CN116064352A - 高产1,3-丙二醇的克雷伯氏工程菌构建方法及应用 - Google Patents

高产1,3-丙二醇的克雷伯氏工程菌构建方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116064352A
CN116064352A CN202211268738.7A CN202211268738A CN116064352A CN 116064352 A CN116064352 A CN 116064352A CN 202211268738 A CN202211268738 A CN 202211268738A CN 116064352 A CN116064352 A CN 116064352A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
delta
klebsiella
pdu
propanediol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211268738.7A
Other languages
English (en)
Inventor
魏东
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Advanced Research Institute of CAS
Original Assignee
Shanghai Advanced Research Institute of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Advanced Research Institute of CAS filed Critical Shanghai Advanced Research Institute of CAS
Priority to CN202211268738.7A priority Critical patent/CN116064352A/zh
Publication of CN116064352A publication Critical patent/CN116064352A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/26—Klebsiella (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01001—Alcohol dehydrogenase (1.1.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01028—Propanediol dehydratase (4.2.1.28)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/22—Klebsiella
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于环境微生物技术领域，特别是涉及高产1,3‑丙二醇的克雷伯氏工程菌构建方法及应用。本发明利用生物技术失活克雷伯氏菌二醇脱水酶、乳酸脱氢酶、乙醇脱氢酶等酶的活性。构建的工程菌进行1,3‑丙二醇发酵时，1,3‑丙二醇的产量和转化率提高，副产物乳酸和乙醇的生成量减少。本发明提供的方法构建的工程菌遗传性能稳定，1,3‑丙二醇合成性能良好，副产物产量减少，是一项比较有应用价值的克雷伯氏工程菌构建方法。

Description

高产1,3-丙二醇的克雷伯氏工程菌构建方法及应用
技术领域
本申请为申请号2020101696453发明专利的分案申请，原申请的申请日为2020年03年12日，发明创造名称为一种提高1,3-丙二醇产量的克雷伯氏工程菌构建方法及应用。本发明涉及环境微生物技术领域，特别是涉及高产1,3-丙二醇的克雷伯氏工程菌构建方法及应用。
背景技术
1,3-丙二醇是一种重要的大宗化学品，在化妆品、食品、润滑剂和医药等行业均有广泛应用，尤其作为单体与对苯二甲酸聚合形成聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)。PTT具有良好的性能，在服装行业、地毯行业、工程热塑料行业被大量应用，从而带动1,3-丙二醇的市场需求量。
生物法合成1,3-丙二醇的技术主要集中在两个方向，其中一个是葡萄糖为底物，另一个为甘油为底物。在代谢甘油合成1,3-丙二醇的系列微生物中，克雷伯氏菌(包括克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)和克雷伯氏产酸杆菌(Klebsiella oxytoca))是一类兼性厌氧菌、具有发酵操作简单、1,3-丙二醇的合成量和转化率较高等的优势，因此，克雷伯氏菌是一类最有前景应用于工业化生产1,3-丙二醇的菌株。
克雷伯氏菌代谢甘油合成1,3-丙二醇的途径包括氧化支路和还原支路。在氧化支路，甘油经甘油脱氢酶、二羟基丙酮激酶的催化生成磷酸二羟基丙酮，之后进入糖酵解途径，生成乙醇、乳酸、琥珀酸、乙酸、2,3-丁二醇等副产物。副产物的生成降低了底物的转化率，同时不利后续工艺1,3-丙二醇产品的提取。在还原支路，甘油在甘油脱水酶(DhaB)的作用下合成3-羟基丙醛，然后由1,3-丙二醇氧化还原酶催化生成1,3-丙二醇。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种提高1,3-丙二醇产量的克雷伯氏工程菌及其构建方法及应用，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种克雷伯氏工程菌，为二醇脱水酶相关基因被敲除的克雷伯氏工程菌。
优选的，所述二醇脱水酶相关基因选自二醇脱水酶基因和/或二醇脱水酶活化因子基因。
更优选的，所述二醇脱水酶基因选自pduC、pduD、pduE中的一个或多个基因；所述二醇脱水酶活化因子基因选自pduG、pduH中的一个或多个基因。
优选的，所述克雷伯氏工程菌中乳酸脱氢酶基因和/或乙醇脱氢酶基因亦被敲除。
更优选的，所述乳酸脱氢酶基因为ldhA基因。
更优选的，所述乙醇脱氢酶基因为adhE基因。
所述克雷伯氏工程菌K.pΔpduΔldhΔadh发酵30小时1,3-丙二醇的产量、转化率均较未改造的克雷伯氏菌分别提高了25.8％，10.3％；K.oΔpduΔldhΔadh发酵30小时1,3-丙二醇的产量、转化率均较未改造的克雷伯氏菌分别提高了22.11％，7.97％。
本发明第二方面提供一种构建克雷伯氏工程菌的方法，所述方法包括以下步骤：将二醇脱水酶相关基因敲除。
优选的，所述二醇脱水酶相关基因敲除选自二醇脱水酶基因和/或二醇脱水酶活化因子基因。
优选的，所述方法还包括敲除乳酸脱氢酶基因和/或乙醇脱氢酶基因。
本发明第三方面提供一种克雷伯氏工程菌在发酵生产1,3-丙二醇方面的应用。
本发明的克雷伯氏工程菌生产1,3-丙二醇的方法包括如下步骤：
1)将克雷伯氏菌株接种到种子培养基中扩大培养；
2)将步骤1)的克雷伯氏工程菌接种到发酵培养基发酵。
进一步的，所述发酵培养基为含甘油的发酵培养基，
更进一步的，所述发酵培养基中甘油的初始浓度为20-50g/L。
进一步的，发酵过程中甘油浓度控制在10-30g/L。
进一步的，发酵过程中pH值控制在6.5-7.5。
进一步的，发酵温度控制在30-40℃。
进一步的，发酵过程中进行搅拌，搅拌速度控制在100-300rpm。
进一步的，发酵过程中向发酵罐中通气，通气量控制在1-4L/min。
更进一步的，通入的气体为空气。
