CN104651388A

CN104651388A - 一种高效合成乙烯的构建体及其构建方法和应用

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Publication number: CN104651388A
Application number: CN201310595856.3A
Authority: CN
Inventors: 吕雪峰; 解晓慢; 朱涛
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2013-11-21
Filing date: 2013-11-21
Publication date: 2015-05-27
Anticipated expiration: 2033-11-21
Also published as: CN104651388B

Abstract

本发明涉及基因工程与生物合成领域，具体而言是一种高效合成乙烯的构建体及其构建方法和应用。构建体包含具有活性的启动子，以及该启动子控制的乙烯合成酶基因（efe）。将所述工程菌利用太阳能固定二氧化碳合成乙烯。本发明通过在蓝细菌细胞内构建一条合成乙烯的途径，实现在光合微生物蓝细菌细胞内利用太阳能来固定二氧化碳并合成乙烯，其中，合成乙烯的能量来自于太阳能，碳源来自于二氧化碳。因此，利用本发明的方法制备生物乙烯不会受到石油短缺的制约，并且使用这种生物乙烯不会增加碳排放。

Description

一种高效合成乙烯的构建体及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程与生物合成领域，具体而言是一种高效合成乙烯的构建体及其构建方法和应用。

背景技术

能源危机与环境恶化是人类可持续发展所面临的核心问题。以石油、煤炭和天然气为代表的化石能源的大量消耗，必将导致不可再生能源的枯竭以及由二氧化碳释放所引起的气候变化，而以石油为主要原料的乙烯工业也将面临巨大挑战。乙烯是世界上产量最大的化学产品之一，被大量用于聚乙烯、乙苯、聚苯乙烯以及乙醇等的生产，是一种很重要的有机化工基本原料。因此，寻找一条可持续发展之路来解决石油资源匮乏对乙烯工业的负面影响就成为学术界及工业界关注的重要课题。

生物乙烯主要来源于植物、微生物和某些藻类。目前已经鉴定了至少三种乙烯合成途径：（1）存在于植物体内的1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)途径(MET-SAM-ACC-C₂H₄)(Yang and Hoffman,1984);（2）存在于微生物体内的2-酮-4-甲基硫代丁酸(KMBA)途径(MET-KMBA-C₂H₄)(Kepczynska et al.,2003)；（3）主要存在于植物致病菌（如丁香假单胞菌）中的α-酮戊二酸(KGA)途径，该途径中的关键酶是乙烯合成酶(Ethylene forming enzyme,EFE)，由efe基因编码，它可以直接将三羧酸（TCA）循环中的α-酮戊二酸(KGA)转化为乙烯(Fukuda et al.,1992a;Fukuda et al.,1992b)。在这三种途径中，基于α-酮戊二酸的乙烯合成途径备受关注，很多研究人员致力于通过基因工程及代谢途径改造的方法将此途径引入到其他微生物体内合成乙烯。

最早用于乙烯生物体内合成研究的微生物体系主要是以大肠杆菌、霉菌和酿酒酵母为代表的异养微生物。Ishihara等人通过基因工程手段将乙烯合成酶基因efe导入大肠杆菌BL21（DE3）中成功实现了EFE的体外表达，并合成了乙烯(Ishiharaet al.,1995)；以绿色木霉（Trichoderma viride）作为宿主菌，Tao等人将efe基因成功整合到其染色体上，并证实纤维素可以有效诱导乙烯在该重组丝状真菌中的合成(Tao et al.,2008)；此外，还有在酿酒酵母中进行乙烯生物合成的相关报道，该研究将乙烯作为葡萄糖发酵的副产物释放出来（I.Pirkov et al.,2008）。

与以大肠杆菌、霉菌和酿酒酵母为代表的异养微生物相比，蓝细菌作为新一代能源微生物系统正受到越来越多的关注(Angermayr et al.,2009)。蓝细菌中乙烯合成的相关研究最早是在模式藻株聚球藻PCC7942中开展的，通过引入基于α-酮戊二酸的乙烯合成途径，日本的Takahira Ogawa实验室经过系列研究，最终得到了451nl/ml/h/OD₇₃₀的产量(Fukuda et al.,1994;Sakai et al.,1997;Takahamaet al.,2003)。但是该实验的研究发现，efe基因在聚球藻PCC7942中不稳定，基因自身携带的多个突变热点（hot spot）导致所获得的基因工程菌株不能稳定合成乙烯；Ungerer等则以集胞藻（Synechocystis sp.）PCC6803作为宿主菌，通过基因密码子优化、提高efe基因拷贝数和工程菌株培养条件优化等操作使乙烯产量达到5650μL/L/h(Ungerer et al.,2012)，该产量明显高于早期其他异养微生物中的相关报道，这表明利用基因工程蓝细菌合成乙烯具有很大研发应用潜力。蓝细菌是一类能够进行植物型产氧光合作用的原核微生物，它作为新一代能源微生物系统具有以下优势：（1）蓝细菌能够吸收太阳能并固定二氧化碳作为碳源进行自养生长；（2）蓝细菌是一类古老的微生物，已在地球上存在了几十亿年，他们对环境适应能力强，生长迅速；（3）蓝细菌遗传操作方便，遗传背景清晰，目前已经完成了120余株藻株的全基因组测序工作，这使得利用基因工程手段改造蓝细菌非常方便。

集胞藻PCC6803是单细胞蓝细菌的代表物种，是一种淡水藻，其全基因组测序于1996年完成，是最早完成全基因组测序的光合原核微生物，也是目前研究最多的蓝细菌之一；聚球藻（Synechococcus sp.）PCC7002是一种海水藻，生长迅速。集胞藻PCC6803和聚球藻PCC7002都具备成熟的遗传操作体系，可以方便地进行外源基因的整合和内源基因的敲除。

蓝细菌因缺乏α-酮戊二酸脱氢酶系（OGDH），其三羧酸循环多年来一直被认为是不完整的。2011年science杂志报道了一项最新的研究成果，证实在聚球藻PCC7002中存在α-酮戊二酸脱羧酶（OGDC）和琥珀酸半醛脱氢酶（SSADH）,分别由A2770和A2771两个基因编码，这两个酶可以催化α-酮戊二酸经由琥珀酸半醛转化为琥珀酸，这一发现结束了40多年来人们对蓝细菌三羧酸循环的认识，为蓝细菌TCA循环相关的基础研究和应用研究提供了新的认识(Zhang and Bryant,2011)。

发明内容

本发明目的在于提供一种高效合成乙烯的构建体及其构建方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种高效合成乙烯的构建体，构建体包含具有活性的启动子，以及该启动子控制的乙烯合成酶基因（efe）。

所述构建还包含有处于所述启动子上游的用于筛选蓝细菌转化体的标记基因。

所述具有活性的启动子选自cpcB启动子、rbcL启动子、6803psbA2启动子、ci启动子、7942psbA2启动子、7942psbA1启动子、psbD启动子、glnA启动子或groESL启动子。

所述乙烯合成酶基因（efe）选自来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种的efe基因、来源于丁香假单胞菌大豆致病变种的efe基因、来源于丁香假单胞菌菜豆致病变种的efe基因、来源于丁香假单胞菌麻致病变种的efe基因或来源于丁香假单胞菌豌豆致病变种的efe基因。

高效合成乙烯的工程菌，将所述构建体通过同源重组整合入集胞藻PCC6803的slr0168基因、sll1981基因和/或slr0370基因的内部；或，将所述构建体通过同源重组整合入集胞藻PCC7002的A2770和/或A2771基因的内部。

一种高效合成乙烯的工程菌的应用，所述工程菌在合成乙烯中的应用。

将所述工程菌在利用太阳能固定二氧化碳合成乙烯。

本发明以集胞藻PCC6803作为宿主菌构建一系列不同启动子驱动乙烯合成酶基因表达的突变株，并从中筛选到可以高效驱动乙烯合成酶基因合成乙烯的启动子；而后将筛选得到启动子驱动乙烯合成酶基因在在集胞藻PCC6803和聚球藻PCC7002的表达，并进一步耦合乙烯生物合成途径与TCA循环，在集胞藻PCC6803的sll1981、slr0370位点，以及聚球藻PCC7002的A2770、A2771位点多拷贝表达乙烯合成酶基因，使TCA循环中间物α-酮戊二酸在乙烯合成酶催化下，合成乙烯的同时完成到琥珀酸的转化，从而获得可以高效合成乙烯的基因工程蓝细菌。

利用上述获得的工程菌在光合微生物蓝细菌体内利用太阳能固定二氧化碳合成乙烯，合成乙烯的能量来自于太阳能，碳源来自于二氧化碳。因此，利用这一技术制备生物乙烯对缓解全球石油短缺对乙烯工业带来的负面影响具有重要意义，是可持续的生产方法。

