CN102952818B

CN102952818B - 用于在蓝细菌中提高脂肪醇产量的构建体和方法

Info

Publication number: CN102952818B
Application number: CN201110246569.2A
Authority: CN
Inventors: 吕雪峰; 高倩倩; 王纬华; 赵辉
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2011-08-26
Filing date: 2011-08-26
Publication date: 2016-03-02
Anticipated expiration: 2031-08-26
Also published as: WO2013030116A1; BR112014004305A2; CN102952818A; US20130059350A1

Abstract

本发明涉及构建体，包含所述构建体的载体，包含所述构建体或用所述载体转化的蓝细菌，以及在蓝细菌中提高脂肪醇产量的方法，其中所述蓝细菌已进行了改造从而能够产生脂肪醇。本发明还涉及新的在蓝细菌中生产脂肪醇的方法。

Description

用于在蓝细菌中提高脂肪醇产量的构建体和方法

技术领域

本发明涉及可再生能源领域和生物质能源领域。具体而言，本发明涉及用于在蓝细菌中提高脂肪醇产量的构建体，包含所述构建体的载体，包含所述构建体或用所述载体转化的蓝细菌，以及在蓝细菌中提高脂肪醇产量的方法，其中所述蓝细菌已进行了改造从而能够产生脂肪醇。本发明还涉及新的在蓝细菌中生产脂肪醇的方法。

背景技术

当前，能源问题和环境问题正逐步凸显成为制约经济社会可持续发展的重要因素。可再生生物燃料的应用被认为是解决这两大问题的有效方式。已开发了制备生物乙醇的技术路线，且能够实现生物乙醇的大规模工业化生产；但是乙醇作为燃料，存在着一些缺陷：(1)能量密度低；(2)容易挥发；(3)其易溶于水所导致的一些问题，如发酵过程中对微生物毒性的增加、蒸馏分离过程中除去水相的成本过高以及运输过程中对管道的腐蚀。而理想的生物燃料应具备高能量密度、低吸湿性、低挥发性等特点，并且具有能与现存发动机设备和运输设施相兼容等的性能。最近，长链脂肪醇、长链生物烃等优质脂肪酸类生物燃料，引起了学术界与企业界越来越多的重视。著名合成生物学家JayDKeasling教授针对这类生物燃料的研究现状及前景撰写过综述(Keaslingetal.，2008)；而且近期Nature杂志报道了JayDKeasling教授及其合作者的最新研究成果：通过代谢工程手段成功实现了在大肠杆菌中合成脂肪醇和蜡脂等脂肪酸类生物燃料(Keaslingetal.，2010)。此外，美国生物燃料公司LS9也致力于通过基因工程改造在大肠杆菌与酿酒酵母等微生物中生产这类新一代的生物燃料(Keasling，J.D.etal，2007)。因此，开展脂肪酸类生物燃料分子的生物合成与代谢调控研究，对于提高生物燃料的品质和产量、推动生物燃料的应用以及应对能源和环境问题日益突出的现状具有重要意义。

目前用于生物燃料研究的微生物体系主要是以大肠杆菌和酿酒酵母为代表的异养微生物。蓝细菌，作为新一代能源微生物系统正受到越来越多的关注(Angermayr，S.A.etal，2009)。在2009年，国内外几个研究小组相继在利用蓝细菌生产生物燃料方面取得突破：中国石油大学的傅鹏程教授将来源于运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)的丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶基因在集胞藻PCC6803中共表达，实现了太阳能到生物乙醇的转化(产量为5.2mmol/OD₇₃₀/L/d)(FuandDexter，2009)；美国加州大学伯克利分校AnastasiosMelis教授的研究小组通过在集胞藻PCC6803中外源表达山葛(Puerariamontana)的异戊二烯合成酶基因，实现了在蓝细菌中生产异戊二烯(产量为50mg/g/d)(Melisetal.，2010)；加州大学洛杉矶分校JamesCLiao教授也发表了他们最新的研究成果：通过基因工程手段实现了在聚球藻PCC7942中高效生产异丁醛(最高产量为6,230μg/L/h)(CaiandWolk，1990)，这项成果发表在NatureBiotechnology杂志上。2010年3月29日，PNAS杂志报道了美国亚历桑那州立大学的一项最新的研究成果，即在集胞藻PCC6803中生产和分泌游离脂肪酸(Curtissetal.，2011)。

蓝细菌(也称为蓝藻)是一类能够进行植物型产氧光合作用的原核微生物，它作为新一代能源微生物系统具有如下优势：(1)蓝细菌能够吸收太阳能、固定二氧化碳作为碳源进行自养生长，培养成本低；(2)蓝细菌是一类古老的微生物，已在地球上存在了几十亿年，它们对环境适应能力强，生长迅速；(3)蓝细菌遗传操作方便，遗传背景清晰，并且许多种类的蓝细菌的基因组测序工作也已经陆续完成，这使得利用基因工程手段改造蓝细菌非常方便。其中，集胞藻(Synechocystissp.)PCC6803是单细胞蓝细菌的代表物种，其全基因组测序于1996年完成，是最早完成全基因组测序的光合生物，也是目前研究最多的蓝细菌之一，被认为是生物燃料合成方面研究的理想的模式物种之一(Angermayretal.，2009)。因此，以集胞藻PCC6803为研究对象开展利用蓝细菌合成脂肪酸类生物燃料方面的基础研究，对于开发蓝细菌作为新一代能源微生物系统和加快推进生物燃料应用具有重要意义。

本发明人之前已通过在集胞藻PCC6803中表达外源脂肪酰辅酶A还原酶，成功地在蓝细菌中生产出了脂肪醇(参见中国发明专利申请201010213758.5，其通过引用以其全文并入本文)。然而，仍然需要进一步提高蓝细菌中的脂肪醇产量，以促进蓝细菌在合成脂肪酸类生物燃料方面的应用，应对日益突出的能源和环境问题。

发明内容

相关术语

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、有机化学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本发明中所使用的，“蓝细菌(Cyanobacterium)”是一类光合自养的原核微生物，其能够利用太阳能，固定二氧化碳。蓝细菌也称为蓝藻。在本发明中，“蓝细菌”和“蓝藻”可互换使用。单细胞蓝细菌的代表物种是集胞藻(Synechocystissp.)PCC6803。

如本发明中所使用的，“能够产生脂肪醇的蓝细菌”是指这样的蓝细菌，其已被基因工程改造而能够表达脂肪酰辅酶A还原酶，从而能够产生脂肪醇。可通过本领域公知的方法来改造蓝细菌，使得其能够表达脂肪酰辅酶A还原酶，例如通过将编码脂肪酰辅酶A还原酶的基因导入蓝细菌，或整合入蓝细菌的基因组。能够产生脂肪醇的蓝细菌的实例包括但不限于，公开于中国发明专利申请201010213758.5中的集胞藻Syn-XT14，Syn-XT34和Syn-XT51。

如本发明中所使用的，脂肪酰辅酶A合成酶(Fattyacyl-CoAsynthetase)是指能够催化游离的脂肪酸与ATP和辅酶A反应生成脂肪酰辅酶A的酶。编码脂肪酰辅酶A合成酶的基因是本领域公知的，包括但不限于：来源于集胞藻PCC6803的slr1609基因(例如参见NCBIID：NC_000911.1)；来源于蓝杆藻ATCC51142的cce_1133(例如参见NCBIID：NC_010546.1)；来源于聚球藻7002的SYNPCC7002_A0675(例如参见NCBIID：NC_010475.1)；来源于聚球藻PCC6301的syc0624_c(例如参见NCBIID：NC_006576.1)；来源于聚球藻PCC7942的Synpcc7942_0918(例如参见NCBIID：NC_007604.1)；和来源于鱼腥藻PCC7120的alr3602(例如参见NCBIID：NC_003272.1)。

如本发明中所使用的，脂肪酰辅酶A还原酶(Fattyacyl-CoAreductase，Far)是指能够催化由脂肪酰辅酶A转化为脂肪醇的反应的酶。编码脂肪酰辅酶A还原酶的基因是本领域公知的，包括但不限于：来源于荷荷芭的far基因(例如参见中国发明专利申请201010213758.5)；来源于拟南芥的at3g11980基因(例如参见中国发明专利申请201010213758.5)；来源于小鼠的far1基因(例如参见NCBIID：BC007178)；密码子经过优化的来源于小鼠的far1基因；来源于小鼠的far2基因(例如参见NCBIID：BC055759)；或来源于拟南芥的at3g56700基因(例如参见NCBIID：NC_003074.8)。其他合适的脂肪酰辅酶A还原酶基因还包括例如：来自弗兰克氏菌(Frankiasp.)CcI3的Francci3_2276(例如参见NC_007777)；来自嗜根库克菌(Kocuriarhizophila)DC2201的KRH_18580(例如参见NC_010617)；来自海洋放线细菌(Actinobacterium)PHSC20C1的A20C1_04336(例如参见NZ_AAOB01000003)；来自HahellachejuensisKCTC2396的HCH_05075(例如参见NC_007645)；来自水油海杆菌(Marinobacteraquaeolei)VT8的Maqu_2220(例如参见NC_008740)；和来自海洋杆菌(Oceanobactersp.)RED65的RED65_09889(例如参见NZ_AAQH01000001)。

如本发明中所使用的，载体(vector)是指能够将DNA片段(例如，目的基因)插入其中从而允许将DNA片段(例如，目的基因)转移到受者细胞中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的DNA片段所编码的蛋白获得表达时，载体也称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的DNA片段在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。

如本发明中所使用的，通常将DNA片段(例如，目的基因)与表达控制序列可操作地连接，以实现DNA片段(例如，目的基因)的组成型或诱导型表达。如本发明中所使用的，“可操作地连接”是指所连接的分子的连接方式使得能够实现预期的功能。例如，表达控制序列与基因编码序列的可操作的连接可实现表达控制序列对基因编码序列的表达的控制作用。如本发明中所使用的，“表达控制序列”是实现基因表达所需要的控制序列，其是本领域熟知的。表达控制序列通常包括启动子，常常也包括转录终止序列，并且还可以包含其他序列，如增强子序列。