如上所述，本发明的提高1,3-丙二醇产量的克雷伯氏工程菌的构建方法及应用，具有以下有益效果：构建的工程菌遗传性能稳定，合成1,3-丙二醇的产量、转化率明显提高，副产物乳酸和乙醇的生成量减少，是一株比较有应用前景的工程菌。本发明提供的克雷伯氏工程菌的构建方法比较有应用价值。
附图说明
图1显示为本发明的实施例1中引物pdu验-s和pdu验-a验证敲除二醇脱水酶编码基因。
图2显示为本发明的实施例2中引物pduGH验-s和pduGH验-a验证敲除二醇脱水酶活化因子编码基因。
图3显示为本发明的实施例3中引物ldh验-s和ldh验-a验证敲除乳酸脱氢酶编码基因。
图4显示为本发明的实施例4中引物adh验-s和adh验-a验证敲除乙醇脱氢酶编码基因。
具体实施方式
本发明第一方面提供一种克雷伯氏工程菌，所述克雷伯氏工程菌为二醇脱水酶相关基因被敲除的克雷伯氏工程菌。
所述克雷伯氏工程菌为野生型克雷伯氏肺炎杆菌或野生型克雷伯氏产酸杆菌中的二醇脱水酶相关基因被敲除的克雷伯氏工程菌。
所述野生型克雷伯氏肺炎杆菌可以选自：克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366。
所述野生型克雷伯氏产酸杆菌可以选自：克雷伯氏产酸杆菌M5a1。
进一步的，所述二醇脱水酶相关基因选自二醇脱水酶基因和/或二醇脱水酶活化因子基因。
进一步的，所述二醇脱水酶基因选自pduC、pduD、pduE中的一个或多个；
进一步的，敲除二醇脱水酶基因可以选择以下方式敲除：
1)敲除pduC；
2)敲除pduD；
3)敲除pduE；
4)敲除pduC、pduD；
5)敲除pduC、pduE；
6)敲除pduD、pduE；
7)敲除pduC、pduD、pduE。
进一步的，所述二醇脱水酶活化因子基因选自pduG、pduH中的一个或多个；
进一步的，敲除二醇脱水酶相关基因时可以选择以下方式敲除：
1)敲除pduC、pduD、pduE、pduG、pduH；
2)敲除pduG、pduH；
3)敲除pduC、pduD和pduE中的任一基因与pduG、pduH中的任一基因；
4)敲除pduC、pduD和pduE中的任二个基因与pduG、pduH中的任一基因；
5)敲除pduC、pduD和pduE中的任二个基因与pduG、pduH；
6)敲除pduC、pduD、pduE三个基因与pduG、pduH中的任一基因。
进一步的，所述二醇脱水酶是指催化甘油脱水生成3-羟基丙醛的酶，由三个基因共同编码，基因名称分别为：pduC、pduD、pduE。
所述pduC、pduD、pduE的基因阅读框可以通过现有的数据库(如NCBI)查询，也可以经过测序得到。
例如，经测序可知在克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366中，pduC的基因阅读框如SEQID NO.1所示，pduD的基因阅读框如SEQ ID NO.2所示，pduE的基因阅读框如SEQ ID NO.3所示。
进一步的，所述的二醇脱水酶活化因子是指活化二醇脱水酶活性的酶，由两个基因共同编码，基因名称分别为：pduG、pduH。
所述pduG、pduH的基因阅读框可以通过现有的数据库(如NCBI)查询，也可以经过测序得到。
例如，经测序可知在克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366中，pduG的基因阅读框如SEQID NO.4所示，pduH的基因阅读框如SEQ ID NO.5所示。
进一步的，所述克雷伯氏工程菌中，乳酸脱氢酶基因和/或乙醇脱氢酶基因亦被敲除。进一步敲除乳酸脱氢酶基因和/或乙醇脱氢酶基因后，克雷伯氏工程菌的1,3-丙二醇产量进一步提高。
更进一步的，所述乳酸脱氢酶是指催化丙酮酸还原成乳酸的酶，其基因名称ldhA。
所述ldhA的基因阅读框可以通过现有的数据库(如NCBI)查询，也可以经过测序得到。
例如，经测序可知所述乳酸脱氢酶基因在克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366中基因阅读框如SEQ ID NO.6所示。
进一步的，所述乙醇脱氢酶是指催化乙醛生成乙醇的酶，其基因名称adhE。
所述adhE的基因阅读框可以通过现有的数据库(如NCBI)查询，也可以经过测序得到。
例如，经测序可知所述乙醇脱氢酶基因在克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366中基因阅读框如SEQ ID NO.7所示。
所述克雷伯氏工程菌K.pΔpduΔldhΔadh发酵30小时1,3-丙二醇的产量、转化率均较未改造的初始克雷伯氏菌分别至少提高了13.825.8％，5.3710.3％。；克雷伯氏工程菌K.oΔpduΔldhΔadh发酵30小时1,3-丙二醇的产量、转化率均较未改造的克雷伯氏菌分别提高了22.11％，7.97％；
所述克雷伯氏工程菌1,3-丙二醇的产量、转化率按照以下方法检测所得：
1)将构建的克雷伯氏菌株与初始菌株分别接种到装有50mL种子培养基的250mL三角烧瓶内，接种量为种子培养基体积的1％，37℃，200rpm的摇床上培养12h。
2)将步骤1)的50mL克雷伯氏工程菌接种到含3L发酵培养基的发酵罐中，37℃，通空气量2L/min，转速200rpm，进行连续发酵合成1,3-丙二醇，发酵过程中用30％的NaOH溶液调节pH值为6.8。
3)发酵过程每隔一段时间取一定量的发酵液，用高效液相色谱法(选用Bio-Rad公司的Aminex HPX-87H色谱柱，检测器为日本岛津公司的RID-20A型示差检测器，流动相0.005mol/L的H2SO4，流速0.8mL/min，柱温箱温度65℃，进样体积一般20μL)测定发酵液中底物甘油的消耗量，发酵罐内甘油若消耗完，以浓度为75％(g/g)的甘油水溶液进行补料。发酵30h结束，高效液相色谱法检测底物甘油的消耗量以及产物1,3-丙二醇的生成量。
4)根据公式①计算转化率，根据公式②计算转化率和1,3-丙二醇产量的提高率。
转化率(％)＝30h的发酵液中1,3-丙二醇的浓度(g/L)*发酵液的体积(L)/[发酵培养基初始甘油的浓度(g/L)*培养基的体积(L)+补料的浓度(g/L)*补料消耗的体积(L)－发酵30h的发酵液中残留甘油的浓度(g/L)*发酵液的体积(L)]*100％  ①
提高率(％)＝[c(工程)-c(初始)]/c(初始)×100％  ②
其中，c(工程)是指克雷伯氏工程菌的转化率或产生的1,3-丙二醇的浓度(g/L)，c(初始)是指初始克雷伯氏菌即未经改造的菌株的转化率或产生的1,3-丙二醇的浓度。
本发明第二方面提供一种构建克雷伯氏工程菌的方法，所述方法包括如下步骤：将二醇脱水酶相关基因敲除。
进一步的，所述二醇脱水酶相关基因选自二醇脱水酶基因和/或二醇脱水酶活化因子基因。
更进一步的，所述方法还包括敲除乳酸脱氢酶基因和/或乙醇脱氢酶基因。
更进一步的，所述方法还包括以下中的一项或多项：
1)所述二醇脱水酶基因选自pduC、pduD、pduE中的一个或多个基因；
2)所述二醇脱水酶活化因子基因选自pduG、pduH中的一个或多个基因；
3)所述乳酸脱氢酶基因为ldhA基因；
4)所述乙醇脱氢酶基因为adhE基因；
5)采用同源重组的方法敲除基因；
本发明第三方面提供一种克雷伯氏工程菌在发酵生产1,3-丙二醇方面的应用。
本发明的克雷伯氏工程菌生产1,3-丙二醇的方法，包括如下步骤：
1)将克雷伯氏工程菌接种到种子培养基中培养。
2)将步骤1)的克雷伯氏工程菌接种到发酵培养基培养。
进一步的，步骤1)中，克雷伯氏工程菌按照种子培养基体积的0.5％-2％接种。
进一步的，步骤1)中，克雷伯氏工程菌的培养条件为30℃-40℃、100-300rpm培养10-20h.