进而利用上述光合微生物蓝细菌体内耦合乙烯生物合成途径与TCA循环，使TCA循环中间物α-酮戊二酸在乙烯合成酶催化下，合成乙烯的同时完成到琥珀酸的转化，从而获得乙烯。

蓝细菌合成乙烯的机制如下：在蓝细菌的三羧酸循环中，由α-酮戊二酸到琥珀酸的途径已被证实，即α-酮戊二酸在α-酮戊二酸脱羧酶（在聚球藻PCC7002中其编码基因为A2770基因，参见例如NCBI ID:CP000951.1；在集胞藻PCC6803中依据序列比对推测其编码基因为sll1981，例如参见NCBI ID:CP003265.1;）的催化下转化为琥珀酸半醛，琥珀酸半醛在琥珀酸半醛脱氢酶（;在聚球藻PCC7002中其编码基因为A2771基因，参见例如NCBI ID:CP000951.1，在集胞藻PCC6803中依据序列比对推测其编码基因为slr0370,例如参见NCBI ID:CP003265.1）的催化下转化为琥珀酸；野生型蓝细菌（例如集胞藻PCC6803和聚球藻PCC7002）基因组中无乙烯合成酶基因类似物，通过以不同启动子驱动乙烯合成酶基因（efe基因）在集胞藻PCC6803基因组中性位点slr0168中表达（例如使用基因工程方法），根据所合成的乙烯量可以筛选到一个高效驱动乙烯合成酶表达的启动子cpcB。此外，以cpcB启动子驱动乙烯合成酶基因在聚球藻PCC7002和集胞藻PCC6803中表达，通过改造三羧酸代谢途径（例如，通过在A2770和A2771位点表达乙烯合成酶基因，即表达乙烯合成酶的同时敲除A2770基因和A2771基因；通过在sll1981和slr0370位点表达乙烯合成酶基因，即表达乙烯合成酶的同时敲除sll1981基因和slr0370基因）和提高乙烯合成酶表达量（提高基因拷贝数），可以提高乙烯的产量。

所述乙烯合成酶基因例如但不限于：来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种的efe基因（例如参见NCBI ID:AB025277.1）;来源于丁香假单胞菌大豆致病变种的efe基因（例如参见NCBI ID:EF175870.1）；来源于丁香假单胞菌菜豆致病变种的efe基因（例如参见NCBI ID:D13182）；来源于丁香假单胞菌麻致病变种的efe基因（例如参见NCBI ID:AF101059.1）；来源于丁香假单胞菌豌豆致病变种的efe基因（例如参见NCBI ID:AF101061.1）。另一个优选的efe基因，具有如SEQ ID NO:1所示的序列。

所述具有活性的启动子包括但不限于，例如cpcB启动子、rbcL启动子、6803psbA2启动子、ci启动子、7942psbA2启动子、7942psbA1启动子、psbD启动子、glnA启动子和groESL启动子。优选为cpcB启动子。

所述用于筛选蓝细菌转化体的标记基因，例如卡那霉素抗性基因（NCBIID:NC_003239.1），氯霉素抗性基因（NCBI ID:NC_015291.1）和壮观霉素抗性基因（NCBI ID：L05082））。所述标记基因可以位于所述在蓝细菌中具有活性的启动子的上游或下游。

所述sll1981基因具有SEQ ID NO:18所示的序列。

所述基因slr0370的具有如SEQ ID NO:19所示的序列。

所述A2770基因具有SEQ ID NO:16所示的序列。

所述基因A2771的具有如SEQ ID NO:17所示的序列。

本发明的实施方案涉及在蓝细菌中合成并定量测定乙烯的方法，所述方法包括：

1）将上述构建体导入集胞藻PCC6803或聚球藻PCC7002。

2)培养步骤1）获得的蓝细菌。

3）取一定量的2）的培养物，放于密闭玻璃瓶中放置一定时间，根据乙烯标准曲线测定上空中的乙烯含量，可以得到培养物的乙烯合成速率。

提高乙烯合成酶基因的拷贝数和优化基因工程藻的培养条件。

相关术语

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、有机化学实验操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本发明中所使用的，“蓝细菌（Cyanobacterium）”是一类光合自养的原核微生物，其能够利用太阳能，固定二氧化碳。蓝细菌也称为蓝藻。在本发明中，“蓝细菌”和“蓝藻”可互换使用。

如本发明中所使用的，载体（vector）是指能够将DNA片段（例如，目的基因）插入其中从而允许将DNA（例如，目的基因）转移到受者细胞中的一种核酸运载工具。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的DNA片段在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。

如本发明中所使用的，乙烯合成酶（Ethylene-forming Enzyme）存在于一些植物致病细菌和真菌中，可以催化三羧酸循环的中间物α-酮戊二酸转化为乙烯，并伴随琥珀酸等的生成。编码乙烯合成酶的基因是本领域公知的，包括但不限于：来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种（Pseudomonas syringae pv.Sesami）的efe基因（例如参见NCBI ID:AB025277.1）;来源于丁香假单胞菌大豆致病变种（Pseudomonas syringae pv.Glycinea）的efe基因（例如参见NCBIID:EF175870.1）；来源于丁香假单胞菌菜豆致病变种（Pseudomonas syringae pv.Phaseolicola）的efe基因（例如参见NCBI ID:D13182）；来源于丁香假单胞菌麻致病变种（Pseudomonas syringae pv.Cannabina）的efe基因（例如参见NCBIID:AF101059.1）；来源于丁香假单胞菌豌豆致病变种（Pseudomonas syringae pv.pisi）的efe基因（例如参见NCBI ID:AF101061.1）。

如本发明中所使用的，α-酮戊二酸脱羧酶（2-oxoglutarate decarboxylase）是指能够催化三羧酸途径中的中间物α-酮戊二酸反应生成琥珀酸半醛的酶。编码α-酮戊二酸脱羧酶的基因及其类似物是本领域公知的，包括但不限于：来源于聚球藻PCC7002的A2770基因（例如参见NCBI ID:CP000951.1）；来源于蓝杆藻ATCC51142的cce_4227基因（例如参见NCBI ID:CP000806.1）；来源于蓝杆藻PCC8801的PCC8801_4168基因（例如参见NCBI ID:CP001287.1）；来源于集胞藻PCC6803的sll1981基因（例如参见NCBI ID:CP003265.1）；来源于蓝杆藻PCC7424的PCC7424_0688基因（例如参见NCBI ID:CP001291.1）；来源于鱼腥藻PCC7120的all3555基因（例如参见NCBI ID:BA000019.2）。

如本发明中所使用的，琥珀酸半醛脱氢酶（succinic semialdehydedehydrogenase）是指能够催化三羧酸途径中的中间物琥珀酸半醛反应生成琥珀酸的酶。编码琥珀酸半醛脱氢酶的基因及其类似物是本领域公知的，包括但不限于：来源于聚球藻PCC7002的A2771基因（例如参见NCBI ID:CP000951.1）；来源于蓝杆藻ATCC51142的cce_4228基因（例如参见NCBI ID:CP000806.1）；来源于蓝杆藻PCC8801的PCC8801_4169基因（例如参见NCBI ID:CP001287.1）；来源于集胞藻PCC6803的slr0370基因（例如参见NCBI ID:CP003265.1）；来源于蓝杆藻PCC7424的PCC7424_2737基因（例如参见NCBI ID:CP001291.1）；来源于鱼腥藻PCC7120的all3556基因（例如参见NCBI ID:BA000019.2）。

如本发明中所使用的，启动子（promoter）定义为能够被RNA聚合酶识别、结合并能启动转录的DNA序列。启动子是本领域技术人员公知的，包括但不限于本发明所使用的一系列启动子。

如本发明中所使用的，6803psbA2启动子（P_6803psbA2）是指集胞藻6803基因组中编码光系统II D1蛋白（Photosystem II D1protein）的三个基因之一的psbA2的启动子。光系统II D1蛋白是光系统II中的一个重要组分，其负责光系统II的电子传递。P_6803psbA2在蓝细菌中具有活性，本发明中对该启动子的光调控区域进行了改造，其例如可以具有如SEQ ID NO:7的序列。

如本发明中所使用的，7942psbA1启动子（P_7942psbA1）是指聚球藻PCC7942基因组中编码光系统II D1蛋白（Photosystem II D1protein）的三个基因中psbA1基因的启动子。P_7942psbA1在蓝细菌中具有活性，其例如可以具有如SEQ ID NO:8的序列。

如本发明中所使用的，7942psbA2启动子(P_7942psbA2)是指聚球藻PCC7942基因组中编码光系统II D1蛋白（Photosystem II D1protein）的三个基因之一的psbA2基因的启动子。光系统II D1蛋白是光系统II中的一个重要组分，其负责光系统II的电子传递。P_7942psbA2在蓝细菌中具有活性，其例如可以具有如SEQ ID NO:9的序列。