如本发明中所使用的，rbc启动子(Prbc)是指集胞藻PCC6803基因组中编码催化光合作用中卡尔文循环的第一个反应的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Ribulose-1，5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase，Rubisco)的操纵子的启动子(参见中国发明专利申请201010213758.5)。rbc启动子在蓝细菌中具有活性，其序列例如可参见中国发明专利申请201010213758.5。

如本发明中所使用的，petE启动子(PpetE)是指编码质体蓝素(Plastocyanin，PC)的基因petE的启动子(参见中国发明专利申请201010213758.5)。质体蓝素是光合作用中将电子由细胞色素b6/f复合体传递到光系统I的电子载体。petE启动子在蓝细菌中具有活性，其序列例如可参见中国发明专利申请201010213758.5。

如本发明中所使用的，psbA2启动子(PpsbA2)是指编码光合系统IID1蛋白(PhotosystemIID1protein)的基因psbA2的启动子。光合系统IID1蛋白是光合系统II中的一个重要组分，其负责光合系统II的电子传递。psbA2启动子在蓝细菌中具有活性，其例如可以具有如SEQIDNO：6所示的序列。之前的研究已证明，psbA2基因的缺失对于集胞藻PCC6803细胞的生理活动没有影响(即，该基因所在的位置是集胞藻PCC6803基因组中的一个中性位点(neturalsite))(SalihandJansson，1997)。因此，在本发明的一个优选实施方案中，分别克隆psbA2基因的包含psbA2启动子在内的1.5kb的上游片段(SEQIDNO：6)和600bp的下游片段(SEQIDNO：7)，用于通过同源重组将psbA2启动子和脂肪酰辅酶A合成酶基因(例如，集胞藻PCC6803脂肪酰辅酶A合成酶基因slr1609)整合到该基因位点，从而实现在蓝细菌中过量表达脂肪酰辅酶A合成酶。

如本发明中所使用的，“杂交”表示这样一个过程：在该过程中，于合适的条件下，两条核酸序列以稳定且特异的氢键相互结合以致形成双链。这些氢键在互补碱基腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)(或尿嘧啶(U))之间(则这称为A-T键)或在互补碱基鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)之间(则这称为G-C键)形成。两条核酸序列的杂交可以是全部的(则称为互补序列)，即在该杂交过程中获得的双链仅包含A-T键和C-G键。这种杂交可以是部分的(则称为足够互补的序列)，即获得的双链包含允许形成双链的A-T键和C-G键，但还包含未与互补碱基结合的碱基。两条互补序列或足够互补的序列之间的杂交取决于所使用的操作条件，并且特别是严紧性。严紧性特别是根据两条核酸序列的碱基组成来定义，以及通过这两条核酸序列之间的错配程度来定义。严紧性还可以取决于反应参数，例如存在于杂交溶液中的离子种类的浓度和类型，变性剂的性质和浓度，和/或杂交温度。所有这些数据是所熟知的，并且合适的条件可以由本领域技术人员来确定。

如本领域已知的，核酸序列彼此杂交的条件可以被描述为从低到高严紧性的范围。在此处提及低严紧杂交条件时，包括至少大约0％到至少大约15％v/v甲酰胺，以及用于杂交的至少大约1M到至少大约2M的盐，和用于洗涤条件的至少大约1M到至少大约2M的盐。一般地，低严紧杂交条件的温度为大约25-30℃到大约42℃。在此处提及中等严紧杂交条件时，包括至少大约16％v/v到至少大约30％v/v的甲酰胺，以及用于杂交的至少大约0.5M到至少大约0.9M的盐，和用于洗涤条件的至少大约0.5M到至少大约0.9M的盐。在此处提及高严紧杂交条件时，包括至少大约31％v/v到至少大约50％v/v的甲酰胺，以及用于杂交的至少大约0.01M到至少大约0.15M的盐，和用于洗涤条件的至少大约0.01M到至少大约0.15M的盐。一般地，洗涤在下列条件下进行：T_m＝69.3+0.41(G+C)％(MarmurandDoty，1962)。但是，每增加1％的错配碱基对数目，双链体DNA的T_m下降1℃(Bonner，1983)。在这些杂交条件中甲酰胺是可选的。因此，特别优选的严紧杂交条件如下确定：低严紧杂交条件是6xSSC缓冲液，1.0％w/vSDS，在25-42℃下；中等严紧杂交条件是2xSSC缓冲液，1.0％w/vSDS，在20℃至65℃的温度下；高严紧杂交条件是0.1xSSC缓冲液，0.1％w/vSDS，在至少65℃的温度下。关于核酸的杂交的详尽指导可见于Tijssen，(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes，第1部分，第2章(Elsevier，NewYork)；和Ausubel等人，编辑(1995)CurrentProtocolsinMolecularBiology，第2章(GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork)。还可参见Sambrook等人，(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，Plainview，NewYork)。

如本发明中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar，Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4：11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weightresiduetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(JMoIBiol.48：444-453(1970))算法，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

本发明的实施方案所涉及的同一性百分数包括至少大约60％，或至少大约65％，或至少大约70％，或至少大约75％，或至少大约80％，或至少大约85％，或至少大约90％，或更高，例如大约95％，或大约96％，或大约97％，或大约98％，或大约99％，例如至少大约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％。

本发明的详细描述

本发明基于发明人的出人意料的发现：在能够产生脂肪醇的蓝细菌中，通过提高脂肪酰辅酶A合成酶的表达量，可以提高脂肪醇的产量。

不希望受任何理论束缚，发明人现认为，蓝细菌产生脂肪醇的机制如下：在蓝细菌中，游离脂肪酸经过脂肪酰辅酶A合成酶的活化作用生成脂肪酰辅酶A，并且脂肪酰辅酶A进一步在脂肪酰辅酶A还原酶的催化作用下转化为脂肪醇。野生型蓝细菌(例如集胞藻PCC6803)天然表达脂肪酰辅酶A合成酶(其编码基因为slr1609基因，参见例如NCBIID：NC_000911.1)，而不表达脂肪酰辅酶A还原酶。因此，通过使蓝细菌表达脂肪酰辅酶A还原酶(例如使用基因工程方法)，发明人成功地在蓝细菌细胞内构建了一条合成脂肪醇的途径，实现了脂肪醇在蓝细菌细胞内的合成。发明人进一步发现，蓝细菌的内源脂肪酰辅酶A合成酶的表达量较低，不能满足大规模生产脂肪醇的需要。因此，不希望受任何理论束缚，发明人现认为，通过提高蓝细菌内脂肪酰辅酶A合成酶的表达量(例如，通过使内源脂肪酰辅酶A合成酶高表达，或通过表达外源脂肪酰辅酶A合成酶)，可以提高脂肪酰辅酶A的产量，从而可以提高下游产物脂肪醇的产量。

因此，在一个方面，本发明的实施方案涉及构建体，其中，所述构建体包含与在蓝细菌中具有活性的启动子可操作地连接的基因，所述基因选自：

1)脂肪酰辅酶A合成酶基因；

2)其核苷酸序列与1)中所列基因的序列具有至少80％同一性，优选地至少85％同一性，更优选地至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，例如至少96％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，或至少99％同一性，并且编码具有脂肪酰辅酶A合成酶活性的蛋白质的基因；或

3)其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与1)中所列基因的序列杂交，并且编码具有脂肪酰辅酶A合成酶活性的蛋白质的基因。

所述构建体可用于在能够产生脂肪醇的蓝细菌中提高脂肪醇的产量。

在一个优选的实施方案中，所述启动子是组成型启动子或诱导型启动子。在另一个优选的实施方案中，所述启动子包括但不限于，例如psbA2启动子，rbc启动子，petE启动子，cmp启动子(Liuetal.，2011)，sbt启动子(Liuetal.，2011)或trc启动子(Atsumietal.，2009)。在另一个优选的实施方案中，所述启动子具有如SEQIDNO：6所示的序列。

在另一个优选的实施方案中，所述基因是脂肪酰辅酶A合成酶基因，例如但不限于：来源于集胞藻PCC6803的slr1609基因(参见例如NCBIID：NC_000911.1)；来源于蓝杆藻ATCC51142的cce_1133(参见例如NCBIID：NC_010546.1)；来源于聚球藻7002的SYNPCC7002_A0675(参见例如NCBIID：NC_010475.1)；来源于聚球藻PCC6301的syc0624_c(参见例如NCBIID：NC_006576.1)；来源于聚球藻PCC7942的Synpcc7942_0918(参见例如NCBIID：NC_007604.1)；和来源于鱼腥藻PCC7120的alr3602(参见例如NCBIID：NC_003272.1)。在另一个优选的实施方案中，所述基因具有如SEQIDNO：1所示的序列。

在另一个优选的实施方案中，所述能够产生脂肪醇的蓝细菌是这样的细菌，其经基因工程改造而能够表达脂肪酰辅酶A还原酶，从而能够产生脂肪醇。例如，可以通过将编码脂肪酰辅酶A还原酶的基因导入蓝细菌，或整合入蓝细菌的基因组，从而获得能够产生脂肪醇的蓝细菌。在另一个优选的实施方案中，能够产生脂肪醇的蓝细菌的实例包括但不限于，公开于中国发明专利申请201010213758.5中的集胞藻Syn-XT14，Syn-XT34和Syn-XT51。

在另一个优选的实施方案中，所述构建体还可以包含用于筛选蓝细菌转化体的标记基因。所述标记基因包括但不限于，例如卡那霉素抗性基因(NCBIID：NC_003239.1)，红霉素抗性基因(NCBIID：NC_015291.1)和壮观霉素抗性基因(参见例如，中国发明专利申请201010213758.5)。此类标记基因是本领域技术人员熟知的，并且其选择在本领域技术人员的能力范围之内。在一个优选的实施方案中，所述标记基因是卡那霉素抗性基因，其例如具有如SEQIDNO：4所示的序列。在另一个优选的实施方案中，所述标记基因为壮观霉素抗性基因Omega片段，其序列例如参见中国发明专利申请201010213758.5。在另一个优选的实施方案中，所述标记基因可以位于所述在蓝细菌中具有活性的启动子的上游或下游。

