WO2011021629A1 - 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法 - Google Patents

形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2011021629A1
WO2011021629A1 PCT/JP2010/063888 JP2010063888W WO2011021629A1 WO 2011021629 A1 WO2011021629 A1 WO 2011021629A1 JP 2010063888 W JP2010063888 W JP 2010063888W WO 2011021629 A1 WO2011021629 A1 WO 2011021629A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
lactic acid
transformant
pombe
lactate dehydrogenase
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/063888
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
太志 原
英毅 東田
Yuko HAMA (浜 祐子)
Original Assignee
旭硝子株式会社
浜 千尋
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 旭硝子株式会社, 浜 千尋 filed Critical 旭硝子株式会社
Priority to EP10809970.6A priority Critical patent/EP2468860B1/en
Priority to JP2011527683A priority patent/JP5772594B2/ja
Priority to CN2010800371957A priority patent/CN102498209A/zh
Priority to IN1521DEN2012 priority patent/IN2012DN01521A/en
Publication of WO2011021629A1 publication Critical patent/WO2011021629A1/ja
Priority to US13/401,197 priority patent/US9284561B2/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid

Definitions

  • the present invention relates to a transformant, a method for producing the transformant, and a method for producing lactic acid.
  • Lactic acid is widely used for food applications, medical raw materials, and other chemical raw materials.
  • Polylactic acid obtained by using lactic acid is attracting attention as a biodegradable plastic that is finally decomposed into carbon dioxide and water by microorganisms and the like. Therefore, it is necessary to produce lactic acid at low cost with high productivity.
  • lactic acid As a method for producing lactic acid, a biological method is known in which sugar is fermented by lactic acid bacteria and produced.
  • lactic acid bacteria have low acid resistance, to obtain high productivity by this method, it is necessary to neutralize lactic acid produced by fermentation with an alkali to form lactate.
  • Such neutralization with alkali requires a step of returning from lactate to lactic acid, which complicates the manufacturing process and increases the manufacturing cost.
  • Patent Document 1 Method using Saccharomyces cerevisiae (budding yeast) into which a gene encoding lactate dehydrogenase has been introduced and the gene encoding pyruvate decarboxylase 1 has been deleted or inactivated (patent) Document 2) is shown.
  • Patent Document 1 is only about 2 to 5% lactic acid can be obtained even in a culture time of 20 to 24 hours, and the productivity is not sufficient.
  • the method of Patent Document 2 is not suitable for industrial mass production of lactic acid because neutralization with an alkali is required when lactic acid is mass-produced. Therefore, a method capable of producing lactic acid with high productivity without performing neutralization with alkali is desired.
  • the present invention aims at a transformant of Schizosaccharomyces pombe that can produce lactic acid with high productivity without requiring neutralization with an alkali, and a method for producing the transformant. Furthermore, it is an object of the present invention to provide a transformant suitable for producing lactic acid in the presence of a high concentration of sugar and suitable for high-density fermentation and a method for producing the transformant. Another object of the present invention is to produce lactic acid with high productivity using the transformant without performing a neutralization step with an alkali.
  • lactic acid refers to L-lactic acid obtained by a biological method.
  • the transformant of the present invention uses Schizosaccharomyces pombe as a host, a lactate dehydrogenase gene is integrated, and a part of the gene group encoding pyruvate decarboxylase of the Schizosaccharomyces pombe host is missing. Inactive or inactive.
  • the deleted or inactivated gene encoding pyruvate decarboxylase is preferably a PDC2 gene.
  • the lactate dehydrogenase gene is preferably a mammalian lactate dehydrogenase gene.
  • the lactate dehydrogenase gene is preferably integrated into the chromosome of Schizosaccharomyces pombe.
  • the method for producing the transformant of the present invention uses a vector having an expression cassette containing a promoter, a terminator, and a lactate dehydrogenase gene functioning in Schizosaccharomyces pombe as a host.
  • the vector further has a recombination site that allows homologous recombination to the chromosome of Schizosaccharomyces pombe, and this vector can be used to introduce an expression cassette into the chromosome of Schizosaccharomyces pombe.
  • the target site for homologous recombination in the host chromosome is preferably the transposon gene Tf2.
  • the deleted or inactivated gene encoding pyruvate decarboxylase is a PDC2 gene.
  • the lactate dehydrogenase gene is preferably a mammalian lactate dehydrogenase gene.
  • the present invention is a method for producing lactic acid, wherein the transformant is cultured in a culture solution and lactic acid is obtained from the culture solution.
  • this method for producing lactic acid it is preferable to perform the culture using a culture solution containing glucose having a concentration of 1 to 50% by mass (more preferably 2 to 16% by mass).
  • cultivation after the pH of the said culture solution will be 3.5 or less with the lactic acid produced by the said transformant.
  • the initial bacterial cell concentration of the transformant in the culture solution is 0.1 to 50 grams (in terms of dry cells) / liter (further 0.2 to 40 grams (in terms of dry cells) / Liter is preferred).
  • the transformant of Schizosaccharomyces pombe of the present invention can produce lactic acid with high productivity without requiring neutralization with alkali. Moreover, it is suitable for lactic acid production in the presence of high-concentration sugars, particularly glucose, fructose, sucrose, maltose, and also suitable for high-density culture. Furthermore, the transformant can be easily obtained by the method for producing a transformant of the present invention. In addition, the method for producing lactic acid according to the present invention can produce lactic acid with high productivity without performing a neutralization step with an alkali.
  • the transformant of the present invention uses Schizosaccharomyces pombe (hereinafter also referred to as S. pombe) as a host, has a lactate dehydrogenase gene incorporated therein, and It is a transformant in which a part of a gene group encoding Pombe host pyruvate decarboxylase is deleted or inactivated.
  • S. pombe Schizosaccharomyces pombe
  • Pombe is a yeast belonging to the genus Schizosaccharomyces (fission yeast), and is a microorganism particularly excellent in acid resistance compared to other yeasts.
  • the inventors have described S.I. It has been found that Pombe is superior to other yeasts such as Saccharomyces cerevisiae in producing lactic acid under a high concentration of glucose and suitable for high-density culture (culture using a large amount of yeast). It has been found that by using a Pombe transformant, lactic acid can be produced with extremely high productivity. S.
  • the entire base sequence of the Pombe chromosome is recorded and disclosed as “Schizosaccharomyces pombe Gene DB (http://www.genedb.org/genedb/pombe/)” in the database “GeneDB” of the Sanger Institute.
  • the sequence data of the pombe gene can be obtained from the above database by searching for the gene name or the above strain name.
  • the pombe is not particularly limited as long as it has acid resistance. S.
  • Pombe is a public or private depository, namely American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA), National Collection of Yeast Cultures (NCYC, Norwich, United Kingdom), NITE Biological Resource Center (NBRC, Japan) It can be obtained from Kisarazu City, Chiba Prefecture), Yeast Genetic Resource Center (YGRC, graduate School of Science, Osaka City University, Japan).
  • ATCC American Type Culture Collection
  • NCYC National Collection of Yeast Cultures
  • NBRC NITE Biological Resource Center
  • YGRC Yeast Genetic Resource Center
  • the gene encoding pyruvate decarboxylase in Pombe includes a gene encoding pyruvate decarboxylase 1 (hereinafter referred to as “PDC1 gene”).
  • a gene encoding pyruvate decarboxylase 2 (hereinafter referred to as “PDC2 gene”), a gene encoding pyruvate decarboxylase 3 (hereinafter referred to as “PDC3 gene”), and pyruvate decarboxylase 4
  • PDC4 genes There are four types of genes.
  • the PDC2 gene and the PDC4 gene are PDC genes having major functions.
  • the system name of each PDC gene is as follows. PDC1 gene (Pdc1); SPAC13A11.06 PDC2 gene (Pdc2); SPAC1F8.07c PDC3 gene (Pdc3); SPAC186.09 PDC4 gene (Pdc4); SPAC3G9.11c
  • the sequence data of the PDC gene is the S.P. It can be obtained by searching by gene name or strain name from the Pombe gene database.
  • Wild type S. In Pombe glucose is metabolized to pyruvate by a glycolytic system, pyruvate is converted to acetaldehyde by pyruvate decarboxylase expressed from the aforementioned PDC gene, and then the acetaldehyde is converted to ethanol by alcohol dehydrogenase. As a result, ethanol fermentation is performed.
  • wild type S. cerevisiae. Pombe does not have a functioning lactate dehydrogenase gene, so there is no route for producing lactic acid from pyruvate.
  • lactate dehydrogenase expressed from the incorporated lactate dehydrogenase gene produces lactic acid by reducing pyruvate to lactic acid.
  • the transformant of the present invention has a chromosome in which a part of the gene group encoding the pyruvate decarboxylase is deleted or inactivated. Since a part of the PDC gene group of the transformant is deleted or inactivated, the efficiency of ethanol fermentation of the transformant is reduced, and the amount of pyruvic acid converted to ethanol is reduced. Improves. However, if the PDC gene group is completely deleted or inactivated, ethanol fermentation cannot be performed at all and growth is inhibited. Therefore, deletion or inactivation is a part of the PDC gene group.
  • the PDC gene to be deleted or inactivated is particularly preferably a PDC2 gene.
  • the PDC2 gene is a PDC gene having a particularly major function. As described above, if the PDC gene is completely deleted or inactivated, the transformant cannot perform ethanol fermentation, and thus growth is inhibited. Therefore, deletion or inactivation of the PDC gene can reduce the ethanol fermentation ability and improve the fermentation efficiency of lactic acid while leaving a sufficient amount of transformant, leaving the ethanol fermentation ability necessary for growth. Must be done as follows.
  • Deletion or inactivation of the PDC gene can be performed by a known method.
  • the PDC gene can be deleted by using the Latour method (described in Nucleic Acids Res, 2006, 34, e11, International Publication No. 2007/063919 pamphlet, etc.).
  • the PDC gene can be inactivated by causing deletion, insertion, substitution, or addition in a part of the base sequence of the PDC gene. These deletion, insertion, substitution, and addition mutations may cause only one of them, or may cause two or more.
  • a known method can be used as a method for introducing the mutation into a part of the PDC gene. For example, mutation isolation method using a mutation agent (Yeast Molecular Genetics Experimental Method, 1996, Society Press Center) and random mutation method using PCR (polymerase chain reaction) (PCR Methods Application (PCR Methods) Appl.), 1992, Vol. 2, p. 28-33.).
  • the PDC gene into which a mutation is partially introduced may express a temperature-sensitive mutant pyruvate decarboxylase.
  • a temperature-sensitive mutant pyruvate decarboxylase is an enzyme that exhibits the same activity as wild-type pyruvate decarboxylase at a certain culture temperature, but loses or decreases its activity at a specific culture temperature or higher. It is.
  • a mutant strain expressing such a mutant pyruvate decarboxylase shows a growth rate equivalent to that of wild-type yeast under a temperature condition where the activity is not restricted, and a growth rate under a specific temperature condition where the activity is restricted. Can be obtained by selecting a material that significantly decreases
  • the S. PDC gene has been deleted or inactivated.
  • the Pombe mutant can be used as a host for producing the transformant of the present invention.
  • a specific gene other than the PDC gene was deleted or inactivated.
  • Pombe can be the host.
  • a specific gene other than the PDC gene has been deleted or inactivated. Examples of the pombe host are described in International Publication No. 2002/101038 pamphlet, International Publication No. 2007/015470 pamphlet and the like. Deletion or inactivation of a protease gene or the like can increase the expression efficiency of a heterologous protein, and application to the host in the present invention can be expected to improve the production efficiency of lactic acid.
  • S. cerevisiae used as a host. It is preferable to use a pombe having a marker for selecting a transformant. For example, it is preferable to use a host in which a specific nutritional component is essential for growth because a certain gene is missing. By incorporating this missing gene (auxotrophic complementary marker) into the vector, the auxotrophy of the host is lost in the transformant. Due to the difference in auxotrophy between the host and the transformant, the transformant can be obtained by distinguishing both. For example, an orotidine phosphate decarboxylase gene (ura4 gene) has been deleted or inactivated and has become uracil-requiring.
  • ura4 gene an orotidine phosphate decarboxylase gene
  • a transformant incorporating the vector can be obtained by selecting those that have lost uracil requirement.
  • the gene that becomes auxotrophic due to deletion in the host is not limited to the ura4 gene as long as it is used for selection of transformants, and may be an isopropylmalate dehydrogenase gene (leu1 gene) or the like.
  • the PDC gene cluster is not deleted or inactivated.
  • Pombe can also be used as a host for the production of transformants.
  • a host in which a gene other than the PDC gene (such as an auxotrophic marker or a protease gene) is deleted or inactivated can be used. After producing a transformant using this host, the transformant of the present invention can be obtained by deleting or inactivating a part of the PDC gene group of the transformant.
  • the transformant of the present invention has a lactate dehydrogenase gene (a gene encoding lactate dehydrogenase, hereinafter also referred to as “LDH gene”).
  • LDH gene a gene encoding lactate dehydrogenase, hereinafter also referred to as “LDH gene”.
  • S.M. Pombe does not naturally have an LDH gene. Therefore, S.M.
  • the LDH gene of organisms other than Pombe can be obtained by genetic engineering.
  • a transformant is obtained by introducing into pombe.
  • the LDH gene in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include an LDH gene derived from a microorganism belonging to the genus Bifidobacterium, Lactobacillus, and the like, and an LDH gene derived from a mammal such as a human.
  • a mammal-derived LDH gene is preferable.
  • human-derived LDH gene is more preferable (Reference: Tsujibo H, Tiano HF, Li SS-L. Nucleotide sequences of the cDNA and an intronless pseudogene for human lactate dehydrogenase-A isozyme. Eur. J. Biochem. (1985) 147, 9-15).
  • the LDH gene described in SEQ ID NO: 1 in the following sequence listing is preferable.
  • the transformant of the present invention has S. cerevisiae in which a part of the PDC gene cluster has been deleted or inactivated.
  • the LDH gene was transferred to S. cerevisiae by a genetic engineering method. It is obtained by introducing it into Pombe.
  • the PDC gene cluster is not deleted or inactivated.
  • the pombe as a host, the LDH gene was transferred to S. cerevisiae by a genetic engineering method. It is also possible to obtain a transformant by introducing it into pombe, and then delete or inactivate a part of the PDC gene group of the obtained transformant to obtain the transformant of the present invention.
  • the target transformant was produced by the former method, but almost the same transformant can be produced by the latter method.
  • a method for producing a transformant will be described using the former method as an example.
  • a method for introducing the LDH gene into the host by a genetic engineering method a known method can be used.
  • methods for introducing a structural gene of a heterologous protein into pombe as a host include, for example, Japanese Patent Laid-Open No. 5-15380, International Publication No. 95/09914, Japanese Patent Laid-Open No. 10-234375, Japan
  • the methods described in Japanese Unexamined Patent Publication No. 2000-262284, Japanese Unexamined Patent Publication No. 2005-198612 and the like can be used.
  • LDH gene is S. It is preferably introduced into the pombe chromosome. By introducing the LDH gene into the chromosome, a transformant having excellent passage stability can be obtained. A plurality of LDH genes can also be introduced into the chromosome. It is considered that by introducing a plurality of LDH genes, the expression efficiency of the LDH gene can be increased, and as a result, the production efficiency of lactic acid can be improved.
  • the number of LDH genes integrated into the chromosome is preferably 1-20, and more preferably 1-8.
  • a known method can be used as a method for introducing the LDH gene into the chromosome.
  • a plurality of LDH genes can be introduced into a chromosome by the method described in Japanese Unexamined Patent Publication No. 2000-262284.
  • one LDH gene can be introduced into the chromosome by this method.
  • one or a plurality of LDH genes can be introduced into a plurality of locations on the chromosome.
  • the LDH gene As a method for introduction into the pombe chromosome, a method for introduction by homologous recombination using a vector having an expression cassette having an LDH gene and a recombination site is preferred. The vector used in this method and the homologous recombination method are described below.
  • the vector has an expression cassette with the LDH gene and a recombination site.
  • An expression cassette is a combination of DNAs necessary for expressing lactate dehydrogenase.
  • a promoter that functions in Pombe Includes a terminator that functions within the pombe. Further, any one or more of 5′-untranslated region and 3′-untranslated region may be included.
  • the auxotrophic complementary marker may be included.
  • a preferred expression cassette is an expression cassette containing an LDH gene, promoter, terminator, 5′-untranslated region, 3′-untranslated region, and an auxotrophic complementary marker.
  • a plurality of LDH genes may be present in the expression cassette. The number of LDH genes in the expression cassette is preferably 1-8, more preferably 1-5.
  • S. Examples of promoters that function in pombe include S. cerevisiae. Pombe's inherent promoter (preferably having high transcription initiation activity) or S. A promoter (eg, a virus-derived promoter) that Pombe does not originally have can be used. Two or more promoters may be present in the vector.
  • promoters inherent to Pombe include alcohol dehydrogenase gene promoter, nmt1 gene promoter involved in thiamine metabolism, fructose-1, 6-bisphosphatase gene promoter involved in glucose metabolism, and invertase gene involved in catabolite repression. Examples include promoters (see International Publication No. 99/23223 pamphlet), heat shock protein gene promoters (see International Publication No. 2007/26617 pamphlet), and the like.
  • promoters that Pombe does not originally have include those derived from animal cell viruses described in Japanese Patent Laid-Open No. 5-15380, Japanese Patent Laid-Open No. 7-163373, and Japanese Patent Laid-Open No. 10-234375. And hCMV promoter and SV40 promoter are preferable.
  • S. Pombe's inherent terminator and S.P. A terminator that Pombe does not have can be used. Two or more terminators may be present in the vector. Examples of the terminator include human-derived terminators described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-15380, Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-163373, and Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-234375. The rutin I terminator is preferred.
  • the recombination site of the vector is S. cerevisiae. This is a site having a base sequence that allows homologous recombination to be performed on a target site for homologous recombination in the pombe chromosome.
  • the target site is S. pneumoniae. This is a target site for integrating the expression cassette in the pombe chromosome.
  • the target site can be freely set by setting the recombination site of the vector to a base sequence that allows homologous recombination to be performed on the target site.
  • the homology between the base sequence of the recombination site and the base sequence of the target site needs to be 70% or more.
  • the homology between the base sequence of the recombination site and the base sequence of the target site is preferably 90% or more, and more preferably 95% or more from the viewpoint that homologous recombination is likely to occur.
  • the expression cassette is incorporated into the target site by homologous recombination.
  • the length (number of bases) of the recombination site is preferably 20 to 2000 bp. If the length of the recombination site is 20 bp or more, homologous recombination is likely to occur.
  • the length of the recombination site is 2000 bp or less, it is easy to prevent the vector from becoming too long and causing homologous recombination to hardly occur.
  • the length of the recombination site is more preferably 100 bp or more, and further preferably 200 bp or more. Further, the length of the recombination site is more preferably 800 bp or less, and further preferably 400 bp or less.
  • the vector may have other DNA regions in addition to the expression cassette and the recombination site.
  • a replication initiation region called “ori” required for replication in E. coli and an antibiotic resistance gene (neomycin resistance gene, etc.) can be mentioned. These are genes usually required when constructing a vector using Escherichia coli.
  • the replication initiation region is preferably removed when the vector is integrated into the host chromosome as described later.
  • the vector is a vector having a circular DNA structure or a linear DNA structure. When introducing into a pombe cell, it is preferable to introduce it in a linear DNA structure. That is, in the case of a vector having a circular DNA structure such as a commonly used plasmid DNA, S.
  • the position for opening the vector having a circular DNA structure is within the recombination site.
  • the recombination sites partially exist at both ends of the opened vector, and the entire vector is integrated into the target site of the chromosome by homologous recombination.
  • the vector may be constructed by a method other than the method of cutting a vector having a circular DNA structure, as long as it can have a linear DNA structure in which a part of the recombination site exists at each end.
  • the vector for example, plasmids derived from E. coli such as pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, and pUC19 can be suitably used.