进一步的，所述种子培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。
进一步的，将步骤1)中的克雷伯氏工程菌全部接种到含发酵培养基的发酵罐里培养。
进一步的，发酵培养基的量为发酵罐容量的50％-80％。
进一步的，所述发酵培养基为含甘油的发酵培养基。所述发酵培养基的成分为磷酸氢二钾0.69g/L，磷酸二氢钾0.25g/L，酵母粉1.5g/L，硫酸铵4.0g/L，硫酸镁0.2g/L。
更进一步的，所述发酵培养基中甘油的初始浓度为20-50g/L。
进一步的，发酵过程中甘油浓度控制在10-30g/L。
进一步的，发酵过程中pH值控制在6.5-7.5。
进一步的，发酵温度控制在30-40℃。
进一步的，发酵过程中进行搅拌，搅拌速度控制在100-300rpm。
进一步的，发酵过程中向发酵罐中通气，通气量控制在1-4L/min。
更进一步的，通入的气体为空气。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1：构建二醇脱水酶失活的克雷伯氏工程菌
本部分敲除二醇脱水酶的编码基因的操作原理和使用的质粒、菌株等材料参见(Wei et.al.Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniaeJournal of Industrial Microbiology&Biotechnology 2012)，具体步骤如下：
1)构建敲除二醇脱水酶编码基因的同源重组片段
根据克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366编码二醇脱水酶的基因序列，设计上下游引物如下：
上游引物pdu-s1：CAACGTGGAAGTCGTGGCGTATAGCT(SEQ ID NO.8)
下游引物pdu-a1：GCGTTGAGGTGGAATACGGTGGC(SEQ ID NO.9)
利用设计的引物pdu-s1和pdu-a1，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366的基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得编码二醇脱水酶的部分基因(包含pduC、pduD、pduE)，通过TA克隆方法连接到pMD-19T simple质粒(商业产品，宝生物工程大连有限公司)上，得到的重组质粒命名为pMD19T-pdu，并由上海生工生物科技有限公司测序验证。
将构建成功的质粒pMD19T-pdu转化菌株DH5α-pIJ790(从NTCC典型培养物保藏中心获得)，得到携带双质粒的菌株DH5α-pIJ790-pMD19T-pdu。
根据携带链霉素抗性基因盒的质粒pIJ778(从NTCC典型培养物保藏中心获得)的基因序列，设计上下游引物：
上游引物pdu-FRT-s1：
CAGGCGCACGTCACCAACGTCAAAGATAACCCGGTACAGATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ IDNO.10)
下游引物pdu-FRT-a1：
AATCGTCGCCTTTGAGTTTTTTACGCTCGACGTACAGCGTTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ IDNO.11)
利用设计的引物pdu-FRT-s1和pdu-FRT-a1，以质粒pIJ778为模板，经PCR扩增，获得链霉素抗性基因盒的片段。
制作菌株DH5α-pIJ790-pMD19T-pdu的感受态细胞，然后用PCR得到并经过清洁回收的链霉素抗性基因盒的片段电转化DH5α-pIJ790-pMD19T-pdu感受态细胞，37℃复苏1h后离心涂布链霉素抗性平板上(链霉素的使用浓度50mg/L)，筛选携带有pMD19T-Δpdu778的阳性菌株。平板上长出菌落后用引物pdu-s1和test778验证(test778：AGAATCTCGCTCTCTCCAGGGGAAG)(SEQ ID NO.12)。如果没有发生重组，则扩增不出来基因片段。如果重组成功，则扩增出来一条约1.0kb的基因片段。将PCR验证重组成功的菌株接种在链霉素抗性的LB试管培养基中培养，提取质粒，质粒命名为pMD19T-Δpdu778。
以构建好的pMD19T-Δpdu778为模板，用引物pdu-s1和pdu-a1在高保真酶KOD的作用下，扩增敲除pdu基因的同源重组片段，得到的片段简记“A”。“A”片段的大小2700bp，两端分别携带约500bp的同源臂，中间为链霉素抗性基因。
2)同源重组敲除克雷伯氏菌二醇脱水酶的编码基因
A、敲除克雷伯氏肺炎杆菌二醇脱水酶的编码基因
克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366菌株(该菌株也称为TUAC01，AC01)，CGMCC1.6366菌株已经在文献(Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology.201239:1219–1226)中公开。该菌株是一株用于生产1,3-丙二醇的菌株。该菌分离自土壤，分离过程及性状描述见(World Journal of Microbiology Biotechnology 2008,24:1731-1740)。
制作克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366的感受态细胞，转化质粒pDK6-red(质粒的构建过程参考文献Wei Dong,Wang Min,Shi Jiping,Hao Jian.Red recombinaseassisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae.Journal of IndustrialMicrobiology&Biotechnology.2012 39:1219–1226)，得到菌株K.p/red。
制作菌株K.p/red的电转化感受态细胞，培养感受态时加入IPTG诱导Red重组酶的表达，加入EDTA提高克雷伯氏菌的电击转化效率。用同源重组片段“A”电击转化K.p/red感受态细胞，复苏后全部涂布在链霉素抗性平板上于37℃过夜培养。待平板上长出单菌落后，用引物pdu验-s和pdu验-a验证[pdu验-s：CGGCGATGTTTACGGCAATGAAG(SEQ ID NO.13)，pdu验-a：CTGGGCCAGCAGCTCAAGGTTAC)(SEQ ID NO.14)]。如果重组成功，则可以扩增出来一条大小为3.0kb的条带，如果没有重组成功，则扩增出来片段的大小为4.0kb，PCR验证的结果见图1。验证正确的PCR产物由上海生工生物科技有限公司测序，进一步确定二醇脱水酶的编码基因是否敲除成功。测序结果验证正确的菌株进行传代培养消除质粒pDK6-red，最终得到的工程菌记为K.pΔpdu778。
B、敲除克雷伯氏产酸杆菌二醇脱水酶的编码基因
克雷伯氏产酸杆菌M5a1是一株广泛应用的克雷伯氏产酸杆菌，很长一段时间内被认为是克雷伯氏肺炎杆菌，所以有的文献中也称为克雷伯氏肺炎杆菌M5a1。
制作克雷伯氏产酸杆菌M5a1的感受态细胞，转化质粒pDK6-red，得到菌株K.o/red。
制作菌株K.o/red的电转化感受态细胞，培养感受态时同样加入IPTG诱导Red重组酶的表达，加入EDTA提高克雷伯氏菌的电击转化效率。用同源重组片段“A”电击转化K.o/red感受态细胞，复苏后全部涂布在链霉素抗性平板上于37℃过夜培养。待平板上长出单菌落后，同样用引物pdu验-s和pdu验-a验证，如果重组成功，则可以扩增出来一条大小为3.0kb的条带，如果没有重组成功，则扩增出来片段的大小为4.0kb。PCR验证正确的PCR产物由上海生工生物科技有限公司测序，进一步确定二醇脱水酶的编码基因是否敲除成功。测序结果验证正确的菌株进行传代培养消除质粒pDK6-red，最终得到的工程菌记为K.oΔpdu778。
3)消除抗性标记基因
A、消除工程菌K.pΔpdu778携带的抗性基因