在另一个优选的实施方案中，所述构建体在两端分别具有psbA2基因的上游片段和下游片段，从而所述构建体可以通过同源重组整合入蓝细菌基因组中psbA2基因所在的位置。在一个优选的实施方案中，所述psbA2基因的上游片段具有如SEQIDNO：6所示的序列。在另一个优选的实施方案中，所述psbA2基因的下游片段具有如SEQIDNO：7所示的序列。

在另一个方面，本发明的实施方案涉及载体，其包含上面所定义的构建体。

可用于插入目的基因或构建体的载体是本领域公知的，包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个优选的实施方案中，载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。

在另一个方面，本发明的实施方案涉及一种包含上面所定义的构建体和/或载体的蓝细菌，或者用上面所定义的载体转化的蓝细菌。在一个优选的实施方案中，所述蓝细菌是能够产生脂肪醇的蓝细菌。在另一个优选的实施方案中，所述蓝细菌例如选自：于2011年5月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter，CGMCC)的蓝细菌GQ5，其保藏号为CGMCC4890。

在另一个方面，本发明的实施方案涉及一种试剂盒，其包含2种构建体，其中第1构建体是如上面所定义的构建体，并且第2构建体包含与在蓝细菌中具有活性的启动子可操作地连接的基因，所述基因选自：

1)脂肪酰辅酶A还原酶基因；

2)其核苷酸序列与1)中所列基因的序列具有至少80％同一性，优选地至少85％同一性，更优选地至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，例如至少96％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，或至少99％同一性，并且编码具有脂肪酰辅酶A还原酶活性的蛋白质的基因；或

3)其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与1)中所列基因的序列杂交，并且编码具有脂肪酰辅酶A还原酶活性的蛋白质的基因。

在一个优选的实施方案中，第2构建体所包含的启动子是组成型启动子或诱导型启动子。在另一个优选的实施方案中，第2构建体所包含的启动子可以选自例如psbA2启动子，rbc启动子，petE启动子，cmp启动子，sbt启动子或trc启动子。在另一个优选的实施方案中，第2构建体所包含的启动子是rbc启动子或petE启动子。

在一个优选的实施方案中，脂肪酰辅酶A还原酶基因可以选自例如：来源于荷荷芭的far基因(例如参见中国发明专利申请201010213758.5)；来源于拟南芥的at3g11980基因(例如参见中国发明专利申请201010213758.5)；来源于小鼠的far1基因(例如参见NCBIID：BC007178)；密码子经过优化的来源于小鼠的far1基因；来源于小鼠的far2基因(例如参见NCBIID：BC055759)；或来源于拟南芥的at3g56700基因(例如参见NCBIID：NC_003074.8)。其他合适的脂肪酰辅酶A还原酶基因还包括例如：来自弗兰克氏菌(Frankiasp.)CcI3的Francci3_2276(例如参见NC_007777)；来自嗜根库克菌(Kocuriarhizophila)DC2201的KRH_18580(例如参见NC_010617)；来自海洋放线细菌(Actinobacterium)PHSC20C1的A20C1_04336(例如参见NZ_AAOB01000003)；来自HahellachejuensisKCTC2396的HCH_05075(例如参见NC_007645)；来自水油海杆菌(Marinobacteraquaeolei)VT8的Maqu_2220(例如参见NC_008740)；和来自海洋杆菌(Oceanobactersp.)RED65的RED65_09889(例如参见NZ_AAQH01000001)。

在另一个优选的实施方案中，第2构建体还可以包含用于筛选蓝细菌转化体的标记基因，例如但不限于，卡那霉素抗性基因，红霉素抗性基因和壮观霉素抗性基因。在一个优选的实施方案中，第2构建体包含的标记基因与第1构建体包含的标记基因不同。

在另一个方面，本发明的实施方案涉及一种试剂盒，其包含2种载体，其中第1载体包含上面所定义的第1构建体，并且第2载体包含上面所定义的第2构建体。

在另一个方面，本发明的实施方案涉及一种蓝细菌，其包含上面所定义的第1构建体和/或第1载体，并且包含上面所定义的第2构建体和/或第2载体。在一个优选的实施方案中，所述蓝细菌是能够产生脂肪醇的蓝细菌。在另一个优选的实施方案中，所述蓝细菌例如是：于2011年5月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的蓝细菌GQ5，其保藏号为CGMCC4890。

在另一个方面，本发明的实施方案涉及在能够产生脂肪醇的蓝细菌中提高脂肪醇产量的方法，其包括将上面所定义的第1构建体和/或第1载体导入所述蓝细菌中。

在一个优选的实施方案中，所述能够产生脂肪醇的蓝细菌是这样的细菌，其经基因工程改造而能够表达脂肪酰辅酶A还原酶，从而能够产生脂肪醇。例如，可以通过将编码脂肪酰辅酶A还原酶的基因导入蓝细菌，或整合入蓝细菌的基因组，从而获得能够产生脂肪醇的蓝细菌。在另一个优选的实施方案中，能够产生脂肪醇的蓝细菌的实例包括但不限于，公开于中国发明专利申请201010213758.5中的集胞藻Syn-XT14，Syn-XT34和Syn-XT51。在另一个优选的实施方案中，将第1构建体整合入所述蓝细菌的基因组内。

在另一个方面，本发明的实施方案涉及在蓝细菌中生产脂肪醇的方法，所述方法包括：

1)将上面所定义的第1构建体和/或第1载体，以及上面所定义的第2构建体和/或第2载体导入蓝细菌；和

2)培养步骤1)获得的蓝细菌，并从培养物中获得脂肪醇。

在一个优选的实施方案中，所述蓝细菌是集胞藻PCC6803。在另一个优选的实施方案中，将第1构建体和/或第2构建体整合入所述蓝细菌的基因组内。在另一个优选的实施方案中，步骤1)获得的蓝细菌是于2011年5月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的蓝细菌GQ5，其保藏号为CGMCC4890。

在另一个方面，本发明的实施方案涉及上面所定义的第1构建体或第1载体在能够产生脂肪醇的蓝细菌中提高脂肪醇产量的用途。

在另一个方面，本发明的实施方案涉及上面所定义的试剂盒在制备能够产生脂肪醇的蓝细菌中的用途。

在本发明中，脂肪醇是指碳链长度为至少12个C(例如至少13个C，至少14个C，至少15个C，或至少16个C)的脂肪醇，例如1-十六烷醇和1-十八烷醇。

发明的有益效果

在本申请中，发明人通过在蓝细菌细胞内构建了一条合成脂肪醇的途径，实现了在光合微生物蓝细菌细胞内利用太阳能来固定二氧化碳并合成脂肪醇，其中，合成脂肪醇的能量来自于太阳能，并且碳源来自于二氧化碳。因此，本发明的技术方案的一个优点在于，利用本发明的方法所制备的生物燃料不会受到原料不足的制约，并且使用这种生物燃料不会增加碳排放，是真正的零排放生物燃料。

进一步，在本申请中，发明人通过提高蓝细菌内脂肪酰辅酶A合成酶的表达量，提高了蓝细菌中脂肪酰辅酶A的产量，从而提高了下游产物脂肪醇的产量。因此，本发明的技术方案的另一个优点在于，进一步提高了蓝细菌中脂肪醇的产量，为使用蓝细菌来大规模生产生物燃料脂肪醇提供了有利条件。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1为质粒pGQ7的基本结构。质粒pGQ7是通过利用NdeI和XhoI两个限制性酶切位点将源于蓝藻PCC6803的slr1609基因(SEQIDNO：1)克隆到质粒pET21b(Novagen)中而获得的。

图2为质粒pXT68的基本结构。质粒pXT68是通过将蓝藻PCC6803的基因psbA2的上游片段(SEQIDNO：6，包含psbA2启动子)和下游片段(SEQIDNO：7)，以及卡那霉素抗性基因ck2(SEQIDNO：4)克隆到质粒pMD18-T(Takara，CatalogNo.：D101A)中而获得的。

图3为质粒pGQ49的基本结构。质粒pGQ49是通过利用NdeI和XhoI两个限制性酶切位点将slr1609基因(SEQIDNO：1)克隆到质粒pXT68中而获得的。在该质粒中，slr1609基因与psbA2启动子可操作地连接，从而其表达由psbA2启动子驱动。

图4为质粒pGQ17的基本结构。质粒pGQ17是通过将slr1609基因的上游片段(SEQIDNO：2)和下游片段(SEQIDNO：3)，以及卡那霉素抗性基因ck2(SEQIDNO：4)克隆到质粒pMD18-T中而获得的。

图5为培养10天后的集胞藻Syn-XT14细胞中脂肪醇的生产情况，如通过气质联用检测所测定的。其中，C15-OH表示1-十五烷醇(其用作内标)；C16-OH表示1-十六烷醇；C18-OH表示1-十八烷醇；纵轴表示丰度，横轴表示时间(单位：分钟)。

图6为培养10天后的集胞藻GQ6细胞中脂肪醇的生产情况，如通过气质联用检测所测定的。其中，C15-OH表示1-十五烷醇(其用作内标)；C16-OH表示1-十六烷醇；C18-OH表示1-十八烷醇；纵轴表示丰度，横轴表示时间(单位：分钟)。

图7为培养10天后的集胞藻GQ5细胞中脂肪醇的生产情况，如通过气质联用检测所测定的。其中，C15-OH表示1-十五烷醇(其用作内标)；C16-OH表示1-十六烷醇；C18-OH表示1-十八烷醇；纵轴表示丰度，横轴表示时间(单位：分钟)。