  • the plasmid vector used for homologous recombination preferably has a replication initiation region called “ori” that is necessary for replication in E. coli.
  • ori replication initiation region
  • the method for constructing the vector from which the replication initiation region has been removed is not particularly limited, but the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-262284 is preferably used.
  • a method is preferred in which a precursor vector in which a replication initiation region is inserted at the cleavage site in the recombination site is constructed so that the replication initiation region is excised at the same time as the linear DNA structure as described above. Thereby, a vector from which the replication initiation region has been easily removed can be obtained.
  • Target sites that incorporate the vector are S. cerevisiae. It may be present only at one location in the pombe chromosome, or may be present at two or more locations. When two or more target sites exist, S.P. Two or more vectors can be integrated into the pombe chromosome. Further, when a plurality of LDH genes are included in the expression cassette, a plurality of LDH genes can be incorporated into one target site. Furthermore, an expression cassette can be incorporated into two or more target sites using two or more vectors having recombination sites corresponding to the respective target sites. In these ways, S. A plurality of LDH genes can be incorporated into the pombe chromosome, thereby increasing the expression level of lactate dehydrogenase and improving the lactate productivity.
  • Base sequences that are substantially identical to each other means that the homology of the base sequences is 90% or more.
  • the homology between the target sites is preferably 95% or more.
  • the length of the base sequences that are substantially identical to each other is a length that includes the recombination site of the vector, and is preferably 1000 bp or more.
  • a transposon gene Tf2 is preferable as a target site present in a plurality of locations in a chromosome.
  • Tf2 is the S.T.
  • a vector can be incorporated into only one location of Tf2 present in 13 locations on a chromosome.
  • a transformant having two or more LDH genes can be obtained by incorporating a vector having two or more LDH genes.
  • a transformant having two or more LDH genes can be obtained by incorporating a vector into two or more locations of Tf2.
  • a transformant having more LDH genes can be obtained by incorporating a vector having two or more LDH genes. If the vector is incorporated at all 13 positions of Tf2, the burden on the survival and growth of the transformant may be too great.
  • the vector is preferably incorporated at 8 sites or less of 13 Tf2, and more preferably at 5 sites or less.
  • ⁇ Transformation method> S.
  • a method for transforming the pombe host by the homologous recombination method a known homologous recombination method can be used.
  • a transformation method of the present invention S. cerevisiae in which a part of the above PDC gene group has been deleted or inactivated.
  • a method in which the expression cassette is integrated by homologous recombination using the above-mentioned vector as a host and pombe as a host is preferable. According to this production method, the transformant of the present invention can be produced easily.
  • the obtained transformant is usually selected after homologous recombination.
  • the selection method include the following methods. Screening is performed with a medium capable of selecting transformants using the auxotrophic marker, and a plurality of colonies obtained are selected. Next, after separately cultivating them, the expression level of the heterologous protein in each culture solution is examined, and a transformant with a higher expression level of the heterologous protein is selected.
  • the number of vectors integrated in the chromosome and the number of expression cassettes can be examined by performing genome analysis by pulse field gel electrophoresis on the selected transformants. The number of vectors integrated into the chromosome can be adjusted to some extent by adjusting the integration conditions and the like, but it is considered that the integration efficiency and the number of integrations vary depending on the size (number of bases) and structure of the vector.
  • an object of the present invention is to obtain a transformant with high production efficiency of lactic acid, and not simply to obtain a transformant having a larger total number of expression cassettes.
  • the expression efficiency of lactate dehydrogenase increases, and as a result, the production efficiency of lactate increases.
  • the number of expression cassettes is too large, the burden on cell survival and proliferation increases, and as a result, the lactic acid production efficiency may be reduced.
  • the probability of integration into a chromosome decreases, and it becomes difficult to increase the number of vectors to be integrated, and thus it is considered difficult to obtain a transformant itself.
  • the method for producing lactic acid of the present invention is a method for producing lactic acid by culturing the transformant of the present invention in a culture solution and obtaining lactic acid from the culture solution.
  • a culture medium containing sugar By culturing the transformant of the present invention in a culture medium containing sugar, pyruvic acid obtained from the sugar was reduced by lactate dehydrogenase by a glycolysis system, and lactic acid was produced and produced in the culture liquid. Lactic acid can be produced by obtaining lactic acid from the culture solution.
  • a known yeast culture medium containing sugar can be used. Contains a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be utilized by Pombe; Any material that can efficiently culture pombe is acceptable.
  • a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • the sugar that is the carbon source include sugars such as glucose, fructose, sucrose, and maltose.
  • the nitrogen source include inorganic acids such as ammonia, ammonium chloride, and ammonium acetate, ammonium salts of inorganic acids, peptone, casamino acid, yeast extract, and the like.
  • inorganic salts include magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride and the like.
  • a fermentation promoting factor such as proteolipid can be included.
  • a culture solution containing glucose particularly as sugar In the method for producing lactic acid of the present invention, it is preferable to use a culture solution containing glucose particularly as sugar.
  • the glucose concentration in the culture medium (100% by mass) at the initial stage of culture is preferably 1% by mass or more, more preferably 1 to 50% by mass, and further preferably 2 to 16% by mass. It is preferable to continue the culture by adding glucose as necessary, because the glucose concentration is lowered by the culture.
  • the glucose concentration at the end of the culture may be 1% by mass or less.
  • the productivity of lactic acid is further improved.
  • the production efficiency of lactic acid improves more by making glucose in a culture solution into 16 mass% or less.
  • the initial bacterial cell concentration of the transformant in the culture solution is 0.1 to 50 g / liter expressed in terms of dry cell weight. More preferably, the initial bacterial cell concentration of the transformant in the culture medium is 0.2 to 40 grams / liter expressed in terms of dry cell weight.
  • High productivity can be achieved in a short time by increasing the initial cell concentration.
  • the initial bacterial cell concentration is too high, there is a possibility that problems such as bacterial cell aggregation and reduction in purification efficiency may occur.
  • OD660 light absorbency
  • the culture a known yeast culture method can be used, and for example, it can be carried out by shaking culture, stirring culture or the like.
  • the culture temperature is preferably 23 to 37 ° C.
  • the culture time can be determined as appropriate.
  • the culture may be batch culture or continuous culture.
  • the cells can be separated from the culture solution to obtain a culture solution containing lactic acid.
  • the continuous culture method for example, a part of the culture solution is extracted from the culture tank being cultured, lactic acid is separated from the extracted culture solution, and the culture supernatant is recovered, and glucose or new A method of continuously culturing by repeating the addition of the culture solution and returning to the culture tank can be mentioned. By performing continuous culture, the productivity of lactic acid is further improved.
  • lactic acid can be produced without neutralization even when the pH is lowered (about pH 2 to 4) due to accumulation of lactic acid. Therefore, even after the pH of the culture solution becomes 4 or less, lactic acid can be produced by continuous culture that continues the culture.
  • the pH at the end of the culture and the pH in the continuous culture are preferably 1 to 4, and more preferably 1.5 to 3.5. In order to increase the productivity of lactic acid, it is preferable to continue the culture after the pH of the culture solution becomes 3.5 or lower. Since the transformant of the present invention has excellent acid resistance, the culture can be continued without neutralizing lactic acid in the culture solution produced by the transformant.
  • a known method can be used to obtain lactic acid from the culture solution.
  • separating the cells from the culture broth after completion of the culture by centrifugation extracting the solution with diethyl ether or ethyl acetate after adjusting the pH to 1 or less, a method of leaching after washing by adsorption on an ion exchange resin, activated carbon And a method of removing impurities using, a method of distilling after reacting with an alcohol in the presence of an acid catalyst, and a method of separating using a separation membrane.
  • lactic acid in the culture medium is neutralized, and then the culture liquid and lactate are separated to obtain lactic acid.
  • lactic acid can also be obtained by a method of converting lactic acid in a culture solution into a calcium salt or a lithium salt and crystallizing the neutralized salt.
  • the above-described method for producing lactic acid according to the present invention has a particularly excellent acid resistance. Since a transformant using pombe as a host is used, lactic acid can be easily produced with high productivity without neutralization with alkali. In addition, since the efficiency of ethanol fermentation is reduced due to deletion or inactivation of a part of the PDC gene group, the yield of lactic acid to sugar (ratio of the amount of lactic acid produced to the amount of consumed sugar) ) Will improve. In the present invention, the yield of lactic acid with respect to sugar can be easily set to 50% by mass or more. In some cases, the yield of lactic acid with respect to sugar reaches 70% by mass or more.
  • the method for producing lactic acid of the present invention is also suitable for high-density culture in the presence of a high concentration of glucose and a high concentration of transformants.
  • adhX strain name: SPBC1773.06c
  • oligo DNA for preparation of deleted fragments UF: 5'-GAAGGAGATTATGTGAAACAAGTTGAAATC-3 '(SEQ ID NO: 50 in the sequence listing below)
  • an UP region was created with UF and UR, an OL region with OF and OR, and a DN region with DF and DR, respectively, were prepared by PCR using KOD-Dash (manufactured by Toyobo Co., Ltd.). Was used as a template, and a full-length deleted fragment was prepared by the same PCR method using FF and FR, respectively.
  • KOD-Dash manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • Table 1 shows the names of the deleted strains prepared using each of the prepared deleted fragments and the deleted genes.
  • Example 2 ⁇ S. Production of Pombe Lactate Dehydrogenase Production Strain> S. Pombe uracil auxotrophic strain (ARC010) and S. Each of the Pombe gene-deleted strains was digested with the restriction enzyme BsiWI digested from the single-locus integrated recombinant vector pXLT-HsLDH carrying the lactate dehydrogenase gene expression cassette. The method of Bahler et al. (Yeast, 1998, Vol. 14, 943-951). pXLT-HsLDH was produced by the following steps.
  • Okayama vector reference: Okayama, H. and Berg, P .: A cDNA cloning vector that permits expression of cDNA inserts in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 3 (1983) 280-289.).
  • Example 3 Production of high production strain of pombe lactate dehydrogenase> Since the IGF543 strain (h-leu1-32 ura4-D18 pdc2-D23) prepared in Example 1 had a slow growth rate, the IGF543 strain was added to the YES plate (yeast extract 0.5) to restore the growth rate. % / Glucose 3% / SP supplement) and cultured at 25 ° C. The obtained colonies were transferred to YPD medium (yeast extract 1% / peptone 2% / glucose 2%) and cultured at 25 ° C. A glycerol stock was prepared using a sufficiently grown culture solution and stored at ⁇ 80 ° C.
  • pTL2HsLDH (Example 2) was double-digested with restriction enzymes SpeI and Bst1107I, and the resulting fragment (hCMV promoter / LDH-ORF / LPI terminator) was obtained as a Tf2 multilocus integrated vector pTf2MCS prepared by the following steps -Inserted between recognition sequences for restriction enzyme NheI-KpnI (end blunting) of ura4 to prepare an integrated L-lactate dehydrogenase gene expression vector pTL2HsLDH-Tf2.
  • the production process of pTf2MCS-ura4 is as follows. That is, using a whole genome DNA extraction kit (DNeasy manufactured by Qiagen) from cells, S. Pombe total genomic DNA was purified, 1 ⁇ g of which was used as a template, and the following primer pair into which the recognition sequence (CGTACG) of restriction enzyme BsiWI was introduced on the 5 ′ end side, 5'-AAGGCCTCGTACGTGAAAGCAAGCAAAACGA-3 '(SEQ ID NO: 71 in the sequence listing below), 5'-AAGGCCTCGTACGTGCTTTGTCCGCTTGTAGC-3 '(SEQ ID NO: 72 in the sequence listing below), And S. cerevisiae by the PCR method.
  • CGTACG recognition sequence
  • a DNA fragment (about 3950 base pairs) of Pombe Tf2-2 (line name SPAC167.08 gene listed in GeneDB) was amplified. Both ends of the amplified DNA fragment were treated with the restriction enzyme BsiWI, separated and purified by agarose gel electrophoresis, and prepared as an insert fragment.
  • chromosomal integration vector pXL4 (Idiris et al., Yeast, Vol. 23, 83-99, 2006) was digested with the same restriction enzyme BsiWI to obtain an ampicillin resistance gene (ApR) and the origin of replication of E. coli (pBR322 ori). A region containing about 2130 base pairs was obtained.
  • the DNA fragment was further dephosphorylated with a dephosphorylating enzyme (CIAP manufactured by Takara Bio Inc.), separated and purified by agarose gel electrophoresis, and prepared as a vector fragment.
  • the insert fragment and the vector fragment were ligated using a ligation kit (DNA Ligation Kit ver. 2 manufactured by Takara Bio Inc.), and then transformed with Escherichia coli DH5 (manufactured by Toyobo Co., Ltd.). Base pair).
  • the following primer pair 5′-GGGGTACCAAGCTTCTAGAGTCGACTCCGGTGCTACGACACTTT-3 ′ (having recognition sequences for restriction enzymes KpnI, HindIII, XbaI, and SalI at the 5 ′ end) (SEQ ID NO: 73 in the sequence listing below), 5′-GGGGTACCAGGCCTCTCGAGGCTAGCCATTTCCAGCGTACATCCT-3 ′ (having recognition sequences for restriction enzymes KpnI, StuI, XhoI, NheI at the 5 ′ end) (SEQ ID NO: 74 in the following sequence listing), was used to amplify the full length by the PCR method to obtain a 6060 base pair fragment.
  • Both ends are digested with KpnI, separated and purified by agarose gel electrophoresis, self-circularized using a ligation kit, and 6058 base pairs having a multicloning site (MCS) inside the transposon gene Tf2-2 sequence.
  • the vector pTf2 (MCS) was prepared.
  • the construction vector pTf2 (MCS) was double digested with restriction enzymes KpnI and NheI, and a 6040 base pair fragment was separated and purified by agarose gel electrophoresis. In addition, S.
  • MCS 8246 base pair vector pTf2
  • MCS multiple cloning site
  • the IGF543 strain (growth rate recovery strain) was transformed by the method of Okazaki et al. (Okazaki et al., Nucleic Acids Res., 1990, Vol. 18, pp. 6485-6489), and the selective medium MMA + Leu It was applied to the plate.
  • a large number of the obtained single colonies were inoculated into a YPD16 (yeast extract 1% / peptone 2% / glucose 16%) medium and cultured at 32 ° C. for 72 hours. Then, only the culture supernatant was used as a sample, and BF-4 and BF- 5 (Oji Scientific Instruments) was used to measure glucose, ethanol, L-lactic acid concentrations and medium pH.
  • Example 4 (Reference example) ⁇ S. Time-lapse culture test using high-producing strain of pombe lactate dehydrogenase> The transformant ASP2767 strain obtained in Example 3 was inoculated into YPD6 liquid medium (yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 6%) and cultured at a temperature of 32 ° C. and a shaking speed of 100 rpm for 24 hours. went. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation (2000 g, 10 minutes).
  • YPD6 liquid medium yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 6%
  • the above-mentioned recovered cells are placed in 5 ml of YPD12L liquid medium (yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 12%, proteolipid 1%) at a concentration of 5.2 grams (in terms of dry cells) / liter (OD660 is 26). And cultured for 24 hours under conditions of a temperature of 32 ° C. and a shaking speed of 100 rpm, and the ethanol, lactic acid concentration and pH in the culture solution were measured over time. The results are shown in Table 3. S. cerevisiae into which a lactate dehydrogenase gene was introduced.
  • the pH is further reduced from 2.8 to 2.5 and the concentration of lactic acid is increased during 4 to 7 hours when lactic acid accumulates and the pH of the culture solution becomes 2.9 or less.
  • Example 5 (Reference example) ⁇ S. High-density culture test using a high-producing strain of pombe lactate dehydrogenase>
  • the transformant ASP2767 obtained in Example 3 was inoculated into a YPD6 liquid medium (yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 6%), and cultured for 24 hours at a temperature of 32 ° C. and a shaking speed of 100 rpm. It was. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation (2000 g, 10 minutes).
  • Example 6 ⁇ S. High Density Culture Test Using Pombe Lactate Dehydrogenase High-Production Strain (pdc2 Deleted Strain)> The transformant ASP2782 obtained in Example 3 was added to a YPD6 liquid medium (1% yeast extract, 2% peptone, 6% glucose). The cells were inoculated and cultured for 24 hours under conditions of a temperature of 32 ° C. and a shaking speed of 100 rpm. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation (2000 g, 10 minutes).
  • YPD12L fermentation medium yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 12%, proteolipid 1%) 0.2, 3.8, 15.0, 23.8, 31.6, Inoculated to a concentration of 46.8 grams (converted to dry cells) / liter (OD660 is 1, 19, 75, 119, 158, 234, respectively), and cultured at a temperature of 32 ° C. and a shaking speed of 100 rpm, respectively.
  • glucose, ethanol and lactic acid concentrations in the culture solution were measured. Table 5 shows the results and the yield of lactic acid against sugar and the production rate calculated from the measurement results.
  • Example 7 ⁇ S. High Density Repeated Culture Test Using Pombe Lactate Dehydrogenase High Production Strain (pdc2 Deleted Strain)>
  • the transformant ASP2782 obtained in Example 3 was inoculated into a YPD6 liquid medium (yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 6%) and cultured for 24 hours under conditions of a temperature of 32 ° C. and a shaking speed of 100 rpm. . After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation (2000 g, 10 minutes).
  • YPD12L liquid medium yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 12%, proteolipid 16% is inoculated to a concentration of about 30 grams (in terms of dry cells) / liter, and the temperature Culturing was performed under conditions of 32 ° C. and shaking speed of 100 rpm, and the concentrations of lactic acid and ethanol in the culture solution were measured. After completion of the culture, the culture supernatant and the cells were collected by centrifugation (2000 g, 10 minutes). The collected cells were added again to the same liquid medium and cultured. Further, this series of operations was performed 6 times.
  • Table 6 shows the inoculum concentration and the culture time in the total seven times of culture, the measurement results of glucose, ethanol and lactic acid concentrations at the end of the culture, and the yield of lactic acid against sugar calculated from the measurement results.
  • the yield of lactic acid against sugar is maintained at a high level even after repeated use, and lactic acid is stably produced with high productivity without neutralization with alkali. Was confirmed.
  • Example 8 ⁇ Minimization of medium> The transformant ASP2782 obtained in Example 3 was inoculated into a YPD6 liquid medium (yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 6%) and cultured for 24 hours under conditions of a temperature of 32 ° C. and a shaking speed of 100 rpm. . After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation (2000 g, 10 minutes).
  • a YPD6 liquid medium yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 6%
  • Example 9 ⁇ S. Results of lactic acid production using a high-producing strain of pombe lactate dehydrogenase> ASP2767 strain was inoculated into 5 ml of YPD24L liquid medium (yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 24%, proteolipid 1%) so that the cell concentration was 0.2 gram (dry cell equivalent) / liter. Culturing was carried out at 32 ° C. for 47 hours. The amount of lactic acid produced after completion of the culture was 124.2 g / L.
  • ASP2767 strain in 5 ml YPD12LA liquid medium has a cell concentration of 74.6 g (dry cell equivalent) / liter And inoculated for 1 hour at 32 ° C.
  • the amount of lactic acid produced after the end of fermentation was 58.6 g / L, and the production rate was 58.6 g / h.
  • ASP2782 strain was inoculated into 5 ml of YPD12L liquid medium (yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 12%, proteolipid 1%) so that the cell concentration was 31.6 g / dry liter. Fermentation was performed at 32 ° C.
  • ASP2782 strain was inoculated into 5 ml of YPD12 liquid medium (yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 12%) so that the cell concentration would be 44.0 g (in terms of dry cells) / liter. Time fermentation was performed. The amount of lactic acid produced after the end of fermentation was 85.7 g / L, and the yield to sugar was 88%. From the above results, it was shown that the ASP2782 strain from which the pdc2 gene was deleted has a higher productivity than the ASP2767 strain from which the pdc2 gene has not been deleted.
  • the transformant of the present invention and the method for producing lactic acid using the same can produce lactic acid with high productivity without performing neutralization with alkali even at low pH, it is suitable as an industrial production method for lactic acid. Can be used.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