如本发明中所使用的，cpcB启动子(P_cpcB)是编码藻蓝蛋白基因（cpcB）的启动子，藻蓝蛋白在多种蓝细菌中为组成型表达，在蓝细菌基因工程研究中，藻蓝蛋白的启动子常被用来表达外源基因，以期获得高的表达量，其例如可以具有如SEQ IDNO:10的序列。

如本发明中所使用的，rbcL启动子（P_rbcL）是指集胞藻6803基因组中编码催化光合作用中1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase,Rubisco）的操纵子的启动子。P_rbcL在蓝细菌中具有活性，其例如可以具有如SEQ ID NO:11的序列。

如本发明中所使用的，ci启动子(P_ci)是指λ噬菌体编码温敏阻遏蛋白的基因ci的启动子。CI阻遏蛋白在控制噬菌体的溶源裂解途径中扮演着重要的角色。P_ci在蓝细菌中具有活性，其例如可以具有如SEQ ID NO:12的序列。

如本发明中所使用的，psbD启动子（P_psbD）是指集胞藻PCC6803基因组中编码光合系统II D2蛋白（Potosystem II D2protein）的基因psbD的启动子。P_psbD在蓝细菌中具有活性，其例如可以具有如SEQ ID NO:13的序列。

如本发明中所使用的，groESL启动子（P_groESL）是指热休克蛋白基因的启动子，当蓝细菌细胞突然暴露在高温等胁迫条件下，蓝细菌自身体内会有一种本能的反应，用于维持自我生理平衡，起主要作用的就是热休克蛋白家族，groESl操纵子是由groES和groEL两个分子伴侣组成的，对蛋白产物后期的正确折叠具有重要作用。P_groESL在蓝细菌中具有活性，其例如可以具有如SEQ ID NO:14的序列。

如本发明中所使用的，glnA启动子（P_glnA）是指编码谷氨酰胺合成酶的基因的启动子，由谷氨酰胺合成酶催化生成的谷氨酰胺参与了生物体碳和氮的代谢，而且在多种氨基酸合成时作为氮源的供体。P_glnA在蓝细菌中具有活性，其例如可以具有如SEQ ID NO:15的序列。

如本发明中所使用的，slr0168基因是集胞藻PCC6803基因组中编码一个未知功能蛋白的基因。前人的研究证明该基因的缺失对于细胞的生理活动没有影响，所以该基因所在的位置被认为是集胞藻PCC6803基因组中的一个中性位点（Neturalsite）。本发明的实施方案就是在该位点通过同源重组来整合不同启动子驱动的乙烯合成酶基因，从而实现在集胞藻PCC6803中表达乙烯合成酶，通过乙烯产量评估来筛选可以高效驱动乙烯合成酶表达的启动子。

如本发明中所使用的，在集胞藻PCC6803中sll1981基因所编码的氨基酸序列与聚球藻PCC7002中A2770基因编码的氨基酸序列具有80%的序列同一性，推测是集胞藻PCC6803基因组中编码α-酮戊二酸脱羧酶的基因。本发明的实施方案就是通过同源重组在该位点整合高效启动子驱动的乙烯合成酶基因，从而实现sll1981基因的插入失活，进而实现在集胞藻PCC6803中表达外源乙烯合成酶。

如本发明中所使用的，在集胞藻PCC6803中slr0370基因所编码的氨基酸序列与聚球藻PCC7002中A2771基因编码的氨基酸序列具有61.8%的序列同一性，推测是集胞藻PCC6803基因组中编码琥珀酸半醛脱氢酶的基因。本发明的实施方案就是通过同源重组在该位点整合高效启动子驱动的乙烯合成酶基因，从而实现slr0370基因的插入失活，进而实现在集胞藻PCC6803中表达外源乙烯合成酶。

如本发明中所使用的，A2770基因是聚球藻PCC7002基因组中编码α-酮戊二酸脱羧酶的基因。本发明的实施方案就是通过同源重组在该位点整合高效启动子驱动的乙烯合成酶基因，从而实现A2770基因的插入失活，进而实现在聚球藻PCC7002中表达外源乙烯合成酶。

如本发明中所使用的，A2771基因是聚球藻PCC7002基因组中编码琥珀酸半醛脱氢酶的基因。本发明的实施方案就是通过同源重组在该位点整合高效启动子驱动的乙烯合成酶基因，从而实现A2771基因的插入失活，进而实现在聚球藻PCC7002中表达外源乙烯合成酶。

“同一性”或“同一性百分比”是指两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间的序列同一性。为确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分数，以最佳比较目的对序列进行比对。两个序列之间的同一性百分比是由这些序列共有的相同位置的数目的函数（即，同一性百分数＝相同位置的数目/位置的总数（例如，重叠位置）×100)。例如，“同一性百分比”通过下列方式来计算：在比较窗中比较两个经最佳比对的序列，测定在两个序列中出现相同核苷酸碱基或相同氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目（即，窗的大小），并且将结果乘以100从而产生序列同一性百分比。用于比较的序列的最佳比对可以通过下述来进行：例如，Smith和Waterman的局部同源性算法(Smithand Waterman,1981)；Needleman和Wunsch的同源性比对算法(Needlema.Sb andWunsch,1970)；Pearson和Lipman的相似性搜索方法(Pearson and Lipman,1988)；这些算法的计算机化实施（例如，Wisconsin Genetics Software Package,GeneticsComputer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA）；或手工比对和目测检查（参见，例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology（1995增刊））。

本发明的实施方案所涉及的同一性百分比包括至少大约60%，或至少大约65%，或至少大约70%，或至少大约75%，或至少大约80%，或至少大约85%，或至少大约90%，或更高，例如大约95%，或大约96%，或大约97%，或大约98%，或大约99%，例如至少大约60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%。

本发明所具有的有益效果：

本发明通过在蓝细菌细胞内构建一条合成乙烯的途径，实现在光合微生物蓝细菌细胞内利用太阳能来固定二氧化碳并合成乙烯，其中，合成乙烯的能量来自于太阳能，碳源来自于二氧化碳。因此，利用本发明的方法制备生物乙烯不会受到石油短缺的制约，并且使用这种生物乙烯不会增加碳排放。

本发明通过以不同启动子驱动乙烯合成酶基因在集胞藻PCC6803中性位点slr0168表达，根据乙烯产量筛选到一个可以高效驱动乙烯合成酶基因表达的启动子cpcB。因此，筛选得到可以在蓝细菌中高效驱动乙烯合成酶基因表达的启动子cpcB可进一步提高乙烯产量。

本发明通过序列比对分析，得出集胞藻PCC6803中与聚球藻PCC7002的α-酮戊二酸脱羧酶（OGDC）和琥珀酸半醛脱氢酶（SSADH）氨基酸序列同一性最高的两个蛋白分别为Sll1981（80%）和Slr0370（61.8%），通过实验经初步证明这两个酶也可能具备类似催化功能。进而选定这两个位点被选定为集胞藻PCC6803中乙烯合成酶的整合位点。

通过上述限定的整合位点，以及通过本发明的P_cpcB驱动乙烯合成酶基因在集胞藻PCC6803（sll1981和slr0370位点）和聚球藻PCC7002（A2700和A2771位点）表达，sll1981和A2770基因的缺失均导致了乙烯合成酶底物α-酮戊二酸的积累，因此分别在sll1981和A2770位点表达乙烯合成酶基因提高了乙烯的产量。而且，通过提高乙烯合成酶基因在集胞藻PCC6803和聚球藻PCC7002中的拷贝数，提高了乙烯合成酶的表达量，从而进一步地提高了乙烯的产量。进一步的对PCC6803基因工程藻XX109（三拷贝）和PCC7002基因工程藻XX113（双拷贝）的培养条件进行优化，使用5×培养基进行培养，并对培养液定期用新鲜培养基进行重悬，分别得到蓝细菌中合成乙烯的最高产量为7769.3nL/mL/H和7285.12nL/mL/H。

由上述可见本发明主要基于高效驱动乙烯合成酶基因表达启动子的筛选，乙烯生物合成途径在集胞藻PCC6803和聚球藻PCC7002中的构建，以及进一步耦合乙烯生物合成途径与TCA循环，在集胞藻PCC6803的sll1981、slr0370位点，以及聚球藻PCC7002的A2770、A2771位点多拷贝表达乙烯合成酶基因，使TCA循环中间物α-酮戊二酸在乙烯合成酶催化下，合成乙烯的同时完成到琥珀酸的转化，从而获得可以高效合成乙烯的基因工程蓝细菌。