序列表信息：

SEQIDNO：1：来源于集胞藻PCC6803的slr1609基因(NCBIID：NC_000911.1)的核苷酸序列。

SEQIDNO：2：slr1609基因的上游片段的核苷酸序列，其是利用引物1609kuF(SEQIDNO：10)和1609kuR(SEQIDNO：11)扩增集胞藻PCC6803的基因组DNA而得到的。

SEQIDNO：3：slr1609基因的下游片段的核苷酸序列，其是利用引物1609kdF(SEQIDNO：12)和1609kdR(SEQIDNO：13)扩增集胞藻PCC6803的基因组DNA而得到的。

SEQIDNO：4：质粒pRL446(ElhaiandWolk，1988)上的卡那霉素抗性基因ck2(NCBIID：NC_003239.1)的核苷酸序列。

SEQIDNO：5：质粒pRL446上的卡那霉素抗性基因ck2(NCBIIDNC_003239.1)和蔗糖筛选基因(NCBIIDNC_000964.3)的核苷酸序列。

SEQIDNO：6：psbA2基因的上游片段(包含psbA2启动子)的核苷酸序列，其是利用引物Pd1-2-f(SEQIDNO：14)和Pd1-2-r(SEQIDNO：15)扩增集胞藻PCC6803的基因组DNA而得到的。

SEQIDNO：7：psbA2基因的下游片段的核苷酸序列，其是利用引物pD1-2d-1(SEQIDNO：16)和pD1-2d-2(SEQIDNO：17)扩增集胞藻PCC6803的基因组DNA而得到的。

SEQIDNO：8：引物1609NdeI的核苷酸序列。

SEQIDNO：9：引物1609R的核苷酸序列。

SEQIDNO：10：引物1609kuF的核苷酸序列。

SEQIDNO：11：引物1609kuR的核苷酸序列。

SEQIDNO：12：引物1609kdF的核苷酸序列。

SEQIDNO：13：引物1609kdR的核苷酸序列

SEQIDNO：14：引物Pd1-2-f的核苷酸序列。

SEQIDNO：15：引物Pd1-2-r的核苷酸序列。

SEQIDNO：16：引物pD1-2d-1的核苷酸序列。

SEQIDNO：17：引物pD1-2d-2的核苷酸序列。

SEQIDNO：18：质粒pRL271(ElhaiandWolk，1988)上的红霉素抗性基因(NCBIID：NC_015291.1)的核苷酸序列。

SEQIDNO：1：ATGGACAGTGGCCATGGCGCTCAATCCAGGATAAAGCTTGGTCAGACTGGGTATAAACTGTCAACATATTTCTGCAAGAGTGGGCCCAATTGGGAAAATCAACCTCAAATCCATTGGAATAGCCTTTTTTCAACCGTAAAAATCCAACTTTCTCTCTTCCCTTCTTCCTTCCATCTGATTATGGTTACGCCAATTAACTACCATTCCATCCATTGCCTGGCGGATATCTGGGCTATCACCGGAGAAAATTTTGCCGATATTGTGGCCCTCAACGATCGCCATAGTCATCCCCCCGTAACTTTAACCTATGCCCAATTGCGGGAAGAAATTACAGCTTTTGCCGCTGGCCTACAGAGTTTAGGAGTTACCCCCCATCAACACCTGGCCATTTTCGCCGACAACAGCCCCCGGTGGTTTATCGCCGATCAAGGCAGTATGTTGGCTGGAGCCGTCAACGCCGTCCGTTCTGCCCAAGCAGAGCGCCAGGAATTACTCTACATCCTAGAAGACAGCAACAGCCGTACTTTAATCGCAGAAAATCGGCAAACCCTAAGCAAATTGGCCCTAGATGGCGAAACCATTGACCTGAAACTAATCATCCTCCTCACCGATGAAGAAGTGGCAGAGGACAGCGCCATTCCCCAATATAACTTTGCCCAGGTCATGGCCCTAGGGGCCGGCAAAATCCCCACTCCCGTTCCCCGCCAGGAAGAAGATTTAGCCACCCTGATCTACACCTCCGGCACCACAGGACAACCCAAAGGGGTGATGCTCAGCCACGGTAATTTATTGCACCAAGTACGGGAATTGGATTCGGTGATTATTCCCCGCCCCGGCGATCAGGTGTTGAGCATTTTGCCCTGTTGGCACTCCCTAGAAAGAAGCGCCGAATATTTTCTTCTTTCCCGGGGCTGCACGATGAACTACACCAGCATTCGCCATTTCAAGGGGGATGTGAAGGACATTAAACCCCATCACATTGTCGGTGTGCCCCGGCTGTGGGAATCCCTCTACGAAGGGGTACAAAAAACGTTCCGGGAAAAGTCCCCTGGGCAACAAAAGCTAATTAATTTCTTTTTCGGCATTTCCCAAAAATATATTTTGGCCAAACGCATTGCCAATAACCTGAGCTTGAACCATCTCCACGCTTCGGCGATCGCCAGGTTGGTGGCCCGGTGCCAAGCCTTGGTGCTTAGTCCTCTCCATTACCTCGGGGACAAAATTGTCTACCATAAGGTACGCCAGGCCGCTGGGGGCAGACTGGAAACTCTCATTTCCGGAGGAGGGGCGTTAGCTAGACATTTAGATGATTTTTACGAAATCACCAGCATTCCCGTCCTGGTGGGCTATGGCTTAACGGAAACGGCCCCAGTAACTAATGCCAGGGTGCATAAACATAATTTGCGCTATTCCTCTGGCCGCCCCATTCCTTTCACAGAAATTCGTATTGTTGACATGGAAACCAAGGAGGATTTGCCCCCCGAAACCCAAGGTCTTGTGCTAATCCGTGGTCCCCAGGTGATGCAGGGCTATTACAACAAGCCGGAAGCCACCGCCAAAGTTTTAGACCAGGAAGGCTGGTTCGACAGCGGTGACTTAGGCTGGGTAACGCCCCAAAATGATTTGATTCTCACCGGTCGGGCCAAGGACACCATTGTGCTCAGTAACGGGGAAAATGTGGAACCCCAACCCATTGAAGATGCCTGTTTACGCAGTGCCTACATTGACCAGATTATGCTGGTGGGCCAGGATCAAAAATCCTTGGGGGCTTTGATTGTGCCCAACTTCGATGCATTGCAAAAATGGGCAGAGACGAAAAATTTACAAATCACCGTGCCGGAACCGTCGGCTAGCAGTGAAGGGATGCAGGCTAGTGGTTTGTATGACCCCCAAGTGGTGGGGTTAATGCGGTCGGAGTTGCATCGGGAAGTGCGCGATCGCCCTGGCTACCGAGCCGATGACCAGATTAAGGATTTCCGTTTTATCCCAGCACCATTTTCCCTGGAAAACGGCATGATGACCCAAACCTTGAAGCTCAAACGACCAGTGGTAACCCAAACTTATCAACATTTAATTGACGAAATGTTTTAA

SEQIDNO：2：GGGCATCCACCAACGCTTTGGTGATGAACACTGGGGAAACCCCAGAAATGAGGGGAGGTAAGGGATAGGTTGCCCCTGCCGTAGTTCCCTTGATTAAAAATTCCGCATCGGCGATCGCCGTCAATTTTCGATCAGCGGGGGTTTTACCCGCCGCAGAAATGCCCGGAATTAAACCAGTTTCCGTAAAGCCCAACACACAGACAAACACCGGTGGACAGTGGCCATGGCGCTCAATCCAGGATAAAGCTTGGTCAGACTGGGTATAAACTGTCAACATATTTCTGCAAGAGTGGGCCCAATTGGGAAAATCAACCTCAAATCCATTGGAATAGCCTTTTTTCAACCGTAAAAATCCAACTTTCTCTCTTCCCTTCTTCCTTCCATCTGATTATGGTTACGCCAATTAACTACCATTCCATCCATTGCCTGGCGGATATCTGGGCTATCACCGGAGAAAATTTTGCCGATATTGTGGCCCTCAACGATCGCCATAGTCATCCC

SEQIDNO：3：GCCTACATTGACCAGATTATGCTGGTGGGCCAGGATCAAAAATCCTTGGGGGCTTTGATTGTGCCCAACTTCGATGCATTGCAAAAATGGGCAGAGACGAAAAATTTACAAATCACCGTGCCGGAACCGTCGGCTAGCAGTGAAGGGATGCAGGCTAGTGGTTTGTATGACCCCCAAGTGGTGGGGTTAATGCGGTCGGAGTTGCATCGGGAAGTGCGCGATCGCCCTGGCTACCGAGCCGATGACCAGATTAAGGATTTCCGTTTTATCCCAGCACCATTTTCCCTGGAAAACGGCATGATGACCCAAACCTTGAAGCTCAAACGACCAGTGGTAACCCAAACTTATCAACATTTAATTGACGAAATGTTTTAAGAACCTGTTTATAAAGTCTGATTCTGCCCCCTAAATCCCCCAATACTGGGGGACTTTGACTTAGTTTCCCCCCAAACTTGGGGGGCCAGGGGGGCTTTTCAAACACGATCTAAGGCCTATGGGTAA

SEQIDNO：4：GGATCCTCTAGAGTCCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCC

SEQIDNO：5：GATATCGGCATTTTCTTTTGCGTTTTTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCTTGTTCAAGGATGCTGTCTTTGACAACAGATGTTTTCTTGCCTTTGATGTTCAGCAGGAAGCTTGGCGCAAACGTTGATTGTTTGTCTGCGTAGAATCCTCTGTTTGTCATATAGCTTGTAATCACGACATTGTTTCCTTTCGCTTGAGGTACAGCGAAGTGTGAGTAAGTAAAGGTTACATCGTTAGGATCAAGATCCATTTTTAACACAAGGCCAGTTTTGTTCAGCGGCTTGTATGGGCCAGTTAAAGAATTAGAAACATAACCAAGCATGTAAATATCGTTAGACGTAATGCCGTCAATCGTCATTTTTGATCCGCGGGAGTCAGTGAACAGGTACCATTTGCCGTTCATTTTAAAGACGTTCGCGCGTTCAATTTCATCTGTTACTGTGTTAGATGCAATCAGCGGTTTCATCACTTTTTTCAGTGTGTAATCATCGTTTAGCTCAATCATACCGAGAGCGCCGTTTGCTAACTCAGCCGTGCGTTTTTTATCGCTTTGCAGAAGTTTTTGACTTTCTTGACGGAAGAATGATGTGCTTTTGCCATAGTATGCTTTGTTAAATAAAGATTCTTCGCCTTGGTAGCCATCTTCAGTTCCAGTGTTTGCTTCAAATACTAAGTATTTGTGGCCTTTATCTTCTACGTAGTGAGGATCTCTCAGCGTATGGTTGTCGCCTGAGCTGTAGTTGCCTTCATCGATGAACTGCTGTACATTTTGATACGTTTTTCCGTCACCGTCAAAGATTGATTTATAATCCTCTACACCGTTGATGTTCAAAGAGCTGTCTGATGCTGATACGTTAACTTGTGCAGTTGTCAGTGTTTGTTTGCCGTAATGTTTACCGGAGAAATCAGTGTAGAATAAACGGATTTTTCCGTCAGATGTAAATGTGGCTGAACCTGACCATTCTTGTGTTTGGTCTTTTAGGATAGAATCATTTGCATCGAATTTGTCGCTGTCTTTAAAGACGCGGCCAGCGTTTTTCCAGCTGTCAATAGAAGTTTCGCCGACTTTTTGATAGAACATGTAAATCGATGTGTCATCCGCATTTTTAGGATCTCCGGCTAATGCAAAGACGATGTGGTAGCCGTGATAGTTTGCGACAGTGCCGTCAGCGTTTTGTAATGGCCAGCTGTCCCAAACCTCCAGGCCTTTTGCAGAAGAGATATTTTTAATTGTGGACGAATCGAATTCAGGAACTTGATATTTTTCATTTTTTTGCTGTTCAGGGATTTGCAGCATATCATGGCGTGTAATATGGGAAATGCCGTATGTTTCCTTATATGGCTTTTGGTTCGTTTCTTTCGCAAACGCTTGAGTTGCGCCTCCTGCCAGCAGTGCGGTAGTAAAGGTTAATACTGTTGCTTGTTTTGCAAACTTTTTGATGTTCATCGTTCATGTCTCCTTTTTTATGTACTGTGTTAGCGGTCTGCTTCTTCCAGCCCTCCTGTTTGAAGATGGCAAGTTAGTTACGCACAATAAAAAAAGACCTAAAATATGTAAGGGGTGACGCCAAAGTATACACTTTGCCCTTTACACATTTTAGGTCTTGCCTGCTTTATCAGTAACAAACCCGCGCGATTTACTTTTCGACCTCATTCTATTAGACTCTCGTTTGGATTGCAACTGGTCTATTTTCCTCTTTTGTTTGATAGAAAATCATAAAAGGATTTGCAGACTACGGGCCTAAAGAACTAAAAAATCTATCTGTTTCTTTTCATTCTCTGTATTTTTTATAGTTTCTGTTGCATGGGCATAAAGTTGCCTTTTTAATCACAATTCAGAAAATATCATAATATCTCATTTCACTAAATAATAGTGAACGGCAGGTATATGTGATGGGTTAAAAAGGATCGATCCTCTAGCTAGAGTCGACGTCGACCTGCAGGGGGGGGGGGGAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACTGGCAGAGCATTACGCTGACTTGACGGGACGGCGGCTTTGTTGAATAAATCGAACTTTTGCTGAGTTGAAGGATCAGATCACGCATCTTCCCGACAACGCAGACCGTTCCGTGGCAAAGCAAAAGTTCAAAATCACCAACTGGACTCTAGA

SEQIDNO：6：CACATAGTTCTGCCAGTTGAGGTTGACGTAACCAAAGGCAATTTCTAAAAATTCCTTCACTTCGTGGGTTTCCCCCGTGGCCACCACATAGTCATCGGGCTGTTCCTGTTGCAACATGGCCCACATGGCCCGTACATAGTCCTTGGCATAGCCCCAATCCCGCTTGGAATCGATATTGCCTAAATACAATTTCTTTTGGGTGCCGGCCACAATTCTGGCGATCGCCCTAGTAATTTTCCTGGTTACAAAGGTTTCTCCCCGGCGGGGGGATTCGTGGTTGAACAAAATGCCGTTACAGGCGAATAAGTCATAGGATTCCCGATAGTTCACCGTTTGCCAATGGCCATAAACCTTGGCACAGGCGTAGGGACTGCGGGGATAAAAGGGGGTGGTTTCCTTTTGGGGAATCTCCTGCACTTTGCCGAACATTTCCGAAGAACCGGCTTGATAGAACCTTACTTGGATGCCGGTGCGATGTTGATAATCCCGAATCGCTTCCAATAGTCGTAGCGTCCCCATGGCCACTGAATCTACAGTGTATTCCGGAGAATCAAAGCTCACCCGCACGTGGGATTGGGCCCCCAGATTGTAAATCTCCGTCGGTTTGACATCTTCTAAAATGCGGCGCAGGGTGGTGCCGTCGGTCAGATCACCATAATGAAGTCGGAGTTTCGCCTCAAGATCATGGGGATCAACATAAAGATGATCAATGCGGTCAGTGTTAAAGGTAGAAGTTCGGCGAATGATGCCATGGACTTGGTAGCCCTTTTCCAACAACAATTCACTCAGATAGGAGCCATCTTGCCCCGTGATGCCTGTCAGCAAAACAACTTTAGACTTTGACATTAGTTAATTTTTCCCCATTGCCCCAAAATACATCCCCCTAAAAATATCAGAATCCTTGCCCAGATGCAGGCCTTCTGGCGATCGCCATGGTGAGCAACGATTGCGGCTTTAGCGTTCCAGTGGATATTTGCTGGGGGTTAATGAAACATTGTGGCGGAACCCAGGGACAATGTGACCAAAAAATTCAGGGATATCAATAAGTATTAGGTATATGGATCATAATTGTATGCCCGACTATTGCTTAAACTGACTGACCACTGACCTTAAGAGTAATGGCGTGCAAGGCCCAGTGATCAATTTCATTATTTTTCATTATTTCATCTCCATTGTCCCTGAAAATCAGTTGTGTCGCCCCTCTACACAGCCCAGAACTATGGTAAAGGCGCACGAAAAACCGCCAGGTAAACTCTTCTCAACCCCCAAAACGCCCTCTGTTTACCCATGGAAAAAACGACAATTACAAGAAAGTAAAACTTATGTCATCTATAAGCTTCGTGTATATTAACTTCCTGTTACAAAGCTTTACAAAACTCTCATTAATCCTTTAGACTAAGTTTAGTCAGTTCCAATCTGAACATCGACAAATACATAAGGAATTATAACCAAATG

SEQIDNO：7：TTCCTTGGTGTAATGCCAACTGAATAATCTGCAAATTGCACTCTCCTTCAATGGGGGGTGCTTTTTGCTTGACTGAGTAATCTTCTGATTGCTGATCTTGATTGCCATCGATCGCCGGGGAGTCCGGGGCAGTTACCATTAGAGAGTCTAGAGAATTAATCCATCTTCGATAGAGGAATTATGGGGGAAGAACCTGTGCCGGCGGATAAAGCATTAGGCAAGAAATTCAAGAAAAAAAATGCCTCCTGGAGCATTGAAGAAAGCGAAGCTCTGTACCGGGTTGAGGCCTGGGGGGCACCTTATTTTGCCATTAATGCCGCTGGTAACATAACCGTCTCTCCCAACGGCGATCGGGGCGGTTCGTTAGATTTGTTGGAACTGGTGGAAGCCCTGCGGCAAAGAAAGCTCGGCTTACCCCTATTAATTCGTTTTTCCGATATTTTGGCCGATCGCCTAGAGCGATTGAATAGTTGTTTTGCCAAGGCGATCGCCCGTTACAATTACCCCAACACCTATCAGGCGGTTTATCCGGTCAAATGTAACCAGCAACGACATCTGGTGGAAGCCCTGGTTCGCTTTGGGCAAACTTCCCAGTGTGGA