　本発明は、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）を宿主とし、乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれ、かつ前記シゾサッカロミセス・ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活している、形質転換体に関する。

Description

形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法
　本発明は、形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法に関する。
　乳酸は食品用途や、医療、化粧品等の化学原料用途に広く用いられている。また、乳酸を用いて得られるポリ乳酸は、微生物等により最終的に二酸化炭素と水にまで分解される生分解性プラスチックとして注目されている。そのため、乳酸を安価に高い生産性で製造することが必要である。
　乳酸の製造方法としては、乳酸菌により糖を発酵させ製造する生物学的方法が知られている。しかし、乳酸菌は耐酸性が低いため、この方法で高い生産性を得るには発酵により産生される乳酸をアルカリにより中和して乳酸塩とする必要がある。このようなアルカリによる中和は、乳酸塩から乳酸に戻す工程が必要となるため、製造工程が煩雑になり製造コストも高くなる。
　そこで、アルカリによる中和を行わずに乳酸を得る方法として、サッカロミセス属の酵母等の耐酸性微生物を宿主とし、該耐酸性微生物に乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換体を用いる方法（特許文献１）、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入され、かつピルビン酸脱炭酸酵素１をコードする遺伝子を欠失または失活させたサッカロミセス・セレビシエ（出芽酵母）を用いる方法（特許文献２）が示されている。
日本国特開２００１－２０４４６４号公報 日本国特開２００８－４８７２６号公報
　しかしながら、特許文献１の方法は、２０～２４時間の培養時間でも２～５％の乳酸が得られる程度であり、生産性が充分でなかった。また、特許文献２の方法は、乳酸を大量生産する場合にはアルカリによる中和が必要となるため、工業的な乳酸の大量生産には適していなかった。そのため、アルカリによる中和を行わずに、高い生産性で乳酸を製造することができる方法が望まれている。
　そこで本発明では、アルカリによる中和を必要とせずに高い生産性で乳酸を産生できるシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）の形質転換体および該形質転換体の製造方法を目的とする。さらに、高濃度の糖存在下での乳酸産生に適し、かつ高密度発酵にも適した、形質転換体および該形質転換体の製造方法を目的とする。
　また、前記形質転換体を用いて、アルカリによる中和工程を行わずに高い生産性で乳酸を製造する方法を目的とする。
　なお、本発明において乳酸とは生物学的方法で得られるＬ－乳酸をいう。
　本発明の形質転換体は、シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれ、かつ前記シゾサッカロミセス・ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活している。
　また、本発明の形質転換体においては、前記欠失または失活しているピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子がＰＤＣ２遺伝子であることが好ましい。前記乳酸脱水素酵素遺伝子は哺乳動物の乳酸脱水素酵素遺伝子であることが好ましい。さらに、前記乳酸脱水素酵素遺伝子はシゾサッカロミセス・ポンベの染色体に組み込まれていることが好ましい。
　また、本発明の形質転換体の製造方法は、シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、シゾサッカロミセス・ポンベ内で機能するプロモーターとターミネーターと乳酸脱水素酵素遺伝子とを含む発現カセットを有するベクターを用いて、前記発現カセットを前記宿主に導入して形質転換体を得ること、および、前記宿主としてピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活した宿主を用いるかまたは前記得られた形質転換体のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部を欠失または失活させることを含む、乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれかつピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活している形質転換体を製造する方法、である。
　また、前記ベクターはさらにシゾサッカロミセス・ポンベの染色体に対して相同組換えを行わせる組換え部位を有し、このベクターを使用して発現カセットをシゾサッカロミセス・ポンベの染色体に導入することが好ましい。さらに、宿主の染色体における相同組み換えを行わせる標的部位がトランスポゾン遺伝子Ｔｆ２であることが好ましい。
　また、本発明の方法においては、前記欠失または失活しているピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子がＰＤＣ２遺伝子であることが好ましい。前記乳酸脱水素酵素遺伝子は哺乳動物の乳酸脱水素酵素遺伝子であることが好ましい。
　さらに、本発明は、前記形質転換体を培養液中で培養し、該培養液から乳酸を取得する乳酸の製造方法である。
　また、この乳酸の製造方法において、濃度１～５０質量％（さらに２～１６質量％が望ましい）のグルコースを含む培養液を使用して培養を行うことが好ましい。また、前記形質転換体により産生される乳酸により、前記培養液のｐＨが３．５以下になった後にさらに培養を継続することが好ましい。
　さらに、前記培養液中の形質転換体の初発菌体濃度を０．１～５０グラム（乾燥菌体換算）／リットルとすることが好ましい（さらに０．２～４０グラム（乾燥菌体換算）／リットルが望ましい）。また、前記形質転換体により産生された培養液中の乳酸を中和することなく培養を継続することが好ましく、また、培養液中の乳酸を中和することなく培養液から乳酸を分離することが好ましい。
　本発明のシゾサッカロミセス・ポンベの形質転換体は、アルカリによる中和を必要とせずに高い生産性で乳酸を産生できる。また、高濃度の糖、特にグルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、の存在下での乳酸産生に適し、かつ高密度培養にも適している。さらに、本発明の形質転換体の製造方法により、前記形質転換体を簡便に得ることができる。
　また、本発明の乳酸の製造方法は、アルカリによる中和工程を行わずに高い生産性で乳酸を製造することができる。
［形質転換体］
　本発明の形質転換体は、シゾサッカロミセス・ポンベ（以下、Ｓ．ポンベともいう）を宿主とし、乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれ、かつＳ．ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活している、形質転換体である。
＜Ｓ．ポンベ＞
　宿主であるＳ．ポンベは、シゾサッカロミセス属に属する酵母（分裂酵母）であり、他の酵母に比べて特に耐酸性に優れる微生物である。本発明者らは、Ｓ．ポンベがサッカロミセス・セレビシエ等の他の酵母に比べ、高濃度のグルコース下における乳酸の生産性に優れ、高密度培養（大量の酵母を用いた培養）にも適していることを見出し、Ｓ．ポンベの形質転換体を用いることにより、極めて高い生産性で乳酸を製造することができることを見出した。
　なお、Ｓ．ポンベの染色体の全塩基配列は、サンガー研究所のデータベース「ＧｅｎｅＤＢ」に「Schizosaccharomyces pombe Gene DB （http://www.genedb.org/genedb/pombe/）」として、収録され、公開されている。本明細書記載のＳ．ポンベの遺伝子の配列データは上記データベースから遺伝子名や上記系統名で検索して、入手できる。
　本発明に用いられるＳ．ポンベは、耐酸性を有するものであれば特に限定されない。
　Ｓ．ポンベは、公的あるいは民間の寄託機関、すなわち、American Type Culture Collection（ATCC、Manassas、VA、USA）、National Collection of Yeast Cultures（NCYC、Norwich、United Kingdom）、NITE Biological Resource Center（NBRC、日本国千葉県木更津市）、酵母遺伝資源センター(YGRC、日本国大阪市立大学大学院理学研究科内）などから入手可能である。
＜ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子＞
　Ｓ．ポンベにおけるピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子（ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子、以下「ＰＤＣ遺伝子」ともいう）群には、ピルビン酸脱炭酸酵素１をコードする遺伝子（以下、「ＰＤＣ１遺伝子」という）、ピルビン酸脱炭酸酵素２をコードする遺伝子（以下、「ＰＤＣ２遺伝子」という）、ピルビン酸脱炭酸酵素３をコードする遺伝子（以下、「ＰＤＣ３遺伝子」という）、ピルビン酸脱炭酸酵素４をコードする遺伝子（以下、「ＰＤＣ４遺伝子」という）の４種類がある。なかでも、Ｓ．ポンベにおいては、ＰＤＣ２遺伝子とＰＤＣ４遺伝子が主要な機能を持つＰＤＣ遺伝子である。各ＰＤＣ遺伝子の系統名は以下の通りである。
　ＰＤＣ１遺伝子（Ｐｄｃ１）；ＳＰＡＣ１３Ａ１１．０６
　ＰＤＣ２遺伝子（Ｐｄｃ２）；ＳＰＡＣ１Ｆ８．０７ｃ
　ＰＤＣ３遺伝子（Ｐｄｃ３）；ＳＰＡＣ１８６．０９
　ＰＤＣ４遺伝子（Ｐｄｃ４）；ＳＰＡＣ３Ｇ９．１１ｃ
　上記ＰＤＣ遺伝子の配列データは、前記Ｓ．ポンベ遺伝子データベースから遺伝子名や系統名で検索して入手できる。
　野生型Ｓ．ポンベでは、解糖系によりグルコースをピルビン酸まで代謝し、前述のＰＤＣ遺伝子から発現されるピルビン酸脱炭酸酵素によりピルビン酸がアセトアルデヒドに変換され、次いで該アセトアルデヒドがアルコール脱水素酵素によりエタノールへと変換されることでエタノール発酵が行われる。また、野生型Ｓ．ポンベは機能を持った乳酸脱水素酵素遺伝子を有していないことより、ピルビン酸から乳酸が生成するルートは存在しない。
　一方、組み込まれた乳酸脱水素酵素遺伝子から発現される乳酸脱水素酵素は、ピルビン酸を乳酸に還元することにより乳酸を産生させる。そのため、野生型Ｓ．ポンベに乳酸脱水素酵素遺伝子を組み込んで乳酸を産生できるようにしても、そのままではエタノール発酵と乳酸発酵の両方を行うことになるため、乳酸の生産性が充分に高くならない。
　本発明の形質転換体は、前記ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群のうち、一部が欠失または失活した染色体を有する。形質転換体のＰＤＣ遺伝子群の一部が欠失または失活していることにより、形質転換体のエタノール発酵の効率が低下し、エタノールに変換されるピルビン酸量が少なくなるため、乳酸の生産性が向上する。ただし、ＰＤＣ遺伝子群を完全に欠失または失活させると、エタノール発酵が全く行えなくなって生育が阻害されるため、欠失または失活させるのはＰＤＣ遺伝子群の一部とする。
　欠失または失活させるＰＤＣ遺伝子は、ＰＤＣ２遺伝子であることが特に好ましい。ＰＤＣ２遺伝子は、特に主要な機能を持つＰＤＣ遺伝子である。
　前述のように、ＰＤＣ遺伝子を全て欠失または失活させてしまうと、その形質転換体はエタノール発酵が行えなくなるために生育が阻害される。そのため、ＰＤＣ遺伝子の欠失または失活は、生育に必要なエタノール発酵能を残して充分な形質転換体量が得られるようにしつつ、エタノール発酵能を低下させて乳酸の発酵効率を向上させられるように行わなければならない。この課題に対して本発明者等が検討を行った結果、ＰＤＣ２遺伝子を欠失または失活させるとＰＤＣ４遺伝子がある程度活性化し、充分な形質転換体量が得られる程度のエタノール発酵能と、高い発酵効率での乳酸の生産が両立できることを見い出した。
　ＰＤＣ遺伝子の欠失や失活は、公知の方法で行うことができる。例えば、Ｌａｔｏｕｒ法（Ｎｕｃｒｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ誌、２００６年、３４巻、ｅ１１頁、国際公開第２００７／０６３９１９号パンフレット等に記載）を用いることによりＰＤＣ遺伝子を欠失させることができる。
　また、ＰＤＣ遺伝子の塩基配列の一部に欠失、挿入、置換、付加を起こすことにより、該ＰＤＣ遺伝子を失活させることもできる。これらの欠失、挿入、置換、付加による変異は、それらのいずれか１つのみを起こしてもよく、２つ以上を起こしてもよい。
　ＰＤＣ遺伝子の一部に前記変異を導入する方法は、公知の方法を用いることができる。
　例えば、変異剤を用いた突然変異分離法（酵母分子遺伝学実験法、１９９６年、学会出版センター）や、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を利用したランダム変異法（ピーシーアール・メソッズ・アプリケーション（ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｐｐｌ．）、１９９２年、第２巻、ｐ．２８－３３．）等が挙げられる。
　また、一部に変異が導入されたＰＤＣ遺伝子は、温度感受性の変異型ピルビン酸脱炭酸酵素を発現するものであってもよい。温度感受性の変異型ピルビン酸脱炭酸酵素とは、ある培養温度においては野生型のピルビン酸脱炭酸酵素と同等の活性を示すが、特定の培養温度以上になると活性の消失または低下が見られる酵素である。
　このような変異型ピルビン酸脱炭酸酵素を発現する突然変異株は、活性が制限されない温度条件下では野生型酵母と同等の生育速度を示し、活性が制限される特定の温度条件下において生育速度が著しく低下するものを選択することで得ることができる。
＜宿主＞
　ＰＤＣ遺伝子が欠失または失活したＳ．ポンベの変異体は、本発明の形質転換体を製造するための宿主として使用することができる。さらに、ＰＤＣ遺伝子以外にさらにＰＤＣ遺伝子以外の特定遺伝子を欠失または失活させたＳ．ポンベを宿主とすることもできる。ＰＤＣ遺伝子以外の特定遺伝子を欠失または失活させたＳ．ポンベ宿主としては、例えば、国際公開第２００２／１０１０３８号パンフレット、国際公開第２００７／０１５４７０号パンフレット等に記載されている。プロテアーゼ遺伝子等を欠失または失活させることにより異種蛋白質の発現効率を高めることができ、本発明における宿主に適用することにより乳酸の生産効率の向上が期待できる。
　さらに宿主として使用するＳ．ポンベには、形質転換体を選択するためのマーカーを有するものを用いることが好ましい。例えば、ある遺伝子が欠落していることにより特定の栄養成分が生育に必須である宿主を使用することが好ましい。ベクターにこの欠落している遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を組み込んでおくことにより、形質転換体においては宿主の栄養要求性が消失する。この宿主と形質転換体の栄養要求性の相違により、両者を区別して形質転換体を得ることができる。
　例えば、オロチジンリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｕｒａ４遺伝子）が欠失または失活してウラシル要求性となっているＳ．ポンベを宿主とし、ｕｒａ４遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を有するベクターにより形質転換した後、ウラシル要求性が消失したものを選択することにより、ベクターが組み込まれた形質転換体を得ることができる。宿主において欠落により栄養要求性となる遺伝子は、形質転換体の選択に用いられるものであればｕｒａ４遺伝子には限定されず、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）等であってもよい。
　また、ＰＤＣ遺伝子群が欠失も失活もしていないＳ．ポンベを形質転換体製造のための宿主として使用することもできる。この場合の宿主としてはＰＤＣ遺伝子以外の前記のような遺伝子（栄養要求性マーカーやプロテアーゼ遺伝子など）が欠失または失活しているものを使用できる。この宿主を用いて形質転換体を製造した後、その形質転換体のＰＤＣ遺伝子群の一部を欠失または失活させて、本発明の形質転換体を得ることができる。
＜乳酸脱水素酵素遺伝子＞
　本発明の形質転換体は、乳酸脱水素酵素遺伝子（乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子、以下「ＬＤＨ遺伝子」ともいう。）を有する。前記のように、Ｓ．ポンベは本来ＬＤＨ遺伝子を有していない。したがって、Ｓ．ポンベ以外の生物のＬＤＨ遺伝子を遺伝子工学的方法でＳ．ポンベに導入して形質転換体を得る。
　本発明におけるＬＤＨ遺伝子は特に限定されず、例えば、ビヒドバクテリウム属、ラクトバシルス属等に属する微生物由来のＬＤＨ遺伝子や、ヒト等の哺乳動物由来のＬＤＨ遺伝子が挙げられる。なかでも、Ｓ．ポンベによる乳酸産生の効率に優れる点から、哺乳動物由来のＬＤＨ遺伝子であることが好ましい。なかでもヒト由来のＬＤＨ遺伝子であることがより好ましい（文献：Tsujibo H, Tiano HF, Li SS-L. Nucleotide sequences of the cDNA and an intronless pseudogene for human lactate dehydrogenase-A isozyme. Eur. J. Biochem. (1985) 147, 9-15）。さらには下記配列表の配列番号１に記載のＬＤＨ遺伝子であることが好ましい。
［形質転換体の製造］
　本発明の形質転換体は、ＰＤＣ遺伝子群の一部が欠失または失活したＳ．ポンベを宿主とし、これにＬＤＨ遺伝子を遺伝子工学的方法でＳ．ポンベに導入して得られる。また、ＰＤＣ遺伝子群が欠失も失活もしていないＳ．ポンベを宿主とし、これにＬＤＨ遺伝子を遺伝子工学的方法でＳ．ポンベに導入して形質転換体を得て、その後得られた形質転換体のＰＤＣ遺伝子群の一部を欠失または失活させて、本発明の形質転換体を得ることもできる。後述の実施例では、前者の方法で目的の形質転換体を製造したが、後者の方法でもほぼ同等の形質転換体を製造することができる。以下、前者の方法を例に形質転換体の製造方法を説明する。
　遺伝子工学的方法で宿主にＬＤＨ遺伝子を導入する方法としては公知の方法を使用できる。Ｓ．ポンベを宿主としてこれに異種蛋白質の構造遺伝子を導入する方法としては、例えば、日本国特開平５－１５３８０号公報、国際公開第９５／０９９１４号パンフレット、日本国特開平１０－２３４３７５号公報、日本国特開２０００－２６２２８４号公報、日本国特開２００５－１９８６１２号公報などに記載の方法を使用できる。
　ＬＤＨ遺伝子はＳ．ポンベの染色体に導入することが好ましい。染色体にＬＤＨ遺伝子を導入することにより継代の維持安定性に優れた形質転換体が得られる。また、ＬＤＨ遺伝子は染色体に複数導入することもできる。ＬＤＨ遺伝子を複数導入することにより、ＬＤＨ遺伝子の発現効率を高めることができ、ひいては乳酸の生産効率が向上すると考えられる。本発明の形質転換体において、染色体に組み込まれたＬＤＨ遺伝子の数は１～２０が好ましく、特に１～８が好ましい。
　染色体にＬＤＨ遺伝子を導入する方法としては公知の方法を使用できる。例えば、前記日本国特開２０００－２６２２８４号公報に記載の方法で染色体にＬＤＨ遺伝子を複数導入することができる。また、この方法で染色体にＬＤＨ遺伝子を1個導入することもできる。また、後述のように、染色体の複数の箇所に1個または複数のＬＤＨ遺伝子を導入することもできる。
　ＬＤＨ遺伝子をＳ．ポンベの染色体に導入する方法としては、ＬＤＨ遺伝子を有する発現カセットと組換え部位とを有するベクターを用い、相同組換え法により導入する方法が好ましい。以下にこの方法に使用するベクターと相同組換え法を説明する。
＜ベクター＞
　ベクターは、ＬＤＨ遺伝子を有する発現カセットと組換え部位を有する。
　発現カセットとは、乳酸脱水素酵素を発現するために必要なＤＮＡの組み合わせであり、ＬＤＨ遺伝子とＳ．ポンベ内で機能するプロモーターとＳ．ポンベ内で機能するターミネーターを含む。さらに、５’－非翻訳領域、３’－非翻訳領域のいずれか１つ以上が含まれていてもよい。さらに、前記栄養要求性相補マーカーが含まれていてもよい。好ましい発現カセットは、ＬＤＨ遺伝子、プロモーター、ターミネーター、５’－非翻訳領域、３’－非翻訳領域、栄養要求性相補マーカーを含む発現カセットである。発現カセットには複数のＬＤＨ遺伝子が存在していてもよい。発現カセット中のＬＤＨ遺伝子の数は１～８が好ましく、１～５がより好ましい。
　Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとターミネーターは、本発明の形質転換体により乳酸が蓄積して酸性になっても（ｐＨ６以下になっても）、形質転換体内で機能して乳酸脱水素酵素の発現を維持することができるものであればよい。Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとしては、Ｓ．ポンベが本来有するプロモーター（転写開始活性が高いものが好ましい）やＳ．ポンベが本来有しないプロモーター（ウイルス由来のプロモーターなど）を使用することができる。なお、プロモーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
　Ｓ．ポンベが本来有するプロモーターとしては、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、チアミンの代謝に関与するｎｍｔ１遺伝子プロモーター、グルコースの代謝に関与するフルクトース－１、６－ビスホスファターゼ遺伝子プロモーター、カタボライト抑制に関与するインベルターゼ遺伝子のプロモーター（国際公開第９９／２３２２３号パンフレット参照）、熱ショック蛋白質遺伝子プロモーター（国際公開第２００７／２６６１７号パンフレット参照）などが挙げられる。
　Ｓ．ポンベが本来有しないプロモーターとしては、例えば、日本国特開平５－１５３８０号公報、日本国特開平７－１６３３７３号公報、日本国特開平１０－２３４３７５号公報に記載されている動物細胞ウイルス由来のプロモーターが挙げられ、ｈＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターが好ましい。
　Ｓ．ポンベ内で機能するターミネーターとしては、Ｓ．ポンベが本来有するターミネーターやＳ．ポンベが本来有しないターミネーターを使用することができる。なお、ターミネーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
　ターミネーターとしては、例えば、日本国特開平５－１５３８０号公報、日本国特開平７－１６３３７３号公報、日本国特開平１０－２３４３７５号公報に記載されているヒト由来のターミネーターが挙げられ、ヒトリポコルチンＩのターミネーターが好ましい。
　ベクターの組換え部位は、Ｓ．ポンベの染色体における相同組換えの標的部位に対して相同組換えを行わせることのできる塩基配列を有する部位である。また、標的部位は、Ｓ．ポンベの染色体内で発現カセットを組み込む標的となる部位である。標的部位は、ベクターの組換え部位を該標的部位に対して相同組換えを行わせる塩基配列とすることにより自由に設定することができる。
　前記組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は７０％以上とすることが必要である。また、組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は、相同組換えが起きやすくなる点から、９０％以上とすることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。このような組換え部位を有するベクターを用いることにより、発現カセットが相同組換えにより標的部位に組み込まれる。
　組換え部位の長さ（塩基数）は、２０～２０００ｂｐであることが好ましい。組換え部位の長さが２０ｂｐ以上であれば、相同組換えが起きやすくなる。また、組換え部位の長さが２０００ｂｐ以下であれば、ベクターが長くなりすぎて相同組換えが起き難くなることを防ぎやすい。組換え部位の長さは１００ｂｐ以上であることがより好ましく、２００ｂｐ以上であることがさらに好ましい。また、組換え部位の長さは８００ｂｐ以下であることがより好ましく、４００ｂｐ以下であることがさらに好ましい。
　ベクターは、前記発現カセットと組換え部位以外に他のＤＮＡ領域を有していてもよい。例えば、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域や抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子等）が挙げられる。これらは大腸菌を使用してベクターを構築する場合に通常必要とされる遺伝子である。ただし、上記複製開始領域は後述のようにベクターを宿主の染色体に組み込む際には除去されることが好ましい。
　ベクターは、環状ＤＮＡ構造または線状ＤＮＡ構造を有するベクターであり、Ｓ．ポンベの細胞に導入する際には線状ＤＮＡ構造で導入することが好ましい。すなわち、通常用いられるプラスミドＤＮＡのような環状ＤＮＡ構造を有するベクターである場合には、制限酵素でベクターを線状に切り開いた後にＳ．ポンベの細胞に導入することが好ましい。
　この場合、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く位置は、組換え部位内とする。これにより、切り開かれたベクターの両端にそれぞれ組換え部位が部分的に存在することとなり、相同組換えによりベクター全体が染色体の標的部位に組み込まれる。
　ベクターは、両端それぞれに組換え部位の一部が存在するような線状ＤＮＡ構造とすることができれば、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く方法以外の方法で構築してもよい。
　ベクターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等の大腸菌由来のプラスミドを好適に用いることができる。
　この場合、相同組換えに用いる際のプラスミドベクターは、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域が除去されていることが好ましい。これにより、上述したベクターを染色体に組み込む際に、その組み込み効率を向上させることができる。
　複製開始領域が除去されたベクターの構築方法は特に限定されないが、日本国特開２０００－２６２２８４号公報に記載されている方法を用いることが好ましい。すなわち、組換え部位内の切断箇所に複製開始領域が挿入された前駆体ベクターを構築しておき、前述のように線状ＤＮＡ構造とすると同時に複製開始領域が切り出されるようにする方法が好ましい。これにより、簡便に複製開始領域が除去されたベクターを得ることができる。
　また、日本国特開平５－１５３８０号公報、日本国特開平７－１６３３７３号公報、国際公開第９６／２３８９０号パンフレット、日本国特開平１０－２３４３７５号公報等に記載された発現ベクターやその構築方法を適用して、発現カセットおよび組換え部位を有する前駆体ベクターを構築し、さらに通常の遺伝子工学的手法で該前駆体ベクターから複製開始領域を除去して相同組換えに用いるベクターを得る方法であってもよい。
＜標的部位＞
　ベクターを組み込む標的部位は、Ｓ．ポンベの染色体中の１箇所のみに存在していてもよく、２箇所以上に存在していてもよい。標的部位が２箇所以上存在している場合、Ｓ．ポンベの染色体に組み込まれるベクターを２箇所以上とすることができる。また、発現カセット中のＬＤＨ遺伝子を複数とした場合には、標的部位の１箇所に複数のＬＤＨ遺伝子を組み込むことができる。さらに、２種以上の標的部位に、それぞれの標的部位に対応する組換え部位を有する２種以上のベクターを用いて、発現カセットを組み込むこともできる。これらの方法で、Ｓ．ポンベの染色体に複数のＬＤＨ遺伝子を組み込むことができ、これにより乳酸脱水素酵素の発現量を増大させ、乳酸の生産性を向上させることができる。
　１箇所の標的部位に発現カセットを組み込む場合、例えば日本国特開２０００－２６２２８４号公報に記載の方法を使用できる。異なる組込み部位を有する２種以上のベクターを用いて、異なる標的部位にそれぞれベクターを組み込むことができる。しかし、染色体の２箇所以上にベクターを組み込む場合、この方法は煩雑である。
　染色体中に複数箇所存在する互いに実質的に同一の塩基配列部分を標的部位として、この複数箇所の標的部位にそれぞれベクターを組み込むことができれば、１種類のベクターを使用して染色体の２箇所以上にベクターを組み込むことができる。互いに実質的に同一の塩基配列とは、塩基配列の相同性が９０％以上であることを意味する。標的部位同士の相同性は９５％以上であることが好ましい。また、互いに実質的に同一である塩基配列の長さは、前記ベクターの組換え部位を包含する長さであり、１０００ｂｐ以上であることが好ましい。１箇所の標的部位に複数のＬＤＨ遺伝子が組み込まれている場合に比較して、ＬＤＨ遺伝子の組み込み数が同一であっても、複数存在する標的部位にＬＤＨ遺伝子が分散して組み込まれている場合には、形質転換体が増殖する際にＬＤＨ遺伝子が染色体から１度に脱落することが少なくなり、形質転換体の継代における維持安定性が向上する。
　染色体中に複数箇所存在する標的部位としては、トランスポゾン遺伝子Ｔｆ２が好ましい。Ｔｆ２は、Ｓ．ポンベの３本（一倍体）の染色体それぞれに合計１３箇所存在するトランスポゾン遺伝子であり、長さ（塩基数）は約４９００ｂｐであり、それらの遺伝子間における塩基配列相同性は９９．７％であることが知られている（下記文献参照）。
　Nathan J. Bowen et al, “Retrotransposons and Their Recognition of pol II Promoters: A Comprehensive Survey of the Transposable Elements From the Complete Genome Sequence of Schizosaccharomyces pombe”, Genome Res. 2003 13: 1984-1997
　染色体に１３箇所存在するＴｆ２の１箇所のみにベクターを組み込むことができる。この場合、２個以上のＬＤＨ遺伝子を有するベクターを組み込むことにより、２個以上のＬＤＨ遺伝子を有する形質転換体を得ることができる。また、Ｔｆ２の２箇所以上にベクターを組み込むことにより、２個以上のＬＤＨ遺伝子を有する形質転換体を得ることができる。この場合、２個以上のＬＤＨ遺伝子を有するベクターを組み込むことにより、さらに多くのＬＤＨ遺伝子を有する形質転換体を得ることができる。Ｔｆ２の１３箇所すべてにベクターが組み込まれると、形質転換体の生存や増殖に対する負荷が大きくなりすぎるおそれがある。好ましくは、１３箇所のＴｆ２の８箇所以下にベクターが組み込まれることが好ましく、５箇所以下にベクターが組み込まれることがより好ましい。
＜形質転換方法＞
　Ｓ．ポンベ宿主を相同組み換え法で形質転換する方法としては、公知の相同組み換え法を使用できる。本発明の形質転換方法としては、上述のＰＤＣ遺伝子群の一部が欠失または失活したＳ．ポンベを宿主とし、その染色体に上述のベクターを用いて、発現カセットを相同組換えにより組み込む方法が好ましい。この製造方法によれば、本発明の形質転換体を簡便に製造することができる。
　本発明の形質転換法では、通常、相同組換えを行った後、得られた形質転換体を選択する。選択する方法としては、例えば、以下に示す方法が挙げられる。前記栄養要求性マーカーにより形質転換体を選択できる培地によりスクリーニングし、得られたコロニーから複数を選択する。次に、それらを別々に液体培養した後、それぞれの培養液における異種蛋白質の発現量を調べ、異種蛋白質の発現量がより多い形質転換体を選択する。また、それら選択した形質転換体に対してパルスフィールドゲル電気泳動法によるゲノム解析を行うことにより、染色体に組み込まれたベクターの数や発現カセットの数を調べることができる。
　染色体に組み込まれるベクターの数は組み込み条件などを調整することによりある程度は調整可能であるが、ベクターの大きさ（塩基数）や構造により組み込み効率や組み込み数も変化すると考えられる。
　Ｓ．ポンベの染色体に複数のＬＤＨ遺伝子を組み込むことにより乳酸脱水素酵素の発現量を増大させ、乳酸の生産性を向上させることができると考えられる。しかし、本発明の目的は乳酸の生産効率の高い形質転換体を得ることにあり、単に発現カセットの総数がより多い形質転換体を得ることを目的とするものではない。一般には発現カセットの数が多いほど乳酸脱水素酵素の発現効率が高まり、ひいては乳酸の生産効率が高まると予想される。しかし、発現カセットの数が多すぎると細胞の生存や増殖に対する負荷が増大し、ひいては乳酸生産効率が低下することも考えられる。また、ベクターが大きくなると、染色体に組み込まれる確率が低下し、組み込まれるベクター数を多くすることが困難となり、ひいては形質転換体を得ること自体が困難となると考えられる。
［乳酸の製造方法］
　本発明の乳酸の製造方法は、前記本発明の形質転換体を培養液中で培養し、該培養液から乳酸を取得する乳酸の製造方法である。
　本発明の形質転換体を糖を含む培養液中で培養することにより、解糖系により該糖から得られるピルビン酸が乳酸脱水素酵素により還元されて乳酸が産生され、培養液に産出された乳酸を培養液から取得することで乳酸を製造することができる。
　乳酸の製造に用いる培養液としては、糖を含有する公知の酵母培養培地を用いることができ、さらにＳ．ポンベが資化しうる窒素源、無機塩類等を含有し、Ｓ．ポンベの培養を効率良く行えるものであればよい。培養液としては、天然培地を用いてもよく、合成培地を用いてもよい。
　炭素源である糖としては、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース等の糖が挙げられる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または無機酸のアンモニウム塩、ペプトン、カザミノ酸、イーストエキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。さらには、プロテオリピドなどの発酵促進因子などを含ませることができる。
　本発明の乳酸の製造方法では、糖として特にグルコースを含有する培養液を用いることが好ましい。培養初期の培養液（１００質量％）中のグルコース濃度は１質量％以上が好ましく、１～５０質量％がより好ましく、２～１６質量％がさらに好ましい。培養によりグルコース濃度が低下することより、必要によりグルコースを添加して培養を継続することが好ましい。培養終期のグルコース濃度は１質量％以下となってもよい。また、乳酸を分離しながら培養液を循環させて連続的に培養を行う場合には上記グルコース濃度を維持することが好ましい。グルコース濃度を２質量％以上とすることにより、乳酸の生産性がより向上する。また、培養液中のグルコースを１６質量％以下とすることにより、乳酸の生産効率がより向上する。
　また、乳酸製造の生産性を高くするために、高密度培養を行うことが好ましい。高密度培養では、培養液中の形質転換体の初発菌体濃度を乾燥菌体重量換算値で表して０．１～５０グラム／リットルとすることが好ましい。培養液中の形質転換体の初発菌体濃度を乾燥菌体重量換算値で表して０．２～４０グラム／リットルとすることがより好ましい。初発菌体濃度を高くすることにより短時間で高い生産性を達成できる。また、初発菌体濃度があまりに高すぎると菌体の凝集や精製効率の低下などの問題が生じるおそれがある。
　なお、後述の実施例等で示す菌体濃度は、日本分光社製可視紫外分光器Ｖ５５０によって測定した波長６６０ｎｍの光の吸光度（ＯＤ６６０）から換算した値である。６６０ｎｍにおけるＯＤ＝１は、分裂酵母乾燥重量の０．２ｇ、湿重量の０．８ｇに相当する。
　培養には公知の酵母培養方法を用いることができ、例えば振とう培養、攪拌培養等により行うことができる。
　また、培養温度は、２３～３７℃であることが好ましい。また、培養時間は適宜決定することができる。
　また、培養は、回分培養であってもよく、連続培養であってもよい。例えば、回分培養で培養を行った後、菌体を培養液から分離して、乳酸を含む培養液を取得することができる。また、連続培養法では、例えば、培養中の培養槽から培養液の一部を抜き出し、抜き出した培養液から乳酸を分離するとともに、培養上清を回収し、該培養上清にグルコースや新たな培養液を加えて培養槽に戻すことを繰り返して、連続的に培養する方法が挙げられる。連続培養を行うことにより、乳酸の生産性がより向上する。
　本発明の形質転換体を用いた乳酸の製造方法では、乳酸の蓄積により低ｐＨ（ｐＨ２～４程度）となっても中和を行わずに乳酸を生産することができる。そのため、培養液のｐＨが４以下になった後も、さらに培養を継続する連続培養により乳酸を製造することができる。培養終期のｐＨや連続培養におけるｐＨは１～４が好ましく、特に、１．５～３．５が好ましい。乳酸の生産性を高くするために、培養液のｐＨが３．５以下になった後にさらに培養を継続することが好ましい。本発明の形質転換体は耐酸性が優れていることにより、形質転換体により産生された培養液中の乳酸を中和することなく培養を継続することができる。
　培養液からの乳酸の取得は、公知の方法を用いることができる。特に、培養液中の乳酸を中和することなく、培養液と乳酸を分離して、乳酸を取得することが好ましい。例えば、培養終了後の培養液から遠心分離により菌体を分離し、ｐＨ１以下にした後にジエチルエーテルや酢酸エチル等により抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着させて洗浄した後に溶出させる方法、活性炭を用いて不純物を除去する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させた後に蒸留する方法、分離膜を用いて分離する方法が挙げられる。また、場合によっては培養液中の乳酸を中和した後培養液と乳酸塩を分離して、乳酸を取得することもできる。例えば、培養液中の乳酸をカルシウム塩またはリチウム塩に変換し、この中和塩を晶析する方法で乳酸を取得することもできる。
　以上説明した本発明の乳酸の製造方法は、特に耐酸性に優れたＳ．ポンベを宿主とする形質転換体を用いるため、アルカリによる中和を行わなくても高い生産性で簡便に乳酸を製造することができる。また、ＰＤＣ遺伝子群の一部が欠失または失活していることでエタノール発酵の効率が低下しているため、乳酸の対糖収率（消費された糖の量に対する乳酸の生産量の割合）が向上する。本発明においては、乳酸の対糖収率を５０質量％以上とすることが容易にできる。場合により、乳酸の対糖収率は７０質量％以上にも達する。また、本発明の乳酸の製造方法は、高濃度のグルコース存在下、および高濃度の形質転換体による高密度培養にも適している。
　以下、実施例および比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。なお、本実施例においては特に断りのない限り「％」は「質量％」を意味する。
［例１］　
＜Ｓ．ポンベ遺伝子削除株の作製＞　
　Ｓ．ポンベのウラシル要求性株（ＡＲＣ０１０、遺伝子型：ｈ－　ｌｅｕ１－３２　ｕｒａ４－Ｄ１８、東京大学大学院理学系研究科附属遺伝子実験施設・飯野雄一教授より供与）をＬａｔｏｕｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．誌、２００６年、３４巻、ｅ１１頁、国際公開第２００７／０６３９１９号パンフレットに記載）に従って形質転換し、ピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）遺伝子およびアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）遺伝子を削除した削除株を作製した。
　削除断片の作製には、Ｓ．ポンベのＡＲＣ０３２株（遺伝子型：ｈ－、東京大学大学院理学系研究科附属遺伝子実験施設・飯野雄一教授より供与）よりＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、削除する遺伝子ごとにそれぞれ次に示す配列の８種の合成オリゴＤＮＡ（オペロン社製）を使用した。
　（１）ｐｄｃ１（系統名：SPAC13A11.06）削除断片の作製のためのオリゴＤＮＡ
　　　ＵＦ：5’-AGGCAAATCGTGAACTCGG-3’ （下記配列表の配列番号２）
　　　ＵＲ：5’-GCCAATTCCACTCTCAATAGCCCGAACGTTCCGTCTCG-3’ （下記配列表の配列番号３）
　　　ＯＦ：5’-GCTATTGAGAGTGGAATTGGC-3’ （下記配列表の配列番号４）
　　　ＯＲ：5’-AGTGGGATTTGTAGCTAAGCTACTGGTTTCCACATTGTTTGG-3’ （下記配列表の配列番号５）
　　　ＤＦ：5’-AAGTTTCGTCAATATCACAAGCTCGAGACGGAACGTTCGG-3’ （下記配列表の配列番号６）
　　　ＤＲ：5’-TTACAATGCTGAGTGTGTATTCC-3’ （下記配列表の配列番号７）
　　　ＦＦ：5’-TGAACTCGGTTGAAAAATGTCG-3’ （下記配列表の配列番号８）
　　　ＦＲ：5’-TGAGTGTGTATTCCTTTTTCGC-3’ （下記配列表の配列番号９）。
　（２）ｐｄｃ２（系統名：SPAC1F8.07c）削除断片の作製のためのオリゴＤＮＡ
　　　ＵＦ：5’-CTCTCCAGCTCCATCCATAAG-3’ （下記配列表の配列番号１０）
　　　ＵＲ：5’-GACACAACTTCCTACCAAAAAGCCTTTCTGCCCATGTTTTCTGTC-3’ （下記配列表の配列番号１１）
　　　ＯＦ：5’-GCTTTTTGGTAGGAAGTTGTGTC-3’ （下記配列表の配列番号１２）
　　　ＯＲ：5’-AGTGGGATTTGTAGCTAAGCTGTATCCATTTCAGCCGTTTGTG-3’ （下記配列表の配列番号１３）
　　　ＤＦ：5’-AAGTTTCGTCAATATCACAAGCTGACAGAAAACATGGGCAGAAAG-3’ （下記配列表の配列番号１４）
　　　ＤＲ：5’-GTTCCTTAGAAAAAGCAACTTTGG-3’ （下記配列表の配列番号１５）
　　　ＦＦ：5’-CATAAGCTTGCCACCACTTC-3’ （下記配列表の配列番号１６）
　　　ＦＲ：5’-GAAAAAGCAACTTTGGTATTCTGC-3’ （下記配列表の配列番号１７）。
　（３）ｐｄｃ３（系統名：SPAC186.09）削除断片の作製のためのオリゴＤＮＡ
　　　ＵＦ：5’-AAGGCATATTCGTTGATTAACCC-3’ （下記配列表の配列番号１８）
　　　ＵＲ：5’-GGTGGAAAGGTTTGTGCAATCCGTCAACTCATGATATTTCTTTATGG-3’ （下記配列表の配列番号１９）
　　　ＯＦ：5’-GATTGCACAAACCTTTCCACC-3’ （下記配列表の配列番号２０）
　　　ＯＲ：5’-AGTGGGATTTGTAGCTAAGCTCATCCCACATCTGTAATAATCACG-3’ （下記配列表の配列番号２１）
　　　ＤＦ：5’-AAGTTTCGTCAATATCACAAGCTCCATAAAGAAATATCATGAGTTGACG-3’ （下記配列表の配列番号２２）
　　　ＤＲ：5’-TTTGAGAAGAAAATTTTATGTCCAGC-3’ （下記配列表の配列番号２３）
　　　ＦＦ：5’-CCATTTAGCAGTATAAGGGTCG-3’ （下記配列表の配列番号２４）
　　　ＦＲ：5’-AAGTAAAAATGTGAAAGCAATGTAGG-3’ （下記配列表の配列番号２５）。
　（４）ｐｄｃ４（系統名：SPAC3G9.11c）削除断片の作製のためのオリゴＤＮＡ
　　　ＵＦ：5’-ACACACAAACACTTCCATTCC-3’ （下記配列表の配列番号２６）
　　　ＵＲ：5’-CCTAACAAAAGCATCATTTGAGAAGACGAATGAAATGACAGCAAC-3’ （下記配列表の配列番号２７）
　　　ＯＦ：5’-TTCTCAAATGATGCTTTTGTTAGG-3’ （下記配列表の配列番号２８）
　　　ＯＲ：5’-AGTGGGATTTGTAGCTAAGCTCTGGACAAGTCTACCTTGGAG-3’ （下記配列表の配列番号２９）
　　　ＤＦ：5’-AAGTTTCGTCAATATCACAAGCTGTTGCTGTCATTTCATTCGTC-3’ （下記配列表の配列番号３０）
　　　ＤＲ：5’-GATACAGGAGTACAACAAAACAC-3’ （下記配列表の配列番号３１）
　　　ＦＦ：5’-TCTCCATCCCTCCTCCC-3’ （下記配列表の配列番号３２）
　　　ＦＲ：5’-ACGCTACTTAAACAAGACAAGC-3’ （下記配列表の配列番号３３）。
　（５）ａｄｈ１（系統名：SPCC13B11.01）削除断片の作製のためのオリゴＤＮＡ
　　　ＵＦ：5’-TCATTCCTCGATATTCAGTTC-3’ （下記配列表の配列番号３４）
　　　ＵＲ：5’-GCCAGTGGGATTTGTAGCTACTCTGATCGGCATTTTTTGG-3’ （下記配列表の配列番号３５）
　　　ＯＦ：5’-GTTTCGTCAATATCACAAGCTTCCCCAACCTCCCATTTCCTCC-3’ （下記配列表の配列番号３６）
　　　ＯＲ：5’-CTACGATCAGAAGAAGATCAATGAGACGCGGAAGGGGAGCGCC-3’ （下記配列表の配列番号３７）
　　　ＤＦ：5’-GGCGCTCCCCTTCCGCGTCTCATTGATCTTCTTCTGATCGTAG-3’ （下記配列表の配列番号３８）
　　　ＤＲ：5’-ATGCATTTCACTCTATTCCTC-3’ （下記配列表の配列番号３９）
　　　ＦＦ：5’-GCTATAGTTAAGTGTAAGAC-3’ （下記配列表の配列番号４０）
　　　ＦＲ：5’-TTGTCCACACCACTCATTCG-3’ （下記配列表の配列番号４１）。
　（６）ａｄｈ４（系統名：SPAC5H10.06c）削除断片の作製のためのオリゴＤＮＡ
　　　ＵＦ：5’-ATCGTCGTCGATGCTGATTGG-3’ （下記配列表の配列番号４２）
　　　ＵＲ：5’-GCCAGTGGGATTTGTAGCTCAGCAGTCATTCTCATTCCG-3’ （下記配列表の配列番号４３）
　　　ＯＦ：5’-CGTCAATATCACAAGCTTGTCTCCCCTTCTATTGGGATTTGC-3’ （下記配列表の配列番号４４）
　　　ＯＲ：5’-GATTACCTGCAATCATGTTTCCGGCCTTTTGTGAAACCTGCC-3’ （下記配列表の配列番号４５）
　　　ＤＦ：5’-GGCAGGTTTCACAAAAGGCCGGAAACATGATTGCAGGTAATC-3’ （下記配列表の配列番号４６）
　　　ＤＲ：5’-GGAGAATGATGTATTGGTAAATAAC-3’ （下記配列表の配列番号４７）
　　　ＦＦ：5’-CCTTGGGAATGAGCGAATTC-3’ （下記配列表の配列番号４８）
　　　ＦＲ：5’-GGGTTGTGAAGAGCATACTG-3’ （下記配列表の配列番号４９）。
　（７）ａｄｈＸ（系統名：SPBC1773.06c）削除断片の作製のためのオリゴＤＮＡ
　　　ＵＦ：5’-GAAGGAGATTATGTGAAACAAGTTGAAATC-3’ （下記配列表の配列番号５０）
　　　ＵＲ：5’-AGCTTAGCTACAAATCCCACTCTGAGGGTAGTGTTCTTGCTACAAAAATCT-3’ （下記配列表の配列番号５１）
　　　ＯＦ：5’-AAGTTTCGTCAATATCACAAGCTCATGACGGAAGATTCCGAGAAATTCCGTTT-3’ （下記配列表の配列番号５２）
　　　ＯＲ：5’-CAAAGCCATGCTTTTAATGTTAAAGTGAAT-3’ （下記配列表の配列番号５３）
　　　ＤＦ：5’-ATTCACTTTAACATTAAAAGCATGGCTTTGATCGATTGAGATTTTTGTAGCAAGAACACT-3’ （下記配列表の配列番号５４）
　　　ＤＲ：5’-GGAAATGGTTCATGTGGACTGGGTTTTATT-3’（下記配列表の配列番号５５）
　　　ＦＦ：5’-CCTGCTCTTAAAATGACGAATGGTGTAGGC-3’ （下記配列表の配列番号５６）
　　　ＦＲ：5’-ATATAGTGCGATATGGATGAAGGAGAAGAG-3’ （下記配列表の配列番号５７）。
　（８）ａｋｒＹ（系統名：SPAC977.14c）削除断片の作製のためのオリゴＤＮＡ
　　　ＵＦ：5’-ATCATAACTTACTATATCGTGAAGAAGAGA-3’（下記配列表の配列番号５８）
　　　ＵＲ：5’-AGCTTAGCTACAAATCCCACTTAGAATGAGTAATTCAACTTCTTAAACCAC-3’ （下記配列表の配列番号５９）
　　　ＯＦ：5’-AAGTTTCGTCAATATCACAAGCTTTAGCTTAAAAGTAATAAGCTTCTATGTGA-3’ （下記配列表の配列番号６０）
　　　ＯＲ：5’-TGAAGACATTTTATAAAACTTAAATAAAAA-3’ （下記配列表の配列番号６１）
　　　ＤＦ：5’-TTTTTATTTAAGTTTTATAAAATGTCTTCAGAAATTTAAATCTGTGGTTTAAGAAGTTGA-3’ （下記配列表の配列番号６２）
　　　ＤＲ：5’-ACTTTGTTTATTGTAGAAAGTCGAGCTTGA-3’（下記配列表の配列番号６３）
　　　ＦＦ：5’-CAAAAGACAGGGGTCGGATTGATTCCTTGG-3’ （下記配列表の配列番号６４）
　　　ＦＲ：5’-TGTGCTGTTTTTCAAGTGGTCATGCGTTAC-3’ （下記配列表の配列番号６５）。
　削除する遺伝子ごとに、ＵＦとＵＲでＵＰ領域を、ＯＦとＯＲでＯＬ領域を、ＤＦとＤＲでＤＮ領域をそれぞれＫＯＤ－Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法によって作製したのち、さらにそれらを鋳型として、それぞれＦＦとＦＲを用いた同様のＰＣＲ法によって全長の削除断片を作製した。全長の削除断片作製時には、下記２つの合成オリゴＤＮＡ（オペロン社製）を用い、ＡＲＣ０３２株より同様に調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、同様のＰＣＲ法によって調製したｕｒａ４領域断片も鋳型として合わせて使用した。
　　　5’-AGCTTAGCTACAAATCCCACT-3’ （下記配列表の配列番号６６）
　　　5’-AGCTTGTGATATTGACGAAACTT-3’ （下記配列表の配列番号６７）
　作製された各削除断片を用いて作製した削除株の株名、削除した遺伝子を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［例２］　
＜Ｓ．ポンベ乳酸脱水素酵素生産株の作製＞　
　Ｓ．ポンベのウラシル要求性株（ＡＲＣ０１０）ならびに例１で作製したＳ．ポンベの遺伝子削除株それぞれを、乳酸脱水素酵素遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＸＬＴ－ＨｓＬＤＨの制限酵素ＢｓｉＷＩ消化物で、Ｂａｈｌｅｒらの方法（Ｙｅａｓｔ誌、１９９８年、１４巻、９４３－９５１頁）に従い形質転換した。
　ｐＸＬＴ－ＨｓＬＤＨは、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、分裂酵母用組込型ベクターｐＸＬ４（Ｉｄｉｒｉｓほか、Ｙｅａｓｔ誌、２００６年、２３巻、８３－９９頁）を制限酵素で二重消化して得られた断片を末端平滑化したのちにライゲーションして得られた分裂酵母用発現ベクターｐＸＬ1（ｄｅｌｔａ－ｎｅｏ）を、さらに制限酵素で二重消化して得られた断片を末端平滑化したのちに、ＡＲＣ０１０株ゲノムよりクローニングしたｔｏｐ２遺伝子断片を挿入して、配列表の配列番号６８にその配列（５’→３’、環状）を示すｐＸＬＴ（５５５８塩基対）を作製した。
　つぎに、岡山ベクター（文献：Okayama, H. and Berg, P.: A cDNA cloning vector that permits expression of cDNA inserts in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 3 (1983) 280-289.）に組込まれたヒト線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、５’－末端側に制限酵素ＮｃｏＩ認識配列を、３’－末端側に制限酵素ＳａｌＩ認識配列を付加した下記プライマーセット、
　　　5’-GTCCATGGCAACTCTAAAGGATCAG-3’（Ｎｏ．４６２０）（下記配列表の配列番号６９）、
　　　5’-CAGTCGACTTAAAATTGCAGCTCCTTTTG-3’（Ｎｏ．４６２１）（下記配列表の配列番号７０）
を用いて、文献（Ｔｓｕｊｉｂｏほか、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．誌、１９８５年、１４７巻、９－１５頁）に記載のヒトＬ－乳酸脱水素酵素構造遺伝子（ＨｓＬＤＨ－ＯＲＦ）をコードする遺伝子断片を、ＰＣＲによって増幅した。得られた増幅断片を、制限酵素ＮｃｏＩおよびＳａｌＩを用いた二重消化ののち、日本国特開２０００－２６２２８４号公報記載のマルチクローニングベクターｐＴＬ２Ｍ５のＡｆｌＩＩＩ－ＳａｌＩ間に組み込み、ＬＤＨ発現ベクターｐＴＬ２ＨｓＬＤＨを作製した。さらにｐＴＬ２ＨｓＬＤＨより発現カセットを制限酵素ＳｐｅＩおよびＢｓｔ１１０７Ｉを用いた二重消化によって切り出し、ｐＸＬＴに組み込んで、ｐＸＬＴ－ＨｓＬＤＨを作製した。
＜培養試験＞
　得られた各形質転換体をＹＰＤ１２液体培地（イーストエキス１％、ペプトン２％、グルコース１２％）に植菌して、温度３２℃、振盪速度１００ｒｐｍの条件下で４．５時間培養した。この時の培養液中の乳酸濃度をＢｉｏＦｌｏｗ（王子計測機器製）を用いて測定した。さらに同じ条件下で合計２０時間培養を継続した。２０時間培養後の培養液中の乳酸濃度を同様に測定した。
　表２に、形質転換体株名、宿主株名、４．５時間培養後の乳酸濃度、２０時間培養後の乳酸濃度を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［例３］　
＜Ｓ．ポンベ乳酸脱水素酵素高生産株の作製＞　
　例１で作製したＩＧＦ５４３株（ｈ－　ｌｅｕ１－３２ ｕｒａ４－Ｄ１８　ｐｄｃ２－Ｄ２３）は生育速度が遅いものであったので、その生育速度を回復すべく、ＩＧＦ５４３株をＹＥＳプレート（イーストエキス０．５％／グルコース３％／ＳＰサプリメント）にストリークして２５℃にて培養し、得られたコロニーをＹＰＤ培地（イーストエキス１％／ペプトン２％／グルコース２％）に植え継ぎ２５℃にて培養し、十分に生育した培養液を用いてグリセロールストックを作製し、－８０℃にて保存した。上記作業を適切な生育速度が得られるまで繰り返し、生育速度の回復した株を作製した（名称はＩＧＦ５４３を継承）。
　ｐＴＬ２ＨｓＬＤＨ（例２）を制限酵素ＳｐｅＩおよびＢｓｔ１１０７Ｉで二重消化し、得られた断片（ｈＣＭＶプロモーター／ＬＤＨ－ＯＲＦ／ＬＰＩターミネ―ター）を、下記の工程で作製したＴｆ２多座組込型ベクターｐＴｆ２ＭＣＳ－ｕｒａ４の制限酵素ＮｈｅＩ－ＫｐｎＩ（末端平滑化）認識配列間に挿入し、組込型Ｌ－乳酸脱水素酵素遺伝子発現ベクターｐＴＬ２ＨｓＬＤＨ－Ｔｆ２を作製した。
　ｐＴｆ２ＭＣＳ－ｕｒａ４の作製工程は次のとおりである。すなわち、細胞からの全ゲノムＤＮＡ抽出キット（キアゲン社製ＤＮｅａｓｙ）を用いて、Ｓ．ポンベの全ゲノムＤＮＡを精製し、そのうちの１μｇを鋳型として、５’末端側に制限酵素ＢｓｉＷＩの認識配列（CGTACG）を導入した下記プライマーペアー、
　　　5’-AAGGCCTCGTACGTGAAAGCAAGAGCAAAACGA-3’ （下記配列表の配列番号７１）、
　　　5’-AAGGCCTCGTACGTGCTTTGTCCGCTTGTAGC-3’ （下記配列表の配列番号７２）、
を用いて、ＰＣＲ法によって、Ｓ．ポンベのＴｆ２－２（ＧｅｎｅＤＢ収載の系統名ＳＰＡＣ１６７．０８遺伝子）のＤＮＡ断片（約３９５０塩基対）を増幅した。増幅ＤＮＡ断片の両末端を制限酵素ＢｓｉＷＩで処理し、アガロースゲル電気泳動によって分離・精製し、インサート断片として調製した。
　次に、染色体組込み用ベクターｐＸＬ４（Ｉｄｉｒｉｓほか、Ｙｅａｓｔ誌、２３巻、８３－９９頁、２００６年）を同じ制限酵素ＢｓｉＷＩで消化し、アンピシリン耐性遺伝子（ＡｐＲ）と大腸菌の複製起点（ｐＢＲ３２２　ｏｒｉ）を含む領域（約２１３０塩基対）を得た。そのＤＮＡ断片をさらに脱リン酸化酵素（タカラバイオ社製ＣＩＡＰ）で脱リン酸化処理し、アガロースゲル電気泳動によって分離・精製し、ベクター断片として調製した。
　上記インサート断片とベクター断片とを、ライゲーションキット（タカラバイオ社製ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｖｅｒ．２）を用いて連結した後、大腸菌ＤＨ５（東洋紡社製）を形質転換し、組換えプラスミドｐＴｆ２－２（６０７１塩基対）を作製した。
　上記構築ベクターｐＴｆ２－２の０．１μｇを鋳型として、下記プライマーペアー、
　　　5’-GGGGTACCAAGCTTCTAGAGTCGACTCCGGTGCTACGACACTTT-3’（５’末端に制限酵素ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩの認識配列を持つ）（下記配列表の配列番号７３）、
　　　5’-GGGGTACCAGGCCTCTCGAGGCTAGCCATTTCCAGCGTACATCCT-3’（５’末端に制限酵素ＫｐｎＩ、ＳｔｕＩ、ＸｈｏＩ、ＮｈｅＩの認識配列を持つ）（下記配列表の配列番号７４）、
を用い、ＰＣＲ法によって全長を増幅し、６０６０塩基対の断片を得た。その両末端をＫｐｎＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によって分離・精製したのち、ライゲーションキットを用いて自己環状化し、トランスポゾン遺伝子Ｔｆ２－２配列の内部にさらにマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を持つ６０５８塩基対のベクターｐＴｆ２（ＭＣＳ）を作製した。
　上記構築ベクターｐＴｆ２（ＭＣＳ）を制限酵素ＫｐｎＩおよびＮｈｅＩを用いて二重消化し、６０４０塩基対の断片をアガロースゲル電気泳動によって分離・精製した。さらにＳ．ポンベのウラシル要求性マーカーｕｒａ４（ＧｅｎｅＤＢ収載の系統名ＳＰＣＣ３３０．０５ｃ、オロチジン－５’－リン酸脱炭酸酵素遺伝子）の両端にＰＣＲ法を用いて制限酵素ＫｐｎＩおよびＮｈｅＩの認識配列を付加した断片を作製し、制限酵素ＫｐｎＩおよびＮｈｅＩを用いて二重消化し、２２０６塩基対の断片をアガロースゲル電気泳動によって分離・精製した。これら二本の断片をライゲーションキットを用いて連結し、トランスポゾン遺伝子Ｔｆ２－２配列の内部にさらにマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を持つ８２４６基対のベクターｐＴｆ２（ＭＣＳ）－ｕｒａ４を作製した。
　上記で作製したベクターを用い、岡崎らの方法（Ｏｋａｚａｋｉほか、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．誌、１９９０年、１８巻、６４８５－６４８９頁）によりＩＧＦ５４３株（生育速度回復株）を形質転換し、選択培地ＭＭＡ＋Ｌｅｕプレートに塗布した。得られた多数のシングルコロニーをＹＰＤ１６（イーストエキス１％／ペプトン２％／グルコース１６％）培地に植菌し３２℃で７２時間培養後、培養上清のみを試料とし、ＢＦ－４およびＢＦ－５（王子計測機器）を用いて、グルコース、エタノール、Ｌ－乳酸濃度ならびに培地のｐＨの測定を行った。その結果を元に、これらの中から再度Ｌ－乳酸生産性の高いものを選抜し、さらにＹＰＤ１２（イーストエキス１％／ペプトン２％／グルコース１２％）培地で培養(２０時間、４４時間、６６．５時間、８０時間、１７６時間)後、同様に培養上清中のグルコース、エタノール、Ｌ－乳酸濃度ならびに培地のｐＨを測定し、Ｌ－乳酸の生産性が最も高い株を選抜、ＡＳＰ２７８２（遺伝子型：ｈ－　ｌｅｕ１－３２　ｕｒａ４－Ｄ１８　ｐｄｃ２－Ｄ２３　Ｔｆ２＜ＨｓＬＤＨ－ＯＲＦ／ｕｒａ４＋)と命名した。
　同様の工程でＡＲＣ０１０株の形質転換体も作製し、ＡＳＰ２７６７株とした。
［例４］（参考例）　
＜Ｓ．ポンベ乳酸脱水素酵素高生産株を用いた経時的培養試験＞
　例３で得られた形質転換体ＡＳＰ２７６７株をＹＰＤ６液体培地（イーストエキス１％、ペプトン２％、グルコース６％）に植菌して、温度３２℃、振盪速度１００ｒｐｍの条件下で２４時間培養を行った。培養終了後、遠心分離（２０００ｇ、１０分）により菌体を回収した。続いて５ｍｌのＹＰＤ１２Ｌ液体培地（イーストエキス１％、ペプトン２％、グルコース１２％、プロテオリピド１％）に上記回収菌体を５．２グラム（乾燥菌体換算）／リットルの濃度（ＯＤ６６０が２６）になるように接種し、温度３２℃、振盪速度１００ｒｐｍの条件下で２４時間培養を行い、培養液中のエタノール、乳酸濃度およびｐＨを経時的に測定した。結果を表３に示す。
　乳酸脱水素酵素遺伝子を導入したＳ．ポンベを用いると、乳酸が蓄積して培養液のｐＨが２．９以下になる４時間から７時間の間において、ｐＨが２．８から２．５にさらに低下し、かつ乳酸の濃度が上昇し、ｐＨ３以下の酸性条件下でもアルカリによる中和を行うことなく乳酸生産が可能であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［例５］（参考例）　
＜Ｓ．ポンベ乳酸脱水素酵素高生産株を用いた高密度培養試験＞
　例３で得られた形質転換体ＡＳＰ２７６７をＹＰＤ６液体培地（イーストエキス１％、ペプトン２％、グルコース６％）に植菌して、温度３２℃、振盪速度１００ｒｐｍの条件下で２４時間培養を行った。培養終了後、遠心分離（２０００ｇ、１０分）により菌体を回収した。続いて５ｍｌのＹＰＤ１２Ｌ液体培地（イーストエキス１％、ペプトン２％、グルコース１２％、プロテオリピド１％）に上記菌体を０．４、５．２、１８．２、３１．８、４８．０グラム（乾燥菌体換算）／リットルの濃度（それぞれＯＤ６６０が２、２６、９１、１５９、２４０）になるように接種し、それぞれ、温度３２℃、振盪速度１００ｒｐｍの条件下で培養を行ない、終了後、培養液中のグルコース、エタノールおよび乳酸濃度を測定した。結果、ならびにその測定結果より計算した、乳酸の対糖収率と生産速度を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
［例６］　
＜Ｓ．ポンベ乳酸脱水素酵素高生産株（ｐｄｃ２削除株）を用いた高密度培養試験＞　例３で得られた形質転換体ＡＳＰ２７８２をＹＰＤ６液体培地（イーストエキス１％、ペプトン２％、グルコース６％）に植菌して温度３２℃、振盪速度１００ｒｐｍの条件下で２４時間培養を行った。培養終了後、遠心分離（２０００ｇ、１０分）により菌体を回収した。続いて５ｍｌのＹＰＤ１２Ｌ発酵培地（イーストエキス１％、ペプトン２％、グルコース１２％、プロテオリピド１％）に上記菌体を０．２、３．８、１５．０、２３．８、３１．６、４６．８グラム（乾燥菌体換算）／リットルの濃度（それぞれＯＤ６６０が１、１９、７５、１１９、１５８、２３４）になるように接種し、それぞれ、温度３２℃、振盪速度１００ｒｐｍで培養を行い、終了後、培養液中のグルコース、エタノールおよび乳酸濃度を測定した。結果、ならびにその測定結果より計算した乳酸の対糖収率と生産速度を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ＰＤＣ２を欠失させたＡＳＰ２７８２株を用いることによって、高い対糖収率で乳酸を生産することができた。また、初発菌濃度が１５．０グラム（乾燥菌体換算）／リットル以上の例が示すように、高密度培養を行うことによって対糖収率が大幅に上昇することがわかった。この対糖収率の上昇から、ＰＤＣ２を欠失させたＳ．ポンベに乳酸脱水素酵素遺伝子を導入した形質転換体は、高度に最適化された高発現系を備えていることがわかった。
　前記表４に示すように、ＰＤＣ２を欠失させていない形質転換体ＡＳＰ２７６７を用いた例５では、この例６に比べて対糖収率が低く、最も収率が高いものでも５０％程度であった。これは、ＰＤＣ２が欠失されていないために、乳酸発酵と同時にエタノール発酵が行われるためであると考えられる。
［例７］　
＜Ｓ．ポンベ乳酸脱水素酵素高生産株（ｐｄｃ２削除株）を用いた高密度繰返し培養試験＞　
　例３で得られた形質転換体ＡＳＰ２７８２をＹＰＤ６液体培地（イーストエキス１％、ペプトン２％、グルコース６％）に植菌して温度３２℃、振盪速度１００ｒｐｍの条件下で２４時間培養を行った。培養終了後、遠心分離（２０００ｇ、１０分）により菌体を回収した。続いて５ｍｌのＹＰＤ１２Ｌ液体培地（イーストエキス１％、ペプトン２％、グルコース１２％、プロテオリピド１％）に上記菌体を３０グラム（乾燥菌体換算）／リットル程度の濃度になるよう接種し、温度３２℃、振盪速度１００ｒｐｍの条件下で培養を行い、培養液中の乳酸とエタノールの濃度を測定した。培養終了後、遠心分離（２０００ｇ、１０分）により培養上清ならびに菌体を回収した。回収された菌体を再び同じ液体培地に加えて培養を行った。さらにこの一連の操作を６回行なった。合計７回の培養における各接種濃度と培養時間、培養終了時のグルコース、エタノールおよび乳酸濃度の測定結果、ならびにその測定結果より計算した乳酸の対糖収率を表６に示す。
　ＡＳＰ２７８２株を用いた連続培養では、回数を重ねても乳酸の対糖収率が高度に維持されており、アルカリによる中和を行うことなく、乳酸を安定して高い生産性で生成されることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
［例８］
＜培地の最少化＞
　例３で得られた形質転換体ＡＳＰ２７８２をＹＰＤ６液体培地（イーストエキス１％、ペプトン２％、グルコース６％）に植菌して温度３２℃、振盪速度１００ｒｐｍの条件下で２４時間培養を行った。培養終了後、遠心分離（２０００ｇ、１０分）により菌体を回収した。続いて５ｍｌのＹＰＤ１２Ｌ液体培地（イーストエキス１％、ペプトン２％、グルコース１２％、プロテオリピド１％）またはＤ１２液体培地（グルコース１２％）に上記菌体を４４．０グラム（乾燥菌体換算）／リットルになるように接種し、温度３２℃、振盪速度１００ｒｐｍの条件下で培養を行い、乳酸とエタノールの濃度を経時的に測定した。２つの培地における培養時間、培養液中のグルコース濃度、エタノール濃度、乳酸濃度およびその測定結果より計算した乳酸の対糖収率を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
［例９］
＜Ｓ．ポンベ乳酸脱水素酵素高生産株を用いた乳酸生産結果＞
　ＡＳＰ２７６７株を５ｍｌのＹＰＤ２４Ｌ液体培地（イーストエキス１％、ペプトン２％、グルコース２４％、プロテオリピド１％）に菌体濃度が０．２グラム（乾燥菌体換算）／リットルになるように接種して３２℃で４７時間培養を行った。培養終了後の乳酸生産量は１２４．２ｇ／Ｌであった。ＡＳＰ２７６７株を５ｍｌのＹＰＤ１２ＬＡ液体培地（イーストエキス１％、ペプトン２％、グルコース１２％、プロテオリピド１％、ＣＳＬ－ＡＳＴ１％）に菌体濃度が７４．６グラム（乾燥菌体換算）／リットルになるように接種して３２℃で１時間発酵を行った。発酵終了後の乳酸生産量は５８．６ｇ／Ｌ、生産速度は５８．６ｇ／ｈであった。
　ＡＳＰ２７８２株を５ｍｌのＹＰＤ１２Ｌ液体培地（イーストエキス１％、ペプトン２％、グルコース１２％、プロテオリピド１％）に菌体濃度が３１．６グラム（乾燥菌体換算）／リットルになるように接種して３２℃で９時間発酵を行った。発酵終了後の乳酸生産量は９９．２ｇ／Ｌ、対糖収率は８３％であった。ＡＳＰ２７８２株を５ｍｌのＹＰＤ１２液体培地（イーストエキス１％、ペプトン２％、グルコース１２％）に菌体濃度が４４．０グラム（乾燥菌体換算）／リットルになるように接種して３２℃で６時間発酵を行った。発酵終了後の乳酸生産量は８５．７ｇ／Ｌ、対糖収率は８８％であった。
　以上の結果から、ｐｄｃ２遺伝子が削除されたＡＳＰ２７８２株の方が、削除されていないＡＳＰ２７６７株よりも優れた生産性を有することが示された。
　本発明を詳細に、また特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく、様々な変更や修正を加えることができることは、当業者にとって明らかである。
　本出願は、２００９年８月２１日出願の日本国特許出願２００９－１９２２７１に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。なお、本明細書中に記載された文献の内容は、ここに参照として取り込まれる。
　本発明の形質転換体およびそれを用いた乳酸の製造方法は、低ｐＨでもアルカリによる中和を行わずに高い生産性で乳酸を生産することができるため、乳酸の工業的な製造方法として好適に用いることができる。

Claims (15)

  1. 　シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）を宿主とし、乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれ、かつ前記シゾサッカロミセス・ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活している、形質転換体。
  2. 　欠失または失活しているピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子がＰＤＣ２遺伝子である、請求項１に記載の形質転換体。
  3. 　前記乳酸脱水素酵素遺伝子が哺乳動物の乳酸脱水素酵素遺伝子である、請求項１または２に記載の形質転換体。
  4. 　前記乳酸脱水素酵素遺伝子がシゾサッカロミセス・ポンベの染色体に組み込まれている、請求項１～３のいずれか一項に記載の形質転換体。
  5. 　シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）を宿主とし、シゾサッカロミセス・ポンベ内で機能するプロモーターとターミネーターと乳酸脱水素酵素遺伝子とを含む発現カセットを有するベクターを用いて、前記発現カセットを前記宿主に導入して形質転換体を得ること、および、
    　前記宿主としてピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活した宿主を用いるかまたは前記得られた形質転換体のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部を欠失または失活させること、
    　を含む、乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれかつピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活している形質転換体の製造方法。
  6. 　前記ベクターがさらにシゾサッカロミセス・ポンベの染色体に対して相同組換えを行わせる組換え部位を有し、このベクターを使用して発現カセットをシゾサッカロミセス・ポンベの染色体に導入する、請求項５に記載の形質転換体の製造方法。
  7. 　宿主の染色体における相同組み換えを行わせる標的部位がトランスポゾン遺伝子Ｔｆ２である、請求項６に記載の形質転換体の製造方法。
  8. 　ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子としてＰＤＣ２遺伝子を欠失または失活させたシゾサッカロミセス・ポンベを宿主とする、請求項５～７のいずれか一項に記載の形質転換体の製造方法。
  9. 　前記乳酸脱水素酵素遺伝子が哺乳動物の乳酸脱水素酵素遺伝子である、請求項５～８のいずれか一項に記載の形質転換体の製造方法。
  10. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の形質転換体を培養液中で培養し、該培養液から乳酸を取得する乳酸の製造方法。
  11. 　濃度１～５０質量％のグルコースを含む培養液を使用して培養を行う、請求項１０に記載の乳酸の製造方法。
  12. 　前記形質転換体により産生される乳酸により、前記培養液のｐＨが３．５以下になった後にさらに培養を継続する、請求項１０または１１に記載の乳酸の製造方法。
  13. 　前記培養液中の形質転換体の初発菌体濃度を０．１～５０グラム（乾燥菌体換算）／リットルとする、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の乳酸の製造方法。
  14. 　前記形質転換体により産生された培養液中の乳酸を中和することなく培養を継続する、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の乳酸の製造方法。
  15. 　前記形質転換体により産生された培養液中の乳酸を中和することなく、培養液から乳酸を分離する、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の乳酸の製造方法。
PCT/JP2010/063888 2009-08-21 2010-08-17 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法 WO2011021629A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10809970.6A EP2468860B1 (en) 2009-08-21 2010-08-17 Transformant and process for production thereof, and process for production of lactic acid
JP2011527683A JP5772594B2 (ja) 2009-08-21 2010-08-17 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法
CN2010800371957A CN102498209A (zh) 2009-08-21 2010-08-17 转化体及其制造方法以及乳酸的制造方法
IN1521DEN2012 IN2012DN01521A (ja) 2009-08-21 2010-08-17
US13/401,197 US9284561B2 (en) 2009-08-21 2012-02-21 Transformant and process for production thereof, and process for production of lactic acid

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009192271 2009-08-21
JP2009-192271 2009-08-21

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US13/401,197 Continuation US9284561B2 (en) 2009-08-21 2012-02-21 Transformant and process for production thereof, and process for production of lactic acid

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011021629A1 true WO2011021629A1 (ja) 2011-02-24

Family

ID=43607080

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2010/063888 WO2011021629A1 (ja) 2009-08-21 2010-08-17 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US9284561B2 (ja)
EP (1) EP2468860B1 (ja)
JP (1) JP5772594B2 (ja)
KR (1) KR20120051705A (ja)
CN (1) CN102498209A (ja)
IN (1) IN2012DN01521A (ja)
WO (1) WO2011021629A1 (ja)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012114979A1 (ja) * 2011-02-21 2012-08-30 旭硝子株式会社 乳酸の製造方法
WO2014030655A1 (ja) * 2012-08-24 2014-02-27 旭硝子株式会社 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法
RU2539092C1 (ru) * 2013-09-27 2015-01-10 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Schizosaccharomyces pombe - ПРОДУЦЕНТ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ
WO2015076393A1 (ja) 2013-11-22 2015-05-28 旭硝子株式会社 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法
WO2016043289A1 (ja) * 2014-09-19 2016-03-24 旭硝子株式会社 有機酸の製造方法
WO2016056566A1 (ja) * 2014-10-10 2016-04-14 旭硝子株式会社 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法
JP2016063802A (ja) * 2013-11-22 2016-04-28 旭硝子株式会社 形質転換体の製造方法、形質転換体、および単座組込み用ベクターキット
JP2021533747A (ja) * 2018-08-09 2021-12-09 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 組み込まれた核酸を評価するための方法

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2014156998A1 (ja) * 2013-03-28 2017-02-16 旭硝子株式会社 化成品の製造方法および製造装置
EP2977471A1 (en) * 2014-07-23 2016-01-27 PURAC Biochem BV Genetic modification of (S)-lactic acid producing thermophilic bacteria
EP3380626B1 (en) 2015-11-24 2020-10-21 Cargill, Incorporated Genetically modified yeasts and fermentation processes using genetically modified yeasts
EP3178313A1 (en) 2015-12-09 2017-06-14 Leibniz-Institut für Pflanzenbiochemie Gene and protein for the synthesis of oxidized zingiberene derivatives
RU2614233C1 (ru) * 2015-12-22 2017-03-23 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГБУ "ГосНИИгенетика") Трансформант дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующий молочную кислоту (варианты), способ его получения (варианты), способ микробиологического синтеза молочной кислоты с использованием такого трансформанта
RU2650669C1 (ru) * 2016-12-21 2018-04-16 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) Штамм Schizosaccharomyces pombe - продуцент молочной кислоты
RU2652877C9 (ru) * 2016-12-21 2018-06-26 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) Способ модификации дрожжей Schizosaccharomyces pombe с помощью Cre-lox системы бактериофага Р1, трансформант, полученный таким способом
KR102140596B1 (ko) 2018-04-17 2020-08-04 에스케이이노베이션 주식회사 유기산 내성 효모 유래 신규 프로모터 및 이를 이용한 목적유전자의 발현방법
CN109280652A (zh) * 2018-09-13 2019-01-29 四川自豪时代药业有限公司 一种外源高表达乳酸脱氢酶突变体的高密度发酵方法
KR20200040017A (ko) 2018-10-08 2020-04-17 에스케이이노베이션 주식회사 알코올 생성이 억제된 재조합 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법
EP4025700A1 (en) 2019-09-05 2022-07-13 Leibniz-Institut für Pflanzenbiochemie (IPB) Nucleic acids, proteins and processes for producing piperine and other amides
KR20210041903A (ko) 2019-10-08 2021-04-16 에스케이이노베이션 주식회사 락테이트 대사 및 알코올 생성이 억제된 재조합 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법
KR20210158676A (ko) 2020-06-24 2021-12-31 에스케이이노베이션 주식회사 젖산 생산능이 증가된 재조합 내산성 효모
WO2023004336A1 (en) * 2021-07-22 2023-01-26 Archer Daniels Midland Company A genetically engineered yeast producing lactic acid

Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0515380A (ja) 1990-09-14 1993-01-26 Asahi Glass Co Ltd ベクター
WO1995009914A1 (fr) 1993-10-05 1995-04-13 Asahi Glass Company Ltd. Vecteur de multiclonage, vecteur d'expression, et production d'une proteine exogene au moyen dudit vecteur d'expression
JPH07163373A (ja) 1993-10-05 1995-06-27 Asahi Glass Co Ltd マルチクローニングベクター、発現ベクター、および異種蛋白質の生産
WO1996023890A1 (fr) 1995-02-03 1996-08-08 Asahi Glass Company Ltd. Gene de signal de secretion et vecteur d'expression comprenant ce signal
JPH10234375A (ja) 1997-02-28 1998-09-08 Asahi Glass Co Ltd マルチクローニングベクター
WO1999014335A1 (en) * 1997-09-12 1999-03-25 A.E. Staley Manufacturing Company Yeast strains for the production of lactic acid
WO1999023223A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Asahi Glass Company Ltd. Induction promoter gene and secretory signal gene usable in $i(schizosaccharomyces pombe), expression vectors having the same, and use thereof
JP2000262284A (ja) 1999-03-18 2000-09-26 Asahi Glass Co Ltd シゾサッカロミセス・ポンベの形質転換方法
JP2001204464A (ja) 2000-01-27 2001-07-31 Toyota Motor Corp 乳酸の製造方法
WO2002101038A1 (fr) 2001-05-29 2002-12-19 Asahi Glass Company, Limited Procede de construction d'un hote et procede de production d'une proteine etrangere
WO2005052174A2 (en) * 2003-11-20 2005-06-09 Tate & Lyle Ingredients Americas, Inc. Lactic acid producing yeast
JP2005198612A (ja) 2004-01-19 2005-07-28 Asahi Glass Co Ltd 酵母の形質転換方法
JP2006006271A (ja) * 2004-06-29 2006-01-12 Toyota Central Res & Dev Lab Inc 乳酸生産酵母および乳酸生産方法
WO2007015470A1 (ja) 2005-08-03 2007-02-08 Asahi Glass Company, Limited 酵母宿主、形質転換体および異種タンパク質の製造方法
WO2007026617A1 (ja) 2005-08-29 2007-03-08 Asahi Glass Company, Limited 発現ベクター、それを導入した形質転換体、および異種タンパク質の製造方法
WO2007063919A1 (ja) 2005-11-29 2007-06-07 Asahi Glass Company, Limited 染色体改変方法
JP2008048726A (ja) 2006-07-24 2008-03-06 Toray Ind Inc 変異型ピルビン酸脱炭酸酵素５遺伝子を有する酵母及び乳酸の製造方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070031950A1 (en) 1998-09-11 2007-02-08 Winkler Aaron A Production of D-lactic acid with yeast
US7141410B2 (en) * 2000-11-22 2006-11-28 Natureworks Llc Methods and materials for the production of organic products in cells of Candida species
US7405068B2 (en) * 2003-05-02 2008-07-29 Tate & Lyle Ingredients Americas, Inc. Pyruvate producing yeast strain
EP2235193B1 (en) * 2007-12-23 2015-11-25 GEVO, Inc. Yeast organism producing isobutanol at a high yield

Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0515380A (ja) 1990-09-14 1993-01-26 Asahi Glass Co Ltd ベクター
WO1995009914A1 (fr) 1993-10-05 1995-04-13 Asahi Glass Company Ltd. Vecteur de multiclonage, vecteur d'expression, et production d'une proteine exogene au moyen dudit vecteur d'expression
JPH07163373A (ja) 1993-10-05 1995-06-27 Asahi Glass Co Ltd マルチクローニングベクター、発現ベクター、および異種蛋白質の生産
WO1996023890A1 (fr) 1995-02-03 1996-08-08 Asahi Glass Company Ltd. Gene de signal de secretion et vecteur d'expression comprenant ce signal
JPH10234375A (ja) 1997-02-28 1998-09-08 Asahi Glass Co Ltd マルチクローニングベクター
WO1999014335A1 (en) * 1997-09-12 1999-03-25 A.E. Staley Manufacturing Company Yeast strains for the production of lactic acid
WO1999023223A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Asahi Glass Company Ltd. Induction promoter gene and secretory signal gene usable in $i(schizosaccharomyces pombe), expression vectors having the same, and use thereof
JP2000262284A (ja) 1999-03-18 2000-09-26 Asahi Glass Co Ltd シゾサッカロミセス・ポンベの形質転換方法
JP2001204464A (ja) 2000-01-27 2001-07-31 Toyota Motor Corp 乳酸の製造方法
WO2002101038A1 (fr) 2001-05-29 2002-12-19 Asahi Glass Company, Limited Procede de construction d'un hote et procede de production d'une proteine etrangere
WO2005052174A2 (en) * 2003-11-20 2005-06-09 Tate & Lyle Ingredients Americas, Inc. Lactic acid producing yeast
JP2005198612A (ja) 2004-01-19 2005-07-28 Asahi Glass Co Ltd 酵母の形質転換方法
JP2006006271A (ja) * 2004-06-29 2006-01-12 Toyota Central Res & Dev Lab Inc 乳酸生産酵母および乳酸生産方法
WO2007015470A1 (ja) 2005-08-03 2007-02-08 Asahi Glass Company, Limited 酵母宿主、形質転換体および異種タンパク質の製造方法
WO2007026617A1 (ja) 2005-08-29 2007-03-08 Asahi Glass Company, Limited 発現ベクター、それを導入した形質転換体、および異種タンパク質の製造方法
WO2007063919A1 (ja) 2005-11-29 2007-06-07 Asahi Glass Company, Limited 染色体改変方法
JP2008048726A (ja) 2006-07-24 2008-03-06 Toray Ind Inc 変異型ピルビン酸脱炭酸酵素５遺伝子を有する酵母及び乳酸の製造方法

Non-Patent Citations (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Abstracts of the Annual Meeting of the Society for Biotechnology, Japan", vol. 61TH, 25 August 2009, article FUTOSHI HARA ET AL.: "Lactate production using Schizosaccharomyces pombe", pages: 190, XP008151368 *
"Abstracts of the Annual Meeting of the Society for Biotechnology, Japan, 2008", vol. 60TH, article FUTOSHI HARA ET AL.: "Lactate production using Schizosaccharomyces pombe", pages: 135, XP008151367 *
"Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan Program Koen Yoshishu", vol. 26TH, 2003, article MASAO SAKURAI ET AL.: "Bunretsu Kobo no Alcohol Dehydrogenase Idenshi Hakai Kabu ni Okeru Totaisha no Kaiseki", pages: 609, XP008151363 *
"Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan Program Koen Yoshishu", vol. 32TH, 20 November 2009, article FUTOSHI HARA ET AL.: "Bunretsu Kobo o Mochiita Muchuwa deno L-Nyusan Seisan ni Okeru Taisha Seigyo", pages: 263, XP008151364 *
"Methods for Yeast Molecular Genetics Experimentation", 1996, GAKKAI SHUPPAN CENTER
BAHLER ET AL., YEAST, vol. 14, 1998, pages 943 - 951
BIANCHI, M.M. ET AL.: "Efficient homolactic fermentation by Kluyveromyces lactis strains defective in pyruvate utilization and transformed with the heterologous LDH gene", APPL. ENVIRON. MICROBIOL., vol. 67, no. 12, 2001, pages 5621 - 5625, XP002236026 *
IDIRIS ET AL., YEAST, vol. 23, 2006, pages 83 - 99
IKUSHIMA, S. ET AL.: "Genetic engineering of Candida utilis yeast for efficient production of L-lactic acid.", BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM., vol. 73, no. 8, 7 August 2009 (2009-08-07), pages 1818 - 1824, XP008151373 *
ISHIDA, N. ET AL.: "The effect of pyruvate decarboxylase gene knockout in Saccharomyces cerevisiae on L-lactic acid production.", BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM., vol. 70, no. 5, 2006, pages 1148 - 1153, XP008129166 *
NATHAN J. BOWEN ET AL.: "Retrotransposons and Their Recognition of pol II Promoters: A Comprehensive Survey of the Transposable Elements From the Complete Genome Sequence of Schizosaccharomyces pombe", GENOME RES., vol. 13, 2003, pages 1984 - 1997
NUCLEIC ACIDS RES., vol. 34, 2006, pages E11
NUCLEIC ACIDS RES., vol. 34, 2006, pages EL 1
OKAYAMA, H.; BERG, P.: "A cDNA cloning vector that permits expression of cDNA inserts in mammalian cells", MOL. CELL. BIOL., vol. 3, 1983, pages 280 - 289, XP008020929
OKAZAKI ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 18, 1990, pages 6485 - 6489
PCR METHODS APPL., vol. 2, 1992, pages 28 - 33
See also references of EP2468860A4 *
TSUJIBO ET AL., EUR. J. BIOCHEM, vol. 147, 1985, pages 9 - 15
TSUJIBO H; TIANO HF; LI SS-L: "Nucleotide sequence of the cDNA and an intronless pseudogene for human lactate dehydrogenase-A isozyme", EUR. J. BIOCHEM., vol. 147, 1985, pages 9 - 15, XP003010998, DOI: doi:10.1111/j.1432-1033.1985.tb08711.x
UICHI LINO, ARC 010, GENOTYPE: H- LEUL-32 URA4-D18
WOOD, V. ET AL.: "The genome sequence of Schizosaccharomyces pombe.", NATURE, vol. 415, no. 6874, 2002, pages 871 - 880, XP002306285 *

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012114979A1 (ja) * 2011-02-21 2012-08-30 旭硝子株式会社 乳酸の製造方法
WO2014030655A1 (ja) * 2012-08-24 2014-02-27 旭硝子株式会社 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法
JPWO2014030655A1 (ja) * 2012-08-24 2016-07-28 旭硝子株式会社 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法
US9428777B2 (en) 2012-08-24 2016-08-30 Asahi Glass Company, Limited Transformant and method for producing same, and method for producing lactic acid
RU2539092C1 (ru) * 2013-09-27 2015-01-10 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Schizosaccharomyces pombe - ПРОДУЦЕНТ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ
JPWO2015076393A1 (ja) * 2013-11-22 2017-03-16 Ｊｍｔｃエンザイム株式会社 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法
WO2015076393A1 (ja) 2013-11-22 2015-05-28 旭硝子株式会社 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法
US10597662B2 (en) 2013-11-22 2020-03-24 Jmtc Enzyme Corporation Transformant and process for production thereof, and process for production of lactic acid
JP2016063802A (ja) * 2013-11-22 2016-04-28 旭硝子株式会社 形質転換体の製造方法、形質転換体、および単座組込み用ベクターキット
WO2016043289A1 (ja) * 2014-09-19 2016-03-24 旭硝子株式会社 有機酸の製造方法
JPWO2016056566A1 (ja) * 2014-10-10 2017-07-27 Ｊｍｔｃエンザイム株式会社 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法
US20170356017A1 (en) * 2014-10-10 2017-12-14 Asahi Glass Company, Limited Transformant and its production process, and method for producing lactic acid
US10214754B2 (en) 2014-10-10 2019-02-26 Jmtc Enzyme Corporation Transformant and its production process, and method for producing lactic acid
WO2016056566A1 (ja) * 2014-10-10 2016-04-14 旭硝子株式会社 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法
JP2021533747A (ja) * 2018-08-09 2021-12-09 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 組み込まれた核酸を評価するための方法
JP7538109B2 (ja) 2018-08-09 2024-08-21 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 組み込まれた核酸を評価するための方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP5772594B2 (ja) 2015-09-02
IN2012DN01521A (ja) 2015-06-05
EP2468860A4 (en) 2013-04-03
US9284561B2 (en) 2016-03-15
KR20120051705A (ko) 2012-05-22
CN102498209A (zh) 2012-06-13
JPWO2011021629A1 (ja) 2013-01-24
EP2468860A9 (en) 2012-12-26
EP2468860B1 (en) 2015-11-25
EP2468860A1 (en) 2012-06-27
US20120214214A1 (en) 2012-08-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5772594B2 (ja) 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法
US9617570B2 (en) Acid resistant yeast cell and use thereof
US9428777B2 (en) Transformant and method for producing same, and method for producing lactic acid
JP2000509988A (ja) キシロースをエタノールに発酵するための安定な組換え酵母
EP3800258A1 (en) Novel promoter derived from organic acid-resistant yeast and method for expression of target gene by using same
CN106715679A (zh) 用于生产乙偶姻的方法
JP6620375B2 (ja) 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法
WO2014156476A1 (ja) 遺伝子改変クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム
US9309542B2 (en) Recombinant Caldicellulosiruptor bescii and methods of use
CN116064352A (zh) 高产1,3-丙二醇的克雷伯氏工程菌构建方法及应用
JP6499587B2 (ja) 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法
JP5565992B2 (ja) 酵母キャンディダ・ユティリスの形質転換法
JP6488666B2 (ja) クローニングベクター、発現ベクターおよび形質転換体の製造方法
JP6620373B2 (ja) 形質転換体およびその製造方法、ならびに炭素数４のジカルボン酸の製造方法
JP2009178104A (ja) ヘテロ接合性の消失を利用した二倍体細胞染色体特定領域のホモ化方法
WO2012165627A1 (ja) プライマーセット及び相同性組み換え方法

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201080037195.7

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10809970

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011527683

Country of ref document: JP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20127004318

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1521/DELNP/2012

Country of ref document: IN

Ref document number: 2010809970

Country of ref document: EP