制作克雷伯氏肺炎杆菌工程菌K.pΔpdu778的感受态细胞，转化质粒pDK6-flp(质粒的构建过程参考文献Wei Dong,Wang Min,Shi Jiping,Hao Jian.Red recombinaseassisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae.Journal of IndustrialMicrobiology&Biotechnology.2012 39:1219–1226)，得到菌株K.pΔpdu778/flp。
传代培养K.pΔpdu778/flp，并加入IPTG诱导质粒pDK6-flp表达FLP重组酶消除抗性标记。传代培养后稀释涂布在无抗LB平板上，选取一定的菌落标记序号并依次接种在链霉素抗性平板上。在链霉素抗性平板上不生长的单菌落用引物pdu验-s和pdu验-a进一步验证。如果携带的抗性基因片段消除成功，扩增的大小为1.1kb，如果没有消除，扩增的大小为3.0kb。PCR大小为1.1kb的产物由上海生工生物科技有限公司测序验证。测序验证正确的菌进行传代培养消除质粒pDK6-flp，最终得到的工程菌K.pΔpdu。
B、消除工程菌K.oΔpdu778携带的抗性基因
制作克雷伯氏产酸杆菌工程菌K.oΔpdu778的感受态细胞，转化质粒pDK6-flp，得到菌株K.oΔpdu778/flp。
传代培养K.oΔpdu778/flp，并加入IPTG诱导质粒pDK6-flp表达FLP重组酶消除抗性标记。传代培养后稀释涂布在无抗LB平板上，选取一定的菌落标记序号并依次接种在链霉素抗性平板上。在链霉素抗性平板上不生长的单菌落用引物pdu验-s和pdu验-a进一步验证。如果携带的抗性基因片段消除成功，扩增的大小为1.1kb，如果没有消除，扩增的大小为3.0kb。PCR大小为1.1kb的产物由上海生工生物科技有限公司测序验证。测序验证正确的菌进行传代培养消除质粒pDK6-flp，最终得到的工程菌K.oΔpdu。
实施例2：构建二醇脱水酶活化因子失活的克雷伯氏工程菌
本部分敲除二醇脱水酶活化因子编码基因的技术方案与实施例1中敲除二醇脱水酶的方法一致，具体步骤如下：
1)构建敲除二醇脱水酶活化因子编码基因的同源重组片段
根据克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366编码二醇脱水酶活化因子的基因序列，设计上下游引物如下：
上游引物pduGH-s1：GCTGCCGATTGTTGACGAAGTGC(SEQ ID NO.15)
下游引物pduGH-a1：CAGGATTTCACTTCGCCTACGAC(SEQ ID NO.16)
利用设计的引物pduGH-s1和pduGH-a1，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366的基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得编码二醇脱水酶活化因子的部分基因(包含pduG、pduH)，通过TA克隆方法连接到pMD-19T simple质粒上，得到的重组质粒命名为pMD19T-pduGH，并由上海生工生物科技有限公司测序验证。
将构建成功的质粒pMD19T-pduGH转化菌株DH5α-pIJ790，得到携带双质粒的菌株DH5α-pIJ790-pMD19T-pduGH。
根据携带安普霉素抗性基因盒的质粒pIJ773(NTCC典型培养物保藏中心)的基因序列，设计上下游引物：
上游引物pduGH-FRT-s1：
GGACCTGCTGGCCGTCGATACCTCGGTGCCGGTGAGCGGATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ IDNO.17)
下游引物pduGH-FRT-a1：
GGAGCAGGAAAGGAATGCCTTCCTCTTCGATACCCAGCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ IDNO.18)
利用设计的引物pduGH-FRT-s1和pduGH-FRT-a1，以质粒pIJ773为模板，经PCR扩增，获得安普霉素抗性基因盒的片段。
制作菌株DH5α-pIJ790-pMD19T-pduGH的感受态细胞，然后用PCR得到并经过清洁回收的安普霉素抗性基因盒的片段电转化DH5α-pIJ790-pMD19T-pduGH感受态细胞，37℃复苏1h后离心涂布安普霉素抗性平板上(安普霉素的使用浓度50mg/L)，筛选携带有pMD19T-ΔpduGH773的阳性菌株。平板上长出菌落后用引物pduGH-s1和test773验证(test773：GCAAATACGGCATCAGTTACC)(SEQ ID NO.19)。如果没有发生重组，则扩增不出来基因片段。如果重组成功，则扩增出来一条约1.0kb的基因片段。将PCR验证重组成功的菌株接种在安普霉素抗性的LB试管培养基中培养，提取质粒，质粒命名为pMD19T-ΔpduGH778。
以构建好的pMD19T-ΔpduGH773为模板，用引物pduGH-s1和pduGH-a1在高保真酶KOD的作用下，扩增敲除pduGH基因的同源重组片段，得到的片段简记“B”。“B”片段的大小2700bp，两端分别携带约500bp的同源臂，中间为安普霉素抗性基因。
2)同源重组敲除克雷伯氏菌二醇脱水酶活化因子的编码基因
A、敲除克雷伯氏肺炎杆菌二醇脱水酶活化因子的编码基因
制作克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366的感受态细胞，转化质粒pDK6-red，得到菌株K.p/red。
制作菌株K.p/red的电转化感受态细胞，培养感受态时加入IPTG诱导Red重组酶的表达，加入EDTA提高克雷伯氏菌的电击转化效率。用同源重组片段“B”电击转化K.p/red感受态细胞，复苏后全部涂布在安普霉素抗性平板上于37℃过夜培养。待平板上长出单菌落后，用引物pduGH验-s和pduGH验-a验证[pduGH验-s：TGCGTAACGTGTTCGGTATTCA(SEQ IDNO.20)，pduGH验-a：GCGGTGCTCCTTATTCGCCATCA)(SEQ ID NO.21)]。如果重组成功，则可以扩增出来一条大小为3.0kb的条带，如果没有重组成功，则扩增出来片段的大小为2.5kb，PCR验证的结果见图2。验证正确的PCR产物由上海生工生物科技有限公司测序，进一步确定二醇脱水酶活化因子的编码基因是否敲除成功。测序结果验证正确的菌株进行传代培养消除质粒pDK6-red，最终得到的工程菌记为K.pΔpduGH773。
B、敲除克雷伯氏产酸杆菌二醇脱水酶活化因子的编码基因
制作克雷伯氏产酸杆菌M5a1的感受态细胞，转化质粒pDK6-red，得到菌株K.o/red。
制作菌株K.o/red的电转化感受态细胞，培养感受态时同样加入IPTG诱导Red重组酶的表达，加入EDTA提高克雷伯氏菌的电击转化效率。用同源重组片段“B”电击转化K.o/red感受态细胞，复苏后全部涂布在安普霉素抗性平板上于37℃过夜培养。待平板上长出单菌落后，同样用引物pduGH验-s和pduGH验-a验证，如果重组成功，则可以扩增出来一条大小为3.0kb的条带，如果没有重组成功，则扩增出来片段的大小为2.5kb。PCR验证正确的PCR产物由上海生工生物科技有限公司测序，进一步确定二醇脱水酶活化因子的编码基因是否敲除成功。测序结果验证正确的菌株进行传代培养消除质粒pDK6-red，最终得到的工程菌记为K.oΔpduGH773。
3)消除抗性标记基因
A、消除工程菌K.pΔpduGH773携带的抗性基因
制作克雷伯氏肺炎杆菌工程菌K.pΔpduGH773的感受态细胞，转化质粒pDK6-flp，得到菌株K.pΔpduGH773/flp。
传代培养K.pΔpduGH773/flp，并加入IPTG诱导质粒pDK6-flp表达FLP重组酶消除抗性标记。传代培养后稀释涂布在无抗LB平板上，选取一定的菌落标记序号并依次接种在安普霉素抗性平板上。在安普霉素抗性平板上不生长的单菌落用引物pduGH验-s和pduGH验-a进一步验证。如果携带的抗性基因片段消除成功，扩增的大小为1.1kb，如果没有消除，扩增的大小为3.0kb。PCR大小为1.1kb的产物由上海生工生物科技有限公司测序验证。测序验证正确的菌进行传代培养消除质粒pDK6-flp，最终得到的工程菌K.pΔpduGH。