SEQIDNO：8：TACATATGGACAGTGGCCATGGCGCTCAAT

SEQIDNO：9：CCCTCGAGAAACATTTCGTCAATTAAATGTT

SEQIDNO：10：TTTAAATGGTGATGAACACTGGGGA

SEQIDNO：11：GGGATGACTATGGCGATCGTTGAG

SEQIDNO：12：TGTTTACGCAGTGCCTACATTGA

SEQIDNO：13：CCCATAGGCCTTAGATCGTGTTT

SEQIDNO：14：CACATAGATCTGCCAGTTGAGGT

SEQIDNO：15：GGGCATATGGTTATAATTCCTTATGTATTTG

SEQIDNO：16：TTCCTTGGTGTAATGCCAACTG

SEQIDNO：17：TCCACACTGGGAAGTTTGCC

SEQIDNO：18：GATATCGGCATTTTCTTTTGCGTTTTTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCTTGTTCAAGGATGCTGTCTTTGACAACAGATGTTTTCTTGCCTTTGATGTTCAGCAGGAAGCTTGGCGCAAACGTTGATTGTTTGTCTGCGTAGAATCCTCTGTTTGTCATATAGCTTGTAATCACGACATTGTTTCCTTTCGCTTGAGGTACAGCGAAGTGTGAGTAAGTAAAGGTTACATCGTTAGGATCAAGATCCATTTTTAACACAAGGCCAGTTTTGTTCAGCGGCTTGTATGGGCCAGTTAAAGAATTAGAAACATAACCAAGCATGTAAATATCGTTAGACGTAATGCCGTCAATCGTCATTTTTGATCCGCGGGAGTCAGTGAACAGGTACCATTTGCCGTTCATTTTAAAGACGTTCGCGCGTTCAATTTCATCTGTTACTGTGTTAGATGCAATCAGCGGTTTCATCACTTTTTTCAGTGTGTAATCATCGTTTAGCTCAATCATACCGAGAGCGCCGTTTGCTAACTCAGCCGTGCGTTTTTTATCGCTTTGCAGAAGTTTTTGACTTTCTTGACGGAAGAATGATGTGCTTTTGCCATAGTATGCTTTGTTAAATAAAGATTCTTCGCCTTGGTAGCCATCTTCAGTTCCAGTGTTTGCTTCAAATACTAAGTATTTGTGGCCTTTATCTTCTACGTAGTGAGGATCTCTCAGCGTATGGTTGTCGCCTGAGCTGTAGTTGCCTTCATCGATGAACTGCTGTACATTTTGATACGTTTTTCCGTCACCGTCAAAGATTGATTTATAATCCTCTACACCGTTGATGTTCAAAGAGCTGTCTGATGCTGATACGTTAACTTGTGCAGTTGTCAGTGTTTGTTTGCCGTAATGTTTACCGGAGAAATCAGTGTAGAATAAACGGATTTTTCCGTCAGATGTAAATGTGGCTGAACCTGACCATTCTTGTGTTTGGTCTTTTAGGATAGAATCATTTGCATCGAATTTGTCGCTGTCTTTAAAGACGCGGCCAGCGTTTTTCCAGCTGTCAATAGAAGTTTCGCCGACTTTTTGATAGAACATGTAAATCGATGTGTCATCCGCATTTTTAGGATCTCCGGCTAATGCAAAGACGATGTGGTAGCCGTGATAGTTTGCGACAGTGCCGTCAGCGTTTTGTAATGGCCAGCTGTCCCAAACCTCCAGGCCTTTTGCAGAAGAGATATTTTTAATTGTGGACGAATCGAATTCAGGAACTTGATATTTTTCATTTTTTTGCTGTTCAGGGATTTGCAGCATATCATGGCGTGTAATATGGGAAATGCCGTATGTTTCCTTATATGGCTTTTGGTTCGTTTCTTTCGCAAACGCTTGAGTTGCGCCTCCTGCCAGCAGTGCGGTAGTAAAGGTTAATACTGTTGCTTGTTTTGCAAACTTTTTGATGTTCATCGTTCATGTCTCCTTTTTTATGTACTGTGTTAGCGGTCTGCTTCTTCCAGCCCTCCTGTTTGAAGATGGCAAGTTAGTTACGCACAATAAAAAAAGACCTAAAATATGTAAGGGGTGACGCCAAAGTATACACTTTGCCCTTTACACATTTTAGGTCTTGCCTGCTTTATCAGTAACAAACCCGCGCGATTTACTTTTCGACCTCATTCTATTAGACTCTCGTTTGGATTGCAACTGGTCTATTTTCCTCTTTTGTTTGATAGAAAATCATAAAAGGATTTGCAGACTACGGGCCTAAAGAACTAAAAAATCTATCTGTTTCTTTTCATTCTCTGTATTTTTTATAGTTTCTGTTGCATGGGCATAAAGTTGCCTTTTTAATCACAATTCAGAAAATATCATAATATCTCATTTCACTAAATAATAGTGAACGGCAGGTATATGTGATGGGTTAAAAAGGATCGATCCTCTAGCTAGAGTCGACCTGCATCCCTTAACTTACTTATTAAATAATTTATAGCTATTGAAAAGAGATAAGAATTGTTCAAAGCTAATATTGTTTAAATCGTCAATTCCTGCATGTTTTAAGGAATTGTTAAATTGATTTTTTGTAAATATTTTCTTGTATTCTTTGTTAACCCATTTCATAACGAAATAATTATACTTTTGTTTATCTTTGTGTGATATTCTTGATTTTTTTCTACTTAATCTGATAAGTGAGCTATTCACTTTAGGTTTAGGATGAAAATATTCTCTTGGAACCATACTTAATATAGAAATATCAACTTCTGCCATTAAAAGTAATGCCAATGAGCGTTTTGTATTTAATAATCTTTTAGCAAACCCGTATTCCACGATTAAATAAATCTCATTAGCTATACTATCAAAAACAATTTTGCGTATTATATCCGTACTTATGTTATAAGGTATATTACCATATATTTTATAGGATTGGTTTTTAGGAAATTTAAACTGCAATATATCCTTGTTTAAAACTTGGAAATTATCGTGATCAACAAGTTTATTTTCTGTAGTTTTGCATAATTTATGGTCTATTTCAATGGCAGTTACGAAATTACACCTCTTTACTAATTCAAGGGTAAAATGGCCTTTTCCTGAGCCGATTTCAAAGATATTATCATGTTCATTTAATCTTATATTTGTCATTATTTTATCTATATTATGTTTTGAAGTAATAAAGTTTTGACTGTGTTTTATATTTTTCTCGTTCATTATAACCCTCTTTAATTTGGTTATATGAATTTTGCTTATTAACGATTCATTATAACCACTTATTTTTTGTTTGGTTGATAATGAACTGTGCTGATTACAAAAATACTAAAAATGCCCATATTTTTTCCTCCTTATAAAATTAGTATAATTATAGCACGCGAATTCATCGAATAAATACCTGTGACGGAAGATCACTTCGCAGAATAAATAAATCCTGGTGTCCCTGTTGATACCGGGAAGCCCTGGGCCAACTTTTGGCGAAAATGAGACGTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTCCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGATAATAAGCGGATGAATGGCAGAAATTCGATATC

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

除非特别指明，否则本发明中所使用的分子生物学实验方法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，JohnWiley&Sons，Inc.，1995中所述的方法进行或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。

实施例1：用于表达脂肪酰辅酶A合成酶的载体的构建

为提高蓝细菌中脂肪酰辅酶A合成酶的表达量，如下构建了携带并能够表达slr1609基因的质粒pGQ7。

以1609NdeI(SEQIDNO：8，5′-TACATATGGACAGTGGCCATGGCGCTCAAT-3′)和1609R(SEQIDNO：9，5′-CCCTCGAGAAACATTTCGTCAATTAAATGTT-3′)为引物，以蓝藻PCC6803基因组DNA为模板进行PCR扩增，并根据生产商的说明书，将PCR扩增产物克隆到pMD18-T载体(Takara，CatalogNo.：D101A)中，从而得到质粒pGQ3。经测序验证后，使用NdeI(Takara，CatalogNo.：D1161A)和XhoI(Takara，CatalogNo.：D1094A)酶切质粒pGQ3，并回收约2.1kb的DNA片段。此外，使用NdeI(Takara，CatalogNo.：D1161A)和XhoI(Takara，CatalogNo.：D1094A)酶切质粒pET21b(Novagen)，并回收DNA片段。然后使用连接酶将所获得的两个DNA片段相连，从而得到携带有slr1609基因的质粒pGQ7。质粒pGQ7的基本结构示于图1中，其包含slr1609基因(SEQIDNO：1)。

实施例2：脂肪酰辅酶A合成酶的活性的检测

为确定质粒pGQ7是否能够表达具有功能的脂肪酰辅酶A合成酶，如Hosakaetal.，1979所述，基于以上几个偶联反应来测定质粒pGQ7所表达的蛋白的活性。具体反应体系如下：Tris-HCl(pH7.4)0.1mM，二硫苏糖醇5mM，TritonX-1001.6mM，ATP7.5mM，氯化镁10mM，油酸0.25mM，辅酶A(CoA)1mM，磷酸烯醇丙酮酸钾(PEPK)0.2mM，NADH0.15mM，腺苷酸激酶11U，丙酮酸激酶9U，乳酸脱氢酶(LDH)9U，质粒pGQ7所表达的经纯化的蛋白(ACSL)1.8mM。最后，通过测定NADH在340nm处的光吸收来测定酶的活性。测定结果表明，质粒pGQ7所表达的蛋白具有脂肪酰辅酶A合成酶活性，其以油酸为底物测得的kcat值(每单位时间内每摩尔的酶能够转化的底物的摩尔量)为3.0±0.3/min，K_m值(米氏常数，即，反应速度达到最大反应速度的一半时的底物浓度)为1.10±0.06mM。

实施例3：用于基因敲入和基因敲除的载体的构建

为了证实脂肪酰辅酶A合成酶在蓝细菌生产脂肪醇中的作用，并证实可以通过提高所述酶的表达来提高蓝细菌中脂肪醇的产量，如下构建了用于将由psbA2启动子驱动的脂肪酰辅酶A合成酶基因(slr1609基因)整合入蓝细菌基因组的载体pGQ49，以及用于将蓝细菌中的内源脂肪酰辅酶A合成酶基因(slr1609基因)敲除的载体的pGQ17。

1、载体pXT68的构建

以集胞藻PCC6803基因组DNA为模板，以Pd1-2-f(SEQIDNO：14，5′-CACATAGATCTGCCAGTTGAGGT-3′)和Pd1-2-r(SEQIDNO：15，5′-GGGCATATGGTTATAATTCCTTATGTATTTG-3′)引物进行PCR扩增，并且根据生产商的说明书，将获得的PCR产物克隆到pMD18-T载体(Takara，CatalogNo.：D101A)中，从而得到载体pXT25。经测序验证后，使用PstI(Takara，CatalogNo.：D1073A)酶切质粒pXT25，并使用T4DNA聚合酶(Fermentas，CatalogNo.：EP0061)将末端补平，然后回收4kb的片段。另外，使用EcoRV(TakaraCatalogNo.：D1040A)和XbaI(TakaraCatalogNo.：D1093A)酶切质粒pRL271(ElhaiandWolk，1988)，并使用T4DNA聚合酶将末端补平，然后回收3kb的片段(该片段含有抗性基因)。然后使用连接酶将所获得的两个片段相连接，从而得到质粒pXT62。

以蓝藻PCC6803基因组DNA为模板，以pD1-2d-1(SEQIDNO：16，5′-TTCCTTGGTGTAATGCCAACTG-3′)和pD1-2d-2(SEQIDNO：17，5′-TCCACACTGGGAAGTTTGCC-3′)为引物进行PCR扩增，并且根据生产商的说明书，将获得的PCR产物克隆到pMD18-T载体(Takara，CatalogNo.：D101A)中。然后使用NdeI和SalI(Takara，CatalogNo.：D1161A和D1080A)酶切所获得的载体，并使用T4DNA聚合酶将末端补平。回收最终的DNA片段，并且该片段经自连后得到载体pXT59。

使用XbaI和SphI(Takara，CatalogNo.：D1093A和D1180)酶切载体pXT62，并使用T4DNA聚合酶将末端补平，然后回收4.5kb的片段；使用XbaI酶切载体pXT59，并使用T4DNA聚合酶将末端补平，然后回收3.2kb的片段；然后使用连接酶将所获得的两个片段相连接，从而得到质粒pXT68。质粒pXT68的基本结构示于图2中，其包含基因psbA2的上游片段(SEQIDNO：6，包含psbA2启动子)和下游片段(SEQIDNO：7)，以及卡那霉素抗性基因ck2(SEQIDNO：4)。

2、质粒pGQ49的构建

使用NdeI和XhoI酶切质粒pGQ7，并回收slr1609基因片段，然后将slr1609基因片段插入到同样经NdeI和XhoI酶切的质粒pXT68中，从而得到质粒pGQ49。质粒pGQ49的基本结构示于图3中，其包含基因psbA2的上游片段(SEQIDNO：6，包含psbA2启动子)，slr1609基因(SEQIDNO：1)，卡那霉素抗性基因ck2(SEQIDNO：4)和基因psbA2的下游片段(SEQIDNO：7)，用于将由psbA2启动子驱动的脂肪酰辅酶A合成酶基因(slr1609基因)整合入蓝细菌基因组。

3、质粒pGQ17的构建

以集胞藻PCC6803基因组DNA为模板，分别以1609kuF(SEQIDNO：10，5′-TTTAAATGGTGATGAACACTGGGGA-3′)和1609kuR(SEQIDNO：11，5′-GGGATGACTATGGCGATCGTTGAG-3′)为引物和以1609kdF(SEQIDNO：12，5′-TGTTTACGCAGTGCCTACATTGA-3′)和1609kdR(SEQIDNO：13，5′-CCCATAGGCCTTAGATCGTGTTT-3′)为引物，进行PCR扩增，并且根据生产商的说明书，将获得的PCR产物分别克隆到pMD18-T载体(Takara，CatalogNo.：D101A)中，得到载体pGQ12和pGQ13。用BamHI(Takara，CatalogNo.：D1010A)酶切质粒pRL446(ElhaiandWolk，1988)，然后将获得的DNA片段克隆到经过同样酶切的载体pGQ12中，从而得到载体pGQ14。用DraI(Takara，CatalogNo.：D1037A)和EcoRI(Takara，CatalogNo.：D1040A)酶切载体pGQ14，并回收1.6kb的包含slr1609基因上游片段和ck2基因的DNA片段。该DNA片段经T4DNA聚合酶(Fermentas，CatalogNo.：EP0061)补平末端后，克隆到经过SmaI(Takara，CatalogNo.：D1085A)酶切的载体pGQ13中，从而得到质粒pGQ17。质粒pGQ17的基本结构示于图4中，其包含slr1609基因的上游片段(SEQIDNO：2)，卡那霉素抗性基因ck2(SEQIDNO：4)和slr1609基因的下游片段(SEQIDNO：3)，用于将蓝细菌中的内源脂肪酰辅酶A合成酶基因(slr1609基因)敲除。

实施例4：蓝细菌的转化以及转化体的筛选

如下进行蓝细菌的转化以及转化体的筛选。

1、取处于对数生长期(OD₇₃₀约为0.5～1.0)的蓝细菌细胞10mL，离心收集细胞；用新鲜的BG11培养基洗涤细胞两次，再将细胞重悬于1mLBG11培养基(1.5gL^-1NaNO₃，40mgL^-1K₂HPO₄·3H₂O，36mgL^-1CaCl₂·2H₂O，6mgL^-1柠檬酸，6mgL^-1柠檬酸铁铵，1mgL^-1EDTA二钠盐，20mgL^-1NaCO₃，2.9mgL^-1H₃BO₃，1.8mgL^-1MnCl₂·4H₂O，0.22mgL^-1ZnSO₄·7H₂O，0.39mgL^-1NaMoO₄·2H₂O，0.079mgL^-1CuSO₄·5H₂O和0.01mgL^-1CoCl₂·6H₂O)中。

2、取0.2mL细胞悬液于新的EP管中，加入2～3μg表1中所列的表达质粒，混匀，并置于30℃、30μEm^-2s^-1光照条件下温育5小时。

3、将蓝细菌细胞与DNA的混合物涂布于铺在BG11平板(未加抗生素)上的硝酸纤维素膜上，并置于30℃、30μEm^-2s^-1光照条件下培养24小时。然后，将硝酸纤维素膜转移到含有与目的藻株相应的抗生素(参见表1)的BG11平板上，并在30℃、30μEm^-2s^-1的条件下继续培养。

4、培养大约5～7天后，将转化子从平板上挑出，在新鲜的BG11平板(含相应的抗生素)上划线；待细胞富集后，再将它们接入到液体BG11培养基(含相应的抗生素)中进行培养。

5、将经转化的蓝细菌细胞在液体BG11培养基(含相应的抗生素)中转接两次到三次，并且在通过基因组测序验证目的构建体的正确导入后，将经转化的细胞用于检测脂肪醇的产量。

表1：所使用的藻株及其来源和抗性

藻株的基因型信息

PCC6803：野生型集胞藻PCC6803，葡萄糖耐受的。

Syn-XT14：slr0168::OmegaPrbcfar(jojoba)Trbc：含有由rbc启动子驱动的来源于荷荷芭(jojoba)的FAR基因(整合到slr0168基因所在的位置)，壮观霉素抗性。

GQ5：slr0168::omegaPrbcfar(jojoba)，psbA2::CK2PpsbA2slr1609：含有由rbc启动子驱动的来源于荷荷芭(jojoba)的FAR基因(整合到slr0168基因所在的位置)，壮观霉素抗性，并且含有由psbA2启动子驱动的slr1609基因(整合到psbA2基因所在的位置)，卡那霉素抗性。

GQ6：slr0168::omegaPrbcfar(jojoba)，slr1609::CK2：含有由rbc启动子驱动的来源于荷荷芭(jojoba)的FAR基因(整合到slr0168基因所在的位置)，壮观霉素抗性，并且内源slr1609基因被敲除，卡那霉素抗性。

实施例5：经基因工程改造的蓝细菌的脂肪醇产量

1、实验步骤：

(1)培养方式：摇瓶培养。普通500毫升三角烧瓶，装300mL液体BG11培养基(含与目的藻株相应的抗生素；对于野生型藻株而言，不含抗生素)，初始接种浓度为OD₇₃₀＝0.05，在30℃、30μEm^-2s^-1光照条件下，通空气培养7～8天。

(2)取200mL培养物，离心收集蓝细菌细胞，用10mLTEpH8.0缓冲液重悬细胞，并超声破碎细胞；

(3)向细胞破碎液中，加入30μg十五烷醇作为内标，加入等体积的氯仿∶甲醇溶液(v/v2∶1)，混匀，在室温下静置半小时；

(4)以3,000g低速离心5分钟，回收有机相，并于55℃氮气下吹干；

(5)加入1mL正己烷以溶解沉淀物，用0.22μm滤膜过滤，然后根据制造商的说明书，使用Agilent7890A-5975C系统，利用AgilentHP-INNOWax(30m×250μm×0.25μm)进行GC-MS分析，以测定各种脂肪醇的含量。分析条件如下：载气为氦气，流速为1mL/min；进样口温度为250℃；柱箱升温程序如下：100℃，1分钟；然后以5℃/min升到200℃；然后以25℃/min升到240℃；保持15分钟。

2、实验结果：

我们分别在三株基因工程蓝细菌Syn-XT14、GQ5和GQ6中检测到了十六烷醇和十八烷醇，而在野生型蓝细菌PCC6803中未检测到脂肪醇的产生(参见图5-7)。图5-7分别展示了集胞藻Syn-XT14、GQ6和GQ5细胞中脂肪醇的生产情况，如通过气质联用检测所测定的。

通过参照内标(十五烷醇)，可以计算得到在普通摇瓶培养条件下细胞内脂肪醇的总产量，结果如表2所示。结果显示，游离脂肪酸由slr1609基因编码的脂肪酰辅酶A合成酶催化生成脂肪酰辅酶A，后者进一步作为脂肪酰辅酶A还原酶的底物而转化成脂肪醇。从表2还可以看出，与Syn-XT14的产量相比，GQ5的十六烷醇产量提高了约53％，十八烷醇产量提高了约59％，脂肪醇的总产量提高了约57％。此外，与Syn-XT14的产量相比，GQ6的十六烷醇产量、十八烷醇产量和脂肪醇的总产量均显著下降。这些结果表明，slr1609基因的表达的提高导致蓝细菌中脂肪醇的产量相应得到提高，并且该基因的表达的降低导致蓝细菌中脂肪醇的产量也相应下降。

由此，本发明充分证实了脂肪酰辅酶A合成酶基因在蓝细菌产生脂肪醇中的重要作用，并证实了可以通过提高脂肪酰辅酶A合成酶的表达来提高蓝细菌中脂肪醇的产量，为使用蓝细菌来大规模生产生物燃料脂肪醇提供了有利条件。

表2：所使用的藻株的脂肪醇产量(单位：μg/L/OD)

注：N.D＝不能检测到(Notdetectable)

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，而不背离如广泛描述的本发明的精神或范围。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

生物材料样品保藏信息

本发明所提及的藻株Syn-XT14，Syn-XT34，Syn-XT51和GQ5均由中国科学院青岛生物能源与过程研究所(山东省青岛市崂山区松岭路189号)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter，CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，并且其保藏时间和保藏号如表3所示。

表3：所提及的藻株及其保藏信息

菌株	保藏号	保藏时间
			集胞藻(Synechocystis sp.)Syn-XT14	CGMCC 3894	2010年6月10日
集胞藻(Synechocystis sp.)Syn-XT34	CGMCC 3895	2010年6月10日
			集胞藻(Synechocystis sp.)Syn-XT51	CGMCC 3896	2010年6月10日
集胞藻(Synechocystis sp.)GQ5	CGMCC 4890	2011年5月20日

参考文献

Angermayr，S.A.，K.J.Hellingwerf，P.Lindblad，andM.J.T.deMattos.2009.Energybiotechnologywithcyanobacteria.CurrOpinBiotech.20：257-263；

Atsumi，S.，W.Higashide，andJ.C.Liao.2009.Directphotosyntheticrecyclingofcarbondioxidetoisobutyraldehyde.NatBiotechnol.27：1177-U1142；

Bonner，W.M.1983.CitationClassic-aFilmDetectionMethodforTritium-LabeledProteinsandNucleic-AcidsinPolyacrylamideGels.Cc/LifeSci：16-16；

Cai，Y.P.，andC.P.Wolk.1990.UseofaConditionallyLethalGeneinAnabaenaSp-StrainPcc-7120toSelectforDoubleRecombinantsandtoEntrapInsertionSequences.JournalofBacteriology.172：3138-3145；

Curtiss，R.，X.Y.Liu，andJ.Sheng.2011.Fattyacidproductioningeneticallymodifiedcyanobacteria.PNatlAcadSciUSA.108：6899-6904；

Elhai，J.，andC.P.Wolk.1988.AVersatileClassofPositive-SelectionVectorsBasedontheNonviabilityofPalindrome-ContainingPlasmidsThatAllowsCloningintoLongPolylinkers.Gene.68：119-138；

Fu，P.C.，andJ.Dexter.2009.Metabolicengineeringofcyanobacteriaforethanolproduction.EnergEnvironSci.2：857-864；

Hosaka，K.，M.Mishina，T.Tanaka，T.Kamiryo，andS.Numa.1979.Acyl-Coenzyme-aSynthetase-IfromCandida-Lipolytica-Purification，PropertiesandImmunochemicalStudies.EurJBiochem.93：197-203；

Keasling，J.D.，S.K.Lee，H.Chou，T.S.Ham，andT.S.Lee.2008.Metabolicengineeringofmicroorganismsforbiofuelsproduction：frombugstosyntheticbiologytofuels.CurrOpinBiotech.19：556-563；

Keasling，J.D.，E.J.Steen，Y.S.Kang，G.Bokinsky，Z.H.Hu，A.Schirmer，A.McClure，andS.B.delCardayre.2010.Microbialproductionoffatty-acid-derivedfuelsandchemicalsfromplantbiomass.Nature.463：559-U182；

Liu，X.，S.Fallon，J.Sheng，andR.Curtiss，3rd.2011.CO2-limitation-inducibleGreenRecoveryoffattyacidsfromcyanobacterialbiomass.ProcNatlAcadSciUSA.108：6905-6908；

Marmur，J.，andP.Doty.1962.Determinationofthebasecompositionofdeoxyribonucleicacidfromitsthermaldenaturationtemperature.JMolBiol.5：109-118；

Melis，A.，P.Lindberg，andS.Park.2010.Engineeringaplatformforphotosyntheticisopreneproductionincyanobacteria，usingSynechocystisasthemodelorganism.MetabolicEngineering.12：70-79；

Salih，G.F.，andC.Jansson.1997.ActivationofthesilentpsbA1geneinthecyanobacteriumSynechocystisspstrain6803producesanovelandfunctionalD1protein.PlantCell.9：869-878.

Claims

1.一种用于转化蓝细菌的构建体，其包含：

(1)脂肪酰辅酶A合成酶基因；及

(2)psbA2基因的上游片段和下游片段，所述psbA2基因的上游片段和下游片段分别位于所述脂肪酰辅酶A合成酶基因的上游和下游，

其中所述脂肪酰辅酶A合成酶基因与所述psbA2基因的上游片段内所含的psbA2启动子可操作地连接。

2.权利要求1的构建体，其中所述脂肪酰辅酶A合成酶基因选自：来源于集胞藻PCC6803的slr1609基因，来源于蓝杆藻ATCC51142的cce_1133基因，来源于聚球藻7002的SYNPCC7002_A0675基因，来源于聚球藻PCC6301的syc0624_c基因，来源于聚球藻PCC7942的Synpcc7942_0918基因和来源于鱼腥藻PCC7120的alr3602基因。

3.权利要求1的构建体，其中所述脂肪酰辅酶A合成酶基因由如SEQIDNO：1所示的序列组成。

4.权利要求1的构建体，其中所述蓝细菌是能够产生脂肪醇的蓝细菌，其经基因工程改造而能够表达脂肪酰辅酶A还原酶。

5.权利要求4的构建体，其中所述能够产生脂肪醇的蓝细菌选自：集胞藻Syn-XT14，集胞藻Syn-XT34和集胞藻Syn-XT51。

6.权利要求1的构建体，其中所述构建体还包含用于筛选蓝细菌转化体的标记基因。

7.权利要求6的构建体，其中所述标记基因是卡那霉素抗性基因，红霉素抗性基因或壮观霉素抗性基因。

8.权利要求7的构建体，其中所述标记基因位于所述启动子的上游。

9.权利要求7的构建体，其中所述标记基因位于所述启动子的下游。

10.权利要求1～9中任一项的构建体，其中

所述psbA2基因的上游片段具有如SEQIDNO：6所示的序列；及

所述psbA2基因的下游片段具有如SEQIDNO：7所示的序列。

11.一种载体，其包含权利要求1～10中任一项的构建体。

12.蓝细菌，其包含

权利要求1～10中任一项的构建体、和/或

权利要求11的载体。

13.权利要求12的蓝细菌，所述蓝细菌是能够产生脂肪醇的蓝细菌。

14.权利要求13的蓝细菌，其是于2011年5月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter，CGMCC)的蓝细菌GQ5，其保藏号为CGMCC4890。

15.一种试剂盒，其包含2种构建体，其中

第1构建体是权利要求1～10中任一项的构建体，并且

第2构建体包含与在蓝细菌中具有活性的启动子可操作地连接的脂肪酰辅酶A还原酶基因。

16.权利要求15的试剂盒，其中所述第2构建体所包含的启动子是组成型启动子或诱导型启动子。

17.权利要求15的试剂盒，其中所述第2构建体所包含的启动子是psbA2启动子，rbc启动子，petE启动子，cmp启动子，sbt启动子或trc启动子。

18.权利要求15的试剂盒，其中所述脂肪酰辅酶A还原酶基因选自：来源于荷荷芭的far基因；来源于拟南芥的at3g11980基因；来源于小鼠的far1基因；密码子经过优化的来源于小鼠的far1基因；来源于小鼠的far2基因；来源于拟南芥的at3g56700基因；来自弗兰克氏菌(Frankiasp.)CcI3的Francci3_2276基因；来自嗜根库克菌(Kocuriarhizophila)DC2201的KRH_18580基因；来自海洋放线细菌(Actinobacterium)PHSC20C1的A20C1_04336基因；来自HahellachejuensisKCTC2396的HCH_05075基因；来自水油海杆菌(Marinobacteraquaeolei)VT8的Maqu_2220基因；和来自海洋杆菌(Oceanobactersp.)RED65的RED65_09889基因。

19.权利要求15的试剂盒，其中所述第2构建体还包含用于筛选蓝细菌转化体的标记基因。

20.权利要求19的试剂盒，其中所述用于筛选蓝细菌转化体的标记基因是卡那霉素抗性基因，红霉素抗性基因或壮观霉素抗性基因。

21.权利要求19的试剂盒，其中所述第2构建体包含的标记基因与第1构建体包含的标记基因不同。

22.一种试剂盒，其包含2种载体，其中

第1载体包含权利要求15～21中任一项所定义的第1构建体，并且

第2载体包含权利要求15～21中任一项所定义的第2构建体。

23.一种蓝细菌，其

包含：

权利要求15～21中任一项所定义的第1构建体、和/或

权利要求22所定义的第1载体，并且

包含：

权利要求15～21中任一项所定义的第2构建体、和/或

权利要求22所定义的第2载体。

24.在能够产生脂肪醇的蓝细菌中提高脂肪醇产量的方法，其包括将权利要求1～10中任一项的构建体和/或权利要求11的载体导入所述蓝细菌中。

25.权利要求24的方法，其中所述能够产生脂肪醇的蓝细菌是这样的细菌，其经基因工程改造而能够表达脂肪酰辅酶A还原酶。

26.权利要求24的方法，其中所述能够产生脂肪醇的蓝细菌选自：集胞藻Syn-XT14，集胞藻Syn-XT34和集胞藻Syn-XT51。

27.权利要求24的方法，其中将所述构建体整合入所述蓝细菌的基因组内。

28.在蓝细菌中生产脂肪醇的方法，所述方法包括：

(1)将权利要求15～21中任一项所定义的第1构建体和/或权利要求22所定义的第1载体，以及权利要求15～21中任一项所定义的第2构建体和/或权利要求22所定义的第2载体导入蓝细菌；和

(2)培养步骤(1)获得的蓝细菌，并从培养物中获得脂肪醇。

29.权利要求28的方法，其中所述蓝细菌是集胞藻PCC6803。

30.权利要求28的方法，其中将第1构建体和/或第2构建体整合入所述蓝细菌的基因组内。

31.权利要求28的方法，其中步骤(1)获得的蓝细菌是于2011年5月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的蓝细菌GQ5，其保藏号为CGMCC4890。

32.权利要求1～10中任一项的构建体和/或权利要求11的载体在能够产生脂肪醇的蓝细菌中提高脂肪醇产量的用途。

33.权利要求15～22中任一项的试剂盒在制备能够产生脂肪醇的蓝细菌中的用途。