RU2614233C1 - Трансформант дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующий молочную кислоту (варианты), способ его получения (варианты), способ микробиологического синтеза молочной кислоты с использованием такого трансформанта - Google Patents

Трансформант дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующий молочную кислоту (варианты), способ его получения (варианты), способ микробиологического синтеза молочной кислоты с использованием такого трансформанта Download PDF

Info

Publication number
RU2614233C1
RU2614233C1 RU2015154997A RU2015154997A RU2614233C1 RU 2614233 C1 RU2614233 C1 RU 2614233C1 RU 2015154997 A RU2015154997 A RU 2015154997A RU 2015154997 A RU2015154997 A RU 2015154997A RU 2614233 C1 RU2614233 C1 RU 2614233C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
lactobacillus
yeast
lactate dehydrogenase
transformant
lactic acid
Prior art date
Application number
RU2015154997A
Other languages
English (en)
Inventor
Лариса Николаевна Борщевская
Татьяна Леонидовна Гордеева
Михаил Михайлович Вустин
Марина Александровна Великая
Анна Николаевна Калинина
Маргарита Александровна Котова
Сергей Павлович Синеокий
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГБУ "ГосНИИгенетика")
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГБУ "ГосНИИгенетика") filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГБУ "ГосНИИгенетика")
Priority to RU2015154997A priority Critical patent/RU2614233C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2614233C1 publication Critical patent/RU2614233C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C12N1/185—Saccharomyces isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01027—L-Lactate dehydrogenase (1.1.1.27)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Группа изобретений относится к микробиологии и биотехнологии и касается получения трансформантов дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующих молочную кислоту. Предложен трансформант, несущий ген ldh, кодирующий лактатдегидрогеназу из Lactobacillus acidophilus или фермент, аминокислотная последовательность которого гомологична ей не менее чем на 93%. Также предложен трансформант, несущий ген ldh, кодирующий лактатдегидрогеназу из Lactobacillus acidophilus или фермент, аминокислотная последовательность которого гомологична ей не менее чем на 93%, в котором инактивирован или делетирован один или несколько генов, кодирующих ферменты, участвующие в пути биосинтеза этанола. Предложен трансформант, несущий ген ldh, кодирующий лактатдегидрогеназу из Lactobacillus acidophilus, или фермент, аминокислотная последовательность которого гомологична ей не менее чем на 93%, и ген ldh, кодирующий лактатдегидрогеназу из Lactobacillus plantarum или Lactobacillus pentosus. Предложен трансформант, несущий ген ldh, кодирующий лактатдегидрогеназу из Lactobacillus acidophilus или фермент, аминокислотная последовательность которого гомологична ей не менее чем на 93%, и ген ldh, кодирующий лактатдегидрогеназу из Lactobacillus plantarum или Lactobacillus pentosus, в котором инактивирован или делетирован один или несколько генов, кодирующих ферменты, участвующие в пути биосинтеза этанола. Также предложены варианты способа получения указанных трансформантов и способ микробиологического синтеза молочной кислоты. Группа изобретений обеспечивает эффективную продукцию молочной кислоты при небольшой концентрации побочного продукта. 9 н. и 4 з.п. ф-лы, 10 ил., 8 пр.

