión no regulada de una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta puede disminuir la velocidad de crecimiento de un organismo o célula huésped o reducir la viabilidad de un organismo o célula huésped (véase, Ejemplo 4). Diversas modalidades del sistema de expresión descrito en la presente pueden proveer la regulación sensible a nitrógeno de la expresión de una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta y asi proveer velocidades de crecimiento aumentadas o mayor viabilidad del huésped transformado si se compara con la expresión no regulada. Si se emplea un sistema de expresión descrito en la presente, un organismo o célula huésped transformado puede tener una velocidad de crecimientp menor de alrededor de 20 % menor (por ejemplo, menos de alrededor de 15 %, 10 % o 5 % menos) que un organismo o célula huésped no transformado en las mismas condiciones o en condiciones sustancialmente similares. Si se emplea un sistema de expresión descrito en la presente, un organismo o célula huésped transformado puede tener una velocidad de crecimiento alrededor de 5 % mayor (por ejemplo, más de alrededor de 10 %, 15 % o 20 % mayor) que un organismo o célula huésped no transformado en las mismas condiciones o en condiciones sustancialmente similares. La discusión anterior se aplica de igual forma a la viabilidad, cuando la viabilidad sustituye la velocidad de crecimiento.

KlTS También se proveen kits. Tales kits pueden incluir un agente o una composición descritos en la presente y, en determinadas modalidades, instrucciones de administración, y pueden facilitar la realización de los métodos descritos en la presente. Cuando se proveen como kit, los diferentes componentes de la composición pueden presentarse en recipientes individuales y mezclarse inmediatamente antes de ser utilizados. Los componentes incluyen, de modo no taxativo, un sistema de expresión o un cásete de expresión descritos en la presente, o componentes o secuencias de ellos. Si se desea, es posible que las presentaciones individuales de los componentes se ' encuentren en un paquete o en un dispositivo dispensador que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen la composición. El paquete puede comprender, por ejemplo, una lámina metálica o de plástico, tal como un blister. Tal paquete de componentes individuales puede, en determinadas circunstancias, permitir el almacenamiento a largo plazo sin que se pierda la actividad de los componentes.

Los kits también pueden incluir reáctivos en recipientes individuales tales como, por ejemplo, agua estéril o solución salina para agregarlos a un componente activo liofilizado empaquetado por separado. Por ejemplo, ampollas de vidrio selladas pueden contener un componente liofiliz'ado y agua estéril, solución salina estéril o estéril en una ampolla separada, cada uno de los cuales se empaquetó con un ( gas neutro no reactivo, tal como nitrógeno. Las ampollas pueden consistir en cualquier material adecuado, tal como vidrio, polímeros orgánicos, tales como policarbonato, poliestireno, cerámica, metal o cualquier otro material usualmente empleado para contener reactivos. Otros ejemplos de recipientes adecuados incluyen botellas que pueden ser fabricadas a "partir de sustancias similares que las ampollas, y sobres que pueden tener en su interior una lámina metálica, tal como de aluminio o una aleación. Otros .recipientes incluyen tubos de ensayo, viales, matraces, botellas, jeringas y similares. Los recipientes pueden tener un puerto de acceso estéril, tal como una botella que tiene un tapón que puede ser perforado con una aguja hipodérmica. Otros recipientes pueden tener dos compartimentos separados mediante una membrana removible que permite que los componentes se mezclen al ser retirada. Las membranas removibles pueden ser de vidrio, plástico, goma y similares.

En determinadas modalidades, los. kits pueden ser provistos con material instructivo. Las instrucciones pueden estar impresas en papel o en otro sustrato, o pueden ser provistas en un medio de lectura digital, tal como un1 disquete, mini-CD-ROM, CD-ROM, DVD-ROM, unidades zip, VHS, cintas de audio y similares. Las instrucciones detalladas pueden no estar asociadas físicamente con el kit. Por el contrario, el fabricante o el distribuidor del kit pueden indicar , al usuario un sitio web.

MODIFICACIÓN MOLECULAR La técnica abarca el diseño, la generación y el ensayo de los nucleótidos variantes, y de sus polipéptidos codificados, que tienen el porcentaje de identidad necesario antemencionado y que mantienen determinada actividad de la proteína expresada. Por ejemplo, la evolución dirigida y el aislamiento rápido de mutantes pueden ser llevados a cabo de acuerdo con métodos descritos en referencias que incluyen, de modo no taxativo, Link et ál. (2007) Nature Reviews ;5(9), 680-688; Sanger et ál. (1991) Gene 97(1), 119-123; Ghadessy et ál. (2001) Proc Nati Acad Sci, EUA 98(8) 4552-4557. Por lo tanto, un experto en la técnica podría generar una amplia variedad de variantes de nucleótidos o polipéptidos que tienen, por ejemplo, i al menos 95-99 % de identidad con la secuencia de referencia descrita en la presente y analizarlos para determinar fenotipos deseados de acuerdo con métodos rutinarios de la técnica. Generalmente, es posible llevar a cabo sustituciones conservadoras en cualquier posición siempre que se mantenga la actividad requerida. 1 i Se entiende que el porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácido o nucleótido es el porcentaje de residuos de aminoácidos o nucleótidos idénticos a los residuos de aminoácidos o nucleótidos en una secuencia candidata respecto a una secuencia de referencia cuando ambas secuencias ; se alinean en forma óptima (con inserciones, eliminaciones y espacios adecuados que representan en conjunto menos que el 20 : por ciento de la secuencia de referencia en la ventana de comparación) .

Para determinar el porcentaje de identidad, se alinean las secuencias y, si es necesario, se introducen los espacios para alcanzar el porcentaje máximo de identidad de secuencia. Los expertos en la técnica conocen los procedimientos de alineación de secuencias para determinar el porcentaje de identidad que incluyen herramientas como el algoritmo de homología de Smith y Waterman, el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, el método de determinación de similitud de Pearson y Lipman y, preferentemente, las implementaciones computarizadas (por ejemplo, GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA) de estos algoritmos. A menudo se emplea software como BLAST, BLAST2 , ALIGN2 o Megalign (DNASTAR) disponible al público para alinear las secuencias. Los expertos en la técnica pueden ¡determinar parámetros adecuados para medir la alineación que incluyen cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Cuando se alinean las secuencias, el porcentaje de identidad de secuencias de una secuencia dada A con o respecto a una secuencia dada B (que, de manera alternativa puede ser expresado como una secuencia dada A que tiene o comprende un determinado porcentaje de identidad de secuencia con o respecto a una secuencia dada B) puede ser calculado como: porcentaje de identidad de secuencia = X/Y100, donde X es la cantidad de residuos que el alineamiento de secuencias A y B del programa o del algoritmo define como idénticos, e Y es la cantidad total de residuos de B. Si la longitud de la secuencia A no es i igual a la longitud de la secuencia B, el porcentaje de identidad de secuencia de A respecto a B no será igual al porcentaje de identidad de secuencia de B respecto a A.

Tal como se usa en la presente, el término "porcentaje de identidad de secuencia importante" se' refiere a un porcentaje de identidad de secuencia de al menos alrededor de 70 % de identidad de secuencia, al menos alrededor de 80 % de identidad de secuencia, al menos alrededor de 90 % de identidad de secuencia o incluso mayor identidad de secuencia, como al menos alrededor de 98 % o alrededor de 99 % de identidad de secuencia. Por lo tanto, una modalidad es una molécula dé ácido nucleico que tiene al menos alrededor de 70 % de identidad de secuencia, al menos alrededor de 80 % de identidad de secuencia, al menos alrededor de 90 % de identidad de secuencia: o incluso mayor identidad de secuencia, como al menos alrededor de 98 % o alrededor de 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico descrita en la presente. El alcance de la presente divulgación abarca las moléculas de ácido nucleico capaces de regular la transcripción de moléculas 1 de ácido nucleico factibles de ser transcriptas enlazadas , en forma operativa y que tienen un porcentaje importante de identidad de secuencia respecto a las secuencias de ácido nucleico de los sistemas de expresión provistos en la presente.

Se definen las "condiciones restrictivas de hibridación" como la hibridación a 65 °C en una solución amortiguadora SSC 6. X (es decir, cloruro de sodio 0.9 M y citrato de sodio 0.09 ) . Dadas tales condiciones, es posible determinar si un conjunto determinado de secuencias se hibridará mediante el cálculo de la temperatura de fusión (Tm) de un dúplex de ADN entre las dos secuencias. Si un dúplex : articular tiene una temperatura de fusión inferior de 65 °C en condiciones de salinidad de 6 X SSC, entonces ambas secuencias no se hibridarán. Por otro lado, si la temperatura de fusión es superior a 65 °C en las mismas condiciones de salinidad, entonces las secuencias se hibridarán. Por lo general, es posible determinar la temperatura de fusión de cualquier secuencia ADÑ : ADN híbrida con la siguiente fórmula: Tm = 81.5 °C + 16.6 (logio [Na+] ) + 0.41 (fracción de contenido G/C) -0.63(% formamida) - (600/1) . Asimismo, la Tm de un híbrido AD : ADN disminuye 1-1.5 °C por cada disminución de 1 % de la identidad de secuencia (véase, por ejemplo, Sambrook y Russel, 2006) .

Es posible transformar las células huéspted con una variedad de técnicas estándar conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook y Russel (2006) Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879697717; Ausubel et al. (2002) Short Protocols in Molecular Biology, 5a ed., Current Protocols, ISBN-10: 0471250929; Sambrook y Russel (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879695773; Elhai, J. y Wolk, C. P. 1988. Methods in Enzymology 167, 747-754). Tales técnicas incluyen, de modo no taxativo, infección viral, transfección de fosfato de ' calcio, transfección mediada con liposomas, administración mediada por microproyectiles , absorción mediada por receptores, fusión celular, electroporación y similares. Las células transíectadas pueden ser seleccionadas y propagadas para proveer células huésped recombinantes que comprenden el vector de expresión integrado en forma estable en el genoma de la célula huésped. ! Es posible evaluar las cepas huésped desarrolladas de acuerdo a los enfoques descritos en la presente mediante diversos medios conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Studier (2005) Protein Expr Purif. 41(1), 207-234; ; Gellissen, ed. (2005) Production of Recombinant Proteins : Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems, Wiley-VCH, ISBN-10: 3527310363; Baneyx (2004) Protein Expression Technologies, Taylor & Francis, ISBN-10: 0954523253).

Los métodos de disminución o ' silenciamiento de genes son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la actividad proteica expresada puede ser disminuida o eliminada con oligonucleótidos antisentido, proteínas aptámeros, nucleótidos , aptámeros e interferencia por ARN (RNAi) (por ejemplo, ARN de pequeña interferencia (ARNip) , ARN de horquilla cort¿ (ARNhc) y microARN (miRNA) (véanse, por ejemplo, Fanning y Symonds (2006) Handbook Exp Pharmacol. 173, 289-303G, que describe ribozimas cabeza de martillo y ARN de horquilla pequeña; Helene, C, et- ál. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27-36; Maher (1992) Bioassays 14(12): 807-15, que describe secuencias de desoxirribonucleótidos diana; Lee et ál. (2006) Curr Opin Chem Biol. 10, 1-8, que describe aptámeros; Reynolds et {ál. (2004) Nature Biotechnology 22(3), 326 - 330, que describe RNAi; Pushparaj y Melendez (2006) Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 33(5-6), 504-510, que describe RNAi; Dillon et ál. (2005) Annual Review of Physiology 67, 147-173, que describe RNAi; Dykxhoorn y Lieberman (2005) Annual Review of Medicine 56, 401-423, que describe RNAi) . Las moléculas de RNAi se encuentran comercialmente disponibles de distintas fuentes (por ejemplo, Ambion, TX; Sigma Aldrich, MO; Invitrogen). Se conocen en la técnica diversos programas que diseñan moléculas de ARNip con una variedad de algoritmos (véase, por ejemplo, Cenix algorithm, Ambion; BLOCK-iT™ RNAi Designer, Invitrogen; siRNA Whitehead Institute ¦ Design Tools, Bioinfórmatics & Research Computing) . Algunas características que influyen en la definición de secuencias óptimas de · ARNip incluyen: contenido G/C en los extremos de ARNip, Tm de dominios internos específicos de ARNip, longitud de ARNip, ubicación de la secuencia diana en la CDS (región codificante) y contenido de nucleótidos de los extremos 3' no acoplados.

Se proporcionan definiciones y métodos en la presente para definir de mejor forma la presente divulgación y para guiar a aguellos expertos en la técnica que 1 pongan en práctica la presente divulgación. A menos que se indique de otra manera, los términos deben entenderse según el uso convencional dado por los expertos en la técnica pertinente.

En algunas modalidades, debe entenderse que las cifras que expresan cantidades de ingredientes, propiedades tales como el peso molecular, las condiciones de las reacciones y demás, que se utilizan para describir y reivindicar determinadas modalidades de la presente divulgación, pueden verse modificadas en algunas ocasiones por el término "aproximadamente". En algunas modalidades, el término "aproximadamente" se utiliza para indicar que un valor incluye la desviación estándar de la media para el dispositivo o método que se está utilizando para determinar el valor. En algunas modalidades, los parámetros numéricos que se establecen en la descripción escrita y en las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar según las propiedades deseadas que se busque obtener por una modalidad particular. 'En algunas modalidades, los parámetros numéricos deberían interpretarse según la cantidad de números significativos informados y mediante la aplicación de técnicas comunes de redondeo. Sin perjuicio de que los intervalos y los parámetros numéricos que indican el amplio alcance de algunas modalidades de la presente divulgación sean aproximaciones, los valores numéricos que se establecen en los ejemplos específicos se indican de la forma más precisa posible. Los valores numéricos presentados en algunas modalidades de la presente divulgación pueden contener determinados errores que resultan necesariamente de la desviación estándar encontrada en sus respectivas medidas de prueba. La mención de intervalos de valores en la presente pretende meramente servir como un método taquigráfico para referirse de forma individual a cada valor por separado que se encuentra en el intervalo. Salvo que se indique lo contrario en la presente, cada valor individual se incorpora en la memoria descriptiva como si se mencionara de forma individual en la presente.