附图说明

图1为本发明实施例提供的质粒pXX29的基本结构。质粒pXX29是通过将壮观霉素抗性基因Omega、来源于蓝细菌PCC6803的基因psbA2的启动子基因P_6803psbA2以及基于丁香假单胞菌芝麻致病变种乙烯合成酶基因序列人工合成的efe基因的串联片段利用XbaI限制性酶切位点克隆到pXT37b(参见中国发明专利申请201010213758.5)中而获得的。

图2为本发明实施例提供的质粒pXX32的基本结构。质粒pXX32是通过将壮观霉素抗性基因Omega、来源于蓝细菌PCC7942的基因psbA1的启动子基因P_7942psbA1以及基于丁香假单胞菌芝麻致病变种乙烯合成酶基因序列人工合成的efe基因的串联片段利用XbaI限制性酶切位点克隆到pXT37b(参见中国发明专利申请201010213758.5)中而获得的。

图3为本发明实施例提供的质粒pXX33的基本结构。质粒pXX33是通过将壮观霉素抗性基因Omega、来源于蓝细菌PCC7942的基因psbA2的启动子基因P_7942psbA2以及基于丁香假单胞菌芝麻致病变种乙烯合成酶基因序列人工合成的efe基因的串联片段利用XbaI限制性酶切位点克隆到pXT37b(参见中国发明专利申请201010213758.5)中而获得的。

图4为本发明实施例提供的质粒pXX46的基本结构。质粒pXX46是通过利用NdeI和XhoI两个限制性酶切位点将来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种的人工合成的efe基因（SEQ ID NO:1）克隆到质粒pXT37b(参见中国发明专利申请201010213758.5)中而获得的。

图5为本发明实施例提供的质粒pXX47的基本结构。质粒pXX47是通过利用KpnI和NdeI两个限制性酶切位点将来源于蓝细菌PCC6803的cpcB启动子基因（SEQ IDNO:10）克隆到质粒pXX46中而获得的。在该质粒中，efe基因与cpcB启动子可操作地连接，从而其表达由cpcB启动子驱动。

图6为本发明实施例提供的质粒pXX48的基本结构。质粒pXX48是通过利用KpnI和NdeI两个限制性酶切位点将来源于蓝细菌PCC6803的rbcL启动子基因（SEQ IDNO:11）克隆到质粒pXX46中而获得的。在该质粒中，efe基因与rbcL启动子可操作地连接，从而其表达由rbcL启动子驱动。

图7为本发明实施例提供的质粒pXX49的基本结构。质粒pXX49是通过利用KpnI和NdeI两个限制性酶切位点将来源于λ噬菌体的ci启动子基因（SEQ ID NO:12）克隆到质粒pXX46中而获得的。在该质粒中，efe基因与ci启动子可操作地连接，从而其表达由ci启动子驱动。

图8为本发明实施例提供的质粒pXX50的基本结构。质粒pXX50是通过利用KpnI和NdeI两个限制性酶切位点将来源于蓝细菌PCC6803的psbD启动子基因（SEQ IDNO:13）克隆到质粒pXX46中而获得的。在该质粒中，efe基因与psbD启动子可操作地连接，从而其表达由psbD启动子驱动。

图9为本发明实施例提供的质粒pXX53的基本结构。质粒pXX53是通过利用KpnI和NdeI两个限制性酶切位点将来源于蓝细菌PCC7120的glnA启动子基因（SEQ IDNO:15）克隆到质粒pXX46中而获得的。在该质粒中，efe基因与glnA启动子可操作地连接，从而其表达由glnA启动子驱动。

图10为本发明实施例提供的质粒pXX54的基本结构。质粒pXX54是通过利用KpnI和NdeI两个限制性酶切位点将来源于蓝细菌PCC7942的groESL启动子基因（SEQ ID NO:14）克隆到质粒pXX46中而获得的。在该质粒中，efe基因与groESL启动子可操作地连接，从而其表达由groESL启动子驱动。

图11为本发明实施例提供的质粒pXX64的基本结构。质粒pXX64是将sll1981基因(SEQ ID NO:18)同源臂克隆到质粒pMD18-T上，并在BalI位点插入卡那霉素抗性基因-cpcB启动子基因-efe基因串联片段。

图12为本发明实施例提供的质粒pXX65的基本结构。质粒pXX65是将slr0370基因（SEQ ID NO:19）同源臂克隆到质粒pMD18-T上，并在ApaI位点插入氯霉素抗性基因-cpcB启动子基因-efe基因串联片段。

图13为本发明实施例提供的质粒pXX66的基本结构。质粒pXX66是将A2770基因(SEQ ID NO:16)同源臂克隆到质粒pMD18-T上，并在KpnI/ApaI位点插入卡那霉素抗性基因-cpcB启动子基因-efe基因串联片段。

图14为本发明实施例提供的质粒pXX67的基本结构。质粒pXX67是将A2771基因（SEQ ID NO:17）同源臂克隆到质粒pMD18-T上，并在EcoRV位点插入氯霉素抗性基因-cpcB启动子基因-efe基因串联片段。

图15为本发明实施例提供的以乙烯标准样品所做的标准曲线，如通过气相色谱所测定的。横轴表示以气相色谱测定的峰面积，纵轴表示峰面积所对应的乙烯量。

图16为本发明实施例提供的以不同启动子驱动乙烯合成酶基因（efe基因）表达的基因工程蓝细菌的乙烯合成速率情况，如通过气相色谱所测定的。产乙烯藻株（XX55、XX56、XX57、XX76、XX78、XX79、XX80和XX81）的培养周期为8天，各取其相应的最高产量作图所得。其中纵轴表示最高乙烯合成速率，横轴表达不同菌株。

图17为本发明实施例提供的源自PCC6803的基因工程蓝细菌XX105、XX106、XX107、XX109和源自PCC7002的基因工程蓝细菌XX111、XX112、XX113的乙烯的最高合成速率分析，如通过气相色谱所测定的。其中纵轴表示最高乙烯合成速率，横轴表示菌株。

图18为本发明实施例提供的对PCC6803基因工程蓝细菌XX109和PCC7002基因工程蓝细菌XX113进行培养条件优化后的乙烯合成速率情况，如通过气相色谱所测定的。白色空心标记代表当天用新鲜培养基对培养液进行重悬操作。其中纵轴表示乙烯合成速率，横轴为培养时间（天）。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对发明的范围的限定。根据附图和优选方法的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

除非特别指出，否则本发明中所使用的分子生物学试验方法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆:实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1995中所述的方法进行或者按照产品说明书进行。所用试剂未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。

序列表信息：

SEQ ID NO:1：来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种的人工合成的efe基因（NCBIID:AB025277.1）的核苷酸序列。

SEQ ID NO:2：质粒pRL57（Elhai andWolk,1988）上克隆的Omega片段序列（NCBIID：L05082）

SEQ ID NO:3：质粒pRL446（Elhai andWolk,1988）上的卡那霉素抗性基因ck2(NCBI ID：NC_003239.1)

SEQ ID NO:4：质粒pRL271（Elhai andWolk,1988）上的氯霉素抗性基因（NCBIID：NC_015291.1）

SEQ ID NO:5：来源于集胞藻PCC6803的slr0168基因的N-末端序列（也包括一部分基因上游序列）（NCBI ID：NC_000911）。

SEQ ID NO:6：来源于集胞藻PCC6803的slr0168基因的C-末端序列（也包括一部分基因下游序列）（NCBI ID：NC_000911）。

SEQ ID NO:7：来源于集胞藻PCC6803的启动子P_6803psbA2的核苷酸序列，其是利用引物03psbA2-1（SEQ ID NO:20）和03psbA2-2（SEQ ID NO:21）扩增集胞藻PCC6803基因组DNA而得到。

SEQ ID NO:8：来源于聚球藻PCC7942的启动子P_7942psbA1的核苷酸序列，其是利用引物42psbA1-1（SEQ ID NO:22）和42psbA1-2（SEQ ID NO:23）扩增聚球藻PCC7002基因组DNA而得到。

SEQ ID NO:9：来源于聚球藻PCC7942的启动子P_7942psbA2的核苷酸序列，其是利用引物42psbA2-1（SEQ ID NO:24）和42psbA2-2（SEQ ID NO:25）扩增聚球藻PCC7002基因组DNA而得到。

SEQ ID NO:10：来源于集胞藻PCC6803的启动子P_cpcB的核苷酸序列，其是利用引物cpcB-F（SEQ ID NO:26）和cpcB-R（SEQ ID NO:27）扩增集胞藻PCC6803基因组DNA而得到。

SEQ ID NO:11：来源于集胞藻PCC6803的启动子P_rbcL的核苷酸序列，其是利用引物rbcL-1（SEQ ID NO:28）和rbcL-2（SEQ ID NO:29）扩增集胞藻PCC6803基因组DNA而得到。

SEQ ID NO:12：来源于λ噬菌体的启动子P_ci的核苷酸序列，其是人工合成的核苷酸序列。

SEQ ID NO:13：来源于集胞藻PCC6803的启动子P_psbD的核苷酸序列，其是利用引物psbD-1（SEQ ID NO:30）和psbD-2（SEQ ID NO:31）扩增集胞藻PCC6803基因组DNA而得到。

SEQ ID NO:14：来源于聚球藻PCC7942的启动子P_groESL的核苷酸序列，其是利用引物PgroESL-1（SEQ ID NO:32）和PgroESL-2（SEQ ID NO:33）扩增聚球藻PCC7942基因组DNA而得到。

SEQ ID NO:15：来源于鱼腥藻PCC7120的启动子P_glnA的核苷酸序列，其是利用引物PglnA-1（SEQ ID NO:34）和PglnA-2（SEQ ID NO:35）扩增鱼腥藻PCC7120基因组DNA而得到。

SEQ ID NO:16：来源于聚球藻PCC7002的A2770基因的核苷酸序列，其是利用引物2770-1（SEQ ID NO:36）和2770-2（SEQ ID NO:37）扩增聚球藻PCC7002基因组DNA而得到。

SEQ ID NO:17：来源于聚球藻PCC7002的A2771基因的核苷酸序列，其是利用引物2771-1（SEQ ID NO:38）和2771-2（SEQ ID NO:39）扩增聚球藻PCC7002基因组DNA而得到。

SEQ ID NO:18：来源于集胞藻PCC6803的sll1981基因的核苷酸序列，其是利用引物1981-1（SEQ ID NO:42）和1981-2（SEQ ID NO:43）扩增集胞藻PCC6803基因组DNA而得到。

SEQ ID NO:19：来源于集胞藻PCC6803的slr0370基因的核苷酸序列，其是利用引物0370-1（SEQ ID NO:44）和0370-2（SEQ ID NO:45）扩增集胞藻PCC6803基因组DNA而得到。

SEQ ID NO:20：引物03psbA2-1的核苷酸序列。

SEQ ID NO:21：引物03psbA2-2的核苷酸序列。

SEQ ID NO:22：引物42psbA1-1的核苷酸序列。

SEQ ID NO:23：引物42psbA1-2的核苷酸序列。

SEQ ID NO:24：引物42psbA2-1的核苷酸序列。

SEQ ID NO:25：引物42psbA2-2的核苷酸序列。

SEQ ID NO:26：引物cpcB-F的核苷酸序列。

SEQ ID NO:27：引物cpcB-R的核苷酸序列。

SEQ ID NO:28：引物rbcL-1的核苷酸序列。

SEQ ID NO:29：引物rbcL-2的核苷酸序列。

SEQ ID NO:30：引物psbD-1的核苷酸序列。

SEQ ID NO:31：引物psbD-2的核苷酸序列。

SEQ ID NO:32：引物PgroESL-1的核苷酸序列。

SEQ ID NO:33：引物PgroESL-2的核苷酸序列。

SEQ ID NO:34：引物PglnA-1的核苷酸序列。

SEQ ID NO:35：引物PglnA-2的核苷酸序列。

SEQ ID NO:36：引物2770-1的核苷酸序列。

SEQ ID NO:37：引物2770-2的核苷酸序列。

SEQ ID NO:38：引物2771-1的核苷酸序列。

SEQ ID NO:39：引物2771-2的核苷酸序列。

SEQ ID NO:40:引物efe-1的核苷酸序列。

SEQ ID NO:41:引物efe-6的核苷酸序列。

SEQ ID NO:42：引物1981-1的核苷酸序列。

SEQ ID NO:43：引物1981-2的核苷酸序列。

SEQ ID NO:44：引物0370-1的核苷酸序列。

SEQ ID NO:45：引物0370-2的核苷酸序列。

实施例1：选择对乙烯合成酶基因

为使乙烯合成酶基因（efe基因）在蓝细菌中的持续稳定表达，通过对比不同来源的乙烯合成酶，最终选择了来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种的可以高效合成乙烯的乙烯合成酶基因，而后获得经过密码子优化以及屏蔽了突变热点（CTATG）的efe基因（参见例如SEQ ID NO:1）。

实施例2：用于以不同启动子驱动乙烯合成酶表达的载体的构建。

为了实现以不同的启动子驱动乙烯合成酶（efe基因）在集胞藻PCC6803表达，如下构建了以不同启动子驱动乙烯合成酶基因（efe基因）表达的表达质粒pXX29（P_6803psbA1）、pXX32（P_7942psbA1）、pXX33（P_7942psbA2）pXX47（P_cpcB）、pXX48（P_rbcL）、pXX49（P_ci）、pXX50（P_psbD）、pXX53（P_glnA）、pXX54（P_groESL）。

1.质粒pXX29（P_6803psbA1）、pXX32（P_7942psbA1）、pXX33（P_7942psbA2）的构建

分别以pTZ32（来源于pXT37b质粒（参见中国发明专利申请201010213758.5），通过常规基因工程操作使含有7942psbA1启动子）、pTZ33（来源于pXT37b质粒，通过常规基因工程操作使含有7942psbA2启动子）和pTZ34（来源于pXT37b质粒，通过常规基因工程操作使含有6803psbA2启动子）为模板，分别以42psbA1-1（SEQID NO:22）/42psbA1-2（SEQ ID NO:23）、42psbA2-1（SEQ ID NO:24）/42psbA2-2（SEQ ID NO:25）和03psbA2-1（SEQ ID NO:20）/03psbA2-2（SEQ ID NO:21）为引物进行PCR扩增（反应体系为1×PCR Buffer,2mM MgCl₂,200μM dNTPs,引物各100pmol,DNA模板50ng,2.5U DNA聚合酶；反应程序为预变性95℃5min，变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃，延伸时间视扩增片段长度而定（1kb/min），30个循环，最后72℃维持10min，4℃保温），并将获得的PCR产物克隆到pFL-XS(来源于pMD18-T商业载体（Takara,Catalog No.:D1073A）,通过常规基因工程操作使含有EcoRI、SpeI、XbaI酶切位点)载体上，分别得到载体pXX13、pXX14和pXX15。

以pTZ35（来源于pXT37b质粒，通过常规基因工程操作使含有efe基因）为模板，以efe-1（SEQ ID NO:40）和efe-6（SEQ ID NO:41）为引物进行PCR扩增（反应体系及反应程序同前），并将获得的PCR产物克隆到pFL-XS（来源于pMD18-T商业载体，通过常规基因工程操作使含有EcoRI、SpeI、XbaI酶切位点）载体上，得到载体pXX16。

使用EcoRI（Fermentas，No.：FD0274）和SpeI（Fermentas，No.：FD1254）分别酶切载体pXX13、pXX14和pXX15，并分别回收约为236bp、88bp和318bp的DNA片段，分别得到P_7942psbA1启动子（SEQ ID NO:8）、P_7942psbA2（SEQ ID NO:9）和P_6803psbA2（SEQ ID NO:7）启动子。此外，使用EcoRI（Fermentas，No.：FD0274）和XbaI（Fermentas，No.：FD0684）酶切载体pXX16，并回收约3.8kb的DNA片段，然后使用连接酶将该3.8kb的DNA片段分别与三个启动子片段相连，分别得到以P_7942psbA1驱动efe基因表达的质粒pXX17、以P_7942psbA2驱动efe基因表达的质粒pXX18和以P_6803psbA2驱动efe基因表达的质粒pXX19。

使用EcoRI（Fermentas，No.：FD0274）和XbaI（Fermentas，No.：FD0684）分别酶切载体pXX17、pXX18和pXX19，并分别回收约为4.0kp、3.9kp和4.1kp的DNA片段。此外，使用EcoRI（Fermentas，No.：FD0274）和SpeI（Fermentas，No.：FD1254）酶切载体pXT170S（来源于pMD18-T商业载体，通过常规基因工程操作使含有壮观抗性基因），并回收约1.9kb的DNA片段，得到壮观抗性基因（SEQ ID NO:2），然后使用连接酶将该壮观抗性基因分别与三个DNA片段相连，分别得到带有壮观抗性标记的质粒pXX20、pXX21和pXX22。

使用SmaI（Fermentas，No.：FD0664）、SpeI（Fermentas，No.：FD1254）和PvuII（Fermentas，No.：FD0634）分别酶切质粒pXX20、pXX21和pXX22，并使用T4DNA聚合酶将末端补平，然后分别回收约3.2kb、3.1kb和3.3kb的DNA片段。此外，使用XbaI酶切质粒pXT22（来源于pUC9商业载体，通过常规基因工程操作使含有slr0168基因的上下游片段），并使用T4DNA聚合酶将末端补平，然后回收约4kb的DNA片段，然后使用连接酶将该4kb的DNA片段分别与三个DNA片段相连，分别得到以P_7942psbA1驱动efe基因表达的质粒pXX32、以P_7942psbA2驱动efe基因表达的质粒pXX33和以P_6803psbA2驱动efe基因表达的质粒pXX29。质粒pXX29、pXX32、pXX33的基本结构示意图分别于图1、2、3中，其包含基因slr0168的上游片段和下游片段，以及分别以P_6803psbA2、P_7942psbA1、P_6803psbA2启动子驱动efe基因表达的片段。