B、消除工程菌K.oΔpduGH773携带的抗性基因
制作克雷伯氏产酸杆菌工程菌K.oΔpduGH773的感受态细胞，转化质粒pDK6-flp，得到菌株K.oΔpduGH773/flp。
传代培养K.oΔpduGH773/flp，并加入IPTG诱导质粒pDK6-flp表达FLP重组酶消除抗性标记。传代培养后稀释涂布在无抗LB平板上，选取一定的菌落标记序号并依次接种在链霉素抗性平板上。在安普霉素抗性平板上不生长的单菌落用引物pduGH验-s和pduGH验-a进一步验证。如果携带的抗性基因片段消除成功，扩增的大小为1.1kb，如果没有消除，扩增的大小为3.0kb。PCR大小为1.1kb的产物由上海生工生物科技有限公司测序验证。测序验证正确的菌进行传代培养消除质粒pDK6-flp，最终得到的工程菌K.oΔpduGH。
实施例3：构建乳酸脱氢酶失活的克雷伯氏工程菌
本部分敲除乳酸脱氢酶的技术方案与实施例1中敲除二醇脱水酶的方法一致，具体步骤如下：
1)构建敲除乳酸脱氢酶编码基因的同源重组片段
根据克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366编码乳酸脱氢酶的基因序列，设计上下游引物
上游引物ldh-s1：AGAGCGCACAGGACCACTATCCA(SEQ ID NO.22)
下游引物ldh-a1：TCGGCGAGCTTATAGACCAGCGT(SEQ ID NO.23)
利用设计的引物ldh-s1和ldh-a1，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得编码乳酸脱氢酶的基因，通过TA克隆方法连接到pMD-19T simple质粒上，得到的重组质粒命名为pMD19T-ldh，并由上海生工生物科技有限公司测序验证。
将构建成功的质粒pMD19T-ldh转化菌株DH5α-pIJ790，得到携带双质粒的菌株DH5α-pIJ790-pMD19T-ldh。
根据携带安普霉素抗性基因盒的质粒pIJ773的基因序列，设计上下游引物上游引物ldh-FRT-s1：
CCAGCTGCCTAGGGGCCTTACTACGTATGGCGAAGCGTTGGCACCCGCCAAAACCGCCA(SEQ IDNO.24)
下游引物ldh-FRT-a1：
CTTCGTCGAGGTCGGATGTCAAGTGGCCGGTAGTCCGCAAGGAGTGGCGGCTCCGCGAC(SEQ IDNO.25)
利用设计的引物ldh-FRT-s1和ldh-FRT-a1，以质粒pIJ773为模板，经PCR扩增，获得安普霉素抗性基因盒的片段。
制作菌株DH5α-pIJ790-pMD19T-ldh的感受态细胞，然后用PCR得到并经过清洁回收的安普霉素抗性基因盒的片段电转化DH5α-pIJ790-pMD19T-ldh感受态细胞，37℃复苏1h后离心涂布安普霉素抗性平板上，筛选携带有pMD19T-Δldh773的阳性菌株。平板上长出菌落后用引物ldh-s1和test773验证。如果没有发生重组，扩增不出来基因片段。如果重组成功，则扩增出来一条约1.3kb的基因片段。将PCR验证重组成功的菌株接种在安普霉素抗性的LB试管培养基中培养，提取质粒，质粒命名为pMD19T-Δldh773。
以构建好的质粒pMD19T-Δldh773为模板，用引物ldh-s1和ldh-a1在高保真酶KOD的作用下，扩增敲除ldh基因的同源重组片段，得到的片段简记“C”。“C”片段的大小2810bp，两端分别携带约800bp和700bp的同源臂，中间为安普霉素抗性基因。
2)同源重组敲除克雷伯氏工程菌乳酸脱氢酶的编码基因
A、敲除K.pΔpdu乳酸脱氢酶的编码基因
制作K.pΔpdu的感受态细胞，转化质粒pDK6-red，得到菌株K.pΔpdu/red。
制作菌株K.pΔpdu/red的电转化感受态细胞，培养感受态时加入IPTG诱导Red重组酶的表达，加入EDTA提高克雷伯氏菌的电击转化效率。用同源重组片段“C”电击转化K.pΔpdu/red感受态细胞，复苏后全部涂布在安普霉素抗性平板上于37℃过夜培养。待平板上长出单菌落后，用引物ldh验-s和ldh验-a验证[ldh验-s：CCTGTTAAAGCATAGTTGCCAGCCGGAC(SEQ ID NO.26)，ldh验-a：TCGTCAGCTCGATGGTTCGGCGATTGG(SEQ ID NO.27)]。如果重组成功，则可以扩增出来一条大小为3.1kb的条带，如果没有重组成功，则扩增出来片段的大小为2.4kb，PCR验证的结果见图3。验证正确的PCR产物由上海生工生物科技有限公司测序，进一步确定乳酸脱氢酶的编码基因是否敲除成功。测序结果验证正确的菌株进行传代培养消除质粒pDK6-red，最终得到的工程菌记为K.pΔpduΔldh773。
B、敲除K.oΔpdu二醇脱水酶的编码基因
制作K.oΔpdu的感受态细胞，转化质粒pDK6-red，得到菌株K.pΔpdu/red。
制作菌株K.oΔpdu/red的电转化感受态细胞，培养感受态时加入IPTG诱导Red重组酶的表达，加入EDTA提高克雷伯氏菌的电击转化效率。用同源重组片段“C”电击转化K.oΔpdu/red感受态细胞，复苏后全部涂布在安普霉素抗性平板上于37℃过夜培养。待平板上长出单菌落后，用引物ldh验-s和ldh验-a验证。如果重组成功，则可以扩增出来一条大小为3.1kb的条带，如果没有重组成功，则扩增出来片段的大小为2.4kb。验证正确的PCR产物由上海生工生物科技有限公司测序，进一步确定乳酸脱氢酶的编码基因是否敲除成功。测序结果验证正确的菌株进行传代培养消除质粒pDK6-red，最终得到的工程菌记为K.oΔpduΔldh773。
3)消除抗性标记基因
A、消除工程菌K.pΔpduΔldh773携带的抗性基因
制作克雷伯氏肺炎杆菌工程菌K.pΔpduΔldh773的感受态细胞，转化质粒pDK6-flp，得到菌株K.pΔpduΔldh773/flp。
传代培养K.pΔpduΔldh773/flp，并加入IPTG诱导质粒pDK6-flp表达FLP重组酶消除抗性标记。传代培养后稀释涂布在无抗LB平板上，选取一定的菌落标记序号并依次接种在安普霉素抗性平板上。在安普霉素抗性平板上不生长的单菌落用引物ldh验-s和ldh验-a进一步验证。如果携带的抗性基因片段消除成功，扩增的大小为1.5kb，如果没有消除，扩增的大小为3.1kb。PCR大小为1.5kb的产物由上海生工生物科技有限公司测序验证。测序验证正确的菌进行传代培养消除质粒pDK6-flp，最终得到的工程菌K.pΔpduΔldh。
B、消除工程菌K.oΔpduΔldh773携带的抗性基因
制作K.oΔpduΔldh773的感受态细胞，转化质粒pDK6-flp，得到菌株K.oΔpduΔldh773/flp。
传代培养K.oΔpduΔldh773/flp，并加入IPTG诱导质粒pDK6-flp表达FLP重组酶消除抗性标记。传代培养后稀释涂布在无抗LB平板上，选取一定的菌落标记序号并依次接种在安普霉素抗性平板上。在安普霉素抗性平板上不生长的单菌落用引物ldh验-s和ldh验-a进一步验证。如果携带的抗性基因片段消除成功，扩增的大小为1.5kb，如果没有消除，扩增的大小为3.1kb。PCR大小为1.5kb的产物由上海生工生物科技有限公司测序验证。测序验证正确的菌进行传代培养消除质粒pDK6-flp，最终得到的工程菌K.oΔpduΔldh。
实施例4：构建乙醇脱氢酶失活的克雷伯氏工程菌
本部分敲除乙醇脱氢酶的技术方案与实施例1敲除二醇脱水酶的方法一致，具体步骤如下：
1)构建敲除乙醇脱氢酶编码基因的同源重组片段
根据克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366编码乙醇脱氢酶的基因序列，设计上下游引物：
上游引物adh-s1：GCAGCATCATCAAAATTGGCGGTTGAC(SEQ ID NO.28)