En algunas modalidades, los términos "un" y "una", "el/la" y referencias similares que se utilizan en el contexto de describir una modalidad particular (especialmente en el contexto de determinadas de las reivindicaciones mási adelante) pueden ser interpretados como abarcativos tanto de singulares como de plurales, a menos que específicamente se estipule lo contrario. En algunas modalidades, el término "o" tal como se utiliza en la presente, lo cual incluye a las reivindicaciones, se utiliza para dar el significado de "y/o" a menos que explícitamente se indique que se refiere únicamente a alternativas o que las alternativas son mutuamente excluyentes. i Los términos "comprende," "tiene" e "incluye" son verbos copulativos de significado abierto. Toda forma o tiempo verbal de uno o más de estos verbos, tales como "comprende'', "tiene", "que tiene", "incluye" y "que incluye", también es de significado abierto. Por ejemplo, no existe limitación para todo método que "comprenda," "tenga" o "incluya" una o más etapas a tener únicamente esas etapas y puede tener otras i etapas no enumeradas. De manera similar, no existe limitacióni para toda composición o dispositivo que "comprenda, " "tenga" o "incluya" una o más características a tener únicamente esas características y puede incluir otras características no enumeradas .

Todos los métodos descritos en la presente se pueden realizar en cualquier orden adecuado, salvo que se indique lo contrario en la presente o que el contexto lo contradiga claramente. Se tiene la intención de que el uso de cualquiera de los ejemplos, o de todos ellos, o de, cualquier otra expresión lingüística de ejemplo (por ejemplo, "tal . como") que se proporcione con respecto a determinadas modalidades de la presente tenga el mero propósito de iluminar mejor la presente divulgación y no imponga limitaciones al alcance de la presente divulgación reivindicada de otro modo. Ninguna expresión lingüística en la presente memoria descriptiva debe interpretarse como indicativa de que los elementos no reivindicados sean esenciales para la práctica de lá presente divulgación.

Las agrupaciones de elementos o modalidades alternativos de la descripción descritos en la presente no se deben interpretar como limitaciones. Puede hacerse referencia y reivindicarse cada miembro del grupo individualmente o en combinación con otros miembros del grupo u otros elementos que se encuentran en la presente. Pueden incluirse o eliminarse uno o más miembros de un grupo por razones de conveniencia o patentabilidad. Cuando ocurra una de tales inclusiones o eliminaciones, se considera que la memoria descriptiva contiene el grupo según se modificó y, por consiguiente, cumple con la descripción escrita de todos los grupos Markush utilizados en las reivindicaciones adjuntas.

Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente y otras referencias que se citan en la presente se incorporan en su totalidad y a todos los efectos a la presente mediante esta referencia como si se hubiese indicado ! especifica e individualmente que cada publicación, patente, solicitud de patente u otra referencia individual se incorporara en su totalidad a todos los efectos mediante referencia. No debe interpretarse que las referencias citadas en la presente impliquen el reconocimiento de que ellas pertenezcan a la técnica previa de la presente divulqación.

Tras haber descrito la presente divulgación detalladamente, será evidente que las modificaciones, variaciones y modalidades equivalentes son posibles sin j apartarse del alcance de la presente divulqación qué se define en las reivindicaciones adjuntas. Adicionalmente, debe I apreciarse que todos los ejemplos en la presente divülgación se i proporcionan como ejemplos no taxativos. j EJEMPLOS j Los ejemplos no taxativos que j siguen a continuación son proporcionados para ilustrar más detalladamente la presente divulgación. Los expertos en la técnica j apreciarán que las técnicas divulgadas en los ejemplos quej siguen a continuación representan enfoques encontrados por los' inventores que dieron resultado en la práctica de la presente divulgación i y, por lo tanto, pueden considerarse como ejemplos de los modos ¦a utilizar al ponerla en práctica. Sin embargo, los éxpertos en I la técnica, en vista de la presente divulgación, comprenderán i que pueden realizarse muchos cambios a las modalidades especificas que se divulgan y aun asi puede obtenerse un resultado parecido o similar sin que ello implique apartarse del i espíritu y el alcance de la presente divulgación. j EJEMPLO 1 : ELIMINACIÓN DE ACTIVIDAD DE INVERTASA DE LA CÉLULA Para acumular sacarosa, se modificó Syhechocystis sp. PCC 6803 para eliminar la actividad de la invertasa (((¾- j fructofuranosidasa ) de la célula dado que la invertasa hidroliza la sacarosa transformándola en glucosa y fructosa que son reasimiladas en las funciones metabólicas normales déntro de la célula. La invertasa que codifica el gen, liml7 (SEQ ID NO: 140), fue eliminada de ATCC 27184 (LYB426) para proporcionar LYB471. También se eliminó de la cepa de tipo salvaje (LYB467) para proporcionar LYB472. A lo largo del tiempo, se han desarrollado las diferencias entre estas cepas tal como la pérdida de motilidad por LYB426 (Kamei et ál. 2001).

' Este gen que codifica invertasa limll fue eliminado por primera vez de LYB426 con el marcador resistente a la neomicina para generar LYB443. Se creó una eliminación en liml7 (SEQ ID NO: 140) con PCR secuencial para dejiar trechos grandes de ADN flanqueante. La primera reacción PCR fue realizada en una plantilla de ADN genómico de célula entera de LYB426 con Sspinvdel-F (SEQ ID NO: 142) y SspinvdelLR (SEQ ID NO: 143) como cebadores. El producto de esta reacción (PCR 1 de eliminación de invertasa Ssp6803; SEQ ID NO: 144) fue utilizado i como cebador en la segunda reacción (con Sspinvdel-R2 (SEQ ID NO: 145) nuevamente con ADN genómico de célula entera LYB426 como plantilla para generar PCR2 de eliminación de; invertasa i Ssp6803 (SEQ ID NO: 146) . El producto secundario de PCR fue digerido con Xbal y Sphl y luego se ligó a' pUC19 digerido de forma similar (SEQ ID NO: 139) que creó pLybAL38 (SEQ ID NO: i 147) . Se amplificó un fragmento de ADN que contenia el gen aminoglicosida 3 ' -fosfotransferasa (aph) y el gen uracilo ' fosforribosiltransferasa (upp) del Bacillus subtilis 168 ('Bs upp aph PCR) (SEQ ID NO: 220) a partir del plásmido pLybAL8f (SEQ ID NO: 69) con los oligonucleótidos bsuppkanmcs-F y bsuppkanPstl-R . Este producto de PCR fue digerido con Salí y PstI y luego se ligó a pLybAL38 (SEQ ID NO: 147) que había sido digerido con Sbfl y Salí, que pueden encontrarse entre las secuencias flanqueantes limll (SEQ ID NO: 140), lo que crea pLybAL41 (SEQ ID NO: 221) . Luego se linearizó el plásmido pLybAL41 mediante la digestión de endonucleasas de restricción con AatlI que se encuentra dentro de la estructura de pUC 19 (SEQ ID NO: 139) y luego se transforma en LYB426 mediante el protocolo de Eaton-Rye (2004) con modificaciones menores. En particular, la mezcla de transformación se colocó directamente en las placas de agar en lugar de colocarla como una membrana sobre la placa ¿le agar. Se administró el antibiótico mediante' el levantamiento del agar y se agregó el antibiótico en el fondo de la placa de Petri y luego se volvió a colocar el agar en la caja. Esta modificación se realizó únicamente para reducir la cantidad. de placas de agar necesarias para tres veces. Se seleccionó la integración en placas BGll-? que contenían 25 µg/ml de neomicina. Se; analizaron colonias en busca de una integración adecuada y una 'segregación completa en todas las copias del cromosoma mediante amplificación del ADN genómico de las células enteras con los oligonucleótidos Sspinvdelscreen-F y Sspinvdelscreen^R . La amplificación de tipo salvaje proporciona un produpto de 2.8 kbp, mientras que la eliminación de limll (SEQ ID NÓ: 140) con el marcador resistente a la neomicina y el gen B. subtilis upp proporciona un producto 3.7 kbp.

Luego puede cambiarse el marcador resistente a la neomicina en LYB443 con el marcador resistente a la espectinomicina (el gen agregado upp también fue eliminado) y se eliminó la invertasa de LYB467. El marcador resistente a la espectinomicina fue amplificado a partir del plásmi'do pBSL175 (Alexeyev et ál. 1995) con los oligonucleótido specSalI-F y specSbfl-R. Luego se digirió el producto de esta reacción con Salí y Sbfl, y se ligó a pLybAL41 que fue digerido de una manera similar para generar pLybAL58. Se realizó una recombinación doble homologa, tal como se describió anteriormente, con las cepas LYB443 y LYB467 para proporcionar las cepas LYB471 y LYB472, respectivamente. Se seleccionó la integración en placas BGll-A que contenían 25 µ?/ml de espectinomicina. Se volvieron a examinar la adecuada integración y completa segregación de colonias mediante amplificación del ADN genómico de células enteras con los oligonucleótidos Sspinvdelscreen-F y Sspinvdelscreen-R. La eliminación de limll (SEQ ID NO': 140) con el marcador resistente a la espectinomicina produce un producto de 2.6 kbp .

La eliminación de la invertasa permitió que la sacarosa tal como se prueba mediante 1) la comparación entre LYB426 (tipo salvaje) y LYB443 ejecutada en condiciones de exposición a sal tuvo por resultado una cantidad de sacarosa no mensurable en el tipo salvaje, pero que aumentó 3 veces, en el ambiente para LYB443 y 2) LYB443 transformado por el gen asf que se ejecutó bajo el control de promotores funcionales indicó que la sacarosa se había acumulado dentro de las células y en el medio de cultivo.

EJEMPLO 2: REDUCCIÓN DE LA EXPRESIÓN DE EXOPOLISACARIDOS Adicionalmente, Synechocystis sp. PCC 6803 es conocida por producir cantidades significativas de un exopolisacárido (EPS) en respuesta al envejecimiento normal de los cultivos o en condiciones de tensión ambiental en las células (Panoff et ál. 1988). La gran cantidad de EPS representa una distribución considerable de carbono y flujo ! metabólico total que podría llevar a que se produzca sacarosa. La genética en la producción de exopolisacáridos en Synechocystis sp . PCC 6803 es relativamente desconocida, si bien se han seleccionado las mutaciones EPS (Panoff y Joset 1989) . Se ha especulado que un conjunto grande de genes (de casi 18 kbp de tamaño) en el plásmido endógeno pSYS es responsable de la producción de EPS (Kaneko et ál. 2003), en base a su homología con · respecto a genes conocidos. A tales efectos, se eliminaron de < LYB472 los genes putativos considerados responsables de las vías biosintéticas clave asociadas con la biosíntesis de EPS para crear LYB476.

Se empleó una estrategia similar a la 'eliminación de la mvertasa para eliminar el supuesto locus EPS. Dé manera similar a lo antedicho, se realizó un PCR secuencia! con los oligonucleótidos primarios epsko-F y epsko-R, y luego con el oligonucleótido secundario pSYSM-R2. El producto secundario de PCR fue digerido con Xbal y Sphl, y luego se ligó a pLybAL 1 digerido de forma similar para proporcionar pLybALGl. Se amplificó el marcador resistente a la eritromicina del plásmido pE194 (Horinouchi y eisblum 1982) con los oligonucleótidos LSSalI-F y MLSSbfI-R . El producto resultante fue digerido con Salí y Sbfl, y luego se ligó a pLybAL61 digerido de forma similar, lo que produjo pLybAL62. Se realizó una recombinación homologa doble de LYB472 con pLybAL62 linearizado tal como se describió anteriormente y se creó la cepa LYB476. Se analizaron las colonias en busca de una integración adecuada mediante PCR del ADN de células enteras con los oligonucleótidos EPSKOscreen-F y EPSKOscreen-R. La eliminación tiene como resultado un producto de 3.2 kbp, en lugar del producto de 18.7; kbp de la cepa de tipo salvaje. La eliminación de 3.2 kbp puede observarse i fácilmente, pero la amplificación del producto de tipo salvaje de 18.7 kbp presentó dificultades, lo que hizo que la amplificación no fuese adecuada para determinar si había segregación completa. La segregación completa fue1 evaluada mediante la pérdida de múltiples productos por PCR con los pares j de oligonucleótidos EPSKOscreen-F/EPSKOint-Rl , EPSKOint-F2/ EPSKOint-R2, EPSKOint-F3 /EPSKOint-R3 , EPSKOint-F4/EPSKOint-R4 y EPSKOint-Fl/ EPSKOscreen-R, para lo cual uno o ambos de los oligonucleótidos se encuentran dentro de la región de eliminación. La amplificación del ADN de tipo salvaje con estos oligonucleótidos proporciona los productos EPS KO Sreen Border 1, EPS KO int PCR 2, EPS KO int PCR 3, EPS KO int PCR 4 y EPS KO Sreen_Border 2, respectivamente. ; Los resultados demostraron que la eliminación de los genes EPS tiene como consecuencia un nuevo, organismo modificado que demostró >80 % de pérdida en la producción de EPS, tal como se determinó por los ensayos colorimétricos y de extracción descritos por Panoff y Joset, 1989, y por Laurentin y I Edwards, 2003. Adicionalmente , parece que los organismos modificados con biosintesis EPS reducida no tienen disminución en la velocidad de crecimiento o en la disponibilidad general.

EJEMPLO 3 : EXPRESIÓN DE ASF DEL PROMOTOR NITRITO REDUCTASA El siguiente ejemplo muestra la expresión de ASF de los promotores nitrito reductasa de Synechocystis sp. PCC 6803 o Synechococcus elongatus PCC 7942. i LYB476, la cepa de Synechocystis sp. que porta el plásmido que comprende el promotor nitrito reductasa de Synechococcus elongatus PCC7942 frente al gen asf (pLybAL18) pero con una expresión de EPS disminuida, fue cultivada en 50 mi de medio BGll ajustado a pH 8.0 con solución amortiguadora HEPES 5 mM complementada con 25 yg/ml de cloranfenicol y nitrato de potasio sustituido por cloruro de amonio 4 mM como ' fuente de nitrógeno. (El plásmido pLybAL18, y su generación, es tal como se describe en la publicación de solicitud de patente estadounidense ?.°' 2009/0181434 que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia. Se introdujo el plásmido pLybALl8 en LYB476 mediante conjugación triparental, como también se describió en la publicación de la solicitud de patente estadounidense n.° 2009/0181434.) Se realizó el cultivo a 28 °C en matraces de agitación a 250 RPM bajo 100 µ? de iluminación con LED blancos. Luego de cuatro días de fermentación se cultivaron las células asépticamente mediante centrifugación, se lavaron una vez con lx volúmenes de agua estéril desionizada. Se redispersaron las células precipitadas en 50 mi de medio BG11 fresco que contenia nitrato de potasio 20 mM y 25 mg/ml de cloranfenicol a pH 9.0. Se agitó el cultivo a 250 RPM y 28 °C durante 24 horas bajo 100 mE de iluminación. Se separó el medio de cultivo de las células mediante centrifugación y se evaluó el medio para determinar las concentraciones de sacarosa con un método colorimétrico con base enzimática (Biovision Sucrose Assay Kit #K626) . Se sometieron las células a lisis con detergente y se evaluó el sobrenadante clarificado para determinar las concentraciones de sacarosa mediante el método enzimático descrito anteriormente.

LYB476, que porta el gen asf mediante el plásmido pLybAL18, expresó sacarosa en el medio de cultivo y constituyó entre 30 y 50 por ciento del peso de la biomasa seca de las células en el cultivo original. La concentración de sacarosa liberada de las células tras la lisis correspondió a menos del 10 % en peso del total de sacarosa observada en el cultivo.

Se transformó alternativamente LYB476 con un plásmido diferente que porta un promotor nitrito reductasa de Synechocystis sp. PCC 6803 frente al gen asf, pLybAL16, y se cultivó en 50 mi de medio BG11 ajustado a pH 8.0 con solución amortiguadora HEPES 5 mM complementada con 25 pg/ml de cloranfenicol y nitrato de potasio sustituido con cloruro de amonio 4mM como fuente de nitrógeno. (El plásmido pLybAL16, y su generación, es tal como se describe en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2009/0181434 que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia. Se introdujo el plásmido pLybAL16 en LYB476 mediante conjugación tripa ental, como también se describió en la publicación de la solicitud de patente estadounidense n.° 2009/0181434.) Se realizó el cultivo a 28 °C en matraces de agitación a 250 RPM bajo 100 µ? de iluminación con LED blancos. Luego de cuatro dias de fermentación se cultivaron las células asépticamente mediante centrifugación, se lavaron una ,vez con lx volúmenes de agua estéril desionizada. Se redispersarón las células precipitadas en 50 mi de medio BG11 fresco que contenía I nitrato de potasio 20 mM y 25 mg/ml de cloranfenicol a pH 9.0. Se agitó el cultivo a 250 RPM y 28 °C durante 24 horas bajo 100 mE de iluminación. Se separó el medio de cultivo de las células mediante centrifugación y se evaluó el medio para determinar las concentraciones de sacarosa con un método colorimétrico con base enzimática (Biovision Sucrose : Assay Kit #K626) . Se sometieron las células a lisis con detergente y se evaluó el sobrenadante clarificado para determinar las concentraciones de sacarosa mediante el método , enzimático descrito anteriormente.

Los resultados de LYB476 que porta el plásmido pLybAL16 mostraron que se observó sacarosa en principalmente en el medio de cultivo, que constituyó entre- el 30 y 50 por ciento en peso de la biomasa seca de las células en él cultivo original. La concentración de sacarosa liberada de las células tras la lisis correspondió a menos del 10 % en peso del total de sacarosa observada en el cultivo.

EJEMPLO 4: EXPRESIÓN DE ASF DE LOS PROMOTORES RUBISCO DE SYNECHOCYSTIS SP. PCC 6803 o DE SYNECHOCOCCUS ELONGATUS PCC 7942, ASÍ COMO LA CÓÉXPRESIÓN DEL PROMOTOR RUBISCO SPS Y SPP DE SYNECHOCYSTIS SP. PCC 6803 , Se cree que el promotor ribulosa-1 , S-^bisfosfato carboxilasa oxigenasa (RuBisCo) de las cianobacterias' es uno de los promotores conocidos más fuertes, dado que RuBisCo es una de las proteínas que se expresa en forma más abundante en la biosfera. Se logró y comprobó exitosamente el aislamiento y la clonación de este promotor tanto de Synechocystis sp'. PCC 6803 como de Synechococcus elongatus PCC 7942 y la ubicación frente al gen asf que produce sacarosa. Los resultados indicaron que la producción de sacarosa mediante la expresión de asf bajo el control de promotores RuBisCo conduce a la inhibición del crecimiento, supuestamente debido a la sobre ubicación de los recursos para la producción de sacarosa. Estos resultados indican adicionalmente que la regulación de la producción de sacarosa durante los periodos de acumulación de biomasa es necesaria .

: El promotor APR y CI del plásmido pLybAL19 (tal como se describe en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2009/0181434) fueron remplazados mediante los promotores RuBisCo de Synechocystis sp. PCC 6803 y Synechococcus elongatus PCC 7942. Los promotores RuBisCo de Synechocystis sp. PCC 6803 y Synechococcus elongatus PCC 7942 fueron amplificados a partir del ADN genómico de células enteras con los pares de oligonucleótidos SsprbcL-F/SsprbcL-R y SelorbcL-F/SelorbcL-R, respectivamente. Los productos de PCR fueron digeridds con Xbal y AflII y se ligaron a pLybAL19 digerido de forma similar para crear pLybAL42 y pLybAL43 para los promotores RuBisCo de Synechocystis sp. PCC 6803 y Synechococcus elongatus PCC 7942, respectivamente. ! Se utilizó conjugación triparental (tal como se describe en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2009/0181434) para insertar los' plásmidos pLybAL42 y pLybAL43 en la cepa LYB472. Sin embargo, aparecieron transconj ugantes que se volvieron marrones y desaparecieron tras ser colocados nuevamente en surcos, para purificar el plásmido que aleja la cepa del donante E. coli y las cepas de ayuda. Se i pensó que esto podía deberse a la producción de sacarosa extrema.

También se produjo un sistema de producción de sacarosa homólogo en el que los genes de Synechocystis sp. PCC 6803 sps y spp se colocaron detrás del promotor RuBisCo Synechocystis sp. PCC 6803 en el contexto del operón RuBisCo de Synechocystis sp. PCC 6803 (rbcLXS) ( SEQ ID NO: 233), y se terminó mediante el supuesto terminador rbcLXS .. Un marco de lectura abierto sps marcado con His6 en el. extremo C comenzó en el inicio de rbcL y terminó en el final de rbcX. Un marco de lectura abierto spp marcado con His6 en el extremo C remplazó rbcS. Para conseguir esta construcción, se sintetizó; el operón artificial, excepto por un fragmento 1.3 kbp de Xmal/Spel dentro de sps, con los sitios flanqueantes Xbal y Pmel (BÍue Heron, Bothell, WA) . Este fragmento Xbal/Pmel fue colocado en el plásmido pLybAL50 (un derivado de pLybAL19) digerido con Xbal y Clal (con extremo romo por la ADN polimerasa T4), lo que creó un plásmido pLybAL66. El fragmento Xmal/Spel de sps fue amplificado por PCR a partir del ADN genómico de células enteras LYB467 con i los oligonucleótidos Ssp6803spsXS-F y Ssp6803spsXS-R. Se digirió el producto con Xmal y Spel y se ligó a pLybAL66, digerido de una forma similar, lo que creó pLybAL67.

Se transfirieron pLybAL66 y pLybAL67 1 a LYB472 mediante conjugación triparental. Los transconjugantes de pLybAL66 (que tenían un sps incompleto) parecían sanos, pero los transcon ugantes de · pLybAL67 (que tenían un sps completo) se comportaron de la misma forma que aquellos de pLybAL42 y pLybAL43. Aparecieron unas pocas colonias verdes de LYB472 con pLybAL67 con el correr del tiempo. Algunas de estas fueron cultivadas en BG11-A con 25 µg/ml de cloranfenicol . El ADN plásmido fue purificado con el kit Wizard Plus SV Miniprep (Promega, Madison, WI), con la adición, de 1 minuto de tratamiento con microesferas de vidrio en un agitador de microesferas luego de volver a suspender el pellet. La poca cantidad de ADN plásmido purificado fue amplificada mediante transformación en E. coli NEB5alpha (NEB, Ipswich, MA) . El ADN fue sometido nuevamente a miniprep y se sometió a análisis de restricción, donde algunos aislados no coincidieron con el ADN plásmido original. Los aislados que parecían correctos de acuerdo al análisis de restricción contenían supuestamente o pocas eliminaciones/inserciones o mutaciones puntuales. En cualquiera de los casos, no se realizaron análisis adicionales de las secuencias de estos plásmidos .

Algunos transconjugantes pLybAL67, sin embargo, fueron analizados cualitativamente para determinar la producción de sacarosa. Brevemente, se cultivaron colonias pequeñas y aisladas de LYB472 que portaban ya sea el plásmido pLybAL66 o el plásmido pLybAL67 de una placa de agar con un tubo de. agitación de vidrio estéril y se transfirió a 50 microlitros del medio BG11A complementado con cloranfenicol . Luego se colocó el microcultivo en un platillo estéril de múltiples pocilios como una gota colgante sobre 1 mi de un grupo de medios ¡de cultivo sin células para prevenir la pérdida por evaporación de la solución de gota colgante. Luego de 7 días se recolectaron las gotas, se eliminó la biomasa mediante centrifugación y se evaluó el sobrenadante (caldo de cultivo usado) para determinar la presencia de sacarosa. Se observó una fuerte 1 respuesta colorimétrica en los cultivos con LYB472 que porta pLybAL67, mientras que los cultivos de LYB472 sin plásmidos o LYB472 pLybAL66 no mostraron respuesta significativa alguna. El ensayo cuantitativo de sacarosa en estas muestras no fue posible debido al nivel extremadamente bajo de biomasa en las muestras. Sin embargo, el análisis cualitativo indicó que se observó producción de sacarosa significativa con un promotor RuBisCo totalmente funcional anterior al gen asf para LYB472: qué porta pLybAL67. Los intentos por modificar LYB472 que porta pLybAL67 resultaron en un crecimiento extremadamente lento que cesó luego de varios días, lo cual tuvo como resultado células de amarillentas a blancuzcas que parecían perder viabilidad con el correr del tiempo. j i EJEMPLO 5: EXPRESIÓN DE LA ESTERASA DE LAS VARIACIONES DEL PROMOTOR RuBisCo DE NOSTOC SP . PCC 7120 ' I El siguiente ejemplo muestra la expresión de la esterasa de las variaciones del promotor RuBisCo de ostoc sp.

I PCC 7120.

Los resultados para pLybAL42, pLybAL 3 , ; LybAL66 y pLybAL67 indicaron que el promotor RuBisCo puede; tener la capacidad de sintetizar suficientes enzimas para la producción de sacarosa, pero la producción debe ser reducida .durante la fase de acumulación de biomasa (véase el ejemplo 3) . Además, la regulación debe ser poco costosa para producir un producto esencial económico. Si bien otros informes han demostrado el uso de NtcA para controlar la expresión (véase, por ejemplo, Jiang et ál. 1997; Herrero et ál, 2001; Muro-Pastor et ál,' 2005), el uso en Synechocystis sp. PCC 6823 no se ha informado. ' El sistema de Ntca en Synechocystis sp'. PCC 6823 se evaluó por primera vez en un sistema sencillo de enzimas, carboxilesterasa termófila, al que se podía analizar fácilmente. El gen de carboxilesterasa termófilo fue amplificado por PCR a partir del plásmido pCE020R con los oligonucleótidos E020-F y E020-R que también se unieron a un marco de lectura abierto marcado por His6 en el extremo C. Se digirió el producto de PCR con Ndel y Clal, y se ligó a pLybAL50, digerido de forma similar, lo que creó de este modo pLybAL68, en el que se remplazó el gen asf de LybAL50 con el gen de esterasa.' Luego, los promotores CI y lambda 'PR - fueron remplazados con varios fragmentos del promotor Nostoc sp PCC 7120 rbcLXS. Se realizaron, cuatro construcciones diferentes que contenían una región entera, el núcleo más la región posterior, el núcleo más la región anterior y el núcleo solo. Estos fragmentos fueron obtenidos mediante amplificación por PCR del ADN cromosómico purificado de Nostoc sp. PCC 712¡0 (ATCC # 27893D-5) , los pares de oligonucleótidos Nsp7120rbcprom-F 1/Nsp7120rbcprom-Rl, Nsp7120rbcprom-F2/Nsp7120rbcprom-Rl, Nsp7120rbcprom-Fl/Nsp7120rbcprom-R2 y Nsp7Í20rbcprom- F2/Nsp7120rbcprom-R2 , respectivamente. Los productos de PCR fueron digeridos con Sbfl y BamHI, y luego se ligaron a pLybAL68, digerido de una forma similar, para crear pLybAL69, pLybAL70, pLybAL71 y pLybAL72, respectivamente.

Se introdujeron plásmidos en LYB4761 mediante conjugación triparental (tal como se describe en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2009/0181434) .

Se cultivó Synechocystis sp. (LYB476) que porta el plásmido pLybAL69 (secuencia del promotor RuBisCo regulada por nitrógeno de Nostoc sp . PCC 7120 frente al gen LYB E020) en 50 mi de medio BGll ajustado a pH 8.0 con solución amortiguadora HEPES 5 mM complementada con 25 µq/ml de cloranfenicol y nitrato de potasio sustituido por cloruro de amonio 4 mM como( fuente de nitrógeno. Se realizó el cultivo a 28 °C en matraces de agitación a 250 RPM bajo 100 µ? de iluminación con LED blancos. Luego de cuatro días de fermentación se cultivaron las células asépticamente mediante centrifugación, se lavaron una vez con lx volúmenes de agua estéril desionizada. Se redispersaron las células precipitadas en agua estéril al mínimo y se dividieron equitativamente y se inocularon en 25 mi de medio BGll fresco que contenía o cloruro de amonio 4 mM o de nitrato de potasio I 20 mM y 25 mg/ml de cloranfenicol a pH 8.0 o pH 9.0, respectivamente. Se agitó el cultivo a 250 RPM y 28' °C durante 24 horas bajo 100 mE de iluminación. Se separó el medio de cultivo de las células mediante centrifugación, se sometieron las células a lisis con detergente y se analizó el sobrenadante clarificado para determinar la actividad de esterasa con un ensayo colorimétrico de acetato de p-nitrofenol . Brevemente, se dispersó p-nitrofenilacetato 100 µ? (de una solución madre de 1 mM en acetonitrilo) en solución amortiguadora de fosfato 50 mM a pH 7. La reacción fue iniciada por la adición de 0.1 µ? de lisado bruto y la formación de p-nitrofenato liberada de la reacción de hidrólisis se siguió a 348 nm (punto isosbéstico para el ion de nitrofenol/nitrofenilato) .

Se cultivó una cepa de Synechocystis sp. (LYB476) que porta el plásmido pLybAL70 (secuencia de promotjor RuBisCo regulada con nitrógeno de Nostoc sp. PCC 7120 frente al gen LYB i E020) en 50 mi de medio BG11 modificado a pH 8.0 con solución amortiguadora HEPES 5 mM complementada con 25:pg/ml de cloranfenicol y nitrato de potasio sustituido por cloruro de amonio 4 mM como fuente de nitrógeno. Se realizó el ( cultivo a 28 °C en matraces de agitación a 250 RPM bajo 100 µ? de iluminación con LED blancos. Luego de cuatro ' días de fermentación se cultivaron las células asépticamente mediante centrifugación y se lavaron una vez con lx volúmenes de agua estéril desionizada. Se redispersaron las células precipitadas i en agua estéril al mínimo, se dividieron equitativamente y se inocularon en 25 mi de medio BG11 fresco que contenia o de cloruro de amonio 4 mM o nitrato de potasio 20 mM y 25 mg/ml de cloranfenicol a pH 8.0 o pH 9.0, respectivamente. Se agitó el cultivo a 250 RPM y 28 °C durante 24 horas bajo ???' mE de iluminación. Se separó el medio de cultivo de las células mediante centrifugación, se sometieron las células a lisis con detergente y se analizó el sobrenadante clarificado para determinar la actividad de esterasa con un ensayo colorimétrico de acetato de p-nitrofenol , tal como se describió anteriormente.

Se cultivó una cepa de Synechocystis sp. (LYB476) que porta el plásmido pLybAL71 (secuencia de promotor RuBisCo regulada con nitrógeno de Nostoc sp. PCC 7120 frente al gen LYB E020 ) en 50 mi de medio BG11 modificado a pH 8.0 con solución amortiguadora HEPES 5 mM complementada con 25'µ?/?t?1 de cloranfenicol y nitrato de potasio sustituido por cloruro de amonio 4 mM como fuente de nitrógeno. Se realizó el cultivo a 28 °C en matraces de agitación a 250 RPM bajo i 100 µ? de iluminación con LED blancos. Luego de cuatro días de fermentación se cultivaron las células asépticamente mediante centrifugación, se lavaron una vez con lx volúmenes de agua estéril desionizada. Se redispersaron las células precipitadas en agua estéril al mínimo y se dividieron equitativamente y se inocularon en 25 mi de medio BG11 fresco que contenía' o cloruro i de amonio 4 mM o nitrato de potasio 20mM, y 25 mg/ml de cloranfenicol a pH 8.0 o pH 9.0, respectivamente. Se agitó el cultivo a 250 RPM y 28 °C durante 24 horas bajo 100 mE de iluminación. Se separó el medio de cultivo de las células mediante centrifugación, se sometieron las células a lisis con detergente y se analizó el sobrenadante clarificado para determinar la actividad de esterasa con un ensayo colorimétrico de acetato de p-nitrofenol , tal como se describió anteriormente. i Se cultivó una cepa de.. Synechocystis sp. (LYB476) que porta el plásmido pLybAL72 (secuencia de promotor RuBisCo regulada con nitrógeno de Nostoc sp. PCC 7120 frente 'al gen LYB E020 ) en 50 mi de medio BG11 modificado a pH 8.0 con solución amortiguadora HEPES 5 mM complementada . con 25 pg/ml de cloranfenicol y nitrato de potasio sustituido con cloruro de amonio 4 mM como fuente de nitrógeno. Se realizó el cultivo a 28 °C en matraces de agitación a 250 RPM bajo 100 µ? de iluminación con LED blancos. Luego de cuatro ' días de fermentación se cultivaron las células asépticamente mediante centrifugación, se lavaron una vez con lx volúmenes de agua estéril desionizada. Se redispersaron las células precipitadas en agua estéril al mínimo y se dividieron equitativamente y se inocularon en 25 mi de medio BG11 fresco que contenía cloruro de amonio 4 mM o nitrato de potasio 20 mM, y 25' mg/ml de cloranfenicol a pH 8.0 o pH 9.0, respectivamente. Sé agitó el cultivo a 250 RPM y 28 °C durante 24 horas bajo ¡100 mE de iluminación. Se separó el medio de cultivo de las células mediante centrifugación, se sometieron las células a lisis con detergente y se analizó el sobrenadante clarificado para determinar la actividad de esterasa con un ensayo coiorimétrico de acetato de p-nitrofenol, tal como se describió anteriormente.

Los resultados mostraron que la expresión del gen de carboxiesterasa corresponde a una esterasa termófila que fue clonada y modificada para contener una etiqueta de 6X Histidina en el extremo carboxilo del polipéptido. La enzima es extremadamente estable y muestra estar bien expresada como una enzima activa altamente soluble en un huésped de organismos recombinantes . El ensayo coiorimétrico para la actividad de una enzima es un medio extremadamente sensible y cuantitativo para determinar la producción de expresión de proteínas: Con este propósito, las pruebas de construcciones de plásmidos que contienen el gen NE020 proporcionaron una respuesta clara a la expresión total de proteínas de las construcciones probadas. La utilización de las velocidades iniciales de recambio ,de enzimas en correlación con el total de proteínas obtenido en cada sistema proporcionó una medida de las enzimas producidas. Adicionalmente, los análisis Western blot de las biomasas lisadas con anticuerpos regenerados contra la etiqueta 6XHis unida a la proteína proporcionaron un entendimiento de los niveles de proteínas expresados en cada muestra y también proporcionaron un medio para validar los datos del ensayo cinético. ' EJEMPLO 6: EXPRESIÓN DE ASF DE VARIACIONES DEL PROMOTOR RUBISCO DE NOSTOC SP. PCC 7120 El siguiente ejemplo muestra la expresión de ASF de las variaciones del promotor RuBisCo de Nostoc sp. 'PCC 7120.

El gen carboxiesterasa (E020) de los. plásmidos pLybAL69, pLybAL70, pLybAL71 y pLybAL72 fue remplazado con el gen asf (que porta una etiqueta His6 en el extremo C) del plásmido pLybAL50. El gen asf en pLybAL50 fue eliminado mediante digestión con BamHI y Clal, y se colocó en pLybAL69, pLybAL70, pLybAL71 y pLybAL72, digeridos de forma similar, 'para crear pLybDB2 (SEQ ID NO: 188), pLybDB3 (SEQ ID NO: 189), pLybDB4 (SEQ ID NO: 190) y pLybDB5 (SEQ ID NO: 191), respec ivamente.

Se introdujeron plásmidos en LYB476 mediante conjugación triparental (tal como se describe en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2009/0181434).

Se cultivó Synechocystis sp. (LYB476) que porta el plásmido pLybDB2 (SEQ ID NO: 188) (secuencia promotora RuBisCo regulada con nitrógeno de Nostoc sp. PCC 7120 frente al gen asf ) en 50 mi de medio BG11 ajustado a pH 8.0 con solución amortiguadora HEPES 5 mM complementada con 25 pg/ml de cloranfenicol y de nitrato de potasio sustituido por cloruro de amonio 4 mM como fuente de nitrógeno. Se realizó el cultivo a 28 °C en matraces de agitación a 250 RPM bajo' 100 µ? de iluminación con LED blancos. Luego de cuatro1 días de fermentación se cultivaron las células asépticamente mediante centrifugación, se lavaron una vez con lx volúmenes de agua estéril desionizada. Se realizó el cultivo a 28 °C en matraces 5 de agitación a 250 RPM bajo 100 µ? de iluminación con LED blancos. Luego de cuatro días de fermentación se cultivaron las células asépticamente mediante centrifugación, se lavaron una vez con lx volúmenes de agua estéril desionizada. Se redispersaron las células precipitadas en agua estéril al 10 mínimo, se dividieron equitativamente y se inocularon en 25 mi de medio BG11 fresco que contenía cloruro de amonio 4 mM o nitrato de potasio 20 mM, y 25 mg/ml de cloranfenicol a pH 8.0 o pH 9.0, respectivamente. Se agitó el cultivo- a 250 RPM y 28 °C durante 48 horas bajo 100 mE de iluminación. Se separaron las 15 células del medio de cultivo y se analizó el contenido de sacarosa en el medio de cultivo usado con un bioensayo de enzimas acopladas de Biovision. La cantidad de sacarosa en el medio de cultivo usado fue comparada con medidas similares de sacarosa realizadas en muestras obtenidas de medio de cultivo 20 amoniacal usado durante la fase de acumulación de biomasa del cultivo. Los experimentos de control fueron realizados para medir el contenido residual de sacarosa de las células' luego del cultivo inducido final y la posterior lisis del pellet celular final. •25 Se cultivó Synechocystis sp. (LYB476) que porta el plásmido pLybDB3 (SEQ ID NO: 189) (secuencia del! promotor RuBisCo interrumpida regulada con nitrógeno de Nostoc sp. PCC 7120 frente al gen asf) en 50 mi de medio BGll ajustado a pH 8.0 con solución amortiguadora HEPES 5 mM complementada con 25 pg/ml de cloranfenicol y nitrato de potasio sustituido por cloruro de amonio 4 mM como fuente de nitrógeno. Se realizó el' cultivo a 28 °C en matraces de agitación a 250 RPM bajo 100 µ? de iluminación con LED blancos. Luego de cuatro1 días de fermentación se cultivaron las células asépticamente mediante centrifugación, se lavaron una vez con lx volúmenes de agua estéril desionizada. Se realizó el cultivo a 28 °C e;n matraces de agitación a 250 RPM bajo 100 µ? de iluminación con LED I blancos. Luego de cuatro dias de fermentación se cultivaron las células asépticamente mediante centrifugación, se lavaron una vez con lx volúmenes de agua estéril desionizada. Se redispersaron las células precipitadas en agua éstéril al mínimo, se dividieron equitativamente y se inocularon en 25 mi de medio BGll fresco que contenía cloruro de amonio 4 mM o nitrato de potasio 20 mM, y 25 mg/ml de cloranfenicol ;a pH 8.0 o pH 9.0, respectivamente. Se separaron las células del medio de cultivo y se analizó el contenido de sacarosa en eí medio de cultivo usado con un bioensayo de enzimas acopladas de i Biovision. La cantidad de sacarosa en el medio de cultivo usado fue comparada con medidas similares de sacarosa realizadas en muestras obtenidas de medio de cultivo amoniacal usado durante la fase de acumulación de biomasa del cultivo. Los experimentos de control fueron realizados para medir el contenido residual de sacarosa de las células luego del cultivo inducido final y la posterior lisis del pellet celular final. ¡ Se cultivó Synechocystis sp. (LYB476) que porta el plásmido pLybDB4 (SEQ ID NO: 190) (secuencia de promotor RuBisCo interrumpida regulada con nitrógeno de Nostoc sp. PCC 7120 frente al gen asf) en 50 mi de medio BG11 ajustado a jpH 8.0 con solución amortiguadora HEPES 5 mM complementada con 25 iq/ l de cloranfenicol y nitrato de potasio sustituido con cloruro de amonio 4 mM como fuente de nitrógeno. Se realizó el; cultivo a 28 °C en matraces de agitación a 250 RPM bajo 100 µ? de iluminación con LED blancos. Luego de cuatro ' días de fermentación se cultivaron las células asépticamente mediante centrifugación, se lavaron una vez con lx volúmenes de agua estéril desionizada. Se redispersaron las células precipitadas en agua estéril al mínimo, se dividieron equitativamente y se i inocularon en 25 mi de medio BG11 fresco que contenia cloruro de amonio 4 mM o nitrato de potasio 20 mM, y 25, mg/ml de cloranfenicol a pH 8.0 o pH 9.0, respectivamente. Se agitó el cultivo a 250 RPM y 28 °C durante 48 horas bajo i 100 mE de iluminación. Se separaron las células del medio de cultivo y se analizó el contenido de sacarosa en el medio de cultivo usado con un bioensayo de enzimas acopladas de Biovision. La cantidad de sacarosa en el medio de cultivo usado fue comparada con medidas similares de sacarosa realizadas en muestras! obtenidas de medio de cultivo amoniacal usado durante la fase de acumulación de biomasa del cultivo. Los experimentos de control fueron realizados para medir el contenido residual de sacarosa de las células luego del cultivo inducido final y la posterior lisis del pellet celular final. i Se cultivó Synechocystis sp. (LYB476) que porta el plásmido pLybDB5 (SEQ ID NO: 191) (secuencia promotora RuBisCo interrumpida regulada con nitrógeno de Nostoc s . PCC 7120 frente al gen asf) en 50 mi de medio BG11 ajustado a ¡pH 8.0 con solución amortiguadora HEPES 5 mM complementada con 25 g/ml de cloranfenicol y nitrato de potasio sustituido con cloruro de amonio 4 mM como fuente de nitrógeno. Se realizó el: cultivo a 28 °C en matraces de agitación a 250 RPM bajo 100 µ? de iluminación con LED blancos. Luego de cuatro' días de fermentación se cultivaron las células asépticamente mediante centrifugación, se lavaron una vez con Ix volúmenes de agua estéril desionizada. Se redispersaron las células precipitadas en agua estéril al mínimo, se dividieron equitativamente y se inocularon en 25 mi de medio BG11 fresco que contenía cloruro de amonio 4 mM o nitrato de potasio 20 mM, y 25¡ mg/ml de cloranfenicol a pH 8.0 o pH 9.0, respectivamente. Sé agitó el i cultivo a 250 RPM y 28 °C durante 48 horas bajo 100 mE de iluminación. Se separaron las células del medio de cultivo y se analizó el contenido de sacarosa en el medio de cultivo usado i con un bioensayo de enzimas acopladas de Biovision. La cantidad de sacarosa en el medio de cultivo usado fue comparada con medidas similares de sacarosa realizadas en muestras obtenidas de medio de cultivo amoniacal usado durante la1 fase de acumulación de biomasa del cultivo. Los experimentos ' de control fueron realizados para medir el contenido residual de sacarosa de las células luego del cultivo inducido final y la posterior lisis del pellet celular final. ' La estructura de la secuencia de promotor RuBisCo de Nostoc sp. PCC 7120 fue acorde a la Tabla 1. ; TABLA 1: Regiones del promotor Nostoc sp. PCC7120 (vea la Figura La región ilustrada en la FIG. 3 comienza desde el punto donde se introduce el sitio Sbfl, a través del primer codón de rbcL (subunidad grande de RuBisCo) . La secuencia de ADN se toma del genoma publicado (Kaneko et ál. 2001 DNA Res 8, 205-213) . La numeración es relativa al inicio de la transcripción (+1). Las letras minúsculas indican mutaciones realizadas para introducir los sitios Sbfl y BamHl de endonucleasas de restricción. La secuencia identificada como promotora cubre el área que normalmente se identificaría como un típico promotor tipo o70 de E.colí. Puede identificarse una secuencia -10 de consenso (TATAAT) con respecto al inicio de la transcripción. Se utilizó análisis de huellas de ADN para mostrar que NtcA une el ADN en dos ubicaciones (véase Kaneko et ál. 2001 DNA Res 8, 205-213) . El sitio de consenso 1 de NtcA en la FIG. 3 es GTNi0AC. El sitio de consenso 2 de NtcA en la FIG. 3 es GTNgAC. Ambos se encuentran flanqueados por A y T. El análisis de huella de ADN indica que una segunda proteína (Factor 2) se une a, la región promotora (véase Ramasubramanian et ál. 1994 J Bacterio! 176, 1214-1223) . I Las medidas de sacarosa se tomaron en un medio de cultivo sin células, se normalizaron hasta obtener una biomasa seca total y se corrigieron en busca de glucosa en el ambiente en cada muestra. ! Los resultados mostraron que la coinstrucción promotora compuesta por la región entera del segmento qué rodea al promotor RuBisCo regulado por nitrógeno proporcionaron poca o nada de sacarosa detectable, al igual que la construcción que carece de las dos regiones flanqueantes de la secuencia. Las construcciones, ya sea con la región líder o la región posterior de la secuencia eliminadas individualmente, demostraron una producción significativa de sacarosa (entre 0.15 y 0.9 gramos de azúcar/gramo de biomasa seca.) Los productos de( sacarosa mostraron depender de la fuente de nitrógeno en el medio de cultivo con amoníaco que contiene cultivos que proporcionan un incremento de 3-5 veces mayor en los productos de 1 azúcar en comparación con las soluciones de cultivo compuestas de nitrato. Los análisis Western Blot realizados para detectar la presencia de la proteína, así (que contiene la etiqueta 6X 'Histidina) demostraron tener cantidades mensurables de proteínas en las construcciones con una única región interrumpida líder o posterior de la secuencia que es coherente ¦ con los descubrimientos de producción de sacarosa. Experimentos de control que medios de cultivo que contienen amoníaco , o nitrato demostraron que los organismos toleraron los cambios en las fuentes de nitrógeno sin cambios visibles en las propiedades de crecimiento del organismo. , EJEMPLO 7: OPERÓN DE DOS GENES DE EXPRESIÓN SPS/SPP DE LAS VARIACIONES DEL PROMOTOR RuBlSCO DE NOSTOC SP . PCC 7120 ' El gen carboxiesterasa (E020) de los plásmidos pLybAL69, pLybAL70, pLybAL71 y pLybAL72 fue remplazado por los genes sps y spp (que portan cada uno una etiqueta His6 en el extremo C) en la estructura de su operón del plásmido pLybAL67. Se amplificó un fragmento que porta los genes sps y spp mediante PCR de la plantilla pLybAL67 con los oligonucleótidos SPSSPP directo #2 y SPSSPP inverso. Se digirió el producto de PCR con BglII y NarI, y se colocó en los plásmidos pLybAL69, pLybAL70 y pLybAL72 que fueron digeridos con BamHI y Clal para crear los plásmidos pLybDB6 (SEQ ID NO: 235), pLybDB7 (SEQ ID NO: 236) y pLybDB9 (SEQ ID NO: 237), respectivamente. El equivalente sps/spp de los plásmidos pLybAL71 (E020) y pLybDB4 (SEQ ID NO: 190) (asf ) , el cual se llamaría pLybDB8, fue dejado de lado debido a dificultades encontradas durante su construcción.

Se introdujeron plásmidos en LYB476 mediante I conjugación triparentál (tal como se describe en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2009/0181434) .

Se cultivó Synechocystis sp. (LYB476) que porta el plásmido pLybDB6 (SEQ ID NO: 235) (secuencia de promotor RuBisCo i regulada por nitrógeno de Afetoc sp. PCC 7120 frente a1 los genes de Synechocystis sp. PCC 6803 sps/spp) en 50 mi de medio BG11 ajustado a pH 8.0 con solución amortiguadora HEPES 5 ftiM con I i 25 µq/ l de cloranfenicol y nitrato de potasio sustituido con cloruro de amonio 4 m como fuente de nitrógeno. Se :realizó el cultivo a 28 °C en matraces de agitación a 250 RPM bajo 100 µ? de iluminación con LED blancos. Luego de cuatro días de fermentación se cultivaron las células . asépticamente mediante centrifugación, se lavaron una vez con lx volúmenes de agua estéril desionizada. Se redispersaron las células precipitadas en agua estéril al mínimo, se dividieron equitativamente y se inocularon en 25 mi de medio BG11 fresco que contenía cloruro de amonio 4 mM o nitrato de potasio 20 mM, y 25, mg/ml de cloranfenicol a pH 8.0 o pH 9.0, respectivamente. Sé agitó el cultivo a 250 RPM y 28 °C durante 48 horas bajo 100 mE iluminación. Se separaron las células del medio de cultivo y se I analizó el contenido de sacarosa en el medio de cultivo usado con un bioensayo de enzimas acopladas de Biovision. La cantidad de sacarosa en el medio de cultivo usado fue comparada con i medidas similares de .sacarosa realizadas en muestras obtenidas de medio de cultivo amoniacal usado durante la; fase de acumulación de biomasa del cultivo. Los experimentos de control fueron realizados para medir el contenido residual de sacarosa de las células luego del cultivo inducido final y la, posterior i lisis del pellet celular final.

Se cultivó Synechocystis sp. (LYB476) que porta el plásmido pLybDB7 (SEQ ID NO: 236) (secuencia de promotor RuBisCo interrumpida regulada por nitrógeno de Nostoc s . , PCC 7120 frente a los genes de Synechocystis sp. PCC 6803 sps/spp) en 50 mi de medio BGll ajustado a pH 8.0 con solución amortiguadora HEPES 5 mM con 25 q/ml de cloranfenicol y nitrato ,de potasio sustituido con cloruro de amonio 4 mM como fuente de nitrógeno. Se realizó el cultivo a 28 °C en matraces de agitación a 250 RPM bajo 100 µ? de iluminación con LED blancos. Luego de cuatro días de fermentación se cultivaron las células asépticamente mediante centrifugación, se lavaron una vez con lx volúmenés de agua estéril desionizada. Se redispersaron las células precipitadas en agua estéril al mínimo, se dividieron equitativamente y se inocularon en 25 mi de medio BGll fresco que contenía :cloruro de amonio 4 mM o nitrato de potasio 20 mM, y 25 mg/ml de cloranfenicol a pH 8.0 o pH 9.0, respectivamente. Se agitó el cultivo a 250 RPM y 28 °C durante 48 horas bajo 100 mE de iluminación. Se separaron las células del medio de cultivo y se analizó el contenido de sacarosa en el medio de cultivo usado con un bioensayo de enzimas acopladas de Biovision. La cantidad de sacarosa en el medio de cultivo usado fue comparada con medidas similares de sacarosa realizadas en muestras! obtenidas de medio de cultivo amoniacal usado durante la fase de acumulación de biomasa del cultivo. Los experimentos de control fueron realizados para medir el contenido residual de sacarosa i de las células luego del cultivo inducido final y la posterior lisis del pellet celular final. ¡ Se cultivó Synechocystis sp . (LYB476) que porta el plásmido pLybDB9 (SEQ ID NO: 237) (secuencia promotora RuBisCo interrumpida regulada por nitrógeno de Nostoc sp. PCC 7120 I frente a los genes de Synechocystis sp. PCC 6803 sps/spp) en 50 mi de medio BGll ajustado a pH 8.0 con solución amortiguadora HEPES 5 mM con 25 µq/ml de cloranfenicol y nitrato de potasio sustituido con cloruro de amonio 4 mM como fuente de nitrógeno. Se realizó el cultivo a 28 °C en matraces de agitación a 250 RPM bajo 100 µ? de iluminación con LED blancos. Luego de cuatro días de fermentación se cultivaron las células asépticamente mediante centrifugación, se lavaron una vez con lx volúmenes de agua estéril desionizada. Se redispersaron las células precipitadas en agua estéril al mínimo, se .dividieron equitativamente y se inocularon en 25 mi de medio BGll fresco que contenía cloruro de amonio 4 mM o nitrato de potasio 20 mM, y 25; mg/ml de cloranfenicol a pH 8.0. o pH 9.0, respectivamente. Se agitó el cultivo a 250 RPM y 28 °C durante 48 horas bajo 100 mE de iluminación. Se separaron las células del medio de cultivo y se analizó el contenido de sacarosa en el medio de cultivo usado con un bioensayo de enzimas acopladas de Biovision. La cantidad de sacarosa en el medio de cultivo usado fue comparada con medidas similares de sacarosa realizadas en muestras obtenidas de. medio de cultivo amoniacal usado durante la! fase de acumulación de biomasa del cultivo. Los experimentos de control fueron realizados para medir el contenido residual de sacarosa de las células luego del cultivo inducido final y la¡ posterior lisis del pellet celular final. i Las medidas de sacarosa se tomaron en un medio de cultivo sin células, se normalizaron hasta obtener una biomasa seca total y se corrigieron en busca de glucosa en el ambiente en cada muestra. ¡ De acuerdo con los resultados observados con las construcciones asf, la construcción promotora compuesta de la región completa del segmento que rodea al promotor RuBisCo regulado por nitrógeno anterior a los genes sps/spp proporcionó poca sacarosa detectable. La construcción con ambas regiones i flanqueantes de la secuencia eliminadas demostró una modesta producción de sacarosa, que varia respecto a los ¡resultados obtenidos con las construcciones de asf.

La construcción con el segmento líder de la secuencia eliminado será generada. Sin embargo, la región posterior eliminada de la secuencia significativa en la producción de sacarosa (entre 0.15 y 0.3 gramos de azúcar/gramos de biomasa seca) . Se mostró que las producciones dé sacarosa eran insensibles a la fuente de nitrógeno, tanto con las fuentes de nitrógeno amoniacales como de nitrato, lo que proporcionó niveles similares de producción de azúcar. Los productos de sacarosa se ven reducidos significativamente en las construcciones sps/spp relacionadas, así como también el control regulador total realizado efectivamente. ¡ I EJEMPLO 8: CONSTRUCCIÓN DE PLÁSMIDOS Se utilizó el vector inferior de copia pSMARTGC LK (Lucigen, Middleton, WI) (SEQ ID NO: 192), que el fabricante describe que posee aproximadamente 20 copias por célula, en los plásmidos iniciales como estructura principal para la construcción en Escherichia coli ???5a (NEB, Ipswich, :MA) . Luego de eso, se remplazó pSMARTGC LK con pLG338 (SEQ ID NO: 202) (6 a 8 copias por célula) . Toda amplificación por PCR fue realizada con la polimerasa Phusion, tal como lo describe el ¡fabricante (NEB, Ipswich, MA) .

I Se amplificó el locus upp de Synechocystis sp. PCC 6803 mediante PCR del ADN genómico con los oligoriucleótidos Sspuppins-F (SEQ ID NO: 193) y Sspuppins-R (SEQ ID N0:¡ 194) y se clonaron en el vector pSMARTGC LK tal como lo describe el fabricante, lo que creó pLybAL73f (SEQ ID NO: 195) . :Se dividió el gen y se agregó un sitio de clonación múltiple mediante la digestión de pLybAL73f con FspI y Kpnl, luego se insertaron los oligonucleótidos anulares y fosforilados SspuppMCS-F ('SEQ ID NO: 196) y SspuppMCS-R (SEQ ID NO: 197), lo que proporcionó el plásmido pLybAL74f (SEQ ID NO: 198). Se creó luego el plásmido pLybAL75f (SEQ ID NO: 201) a partir de pLybAL74f mediante digestión de pLybAL74f con FspI y Sphl y se ligó a los oligonucleótidos anulares y fosforilados Selo7942rbcTerm-F (SEQ ID NO: 199) y Selo7942rbcTerm-R (SEQ ID NO: '200) . Esto coloco el terminador de transcripción del operón rubisco de Synechococcus elongatus PCC 7942 delante del sitio de clonación múltiple para prevenir la expresión de asf (SEQ ID NO: 1) de las trancripciones revisadas producidas por el promotor úpp. Luego, se intentó clonar asf junto con los respectivos promotores de i pLybDB3 (SEQ ID NO: 189) y pLybDB4 (SEQ ID NO: 190) a pLybAL75f de modo que sus respectivos productos puedan lineariz.arse y luego transformarse en LYB476 para la integración en el cromosoma, pero los productos correctos nunca se obtuvieron.

Luego se eligió un vector de cifra de ¡ copia aún menor, pLG338 (SEQ ID NO: 202) (6 a 8 copias por célula) . Se construyó el plásmido pLybAL78A (SEQ ID NO: 203) a : partir de pLG338 mediante la digestión parcial con Sphl, seguido por la digestión con EcoRV, el tratamiento con polimerasa T4 para quitar la punta del sitio Sphl y luego la religación del vector de 5.4 kbp. Luego se digirió el plásmido pLybAL78A con PshAI y Nhel, y luego el fragmento HindIII (tratado con polimerasa T4) -Xbal que porta el locus upp de Synechocystis sp. PCC 6803 con el I terminador de transcripción interviniente , y se insertó el sitio de clonación múltiple de pLybAL75f (SEQ ID NO: 201), lp que creó pLybAL79 (SEQ ID NO: 204) . Los fragmentos Sphl - Clal (tratados i con polimerasa T4) que portan asf junto con los respectivos promotores de pLybDB3 (SEQ ID NO: 189) y pLybDB4 (SEQ ID NO: 190) fueron insertados con éxito en pLybAL79, digerido con Sphl i y Notl (tratado con polimerasa T4) para crear pLybAL80 (SEQ ID NO: 205) y pLybAL81 (SEQ ID NO: 206), respectivamente.! Para permitir la selección mediante la cointegración de un marcador resistente a los antibióticos, se crearon los plásmidos pLybEA8 (SEQ ID NO: 238), pLybEA9 (SEQ ID NO: 239) y pLybEAlO (SEQ ID NO: 240) a partir de; pLybAL79 , pLybAL80 y pLybAL81, respectivamente, mediante la inserción del gen de cloranfenicol acetiltransferasa de pKD32 (SEQ ID NO: 241) amplificado con el uso de los oligonucleotidos asfcmlint-F (SEQ ID NO: 242) y asfcmlint-R ( SEQ ID NO: 243), y digeridos con SacII en el sitio SacII. Esto proporcionó los plásmidos en los que se transcribió convergentemente a los genes asf y cloranfenicol acetiltransferasa posterior sin necesidad de un terminador de transcripción interviniente . Se construyeron los plásmidos que contienen el marcador resistente a cloranfenicol en la orientación contraria a la de los plásmidos pLybEA8 , pLybEA9 y pLybEAlO mediante su digestión con SacII y la religación para crear los plásmidos pLybAL84 (SEQ ID1 NO: 244), pLybAL85 (SEQ ID NO: 245) y pLybAL86 (SEQ ID ,NO: 246), I respectivamente.

La construcción de vectores para la int gración en el locus de invertasa comenzó con el plásmido pLybAL8¡7b (SEQ ID NO: 247) . Se creó el plásmido pLybAL87b a partir de pLybEA8 al insertar un producto de PCR que porta el locus de invertasa con un sitio de clonación múltiple interviniente. Este producto de PCR se creó mediante sucesivas PCR del ADN cromosómieo de tipo salvaje de Synechocystis sp. PCC 6803 con los oligonucleotidos Sspinvint-F (SEQ ID NO: 248) y Sspinvint-R (SEQ ID 'NO: 249), seguidas de una amplificación secundaria con el producto de la primera reacción y el oligonucleótido Sspinvint-R2 (SEQ ID NO: 250) como cebadores. Este producto de PCR final fue digerido con EcoRI y el producto de 1.4 kbp fue insertado en el fragmento de 4.9 kbp de EcoRI de pLybEA8, gue remplazó el locus upp junto con su sitio de clonación múltiple interviniente y el marcador resistente al cloranfenicol . Nuevamente, el terminador de transcripción del operón rubisco de Synechococcus elóngatus PCC 7942 fue colocado antes del sitio de clonación múltiple para i prevenir una transcripción revisada del gen asf mediante promotores corriente .arriba. Se digirió el plásmido, pLybAL87b con Notl y Sphl, y se insertaron los oligonucleotidos anulares y fosforilados Selo7942rbcTerm-F2 (SEQ ID NO: ¡ 251) y Selo79'42rbcTerm-R2 (SEQ ID NO: 252), lo que creó pLybAL88b (SEQ ID NO: 253) . Para prevenir una expresión adicional innecesaria del marcador resistente al cloranfenicol de los promotores ubicados delante del gen asf en las construcciones finales, se colocó también un terminador de transcripción entre el gen asf y el marcador resistente al cloranfenicol en el plásmido pLybAL85 (SEQ ID NO: 245) . Se digirió parcialmente el plásmido pLybAL85 tanto con SacII como con BamHI, y luego se insertaron en el vector 9.5 kbp los oligonucleotidos anulares y fo!sfotilados Selo7942AIITerm-F (SEQ ID NO: 254) y Selo7942AI ITerm-R (SEQ ID NO: 255) que contienen el terminador de transcripción de Synechococcus elóngatus PCC 7942 psbAII, lo que creó pLybAL89 i (SEQ ID NO: 256) . Se combinaron los plásmidos pLybAL88b y pLybAL89 para crear pLybAL90 (SEQ ID NO: 257) . Sé ligó el i fragmento de 3.9 kbp de Sphl - Kpnl de pLybAL89 al fragmento de 6.3 kbp de Sphl - Kpnl de pLybAL88b. El fragmento de 0.37 kbp de Sphl -BamHI del plásmido pLybAL86 se combinó luego con el fragmento de 9.6 kbp de Sphl -BamHI del plásmido pLybAL90 para crear pLybAL91 (SEQ ID NO: 258) . El plásmido pLybAL91 contiene el locus de invertasa dividido por el terminador de transcripción, el fragmento del promotor rubisco de1 Nostoc sp PCC7120 de pLybDB4, asf, otro terminador de transcripción y luego el marcador resistente al cloranfenicol con su propio promotor transcripto en la misma orientación que asf. ¡ El locus de invertasa del plásmido pLybAL88b fue barrido con el locus de exopolisacáridos en dos etapas. En primer lugar, se amplificó el ADN cromosómico de tipo salvaje de Synechocystis sp. PCC 6803 con los oligonucleótidos SspEPSint-F (SEQ ID NO: 259) y SspEPSint-R (SEQ ID NO: 260) . El producto de 0.67 kbp de esta reacción fue digerido con EcoRI y NotT, y se ligó al fragmento de 5.7 kbp, digerido de una forma similar, de pLybAL88b, lo que formó pLybAL93 (SEQ ID NO: 261) . En segundo lugar, se amplificó el ADN cromosómico de tipo salvaje de Synechocystis sp. PCC 6803 con los oligonucleótidos SspEPSint-F2 I (SEQ ID NO: 262) y SspEPSint-R2 (SEQ ID NO: 263) . El producto de 1.1 kbp de esta reacción fue digerido con EcoRI y Kpnl> y se ligó al fragmento de 5.6 kbp de pLybAL93, digerido de forma similar, lo que formó pLybAL94 (SEQ ID NO: 264). Luego, se creó el plásmido pLybAL98 (SEQ IDNO: 265) mediante la ligación del fragmento de 6.7 kbp de Sphl - Kpnl de pLybAL94 con el1 fragmento de 3.6 kbp de pLybAL91, digerido de forma similar. El plásmido pLybAL98 contiene el locus de exopolisacáridos dividido por el terminador de transcripción, el fragmento del promotor rubisco de Nostoc sp PCC7120 de pLybDB4, asf, otro terminador de transcripción y luego el marcador resistente al clóranfenicol con su propio promotor transcripto en la misma orientación que asf.

El locus de exopolisacáridos del plásmido pLybAL94 fue barrido con el locus sps de Synechocystis sp . PCC 6803 en dos etapas. En primer lugar, se amplificó el ADN cromosómico de tipo salvaje de Synechocystis sp. PCC 6803 1 con los oligonucleótidos Sspspsint-F (SEQ ID NO: 266) y Sspspsint-R (SEQ ID NO: 267). El producto de 1.3 kbp de esta reacción fue digerido con RsrII y Kpnl, y se ligó al fragmento de 5.6 kbp, digerido de una forma similar, de pLybAL94, lo Jque formó pLybAL95 (SEQ ID NO: 268). En segundo lugar, se amplificó el ADN cromosómico de tipo salvaje de Synechocystis sp. PCC 6803 con los oligonucleótidos Sspspsint-F2 (SEQ ID NO: 269) y Sspspsint-R2 (SEQ ID NO: 270). El producto de 0.92 kbp de est reacción fue digerido con Mrel y Notl, y se ligó al fragmento de 6.3 kbp, digerido de una forma similar, de pLybAL95, lo ¡que formó pLybAL96 (SEQ ID NO: 271) . i Se utilizaron los plásmidps pLybALlO 6 (SEQ ID NO: 272) y pLybAL107 (SEQ ID NO: 273) para integrar j proteínas reguladores de reguión de nitrógeno inducible con nitrato y los i genes de invertasa, respectivamente, junto con el marcador resistente a la kanamicina en el locus sps de Synechocystis sp. PCC 6803. En primer lugar, se eliminó el marcador resistente a la kanamicina de pLybAL90 mediante la digestión con : Mlul y la relegación del fragmento de 8.7 kbp, lo que creó pLybALlOO (SEQ ID NO: 274). Se remplazó el marcador resistente al cloranfenicol de pLybALlOO con. el marcador resistente a la kanamicina dé pKD13 (SEQ ID NO: 275) . Se amplificó el marcador resistente a la kanamicina de pKD 13 con los oligonucleótidos neoflp,int-F (SEQ ID NO: 276) y asfcmlint-R (a) (SEQ ID NO: 277) . Se digirió el producto de 1.3 kbp con Pací y SacII, y se ligó al fragmento de 7.7 kbp de pLybALlOO, digerido de una forma similar, lo que creó pLybALlOl (SEQ ID NO: 278). Se sintetizaron los fragmentos que contenían el promotor nirA (SEQ ID NO: 32) de Syñechococcus elongatus PCC 7942 seguido ya sea por los genes ntcA y ntcB (PnirA_ntcA_ntcB) (SEQ ID NO: 279) o por invertasa ( PriirA_liml7 ) (SEQ ID NO: 280) de Syñechococcus elongatus PCC 7942 mediante Blueheron (Bothell, WA) . Los genes de Synechococcus elongatus PCC 7942 fueron utilizados en lugar de aquellos de Synechocystis sp. PCC 6803 para limitar la recombinación cromosómica errónea.

I Estos fragmentos (1.9 y 1.7 kbp) fueron digeridos con Sbfl y Pmel, y se colocaron en el fragmento de 6.2 kbp de pLybALlOl para crear pLybAL102 (SEQ ID NO: 281) y pLybAL103 (SEQ ID NO: 282), respectivamente. Los genes inducibles y los marcadores resistentes a la kanamicina de pLybAL102 y pLybALÍ03 fueron combinados con pLybAL96, para integrarse en el locus sps. Los fragmentos de 3.2 y 3.1 kbp de Sbfl - SacII de pLybAL102 y pLybALl03 fueron ligados al fragmento de 7.2 kbp de; pLybAL96, digerido de forma similar, para proporcionar pLybAL106 (SEQ ID NO: 272) y pLybAL107 (SEQ ID NO: 273), respectivamente.

EJEMPLO 9: INTEGRACIÓN ¡ Para la integración en dos cepas de Synechocystis sp. PCC 6803, se cultivaron células en BG11-A (amortiguadas ya sea con HEPES a pH 8.0 o CHES a pH 9.0) a un OD730 de aproximadamente 0.4, precipitaron mediante centrifugación y se volvieron a suspender en un medio fresco a un OD73o de 2.5. Se I observo un crecimiento mejorado cuando se amortigua con CHES a pH 9.0, pero cuando se complementó el medio con compuestos sensibles a bases como neomicina y 5-fluoruracilo, se utilizó HEPES a pH 8.0. Se realizó una transformación mediante la mezcla de 2-10 µg de ADN (linearizado con AflII y MluI) con, 500 µ? de esta suspensión celular, se incubó bajo luz en un tubo plástico transparente durante 3 horas, se mezcló y se incubó durante i otras 3 horas. Luego se aplicó la suspensión celular a placas de agar con BG11-A que contenían 0.3 % de tiosulfato de sodio.' Se incubaron las placas durante la noche bajo iluminación constante. Tras 24 horas de que las células fueran colocadas en las placas, se levantó el agar y se aplicó 50 % del antibiótico debajo del agar. El otro 50 % del antibiótico se aplicó luego de 36 horas. Las concentraciones finales de cloranfenicol , neomicina y 5-fluorouracilo fueron de 25, 25 y: 1 µg/ml, respectivamente. Los candidatos fueron colocados nuevamente en i I surcos en las placas que contienen el antibiótico y luego se analizaron por PCR por colonia. Se repitió este proceso hasta que se observó la segregación total. Tras una segregación completa, se volvió a colocar los candidatos en surcos, esta vez sin el antibiótico. Se volvió a analizar los candidatos por PCR por colonia para determinar que se mantuvo la segregación completa. ! j Se analizó la integración por PCR con oligonucleótidos fuera de la región de recombinación. ¡Se analizó la integración en el locus upp con los oligonucleótidos Sspuppintscrn-F (SEQ ID NO: 283) y Sspuppintscrn-R (SEQ ID NO: 284) . El upp de tipo salvaje, tal como se encontró en la cepa LYB476, proporcionó un producto de 0.89 kbp . La integración adecuada con pLybAL81 (SEQ D NO: 206), pLybEA8 (SEQ ID NO: 238), pLybEAlO (SEQ ID NO: 240), pLybAL84 (SEQ ID NO: 244) y pLybAL86 (SEQ ID NO: 246) proporcionó productos de 3.4, 2.0, 4.5, 2.0 y 4.5 kbp, respectivamente. Se analizó la integración en el locus de invertasa (lim 17) con los oligonucleótidos Sspinvdelscreen-F (SEQ ID NO: 153) y Sspinvdelscreen-R (SEQ IDNO: ¡ 154). La amplificación del locus de invertasa de la cepa LYB476 proporcionó un producto de 2.6 kbp. La integración adecuada con pLybAL91 (SEQ ID NO: 258) proporcionó un producto de 5¡.3 kbp. Se analizó la integración en el locus de exopolisacáridos con los oligonucleótidos EPSKOscreen-F (SEQ ID NO: 167) y EPS Oscreen-R (SEQ ID NO: 168). La amplificación del locus de exopol.isaqáridos de la cepa LYB476 proporcionó un producto de 3.2 kbp. La integración adecuada con pLybAL98 (SEQ D NO: 265) proporcionó un producto de 5.6 kbp. Se analizó la integración en el' locus sps con los oligonucleótidos Ssp6803spsscreen-F (SEQ ID NO: 285) y Ssp6803spsscreen-R (SEQ ID NO: 286) . El' sps de tipo salvaje, tal I como se encontró en la cepa LYB476, proporcionó un producto de 4.0 kbp. La integración adecuada con los plásmidos pLybAL106 (SEQ D NO: 272) y pLybAL107 (SEQ ID NO: 273) proporcionó productos de 5.6 kbp y 5.4 kbp, respectivamente.

Se linearizaron los plásmidos pLybAL106 y pLybAL107, y se transformaron en la cepa LYB476 para proporcionar LYB509 y LYB510, respectivamente. Se linearizó el plásmido pLybAL98 y se transformó en LYB509 y LYB510 para proporcionar LYB511 y LYB512, respectivamente.

Integración de asf en el locus upp Se intentó integrar asf en el locus upp de Synechocystis sp. PCC 6803 con pLybAL81, pero no se t!uvo éxito. Se linearizó el plásmido pLybAL81 (SEQ D NO: 206) con AflII y MJuI, se transformó en LYB476 y luego se seleccionaron i transformantes en las placas BG11-A que contenían 1 ptj/ml de 5-fluorouracilo . Se analizaron los candidatos mediante amplificación por PCR a partir de su ADN genómicó con los oligonucleótidos Sspuppintscrn-F (SEQ ID NO: ' 283) y Sspuppintscrn-R (SEQ ID NO: 284) . Una integración adecuada proporcionó un producto de PCR de 3.4 kbp, en lugar de uno del i tipo salvaje de 0.89 kbp. Los productos de PCR de la amplificación del ADN genómico de los candidatos resistentes a 5-fluorouracilo obtenidos fueron del tamaño de ADN de tipo salvaje. Estos candidatos pueden resultar de la i selección espontánea de mutantes resistentes a 5-fluorouracilo, ya sea en el locus upp u otro locus, en lugar de la integración de asf. Sin embargo, no fueron caracterizados. j Se decidió seleccionar para la integración de asf en el locus upp mediante cointegración de un marcador ¡ resistente a antibióticos con los plásmidos pLybEA8 (SEQ ID NO: 238) y pLybEAlO (SEQ ID NO: 240) . El plásmido pLybEA8 contiene solo el marcador resistente al cloranfenicol, mientras qué pLybEAlO también contiene el gen asf transcripto del fragmento de promotor rubisco de Nostoc PCC 7120 encontrado en el plásmido pLybDB4 (SEQ ID NO: 190) . Las colonias se obtuvieron! solamente por transformación de LYB476 con pLybEA8 linearizado, el plásmido sin el gen asf. El locus upp fue analizado por PCR con I los cebadores sspuppintscrn-F (SEQ ID NO: 283) y sspuppintscrn-R (SEQ ID NO: 284). Una integración adecuada proporcionaría un fragmento de ADN de 2.0 kbp, en lugar de uno de 0.89 kbp de tipo i ¦ salvaje. Se detectaron tanto los fragmentos de tipo salvaje como los integrantes, lo que indica una segregación incompleta. La colocación repetida en surcos con una selección de antibióticos i no produjo la segregación completa. No se obtuvieron colonias para las transformaciones de pLybEAlO, el plásmido que contiene asf. ; Para asegurar que la expresión apropiada del marcador resistente al cloranfenicol no constituyera un problema para obtener la integración de asf, se revirtió la orientación del marcador de plásmidos pLybEA8 y pLybEAlO en pLybA¿84 (SEQ ID NO: 244) y pLybAL86 (SEQ ID NO: 246), respectivamente. Se especuló que la fuerte expresión de asf podría resultar en una disminución de la expresión del gen cat convergente 'posterior. Sin embargo, se obtuvieron resultados similares.

' Integración de asf en los loci de invertasa y exopolisacáridos i La integración del locus upp fue dejada¡de lado a favor de la integración en los loci de invertasa y exopolisacáridos, de la cual se sabe por otros trabajos que la segregación completa de las eliminaciones de estos genes no es I problemática. Se transformó LYB476 con pLybAL91 linearizado (SEQ ID NO: 258) y pLybAL98 (SEQ ID NO: 265) para integrar ¡el gen asf en el locus de invertasa (liml7) en el cromosoma y el locus de exopolisacáridos ubicado en el plásmido grande p'SYSM. Los procedimientos de integración proporcionaron colonias muy pequeñas que comenzaron a aparecer, pero que, sin embargo, murieron rápidamente. I Integración de asf en los loci de invertasa y exopolisacáridos en huéspedes modificados 1 Se sospechó que la carencia de una integración exitosa seria el resultado de la producción de sacarosa mediante ASF, que se expresa aun cuando se cultiva en un ' medio que contiene nitrato. Los resultados previos con el plásmido pLybDB4 (SEQ ID NO: 190) mostraron que la expresión no se había suspendido por completo en condiciones de no inducción. Esto condujo a esfuerzos para reducir la toxicidad de la sacarosa (lo cual probablemente tenga por resultado un desequilibrio osmótico severo) ya sea mediante la reducción del nivel ba¡sal de la expresión de asf (adición de exceso de NtcA y NtcB) o . . . . . I degradación de la sacarosa, que causa toxicidad (adición de la actividad de la invertasa) . Los genes que codifican estas proteínas fueron colocados detrás del promotor de Synechqcoccus elongatus PCC 7942 nirA, que es inducido durante el crecimiento con nitrato, pero inactivado durante el crecimiento con amoníaco. Se utilizaron los plásmidos pLybAL106 (SEQ i'D NO: 272) y pLybAL107 (SEQ ID NO: 273) para integrar estas construcciones en el locus sps, lo que condujo a las cepas LYB509 y LYB510. Estas cepas fueron construidas sin dificultad alguna. j La integración de asf en el locus de invertasa de las cepas LYB509 y LYB510 con el plásmido pLybAL91 ($EQ ID NO: 258) siguió sin tener éxito. Sin embargo, la integración de asf ¡ en el locus de exopolisacáridos en estas cepas con el plásmido pLybAL98 (SEQ ID NO: 265) proporcionó LYB511 y- LYB512, •respectivamente.

De acuerdo con datos previos de LYB476. que porta el plásmido pLybDB4 (SEQ ID NO: 190), el cual mostró una producción de sacarosa incrementada en respuesta a la inducción con urea. Las células inducidas con urea secretaron aproximadamente 3 veces más sacarosa que las células cultivadas en nitrato. Nuestros resultados indican que el integrante LYB511 asf también secreta sacarosa en respuesta a la inducción con urea. LYB511 mostró una disminución de 4-5 veces en la secreción de sacarosa en respuesta a la urea en comparación con el nitrato. Resulta interesante que LYB511 tratado con urea secretó 4 veces más sacarosa que LYB476 que porta pLybDB4 tratado con urea. Adicionalmente, LYB511 tratado con nitrato secretó 3 veces más sacarosa que LYB476 que porta pLybDB4 tratado con nitrato. Estos resultados indicaron que el integrante asf produce más sacarosa en total en comparación con la expresión de asf exógeno del plásmido. La cantidad de sacarosa obtenida de los Usados de células fue similar entre todas las muestras. Estos resultados indican que las células solo pueden tolerar una concentración interna finita de sacarosa antes de la secreción.: De estos resultados del ensayo de sacarosa se infiere también la expresión endógena estable del gen asf.

La cepa LYB512 no muestra producción de sacarosa incrementada en respuesta la urea. El control regulador de nitrógeno de la expresión de invertasa adicional debe ser permeable o la invertasa debe ser muy estable en el .correr del tiempo.

EJEMPLO 10: PRODUCCIÓN DE SACAROSA REGULADA POR NITRÓGENO INTEGRADO EN UN FOTOBIORBEACTOR EN ESTADO LÍQUIDO Se cultivó la cepa LYB511 en un medio de cultivo de agar BG11 y se transfirieron colonias individuales ja 50 mi de medio de cultivo BG11 liguido y se agitó a 250 RP a 30 °C bajo 50 microeinsteins de luz blanca hasta que se determinó que el cultivo entró en la fase de crecimiento logarítmica mediante medidas de densidad óptica a 730 nm (nominalmente 3-4 días) . Se transfirió el cultivo en fase logarítmica asépticamente en 500 mi de caldo de cultivo BG11 agitado que se mantuvo a 30 °C, se aireó con 1 volumen de aire filtrado por minuto bajo 150 microeinsteins de luz blanca fluorescente. Una vez que el cultivo alcanzó una fase de crecimiento logarítmica j media, se cultivaron asépticamente las células mediante centrifugación y se lavaron una vez con agua desionizada. Se dispersaron las células precipitadasprecipitadas en 10 mi de agua desionizada y se introdujeron 5 mi en 500 mi de caldo de cultivo BG11 complementado con nitrato de sodio 20 mM o urea 10 mM. Se cultivaron los cultivos a 30 °C con agitación y aireación a 1 volumen de aire por minuto bajo 150 microeinsteins de luz blanca fluorescente. Se retiraron 10 mi de caldo de cultivo diariamente i durante el transcurso de 4 días y se midieron el pH, la densidad de biomasa y la concentración de sacarosa. i Los resultados mostraron que, para el cultivo que incluye nitrato de sodio como fuente de nitrógeno, la acumulación de biomasa durante un ensayo de 4 días aumentó 2.25 veces con un pico de concentración de sacarosa de 9.3 micromolar. Para el cultivo que incluye urea como .fuente de i nitrógeno, la acumulación de biomasa durante un ensayó de 4 días aumentó 1.2 veces con un pico de concentración de sacarosa de 83 micromolar. En ambos cultivos el pH aumentó lentamente de 7 a 7.8. i i EJEMPLO 11: PRODUCCIÓN DE SACAROSA REGULADA CON NITRÓGENO PLÁSMIDO EN UN FOTOBIORREACTOR EN ESTADO SÓLIDO Se cultivó la cepa LYB476 que porta el plásmido pLybDB4 en un medio de cultivo de agar- BG11 y se transfirieron i colonias individuales a 50 mi de medio de cultivo BGll! liquido y se agitó a 250 RPM a 30 °C bajo 50 microeinsteins de luz blanca hasta que se determinó que el cultivo entró en la fase de crecimiento logarítmica mediante medidas de densidad óptica a 730 nm ( nominalmente , 3-4 días). Se transfirió el cultivo en fase logarítmica asépticamente a 3000 mi de caldo de cultivo BGll agitado que se mantuvo a 30 °C, se aereó con 1 volumen de aire filtrado por minuto bajo 150 microeinsteins de luz blanca fluorescente .

Una vez que el cultivo alcanzó und fase de crecimiento logarítmica media, se transfirieron asépticamente las células a una cuba estéril. Se sumergió una; tela del i fotobiorreactor en estado sólido (tal como se describe en la solicitud de patente estadounidense 20090181434) que medía 6 pulgadas en la cuba y se permitió que incubara durant'e la noche en la oscuridad a temperatura ambiente. Se instaló de forma aséptica la tela en el fotobiorreactor en estado sólido con cañerías de gas y medio de cultivo unidas. La fuente de gas fue filtrada con aire del ambiente y se introdujo a 0.1 -¡litros por minuto. Se introdujo el medio de cultivo en el reactor a intervalos regulares de 4 horas con 15 minutos de bombeo activo i a una velocidad de flujo de 0.2 mi por minuto. Se cultivaron los cultivos a 30 °C bajo 150 microeinsteins de luz blanca fluorescente. El medio de cultivo inicial consistió en BG11 con nitrato de sodio 20 mM como fuente de nitrógeno el cual se cambió luego de 5 días por BG11 que contenía urea 10 mM como fuente de nitrógeno y se continuó la fermentación durante el transcurso de 7 días. Se retiraron 10 mi de caldo de cultivo I diariamente durante el transcurso del ensayo y se midieron el pH y la concentración de sacarosa. Durante el cultivo el pH permaneció a 7.2 en el efluente recolectado. ; Los resultados mostraron que el pico de producción de sacarosa durante la alimentación en la fase de nitrato proporcionó 0.16 milimoles a una concentración de sacarosa de 8.8 mM. El pico de producción de sacarosa durante la i alimentación en la fase de urea proporcionó 0.94 milimoles a una concentración de sacarosa de 52 mM.