2.载体pXX46的构建

使用NdeI(Fermentas，No.：FD0584)和XhoI(Fermentas，No.：FD0694)酶切pTZ35，回收约为1.1kb的efe基因片段。此外，使用NdeI(Fermentas，No.：FD0584)和XhoI(Fermentas，No.：FD0694)酶切质粒pXT37b（参见中国发明专利申请201010213758.5），并回收大的DNA片段，该DNA片段包含有slr0168两端同源臂-Omega-PpetE,P_petE两侧分别带有KpnI和NdeI酶切位点。然后使用连接酶将所获得的两个DNA片段相连，从而得到携带有efe基因的质粒pXX46，质粒pXX46的基本结构示于图4中，其包含efe基因（SEQ ID NO:1）。

3.质粒pXX47（P_cpcB）和pXX50(P_psbD)的构建

使用KpnI（Fermentas，No.：FD0524）和NdeI（Fermentas，No.：FD0584）酶切载体pXX46，并回收去除P_petE后的大片段。使用KpnI和NdeI分别酶切质粒pZZ008（来源于pMD18-T商业载体,通过常规基因工程操作使含有cpcB启动子）和质粒pFQ30C（来源于pXT37b,通过常规基因工程操作使含有psbD启动子），分别回收约600bp和900bp的片段，分别为cpcB启动子（SEQ ID NO:10）和psbD启动子（SEQ ID NO:13）。然后使用连接酶将所获得的大片段分别与两个启动子片段相连，从而分别得到以P_cpcB驱动efe基因表达的质粒pXX47和以P_psbD驱动efe基因表达的质粒pXX50，质粒pXX47和质粒pXX50的基本结构分别示于图5和图8中。

4.质粒pXX48（P_rbcL）和pXX49（P_ci）的构建

使用KpnI（Fermentas，No.：FD0524）酶切载体pXX46，并使用T4DNA聚合酶将末端补平，然后使用NdeI（Fermentas，No.：FD0584）酶切补平后的片段，回收去除P_petE后的大片段。使用BglII（Fermentas，No.：FD0084）分别酶切质粒pLX89（来源于pGEMT-easy商业载体（Promega,Catalog No.:AB1360），通过常规基因工程操作使含有rbcL启动子）和pZZ019（来源于pMD18-T商业载体,通过常规基因工程操作使含有ci启动子），并使用T4DNA聚合酶将末端补平，然后使用NdeI（Fermentas，No.：FD0584）酶切补平后的片段，分别回收约1.3kb和80bp的片段，得到rbcL启动子（SEQ ID NO:11）和ci启动子（SEQ ID NO:12）片段。然后使用连接酶将所获得的大片段分别与两个启动子片段相连，从而分别得到以P_rbcL驱动efe基因表达的质粒pXX48和以P_ci驱动_efe基因表达的质粒pXX49，质粒pXX48和质粒pXX49的基本结构分别示于图6和图7中。

5.质粒pXX53（P_glnA）的构建

以鱼腥藻PCC7120基因组DNA为模板，以PglnA-1（SEQ ID NO:34）和PglnA-2（SEQ ID NO:35）引物进行PCR扩增（反应体系及反应程序同前），并将获得的PCR产物克隆到pFL-XS（来源于pMD18-T商业载体,通过常规基因工程操作使含有EcoRI、SpeI、XbaI酶切位点）载体中，得到载体pXX52。

使用KpnI（Fermentas，No.：FD0524）和NdeI（Fermentas，No.：FD0584）酶切载体pXX46，并回收去除P_petE后的大片段。使用KpnI（Fermentas，No.：FD0524）和NdeI（Fermentas，No.：FD0584）酶切载体pXX52，并回收约380bp的片段，然后使用连接酶将所获得的两个片段相连接，从而得到质粒pXX53。质粒pXX53的基本结构分别示于图9中。

6.质粒pXX54（P_groESL）的构建

以聚球藻PCC7942基因组DNA为模板，以PgroESL-1（SEQ ID NO:32）和PgroESL-2（SEQ ID NO:33）引物进行PCR扩增（反应体系及反应程序同前），并将获得的PCR产物克隆到pFL-XS（来源于pMD18-T商业载体,通过常规基因工程操作使含有EcoRI、SpeI、XbaI酶切位点）载体中，得到载体pXX51。

使用KpnI（Fermentas，No.：FD0524）和NdeI（Fermentas，No.：FD0584）酶切载体pXX46，并回收去除P_petE后的大片段。使用KpnI（Fermentas，No.：FD0524）和NdeI（Fermentas，No.：FD0584）酶切载体pXX51，并回收约240bp的片段，然后使用连接酶将所获得的两个片段相连接，从而得到质粒pXX54。质粒pXX54的基本结构分别示于图10中。

实施例3：用于以P_cpcB驱动efe在集胞藻PCC6803的sll1981和slr0370位点表达的相关载体的构建

为了证实在sll1981和slr0370位点整合乙烯合成酶对合成乙烯的影响，并证实可以通过提高efe基因拷贝数来提高乙烯合成酶的表达量，从而提高乙烯的产量，如下构建了用于将由P_cpcB驱动的乙烯合成酶基因（efe基因）整合入PCC6803基因组中sll1981位点的载体pXX64，以及用于将由P_cpcB驱动的乙烯合成酶基因（efe基因）整合入PCC6803基因组中slr0370位点的载体pXX65。

1.载体pXX64的构建

以集胞藻PCC6803基因组DNA为模板，以1981-1(SEQ ID NO:42)和1981-2（SEQID NO:43）引物进行PCR扩增（反应体系及反应程序同前），并且根据生产商的说明书，将获得的PCR产物克隆到pMD18-T载体（Takara,Catalog No.:D1073A）中，从而得到载体pTZ14。

以载体pXX46为模板，以cpcB-F(SEQ ID NO:26)和efe-10（SEQ ID NO:41）引物进行PCR扩增（反应体系及反应程序同前），将获得的PCR产物克隆到pFL-XS（来源于pMD18-T商业载体,通过常规基因工程操作使含有EcoRI、SpeI、XbaI酶切位点）中，从而获得载体pXX55。经测序验证后，使用EcoRI（Fermentas，No.：FD0274）和XbaI（Fermentas，No.：FD0684）酶切质粒pXX55，回收约4.4kb的P_cpcB-efe的片段。另外，使用EcoRI（Fermentas，No.：FD0274）和SpeI（Fermentas，No.：FD1254）酶切质粒pFL11（来源于pMD18-T商业载体,通过常规基因工程操作使含有卡那霉素抗性基因），回收约为1.1kb的C.K2（卡那霉素抗性基因），然后使用连接酶将所获得的两个片段相连接，从而得到质粒pXX60。

使用BalI（Takara,No:1009A）酶切质粒pTZ14，回收最终的DNA片段。使用XbaI（Fermentas，No.：FD0684）、SpeI（Fermentas，No.：FD1254）和ApaL I(Fermentas，No.：FD0044)酶切质粒pXX60，并使用T4DNA聚合酶将末端补平，回收约3kb的C.K2-P_cpcB-efe的片段。然后使用连接酶将所获得的两个片段相连接，从而得到质粒pXX64。质粒pXX64的基本结构示于图11中，其包含基因sll1981片段（SEQ IDNO:18），卡那霉素抗性基因C.K2（SEQ ID NO:3），cpcB启动子基因（SEQ ID NO:10）和乙烯合成酶基因（SEQ ID NO:1），用于将由P_cpcB驱动的乙烯合成酶基因（efe基因）整合入集胞藻PCC6803基因组中sll1981位点。

2.质粒pXX65的构建

以集胞藻PCC6803基因组DNA为模板，以0370-1(SEQ ID NO:44)和0370-2（SEQID NO:45）引物进行PCR扩增（反应体系及反应程序同前），并且根据生产商的说明书，将获得的PCR产物克隆到pMD18-T载体（Takara,Catalog No.:D1073A）中，从而得到载体pTZ15。

使用EcoRI（Fermentas，No.：FD0274）和XbaI（Fermentas，No.：FD0684）酶切质粒pXX55，回收约4.4kb的P_cpcB-efe的片段。另外，使用EcoRI（Fermentas，No.：FD0274）和SpeI（Fermentas，No.：FD1254）酶切质粒pFL008（来源于pMD18-T商业载体,通过常规基因工程操作使含有氯霉素抗性基因），回收约为900bb的Cm（氯霉素抗性基因），然后使用连接酶将所获得的两个片段相连接，从而得到质粒pXX61。

使用ApaI（Fermentas，No.：FD1414）酶切质粒pTZ15，并使用T4DNA聚合酶将末端补平，回收最终的DNA片段。使用XbaI（Fermentas，No.：FD0684）、SpeI（Fermentas，No.：FD1254）和ApaL I(Fermentas，No.：FD0044)酶切质粒pXX61，并使用T4DNA聚合酶将末端补平，回收约为2.6kb的Cm-P_cpcB-efe的片段。然后使用连接酶将所获得的两个片段相连接，从而得到质粒pXX65。质粒pXX67的基本结构示于图12中，其包含基因slr0370的片段（SEQ ID NO:19），氯霉素抗性基因Cm（SEQ ID NO:4），cpcB启动子基因（SEQ ID NO:10）和乙烯合成酶基因efe（SEQID NO:1），用于将由P_cpcB驱动的乙烯合成酶基因（efe基因）整合入集胞藻PCC6803基因组slr0370位点。

实施例3：用于以P_cpcB驱动efe基因插入PCC7002基因组中A2770和A2771位点表达的载体的构建

为了证实乙烯合成酶在A2770和A2771位点进行表达对合成乙烯的作用，并证实可以通过表达多份efe基因拷贝来提高乙烯合成酶的表达量，从而提高乙烯的产量，如下构建了用于将由cpcB启动子驱动的乙烯合成酶基因（efe基因）整合入PCC7002基因组中A2770位点的载体pXX66，以及用于将由cpcB启动子驱动的乙烯合成酶基因（efe基因）整合入PCC7002基因组中A2771位点的载体pXX67。

1.载体pXX66的构建

以聚球藻PCC7002基因组DNA为模板，以2770-1(SEQ ID NO:36)和2770-2（SEQID NO:37）引物进行PCR扩增（反应体系及反应程序同前），并且根据生产商的说明书，将获得的PCR产物克隆到pMD18-T载体（Takara,Catalog No.:D1073A）中，从而得到载体pTZ51。

使用KpnI（Fermentas，No.：FD0524）和ApaI（Fermentas，No.：FD1414）酶切质粒pTZ51，并使用T4DNA聚合酶将末端补平，回收最终的DNA片段。使用XbaI（Fermentas，No.：FD0684）、SpeI（Fermentas，No.：FD1254）和ApaL I(Fermentas，No.：FD0044)酶切质粒pXX60，并使用T4DNA聚合酶将末端补平，回收约为3kb的C.K2-P_cpcB-efe的片段。然后使用连接酶将所获得的两个片段相连接，从而得到质粒pXX64。质粒pXX66的基本结构示于图13中，其包含基因A2770片段（SEQ IDNO:16），卡那霉素抗性基因C.K2（SEQ ID NO:3），cpcB启动子基因（SEQ ID NO:10）和乙烯合成酶基因（SEQ ID NO:1），用于将由cpcB启动子驱动的乙烯合成酶基因（efe基因）整合入聚球藻PCC7002基因组中A2770位点。

2.质粒pXX67的构建

以聚球藻PCC7002基因组DNA为模板，以2771-1(SEQ ID NO:38)和2771-2（SEQID NO:39）引物进行PCR扩增（反应体系及反应程序同前），，将获得的PCR产物克隆到pMD18-T载体（Takara,Catalog No.:D1073A）中，从而得到载体pTZ50。

使用EcoRV（Fermentas，No.：FD0304）酶切质粒pTZ15，并使用T4DNA聚合酶将末端补平，回收最终的DNA片段。使用XbaI（Fermentas，No.：FD0684）、SpeI（Fermentas，No.：FD1254）和ApaL I(Fermentas，No.：FD0044)酶切质粒pXX61，并使用T4DNA聚合酶将末端补平，回收约为2.6kb的Cm-P_cpcB-efe的片段。然后使用连接酶将所获得的两个片段相连接，从而得到质粒pXX67。质粒pXX67的基本结构示于图14中，其包含基因A2771的片段（SEQ ID NO:17），氯霉素抗性基因Cm（SEQ ID NO:4），cpcB启动子基因（SEQ ID NO:10）和乙烯合成酶基因efe（SEQID NO:1），用于将由cpcB启动子驱动的乙烯合成酶基因（efe基因）整合入聚球藻PCC7002基因组A2771位点。

实施例4：蓝细菌的转化以及转化体的筛选

如下进行集胞藻PCC6803的转化以及转化体的筛选

1.取处于对数生长期（OD₇₃₀约为0.5～1.0）的集胞藻PCC6803野生型蓝细菌细胞10mL，离心收集细胞；用新鲜的BG11培养基洗涤细胞两次，再将细胞重悬于1mLBG11培养基（BG11培养基成分为：1.5g L^-1NaNO₃,40mg L^-1K₂HPO₄·3H₂O,36mg L^-1CaCl₂·2H₂O,6mg L^-1柠檬酸,6mg L^-1柠檬酸铁铵,1mg L^-1EDTA二钠盐,20mg L^-1NaCO₃,2.9mg L^-1H₃BO₃,1.8mg L^-1MnCl₂·4H₂O,0.22mg L^-1ZnSO₄·7H₂O,0.39mg L^-1NaMoO₄·2H₂O,0.079mg L^-1CuSO₄·5H₂O和0.01mg L^-1CoCl₂·6H₂O）中。

2.每次取0.2mL细胞重悬液分别置于新的EP管中，每个管中分别加入2～3μg表1中所提到的工程菌，混匀，并置于30℃、30μE m^-2s^-1光照条件下温育5小时。

3.将步骤2蓝细菌细胞与质粒DNA的混合物涂布于铺在BG11平板（未加抗生素）上的硝酸纤维素膜上，并置于30℃、30μE m^-2s^-1光照条件下培养24小时。然后，将硝酸纤维素膜转移到含有与目的藻株相应的抗生素（参见表1）的BG11平板上，并在30℃、30μE m^-2s^-1的光照条件下继续培养。

4.培养大约5～7天，将转化子从平板上挑出，在新鲜的BG11平板（含相应的抗生素）上划线；待细胞富集后，再将它们接入到液体BG11培养基（含相应的抗生素）中，在30℃、30μE m^-2s^-1光照，140转每分钟的振荡条件下培养。

5.将经转化的蓝细菌细胞在液体BG11培养基（含相应的抗生素）中转接两次到三次，并且在通过基因组测序验证目的构建体的正确导入后，将经转化的细胞用于检测乙烯的产量。

聚球藻PCC7002的转化以及转化体的筛选的操作步骤与集胞藻PCC6803类似，但所用培养基为A+培养基（18g/L NaCl,0.6g/L KCl,1.0g/L NaNO₃,5.0g/LMgSO₄·7H₂O,0.2775g/L CaCl₂,2.86mg/L H₃BO₃,0.222mg/L ZnSO₄.7H₂O,0.079mg/LCuSO₄.5H₂O,0.0403mg/L CoCl₂.6H₂O,1.81mg/L MnCl₂.4H₂O,1.26mg/L Na₂MoO₄.2H₂O,0.239mg/L NaVO₃,5.73mg/L15mM Fe-EDTA,1.01g/L Tris-HCl,0.05g/L KH₂PO₄,0.01mg/L VB₁₂）。

表1：所使用的基因工程藻株及其来源和抗性

藻株的基因型信息

XX55：slr0168::Sp^r-P_7942psbA1-efe：含有由P_7942psbA1驱动的来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种的efe基因（整合到slr0168基因位点），壮观霉素抗性。

XX56：slr0168::Sp^r-P_7942psbA2-efe：含有由P_7942psbA2驱动的来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种的efe基因（整合到slr0168基因位点），壮观霉素抗性。

XX57：slr0168::Sp^r-P_6803psbA2-efe：含有由P_6803psbA2驱动的来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种的efe基因（整合到slr0168基因位点），壮观霉素抗性。

XX76：slr0168::Sp^r-P_cpcB-efe：含有由P_cpcB驱动的来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种的efe基因（整合到slr0168基因位点），壮观霉素抗性。

XX77：slr0168::Sp^r-P_rbcL-efe：含有由P_rbcL驱动的来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种的efe基因（整合到slr0168基因位点），壮观霉素抗性。

XX78：slr0168::Sp^r-P_ci-efe：含有由P_ci驱动的来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种的efe基因（整合到slr0168基因位点），壮观霉素抗性。

XX79：slr0168::Sp^r-P_psbD-efe：含有由P_psbD驱动的来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种的efe基因（整合到slr0168基因位点），壮观霉素抗性。

XX80：slr0168::Sp^r-P_glnA-efe：含有由P_glnA驱动的来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种的efe基因（整合到slr0168基因位点），壮观霉素抗性。

XX81：slr0168::Sp^r-P_groESL-efe：含有由P_groESL驱动的来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种的efe基因（整合到slr0168基因位点），壮观霉素抗性。

XX105:sll1981::Km^r-P_cpcB-efe:含有由P_cpcB驱动的来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种的efe基因（整合到sll1981基因位点），卡那霉素抗性。

XX106:slr0370::Cm^r-P_cpcB-efe：含有由P_cpcB驱动的来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种的efe基因（整合到slr0370基因位点），氯霉素抗性。

XX107:sll1981::Km^r-P_cpcB-efe,slr0370::Cm^r-P_cpcB-efe：含有由P_cpcB驱动的来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种的efe基因（分别整合到sll1981基因和slr0370基因位点），卡那霉素和氯霉素抗性。

XX109:slr0168::Sp^r-P_cpcB-efe,sll1981::Km^r-P_cpcB-efe,slr0370::Cm^r-P_cpcB-efe：含有由P_cpcB驱动的来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种的efe基因（分别整合到slr0168,sll1981基因和slr0370基因位点），壮观霉素、卡那霉素和氯霉素抗性。

XX111：A2770::Km^r-_PcpcB-efe:含有由P_cpcB驱动的来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种的efe基因（整合到A2770基因位点），卡那霉素抗性。

XX112：A2771::Cm^r-P_cpcB-efe：含有由P_cpcB驱动的来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种的efe基因（整合到A2771基因位点），氯霉素抗性。

XX113：A2770::Km^r-P_cpcB-efe，A2771::Cm^r-P_cpcB-efe：含有由P_cpcB驱动的来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种的efe基因（整合到A2771基因位点），氯霉素抗性。并且含有由P_cpcB驱动的来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种的efe基因（整合到A2770基因位点），卡那霉素抗性。

实施例5：基因工程蓝细菌藻株的乙烯产量

1、实验步骤：

（1）培养方式：通气培养。普通250mL毫升三角烧瓶，装200mL液体培养基（含与目的藻株相应抗性的抗生素；对于野生型藻株而言，不含抗生素），初始接种浓度为OD₇₃₀≈0.05，在30℃、30μE m^-2s^-1的光照条件下，通入5%CO₂培养8～9天。

（2）测试方法：每天测试前取1mL藻液于带有密闭橡胶盖的玻璃小瓶中，并放置于30℃、500μE m^-2s^-1光强下孵育一小时，然后用色谱用气体进样针吸取小瓶上空200μL气体注入气相色谱（GC）中，然后根据制造商的说明书，使用Agilent7890A-5975C系统，利用Agilent HP-INNOWax Polythelene Glycol柱进行GC分析，分析条件如下：载气为氮气；进样口温度为200℃,流速为14mL/min；柱箱温度为100℃，持续时间为4min；检测器温度为200℃。然后根据用乙烯标准样品所做的标准曲线对乙烯含量进行定量，所作标准曲线示意图示于图15中。

2、实验结果：

(1)以不同启动子驱动乙烯合成酶基因（efe基因）在PCC6803基因组中slr0168位点表达的实验结果

分别在九株含有不同启动子的基因工程蓝细菌XX55（P_7942psbA1）、XX56（P_7942psbA2）、XX57（P_6803psbA2）、XX76（P_cpcB）、XX77（P_rbcL）、XX78（P_ci）、XX79（P_psbD）、XX80（P_glnA）和XX81（P_groESL）中检测到了乙烯的生成，而在野生型蓝细菌PCC6803中未检测到乙烯的产生。图16展示了每一种藻株连续测定8天后，取每一株基因工程藻的乙烯最高产量的示意图，如通过气相色谱所测定，并通过乙烯标样标准曲线进行定量。结果显示（图16），以cpcB启动子驱动乙烯合成酶基因（efe基因）表达的藻株的乙烯产量最高，因此P_cpcB可以被认为是一种蓝细菌体内合成乙烯的高效启动子。

（2）以P_cpcB驱动乙烯合成酶基因（efe基因）插入PCC6803基因组中（sll1981和slr0370）和PCC7002基因组中（A2770和A2771）基因所在位置进行表达的实验结果

我们分别在PCC6803基因工程藻XX105、XX106、XX107和XX109和PCC7002基因工程藻XX111、XX112、XX113中均检测到了乙烯的产生（参见图17）。图17展示了这七株藻中乙烯的生产情况，通过气相色谱所测定，并通过乙烯标样标准曲线进行定量。结果显示，在PCC6803基因工程藻中，在单拷贝基因工程蓝细菌XX105和XX106中，在sll1981位点整合P_cpcB-efe的XX105的乙烯产量高于在slr0370位点整合的XX106，与XX106相比，XX105的乙烯产量提高了约46%。此外，分别在slr0168位点和sll1981位点各表达一份efe基因，得到双拷贝藻株XX107，XX107的乙烯产量与拷贝藻株XX105相比，提高了约70%，进一步的分别在slr0168位点、sll1981位点和slr0370位点各表达一份efe基因，得到三拷贝藻株XX109，乙烯产量进一步提高，达到541.61nL/mL/H。

同样，在PCC7002基因工程藻中，在A2770位点整合P_cpcB-efe的单拷贝藻株XX111的乙烯产量高于在A2771位点整合的单拷贝藻株XX112，与XX111相比，XX112的乙烯产量提高了约45%。此外，在A2770位点和A2771位点各表达一份efe基因的双拷贝藻株XX113的乙烯产量与XX111相比，提高了42%，乙烯产量达到683.33nL/mL/H。这些结果表明，在sll1981和A2770位点表达efe基因可以提高乙烯产量，可能机制为sll1981基因和A2770基因的缺失均会导致上游代谢物α-酮戊二酸的积累，即为乙烯合成酶提供了合成乙烯的底物，所以会提高乙烯产量。此外，提高efe基因的拷贝数，即提高乙烯合成酶的表达量可以有效提高乙烯产量。

表2所使用藻株的最高乙烯产量（单位：nL/mL/H）

（3）对PCC6803基因工程藻XX109和PCC7002基因工程藻XX113优化培养条件，并测定其乙烯产率的实验结果。

将PCC6803基因工程藻XX109和PCC7002基因工程藻XX113在5×培养基中通入5%CO₂进行光照培养。在250mL的三角瓶中培养200mL，起始接种OD730为0.05，在开始培养的第六天用新鲜5×培养基重悬培养液，之后每三天用新鲜5×A⁺培养基重悬一次，实验结果展示于图18中，最高产量分别可达到7769.3nL/mL/H和7285.12nL/mL/H，此产量要高于所有有关报道中在蓝细菌中合成乙烯的产量，此结果表明，用新鲜培养基对培养液进行重悬，可以显著提高乙烯产量。

生物材料样品保藏信息

菌株	保藏号	保藏时间
			集胞藻（Synechocystis sp.）XX109	CGMCC8357	2013年10月18日
聚球藻（Synechococcus sp.）XX113	CGMCC8358	2013年10月18日

上述菌株均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（China GeneralMicrobiological Culture Collection Center，CGMCC），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

参考文献

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Claims

1.一种高效合成乙烯的构建体，其特征在于：构建体包含具有活性的启动子，以及该启动子控制的乙烯合成酶基因（efe）。

2.按权利要求1所述的高效合成乙烯的构建体，其特征在于：所述构建还包含有处于所述启动子上游的用于筛选蓝细菌转化体的标记基因。

3.按权利要求1所述的高效合成乙烯的构建体，其特征在于：所述具有活性的启动子选自cpcB启动子、rbcL启动子、6803psbA2启动子、ci启动子、7942psbA2启动子、7942psbA1启动子、psbD启动子、glnA启动子或groESL启动子。

4.按权利要求1所述的高效合成乙烯的构建体，其特征在于：所述乙烯合成酶基因（efe）选自来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种的efe基因、来源于丁香假单胞菌大豆致病变种的efe基因、来源于丁香假单胞菌菜豆致病变种的efe基因、来源于丁香假单胞菌麻致病变种的efe基因或来源于丁香假单胞菌豌豆致病变种的efe基因。

5.一种权利要求1所述的高效合成乙烯的工程菌，其特征在于：将所述构建体通过同源重组整合入集胞藻PCC6803的slr0168基因、sll1981基因和/或slr0370基因内部；或，将所述构建体通过同源重组整合入聚球藻PCC7002的A2770和/或A2771基因内。

6.一种高效合成乙烯的工程菌的应用，其特征在于：所述工程菌在合成乙烯中的应用。

7.按权利要求6所述的高效合成乙烯的工程菌的应用，其特征在于：将所述工程菌利用太阳能固定二氧化碳合成乙烯。