下游引物adh-a1：GTGCTTTGCTATGGCTTGCGGACAGAC(SEQ ID NO.29)
利用设计的引物adh-s1和adh-a1，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得编码乙醇脱氢酶的基因，通过TA克隆方法连接到pMD-19T simple质粒上，得到的重组质粒命名为pMD19T-adh，并由上海生工生物科技有限公司测序验证。
将构建成功的质粒pMD19T-adh转化菌株DH5α-pIJ790，得到携带双质粒的菌株DH5α-pIJ790-pMD19T-adh。
根据携带链霉素抗性基因盒的质粒pIJ778的基因序列，设计上下游引物
上游引物adh-FRT-s1：
CAGTTTCACTCAAGAACAAGTCGACAAAATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.30)
下游引物adh-FRT-a1：
CGACCGTAGTAGGTATCCAGCAGGATCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.31)
利用设计的引物adh-FRT-s1和adh-FRT-a1，以质粒pIJ778为模板，经PCR扩增，获得链霉素抗性基因盒的片段。
制作菌株DH5α-pIJ790-pMD19T-adh的感受态细胞，然后用PCR得到并经过清洁回收的链霉素抗性基因盒的片段电转化DH5α-pIJ790-pMD19T-adh感受态细胞，37℃复苏1h后离心涂布链霉素抗性平板上，筛选携带有pMD19T-Δadh778的阳性菌株。平板上长出菌落后用引物adh-s1和test778验证。如果没有发生重组，扩增不出来基因片段。如果重组成功，则扩增出来一条约1.3kb的基因片段。将PCR验证重组成功的菌株接种在链霉素抗性的LB试管培养基中培养，提取质粒，质粒命名为pMD19T-Δadh778。
以构建好的质粒pMD19T-Δadh778为模板，用引物adh-s1和adh-a1在高保真酶KOD的作用下，扩增敲除adh基因的同源重组片段，得到的片段简记“D”。“D”片段的大小2.5kb，两端分别携带约600bp和500bp的同源臂，中间为链霉素抗性基因。
2)同源重组敲除克雷伯氏工程菌乙醇脱氢酶的编码基因
A、敲除K.pΔpduΔldh乙醇脱氢酶的编码基因
制作K.pΔpduΔldh的感受态细胞，转化质粒pDK6-red，得到菌株K.pΔpduΔldh/red。
制作菌株K.pΔpduΔldh/red的电转化感受态细胞，培养感受态时加入IPTG诱导Red重组酶的表达，加入EDTA提高克雷伯氏菌的电击转化效率。用同源重组片段“D”电击转化K.pΔpduΔldh/red感受态细胞，复苏后全部涂布在链霉素抗性平板上于37℃过夜培养。待平板上长出单菌落后，用引物adh验-s和adh验-a验证[adh验-s：GTTAACCAGGGCAAATAAGCCGATG(SEQ ID NO.32)，adh验-a：CGATTCACTGCGTGCTGGTGGATGA(SEQ IDNO.33)]。如果重组成功，则可以扩增出来一条大小为2.9kb的条带，如果没有重组成功，则扩增出来片段的大小为1.8kb，PCR验证的结果见图4。验证正确的PCR产物由上海生工生物科技有限公司测序，进一步确定乙醇脱氢酶的编码基因是否敲除成功。测序结果验证正确的菌株进行传代培养消除质粒pDK6-red，最终得到的工程菌记为K.pΔpduΔldhΔadh778。
B、敲除K.oΔpduΔldh乙醇脱氢酶的编码基因
制作K.oΔpduΔldh的感受态细胞，转化质粒pDK6-red，得到菌株K.oΔpduΔldh/red。
制作菌株K.oΔpduΔldh/red的电转化感受态细胞，培养感受态时加入IPTG诱导Red重组酶的表达，加入EDTA提高克雷伯氏菌的电击转化效率。用同源重组片段“D”电击转化K.oΔpduΔldh/red感受态细胞，复苏后全部涂布在链霉素抗性平板上于37℃过夜培养。待平板上长出单菌落后，用引物adh验-s和adh验-a验证。如果重组成功，则可以扩增出来一条大小为2.9kb的条带，如果没有重组成功，则扩增出来片段的大小为1.8kb。验证正确的PCR产物由上海生工生物科技有限公司测序，进一步确定乙醇脱氢酶的编码基因是否敲除成功。测序结果验证正确的菌株进行传代培养消除质粒pDK6-red，最终得到的工程菌记为K.oΔpduΔldhΔadh778。
3)消除抗性标记基因
A、消除工程菌K.pΔpduΔldhΔadh778携带的抗性基因
制作克雷伯氏肺炎杆菌工程菌K.pΔpduΔldhΔadh778的感受态细胞，转化质粒pDK6-flp，得到菌株K.pΔpduΔldhΔadh778/flp。
传代培养K.pΔpduΔldhΔadh778/flp，并加入IPTG诱导质粒pDK6-flp表达FLP重组酶消除抗性标记。传代培养后稀释涂布在无抗LB平板上，选取一定的菌落标记序号并依次接种在链霉素抗性平板上。在链霉素抗性平板上不生长的单菌落用引物adh验-s和adh验-a进一步验证。如果携带的抗性基因片段消除成功，扩增的大小为1.4kb，如果没有消除，扩增的大小为2.9kb。PCR大小为1.4kb的产物由上海生工生物科技有限公司测序验证。测序验证正确的菌进行传代培养消除质粒pDK6-flp，最终得到的工程菌K.pΔpduΔldhΔadh。
B、消除工程菌K.oΔpduΔldhΔadh778携带的抗性基因
制作克雷伯氏肺炎杆菌工程菌K.oΔpduΔldhΔadh778的感受态细胞，转化质粒pDK6-flp，得到菌株K.oΔpduΔldhΔadh778/flp。
传代培养K.oΔpduΔldhΔadh778/flp，并加入IPTG诱导质粒pDK6-flp表达FLP重组酶消除抗性标记。传代培养后稀释涂布在无抗LB平板上，选取一定的菌落标记序号并依次接种在链霉素抗性平板上。在链霉素抗性平板上不生长的单菌落用引物adh验-s和adh验-a进一步验证。如果携带的抗性基因片段消除成功，扩增的大小为1.4kb，如果没有消除，扩增的大小为2.9kb。PCR大小为1.4kb的产物由上海生工生物科技有限公司测序验证。测序验证正确的菌进行传代培养消除质粒pDK6-flp，最终得到的工程菌K.oΔpduΔldhΔadh。
实施例5：克雷伯氏菌及构建的工程菌进行发酵实验
将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366(简记为K.p)、克雷伯氏产酸杆菌M5a1(简记为K.o)和实施例1-4中获得的工程菌：K.pΔpdu、K.pΔpduGH、K.pΔpduΔldh、K.pΔpduΔldhΔadh、K.oΔpdu、K.oΔpduGH、K.oΔpduΔldh、K.oΔpduΔldhΔadh在5L的发酵罐进行连续补料发酵，考察菌株合成1,3-丙二醇的性能。每个菌株重复3批次的发酵。
将上述菌株分别接种到装有50mL种子培养基的250mL三角烧瓶内，按着1％(体积)的比例接种，于37℃，200rpm的摇床上培养12h，培养结束后得到的种子接种发酵罐。
种子培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。
将培养好的种子接种到5L的发酵罐中进行1,3-丙二醇发酵。发酵罐中配置3L的发酵培养基，50mL的种子液全部接种。控制发酵罐的温度37℃，通空气量2L/min，转速200rpm，发酵过程中用30％的NaOH溶液调节pH值为6.8。发酵过程每隔一段时间取一定量的发酵液进行分析。用分光光度计测定菌体的生长情况，高效液相色谱测定发酵液中底物甘油的消耗量以及产物1,3-丙二醇、副产物乳酸和乙醇的生成量。同时在发酵罐内甘油消耗完之后，以灭菌的浓度为75％(g/g)的甘油水溶液进行补料。补料不易过快，需要结合罐体内甘油的残留量进行控制，一般补料初期控制发酵液中甘油的浓度为10g/L。发酵30h结束，1,3-丙二醇的产量、乳酸、乙醇以及转化率的结果见表1。
发酵培养基组成：磷酸氢二钾0.69g/L，磷酸二氢钾0.25g/L，酵母粉1.5g/L，硫酸铵4.0g/L，硫酸镁0.2g/L，甘油30.0g/L。
表1克雷伯氏菌及工程菌发酵结果