EJEMPLO 12 : PRODUCCIÓN DE SACAROSA REGULADA POR NITRÓGENO INTEGRADO EN UN FOTOBIORREACTOR EN ESTADO SÓLIDO I Se cultivó la. cepa LYB511 en un medio ¡de cultivo de agar BG11 y se transfirieron colonias individuales a 50 mi de medio de cultivo BG11 liquido y se agitó a 250 RPM a 30 PC bajo í 50 microeinsteins de luz blanca hasta que se determinó que el cultivo entró en la fase de crecimiento logarítmica mediante j medidas de densidad óptica a 730 nm (nominalmente, 3-4; días) . Se transfirió el cultivo en fase logarítmica asépticamente a 3000 mi de caldo de cultivo BG11 agitado que se mantuvo a 30 °C, se aireó con 1 volumen de aire filtrado por minutó bajo 150 microeinsteins de luz blanca fluorescente. Una vez que el cultivo alcanzó una fase de crecimiento logarítmica ! media, se transfirieron asépticamente las células a una cuba estéril. Se sumergió una tela del fotobiorreactor en estado sólido, (tal como se describe en la solicitud de patente estadounidense i 20090181434) que medía 6 pulgadas por 6 pulgadas en la! cuba y se permitió que incubara durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente. Se instaló de forma aséptica la 'tela en el fotobiorreactor en estado sólido con cañerías de gas y medio de cultivo unidas. La fuente de gas fue filtrada con; aire del ambiente y se introdujo a 0.1 litros por minuto. Se¦ introdujo medio de cultivo en el reactor a intervalos regulares de 4 horas con 15 minutos de bombeo activo a una velocidad de flujo de 0.2 mi por minuto. Se cultivaron los cultivos a 30 °C bajo 150 microeinsteins de luz blanca fluorescente. El medio de cultivo inicial consistió en BG11 con nitrato de sodio 20 m como fuente de nitrógeno la cual se cambió luego de 5 días por BG11 que contenia urea 10 mM como fuente de nitrógeno y se continuó la fermentación durante el transcurso de 7 días. Se retiraron 10 mi í de caldo de cultivo diariamente durante el transcurso ¡del ensayo y se midieron el pH y la concentración de sacarosa. Durante el cultivo el pH permaneció a 7.2 en el efluente recolectado.

Los resultados mostraron que el pico de ¡producción de sacarosa durante la alimentación en la fase de nitrato proporcionó 0.32 milimoles a una concentración de sacarosa de j 18 mM. El pico de producción de sacarosa durante la alimentación en la fase de urea proporcionó 1.6 milimoles a una concentración de sacarosa de 91 mM. : REFERENCIAS Herrero, A, Muro-Pastor, AM y E Flores. 2001.

Nitrogen control of cyanobacteria. J Bact. 183: Muro-Pastor, MI, Reyes, JC y FJ Florencio. 2005. Ammonium assimilation in cyanobacteria. Photosynth Res. 83:135-150. j Emlyn-Jones, D, Price, GD y TJ Andrews. 2003.

Nitrogen-regulated hypermutator strain of Synechococcüs sp. For use in in vivo artificial evolution. Appl Environ Microbiol. 69:6427-6433.

Kamei, A, Yuasa, T, Orikawa, K, Geng', XX y M Ikeuchi. 2001. A eukaryotic type protein kinase, SpkS, is required for normal motility of the unicellular cyanobaoterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. J Bact. 183 : 1505-15Í0.

Panoff, J-M, Priem, B, Morvan, H y F Joset . 1988. Sulphated exopolysaccharides produced by two unicellul¡ar strains l ; of cyanobacteria, Synechocystis PCC 6803 and 6)714. Arch Microbiol. 150:558-563.

Panoff, J-M., Joset, F. 1989, Selection! by anion-exchange chromatography of exopolysaccharide mutants of the cyanobacterium Synechocystis PCC 6803. Appl . Environ. Microbiol. 55, 1452-1456. ! Laurentin, A., Edwards, C.A., 2003. A microtiter modification of the anthrone-sulfuric acid colorimetric assay for glucose-based carbohydrates . Anal. Biochem. 315, 143-145.

Kaneko T et ál . 2001 Complete genomic sjequence of I the filamentous nitrogen-fixing cyanobacterium Ana'baeña sp. strain PCC 7120. DNA Res 8:205-213.

Nierzwicki-Bauer SA, Curtís SE y Haselkórn R. 1984. Cotranscription of genes encoding the small and large subunits of ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase in the cyanobacterium Anabaena 7120. Proc Nati Acad Sci EUA. 81:5961- 5965.

Ramasubramanian TS, Wei T-F y Golden JW.: 1994. Two i Anabaena sp. strain PCC 7120 DNA-binding factors interact with vegetative cell- and heterocyst-specific genes. J Ba cteriol 176:1214-1223.

I i Vázquez-Bermúdez MF, Flores E y Herrero A. 2002. Analysis of binding sites for the nitrogen-control transcription factor NtcA in the promoters of Synechococcus ¡ nitrogen-regulated genes. Biochemica et Biophysica Acta 1578:95^-98. i j

Claims (18)

R E I V I N D I C A C I O N E S

1. Un sistema de expresión sensible al nitrógeno i que comprende: j una región de factor de transcripción qué comprende un sitio de aglutinamiento NtcA; y una región promotora de núcleo que comprende un promotor RuBisCo o una variante o un fragmento funcional del mismo en donde la región promotora de núcleo o está enlazada operablemente a la región de factor de transcripción .

2. El sistema de expresión tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado además porque comprende : I una molécula de ácido nucleico transcribióle y una i : molécula de ácido nucleico de terminación de transcripción 3' ; en donde, i la región promotora de núcleo estáj enlazada operablemente a la molécula de ácido nucleico transcribible ; y I la molécula de ácido nucleico transcribióle está enlazada operablemente a la molécula de ácido nucleico de transmisión de transcripción 3' .

3. El sistema de expresión tal como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 1-2, caracterizado porque la región de factor de transcripción comprende por lo menos uno de: una secuencia de consenso GTANnC; una secuencia de i consenso GTAN8TAC; una secuencia de consenso GTANgTGC; una secuencia de consenso GTNioAC una secuencia de consenso TGTNgACA; una secuencia de consenso TGTNi0ACA; o una caja TAN3T/A.

4. El sistema de reivindica en una cualquiera de las porque la región promotora de núcleo comprende un sitio de aglutinamiento de polimerasa de un promotor RuBisCo.

5. El sistema de expresión tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 1-4, caracterizado porque la región promotora de núcleo comprende por lo menos alrededor de 70 por ciento de identidad de secuencia para una secuencia promotora de RuBisCo (rbcLS) de Nostoc sp. PCC 7120; Synechocystis sp. PCC 6803; o Anabaena PCC 7120, o un fragmento funcional del mismo.

6. El sistema de expresión tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 1-5, caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico aislada teniendo una actividad promotora y por lo menos alrededor de una identidad de secuencia de 70 por ciento a una cualquiera de SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, o SEQ ID NO: 234.

7. El sistema de expresión tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 1-6, caracterizado porque compren de una molécula de ácido nucleico aislada teniendo actividad promotora y (a) por lo menos 95 bases contiguas de uno cualquiera de SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, o SEQ ID NO: 234; o ¡ (b) un fragmento funcional de una cualquiera de uno cualquiera de SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, o SEQ ID NO: 234.

8. El sistema de expresión tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 1-7, caracterizado porque comprende: j (a) una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido NtcA o un polipéptido NtcB, en donde el polipéptido NtcA o el polipéptido NtcB está j enlazado operablemente a la región promotora de núcleo del constructor; o (b) una secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO: 279, codificando un polipéptido NtcA y un polipéptido NtcB, enlazado operablemente a la región promotora de núcleo.

9. El sistema de expresión tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 1-8, caracterizado porque comprende : una molécula de ácido nucleico aislada de posiciones de nucleótido 177 a 836 o SEC ID NO: 234, o por lo menos alrededor de 70 por ciento de la identidad de! secuencia para la misma teniendo una actividad promotora; j ' i una molécula de ácido nucleico aislada de posiciones de nucleótido 1 a 352 de la SEC ID NO: 234, o por lo menos alrededor de 70 por ciento de la identidad de: secuencia para la misma teniendo una actividad promotora; o ; i una molécula de ácido nucleico aislado de las posiciones de nucleótido 177 a 352 de la SEC ID NO: 234, o por lo menos alrededor de 70 por ciento de la identidad de secuencia para la misma teniendo una actividad promotora

10. El sistema de expresión tal y como se i reivindica en una cualquiera de las cláusulas 1-9, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico transcribible codifica un polipéptido teniendo: actividad de sintasa de fosfato sucrosa, actividad de fosfatase fosfato sucrosa; actividad de fosfatasa fosfato sucrosa y sintasa fosfato sucrosa; actividad de sintasa fosfato trehalosa; actividad de fosfatasa fosfato trehalosa; actividad de sintasa fosfato glucosilglicerol ; actividad de fosfatasa fosfato glucosilglicerol; actividad de sintJsa fosfato manosilfructosa; o actividad de fosfatasa fosfato manosilf uctosa .

11. El sistema de expresión tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 1-9, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico transcribible compjrende: I SEQ. ID NO: 1, o por lo menos 80 por i ciento de identidad de secuencia para el mismo y codificando un polipéptido teniendo una actividad de sintasa fosfato sucrosa y, fosfatasa fosfato sucrosa; o una secuencia de ácido nucleico codificando un i polipéptido de SEC ID NO: 2, o un polipéptido por lo menos 80 por ciento similar al mismo teniendo una actividad de; fosfatasa fosfato sucrosa y sintasa fosfato sucrosa.

12. Un método para expresar una molécula de ácido nucleico transcribible en una célula anfitriona que comprende: transformar establemente una célula anfitriona con un sistema de expresión de una cualquiera de las cláusulas 1-11; y cultivar la célula anfitriona, o la progenia de la misma comprendiendo el sistema de expresión bajo condiciones por las que la molécula de ácido nucleico transcribible es 'expresada; en donde la expresión de la moléculaj de ácido nucleico transcribible es reprimida cuando el nitrato es una fuente de nitrógeno predominante y la molécula de ácido nucleico transcribible es expresada cuando la urea o el amoniaco es la fuente de nitrógeno predominante.

13. El método tal y como se reivindica en la cláusula 12, caracterizado porque: la tasa de crecimiento del organismo[ anfitrión transformado no es de más de alrededor de 20 por ciento más bajo que del organismo anfitrión no transformado bajo las mismas, condiciones o condiciones esencialmente similares; o j la tasa de crecimiento del organismo, anfitrión transformado es más de alrededor de un 5 por ciento jde tasa de crecimiento superior (por ejemplo, más de alrededor de 10 por ciento, 15 por ciento, o 20 por ciento de la tasa de crecimiento superior) que un organismo anfitrión transformado' con una construcción no regulada cultivada bajo las mismas esencialmente similares condiciones.

14. El método tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 12-13, caracterizado porque: (a) la célula anfitriona expresa endógenamente un polipéptido NtcA o un polipéptido NtcB bajo un sistema 'de control de nitrógeno; (b) la célula anfitriona es diseñada para expresar un polipéptido NtcA o un polipéptido NtcB bajo un sistema de control de nitrógeno; j (c) el sistema de expresión comprende una secuencia de polinucleótido codificando un polipéptido. NtcA o un polipéptido NtcB y el polipéptido NtcA o el polipéptido NtcB está enlazado operablemente a la región promotora de núcleo de la construcción. i

15. El método tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 12-14, caracterizado porqué la célula anfitrión es un microorganismo fotosintético . I

16. El método tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 12-15, caracterizado anfitrión es un microorganismo fotosintético grupo que consiste de: Spirulina máximum, Spirulina '.platensis, Dunaliella salina, Botrycoccus braunii, Chlorella vulgaris, Chlorella pyrenoidosa, Serenastrum capricomutum, Scenedesmus auadricauda, Porphyridium cruentum, Scenedesmus acutus, Dunaliella sp., Scenedesmus obliquus, Anabaenopsis, Aulosira, Cylindrospermum, Synechoccus sp., Synechocystis ¡ sp., y Tolypothrix . j

17. Un cásete de expresión que comprende: (a) una región de factor de transcripción que comprende un sitio de aglutinamiento NtcA; (b) una región promotora de núcleo comprende un promotor de RuBisCo o una variante o de un fragmento funcional del mismo; (c) una molécula de ácido nucleico transcribióle; (d) una molécula de ácido nucleico de terminación de transcripción 3' ; y i (e) opcionalmente, una secuencia de polinucleótido codificando un polipéptido NtcA o un polipéptido NtcB; en donde, la región promotora de núcleo comprende o está enlazada operablemente a la región de factor de transcripción; la región de promotor de núcleo está enlazada ¦ uno a otro de manera que la expresión del cásete de expresión en el organismo anfitrión resulta en la producción de una secuencia de polipéptido codificada por la molécula de ácido nucleico transcribible; y ¡ el elemento (e) cuando está de manera que la expresión del cásete organismo anfitrión resulta en la producción del polipéptido NtcA o del polipéptido NtcB.

18. Una célula anfitriona transgéni que comprende el sistema de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11; producida por el método de una cualquiera de las cláusulas 12-16, o la progenia del mismo comprendiendo el sistema de expresión; o 10 comprendiendo el cásete de expresión de la cláusula 17; en donde, la expresión de la secuencia de polipéptido codificada por la molécula de ácido nucleico transcribióles reprimido en la presencia de nitrato; y la expresión de la secuencia de pjolipéptido codificada por la molécula de ácido nucleico transcribióle es inducida en la presencia de urea o amoniaco. i R E S U M E N I I La presente divulgación se refiere a composiciones y métodos para la regulación de la expresión sensible al i nitrógeno de una molécula de ácido nucleico factible de ser transcripta. Un aspecto proporciona un sistema de j expresión sensible al nitrógeno que incluye . una región de factor de transcripción que comprende un sitio de unión a N(tcA y una región de promotor mínimo que comprende un promotor RuBisCo o un fragmento funcional o variante de él. Otro aspecto proporciona un método para transformar una célula huésped con un sistema de i expresión. También se proporcionan casetes de expresión, células huésped transformadas y kits.