Description

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается получения трансформантов дрожжей Schizosaccharomyces pombe, способных продуцировать молочную кислоту.
Молочную кислоту (МК) широко используют в пищевой промышленности для консервирования и ароматизации и в производстве биодеградируемой пластмассы - полилактата. Другая сфера использования молочной кислоты - получение биодеградируемого растворителя этиллактата, который применяют при производстве электротехники, лаков и красок, текстиля, смазок, клеев и т.д. Нетоксичные эфиры молочной кислоты потенциально могут заменить более 80% растворителей, используемых в мире в настоящее время. В связи с этим актуальной становится задача разработки эффективных способов производства молочной кислоты.
Традиционно для получения МК используют микробиологические способы получения, основанные на культивировании бактериальных штаммов молочнокислых бактерий. Недостатком бактериальных штаммов-продуцентов молочной кислоты является их чувствительность к низким значениям рН и высоким концентрациям молочной кислоты, что приводит к замедлению роста культуры, снижению скорости синтеза молочной кислоты и, как следствие, преждевременному завершению процесса ферментации.
Особый интерес для создания продуцентов молочной кислоты представляет конструирование штаммов микроорганизмов, в меньшей степени чувствительных к низким значениям рН и высоким концентрациям молочной кислоты.
Перспективным объектом для производства молочной кислоты являются дрожжи, многие из которых способны расти и осуществлять брожение в условиях повышенной кислотности [Бабьева И.П., Чернов И.Ю. Биология дрожжей, Товарищество научных изданий КМК, М., 2004].
В норме дрожжи не продуцируют значимых количеств молочной кислоты, однако, экспрессия гена лактатдегидрогеназы (ldh) в дрожжевых клетках позволяет получить штаммы, продуцирующие молочную кислоту в количествах, сравнимых с производственным уровнем [Biotechnol Genet Eng Rev., 2010, v. 27, №1, p. 9-256]. В качестве реципиента в таких случаях используют штаммы таких дрожжей, как Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces sp., Pichia sp., Schizosaccharomyces sp. и Hansenula sp., а в качестве источника гена лактатдегидрогеназы - молочнокислые бактерии (Lactobacillus), грибы (Rhizopus oryzae) и ткани млекопитающих (ген ldh из клеток мышечной ткани быка или человека).
Дрожжи Pichia stipitis, несущие ген лактатдегидрогеназы из Lactobacillus helveticus, способны продуцировать молочную кислоту в количестве 41 г/л культуральной жидкости [Appl Environ Microbiol., 2007, v. 73, p. 117-123].
Трансформант дрожжей Saccharomyces cerevisiae JnvScl, содержащая ген лактатдегидрогеназы из гриба Rhizopus oryzae (J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2003, v. 30, p. 22-27), продуцирует молочную кислоту в количестве до 40 г/л культуральной жидкости, а его отличительной способностью является неизменная скорость образования молочной кислоты в интервале рН 3,5-6,0.
Известен [Enzyme Microbial Technology., 2003, v. 33, №1, p. 38-46] трансформант на основе дрожжей Saccharomyces cerevisiae, несущий ген лактатдегидрогеназы из бактерий Lactobacillus plantarum, который продуцирует молочную кислоту в количестве 58 г/л культуральной жидкости при рН 3,6. Основным недостатком дрожжей Saccharomyces cerevisiae является то, что процесс синтеза молочной кислоты у них чувствителен к ее высоким концентрациям, что отрицательно влияет на выход конечного продукта.
Известно, что высокой устойчивостью к низким значениям рН среды и высоким концентрациям молочной кислоты обладают дрожжи Schizosaccharomyces pombe [RU 2268304]. Они хорошо генетически изучены, не требуют для своего роста сложных органических сред и удобны для промышленной ферментации, что делает их перспективным объектом для создания продуцентов молочной кислоты.
Показано, что дрожжи Schizosaccharomyces pombe, содержащие ген лактатдегидрогеназы из грибов Rhizopus oryzae [RU 2268304], продуцируют молочную кислоту в количестве 58 г/л культуральной жидкости. Однако они не подходят для промышленного применения, так как требуют двухстадийного культивирования и тщательной отмывки клеток. Кроме того, время культивирования для достижения указанного количества молочной кислоты очень велико и составляет 8 суток.
Штамм Schizosaccharomyces pombe АТСС №2476, несущий ген лактатдегидрогеназы млекопитающих (Homo sapiens), продуцирует молочную кислоту в количестве 88 г/л культуральной жидкости [US 20120214214].
Известно [WO 2014030655], что гены лактатдегидрогеназ экспрессируются в дрожжах Schizosaccharomyces pombe с различной эффективностью, а кодируемые ими ферменты лактатдегидрогеназы могут не проявлять активности. Показано, что трансформанты, несущие в составе хромосомы гены лактатдегидрогеназ из Lactobacillus bulgaricus, Staphylococcus aureus, не способны продуцировать молочную кислоту, а трансформанты, несущие в составе хромосомы гены лактатдегидрогеназ из Homo sapiens, Lactobacillus pentosus, Pediococcus acidilactici, продуцируют молочную кислоту в разных количествах: 83,2 г/л, 78,9 г/л и 22,0 г/л культуральной жидкости соответственно. В работе исследованы также трансформанты, несущие одновременно несколько генов лактатдегидрогеназ из различных источников. Так, трансформант, несущий гены лактатдегидрогеназ из Homo sapiens и Lactobacillus plantarum продуцирует молочную кислоту в количестве 64,8 г/л культуральной жидкости, а трансформант, несущий гены лактатдегидрогеназ из Homo sapiens и Lactobacillus pentosus - в количестве 91,5 г/л культуральной жидкости. Однако, представленные результаты получены в модельной системе с использованием сгущенной культуры клеток, процесс культивирования осуществляется в две стадии, а ферментационная среда для успешного культивирования должна содержать редкую и дорогую добавку - протеолипиды (белково-липидные соединения, экстрагируемые органическими растворителями из ткани мозга).
Выбор генов, кодирующих лактатдегидрогеназы, эффективно работающие в дрожжах S. pombe, и создание на их основе промышленно значимых продуцентов молочной кислоты является важной задачей.
Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих молочную кислоту, и расширение арсенала способов микробиологического синтеза молочной кислоты.
Задача решена путем получения:
- трансформанта дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующего молочную кислоту, содержащего ген ldh, кодирующий лактатдегидрогеназу из Lactobacillus acidophilus или фермент, аминокислотная последовательность которого гомологична ей не менее чем на 93%;
- трансформанта дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующего молочную кислоту, содержащего ген ldh, кодирующий лактатдегидрогеназу из Lactobacillus acidophilus или фермент, аминокислотная последовательность которого гомологична ей не менее чем на 93%, в котором инактивирован или делетирован один или несколько генов, кодирующих ферменты, участвующие в пути биосинтеза этанола;
- трансформанта дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующего молочную кислоту, содержащего ген ldh, кодирующий лактатдегидрогеназу из Lactobacillus acidophilus или фермент, аминокислотная последовательность которого гомологична ей не менее чем на 93%, и ген ldh, кодирующий лактатдегидрогеназу из Lactobacillus plantarum или Lactobacillus pentosus;
- трансформанта дрожжей Schizosaccharomyces pombe продуцирующего молочную кислоту, содержащего ген ldh, кодирующий лактатдегидрогеназу из Lactobacillus acidophilus или фермент, аминокислотная последовательность которого гомологична ей не менее чем на 93%, и ген ldh, кодирующий лактатдегидрогеназу из Lactobacillus plantarum или Lactobacillus pentosus, в котором инактивирован или делетирован один или несколько генов, кодирующих ферменты, участвующие в пути биосинтеза этанола.
К ферментам, аминокислотная последовательность которых гомологична лактатдегидрогеназе из Lactobacillus acidophilus [NCBI: WP 003549000.1] не менее чем на 93% относятся, например, лактатдегидрогеназа из Lactobacillus kitasatonis [NCBI: WP 025014735.1], или Lactobacillus ultunensis [NCBI: WP 007126779.1], или Lactobacillus crispatus [NCBI: WP 005721100.1], или Lactobacillus gallinarum [NCBI: WP 025005283.1], или Lactobacillus amylovorus [NCBI: WP 013437112.1], или Lactobacillus kefiranofaciens [NCBI: WP 013855318.1].
Аминокислотные последовательности лактатдегидрогеназ из Lactobacillus plantarum и Lactobacillus pentosus приведены в базе NCBI: [GenBank: ACJ15334.1] и [NCBI: WP_003638120.1] соответственно.
К ферментам, участвующим в биосинтезе этанола у дрожжей S. pombe, относятся алкогольдегидрогеназы ADH1, ADH2, ADH3, ADH4 и пируватдекарбоксилазы PDC1, PDC2, PDC3, PDC4.
Получение заявленных трансформантов включает введение выбранного гена или генов ldh в клетки дрожжей S. pombe с помощью подходящего плазмидного вектора, содержащего экспрессионную кассету, включающую в свой состав ген ldh, промотор, работающий в дрожжах S. pombe, терминатор, маркерный ген и, предпочтительно, сайт для гомологичной интеграции в хромосому. Интеграция может быть осуществлена путем как гомологичной, так и негомологичной рекомбинации. Примеры векторов можно найти, например, в [http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/vectortable.html]. Плазмидные вектора или экспрессионные кассеты трансформируют в клетки дрожжей S. pombe методом электоропорации [Yeast, 2002, v. 18, p. 1015-1021], методом с использованием ацетата лития или протопластов [http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/tfmn.html] или другими.
Конструирование векторов и экспрессионных кассет осуществляют стандартными методами генетической инженерии [Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии. - СПб.: СПбГТУ, 1999. Sambrook J., Maniatis Т., Fritsch Е. Molecular cloning: a laboratory manual. - N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989] с использованием генетических элементов, подходящих для работы с дрожжами S. pombe. В качестве промоторов используют adh, nmtl, nmt41, nmt81, hCMV, CV40 или другие [http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/vectortable.html]. В качестве селективных маркеров используют гены can1 или kanMX [http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/drugs.html], придающие клеткам устойчивость к канаванину или G418, а также гены комплементирующие ауксотрофные мутации в геноме S. pombe, например, URA4 или LEU2 [http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/vectortable.html]. В качестве плечей для гомологичной интеграции используют последовательности транспозонов Tf1 [Eukaryotic Cell, Feb. 2002, p. 44-55] или Tf2 [US 20120214214] или последовательность гена LEU1 [РФ 2539092] или другие последовательности, гомологичные участкам хромосомы дрожжей S. pombe.
Получение других заявленных трансформантов, кроме введения выбранного гена или генов в клетки дрожжей S. pombe, дополнительно включает инактивацию или делетирование генов, кодирующих ферменты, участвующие в пути биосинтеза этанола, что позволяет уменьшить количество этого побочного продукта.
Нуклеотидные последовательности генов, кодирующих алкогольдегидрогеназы ADH1, ADH2, ADH3, ADH4 и пируватдекарбоксилазы PDC1, PDC2, PDC3, PDC4 приведены в геномном сиквенсе дрожжей S. pombe [Nature, 2002, v. 415, p. 871-880]. Инактивацию или делетирование генов осуществляют любым подходящим способом, например, методом Латура [Nucleic. Acids Res., 2006, v. 34, p. 11] или с помощью ПЦР, допускающей ошибки [PCR Methods Appl., 1992, v. 2, p. 28-33], или методами, основанными на использовании Cre-lox системы [Biosci. Biotechnol. Biochem., 68 (3), 545-550, 2004], или методами [Yeast Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1163, p. 45-72] или другими.
Задача решена также тем, что предложен способ микробиологического синтеза молочной кислоты, включающий культивирование в питательной среде заявленных трансформантов.
Заявленный способ включает культивирование полученных трансформантов в подходящих для продукции молочной кислоты питательных средах и условиях, например [RU 2268304; WO 2014030655; RU 2539092].
В приведенных примерах в качестве штамма-реципиента используют штамм Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-3106. Плазмидные вектора, содержащие интегративные экспрессионные кассеты, конструируют методом клонирования [Sambrook J., Maniatis Т., Fritsch Е. Molecular cloning: a laboratory manual. - N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.] генетических элементов (описанных в примерах) в коммерческий вектор pUC19. Генетические элементы - дрожжевой селективный маркер kanMX, фланкированный сайтами lox 66 и lox 71, под контролем дрожжевого TEF промотора, CMV промотор, нуклеотидную последовательность ретротранспозона Tf1 - синтезируют стандартным методом ПЦР [http://www.gene-quantification.de/ras-pcr-application-manual-3rd-ed.pdf]. Дрожжи S. pombe трансформируют интегративными экспрессионными кассетами методом электропорации [http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/tfmn.html]. Продуктивные трансформанты отбирают на селективной среде, содержащей мел.
Ферментацию полученных трансформантов в приведенных примерах осуществляют при 30°С в питательной среде, содержащей дрожжевой экстракт, пептон и глюкозу, в пробирках (50 мл) с рабочим объемом 5 мл.
Концентрацию молочной кислоты в культуральной жидкости определяют согласно методу ВЭЖХ [Acta Biotechnol. 1990. v. 10 (5) р. 459-468]. Концентрацию этанола определяют согласно методу ГХ [Chromatogr. Sci. 2009. v. 47 (4). p. 272-278].
Изобретение проиллюстрировано чертежами, где приведено:
Фиг. 1. Плазмидный вектор pCMV-aci-Tf1.
Фиг. 2. Плазмидный вектор pCMV-amy-Tf1.
Фиг. 3. Плазмидный вектор pCMV-cri-Tf1.
Фиг. 4. Плазмидный вектор pCMV-aci-adh1.
Фиг. 5. Электрофореграмма ПЦР-анализа трансформанта с отключенным геном adh1.
Фиг. 6. Плазмидный вектор pCMV-aci-pdc2.
Фиг. 7. Электрофореграмма ПЦР-анализа трансформанта с отключенным геном pdc2.
Фиг. 8. Плазмидный вектор pCMV-pla-Tf1-Hyg.
Фиг. 9. Плазмидный вектор pCMV-pen-Tf1-Hyg.
Фиг. 10. Электрофореграмма ПЦР-анализа трансформантов по примерам 1-7.
Пример 1. Получение трансформанта дрожжей S. pombe, несущего ген ldh из Lactobacillus acidophilus
Получают плазмидный вектор pCMV-aci-Tf1, содержащий интегративную экспрессионную кассету. В качестве источника гена ldh используют тотальную геномную ДНК Lactobacillus acidophilus ВКПМ В-4625. Синтезируют ДНК гена ldh методом ПЦР с использованием праймеров pr-aci-1 и pr-aci-2, содержащих на 5'-концах сайты рестрикции (выделены жирным шрифтом) для клонирования - Nhe1 и Pme1 соответственно:
Figure 00000001
,
Figure 00000002
.
Полученную ДНК, дрожжевой селективный маркер kanМХ, нуклеотидную последовательность ретротранспозона Тf1 клонируют в вектор pUC19. Полученный таким образом плазмидный вектор pCMV-aci-Tf1 (фиг. 1) содержит в своем составе следующие генетические элементы:
1. Дрожжевой селективный маркер kanМХ, фланкированный сайтами lox 66 и lox 71, под контролем дрожжевого TEF промотора.
2. Ген ldh Lactobacillus acidophilus, под контролем CMV промотора.
3. Область для интеграции - нуклеотидная последовательность ретротранспозона Tf1.
4. Селективный маркер для клеток E. coli - ген bla, кодирующий β-лактамазу, придающий клеткам устойчивость к ампициллину.
5. Бактериальный pUC origin.
Для получения интегративной экспрессионной кассеты плазмиду pCMV-aci-Tf1 обрабатывают эндонуклеазами рестрикции BamH1, Nae1. Полученные ДНК фрагменты разделяют в агарозном геле, выделяют и очищают ДНК фрагмент размером 5326 п.о. Полученный ДНК фрагмент является интегративной экспрессионной кассетой, содержащей в своем составе ген ldh Lactobacillus acidophilus, под контролем CMV промотора; маркерный ген kanМХ, фланкированный сайтами lox 66 и lox 71 и обуславливающий у дрожжей S. pombe устойчивость к антибиотику G418; и плечи для гомологичной интеграции в хромосому. В качестве плечей для интеграции используют нуклеотидную последовательность ретротранспозона Tf1.
Дрожжи S. pombe трансформируют указанной интегративной экспрессионной кассетой.
Штамм S. pombe Y-3106 предварительно выращивают в жидкой питательной среде YPD (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, вода - остальное) до концентрации 1×108 клеток на 1 мл. Клетки центрифугируют, промывают в ледяной стерильной воде, а затем в ледяном растворе 1 М сорбитола. Клетки инкубируют в 25 мМ растворе дитиотрейтола в течение 15 минут, затем промывают в ледяном растворе 1М сорбитола. Клетки ресуспендируют в ледяном растворе 1 М сорбитола в концентрации 1-5×109 клеток на 1 мл. Аликвоту, объемом 40 мкл клеточной суспензии, переносят в охлажденный эппендорф, добавляют 400 нг ДНК экспрессионной интеграционной кассеты, и инкубируют во льду 5 минут. Смесь клеток и ДНК переносят в предварительно охлажденную кювету для электропорации. Электропорацию проводят при следующих условиях: 1,5 кВ, 400 Ом, 25 uF. После порации добавляют 1 мл ледяного раствора 1 М сорбитола.
Селекцию трансформантов ведут на агаризованной среде среде YES [http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/media.html] с добавлением глюкозы (2 мас. %) в течение 5 суток при температуре 30°С. В качестве селективного агента добавляют антибиотик G418 в количестве 130 мкг/мл.
Продукцию молочной кислоты трансформантами оценивают в чашечном тесте по зонам гидролиза. В тесте используют агаризованную среду YPD (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, агар - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %) и мела (0,5 мас. %). В качестве контроля используют штамм Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-3106.
Наиболее продуктивные трансформанты, показавшие наибольшее соотношение диаметра зоны гидролиза к диаметру колонии на чашках с мелом, отбирают и культивируют в жидкой питательной среде в пробирке.
Посевную культуру выращивают в пробирках (50 мл) с 10 мл жидкой питательной среды YPD с добавлением глюкозы (2 мас. %) при 30°С в течение 24 ч на качалке с 250 об/мин. Посев ферментационной среды осуществляют в соотношении 1/10 об.
Ферментацию проводят при 30°С в термостате без аэрации в питательной среде состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 0,5, пептон - 1, вода - остальное с добавлением глюкозы (18 мас. %) в пробирках (50 мл) с рабочим объемом 5 мл. Ферментацию продолжают в течение 72 часов.
По результатам ферментации отобран трансформант, который при культивировании в пробирках синтезирует молочную кислоту в количестве 40 г/л культуральной жидкости, а побочный продукт - этанол в количестве 39 г/л.
Пример 2. Получение трансформанта дрожжей S. pombe, несущего ген ldh из Lactobacillus amylovorus
Получают плазмидный вектор pCMV-amy-Tf1, содержащий интегративную экспрессионную кассету. В качестве источника гена ldh используют тотальную геномную ДНК Lactobacillus amylovorus, DSM 20531. Синтезируют ДНК гена ldh методом ПЦР с использованием праймеров pr-amy-1 и pr-amy-2, содержащих на 5'-концах сайты рестрикции (выделены жирным шрифтом) для клонирования - Nhe1 и Pme1 соответственно:
Figure 00000003
,
Figure 00000004
.
Полученную ДНК, дрожжевой селективный маркер kanМХ, нуклеотидную последовательность ретротранспозона Tf1 клонируют в вектор pUC19. Полученный таким образом плазмидный вектор pCMV-amy-Tf1 (фиг. 2) содержит в своем составе следующие генетические элементы:
1. Дрожжевой селективный маркер kanМХ, фланкированный сайтами lox 66 и lox 71, под контролем дрожжевого TEF промотора.
2. Ген ldh Lactobacillus amylovorus под контролем CMV промотора
3. Область для интеграции - нуклеотидная последовательность ретротранспозона Tf1.
4. Селективный маркер для клеток E. coli - ген bla, кодирующий β-лактамазу, придающий клеткам устойчивость к ампициллину.
5. Бактериальный pUC origin.
Для получения интегративной экспрессионной кассеты плазмиду pCMV-amy-Tf1 обрабатывают эндонуклеазами рестрикции BamH1, Nae1. Полученные ДНК фрагменты разделяют в агарозном геле, выделяют и очищают ДНК фрагмент, размером 5319 п.о. Полученный ДНК фрагмент является интегративной экспрессионной кассетой, содержащей в своем составе ген ldh Lactobacillus amylovorus, под контролем CMV промотора; маркерный ген kanМХ, фланкированный сайтами lox 66 и lox 71, и обуславливающий у дрожжей S. pombe устойчивость к антибиотику G418; и плечи для гомологичной интеграции в хромосому. В качестве плечей для интеграции используют нуклеотидную последовательность ретротранспозона Tf1.
Дрожжи S. pombe трансформируют указанной интегративной экспрессионной кассетой.
Получение, отбор и культивирование трансформантов осуществляют по примеру 1.
По результатам ферментации отобран трансформант, который при культивировании в пробирках синтезирует молочную кислоту в количестве 45 г/л культуральной жидкости, а побочный продукт - этанол в количестве 36 г/л.
Пример 3. Получение трансформанта дрожжей S. pombe, несущих ген ldh из Lactobacillus crispatus
Получают плазмидный вектор pCMV-cri-Tf1, содержащий интегративную экспрессионную кассету. В качестве источника гена ldh используют тотальную геномную ДНК Lactobacillus crispatus DSM 20584. Синтезируют ДНК гена ldh методом ПЦР с использованием праймеров pr-cri-1 и pr-cri-2, содержащих на 5'-концах сайты рестрикции (выделены жирным шрифтом) для клонирования - Nhe1 и Pme1 соответственно:
Figure 00000005
,
Figure 00000006
.
Полученную ДНК, дрожжевой селективный маркер kanМХ, нуклеотидную последовательность ретротранспозона Tf1 клонируют в вектор pUC19. Полученный таким образом плазмидный вектор pCMV-cri-Tf1 (фиг. 3) содержит в своем составе следующие генетические элементы:
1. Дрожжевой селективный маркер kanМХ, фланкированный сайтами lox 66 и lox 71, под контролем дрожжевого TEF промотора.
2. Ген ldh Lactobacillus crispatus, под контролем CMV промотора.
3. Область для интеграции - нуклеотидная последовательность ретротранспозона Tf1.
4. Селективный маркер для клеток E. coli - ген bla, кодирующий β-лактамазу, придающий клеткам устойчивость к ампициллину.
5. Бактериальный pUC origin.
Для получения интегративной экспрессионной кассеты плазмиду pCMV-cri-Tf1 обрабатывают эндонуклеазами рестрикции BamH1, Nae1. Полученные ДНК фрагменты разделяют в агарозном геле, выделяют и очищают ДНК фрагмент, размером 5322 п.о. Полученный ДНК фрагмент является интегративной экспрессионной кассетой, содержащей в своем составе ген ldh Lactobacillus crispatus, под контролем CMV промотора; маркерный ген капМХ, фланкированный сайтами lox 66 и lox 71, и обуславливающий у дрожжей S. pombe устойчивость к антибиотику G418; и плечи для гомологичной интеграции в хромосому. В качестве плечей для интеграции используют нуклеотидную последовательность ретротранспозона Tf1.
Дрожжи S. pombe трансформируют указанной интегративной экспрессионной кассетой.
Получение, отбор и культивирование трансформантов осуществляют по примеру 1.
По результатам ферментации отобран трансформант, который при культивировании в пробирках синтезирует молочную кислоту в количестве 38 г/л культуральной жидкости, а побочный продукт - этанол в количестве 40 г/л.
Пример 4. Получение трансформанта дрожжей S. pombe с инактивированным геном adhl. в хромосому которого интегрирован ген ldh из Lactobacillus acidophilus
Инактивацию гена adh1 [NCBI: NC_003421.2] осуществляют методом двойного кроссинговера [http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/disruptions.html]. Для этого получают плазмидный вектор pCMV-aci-adh1, содержащий интегративную экспрессионную кассету, включающую в свой состав в качестве плечей для интеграции фрагменты гена adh1: 5'- adh1 и 3'- adh1. ДНК фрагмент 5'- adh1 синтезируют методом ПЦР с использованием праймеров pr-5'-adh1-1 и pr-5'-adh1-2, содержащих на 5'-концах сайты рестрикции (выделены жирным шрифтом) для клонирования - Sma1 и Есо321 соответственно:
Figure 00000007
,
Figure 00000008
.
ДНК фрагмент 3'-adh1 синтезируют методом ПЦР с использованием праймеров рr-3'-adh1-1 и pr-3'-adh1-2, содержащих на 5'-концах сайты рестрикции (выделены жирным шрифтом) для клонирования - Есо321 и BamH1 соответственно:
Figure 00000009
,
Figure 00000010
.
В качестве источника гена ldh используют тотальную геномную ДНК Lactobacillus acidophilus ВКПМ В-4625. Синтезируют ДНК гена ldh методом ПЦР с использованием праймеров pr-aci-1 и pr-aci-2, содержащих на 5'-концах сайты рестрикции (выделены жирным шрифтом) для клонирования - Nhe1 и Pme1 соответственно:
Figure 00000011
,
Figure 00000012
.
Полученную ДНК, ДНК фрагменты 5'-adh1 и 3'-adh1, дрожжевой селективный маркер kanМХ клонируют в вектор pUC19. Полученный таким образом плазмидный вектор pCMV-aci-adh1 (фиг 4), содержит в своем составе следующие генетические элементы:
1. Дрожжевой селективный маркер kanМХ, фланкированный сайтами lox 66 и lox 71, под контролем дрожжевого TEF промотора.
2. Ген ldh Lactobacillus acidophilus под контролем CMV промотора.
3. Область для интеграции - фрагменты нуклеотидной последовательности гена алкогольдегидрогеназы adh1 дрожжей S. pombe.
4. Селективный маркер для клеток E. coli - ген bla, кодирующий β-лактамазу, придающий клеткам устойчивость к ампициллину.
5. Бактериальный pUC origin.
Для получения интегративной экспрессионной кассеты плазмиду pCMV-aci-adh1 обрабатывают эндонуклеазами рестрикции BamH1, Sma1. Полученные ДНК фрагменты разделяют в агарозном геле, выделяют и очищают ДНК фрагмент, размером 5428 п.о. Полученный ДНК фрагмент является интегративной экспрессионной кассетой, содержащей в своем составе фрагмент ДНК, кодирующий аминокислотную последовательность гена ldh Lactobacillus acidophilus, под контролем CMV промотора; маркерный ген kanМХ, фланкированный сайтами lox 66 и lox 71, и обуславливающий у дрожжей S. pombe устойчивость к антибиотику G418; и плечи для гомологичной интеграции в хромосому. В качестве плечей для интеграции используют нуклеотидную последовательность гена adh1.
Дрожжи S. pombe трансформируют указанной интегративной экспрессионной кассетой.
Получение и селекцию трансформантов осуществляют по примеру 1. Далее проводят отбор трансформантов с отключенным геном adh1 по стандартной методике [http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/disruptions.html]. Для этого проводят ПЦР с использованием праймеров pr-5'-adh1-1 и pr-3'-adh1-1, гомологичных началу и концу последовательности гена adhl. Отбирают трансформанты, у которых в результате ПЦР, не нарабатывается полноразмерный ген adh1 (фиг. 5: 1 - полноразмерный ген adh1 отсутствует, 2 - полноразмерный ген adh1 присутствует, 3 - контроль). Для контроля величины фрагментов ДНК при электрофорезе используют молекулярный маркер O'GeneRuler 1000 bp DNA Ladder, размер фрагментов (сверху вниз) 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500,4000, 5000, 6000, 8000, 10000 п.н,
Культивирование трансформантов и оценку продукции молочной кислоты осуществляют по примеру 1. Однако ферментацию проводят аэробно на качалке с 250 об/мин.
По результатам ферментации отобран трансформант, который при культивировании в пробирках синтезирует молочную кислоту в количестве 50 г/л культуральной жидкости, а побочный продукт - этанол в количестве 20 г/л.
Пример 5. Получение трансформантов дрожжей S. pombe с инактивированным геном pdc2, в хромосому которых интегрирован ген ldh из Lactobacillus acidophilus
Инактивацию гена pdc2 [NCBI Reference Sequence: NC 003421.2] осуществляют методом двойного кроссинговера [http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/disruptions.html]. Для этого получают плазмидный вектор pCMV-aci-pdc2, содержащий интегративную экспрессионную кассету, включающую в свой состав в качестве плечей для интеграции фрагменты гена pdc2: 5'-pdc2 и 3'-pdc2. ДНК фрагмент 5'-pdc2 синтезируют методом ПЦР с использованием праймеров pr-5'-pdc21 и pr-5'-pdc2-2, содержащих на 5'-концах сайты рестрикции (выделены жирным шрифтом) для клонирования - BamH1 и Есо321 соответственно:
Figure 00000013
,
Figure 00000014
.
ДНК фрагмент 3'-pdc2 синтезируют методом ПЦР с использованием праймеров pr-3'-pdc2-1 и pr-3'-pdc2-2, содержащих на 5'-концах сайты рестрикции (выделены жирным шрифтом) для клонирования - Есо321 и Kpn1 соответственно:
Figure 00000015
,
Figure 00000016
.
В качестве источника гена ldh используют тотальную геномную ДНК Lactobacillus acidophilus ВКПМ В-4625. Синтезируют ДНК гена ldh методом ПЦР с использованием праймеров pr-aci-1 и pr-aci-2, содержащих на 5'-концах сайты рестрикции (выделены жирным шрифтом) для клонирования - Nhe1 и Pme1 соответственно:
Figure 00000017
,
Figure 00000018
.
Полученную ДНК, ДНК фрагменты 5'- pdc2 и 3'- pdc2, дрожжевой селективный маркер kanМХ клонируют в вектор pUC19. Полученный таким образом плазмидный вектор pCMV-aci-pdc2 (фиг. 6), содержит в своем составе следующие генетические элементы:
1. Дрожжевой селективный маркер kanМХ, фланкированный сайтами lox 66 и lox 71, под контролем дрожжевого TEF промотора.
2. Ген ldh Lactobacillus acidophilus под контролем CMV промотора.
3. Область для интеграции - нуклеотидная последовательность гена pdc2.
4. Селективный маркер для клеток E. coli - ген bla, кодирующий β-лактамазу, придающий клеткам устойчивость к ампициллину.
5. Бактериальный pUC origin.
Для получения интегративной экспрессионной кассеты плазмиду pCMV-aci-pdc2 обрабатывают эндонуклеазами рестрикции BamH1, Kpn1. Полученные ДНК фрагменты разделяют в агарозном геле, выделяют и очищают ДНК фрагмент, размером 5716 и.о. Полученный ДНК фрагмент является интегративной экспрессионной кассетой, содержащей в своем составе ген ldh Lactobacillus acidophilus под контролем CMV промотора; маркерный ген kanМХ, фланкированный сайтами lox 66 и lox 71, и обуславливающий у дрожжей S. pombe устойчивость к антибиотику G418; и плечи для гомологичной интеграции в хромосому. В качестве плечей для интеграции используют нуклеотидную последовательность гена pdc2.
Дрожжи S. pombe трансформируют указанной интегративной экспрессионной кассетой.
Получение и селекцию трансформантов осуществляют по примеру 1. Далее проводят отбор трансформантов с отключенным геном pdc2 по стандартной методике [http://www-bcf.ucs.edu/~forsburg/disruptions.html]. Для этого проводят ПЦР с использованием праймеров pr-5'-pdc2-1 и pr-3'-pdc2-2, гомологичных началу и концу последовательности гена pdc2. Отбирают трансформанты, у которых в результате ПЦР, не нарабатывается полноразмерный ген pdc2 (фиг. 7: 1 - контроль, 2 - полноразмерный ген pdc2 присутствует, 3 - полноразмерный ген pdc2 отсутствует). Для контроля величины фрагментов ДНК при электрофорезе используют молекулярный маркер O'GeneRuler 1000 bp DNA Ladder.
Культивирование трансформантов и оценку продукции молочной кислоты осуществляют по примеру 1. Однако ферментацию проводят аэробно на качалке с 250 об/мин.
По результатам ферментации отобран трансформант, который при культивировании в пробирках синтезирует молочную кислоту в количестве 45 г/л культуральной жидкости, а побочный продукт - этанол в количестве 25 г/л.
Пример 6. Получение трансформанта дрожжей S. pombe с инактивированным геном adh1, в хромосому которого интегрированы гены ldh из Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus plantarum
Получают плазмидный вектор pCMV-pla-Tf1-Hyg, содержащий интегративную экспрессионную кассету. В качестве источника гена ldh используют тотальную геномную ДНК Lactobacillus plantarum ВКПМ В-7636. Синтезируют ДНК гена ldh методом ПЦР с использованием праймеров pr-pla-1 и pr-pla-2, содержащих на 5'-концах сайты рестрикции (выделены жирным шрифтом) для клонирования - Nhe1 и Pme1 соответственно:
Figure 00000019
,
Figure 00000020
.
Полученную ДНК, дрожжевой селективный маркер hph, нуклеотидную последовательность ретротранспозона Tf1 клонируют в вектор pUC19. Полученный таким образом плазмидный вектор pCMV-pla-Tf1-Hyg (фиг 8) содержит в своем составе следующие генетические элементы:
1. Дрожжевой селективный маркер hph, фланкированный сайтами lox 66 и lox 71, под контролем дрожжевого TEF промотора.
2. Ген ldh Lactobacillus plantarum, под контролем CMV промотора; Область для интеграции - нуклеотидная последовательность ретротранспозона Tf1.
3. Селективный маркер для клеток E. coli - ген bla, кодирующий β-лактамазу, придающий клеткам устойчивость к ампициллину.
4. Бактериальный pUC origin.
Для получения интегративной экспрессионной кассеты плазмиду pCMV-pla-Tf1-Hyg обрабатывают эндонуклеазами рестрикции BamH1, Nae1. Полученные ДНК фрагменты разделяют в агарозном геле, выделяют и очищают ДНК фрагмент, размером 5461 п.о. Полученный ДНК фрагмент является интегративной экспрессионной кассетой, содержащей в своем составе ген ldh Lactobacillus plantarum, под контролем CMV промотора; маркерный ген hph, фланкированный сайтами lox 66 и lox 71, и обуславливающий у дрожжей S. pombe устойчивость к антибиотику гигромицину; и плечи для гомологичной интеграции в хромосому. В качестве плечей для интеграции используют нуклеотидную последовательность ретротранспозона Tf1.
Клетки трансформанта дрожжей S. pombe с инактивированным геном adh1, несущих ген ldh из Lactobacillus acidophilus, по примеру 4, трансформируют указанной интегративной экспрессионной кассетой.
Получение, отбор и культивирование трансформантов осуществляют по примеру 1. Однако в качестве селективного агента добавляют антибиотик гигромицин в количестве 5 мг/мл, а ферментацию проводят аэробно на качалке с 250 об/мин.
По результатам ферментации отобран трансформант, который при культивировании в пробирках синтезирует молочную кислоту в количестве 90 г/л культуральной жидкости, а побочный продукт - этанол в количестве 10 г/л.
Пример 7. Получение трансформантов дрожжей S. pombe с инактивированным геном adh1, в хромосому которых интегрирован ген ldh из Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus pentosus
Получают плазмидный вектор pCMV-pen-Tf1-Hyg, содержащий интегративную экспрессионную кассету. В качестве источника гена ldh используют тотальную геномную ДНК Lactobacillus pentosus ВКПМ В-7667. Синтезируют ДНК гена ldh методом ПЦР с использованием праймеров pr-pla-1 и pr-pla-2, содержащих на 5'-концах сайты рестрикции (выделены жирным шрифтом) для клонирования - Nhe1 и Pme1 соответственно:
Figure 00000021
,
Figure 00000022
.
Полученную ДНК, дрожжевой селективный маркер hph, нуклеотидную последовательность ретротранспозона Tf1 клонируют в вектор pUC19. Полученный таким образом плазмидный вектор pCMV-pen-Tf1-Hyg (фиг. 9) содержит в своем составе следующие генетические элементы:
1. Дрожжевой селективный маркер hph, фланкированный сайтами lox 66 и lox 71, под контролем дрожжевого TEF промотора.
2. Ген ldh Lactobacillus pentosus, под контролем CMV промотора.
3. Область для интеграции - нуклеотидная последовательность ретротранспозона Tf1.
4. Селективный маркер для клеток E. coli - ген bla, кодирующий β-лактамазу, придающий клеткам устойчивость к ампициллину.
5. Бактериальный pUC origin.
Для получения интегративной экспрессионной кассеты плазмиду pCMV-pen-Tf1-Hyg обрабатывают эндонуклеазами рестрикции BamH1, Nae1. Полученные ДНК фрагменты разделяют в агарозном геле, выделяют и очищают ДНК фрагмент, размером 5461 п.о. Полученный ДНК фрагмент является интегративной экспрессионной кассетой, содержащей в своем составе ген ldh Lactobacillus pentosus под контролем CMV промотора; маркерный ген hph, фланкированный сайтами lox 66 и lox 71, и обуславливающий у дрожжей S. pombe устойчивость к антибиотику гигромицину; и плечи для гомологичной интеграции в хромосому. В качестве плечей для интеграции используют нуклеотидную последовательность ретротранспозона Tf1.
Клетки трансформанта дрожжей S. pombe с инактивированным геном adh1, несущих ген ldh из Lactobacillus acidophilus, по примеру 4, трансформируют указанной интегративной экспрессионной кассетой.
Получение, отбор и культивирование трансформантов осуществляют по примеру 1. Однако в качестве селективного агента добавляют антибиотик гигромицин в количестве 5 мг/мл, а ферментацию проводят аэробно на качалке с 250 об/мин.
По результатам ферментации отобран трансформант 7-5, который при культивировании в пробирках синтезирует молочную кислоту в количестве 90 г/л культуральной жидкости, а побочный продукт - этанол в количестве 10 г/л.
Важно отметить, что общей характеристикой для всех трансформантов, полученных по примерам 1-7 является следующее. Если для любого из полученных в примерах трансформантов при проведении ПЦР использовать его хромосому и проверочные селективные праймеры Pr-1 и Pr-2
Figure 00000023
,
Figure 00000024
,
то образующийся в ходе полимеразной цепной реакции ДНК фрагмент характеризуется размером, попадающим в интервал 1031-1050 п.н., что дает возможность осуществлять их идентификацию.
На фиг. 10 приведена электрофореграмма ПЦР-анализа полученных трансформантов (примеры 1-7, 8-контроль). Для контроля величины фрагментов ДНК при электрофорезе используют молекулярный маркер O'GeneRuler 1000 bp DNA Ladder.
Пример 8. Способ микробиологического синтеза молочной кислоты с использованием трансформанта с инактивированным геном adh1. в хромосому которого интегрирован ген ldh из Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus pentosus
В качестве посевной культуры используют клетки трансформанта 7.5, полученного по примеру 7.
Посевную культуру выращивают при 30°С в течение 2 суток на чашках Петри на агаризованной среде YPD (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, агар - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %).
Для получения инокулята пробирки (50 мл) с 10 мл жидкой питательной среды YPD с добавлением глюкозы (2 мас. %) засевают посевной культурой. Пробирки инкубируют на качалке (240 об/мин) при 30°С в течение 24 ч.
Колбу объемом 750 мл, содержащую 95 мл среды состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 0,5, пептон - 1, вода - остальное с добавлением глюкозы (18 мас. %), засевают 5 мл инокулята.
Культивирование осуществляют на качалке со скоростью 250 об/мин при температуре 30°С в течение 72 часов. При культивировании в колбе трансформант 7.5 секретирует молочную кислоту в количестве 98 г/л культуральной жидкости, продукция побочного продукта этанола составляет 6 г/л.
Таким образом, полученные трансформанты могут быть использованы в качестве продуцентов молочной кислоты, позволяющих в промышленно приемлемых условиях получать хорошую продукцию молочной кислоты при небольшой концентрации побочного продукта.
Показано, что совместная работа нескольких предложенных лактатдегидрогеназ в дрожжах S. pombe позволяет получать штаммы, эффективно продуцирующие молочную кислоту, сравнимые по уровню продукции с лучшими мировыми аналогами.

Claims (13)

1. Трансформант дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующий молочную кислоту, содержащий ген ldh, кодирующий лактатдегидрогеназу из Lactobacillus acidophilus или фермент, аминокислотная последовательность которого гомологична ей не менее чем на 93%.
2. Трансформант по п.1, в котором указанный ген ldh интегрирован в состав хромосомы.
3. Трансформант по п.1, в котором в качестве фермента, аминокислотная последовательность которого гомологична лактатдегидрогеназе из Lactobacillus acidophilus не менее чем на 93%, используют лактатдегидрогеназу из Lactobacillus kitasatonis, или Lactobacillus ultunensis, или Lactobacillus crispatus, или Lactobacillus gallinarum, или Lactobacillus amylovorus, или Lactobacillus kefiranofaciens.
4. Трансформант дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующий молочную кислоту, содержащий ген ldh, кодирующий лактатдегидрогеназу из Lactobacillus acidophilus или фермент, аминокислотная последовательность которого гомологична ей не менее чем на 93%, в котором инактивирован или делетирован один или несколько генов, кодирующих ферменты, участвующие в пути биосинтеза этанола.
5. Трансформант по п.4, в котором инактивирован ген adh1 и/или pdc2.
6. Трансформант дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующий молочную кислоту, содержащий ген ldh, кодирующий лактатдегидрогеназу из Lactobacillus acidophilus или фермент, аминокислотная последовательность которого гомологична ей не менее чем на 93%, и ген ldh, кодирующий лактатдегидрогеназу из Lactobacillus plantarum или Lactobacillus pentosus.
7. Трансформант дрожжей Schizosaccharomyces pombe продуцирующий молочную кислоту, содержащий ген ldh, кодирующий лактатдегидрогеназу из Lactobacillus acidophilus или фермент, аминокислотная последовательность которого гомологична ей не менее, чем на 93%, и ген ldh, кодирующий лактатдегидрогеназу из Lactobacillus plantarum или Lactobacillus pentosus, в котором инактивирован или делетирован один или несколько генов, кодирующих ферменты, участвующие в пути биосинтеза этанола.
8. Трансформант по п.7, в котором инактивирован ген adh1 и/или pdc2.
9. Способ получения трансформанта по п.1, включающий введение в клетки дрожжей Schizosaccharomyces pombe гена ldh, кодирующего лактатдегидрогеназу из Lactobacillus acidophilus или фермент, аминокислотная последовательность которого гомологична ей не менее чем на 93%.
10. Способ получения трансформанта по п.4, включающий введение в клетки дрожжей Schizosaccharomyces pombe гена ldh, кодирующего лактатдегидрогеназу, из Lactobacillus acidophilus или фермент, аминокислотная последовательность которого гомологична ей не менее чем на 93%, и инактивацию или делетирование одного или нескольких генов, кодирующих ферменты, участвующие в пути биосинтеза этанола.
11. Способ получения трансформанта по п.6, включающий введение в клетки дрожжей Schizosaccharomyces pombe гена ldh, кодирующего лактатдегидрогеназу из Lactobacillus acidophilus или фермент, аминокислотная последовательность которого гомологична ей не менее чем на 93%, и гена ldh, кодирующего лактатдегидрогеназу из Lactobacillus plantarum или Lactobacillus pentosus.
12. Способ получения трансформанта по п.7, включающий введение в клетки дрожжей Schizosaccharomyces pombe гена ldh, кодирующего лактатдегидрогеназу из Lactobacillus acidophilus или фермент, аминокислотная последовательность которого гомологична ей не менее чем на 93%, гена ldh, кодирующего лактатдегидрогеназу из Lactobacillus plantarum или Lactobacillus pentosus, и инактивацию или делетирование одного или нескольких генов, кодирующих ферменты, участвующие в пути биосинтеза этанола.
13. Способ микробиологического синтеза молочной кислоты, включающий культивирование дрожжей Schizosaccharomyces pombe в питательной среде, отличающийся тем, что для культивирования используют трансформант по пп.1-8.
RU2015154997A 2015-12-22 2015-12-22 Трансформант дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующий молочную кислоту (варианты), способ его получения (варианты), способ микробиологического синтеза молочной кислоты с использованием такого трансформанта RU2614233C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015154997A RU2614233C1 (ru) 2015-12-22 2015-12-22 Трансформант дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующий молочную кислоту (варианты), способ его получения (варианты), способ микробиологического синтеза молочной кислоты с использованием такого трансформанта

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015154997A RU2614233C1 (ru) 2015-12-22 2015-12-22 Трансформант дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующий молочную кислоту (варианты), способ его получения (варианты), способ микробиологического синтеза молочной кислоты с использованием такого трансформанта

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2614233C1 true RU2614233C1 (ru) 2017-03-23

Family

ID=58453308

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015154997A RU2614233C1 (ru) 2015-12-22 2015-12-22 Трансформант дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующий молочную кислоту (варианты), способ его получения (варианты), способ микробиологического синтеза молочной кислоты с использованием такого трансформанта

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2614233C1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2752896C1 (ru) * 2020-12-04 2021-08-11 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) Штамм дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующий L-молочную кислоту, содержащий в составе хромосомы гены трех различных гетерологичных лактатдегидрогеназ

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050112737A1 (en) * 2003-11-20 2005-05-26 A. E. Staley Manufacturing Co. Lactic acid producing yeast
RU2268304C1 (ru) * 2004-06-24 2006-01-20 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) Способ микробиологического синтеза молочной кислоты и рекомбинантный штамм дрожжей schizosaccharomyces pombe для его осуществления
RU2355759C1 (ru) * 2007-08-14 2009-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРОМАТИЧЕСКОЙ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН ydiB, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЛОЖНОГО ЭФИРА НИЗШИХ АЛКИЛОВ АЛЬФА-L-АСПАРТИЛ-L-ФЕНИЛАЛАНИНА
US20120214214A1 (en) * 2009-08-21 2012-08-23 Asahi Glass Company, Limited Transformant and process for production thereof, and process for production of lactic acid
RU2539092C1 (ru) * 2013-09-27 2015-01-10 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Schizosaccharomyces pombe - ПРОДУЦЕНТ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ
US20150232895A1 (en) * 2012-08-24 2015-08-20 Asahi Glass Company, Limited Transformant and method for producing same, and method for producing lactic acid

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050112737A1 (en) * 2003-11-20 2005-05-26 A. E. Staley Manufacturing Co. Lactic acid producing yeast
RU2268304C1 (ru) * 2004-06-24 2006-01-20 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) Способ микробиологического синтеза молочной кислоты и рекомбинантный штамм дрожжей schizosaccharomyces pombe для его осуществления
RU2355759C1 (ru) * 2007-08-14 2009-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРОМАТИЧЕСКОЙ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН ydiB, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЛОЖНОГО ЭФИРА НИЗШИХ АЛКИЛОВ АЛЬФА-L-АСПАРТИЛ-L-ФЕНИЛАЛАНИНА
US20120214214A1 (en) * 2009-08-21 2012-08-23 Asahi Glass Company, Limited Transformant and process for production thereof, and process for production of lactic acid
US20150232895A1 (en) * 2012-08-24 2015-08-20 Asahi Glass Company, Limited Transformant and method for producing same, and method for producing lactic acid
RU2539092C1 (ru) * 2013-09-27 2015-01-10 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Schizosaccharomyces pombe - ПРОДУЦЕНТ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C1. *
RU 2268304 С1, 20.01.2006 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2752896C1 (ru) * 2020-12-04 2021-08-11 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) Штамм дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующий L-молочную кислоту, содержащий в составе хромосомы гены трех различных гетерологичных лактатдегидрогеназ

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7326550B2 (en) Yeast strains for the production of lactic acid
US20070031950A1 (en) Production of D-lactic acid with yeast
CN101128581B (zh) 突变aox1启动子
Wang et al. High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica
JP5803106B2 (ja) Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびｄ−乳酸の製造方法
CN107815424B (zh) 一种产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用
WO2012169969A1 (en) Genetic manipulation and expression systems for pucciniomycotina and us tilaginom ycotina subphyla
JP5435657B2 (ja) 凝集性酵母、及びその作製法
CN110760453B (zh) 一种高产乙酸苯乙酯的基因工程酵母菌株及其构建方法和生产乙酸苯乙酯的方法
JP2010075171A (ja) キャンディダ・ユティリスによる高効率乳酸製造法
RU2539092C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Schizosaccharomyces pombe - ПРОДУЦЕНТ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ
RU2652877C9 (ru) Способ модификации дрожжей Schizosaccharomyces pombe с помощью Cre-lox системы бактериофага Р1, трансформант, полученный таким способом
RU2614233C1 (ru) Трансформант дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующий молочную кислоту (варианты), способ его получения (варианты), способ микробиологического синтеза молочной кислоты с использованием такого трансформанта
EP3228707A1 (en) Vector containing centromere dna sequence and use thereof
JP4806904B2 (ja) 乳酸生産方法
RU2650669C1 (ru) Штамм Schizosaccharomyces pombe - продуцент молочной кислоты
JP2008035732A (ja) 有機酸の製造方法
CN116064266A (zh) 盐胁迫抗性增强的重组酿酒酵母菌及其构建方法与应用
JP2007082490A (ja) 有機酸の抽出発酵による生産方法及び該生産方法に用いる有機酸生産酵母
Nguong et al. Characterising yeast isolates from Malaysia towards the development of alternative heterologous protein expression systems
JP2008301766A (ja) 乳酸製造用培地及び乳酸の製造方法
WO2010095751A1 (ja) キャンディダ・ユティリスによる高効率乳酸製造法
KR101686899B1 (ko) 신규한 클루이베로마이세스 막시아누스 mj1 및 이의 용도
EP3530739B1 (en) Expression system for productin of a heterologous protein, plasmid expression vectors, method of construction of a recombinant strain of psychrotolerant yeast debaryomyces macquariensis and method of protein production by the recombinant yeast strain
CN117467551A (zh) 一种高产l-苹果酸的耐酸酵母菌株及其构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PD4A Correction of name of patent owner