Figure BDA0003894195080000181
转化率(％)＝发酵30h的发酵液中1,3-丙二醇的浓度g/L*发酵液的体积L/(发酵培养基初始甘油的浓度g/L*培养基的体积L+补料的浓度g/L*补料消耗的体积L－发酵30h的发酵液中残留甘油的浓度g/L*发酵液的体积)*100
从表1可以看出：
与初始菌株K.p相比，敲除二醇脱水酶的工程菌K.pΔpdu发酵30h后1,3-丙二醇的产量达到63.65g/L，比K.p合成1,3-丙二醇的产量提高了14.19％；副产物乳酸的产量为15.84g/L，比K.p合成乳酸的产量减少了45.99％；副产物乙醇的产量为3.09g/L，比K.p合成乙醇的产量减少了56.11％；K.pΔpdu代谢甘油合成1,3-丙二醇的转化率为46.16％，比K.p的转化率提高了6.9％；K.pΔpdu的发酵结果说明在克雷伯氏肺炎杆菌中敲除二醇脱水酶编码基因能够明显提高菌株合成1,3-丙二醇的性能，同时减少副产物乳酸和乙醇的生成。
同样与初始菌株K.p相比，敲除二醇脱水酶活化因子的工程菌K.pΔpduGH发酵30h后1,3-丙二醇的产量达到58.82g/L，比K.p合成1,3-丙二醇的产量提高了5.52％；副产物乳酸的产量为24.56g/L，比K.p合成乳酸的产量减少了16.26％；副产物乙醇的产量为5.61g/L，比K.p合成乙醇的产量减少了20.31％；K.pΔpduGH代谢甘油合成1,3-丙二醇的转化率为42.13％，比K.p的转化率提高了2.87％；K.pΔpduGH的发酵结果说明在克雷伯氏肺炎杆菌中敲除二醇脱水酶活化因子的编码基因同样能够提高菌株合成1,3-丙二醇的性能，但是该菌合成1,3-丙二醇的产量低于K.pΔpdu。
在工程菌K.pΔpdu上，进一步敲除乳酸脱氢酶编码基因，得到的工程菌K.pΔpduΔldh发酵30h后，1,3-丙二醇的产量达到68.07g/L，比K.p合成1,3-丙二醇的产量提高了22.12％；副产物乳酸不再合成；副产物乙醇的产量为3.18g/L，比K.p合成乙醇的产量减少了54.82％；K.pΔpduΔldh代谢甘油合成1,3-丙二醇的转化率为48.14％，比K.p的转化率提高了8.88％。K.pΔpduΔldh的发酵结果说明进一步的敲除克雷伯氏肺炎杆菌乳酸脱氢酶编码基因能够继续提高菌株代谢甘油合成1,3-丙二醇的性能，副产物乳酸的合成因为敲除ldh基因被完全阻断。
在工程菌K.pΔpduΔldh上，进一步敲除乙醇脱氢酶编码基因，得到的工程菌K.pΔpduΔldhΔadh发酵30h后，1,3-丙二醇的产量达到70.12g/L，比K.p合成1,3-丙二醇的产量提高了25.80％；副产物乳酸和乙醇均不再合成；K.pΔpduΔldhΔadh代谢甘油合成1,3-丙二醇的转化率为49.56％，比K.p的转化率提高了10.3％。K.pΔpduΔldhΔadh的发酵结果说明进一步的敲除克雷伯氏肺炎杆菌乙醇脱氢酶编码基因能够继续提高菌株代谢甘油合成1,3-丙二醇的性能，副产物乙醇的合成因为敲除adh基因被完全阻断。
与初始菌株K.o相比，敲除二醇脱水酶的工程菌K.oΔpdu发酵30h后，1,3-丙二醇的产量达到54.76g/L，比K.o合成1,3-丙二醇的量提高了13.80％；副产物乳酸的产量为14.12g/L，比K.o合成乳酸的产量减少了47.35％；副产物乙醇的产量为4.1g/L，比K.o合成乙醇的产量减少了46.05％；K.oΔpdu代谢甘油合成1,3-丙二醇的转化率为40.6％，比K.p的转化率提高了5.37％；K.oΔpdu的发酵结果说明在克雷伯氏产酸杆菌中敲除二醇脱水酶基因能够明显提高菌株合成1,3-丙二醇的性能，同时减少副产物乳酸和乙醇的生成。
同样与初始菌株K.o相比，敲除二醇脱水酶活化因子的工程菌K.oΔpduGH发酵30h后，1,3-丙二醇的产量达到50.21g/L，比K.o合成1,3-丙二醇的量提高了4.34％；副产物乳酸的产量为22.32g/L，比K.o合成乳酸的产量减少了16.77％；副产物乙醇的产量为6.41g/L，比K.o合成乙醇的产量减少了15.66％；K.oΔpdu代谢甘油合成1,3-丙二醇的转化率为37.22％，比K.p的转化率提高了1.99％；K.oΔpdu的发酵结果说明在克雷伯氏产酸杆菌中敲除二醇脱水酶活化因子的基因能够明显提高菌株合成1,3-丙二醇的性能，同时减少副产物乳酸和乙醇的生成。在工程菌K.oΔpdu上进一步敲除乳酸脱氢酶编码基因，得到的工程菌K.oΔpduΔldh发酵30h后，1,3-丙二醇的产量达到58.11g/L，比K.o合成1,3-丙二醇的产量提高了20.76％；副产物乳酸同样不再合成；副产物乙醇的产量为4.6g/L，比K.p合成乙醇的产量减少了39.47％；K.oΔpduΔldh代谢甘油合成1,3-丙二醇的转化率为42.1％，比K.o的转化率提高了6.87％。K.oΔpduΔldh的发酵结果同样说明进一步的敲除乳酸脱氢酶编码基因能够继续提高克雷伯氏产酸杆菌代谢甘油合成1,3-丙二醇的性能，副产物乳酸的合成同样因为敲除ldh基因被完全阻断。
在工程菌K.oΔpduΔldh上，进一步敲除乙醇脱氢酶编码基因，得到的工程菌K.oΔpduΔldhΔadh发酵30h后，1,3-丙二醇的产量达到58.76g/L，比K.o合成1,3-丙二醇的产量提高了22.11％；副产物乳酸和乙醇均不再合成；K.oΔpduΔldhΔadh代谢甘油合成1,3-丙二醇的转化率为43.2％，比K.o的转化率提高了7.97％。K.oΔpduΔldhΔadh的发酵结果说明进一步的敲除克雷伯氏产酸杆菌乙醇脱氢酶编码基因能够继续提高菌株代谢甘油合成1,3-丙二醇的性能，副产物乙醇的合成同样因为敲除ahd基因被完全阻断。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种克雷伯氏工程菌，其特征在于，所述克雷伯氏工程菌为二醇脱水酶相关基因被敲除的克雷伯氏工程菌，所述二醇脱水酶相关基因为二醇脱水酶活化因子基因。
2.根据权利要求1所述的克雷伯氏工程菌，其特征在于，所述二醇脱水酶活化因子基因选自pduG、pduH中的一个或多个基因。
3.根据权利要求1所述的克雷伯氏工程菌，其特征在于，所述克雷伯氏工程菌中，乳酸脱氢酶基因和/或乙醇脱氢酶基因亦被敲除。
4.根据权利要求3所述的克雷伯氏工程菌，其特征在于，所述乳酸脱氢酶基因为ldhA基因，和/或，所述乙醇脱氢酶基因为adhE基因。
5.一种构建克雷伯氏工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将野生型克雷伯氏菌的二醇脱水酶相关基因敲除，所述二醇脱水酶相关基因为二醇脱水酶活化因子基因。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述二醇脱水酶活化因子基因选自pduG、pduH中的一个或多个基因。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括敲除乳酸脱氢酶基因和/或乙醇脱氢酶基因。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述乳酸脱氢酶基因为ldhA基因；和/或，所述乙醇脱氢酶基因为adhE基因。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，采用同源重组的方法敲除基因。
10.如权利要求1-4任一所述克雷伯氏工程菌在生产1,3-丙二醇的应用。
CN202211268738.7A 2020-03-12 2020-03-12 高产1,3-丙二醇的克雷伯氏工程菌构建方法及应用 Pending CN116064352A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211268738.7A CN116064352A (zh) 2020-03-12 2020-03-12 高产1,3-丙二醇的克雷伯氏工程菌构建方法及应用

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010169645.3A CN111334459B (zh) 2020-03-12 2020-03-12 一种提高1,3-丙二醇产量的克雷伯氏工程菌构建方法及应用
CN202211268738.7A CN116064352A (zh) 2020-03-12 2020-03-12 高产1,3-丙二醇的克雷伯氏工程菌构建方法及应用

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010169645.3A Division CN111334459B (zh) 2020-03-12 2020-03-12 一种提高1,3-丙二醇产量的克雷伯氏工程菌构建方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116064352A true CN116064352A (zh) 2023-05-05

Family

ID=71182286

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211268738.7A Pending CN116064352A (zh) 2020-03-12 2020-03-12 高产1,3-丙二醇的克雷伯氏工程菌构建方法及应用
CN202010169645.3A Active CN111334459B (zh) 2020-03-12 2020-03-12 一种提高1,3-丙二醇产量的克雷伯氏工程菌构建方法及应用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010169645.3A Active CN111334459B (zh) 2020-03-12 2020-03-12 一种提高1,3-丙二醇产量的克雷伯氏工程菌构建方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN116064352A (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114806982B (zh) * 2021-01-21 2023-07-25 中国科学院上海高等研究院 改造的1,3-丙二醇生产菌株及其应用
CN116694591A (zh) * 2023-06-28 2023-09-05 江南大学 一种1,3-丙二醇脱氢酶突变体及产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5686276A (en) * 1995-05-12 1997-11-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Bioconversion of a fermentable carbon source to 1,3-propanediol by a single microorganism
ATE335823T1 (de) * 1999-08-18 2006-09-15 Du Pont Verfahren zur biologischen herstellung von 1,3- propandiol
EP1586647A1 (en) * 1999-08-18 2005-10-19 E.I. du Pont de Nemours and Company Process for the biological production of 1,3-propanediol with high titer
JP2005304362A (ja) * 2004-04-20 2005-11-04 Nippon Shokubai Co Ltd １，３−プロパンジオール及び／又は３−ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法
CN105274041B (zh) * 2015-10-28 2019-04-16 山东大学 一株重组大肠杆菌及其在生产2-丁醇中的应用
CN105400831B (zh) * 2015-12-07 2019-02-05 清华大学 利用重组谷氨酸棒杆菌联产1，3-丙二醇和谷氨酸的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN111334459A (zh) 2020-06-26
CN111334459B (zh) 2022-11-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110438056B (zh) 一株产正丁酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用
JP7034088B2 (ja) 乳酸産生法
WO2011021629A1 (ja) 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法
CN107815424B (zh) 一种产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用
CN105051181B (zh) 2，3-丁二醇的生成能力增加的重组微生物及利用其的2，3-丁二醇的制备方法
US9090919B2 (en) Method of producing 3-hydroxypropionic acid from glycerol
CN116064352A (zh) 高产1,3-丙二醇的克雷伯氏工程菌构建方法及应用
CN106701844B (zh) 克雷伯氏肺炎杆菌生产木糖酸的方法
CN108977422B (zh) 一种具葡糖淀粉酶活性乳酸单体生产菌及其应用
CN114507613A (zh) 一种发酵生产α-檀香烯的酵母工程菌及其应用
JP5813977B2 (ja) Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属の変異体酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法
KR20150121789A (ko) 2,3―부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3―부탄디올의 생산 방법
CN106867922A (zh) 克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸和异丁醇的方法
CN106148255B (zh) 产有机酸途径缺失的工程菌及其在联产1,3-丙二醇、2,3-丁二醇和乙醇中的应用
CN115261292B (zh) 改造的克雷伯氏菌属细菌及其生产1,2-丙二醇的应用和方法
CN113430127B (zh) 一种产l-乳酸的重组菌及其应用
CN112280725B (zh) 一种高效生产琥珀酸的重组大肠杆菌及其构建方法
CN115058374A (zh) 一种利用丙酮酸合成乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用
CN101348775A (zh) 肠杆菌重组菌及其应用
CN111394396A (zh) 一种微生物利用甘油发酵生产1,3-丙二醇的方法
CN104498523A (zh) 一株敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因的工程菌及其应用
JP2021511787A (ja) １，３−プロパンジオール生成能を有する変異微生物及びこれを用いた１，３−ｐｄｏの製造方法
KR101871464B1 (ko) 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 개량된 변이 미생물 및 이를 이용한 에탄올의 제조방법
CN113234653B (zh) 一种提高合成气发酵产乙醇含量的突变株和利用突变株的应用
CN114806981B (zh) 克雷伯氏菌工程菌在生产1,3-丙二醇中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination