JP2010075171A - キャンディダ・ユティリスによる高効率乳酸製造法 - Google Patents

Abstract

【課題】乳酸を高い効率で製造する酵母菌株の提供。
【解決手段】乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードしている遺伝子の発現を可能にするプロモーター配列が機能的に結合した該遺伝子の少なくとも１コピーにより形質転換されてなる、キャンディダ・ユティリスの酵母菌株。
【選択図】なし

Description

発明の背景

技術分野
本発明は、クラブトゥリー陰性酵母であるキャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）を宿主とした乳酸の製造方法に関する。

背景技術
近年、環境問題への取り組みから、生分解性プラスチックへの関心が高まっている。生分解性プラスチックは資源を自然循環でき、自然に分解していく点から環境に対する負荷が少ない。代表的な生分解性プラスチックの原料であるポリ乳酸はＬ−乳酸を重合して製造するが、乳酸の光学純度が高いほど安定したポリ乳酸ができる。通常、乳酸はグルコース等の糖質を基質とした微生物の代謝産物として得られる。特に乳酸菌と呼ばれる一群の細菌類は乳酸を特異的に製造することが古くから知られており、ヨーグルト等の製造に関わっている。しかし、乳酸菌は発酵過程においてＬ−乳酸の他にＤ−乳酸も数％副生するので、製造した乳酸の光学純度が低下してしまう。

有用物質の製造には酵母がしばしば用いられている。酵母は一般に細菌よりも高い細胞密度で培養することができ、かつ連続培養も可能である。また、酵母は蛋白質を培地中に分泌し、分泌された蛋白質は糖鎖による修飾を受ける。このため、酵母による蛋白質の生産は、このような修飾が生物活性に重要である場合に有利である。

酵母のうち、今日まで最も良く研究され、遺伝学的知見が蓄積しているものにはサッカロマイセス属酵母があり、この酵母は種々の物質生産の宿主として検討がなされている。また、近年、サッカロマイセス属酵母以外の酵母としてピキア属酵母、ハンセヌラ属酵母、クルイベロマイセス属酵母、キャンディダ属酵母などのいくつかの種について、それらを形質転換する手法が開発され、有用物質生産の宿主として検討されている。このうち、キャンディダ属酵母は、特に、炭素資化域が広いなど、サッカロマイセス属酵母にない特性を有している。

キャンディダ属酵母の中でも、キャンディダ・ユティリスは、キシロースをはじめとするペントースに対する優れた資化性を示す。また、サッカロマイセス酵母と異なり、好気的条件下での培養でエタノールを製造せず、それによる増殖阻害も受けないことから、高密度での連続培養による効率的な菌体製造が可能である。従って、キャンディダ・ユティリスは、かつて蛋白質源として注目され、ペントースを多く含む広葉樹の糖化液や亜硫酸パルプ廃液を糖源とした菌体の工業生産が行われていた。また、この酵母はアメリカＦＤＡ（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）により、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・フラジリス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）とともに、食品添加物として安全に使用できる酵母として認められている。実際に、キャンディダ・ユティリスは、ドイツをはじめとして、アメリカや台湾、ブラジルなど世界各国で製造され、食飼料として使用されている。また、このような微生物蛋白質としての利用以外にも、キャンディダ・ユティリスは、ペントースやキシロースの発酵株、エチルアセテート、Ｌ−グルタミン、グルタチオン、インベルターゼ等の製造株として広く産業界で利用されてきた。

酵母を用いて乳酸を製造する試みとしては、乳酸製造能を持たない酵母に、外来の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を導入し乳酸を製造する技術が開発されている。このような遺伝子操作がなされた酵母は、グルコースからピルビン酸を経て、乳酸を製造することができる。酵母の中でも最も研究が進んでいるサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、ピルビン酸からアセトアルデヒドを経てエタノールを製造するアルコール発酵を行う能力が旺盛であるため、基質となるグルコースからの乳酸製造効率が低下してしまう。そこでアルコール発酵を抑制するために、サッカロマイセス・セレビシエの染色体中のピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を破壊することによって、その発現を抑制する試みがなされてきた（特許文献１：特表２００１−５１６５８４号公報；特許文献２：特表２００３−５０００６２号公報）。しかしながら、サッカロマイセス・セレビシエは高グルコース下でエタノール発酵依存的生育を行う性質（クラブトゥリー陽性効果）を持つため、ＰＤＣ遺伝子の破壊は乳酸製造に貢献したが、細胞増殖の抑制を同時に引き起こすという負の効果ももたらした。

一方、クラブトゥリー効果陰性酵母を用いた例としては、少なくともＰＤＣ遺伝子を破壊したクルイベロマイセス属酵母菌株を用いて乳酸を製造する試みがなされているが（特許文献１：特表２００１−５１６５８４号公報；特許文献３：特表２００５−５２８１０６号公報）、例えば攪拌タンク発酵槽での発酵時間が長い等の欠点があった。

また、クラブトゥリー効果陰性酵母であるキャンディダ属の組換え酵母を宿主とした乳酸の製造例として、キャンディダ・ソノレンシスを用いた報告例があるが（特許文献４：特開２００７−１１１０５４号公報；特許文献５：特表２００５−５１８１９７号公報）、乳酸製造効率は低率であり、製造される乳酸の濃度は低く、あるいは乳酸製造に長時間を要する。

さらに、このようなクラブトゥリー効果陰性の乳酸製造酵母を用いて、モラセスの主要構成糖であるスクロースを炭素源として含む培地において高い効率で乳酸を製造した例は報告されていない。

特表２００１−５１６５８４号公報 特表２００３−５０００６２号公報 特表２００５−５２８１０６号公報 特開２００７−１１１０５４号公報 特表２００５−５１８１９７号公報

本発明者らは、乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に備えるキャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）の酵母菌株を形質転換により作出し、それを培養することで、より効率的に乳酸を製造しうることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。

従って、本発明は、クラブトゥリー効果陰性酵母であるキャンディダ・ユティリスを用いて作出した、乳酸を高い効率で製造する酵母菌株、ならびに低コストで高収率な乳酸の製造方法を提供することを目的とする。

そして、本発明による酵母菌株は、乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードしている遺伝子の発現を可能にするプロモーター配列が機能的に結合した該遺伝子の少なくとも１コピーにより形質転換されてなる、キャンディダ・ユティリスの酵母菌株である。

さらに、本発明による乳酸製造法は、本発明による酵母菌株を培養することを含んでなる。

本発明によれば、乳酸製造能を備えた新規キャンディダ・ユティリス株が提供され、この酵母菌株を適切な条件で発酵に用いることにより、Ｌ−乳酸を短時間で効率的に製造することが可能となる。本発明によれば、クラブトゥリー効果陰性酵母であるキャンディダ・ユティリスを用いた乳酸製造法において、エタノールや各種有機酸といった副産物の生成を抑えつつ、乳酸製造の効率を大幅に向上させることができる。

発明の具体的説明

本発明において使用される酵母、キャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）は食飼料用に生産されていることから、この酵母については安全性が高いことが知られている。

本発明による酵母菌株は、このキャンディダ・ユティリスの菌株を、乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードしている遺伝子の発現を可能にするプロモーター配列が機能的に結合した該遺伝子の少なくとも１コピーにより形質転換して得られたものである。

さらに、キャンディダ・ユティリスは、サザンハイブリダイゼーション法を用いた解析により、ピルビン酸脱炭酸酵素の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を少なくとも１種類有していることが示唆された（ＣｕＰＤＣ１遺伝子）。ＣｕＰＤＣ１遺伝子を破壊すると、ピルビン酸がアセトアルデヒドに変換される反応が進まなくなるため、その後の代謝経路であるアルコール発酵は行われず、エタノールをほとんど製造しない。本発明において、乳酸製造酵母の宿主としてピルビン酸脱炭酸酵素の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を破壊した酵母を用いれば、エタノールという乳酸製造にとっての余剰物質が製造されず、高効率で乳酸を製造することが可能となる。

従って、本発明の好ましい実施態様によれば、ピルビン酸脱炭酸酵素の活性がないか、あるいは低下し、かつ乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に備える酵母菌株が提供される。この酵母菌株においては、ピルビン酸脱炭酸酵素の活性を有するポリペプチドをコードする内因性遺伝子が破壊されていることが好ましい。

さらに、前記乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ピルビン酸脱炭酸酵素の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のプロモーターの制御下で発現可能に備えられていることが好ましく、より好ましくは、酵母染色体上におけるピルビン酸脱炭酸酵素の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のプロモーターの制御下で発現可能に備えられている。

本発明の特に好ましい実施態様によれば、乳酸製造酵母であって、染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が破壊されると共に、破壊された該遺伝子のプロモーターの制御下で乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に備える酵母菌株が提供される。

これらのいずれかの実施態様の酵母菌株において、前記ピルビン酸脱炭酸酵素の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子はピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子１（ＣｕＰＤＣ１遺伝子）であることが好ましく、前記乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドはウシ由来であることが好ましい。

また、本発明による酵母菌株によって製造される乳酸は、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、およびＤＬ−乳酸のいずれであってもよいが、好ましくはＬ−乳酸とされる。

以下、本発明による酵母菌株について説明すると共に、この酵母を用いた乳酸製造方法について説明する。

乳酸製造に用いる酵母
本発明による酵母菌株は、外来の乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を有する形質転換酵母である。乳酸の製造に用いる酵母は、クラブトゥリー陰性酵母であるキャンディダ・ユティリスである。キャンディダ・ユティリスの菌株は当技術分野において公知の様々な株、例えば、ＮＢＲＣ０６２６株、ＮＢＲＣ０６３９株、ＮＢＲＣ０９８８株、ＮＢＲＣ１０８６株等であってよいが、好ましくはＮＢＲＣ０９８８株とされる。

ピルビン酸脱炭酸酵素
本発明による酵母菌株においては、ピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）活性がないか、または低下していることが好ましい。この酵素は、アルコール発酵経路においてピルビン酸をアセトアルデヒドに変換する酵素であり、アルコール発酵を行う酵母はピルビン酸脱炭酸酵素の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を染色体上に本来的に有している。サッカロマイセス・セレビシエにはピルビン酸脱炭酸酵素の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が３種類（ＳｃＰＤＣ１、ＳｃＰＤＣ５およびＳｃＰＤＣ６）存在し、これらはいわゆるオートレギュレーション機構により機能している。また、各遺伝子のヌクレオチドレベルでの相同性も７０％以上と高い。これらの遺伝子がコードするタンパク質はＮ末端側のＴＰＰ結合領域とＣ末端側のＰＤＣ活性領域から構成されている。ＰＤＣをコードする遺伝子は他の酵母でも存在しており、例えば、クルイベロマイセス・ラクティスのＫｌＰＤＣ１遺伝子はＳｃＰＤＣ１遺伝子との高い相同性を有する。一方、キャンディダ・ユティリスにはピルビン酸脱炭酸酵素の活性を有するポリペプチドをコードする１種類の遺伝子（ＣｕＰＤＣ１）が存在し、他にも同様の遺伝子が存在する可能性があるが、少なくともＣｕＰＤＣ１遺伝子を破壊することによりアルコール発酵はほぼ全く行われなくなる。

ここで「ＰＤＣ活性がないか、または低下している」とは、ＰＤＣ活性が全くないか、または野生型よりも低い活性の該酵素が生産されているか、あるいは該酵素の生産量が野生型よりも少ないことを意味する。ＰＤＣ活性がないか、または低下している酵母菌株は、人工的な操作により得られたものであっても、あるいはスクリーニングによって見出されたものであってもよい。このような酵素活性の消滅または低下のための人工的操作は、ＲＮＡｉを利用する方法、選択マーカーの全部または一部の配列などの他の遺伝子と入れ替える方法、無意味な配列を遺伝子内部に挿入する方法など、当技術分野において周知の方法で行うことができる。この中でも、当該酵素の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を破壊（ノックアウト）することが好ましく、このような方法として、上記の各手法のうち、選択マーカーの全部または一部の配列などの他の遺伝子とＰＤＣをコードする遺伝子とを入れ替える方法が挙げられる。

破壊対象のピルビン酸脱炭酸酵素の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子は、元々キャンディダ・ユティリスに存在するが、うち、本発明の実施例で記載されているのはＮＢＲＣ０９８８株に存在するＣｕＰＤＣ１遺伝子のアレルのうちの１つであり、そのヌクレオチド配列は配列番号６３で表され、コードされるアミノ酸配列は配列番号６４で表される。キャンディダ・ユティリスの他の株、例えばＮＢＲＣ０６２６株、ＮＢＲＣ０６３９株、ＮＢＲＣ１０８６株等を用いる場合には、仮に当該配列と相違していても、同等の機能、すなわち活性を有するものが存在していればそれを破壊対象とすることができる。

本発明の好ましい実施態様によれば、破壊対象となるピルビン酸脱炭酸酵素の活性を有するポリペプチドをコードする内因性遺伝子は、配列番号６４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子、より好ましくは配列番号６３で表されるヌクレオチド配列を含む遺伝子とされる。

乳酸脱水素酵素
本発明による酵母菌株は、乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子（ＬＤＨ遺伝子）を保持している。酵母は元来乳酸製造能を持たないので、本発明による酵母菌株が有する乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子（ＬＤＨ）は外来性である。ＬＤＨには、生物の種類に応じて、あるいは生体内においても各種同属体が存在し、本発明に使用するのはＬ−ＬＤＨであってもＤ−ＬＤＨであってもよいが、好ましくはＬ−ＬＤＨである。また、本発明において使用する乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子としては、天然由来のＬＤＨの他、化学合成的或いは遺伝子工学的な手法により人工合成されたＬＤＨも包含している。ＬＤＨをもつ生物としては、乳酸菌等の原核生物、カビ等の真核生物、植物や動物並びに昆虫等の高等真核生物などが挙げられる。本発明において使用するＬＤＨとして好ましいのは高等真核生物由来であり、特にウシ由来のものが適している。ウシ由来の乳酸脱水素酵素（Ｌ−ＬＤＨ）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号３８で表されるものであり、これによりコードされるアミノ酸配列は配列番号３５で表される。

本発明の好ましい実施態様によれば、乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドは、配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドとされる。また、乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドは、配列番号３７で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドであってもよい。

ここで、アミノ酸の欠失、置換、付加、又は挿入は、上記ポリペプチドをコードする遺伝子を、当技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法又はＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（タカラバイオ社）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（タカラバイオ社）などを用いて、あるいは、タカラバイオ社のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキット、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）などを用いて変異を導入することができる。乳酸脱水素酵素の活性は、当技術分野において公知の手法により確認することができる。

さらに、宿主に導入する乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号３５に記載したウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）由来の酵素のアミノ酸配列（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＡＡＩ４６２１１．１）に対応するヌクレオチド配列をキャンディダ・ユティリスのコドン使用頻度を考慮して人工的に合成したものが好ましい。このような人工的な合成は当業者であれば適切に行うことができるが、特に好ましいヌクレオチド配列は、配列番号３６のうち、１３番目のaから１，０１１番目のaまでのヌクレオチド配列である。なお、その前後の配列は、制限酵素認識部位である、それぞれＫｐｎＩ認識部位（配列番号３６のヌクレオチド配列において１番目のgから６番目のcまでの配列）、Ｘｂａ I認識部位（配列番号３６のヌクレオチド配列において７番目のｔから１２番目のaまでの配列）、ＢａｍＨＩ認識部位（配列番号３６のヌクレオチド配列において１，０１５番目のgから１，０２０番目のcまでの配列）、およびＳａｃＩ認識部位（配列番号３６のヌクレオチド配列において１，０２１番目のgから１，０２５番目のcまでの配列）である。この配列番号３６のうち、１３番目のaから１，０１１番目のa（２つの翻訳終了コドンのうち、上流域のｔｇa）までのヌクレオチド配列（コドン最適化配列：配列番号３６）と配列番号３８で表されるヌクレオチド配列（ウシ由来の野生型配列）のアライメントを図１に示す。両者の配列は９９９塩基中７５１塩基が等しく、相同性は７５%であった。図１において、上側の配列は、配列番号３６のうち、１３番目のaから１，０１１番目のa（２つの翻訳終了コドンのうち、上流域のｔｇa）までのヌクレオチド配列である。図１の下側の配列は配列番号３８で表されるＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ由来のＬ−ＬＤＨ−Ａ遺伝子の塩基配列（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＢＣ１４６２１０．１より抜粋）である（翻訳産物は配列番号３５となる）。このように人工的に合成された当該乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子は、キャンディダ・ユティリスにおけるコドン使用頻度が最適化されているため、酵母に形質転換されると特にＬ−乳酸を高効率で製造することができる。

本発明の好ましい実施態様によれば、乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードしている遺伝子は、配列番号３６のうち、１３番目のaから１，０１１番目のaまでのヌクレオチド配列を含む遺伝子、またはその同等物とされる。この同等物は、配列番号３６のうち、１３番目のaから１，０１１番目のaまでのヌクレオチド配列を含む遺伝子と同等の機能を有することを条件に、一部のヌクレオチド残基が異なる遺伝子を意味する。このような同等物としては、配列番号３６のうち、１３番目のaから１，０１１番目のaまでのヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性があり、かつ乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子が挙げられる。前記同等物としてはさらに、配列番号３６のうち、１３番目のaから１，０１１番目のaまでのヌクレオチド配列もしくはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子が挙げられる。前記同等物としてはさらに、配列番号３６のうち、１３番目のaから１，０１１番目のaまでのヌクレオチド配列において１もしくは数個のヌクレオチド残基が欠失、置換、付加、または挿入された配列を含み、かつ乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子が挙げられる。本発明の特に好ましい実施態様によれば、乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードしている遺伝子は、配列番号３６のうち、１３番目のaから１，０１１番目のaまでのヌクレオチド配列を含む遺伝子とされる。

ここで、ヌクレオチド残基の欠失、置換、付加、又は挿入は、上記配列を含む遺伝子を、当技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法又はＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キットを用いればよい。例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（タカラバイオ社）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（タカラバイオ社）などを用いて、あるいは、タカラバイオ社のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキット、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）などを用いて変異を導入することができる。乳酸脱水素酵素の活性は、当技術分野において公知の手法により確認することができる。

相同性を示す数値（％）は、塩基配列比較用プログラム：例えばＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ７．０．０を用いて、デフォルト（初期設定）のパラメーターにより算出されるものである。すなわち、酵母染色体上の各遺伝子が、同一ではないが同等の機能、すなわち各活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子によって相同組換え等を介して置換されていてもよい。乳酸脱水素酵素の活性は、当技術分野において公知の手法により確認することができる。

ストリンジェントな条件とは、例えば、Ｒａｐｉｄ−Ｈｙｂ Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用い、温度条件を好ましくは４０〜７０℃、より好ましくは６０℃として、その他は添付のプロトコールに従って行うハイブリダイゼーション条件である。その後、例えば当業者の一般的な方法を用い、２×ＳＳＣと０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳから成り立つ溶液での５分間の洗浄、続いて１×ＳＳＣと０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳから成り立つ溶液での１０分間の洗浄、さらに０．１×ＳＳＣと０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳから成り立つ溶液での１０分間の洗浄を行うことを指す。ただしハイブリダイゼーション時の温度条件や、その後のメンブレンの洗浄に用いる溶液の塩濃度等の条件を適宜設定することにより、ある一定（７０％、８０％、８５％、９０％、９５％のいずれか）以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡをクローニングできる。そのようにして得られる遺伝子が、配列上は同一ではないが同等の機能、すなわち各活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子によって相同組換え等を介して置換されていてもよい。乳酸脱水素酵素の活性は、当技術分野において公知の手法により確認することができる。

構造遺伝子の発現のために利用するプロモーター
乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子は、強力なプロモーター活性を有するプロモーターの制御下で発現可能に備えられていることが好ましい。例えば、キャンディダ・ユティリスでは、キャンディダ・ユティリスのグリセロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードするＧＡＰ遺伝子のプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼの活性を有するポリペプチドをコードするＰＧＫ遺伝子のプロモーター、原形質膜プロトンＡＴＰａｓｅの活性を有するポリペプチドをコードするＰＭＡ遺伝子のプロモーター（以上、特開２００３−１４４１８５号公報）等が例示されるが、さらに好ましくはピルビン酸脱炭酸酵素の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子１（ＣｕＰＤＣ１遺伝子）のプロモーターである。うち、本発明の実施例で記載されているのはキャンディダ・ユティリスＮＢＲＣ０９８８株に存在するもの（配列番号３）である。キャンディダ・ユティリスの他の株、例えばＮＢＲＣ０６２６株、ＮＢＲＣ０６３９株、ＮＢＲＣ１０８６株等を用いる場合には、仮に当該配列と相違していても同等の機能、すなわち活性を有するもの（他株配列）が存在していればそのまま使用することができる。当該他株配列は、当業者であれば公知の方法により確認することができる。

乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子は、酵母染色体上のＣｕＰＤＣ１遺伝子プロモーターの制御下で発現可能に備えられていることが好ましい。本発明による酵母菌株の宿主として用いるキャンディダ・ユティリスは少なくとも１種類のＰＤＣ遺伝子を有していると推定される（ＣｕＰＤＣ１遺伝子）。このＣｕＰＤＣ１遺伝子プロモーターによって制御されるＣｕＰＤＣ１遺伝子が破壊されて乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が代わりに発現されることで、効果的にピルビン酸脱炭酸酵素活性の低下と乳酸脱水素酵素活性の発現とを同時に実現できる。

本発明の好ましい実施態様によれば、前記プロモーター配列は、ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする内因性遺伝子のプロモーター部分とされ、より好ましくは配列番号３で表されるヌクレオチド配列を含むものとされる。あるいは、このプロモーター配列は、配列番号３で表されるヌクレオチド配列を含むものと同等の機能を有することを条件に、一部のヌクレオチド残基が異なる同等物であってもよい。このような同等物としては、配列番号３で表されるヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性があり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡが挙げられる。前記同等物としてはさらに、配列番号３で表されるヌクレオチド配列もしくはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有するＤＮＡが挙げられる。前記同等物としてはさらに、配列番号３で表されるヌクレオチド配列において１もしくは数個のヌクレオチド残基が欠失、置換、付加、または挿入された配列を含み、かつプロモーター活性を有するＤＮＡが挙げられる。

ここで、ヌクレオチド残基の欠失、置換、付加、又は挿入は、上記配列を、当技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法又はＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（タカラバイオ社）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（タカラバイオ社）などを用いて、あるいは、タカラバイオ社のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキット、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）などを用いて変異を導入することができる。プロモーター活性、すなわち転写活性は、当技術分野において公知の手法により確認することができる。

相同性を示す数値（％）は、塩基配列比較用プログラム：例えばＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ７．０．０を用いて、デフォルト（初期設定）のパラメーターにより算出されるものである。すなわち、酵母染色体上の各遺伝子が、同一ではないが同等の機能、すなわち各活性を有する遺伝子によって相同組換え等を介して置換されていてもよい。プロモーター活性、すなわち転写活性は、当技術分野において公知の手法により確認することができる。

ストリンジェントな条件とは、例えば、Ｒａｐｉｄ−Ｈｙｂ Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用い、温度条件を好ましくは４０〜７０℃、より好ましくは６０℃として、その他は添付のプロトコールに従って行うハイブリダイゼーション条件である。その後、例えば当業者の一般的な方法を用い、２×ＳＳＣと０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳから成り立つ溶液での５分間の洗浄、続いて１×ＳＳＣと０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳから成り立つ溶液での１０分間の洗浄、さらに０．１×ＳＳＣと０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳから成り立つ溶液での１０分間の洗浄を行うことを指す。ただしハイブリダイゼーション時の温度条件や、その後のメンブレンの洗浄に用いる溶液の塩濃度等の条件を適宜設定することにより、ある一定（７０％、８０％、８５％、９０％、９５％のいずれか）以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡをクローニングできる。そのようにして得られる遺伝子が、配列上は同一ではないが同等の機能、すなわち各活性を有する遺伝子によって相同組換え等を介して置換されていてもよい。プロモーター活性、すなわち転写活性は、当技術分野において公知の手法により確認することができる。

酵母菌株の分子育種
本発明による酵母菌株の分子育種は、宿主酵母に対して乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能な状態で導入することによって行うことができる。その際に、宿主酵母に対してＰＤＣをコードする遺伝子の破壊を伴っていることが好ましい。ＰＤＣ破壊のためのＤＮＡ構築物は、特定の遺伝子部位に導入して遺伝子を破壊するための相同組換え用遺伝子配列を備えている。ここでいう相同組換え用遺伝子配列とは、破壊しようとするＰＤＣ遺伝子であるターゲット部位、或いはその近傍の遺伝子と相同な遺伝子配列である。例えば、２種類の相同組換え用遺伝子配列を、染色体上のターゲット遺伝子の上流側と下流側の遺伝子とのそれぞれに相同な遺伝子配列とし、これらの相同組換え用遺伝子配列の間に遺伝子を破壊するための遺伝子を備えるＤＮＡ断片を酵母染色体に相同組換えにより導入することでターゲット部位の遺伝子を破壊することができる。このような染色体上への組込みを実現するための相同組換え用遺伝子配列の選択は、当業者において周知であり、当業者であれば必要に応じて適切な相同組換え用遺伝子配列を選択して相同組換え用ＤＮＡ断片を構成することができる。

本発明の好ましい実施態様によれば、ピルビン酸脱炭酸酵素の活性を有するポリペプチドをコードしている内因性遺伝子は、選択マーカー配列の挿入による該遺伝子の欠失によって破壊される。例えば、上記の相同組換えにおいてＰＤＣ遺伝子の代わりに挿入されるヌクレオチド配列中に選択マーカー配列を組込んでおくことにより、ＰＤＣ遺伝子を破壊することができる。選択マーカーは、形質転換された菌体を選択する上で有用である。選択マーカー配列の挿入は、その配列全体を導入することだけでなく、一部の配列を導入することにより、この部分配列と酵母菌に元々存在する配列とを組み合わせて選択マーカー配列を完成させることをも含む。例えば、元々存在する選択マーカー配列の一部が欠落する酵母菌株を形質転換の宿主とする場合には、その欠落した一部の配列を選択マーカー配列として導入することによって、相同組換えを伴う任意の遺伝子破壊を実施することができる。または、ハイグロマイシンやジェネティシン（以下、Ｇ４１８とも表記する）などの薬剤に感受性の場合、これらの薬剤に対して耐性能を付与するための遺伝子を導入することによって、相同組換えを伴う任意の遺伝子の破壊を実施することができる。よって、本発明の一つの実施態様によれば、前述のハイグロマイシンＢおよびＧ４１８に感受性の酵母菌株を宿主として、当該菌株に元々は存在しない薬剤耐性能を付与する遺伝子を用いて、当該菌株のＰＤＣ遺伝子を破壊するものとする。選択マーカーの具体例としては、特開２００３−１４４１８５号公報において当該菌種で利用可能であることが示されたハイグロマイシンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＰＴ遺伝子、ハイグロマイシンＢに対する耐性能を付与する遺伝子）およびアミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ（ＡＰＴ遺伝子、Ｇ４１８に対する耐性能を付与する遺伝子）が挙げられる。

乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードしている遺伝子が酵母ゲノムに組込まれる染色体上の位置は特に制限されるものではないが、ピルビン酸脱炭酸酵素の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子座とすることが有利である。これにより、乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードしている遺伝子を、ＰＤＣ遺伝子の全長プロモーターの制御下におくことができ、よって、高い発現効率を得ることができる。

本発明の一つの実施態様によれば、本発明による酵母菌株は、プロモーター配列および該プロモーター配列の制御下にある乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列を含有する発現ベクターによって形質転換されたものとされる。また、このような発現ベクターは、本発明の一つの態様をなす。

キャンディダ・ユティリスは、その倍数性が高く、胞子を形成しない。倍数性の高い株の遺伝子に変異を導入しようとする場合、１倍体の株に比べて、その変異を重度に加える必要があるが、その際に、変異を与えたい遺伝子ではない遺伝子にも変異が加えられる可能性が高まると考えられる。従って、キャンディダ・ユティリスの遺伝子に変異を導入する場合には、標的とする遺伝子のみに効率よく多重に変異を加えることができる技術を用いることが好ましい。

キャンディダ・ユティリスの形質転換法としては、特開２００３−１４４１８５号公報に記載の技術が挙げられる。この文献では、利用可能なベクターとして、キャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡと相同な配列と、選択マーカー遺伝子とを含んでなり、相同組換えによって異種遺伝子をキャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡに組込むことができるもの、あるいは、キャンディダ・ユティリスで自律複製機能を有するＤＮＡ配列と、選択マーカー遺伝子とを含んでなり、高い頻度でキャンディダ・ユティリスを形質転換できるものが開発されている。

キャンディダ・ユティリスの形質転換系で利用可能な選択マーカー遺伝子は、キャンディダ・ユティリスで機能し得る薬剤耐性マーカー、好ましくはシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子、ジェネティシン（Ｇ４１８）耐性を付与する遺伝子、またはハイグロマイシンＢ耐性を付与する遺伝子などがある。ジェネティシン（Ｇ４１８）耐性を付与する遺伝子、またはハイグロマイシンＢ耐性を付与する遺伝子は、野生の酵母には存在しない配列であるため、標的の遺伝子座に組込まれる確率が高いと考えられている。また、他の種の酵母では、その宿主の形質に与える影響も小さいと考えられている（Ｂａｇａｎｚ Ｆら，１３（１６）：１５６３−７３．，１９９７）（Ｃｏｒｄｅｒｏ Ｏｔｅｒｏ Ｒら，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，４６（２）：１４３−８．，１９９６）。これらの特徴を有する当該遺伝子は、キャンディダ・ユティリスの育種においても有益であると考えられる。

他の形質転換系として、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ−ｌｏｘＰ系が挙げられる。これは、２つの３４ｂｐのｌｏｘＰ配列間での部位特異的組換えシステムであり、この組換えはＣｒｅ遺伝子がコードするＣｒｅ組換え酵素によって触媒される。このシステムは、サッカロマイセス・セレビシエなどの酵母細胞においても機能することが報告されており、２つのｌｏｘＰ配列の間に配置された選択マーカー遺伝子は、ｌｏｘＰ配列間の組換えによって除去されることが知られている（Ｇｕｌｄｅｎｅｒ，Ｕ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２４，２５１９−２４．，１９９６）。このシステムはクルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）など、キャンディダ・ユティリス以外の複数の酵母種で利用されている（Ｓｔｅｅｎｓｍａ，Ｈ．Ｙ．ら，Ｙｅａｓｔ，１８，４６９−７２．，２００１）。

乳酸の製造方法
本発明による酵母菌株を適当な炭素源の存在下で培養することにより、培養物中に乳酸脱水素酵素の発酵産物である乳酸を製造することができる。本発明による乳酸製造法によれば、培養系から乳酸を分離する工程を実施することにより、乳酸を得ることが出来る。なお、本発明において培養物とは、培養上清の他、培養細胞あるいは菌体、細胞もしくは菌体の破砕物を包含している。

本発明による酵母菌株の培養にあたっては、酵母の種類に応じて培養方法や培養条件を選択することができる。例えば、試験管、フラスコあるいはジャーファーメンターを用いた液体培養法を挙げることができ、回分培養、半回分培養などの培養形式を採用できる。試験管やフラスコでの培養では振幅３５ｍｍの条件が好適であり、このような培養は、ＴＡＩＴＥＣ社製卓上培養装置により行うことができる。

本発明による乳酸製造法において、培地の組成は、酵母が生育し、且つ乳酸を製造できる各種栄養素を含む組成であれば特に限定されない。培地に含まれる資化炭素源としては、例えば、グルコースのほかにもキシロースやスクロースでも資化できれば用いることができる。本発明の好ましい実施態様によれば、炭素源としてはグルコースまたはスクロースが用いられ、より好ましくはグルコースが用いられる。

また、培地に含まれる栄養源としては、例えば、酵母エキス、ペプトン、ホエーなどが用いられるが、ＹＰ（１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌペプトン）に上記の資化炭素源を加えた培地、例えばＹＰＤ（２０ｇ／Ｌグルコース、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌペプトン）、ＹＰＸ（２０ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌペプトン）、ＹＰＳｕｃ１０培地（１００ｇ／Ｌスクロース、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌペプトン）等の培地で、さらに適宜ｐＨ調整されたものが便利である。

なお、安価で精製工程に負担がかからない培地にするには、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩などの無機態窒素や尿素の方が好ましい。また、無機物栄養源としては、例えば、リン酸カリウム、硫酸マグネシウムやＦｅ（鉄）、Ｍｎ（マンガン）化合物なども使用される。さらに、培地には、ｐＨ調整剤が含まれていてもよい。

発酵温度は、用いる乳酸製造酵母の生育可能な範囲で選択することができる。発酵温度は、例えば、約１５℃〜４５℃とすることができ、より好ましくは２５〜４０℃、さらに好ましくは２７〜４０℃、最も好ましくは３５℃とする。また、発酵過程における培地のｐＨは３〜８に保持することが好ましく、より好ましくはｐＨ４〜７、最も好ましくはｐＨ６であり、必要に応じて発酵産物である乳酸等の中和を行うことができる。用いる中和剤としては、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が挙げられるが、好ましくは炭酸カルシウムである。

乳酸製造に要する反応時間は特に限定されず、本発明の効果が認められる限り任意の反応時間で実施される。これらの条件の最適化は、当業者であれば容易に行うことができる。

乳酸製造にあたり、まず酵母を増殖させる場合には、前々培養、前培養を行い、その後に発酵培養による乳酸製造を行うことが好ましい。

前々培養の条件としては、３０℃で１〜３日間ＹＰＤ寒天培地上で生育させた菌体を、滅菌された爪楊枝で一掻きして取得する。これを１５ｍＬのチューブに加えられた３〜５ｍＬのＹＰＤ液体培地を用い、１２０〜１５０ｒｐｍの振とう条件下で培養することが好ましい。

前培養の条件としては、培地として５０ｍＬ〜１００ｍＬのＹＰＤ液体培地、ＹＰＸ１０液体培地（１００ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌペプトン）またはＹＰＳｕｃ１０液体培地（１００ｇ／Ｌスクロース、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌペプトン）を用い、前々培養の菌体を、ＯＤ６００が約０．１になるよう新たな培地に接種したうえで１２０〜１５０ｒｐｍ、３０℃で通常１６〜３０時間培養し、ＯＤ６００が１０〜２５を示す対数増殖期または定常期まで培養することが好ましい。

発酵培養の条件としては、培地として、グルコース、キシロースまたはスクロースを９５〜１１５ｇ／Ｌ（好ましくは１００〜１１５ｇ／Ｌ）の濃度で含み、且つ、中和剤として炭酸カルシウムを３〜５％含む培地、例えば、炭酸カルシウムを３〜５％含むＹＰＤ１０培地（１００ｇ／Ｌグルコース、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌペプトン）、ＹＰＸ１０培地（１００ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌペプトン）またはＹＰＳｕｃ１０培地（１００ｇ／Ｌスクロース、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌペプトン）を用い、７０〜１５０ｒｐｍ、１５〜４５℃、１０〜４０ｍＬの液量の通気条件下で培養することが好ましい。より好ましくは８０〜１００ｒｐｍ、２５〜４０℃、１０〜２０ｍＬ、さらに好ましくは８０ｒｐｍ、２７〜４０℃、１０〜１５ｍＬである。なお発酵にはバッフル付の１００ｍＬ三角フラスコを用い、これに１０〜４０ｍＬの培地および菌体を加えることが好ましい。特にこの段階では、初期の菌体量としてＯＤ６００を１〜３０（好ましくは１〜２０）に調整することが、より短時間で効率良く乳酸を製造できる点で好ましく、より好ましくはＯＤ６００を５〜２５、さらに好ましくは５〜１５とし、最も好ましくはＯＤ６００を約１０とする。

５００ｍＬ以上の培地スケールでの乳酸製造では、酵母を増殖させる場合に、液体培地で前前々培養、前々培養、前培養を行い、その後に発酵培養による乳酸製造を行うことが好ましい。当該規模での試験ではジャーファーメンターを用いることが好ましい。

前前々培養での条件としては、３０℃で１〜３日間ＹＰＤ寒天培地上で生育させた菌体を、滅菌された爪楊枝で一掻きして取得する。これを１５ｍＬのチューブに加えられた３〜５ｍＬのＹＰＤ液体培地を用い、１２０〜１５０ｒｐｍ、３０℃で通常６〜３０時間、振とう条件下で培養することが好ましい。

前前培養での条件としては、培地として５０ｍＬ〜１００ｍＬのＹＰＤ液体培地を用い、前前々培養の菌体を、ＯＤ６００が約０．１になるよう新たな培地に接種したうえで１２０〜１５０ｒｐｍ、３０℃で通常１０〜３０時間培養し、ＯＤ６００が１０〜２５を示す対数増殖期または定常期まで培養することが好ましい。当該培養では坂口フラスコを用いることが好ましい。

前培養での条件としては、温度、通気量や撹拌速度などが調整できるジャーファーメンターを用いることが好ましい。培地として５００ｍＬ〜２．５ＬのＹＰＤ液体培地を用い、前々培養液を２０〜１００ｍＬ添加して、ＯＤ６００が約０．１になるよう新たな培地に接種したうえで、撹拌速度を３００〜４００ｒｐｍ、温度を３０℃、通気量を１．２５ｖｖｍにして通常１０〜３０時間培養し、ＯＤ６００が１０〜２５を示す対数増殖期または定常期まで培養することが好ましい。

発酵培養での条件としては、温度、通気量、撹拌速度、ｐＨ制御などが調整できるジャーファーメンターを用いることが好ましい。培地としてグルコースまたはスクロースを５０〜２２０ｇ／Ｌ、好ましくは１００〜１１５ｇ／Ｌの濃度で含み且つ中和剤として炭酸カルシウム培地を３〜５％含むＹＰＤ１０培地（１００ｇ／Ｌグルコース、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌペプトン）またはＹＰＳｕｃ１０培地（１００ｇ／Ｌスクロース、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌペプトン）、あるいはｐＨを水酸化ナトリウムあるいは水酸化カリウムなどの中和剤で発酵に適したｐＨに保たれた状態のＹＰＤ１０培地またはＹＰＳｕｃ１０培地、撹拌速度を１００〜３００ｒｐｍ、１５〜４５℃、５００ｍＬ〜２．５Ｌの液量の条件下で培養することが好ましい。より好ましくは２００〜２５０ｒｐｍ、２７〜３７℃、１．５〜２Ｌである。特にこの段階では、初期の菌体量としてＯＤ６００を１〜３０（好ましくは１〜２０）に調整することが、より短時間で効率良く乳酸を製造できる点で好ましく、より好ましくはＯＤ６００を５〜１５とし、最も好ましくはＯＤ６００を約１０とする。

ここでいう発酵時の通気条件としては、好気条件、特に微好気の条件が好ましい。通常２４〜４８時間培養することで目的とする乳酸が高効率で製造される。

本発明による乳酸製造法においては、このようにして製造した乳酸成分を培地から分離・回収するが、その分離・回収方法は特に限定されない。本発明による乳酸製造法では、例えば、乳酸成分の分離濃縮手段として従来の乳酸発酵による製造プロセスで用いられる公知の方法を用いることができる。そのような公知の方法としては、例えば、１）石灰乳を加えて中和することからなる乳酸カルシウム再結晶法、２）エーテルなどの溶媒を用いる有機溶媒抽出法、３）精製乳酸をアルコールでエステル化するエステル化分離法、４）イオン交換樹脂を用いるクロマトグラフィ分離法、５）イオン交換膜を用いる電気透析法などが挙げられる。従って、本発明による乳酸の製造方法により得られる乳酸成分は、遊離型の乳酸のみならず、ナトリウム、カリウムなどの塩や、メチルエステル、エチルエステルなどのエステルの形態であってもよい。

本発明による乳酸製造法によれば、乳酸製造能を有する酵母キャンディダ・ユティリスにおける乳酸製造能を向上させることができ、その結果、短時間に高収率で乳酸を製造することができる。本発明による乳酸製造法は、使用する培地の組成にかかわらず、乳酸製造能を有する酵母における乳酸製造能を向上させることができる。従って、本発明による乳酸製造法によれば、比較的安価な合成培地等の貧栄養な培地であっても乳酸製造能の向上を達成することができ、乳酸製造のコストを低減することができる。

特に、本発明による乳酸製造法によれば、乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を導入した酵母等に代表されるエタノール生産能を併せ持つ微生物を用いた場合、エタノール製造を抑止し、且つ高収率で乳酸を製造することができる。また、エタノール以外の副産物であるＤ−乳酸等の各種有機酸の製造も抑えることによって、培地に含まれる乳酸をより簡易に回収することができる。言い換えれば、乳酸の回収及び精製に要する工程を簡略化することができ、乳酸製造に要するコストを抑制することができる。このような副産物は公知の手法に従い分析し評価することができる。例えば、エタノールはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）あるいは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、アセトアルデヒドなどの各種香気成分はＧＣにより、ピルビン酸などの各種有機酸はＨＰＬＣにより、それぞれ分析し、評価することができる。また、グルコースの定量はＨＰＬＣあるいはバイオケミストリーアナライザー（以下、ＢＡ）（ワイエスアイジャパン社）、Ｌ−乳酸はＨＰＬＣあるいはＢＡ、Ｄ−乳酸はＨＰＬＣあるいはＬ−乳酸と合わせてＦ−キットＤ−乳酸／Ｌ−乳酸（Ｊ．Ｋ．インターナショナル社）を用いて、それぞれ分析し、評価することができる。各種分析に供する試料は、例えば、０．２２μｍのフィルターで濾過することにより、例えばカラムを詰まらせるなど、分析に悪影響を及ぼしうる夾雑物を除去することが好ましい。

なお、培養液中のピルビン酸およびクエン酸、リンゴ酸、コハク酸等の各種有機酸は、ＨＰＬＣによる有機酸分析（電気伝導度による検出）により測定した。また、エタノール等、その他の物質の測定法は、以下の実施例に記載した。

本明細書においては、さらに、ピルビン酸脱炭酸酵素の活性を有するポリペプチドをコードしている内因性遺伝子が破壊されているキャンディダ・ユティリスの酵母菌株であって、乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードしている遺伝子が導入されていない酵母菌株を培養することにより、ピルビン酸が大量に生産されることが見出されている。

従って、本発明の他の態様によれば、ピルビン酸脱炭酸酵素の活性を有するポリペプチドをコードしている内因性遺伝子が破壊されているキャンディダ・ユティリスの酵母菌株が提供され、さらには、該酵母菌株を培養することを含んでなる、ピルビン酸を製造する方法が提供される。ピルビン酸は反応性が高く、医薬、農薬等の合成の基質などに用いられるため、ファインケミカル分野においては重要な中間物質とされている。

キャンディダ・ユティリスの酵母菌株におけるピルビン酸脱炭酸酵素の活性を有するポリペプチドをコードしている内因性遺伝子およびその破壊の詳細は、上述したとおりである。ピルビン酸の精製方法としては、有機化合物の精製方法として知られるいかなる方法を用いてもよく、例えば、特開２００７−１６９２４４号公報などに記載されている蒸留による方法を用いることができる。蒸留は、例えば、１回目の蒸留として７０〜８０℃の減圧条件または真空条件下において、２回目の蒸留として９０〜１００℃の減圧条件または真空条件下において行うことができる。蒸留により得られたピルビン酸は、さらに活性炭による処理、脱水、脱酢酸等の処理を適宜行うことにより、乳酸等の製造物から分離し、回収することができる。このようにして精製されたピルビン酸は、上述の通り、ファインケミカル分野において利用することができる。

以下に本発明の具体例を記載するが、これにより本発明の技術的範囲につき何等制約を受けるものではない。

ＰＣＲによる遺伝子増幅には、特に述べない限りＴａＫａＲａ社製Ｅｘ ＴａｑあるいはＴｏｙｏｂｏ社製ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を使用し、方法は添付のプロトコールに従った。ＰＣＲ増幅反応は９４℃で1分間の熱処理を行った後、変性工程：９４℃で３０秒、アニーリング工程：Ｘ℃で３０秒（Ｘ℃はプライマーのＴｍ値である。ただし特記しない限り５５℃とした。）、伸長工程：７２℃でＹ秒（ただし、Ｙ秒は予想される増幅産物の大きさから１ｋｂｐ（ｋｉｌｏ ｂａｓｅ ｐａｉｒ）につき約６０秒として計算）の３工程を３０サイクル繰り返し、最後に４℃とした。ＰＣＲ増幅装置はＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用した。酵母からのゲノムＤＮＡの抽出には、ＴａＫａＲａ社製Ｇｅｎとるくん、もしくは酢酸カリウム法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６５、４０４，１９８０）を用いた。ＤＮＡの脱リン酸化反応にはＴａＫａＲａ社製Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ． ｃｏｌｉ Ｃ７５)またはＴａＫａＲａ社製Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｓｈｒｉｍｐ)を使用し、ライゲーション反応にはＴａＫａＲａ社製Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２を使用し、方法は添付のプロトコールに従った。大腸菌の形質転換にはＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社）のコンピテントセルを使用し、方法は添付のプロトコールに従った。大腸菌の形質転換体の選抜には、プラスミドに含まれる薬剤耐性マーカー遺伝子に応じて、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢプレート（ＬＢ＋ａｍｐプレート）またはカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢプレートを用い、必要に応じて２０μｇ／ｍＬＸ−ｇａｌ及び０．１ｍＭＩＰＴＧによる青白選択を行った。大腸菌からのプラスミドＤＮＡの回収にはＱＩＡＧＥＮ社製ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用し、方法は添付のプロトコールに従った。サッカロマイセス・セレビシエの形質転換はリチウム法（Ｉｔｏら、 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３、１６３，１９８３）により行った。キャンディダ・ユティリスの形質転換は特開２００３−１４４１８５号公報に記載された方法を一部改変して行った。塩基配列の決定は以下の方法で行った。アプライドバイオシステムズ社製ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１を用いてＰＣＲを行い、方法は添付のプロトコールに従った。未反応ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒの除去にはＣＥＮＴＲＩ−ＳＥＰ ＣＯＬＵＭＮＳ（ＰＲＩＮＣＥＴＯＮ ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ）を用い、方法は添付のプロトコールに従った。塩基配列の決定には、アプライドバイオシステムズ社製３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用し、方法は添付のプロトコールに従った。なお、配列表に記載されている縮重プライマーの表記については、「Ｗ」が「Ａ（アデニン）」と「Ｔ（チミン）」から、「Ｒ」は「Ａ（アデニン）」と「Ｇ（グアニン）」、「Ｙ」は「Ｃ（シトシン）」と「Ｔ（チミン）」、「Ｍ」は「Ａ（アデニン）」と「Ｃ（シトシン）」からの混合物より、それぞれ成り立つことを示す。なお、表中の乳酸製造量等の各種数値は、平均値±標準誤差で示した。

電気パルスによるキャンディダ・ユティリス株の形質転換は特開２００３−１４４１８５号公報に記載された方法を一部改変して行った。ＹＰＤプレート上のコロニーを、５ｍｌのＹＰＤ液体培地において、３０℃で約８時間振盪培養した後、２００ｍｌのＹＰＤ液体培地にＯＤ６００が０．００２４になるよう植菌して３０℃で振盪培養する。約１６時間後、対数増殖期（ＯＤ６００＝２．５）にまで菌体が増殖した後、１，４００×ｇで５分間の遠心分離により集菌する。菌体は１００ｍｌの氷冷した滅菌水で１回、続いて４０ｍｌの氷冷した滅菌水で１回洗浄した後、氷冷した１Ｍソルビトール４０ｍｌで１回洗浄する。菌体を１０ｍｌの１Ｍソルビトールに懸濁した後、滅菌ポリプロピレンチューブに移し、再度１，１００×ｇで５分間の遠心分離により集菌する。上清を除いた後、最終菌体液量が２．５ｍｌになるよう、氷冷した１Ｍソルビトールに懸濁する。

電気パルスによる形質転換実験はバイオラッド社のジーンパルサーを用いて行なう。５０μｌの菌液と、１００ｎｇ〜１０μｇのＤＮＡを含む５μｌのＤＮＡ試料、および２．０ｍｇ／ｍｌのサケ精巣由来のキャリアーＤＮＡを５μｌ混合した後、０．２ｃｍのディスポーザブルキュベットに入れ、適当な条件の電気パルスを加える。例えば、本発明の好ましい態様によれば、電気容量が２５μＦ、抵抗値が６００〜１０００オーム、電圧が０．７５〜５ＫＶ／ｃｍの条件とする。パルス後、１ｍｌの氷冷した１Ｍソルビトールを含むＹＰＤ培地を加え、滅菌ポリプロピレンチューブに移した後、３０℃で約６〜１５時間振盪培養する。培養後、選択マーカー遺伝子に応じて、菌液を適切な薬剤を含むＹＰＤ選択培地に塗布した後、プレートを２８〜３０℃で３〜４日保温して、形質転換体コロニーを得た。ＨＰＴ遺伝子を選択マーカー遺伝子とする場合にはハイグロマイシンＢを６００〜８００μｇ／ｍｌの濃度で、ＡＰＴ遺伝子を選択マーカー遺伝子とする場合にはＧ４１８を２００μｇ／ｍｌの濃度でＹＰＤ培地に加えた。以下、それぞれの培地をＨｙｇＢ培地およびＧ４１８培地と表記する。また、ハイグロマイシンＢに耐性であることをＨｙｇＢｒ、ハイグロマイシンＢに感受性であることをＨｙｇＢｓ、Ｇ４１８に耐性であることをＧ４１８ｒ、Ｇ４１８に感受性であることをＧ４１８ｓと表記する。

実施例１：Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを利用したキャンディダ・ユティリスの形質転換系の開発
１−１．Ｃｒｅ−ｌｏｘ系を利用した多重形質転換系に必要なプラスミドの構築
遺伝子破壊用のＤＮＡ断片を調製するためのプラスミドｐＣＵ５６３は次の手順で構築した。Ｓｈｉｍａｄａら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４，２６７６−２６８０）に記載されたＰＧＫ遺伝子プロモーターとハイグロマイシン耐性遺伝子ＨＰＴ遺伝子を有するプラスミドｐＧＫＨＰＴ１を鋳型にして、ＩＭ−５３（配列番号１６）とＩＭ−５７（配列番号１７）のプライマーセットでＰＣＲ（伸長反応１．５分）を行うことにより、順にｌｏｘＰ（配列番号１８）、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、ＨＰＴ遺伝子からなるＤＮＡ断片を増幅した。また、ｐＧＡＰＰＴ１０（Ｋｏｎｄｏら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５，４５３−４５７）を鋳型にして、ＩＭ−５４（配列番号１９）とＩＭ−５５（配列番号２０）のプライマーセットでＰＣＲ（伸長反応３０秒）を行うことにより、ＧＡＰ遺伝子ターミネーターとｌｏｘＰからなるＤＮＡ断片を増幅した。これらを混合してＩＭ−１（配列番号２１）とＩＭ−２（配列番号２２）でＰＣＲ（伸長反応２分）を行うことによって、順にｌｏｘＰ、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、ＨＰＴ遺伝子、ＧＡＰ遺伝子ターミネーター、ｌｏｘＰからなるＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片をｐＣＲ２．１ベクター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：ＴＡクローニングキット（ｐＣＲ２．１ｖｅｃｔｏｒ）］にクローン化した。こうして得られたプラスミドをｐＣＵ５６３と名づけた（図２）。形質転換によって本モジュールが組込まれたキャンディダ・ユティリス細胞は、例えば野生株では生育できない６００〜８００μｇ／ｍｌの濃度でＨｙｇＢを含む培地で生育可能となる。

Ｃｒｅ組換え酵素の発現プラスミドｐＣＵ５９５は以下の手順で構築した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでＣｒｅを発現させるプラスミドｐＳＨ６５（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ，Ｕ．ら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０ (６)，Ｅ２３，２００２）を鋳型として、(１)ＩＭ−４９（配列番号２３）とＩＭ−５０（配列番号２４）、(２)ＩＭ−５１（配列番号２５）とＩＭ−５２（配列番号２６）の２種のプライマーセットでＰＣＲを行った（共に伸長反応３０秒）。それぞれの増幅ＤＮＡ断片を混合した後にＩＭ−４９（配列番号２３）とＩＭ−５２（配列番号２６）を用いたＰＣＲを行うことによって、Ｃｒｅ組換え酵素をコードする遺伝子断片を増幅した。こうしてできたＣｒｅ遺伝子では、ｐＳＨ６５のＣｒｅ遺伝子内に存在するＢａｍＨＩ認識配列（ＧＧＡＴＣＣ）が、アミノ酸配列を変化させずに、当該酵素が認識しない配列（ＧＣＡＴＡＣ）となっている。さらにこれをＸｂａＩとＢａｍＨＩで消化して得たＤＮＡ断片を、ｐＰＭＡＰＴ１（特開２００３−１４４１８５号公報）のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩギャップに挿入した。このプラスミドをＮｏｔＩで処理して得たＣｒｅ発現モジュール、すなわち順にＰＭＡ遺伝子プロモーター、Ｃｒｅ遺伝子、ＰＭＡ遺伝子ターミネーターからなるＤＮＡ断片を、自律複製配列ＣｕＡＲＳ２を有するｐＣＡＲＳ７（特開２００３−１４４１８５号公報）をＮｏｔＩで部分消化したＤＮＡに挿入した。こうして得られたプラスミドをｐＣＵ５９５と名づけた（図３）。本プラスミドはＡＰＴ遺伝子を有しており、これでキャンディダ・ユティリスの形質転換を行うと、プラスミドが導入された細胞は、例えば野生株では生育できない２００μｇ／ｍｌの濃度でＧ４１８を含む培地で生育可能となる。

１−２．Ｃｒｅ−ｌｏｘ系を利用したＣｕＵＲＡ３遺伝子の多重破壊
Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系が機能するかどうかを調べるために、特開２００３−１４４１８５号公報で記載されたＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ ＵＲＡ３遺伝子（以下、ＣｕＵＲＡ３遺伝子）の多重破壊を試みた。当該遺伝子はオロチジン―５’―リン酸脱炭酸酵素をコードしており、細胞内にある機能性の当該遺伝子が全て失われた株は、ウラシル要求性となる。すなわちウラシルを含まない培地で生育できなくなると考えられる。

１コピー目と２コピー目のＣｕＵＲＡ３遺伝子を破壊するためのＤＮＡ断片の調製を次のようにして行った。まず、次の（１）、（２）および（３）に示した２種類のＰＣＲを実施した：（１）鋳型としてｐＣＵ５６３を用い、プライマーとしてＩＭ−１（配列番号２１）とＩＭ−２（配列番号２２）を用い、伸長反応時間を２分とした；（２）鋳型としてＮＢＲＣ０９８８株のゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてＩＭ−５９（配列番号５４）とＩＭ−６０（配列番号５５）を用い、伸長反応時間を３０秒とした；（３）鋳型としてＮＢＲＣ０９８８株ゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてＩＭ−６１（配列番号５６）とＩＭ−６２（配列番号５７）を用い、伸長反応時間を３０秒とした。なお、（２）および（３）ではＣｕＵＲＡ３遺伝子の上流部分と下流部分が増幅される。さらに以下の（４）のＰＣＲを実施した：（４）鋳型として先述の（１）、（２）および（３）で増幅された３種類のＤＮＡの混合物を用い、プライマーとしてＩＭ−５９（配列番号５４）とＩＭ−６２（配列番号５７）を用い、伸長反応時間を３分とした。これにより、順にＣｕＵＲＡ３遺伝子の上流領域、ｌｏｘＰ、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、ＨＰＴ遺伝子、ＧＡＰ遺伝子ターミネーター、ｌｏｘＰ、ＣｕＵＲＡ３遺伝子の下流領域からなるＤＮＡ断片を取得した。以下、このＤＮＡ断片を「ＣｕＵＲＡ３破壊１・２回目断片」と表記する。本ＤＮＡ断片を用いて形質転換をすれば、ＣｕＵＲＡ３遺伝子の上流領域と下流領域で二重鎖相同組換えが起こることにより、ＣｕＵＲＡ３遺伝子のアレルを部分的に欠失させることが可能である。

ＤＮＡ断片としてＣｕＵＲＡ３破壊１・２回目断片１μｇを用いて、ＮＢＲＣ０９８８株の形質転換を行った。その結果、１１９クローンのＨｙｇＢｒの形質転換体が得られた。ＮＢＲＣ０９８８株および１１９クローンから任意に選抜した１１クローンの形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＩＭ−６３（配列番号５８）とＩＭ−９２（配列番号５９）でＰＣＲを行った（伸長反応３．５分）。図４に示したとおり、これらのプライマーは相同組換え領域の外側にアニーリングする。０．８％アガロースゲル電気泳動に供したところ、ＮＢＲＣ０９８８株では２．３ｋｂ、１１クローン全ての形質転換体では３．２ｋｂと２．３ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されていた（図５）。このことから、目的とするＨｙｇＢｒのＣｕＵＲＡ３遺伝子１コピー破壊株が得られたことがわかった。また、形質転換体から陽性のクローンを選抜できる確率も高いことが明らかになった。

ＨｙｇＢｒのＣｕＵＲＡ３遺伝子１コピー破壊株の形質転換をＣｒｅ発現用プラスミドであるｐＣＵ５９５で行った。Ｇ４１８を含む培地では、ＤＮＡを加えなかった陰性対照ではコロニーが形成されなかったのに対し、ｐＣＵ５９５を加えた試料では１，０００以上の形質転換体が得られた。このうちの３０株について、Ｇ４１８培地あるいはＨｙｇＢ培地に塗布した結果、全てＧ４１８培地では生育可能であったが、ＨｙｇＢ培地では生育できなかった。

ＨｙｇＢｒのＣｕＵＲＡ３遺伝子１コピー破壊株と、ＨｙｇＢｓのＣｕＵＲＡ３遺伝子１コピー目の破壊株からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＩＭ−６３（配列番号５８）とＩＭ−９２（配列番号５９）でＰＣＲを行った（伸長反応３．５分）。０．８％アガロースゲル電気泳動に供したところ、前者の株では３．２ｋｂと２．３ｋｂ、後者の株では２．３ｋｂと１．１ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されていた。目的のとおりＨＰＴ遺伝子が除去された株が取得された。

ＨｙｇＢｓのＣｕＵＲＡ３遺伝子１コピーの破壊株をＹＰＤ液体培地で１晩培養後、その一部をＹＰＤ培地に塗布した。１〜３日後にシングルコロニーを複数分離し、Ｇ４１８培地とＹＰＤ培地に塗布した。その結果、ほとんどのクローンが、ＹＰＤ培地では生育したが、Ｇ４１８培地では生育しなかった。

ＮＢＲＣ０９８８株、ＮＢＲＣ０９８８株由来のＣｕＵＲＡ３遺伝子が１コピー破壊されたＨｙｇｒかつＧ４１８ｓ株、続いてＣｒｅ発現プラスミドを導入して構築されたＨｙｇｓかつＧ４１８ｒの株、さらにＣｒｅ発現プラスミドが脱落したＨｙｇｓかつＧ４１８ｓ株から抽出したＤＮＡを鋳型、ＩＭ−６３（配列番号５８）とＩＭ−９２（配列番号５９）をプライマーとしてＰＣＲを実施した結果を図５に示した（伸長反応３．５分）。順にレーン１、レーン２、レーン３、レーン４に相当する。

ＮＢＲＣ０９８８株、ＮＢＲＣ０９８８株由来のＣｕＵＲＡ３遺伝子が１コピー破壊されたＨｙｇｒかつＧ４１８ｓ株、続いてＣｒｅ発現プラスミドを導入して構築されたＨｙｇｓかつＧ４１８ｒの株、さらにＣｒｅ発現プラスミドが脱落したＨｙｇｓかつＧ４１８ｓ株から抽出したＤＮＡを鋳型とし、ＩＭ−６３（配列番号５８）とＩＭ−２２３（配列番号６０）をプラスミドとしてＰＣＲを実施した結果を図６に示した（伸長反応２分）。順にレーン１、レーン２、レーン３、レーン４に相当する。図４に示したとおり、ＩＭ−６３（配列番号５８）は相同組換え領域の外側に、ＩＭ−２２３（配列番号６０）はＨＰＴ遺伝子内部にアニーリングする。Ｈｙｇｒの株を鋳型としたレーン２のみで１．４ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されたことから、ＩＭ−６３（配列番号５８）とＩＭ−９２（配列番号５９）の結果と同様、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムがキャンディダ・ユティリスでも機能することが明らかになった。

ＨｙｇＢｓのＣｕＵＲＡ３遺伝子１コピーが破壊されてはいるが、Ｇ４１８を含む培地での生育能が異なるＧ４１８ｒ株とＧ４１８ｓ株からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＣｒｅ遺伝子を増幅するためのプライマーセットであるＩＭ−４９（配列番号２３）とＩＭ−５２（配列番号２６）でＰＣＲを行った（伸長反応１分）。その結果、Ｇ４１８ｒ株では１ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されたが、Ｇ４１８ｓ株では増幅されなかった。このことからｐＣＵ５９５が脱落し、ＨｙｇＢｓかつＧ４１８ｓのＣｕＵＲＡ３遺伝子１コピー目の破壊株が得られたことを確認した。

ＤＮＡ断片としてＣｕＵＲＡ３破壊１・２回目断片を用いて、ＨｙｇＢｓかつＧ４１８ｓのＣｕＵＲＡ３遺伝子１コピーの破壊株の形質転換を行った。得られた形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＩＭ−６３（配列番号５８）とＩＭ−９２（配列番号５９）でＰＣＲを行った（伸長反応３．５分）。０．８％アガロースゲル電気泳動に供したところ、３．２ｋｂ、２．３ｋｂ、１．１ｋｂの３種類ＤＮＡ断片が増幅される株が複数存在した。このことから目的とするＨｙｇＢｒのＣｕＵＲＡ３遺伝子２コピーの破壊株が得られたことがわかった。

ＨｙｇＢｒのＣｕＵＲＡ３遺伝子２コピー破壊株の形質転換を、Ｃｒｅ発現用プラスミドであるｐＣＵ５９５で行った。得られた形質転換体をＧ４１８培地およびＨｙｇＢ培地に塗布したところ、全てＧ４１８培地では生育可能であったが、ＨｙｇＢ培地では生育できなかった。このＨｙｇＢｓかつＧ４１８ｒの形質転換体から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＩＭ−６３（配列番号５８）とＩＭ−９２（配列番号５９）でＰＣＲを行った（伸長反応３．５分）。０．８％アガロースゲル電気泳動に供したところ、２．３ｋｂと１．１ｋｂの２種類ＤＮＡ断片が増幅されていた。ＨＰＴ遺伝子を除去できたことがわかった。

ＨｙｇＢｓのＣｕＵＲＡ３遺伝子２コピー破壊株をＹＰＤ液体培地で１晩培養後、その一部をＹＰＤ培地に塗布した。２日後にシングルコロニーを分離し、ＹＰＤ培地とＧ４１８培地に塗布した。そしてＹＰＤ培地では生育するが、Ｇ４１８培地では生育しないクローンを分離した。ｐＣＵ５９５が脱落した株、すなわち、ＨｙｇＢｓかつＧ４１８ｓのＣｕＵＲＡ３遺伝子２コピー目の破壊株を取得できた。

３コピー目と４コピー目のＣｕＵＲＡ３遺伝子を破壊するためのＤＮＡ断片の調製を次のようにして行った。まず、次の（１）、（２）および（３）に示した３種類のＰＣＲを実施した：（１）鋳型としてｐＣＵ５６３を用い、プライマーとしてＩＭ−１（配列番号２１）とＩＭ−２（配列番号２２）を用い、伸長反応時間を２分とした；（２）鋳型としてＮＢＲＣ０９８８株のゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてＩＭ−２９５（配列番号６１）とＩＭ−２９６（配列番号６２）を用い、伸長反応時間を３０秒とした；（３）鋳型としてＮＢＲＣ０９８８株ゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてＩＭ−６１（配列番号５６）とＩＭ−６２（配列番号５７）を用い、伸長反応時間を３０秒とした。なお、（２）および（３）ではＣｕＵＲＡ３遺伝子の上流部分と下流部分が増幅される。さらに以下の（４）のＰＣＲを実施した：（４）鋳型として先述の（１）、（２）および（３）で増幅された３種類のＤＮＡの混合物を用い、プライマーとしてＩＭ−２９５（配列番号６１）とＩＭ−６２（配列番号５７）を用い、伸長反応時間を３分とした。これにより、順にＣｕＵＲＡ３遺伝子の上流領域、ｌｏｘＰ、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、ＨＰＴ遺伝子、ＧＡＰ遺伝子ターミネーター、ｌｏｘＰ、ＣｕＵＲＡ３遺伝子の下流領域からなるＤＮＡ断片を取得した。以下、このＤＮＡ断片を「ＣｕＵＲＡ３破壊３・４回目断片」と表記する。本ＤＮＡ断片を用いて形質転換をすれば、ＣｕＵＲＡ３遺伝子の上流領域と下流領域で二重鎖相同組換えが起こることにより、ＣｕＵＲＡ３遺伝子のアレルを部分的に欠失させることが可能である。また、（３）で増幅されるＣｕＵＲＡ３遺伝子の上流領域は、ＣｕＵＲＡ３破壊１・２回目断片を用いて行った１コピー目および２コピー目のＣｕＵＲＡ３遺伝子破壊のための形質転換において欠失された領域であるので、２コピーの破壊されたアレルに組込まれる可能性を減らすことができると考えられる。

ＤＮＡ断片としてＣｕＵＲＡ３破壊３・４回目断片を用いて、３コピー目のＣｕＵＲＡ３遺伝子の破壊のために、ＨｙｇＢｓかつＧ４１８ｓのＣｕＵＲＡ３遺伝子２コピー破壊株の形質転換を行った。得られた形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＩＭ−６３（配列番号５８）とＩＭ−９２（配列番号５９）でＰＣＲを行った（伸長反応３．５分）。０．８％アガロースゲル電気泳動に供したところ、３．６ｋｂ、２．３ｋｂ、１．１ｋｂの３種類ＤＮＡ断片が増幅される株があった。このことから、目的とするＨｙｇＢｒのＣｕＵＲＡ３遺伝子３コピー目の破壊株が得られたことがわかった。

ＨｙｇＢｒのＣｕＵＲＡ３遺伝子３コピー破壊株の形質転換をＣｒｅ発現用プラスミドであるｐＣＵ５９５で行った。得られた形質転換体をＧ４１８培地およびＨｙｇＢ培地に塗布した結果、全てＧ４１８培地では生育可能であったが、ＨｙｇＢ培地では生育できなかった。このＨｙｇＢｓかつＧ４１８ｒの形質転換体から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＩＭ−６３（配列番号５８）とＩＭ−９２（配列番号５９）でＰＣＲを行った（伸長反応３．５分）。０．８％アガロースゲル電気泳動に供したところ、２．３ｋｂ、１．５ｋｂ、１．１ｋｂの３種類ＤＮＡ断片が増幅されていた。ＨＰＴ遺伝子を除去できたことがわかった。

ＨｙｇＢｓのＣｕＵＲＡ３遺伝子３コピー破壊株をＹＰＤ液体培地で１晩培養後、その一部をＹＰＤ培地に塗布した。２日後にシングルコロニーを分離し、ＹＰＤ培地とＧ４１８培地に塗布した。そしてＹＰＤ培地では生育するが、Ｇ４１８培地では生育しないクローンを分離した。ｐＣＵ５９５が脱落した株、すなわち、ＨｙｇＢｓかつＧ４１８ｓのＣｕＵＲＡ３遺伝子３コピー目の破壊株を取得できた。

ＤＮＡ断片としてＣｕＵＲＡ３破壊３・４回目断片を用いて、ＨｙｇＢｓかつＧ４１８ｓのＣｕＵＲＡ３遺伝子３コピー破壊株の形質転換を行った。得られた形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型として、ＩＭ−６３（配列番号５８）とＩＭ−９２（配列番号５９）でＰＣＲを行った（伸長反応３．５分）。０．８％アガロースゲル電気泳動に供したところ、複数の形質転換体では３．６ｋｂ、１．５ｋｂ、１．１ｋｂの３種類ＤＮＡ断片が増幅されていた。このことから目的とするＨｙｇＢｒのＣｕＵＲＡ３遺伝子４コピー破壊株が得られたことがわかった。また、野生株であるＮＢＲＣ０９８８株でみられた２．３ｋｂのＤＮＡ断片、すなわち破壊されていないアレルが増幅されたＤＮＡ断片が検出されなかったことから、この株はＣｕＵＲＡ３遺伝子完全破壊株であると考えられた。

ＨｙｇＢｒのＣｕＵＲＡ３遺伝子４コピー破壊株の形質転換をＣｒｅ発現用プラスミドであるｐＣＵ５９５で行った。得られた形質転換体をＧ４１８培地およびＨｙｇＢ培地に塗布した結果、全てＧ４１８培地では生育可能であったが、ＨｙｇＢ培地では生育できなかった。このＨｙｇＢｓかつＧ４１８ｒの形質転換体から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＩＭ−６３（配列番号５８）とＩＭ−９２（配列番号５９）でＰＣＲを行った（伸長反応３．５分）。０．８％アガロースゲル電気泳動に供したところ、１．５ｋｂと１．１ｋｂの２種類のＤＮＡ断片が増幅される株が複数存在した。ＨＰＴ遺伝子を除去できたことがわかった。

ＨｙｇＢｓのＣｕＵＲＡ３遺伝子４コピー破壊株をＹＰＤ液体培地で１晩培養後、その一部をＹＰＤ培地に塗布した。２日後にシングルコロニーを分離し、ＹＰＤ培地とＧ４１８培地に塗布した。そしてＹＰＤ培地では生育するが、Ｇ４１８培地では生育しないクローンを分離した。ｐＣＵ５９５が脱落した株、すなわち、ＨｙｇＢｓかつＧ４１８ｓのＣｕＵＲＡ３遺伝子４コピー目の破壊株を取得できた。

ＮＢＲＣ０９８８株、およびＮＢＲＣ０９８８株を宿主として、順にＣｕＵＲＡ３遺伝子を破壊した株（ＨＰＴ遺伝子およびＡＰＴ遺伝子を除去したＨｙｇＢｓかつＧ４１８ｓ）の非選択培地であるＳＣ培地、ＳＣ−Ｕｒａ培地（ウラシルを含まない培地）および５−ＦＯＡ培地における生育能を調べた。なお、これらの培地組成はＭｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９７ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載されたものに従った。図７に示したとおり、ＣｕＵＲＡ３遺伝子４コピー、すなわち全て破壊した株だけが、ＮＢＲＣ０９８８株を含める他の４株と異なり、ＳＣ−Ｕｒａ培地で生育できず、５−ＦＯＡ培地で生育できた。

組換えＤＮＡ技術を用いてＣｕＵＲＡ３遺伝子の全アレルを破壊し、ウラシル要求性株の取得に成功した。これはキャンディダ・ユティリスにおいて、細胞内に４つのアレルが存在していることが示された初めての報告である。選択マーカー遺伝子をくり返し利用しながら目的の遺伝子を効率よく破壊することが可能となったＣｒｅ−ｌｏｘＰ系を利用したキャンディダ・ユティリスの形質転換システムが、意義あるものであると考えられた。

実施例２：ＰＤＣをコードする遺伝子破壊株の構築
２−１．ＰＤＣをコードする遺伝子のクローニング
ＳｃＰＤＣ１遺伝子やＫｌＰＤＣ１遺伝子で共通の配列が多いＣ末端側の塩基配列を増幅するプライマーＩＫＳＭ−２９（配列番号１）とＩＫＳＭ−３０（配列番号２）を作製し、ＮＢＲＣ０９８８株のゲノムを鋳型としたＰＣＲを行った（伸長時間３０秒）。増幅された約２２０ｂｐ（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）のＤＮＡ断片（以下、ＣｕＰ−Ｆｇと呼ぶ）のシークエンスを解読したところ（配列番号３）、ＳｃＰＤＣ１遺伝子との相同性が高いことがわかった。このことから、このＤＮＡ断片はＰＤＣをコードする遺伝子の一部であると考えられた。

このＤＮＡ断片をプローブとしてサザン解析を行った。まず、サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株（ＮＢＲＣ１１３６株）から抽出したゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、、キャンディダ・ユティリスＮＢＲＣ０９８８から抽出したゲノムＤＮＡをＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩで消化し、これらを０．８％アガロースゲル電気泳動に供した。分離したゲノムＤＮＡを、定法に従ってアマシャム・バイオサイエンス社製Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋ナイロンメンブレンにトランスファーした。プローブの放射性標識にはＴａＫａＲａ社製Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２を用い、方法は添付のプロトコールに従った。標識ｄＣＴＰにはアマシャム・バイオサイエンス社製〔α−３２Ｐ〕ｄＣＴＰを１．８５ＭＢｑ用いた。ハイブリダイゼーションはＲａｐｉｄ−Ｈｙｂ ｂｕｆｆｅｒを用い、添付のプロトコールに従って行った。ただし、ハイブリダイゼーションの温度を６０℃として行った。その結果を図８に示す。

サッカロマイセス・セレビシエでは３種のＰＤＣ遺伝子（ＳｃＰＤＣ１遺伝子、ＳｃＰＤＣ５遺伝子、ＳｃＰＤＣ６遺伝子）由来であると考えられる３本のバンドがそれぞれ検出された（レーン１）。これに対して、キャンディダ・ユティリスＮＢＲＣ０９８８株では、プローブ内に制限酵素認識部位があるＢｇｌＩＩ（レーン４）、およびＥｃｏＲＩ（レーン５）以外の試料では１本のバンドしか検出されなかった。このことからＮＢＲＣ０９８８においてＰＤＣ活性を持つ遺伝子は１種類であることが示唆された。なお、当該プローブ内にはＥｃｏＲＩ認識配列は存在しないが、当該プローブがハイブリダイズする領域の近傍に、相同染色体のアレル間でＥｃｏＲＩ認識配列が存在する遺伝子座と存在しないへテロな領域が存在している可能性が考えられた。

コロニーハイブリダイゼーションに利用するゲノムライブラリーとして、ＢａｍＨＩで消化後に脱リン酸化させたｐＢＲ３２２（ニッポン・ジーン）に、Ｓａｕ３ＡＩで部分消化したＤＮＡのうち５〜１０ｋｂの断片を連結するための反応を行った。この溶液でＬＢ＋Ａｍｐ寒天培地に生育した５０，０００クローンを取得した。なお、自己閉環したクローンは５％に満たなかった。

さらに、前述のＤＮＡ断片ＣｕＰ−Ｆｇをプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーション法によって、プローブ配列との相同部位を含むクローンを複数取得した。そして、プライマーウォーキング法でこれらのクローンの配列を解読したところ、１種類のコンティグができあがった（配列番号６３）。これをＳＧＤ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ）のＢＬＡＳＴ検索に供したところ、ＳｃＰＤＣ１遺伝子やＳｃＰＤＣ５遺伝子との相同性が高かったので、本遺伝子をＣｕＰＤＣ１遺伝子と名づけた。このＤＮＡ断片をＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢＬＡＳＴで相同性検索したところ、種々の酵母のピルビン酸脱炭酸酵素の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子と高い相同性が認められた。さらにＮＣＢＩのデータベースを利用して、本配列と他生物種のＰＤＣ遺伝子との相同性検索を行うことにより、ＯＲＦ（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）領域の特定を試みたところ、ＣｕＰＤＣ１遺伝子のＯＲＦは１，６９２ｎｔ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）であると推察された（配列番号６３）。当該遺伝子の配列は、ＳｃＰＤＣ１遺伝子とはアミノ酸レベルでの相同性は７６％であり、ＰＤＣ活性を有している可能性が高いと考えられた。なお、配列番号６３に記載の当該遺伝子ＯＲＦ領域の上流領域の配列２，２４６塩基はＣｕＰＤＣ１遺伝子のプロモーター領域、下流領域の１，０７６塩基はＣｕＰＤＣ１遺伝子のターミネーター領域に相当すると考えられた。なお、ここで報告した配列は、コロニーハイブリダイゼーション法で取得したプラスミドｐＣＵ５３０に全て含まれた。

ＯＲＦの上流領域１．２ｋｂのプロモーター領域について、転写制御に関わるシスエレメントの有無を調べた。ＯＲＦの転写開始ＡＴＧのＡの直前の塩基を「−１」として、位置づけをした。その結果、−１４９付近にＴＡＴＡＴＡＡからなるＴＡＴＡボックスであると考えられる配列が存在した。サッカロマイセス・セレビシエやクルイベロマイセス・ラクティスのＰＤＣ遺伝子の転写活性化に必要であると考えられているＵＡＳ−ＰＤＣ配列（ＧＣＡＣＣＡＴＡＣＣＴＴ）（Ｂｕｔｌｅｒ Ｇ．ら，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ．，１４（５）：４０５−１２．，１９８８）と相同性の高い配列が少なくとも３つ見出された（−１，０８４付近、−９９８付近、−８１２付近）。さらにそれらとは重複しないＧｃｒ１結合ドメインは少なくとも４つ（−１，５３８付近、−５５６付近、−５１８付近、−４３０付近）、ＣＡＡＴ配列は少なくとも５つ（−１，２２４付近、−１，１１６付近、−９７９付近、−６５８付近、−５５６付近）局在していると考えられた。

ＤＮＡ断片ＣｕＰ−Ｆｇを用いて、ＮＢＲＣ０６２６株、ＮＢＲＣ０６３９株、ＮＢＲＣ１０８６株等のキャンディダ・ユティリス株から抽出したゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化した試料についてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、全てＮＢＲＣ０９８８と同じ位置にバンドが検出された。また、ＣｕＰＤＣ１遺伝子の塩基配列には、ＮＢＲＣ０６２６株、ＮＢＲＣ０９８８株、およびＮＢＲＣ１０８６株の間に一塩基多型が見出された。

ＣｕＰＤＣ１遺伝子の機能を解析するため、ＣｕＰＤＣ１遺伝子をＳｃＰＤＣ１遺伝子プロモーターで発現させることにより、サッカロマイセス・セレビシエにおけるＳｃＰＤＣ１遺伝子とＳｃＰＤＣ５遺伝子の二重破壊の致死性を抑圧できるかを調べた。そこでまず、酵母・全遺伝子破壊株シリーズのＢＹ４７４１由来（ｕｒａ３遺伝子およびｈｉｓ３遺伝子変異株）のＳｃＰＤＣ１遺伝子破壊株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、ＢＹ４７４２由来（ｕｒａ３遺伝子およびｈｉｓ３遺伝子変異株）のＳｃＰＤＣ５遺伝子破壊株（Ｏｐｅｎ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）の交雑株ＳＧＹ１０７株を構築した。

ＳｃＰＤＣ１遺伝子をサッカロマイセス・セレビシエで発現させるためのプラスミドｐＣＵ５４６は次のようにして構築した。サッカロマイセス・セレビシエで機能するセントロメリック型のプラスミドｐＲＳ３１６（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｒら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１２２，１９―２７．１９８９）（ＵＲＡ３遺伝子を有する）をＣｌａＩとＢａｍＨＩで切断した。ＢＹ４７４１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を鋳型として、ＩＭ―１３５（配列番号４）とＩＭ−１３６（配列番号５）のプライマーセットでＰＣＲを行った（伸長時間３分）。この増幅断片をＣｌａＩとＢａｍＨＩで消化した。このＤＮＡ断片を、先に制限酵素処理したプラスミド断片と連結したプラスミドｐＣＵ５４６を構築した。

次に、ＳＧＹ１０７株をｐＣＵ５４６で形質転換した。この株を胞子形成寒天培地（０．５ｇ／Ｌグルコース、１ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、１０ｇ／Ｌ酢酸カリウム、２０ｇ／Ｌアガロース）にうつして２５℃で３日間静置した。得られた胞子から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にして、次の２種類のＰＣＲに供した（伸長時間２分）：（１）ＩＭ−１９（配列番号６）とＩＭ−３３１（配列番号７）のプライマーセット（この組み合わせではＳｃＰＤＣ１遺伝子が破壊されている株のみ、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片が増幅される）；（２）ＩＭ−２０（配列番号８）とＩＭ−３３４（配列番号９）のプライマーセット（この組み合わせではＳｃＰＤＣ５遺伝子が破壊されている株のみ、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片が増幅される）。両方のプライマーセットでＤＮＡ断片が増幅され、かつ、ｐＣＵ５４６を保持するＳＧＹ１１６株を取得した。

ＳＧＹ１１６株と、ＢＹ４７４２由来のＳｃＰＤＣ６遺伝子破壊株（Ｏｐｅｎ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）の交雑株を構築した。胞子形成培地にうつして２５℃で３日間静置した。得られた胞子から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にして次の３種類のＰＣＲに供した（伸長時間２分）：（１）ＩＭ−１９（配列番号６）とＩＭ−３３１（配列番号７）のプライマーセット；（２）ＩＭ−２０（配列番号８）とＩＭ−３３４（配列番号９）のプライマーセット；（３）ＩＭ−３３９（配列番号１０）とＩＭ−３４０（配列番号１１）のプライマーセット（この組み合わせではＳｃＰＤＣ６遺伝子が破壊されている株から増幅されるＤＮＡ断片は、ＳｃＰＤＣ６遺伝子が破壊されていない株で増幅されるＤＮＡ断片（約３．４ｋｂ）より大きい）。その結果、（１）および（２）のＰＣＲでは約１．５ｋｂのＤＮＡ断片が、（３）のＰＣＲでは３．４ｋｂより大きいＤＮＡ断片が増幅された。つまり、ＳｃＰＤＣ１遺伝子、ＳｃＰＤＣ５遺伝子、およびＳｃＰＤＣ６遺伝子全てが破壊され、かつｐＣＵ５４６を保持するＳＧＹ３８９株を取得した。

ＣｕＰＤＣ１遺伝子をサッカロマイセス・セレビシエで発現させるためのプラスミドｐＣＵ６５５は次のようにして構築した。まず、次の（１）、（２）および（３）のＰＣＲを行った：（１）ＢＹ４７４１株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＩＭ−１３５（配列番号４）とＩＭ−１４７（配列番号１２）をプライマーとした（伸長反応１分）；（２）ＢＹ４７４１株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＩＭ−１５０（配列番号１３）とＩＭ−１３６（配列番号５）をプライマーとした（伸長反応１分）；（３）ＣｕＰＤＣ１遺伝子の推定ＯＲＦ領域を有するｐＣＵ５３０を鋳型として、ＩＭ−１４８（配列番号１４）とＩＭ−１４９（配列番号１５）をプライマーとした（伸長反応２分）。次に、（１）、（２）および（３）で増幅したＤＮＡ断片を鋳型として、ＩＭ−１３５（配列番号４）とＩＭ−１３６（配列番号５）をプライマーとしてＰＣＲを行った。この結果、順にＳｃＰＤＣ１遺伝子、ＣｕＰＤＣ１遺伝子の推定ＯＲＦ領域、およびＳｃＰＤＣ１遺伝子のターミネーター領域からなるＤＮＡ断片を取得した。なお、全てのＰＣＲはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を用いて行った。この断片を、サッカロマイセス・セレビシエで機能するセントロメリック型のプラスミドｐＲＳ３１３（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｒら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１２２，１９―２７．１９８９）（ＨＩＳ３遺伝子を有する）をＳｍａＩで切断して得られたＤＮＡ断片と連結した。得られたプラスミドをｐＣＵ６５５と名づけた。

ＳｃＰＤＣ１遺伝子、ＳｃＰＤＣ５遺伝子、およびＳｃＰＤＣ６遺伝子の全てが破壊されているＳＧＹ３８９株を、ｐＲＳ３１３またはｐＣＵ６５５で形質転換し、それぞれＳＧＹ３９３株およびＳＧＹ３９２株を取得した。

５−ＦＯＡ培地において、ＢＹ４７４１株、ＢＹ４７４２株、ＢＹ４７４１株由来のＳｃＰＤＣ１遺伝子破壊株、ＢＹ４７４２株由来のＳｃＰＤＣ５遺伝子破壊株、ＢＹ４７４２株由来のＳｃＰＤＣ６遺伝子破壊株は生育可能であった。つまり、これらの株はウラシル要求性の株であることを示している。次に、ＳｃＰＤＣ１遺伝子、ＳｃＰＤＣ５遺伝子、およびＳｃＰＤＣ６遺伝子の全てが破壊され、かつｐＣＵ５４６を保持するＳＧＹ３８９株、およびＳＧＹ３８９株にｐＲＳ３１３を導入したＳＧＹ３９３株は、５−ＦＯＡ培地で生育できなかった。これは、ＳｃＰＤＣ１遺伝子を発現させているｐＣＵ５４６が脱落できないことを示している。つまり、５−ＦＯＡ培地においては、ＰＤＣ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現させることが、生育に必須であることを示している。一方、ＳＧＹ３８９株にｐＣＵ６５５を導入したＳＧＹ３９２株（ＣｕＰＤＣ１遺伝子を発現する株）は、５−ＦＯＡ培地で生育することが可能であった。これは、ｐＣＵ６５５に含まれるＣｕＰＤＣ１遺伝子が、ｐＣＵ５４７に含まれるＳｃＰＤＣ１遺伝子が有するＰＤＣの機能を保持していることを示している。従って、ＣｕＰＤＣ１遺伝子がコードするポリペプチドはＰＤＣであることが示唆された。

２−２．Ｃｒｅ−ｌｏｘ系を利用したＣｕＰＤＣ１遺伝子の多重破壊
１コピー目と２コピー目のＣｕＰＤＣ１遺伝子を破壊するためのＤＮＡ断片の調製を次のようにして行った。まず、次の（１）、（２）および（３）に示した３種類のＰＣＲを実施した：（１）鋳型としてｐＣＵ５６３を用い、プライマーとしてＩＭ−１（配列番号２１）とＩＭ−２（配列番号２２）を用い、伸長反応時間を２分とした；（２）鋳型としてＮＢＲＣ０９８８株のゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてＩＭ−２７７（配列番号２７）とＩＭ−２７８（配列番号２８）を用い、伸長反応時間を３０秒とした；（３）鋳型としてＮＢＲＣ０９８８株ゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてＩＭ−２７９（配列番号２９）とＩＭ−２８０（配列番号３０）を用い、伸長反応時間を３０秒とした。なお、（２）および（３）ではＣｕＰＤＣ１遺伝子の上流部分と下流部分が増幅される。さらに、以下の（４）のＰＣＲを実施した：（４）鋳型として先述の（１）、（２）および（３）で増幅された３種類のＤＮＡの混合物を用い、プライマーとしてＩＭ−２７７（配列番号２７）とＩＭ−２８０（配列番号３０）を用い、伸長反応時間を３分とした。これにより、順にＣｕＰＤＣ１遺伝子の上流領域、ｌｏｘＰ、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、ＨＰＴ遺伝子、ＧＡＰ遺伝子ターミネーター、ｌｏｘＰ、ＣｕＰＤＣ１遺伝子の下流領域からなるＤＮＡ断片を取得した。以下、このＤＮＡ断片を「ＣｕＰＤＣ１破壊１・２回目断片」と表記する。本ＤＮＡ断片を用いて形質転換をすれば、ＣｕＰＤＣ１遺伝子の上流領域と下流領域で二重鎖相同組換えが起こることにより、ＣｕＰＤＣ１遺伝子のアレルを部分的に欠失させることが可能である。

ＤＮＡ断片としてＣｕＰＤＣ１破壊１・２回目断片を用いて、ＮＢＲＣ０９８８株の形質転換を行った。ＮＢＲＣ０９８８株および得られた形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＩＭ−２８１（配列番号３１）とＩＭ−２８２（配列番号３２）でＰＣＲを行った（伸長反応４分）。図９に示したとおり、これらのプライマーは相同組換え領域の外側にアニーリングする。０．８％アガロースゲル電気泳動に供したところ、ＮＢＲＣ０９８８株では３．７ｋｂのＤＮＡ断片、複数の形質転換体では３．９ｋｂと３．７ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されていた。このことから、目的とするＨｙｇＢｒのＣｕＰＤＣ１遺伝子１コピー破壊株が得られたことがわかった。

ＨｙｇＢｒのＣｕＰＤＣ１遺伝子１コピー破壊株の形質転換をＣｒｅ発現用プラスミドであるｐＣＵ５９５で行った。Ｇ４１８を含む培地では、ＤＮＡを加えなかった陰性対照ではコロニーが形成されなかったのに対し、ｐＣＵ５９５を加えた試料では１，０００以上の形質転換体が得られた。このうちの任意の３０株をＧ４１８培地またはＨｙｇＢ培地に塗布した結果、全てＧ４１８培地では生育可能であったが、ＨｙｇＢ培地では生育できなかった。

ＨｙｇＢｒのＣｕＰＤＣ１遺伝子１コピー破壊株と、ＨｙｇＢｓのＣｕＰＤＣ１遺伝子１コピー目の破壊株からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＩＭ−２８１（配列番号３１）とＩＭ−２８２（配列番号３２）でＰＣＲを行った（伸長反応４分）。０．８％アガロースゲル電気泳動に供したところ、前者の株では３．９ｋｂと３．７ｋｂのＤＮＡ断片、後者の株では３．７ｋｂと１．９ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されていた。目的のとおりＨＰＴ遺伝子が除去された株が取得された。

ＨｙｇＢｓのＣｕＰＤＣ１遺伝子１コピーの破壊株をＹＰＤ液体培地で１晩培養後、その一部をＹＰＤ培地に塗布した。２日後にシングルコロニーを複数分離し、Ｇ４１８培地とＹＰＤ培地に塗布した。その結果、ほとんどのクローンが、ＹＰＤ培地では生育したが、Ｇ４１８培地では生育しなかった。

ＨｙｇＢｓのＣｕＰＤＣ１遺伝子１コピーが破壊されてはいるが、Ｇ４１８を含む培地での生育能が異なるＧ４１８ｒ株とＧ４１８ｓ株からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＣｒｅ遺伝子を増幅するためのプライマーセットであるＩＭ−４９（配列番号２３）とＩＭ−５２（配列番号２６）でＰＣＲを行った（伸長反応１分）。その結果、Ｇ４１８ｒ株では１ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されたが、Ｇ４１８ｓ株では増幅されなかった。このことから、ｐＣＵ５９５が脱落し、ＨｙｇＢｓかつＧ４１８ｓのＣｕＰＤＣ１遺伝子１コピー目の破壊株が得られた。

ＤＮＡ断片としてＣｕＰＤＣ１破壊１・２回目断片を用いて、ＨｙｇＢｓかつＧ４１８ｓのＣｕＰＤＣ１遺伝子１コピーの破壊株の形質転換を行った。得られた形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＩＭ−２８１（配列番号３１）とＩＭ−２８２（配列番号３２）でＰＣＲを行った（伸長反応４分）。０．８％アガロースゲル電気泳動に供したところ、３．９ｋｂ、３．７ｋｂ、１．９ｋｂの３種類ＤＮＡ断片が増幅される株が複数存在した。このことから、目的とするＨｙｇＢｒのＣｕＰＤＣ１遺伝子２コピーの破壊株が得られたことがわかった。

ＨｙｇＢｒのＣｕＰＤＣ１遺伝子２コピー破壊株の形質転換をＣｒｅ発現用プラスミドであるｐＣＵ５９５で行った。得られた形質転換体をＧ４１８培地およびＨｙｇＢ培地に塗布したところ、全てＧ４１８培地では生育可能であったが、ＨｙｇＢ培地では生育できなかった。このＨｙｇＢｓかつＧ４１８ｒの形質転換体から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＩＭ−２８１（配列番号３１）とＩＭ−２８２（配列番号３２）でＰＣＲを行った（伸長反応４分）。０．８％アガロースゲル電気泳動に供したところ、３．７ｋｂおよび１．９ｋｂの２種類のＤＮＡ断片が増幅されていた。ＨＰＴ遺伝子を除去できたことがわかった。

ＨｙｇＢｓのＣｕＰＤＣ１遺伝子２コピー破壊株をＹＰＤ液体培地で１晩培養後、その一部をＹＰＤ培地に塗布した。２日後にシングルコロニーを分離し、ＹＰＤ培地とＧ４１８培地に塗布した。そして、ＹＰＤ培地では生育するが、Ｇ４１８培地では生育しないクローンを分離した。ｐＣＵ５９５が脱落した株、すなわち、ＨｙｇＢｓかつＧ４１８ｓのＣｕＰＤＣ１遺伝子２コピー目の破壊株を取得できた。

３コピー目と４コピー目のＣｕＰＤＣ１遺伝子を破壊するためのＤＮＡ断片の調製を次のようにして行った。まず、次の（１）、（２）および（３）に示した３種類のＰＣＲを実施した：（１）鋳型としてｐＣＵ５６３を用い、プライマーとしてＩＭ−１（配列番号２１）とＩＭ−２（配列番号２２）を用い、伸長反応時間を２分とした；（２）鋳型としてＮＢＲＣ０９８８株のゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてＩＭ−２７７（配列番号２７）とＩＭ−２７８（配列番号２８）を用い、伸長反応時間を３０秒とした；（３）鋳型としてＮＢＲＣ０９８８株ゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてＩＭ−１８５（配列番号３３）とＩＭ−１６８（配列番号３４）を用い、伸長反応時間を３０秒とした。なお、（２）および（３）ではＣｕＰＤＣ１遺伝子の上流部分と下流部分が増幅される。さらに、以下の（４）のＰＣＲを実施した：（４）鋳型として先述の（１）、（２）および（３）で増幅された３種類のＤＮＡの混合物を用い、プライマーとしてＩＭ−２７７（配列番号２７）とＩＭ−１６８（配列番号３４）を用い、伸長反応時間を３分とした。これにより、順にＣｕＰＤＣ１遺伝子の上流領域、ｌｏｘＰ、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、ＨＰＴ遺伝子、ＧＡＰ遺伝子ターミネーター、ｌｏｘＰ、ＣｕＰＤＣ１遺伝子の下流領域からなるＤＮＡ断片を取得した。以下、このＤＮＡ断片を「ＣｕＰＤＣ１破壊３・４回目断片」と表記する。本ＤＮＡ断片を用いて形質転換をすれば、ＣｕＰＤＣ１遺伝子の上流領域と下流領域で二重鎖相同組換えが起こることにより、ＣｕＰＤＣ１遺伝子のアレルを部分的に欠失させることが可能である。また、（３）で増幅されるＣｕＰＤＣ１遺伝子の下流領域は、ＣｕＰＤＣ１破壊１・２回目断片を用いて行った１コピー目および２コピー目のＣｕＰＤＣ１遺伝子破壊のための形質転換において欠失された領域がほとんどであるので、２コピーの破壊されたアレルに組込まれる可能性を大きく減らすことができると考えられる。

ＤＮＡ断片としてＣｕＰＤＣ１破壊３・４回目断片を用いて、３コピー目のＣｕＰＤＣ１遺伝子の破壊のために、ＨｙｇＢｓかつＧ４１８ｓのＣｕＰＤＣ１遺伝子２コピー破壊株の形質転換を行った。得られた形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＩＭ−２８１（配列番号３１）とＩＭ−２８２（配列番号３２）でＰＣＲを行った（伸長反応４分）。０．８％アガロースゲル電気泳動に供したところ、４．４ｋｂ、３．７ｋｂ、１．９ｋｂの３種類ＤＮＡ断片が増幅される株があった。このことから、目的とするＨｙｇＢｒのＣｕＰＤＣ１遺伝子３コピー目の破壊株が得られたことがわかった。

ＨｙｇＢｒのＣｕＰＤＣ１遺伝子３コピー破壊株の形質転換をＣｒｅ発現用プラスミドであるｐＣＵ５９５で行った。得られた形質転換体をＧ４１８培地およびＨｙｇＢ培地に塗布した結果、全てＧ４１８培地では生育可能であったが、ＨｙｇＢ培地では生育できなかった。このＨｙｇＢｓかつＧ４１８ｒの形質転換体から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＩＭ−２８１（配列番号３１）とＩＭ−２８２（配列番号３２）でＰＣＲを行った（伸長反応４分）。０．８％アガロースゲル電気泳動に供したところ、３．７ｋｂ、２．４ｋｂ、１．９ｋｂの３種類ＤＮＡ断片が増幅されていた。ＨＰＴ遺伝子を除去できたことがわかった。

ＨｙｇＢｓのＣｕＰＤＣ１遺伝子３コピー破壊株をＹＰＤ液体培地で１晩培養後、その一部をＹＰＤ培地に塗布した。２日後にシングルコロニーを分離し、ＹＰＤ培地とＧ４１８培地に塗布した。そして、ＹＰＤ培地では生育するが、Ｇ４１８培地では生育しないクローンを分離した。ｐＣＵ５９５が脱落した株、すなわち、ＨｙｇＢｓかつＧ４１８ｓのＣｕＰＤＣ１遺伝子３コピー目の破壊株を取得できた。

ＤＮＡ断片としてＣｕＰＤＣ１破壊３・４回目断片を用いて、ＨｙｇＢｓかつＧ４１８ｓのＣｕＰＤＣ１遺伝子３コピー破壊株の形質転換を行った。得られた形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＩＭ−２８１（配列番号３１）とＩＭ−２８２（配列番号３２）でＰＣＲを行った（伸長反応４分）。０．８％アガロースゲル電気泳動に供したところ、複数の形質転換体では４．４ｋｂ、２．４ｋｂ、１．９ｋｂの３種類ＤＮＡ断片が増幅されていた。このことから、目的とするＨｙｇＢｒのＣｕＰＤＣ１遺伝子４コピー破壊株が得られたことがわかった。また、野生株であるＮＢＲＣ０９８８株でみられた３．７ｋｂのＤＮＡ断片、すなわち破壊されていないアレルが増幅されたＤＮＡ断片が検出されなかったことから、この株がＣｕＰＤＣ１遺伝子完全破壊株であると考えられた。

ＨｙｇＢｒのＣｕＰＤＣ１遺伝子４コピー破壊株の形質転換をＣｒｅ発現用プラスミドであるｐＣＵ５９５で行った。得られた形質転換体をＧ４１８培地およびＨｙｇＢ培地に塗布した結果、全てＧ４１８培地では生育可能であったが、ＨｙｇＢ培地では生育できなかった。このＨｙｇＢｓかつＧ４１８ｒの形質転換体から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＩＭ−２８１（配列番号３１）とＩＭ−２８２（配列番号３２）でＰＣＲを行った（伸長反応４分）。０．８％アガロースゲル電気泳動に供したところ、２．４ｋｂと１．９ｋｂの２種類のＤＮＡ断片が増幅される株が複数存在した。ＨＰＴ遺伝子を除去できたことがわかった。

ＨｙｇＢｓのＣｕＰＤＣ１遺伝子４コピー破壊株をＹＰＤ液体培地で１晩培養後、その一部をＹＰＤ培地に塗布した。２日後にシングルコロニーを分離し、ＹＰＤ培地とＧ４１８培地に塗布した。そして、ＹＰＤ培地では生育するが、Ｇ４１８培地では生育しないクローンを分離した。ｐＣＵ５９５が脱落した株、すなわち、ＨｙｇＢｓかつＧ４１８ｓのＣｕＰＤＣ１遺伝子４コピー目の破壊株を取得できた。この株をＣｕ８４０２ｇ株と名づけた。

２−３． ＣｕＰＤＣ１遺伝子破壊株の特性評価
ＣｕＰＤＣ１遺伝子は、ピルビン酸からアセトアルデヒドへの変換を触媒するピルビン酸脱炭酸酵素の活性を有するポリペプチドをコードすると考えられる。発酵経路においては、アセトアルデヒドは、アルコール脱水素酵素によりさらにエタノールへと代謝される。すなわち、ＣｕＰＤＣ１遺伝子を破壊することにより、エタノールへの代謝経路がシャットダウンされ、エタノール製造能が低下することが期待される。そこで、ＣｕＰＤＣ１遺伝子１コピー破壊株、ＣｕＰＤＣ１遺伝子２コピー破壊株、ＣｕＰＤＣ１遺伝子３コピー破壊株、ＣｕＰＤＣ１遺伝子完全破壊株Ｃｕ８４０２ｇ株を発酵試験に供し（全てＨｙｇＢｓかつＧ４１８ｓの株）、エタノール製造能および有機酸の分析を行った。

Ｃｕ８４０２ｇ株のエタノール製造能、香気成分製造能および有機酸製造能を調べる目的で、野生株ＮＢＲＣ０９８８株およびＣｕ８４０２ｇ株を、培地として５０ｍＬ〜１００ｍＬのＹＰＤ液体培地を用い、１〜３日間ＹＰＤ寒天培地で生育させた菌体を、ＯＤ６００が約０．１になるように新たな培地に接種し、ＴＡＩＴＥＣ社製卓上培養装置により振幅３５ｍｍ、１２０〜１５０ｒｐｍ、３０℃で１６〜３０時間培養した。そして、４℃、３，０００ｒｐｍ、５分間の条件で遠心分離によって集菌し、さらに上清を除した後、発酵に用いる培地（中和剤は含まない）で洗浄した。こうして得られた酵母菌体を、バッフル付きの１００ｍＬ三角フラスコでＹＰＤ１０（１００ｇ／Ｌグルコース、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌペプトン）培地５０ｍＬに初期ＯＤ６００が０．５になるようにそれぞれ植菌し、ＴＡＩＴＥＣ社製卓上培養装置を用いて３０℃で４８時間３５ｍｍの振幅、８０ｒｐｍの振とう速度で培養した。培養液を０．２２μｍのフィルターで濾過し、培地中のエタノール濃度、香気成分濃度および各種有機酸濃度を測定した。結果を表１に示した。なお、各種データは、独立に３回試行した結果から算出した値である。

発酵開始から４８時間後、ＮＢＲＣ０９８８株では３．９６ｇ／Ｌのエタノールを製造していたが、Ｃｕ８４０２ｇ株ではエタノールを検出できなかった。

発酵開始から４８時間後、アセトアルデヒドについてはＮＢＲＣ０９８８株では２６．２ｍｇ／Ｌを製造していたが、Ｃｕ８４０２ｇ株では１．１４ｍｇ／Ｌであった。

発酵開始から４８時間後、酢酸についてはＮＢＲＣ０９８８株では６６０．３ｍｇ／Ｌを製造していたが、Ｃｕ８４０２ｇ株では２７３．１ｍｇ／Ｌであった。

発酵開始から４８時間後、アセトアルデヒドが前躯体であるエタノールと酢酸の濃度はともに、ＮＢＲＣ０９８８株よりもＣｕ８４０２ｇ株で低かった。

発酵開始から４８時間後におけるＮＢＲＣ０９８８株のピルビン酸濃度は４６２．４ｍｇ／Ｌであったのに対し、Ｃｕ８４０２ｇ株では３６５９．９ｍｇ／Ｌ存在していることが観察された。Ｌ−乳酸濃度はＮＢＲＣ０９８８株およびＣｕ８４０２ｇ株の両株が、酵母を加えていない培地よりも低下していた。Ｄ−乳酸の濃度については、酵母を加えていない培地に比べ、ＮＢＲＣ０９８８株では低下していたが、Ｃｕ８４０２ｇ株では上昇していた。

Ｃｕ８４０２ｇ株の特徴として、ＣｕＰＤＣ１遺伝子を破壊することにより、ピルビン酸からアセトアルデヒドへ変換する経路がシャットダウンされ、これによりピルビン酸が代謝されずに蓄積し、さらにこのことが影響して、メチルグリオキサール経路においてはピルビン酸の前駆体であるＤ−乳酸が蓄積しやすくなったと考えられる。

以上の結果は、ＣｕＰＤＣ１遺伝子が、ピルビン酸からアセトアルデヒドへの変換に関わるピルビン酸脱炭酸酵素をコードしており、本遺伝子を完全に欠損することにより、細胞内における当該酵素の活性がなくなった、あるいは低下したことに起因すると考えられる。

目的産物であるＬ−乳酸を精製する工程において、培養上清に炭酸カルシウムを加え、Ｌ−乳酸カルシウム塩として回収する手法が広く用いられている。エタノールやＴＣＡ回路の各種有機酸濃度が野生株に比べて大きく減少していることは、この工程でＬ−乳酸塩以外の副産物の産生を低減化できる可能性を示していることから、乳酸製造能を評価するうえで有用な指標となる形質であると考えられる。

発酵開始から４８時間後にはＣｕＰＤＣ１遺伝子１コピー破壊株、ＣｕＰＤＣ１遺伝子２コピー破壊株、ＣｕＰＤＣ１遺伝子３コピー破壊株は、キャンディダ・ユティリス野生株ＮＢＲＣ０９８８株と同じ程度エタノール製造能を有していた。

実施例３：Ｌ−ＬＤＨ遺伝子を導入したキャンディダ・ユティリス株の構築
３−１．Ｌ−乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードするＬ−ＬＤＨ遺伝子のＤＮＡ配列の設計
高等真核生物であるウシ由来Ｌ−乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドを酵母キャンディダ・ユティリスで効率よく発現させるために、特開２００３−２５９８７８号公報に記載され、ウシ由来の酵素のアミノ酸配列（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＡＡＩ４６２１１．１）に記載された乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子に対して、以下の項目を設計指針として、タカラバイオ社に天然に存在しない新規な遺伝子配列の設計及び合成を依頼した。

（イ）キャンディダ・ユティリスにおいて多用されているコドンを用いた。
（ロ）ｍＲＮＡの不安定配列や繰り返し配列を出来る限り排除した。
（ハ）全領域にわたってＧＣ含量の偏りに差がでないようにした。
（ニ）設計した配列中に遺伝子クローニングに不適当な制限酵素部位ができないようにした。
（ホ）Ｌ−ＬＤＨ遺伝子発現用ベクターに組込むための両末端に有用な制限酵素部位を付加した（Ｌ−ＬＤＨコード領域上流：ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ；Ｌ−ＬＤＨコード領域下流：ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ）。ここで、ＫｐｎＩ認識部位は、配列番号３６のヌクレオチド配列において１番目のgから６番目のcまでの配列ＧＧＴＡＣＣを示し、Ｘｂａ I認識部位は、配列番号３６のヌクレオチド配列において７番目のtから１２番目のaまでの配列ＴＣＴＡＧＡを示し、ＢａｍＨＩ認識部位は、配列番号３６のヌクレオチド配列において１，０１５番目のgから１，０２０番目のcまでの配列ＧＧＡＴＣＣを示し、ＳａｃＩ認識部位は、配列番号３６のヌクレオチド配列において１，０２１番目のgから１，０２６番目のcまでの配列ＧＡＧＣＴＣを示す。

合成されたＤＮＡ配列を配列番号３６に示す。また、このうち上記のＬ−乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードする１３番目のaから１，０１１番目のaまでのヌクレオチド配列に対応するアミノ酸配列はウシ由来そのものであり、配列番号３５として記載した（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＡＡＩ４６２１１．１）。なお、配列番号３６の１，００９から１，０１１番目のＴＧＡと、それに引き続く１，０１２から１，０１４番目のＴＧＡは共に翻訳の終了コドンである。このＤＮＡ断片を有するプラスミドをｐＣＵ６６９（別名：ＧＡ０７０３３）と名付けた。

この配列番号３６のうち、１３番目のaから１，０１１番目のa（２つの翻訳終了コドンのうち、上流域のＴＧＡ）までのヌクレオチド配列（コドン最適化配列）と配列番号３８で表されるヌクレオチド配列（ウシ由来の野生型配列）のアライメントを図１に示す。両者の配列は９９９塩基中７５１塩基が等しく、相同性は７５%であった。図１において、上側の配列は、配列番号３６のうち、１３番目のaから１，０１１番目のa（２つの翻訳終了コドンのうち、上流域のＴＧＡ）までのヌクレオチド配列である。図１の下側の配列は配列番号３８で表されるＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ由来のＬ−ＬＤＨ−Ａ遺伝子の塩基配列（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＢＣ１４６２１０．１より抜粋）である（翻訳産物は配列番号３５となる）。

３−２．Ｌ−ＬＤＨ遺伝子発現用プラスミドの作製
Ｌ−ＬＤＨ遺伝子発現用プラスミドの構築を、特記しない限りは、ＫＯＤ―Ｐｌｕｓ−を用いて以下のようにして実施した。

ＩＭ−３４５（配列番号３９）とＩＭ−３４６（配列番号４０）でＰＣＲを行い、ＣｕＰＤＣ１遺伝子の下流領域を増幅した（伸長反応１分）。この増幅断片をＢｓｓＨＩＩで消化した後、ＢｓｓＨＩＩで完全に消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）（ＴＯＹＯＢＯ社）と連結した。得られたプラスミドをｐＣＵ６７０（別名：ｐＰｔ）と名付けた。

遺伝子破壊用のＤＮＡ断片を調製するためのプラスミドｐＣＵ５６３がもつＰＧＫ遺伝子プロモーターを長くしたプラスミドｐＣＵ６２１は、次の手順で構築した。Ｓｈｉｍａｄａら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４，２６７６−２６８０）に記載されたＰＧＫ遺伝子プロモーターとハイグロマイシン耐性遺伝子ＨＰＴ遺伝子を有するプラスミドｐＧＫＨＰＴ１を鋳型にして、ＩＭ−２８３（配列番号４１）とＩＭ−５７（配列番号１７）のプライマーセットでＰＣＲ（伸長反応２分）を行うことにより、順にｌｏｘＰ、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、ＨＰＴ遺伝子からなるＤＮＡ断片を増幅した。また、ｐＧＡＰＰＴ１０（Ｋｏｎｄｏら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５，４５３−４５７）を鋳型として、ＩＭ−５４（配列番号１９）とＩＭ−５５（配列番号２０）のプライマーセットでＰＣＲ（伸長反応３０秒）を行うことにより、ＧＡＰ遺伝子ターミネーターとｌｏｘＰからなるＤＮＡ断片を増幅した。これらを混合してＩＭ−１（配列番号２１）とＩＭ−２（配列番号２２）でＰＣＲを行うことによって（伸長反応２．５分、酵素としてはタカラバイオ社製ＬＡ Ｔａｑを使用した）、順にｌｏｘＰ、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、ＨＰＴ遺伝子、ＧＡＰ遺伝子ターミネーター、ｌｏｘＰからなるＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を、ｐＣＲ２．１ベクターにクローン化した。こうして得られたプラスミドをｐＣＵ６２１（別名：ｐＮＮＬＨＬ）と名づけた。

まず、次の３種類のＰＣＲを行った：（１）ｐＣＵ６２１を鋳型とし、ＩＭ−３４９（配列番号４２）とＩＭ−３５０（配列番号４３）をプライマーとしてＰＣＲを行った（伸長反応２．５分）；（２）ｐＰＧＫＰＴ２（特開２００３−１４４１８５号公報）を鋳型とし、ＩＭ−３４７（配列番号４４）とＩＭ−３４８（配列番号４５）をプライマーとしてＰＣＲ行い（伸長反応３０秒）、ＰＧＫ遺伝子のターミネーター領域を、ＢｇｌＩＩ認識配列がなくなるように一塩基変異を入れて増幅した；（３）鋳型として（１）および（２）で増幅したＤＮＡ断片を用い、プライマーとしてＩＭ−３４７（配列番号４４）とＩＭ−３５０（配列番号４３）を用いてＰＣＲを行った（伸長反応３分）。（３）で得られたＤＮＡ断片を、ＳｍａＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）に連結した。得られたプラスミドをｐＣＵ６７２（別名：ｐＰＧｔＨ）と名付けた。

ｐＣＵ６７２（別名：ｐＰＧｔＨ）をＢａｍＨＩとＣｌａＩで消化して得られたＰＧＫ遺伝子ターミネーター、ｌｏｘＰ、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、ＨＰＴ遺伝子、ＧＡＰ遺伝子ターミネーター、ｌｏｘＰからなる約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩとＣｌａＩで消化したｐＣＵ６７０に連結させて、新たなプラスミドｐＣＵ６７５（別名：ｐＰＧｔＨＰｔ）を構築した。

まず、次の３種類のＰＣＲを行った：（１）ｐＣＵ５３０を鋳型とし、ＩＭ−３４１（配列番号４６）とＩＭ−３４２（配列番号４７）をプライマーとしてＰＣＲを行い（伸長反応２分）、ＣｕＰＤＣ１遺伝子プロモーター領域を増幅した；（２）ｐＣＵ６６９（別名：ＧＡ０７０３３）を鋳型とし、ＩＭ−３４３（配列番号４８）とＩＭ−３７９（配列番号４９）をプライマーとしてＰＣＲを行い（伸長反応１分）、Ｌ−ＬＤＨ構造遺伝子を増幅した；（３）鋳型として（１）および（２）で増幅したＤＮＡ断片を用い、プライマーとしてＩＭ−３４１（配列番号４６）とＩＭ−３７９（配列番号４９）を用いてＰＣＲを行った（伸長反応３分）。（３）で増幅したＤＮＡ断片をＮｏｔＩとＢｇｌＩＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、ＮｏｔＩとＢａｍＨＩで切断したｐＣＵ６７５（別名：ｐＰＧｔＨＰｔ）に連結した。得られたプラスミドｐＣＵ６８１（別名：ｐＰＬＰＧｔＨＰｔ）（図１０）は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＢｓｓＨＩＩ部位に、順にＣｕＰＤＣ１遺伝子プロモーター領域、Ｌ−ＬＤＨ構造遺伝子、ＰＧＫ遺伝子ターミネーター、ｌｏｘＰ、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、ＨＰＴ遺伝子、ＧＡＰ遺伝子ターミネーター、ｌｏｘＰ、ＣｕＰＤＣ１遺伝子の下流領域からなるＤＮＡ断片が挿入されている。２つのＢｓｓＨＩＩ認識配列の挿入ＤＮＡ断片側には、当該認識配列の直後にＢｇｌＩＩ認識配列が備わっていることから、ｐＣＵ６８１（別名：ｐＰＬＰＧｔＨＰｔ）をＢｇｌＩＩで消化することにより、上述のＣｕＰＤＣ１遺伝子プロモーターからＣｕＰＤＣ１遺伝子の下流領域からなるＤＮＡ断片を取得することが可能である。なお、形質転換体は６００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを含むＹＰＤ培地で選択する。

３−３．キャンディダ・ユティリス野生株ＮＢＲＣ０９８８株へのＬ−ＬＤＨ遺伝子の導入
ＢｇｌＩＩで消化したｐＣＵ６８１（ｐＰＬＰＧｔＨＰｔ）３μｇでＮＢＲＣ０９８８株の形質転換を行った。得られた形質転換体から抽出したＤＮＡを鋳型とし、ＩＭ−３６２（配列番号５０）とＩＭ−１７４（配列番号５１）をプライマーセットとしてＰＣＲを行った（伸長反応４分）。その内、ＮＢＲＣ０９８８株では増幅されない３．６ｋｂのＤＮＡ断片が増幅される形質転換体Ｐｊ０２０２株を取得した。また、ＩＭ−１６３（配列番号５２）とＩＭ−１６４（配列番号５３）をプライマーセットとしたＰＣＲを行ったところ（伸長反応３０秒）、約５００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。このことからＰｊ０２０２株は、破壊されていないＣｕＰＤＣ１遺伝子を少なくとも１コピー以上有していることが示された。

３−４．ＮＢＲＣ０９８８株およびＣｕＰＤＣ１遺伝子完全破壊株Ｃｕ８４０２ｇ株へのＬ−ＬＤＨ遺伝子の導入
ＢｇｌＩＩで消化したｐＣＵ６８１（ｐＰＬＰＧｔＨＰｔ）３μｇでＣｕ８４０２ｇ株の形質転換を行った。得られたＨｙｇＢｒの形質転換体から抽出したＤＮＡを鋳型とし、ＩＭ−３６２（配列番号５０）とＩＭ−１７４（配列番号５１）をプライマーセットとして、ＰＣＲを行った（伸長反応４分）。その内、Ｃｕ８４０２ｇ株では増幅されない３．６ｋｂのＤＮＡ断片が増幅される形質転換体Ｐｊ０４０４株を取得した。この株はＬ−ＬＤＨ遺伝子がＣｕＰＤＣ１遺伝子座に組込まれた株であり、Ｌ−ＬＤＨ遺伝子の発現は本来のＣｕＰＤＣ１遺伝子プロモーターによって制御される。

Ｐｊ０４０４株は少なくとも１コピー以上のＬ−ＬＤＨ遺伝子が導入された株である。特に、本検討で発現させたＨＰＴ遺伝子は１コピーのみの導入によってＨｙｇＢｒの表現型を示す形質転換体を選択できることから、Ｐｊ０４０４株は、１コピーのＬ−ＬＤＨ遺伝子が組込まれた株であると考えられる。ＩＭ−２８１（配列番号３１）とＩＭ−２８２（配列番号３２）をプライマーセットとしてＰＣＲを行った結果（伸長反応４分）、２．４ｋｂと１．９ｋｂの少なくとも２種類のＤＮＡ断片が増幅された。この結果、Ｌ−ＬＤＨ遺伝子が組込まれずに、破壊された状態のＣｕＰＤＣ１遺伝子座がＰｊ０４０４株に存在していることが明らかになった。

Ｃｒｅ組換え酵素の発現プラスミドｐＣＵ５９５でＰｊ０４０４株の形質転換を行い、ＨｙｇＢｓかつＧ４１８ｒのクローンを取得した。当該クローンをＹＰＤ液体培地で１晩培養後、その一部をＹＰＤ培地に塗布した。２日後にシングルコロニーを分離し、ＹＰＤ培地とＧ４１８培地に塗布した。そして、ＹＰＤ培地では生育するが、Ｇ４１８培地では生育しないクローンを分離した。このクローンＰｊ０７０７ａ株から抽出したＤＮＡを鋳型として、ＩＭ−３６２（配列番号５０）とＩＭ−１７４（配列番号５１）をプライマーセットとしてＰＣＲを行った結果（伸長反応４分）、１．２ｋｂのＤＮＡが増幅された。Ｐｊ０７０７ａ株はＨｙｇＢｓかつＧ４１８ｓの表現型をもち、ＣｕＰＤＣ１遺伝子が全て破壊され、かつＣｕＰＤＣ１遺伝子座に組込まれたＣｕＰＤＣ１遺伝子プロモーター誘導性のＬ−ＬＤＨ遺伝子が導入された株である。

ＢｇｌＩＩで消化したｐＣＵ６８１（ｐＰＬＰＧｔＨＰｔ）３μｇでＰｊ０７０７ａ株の形質転換を行った。得られたＨｙｇＢｒの形質転換体から抽出したＤＮＡを鋳型とし、ＩＭ−３６２（配列番号５０）とＩＭ−１７４（配列番号５１）をプライマーセットとして、ＰＣＲを行った（伸長反応４分）。その結果、３．６ｋｂと１．２ｋｂの２種類のＤＮＡ断片が増幅される形質転換体Ｐｊ０９５７株を取得した。この株はＬ−ＬＤＨ遺伝子が、Ｐｊ０４５７株でＬ−ＬＤＨ遺伝子が組込まれたＣｕＰＤＣ１遺伝子座とは異なるアレルのＣｕＰＤＣ１遺伝子座に組込まれた株である。この形質転換によって導入されたＬ−ＬＤＨ遺伝子の発現も、本来のＣｕＰＤＣ１遺伝子プロモーターによって制御される。

Ｐｊ０９５７株は少なくとも２コピー以上のＬ−ＬＤＨ遺伝子が導入された株である。特に、本検討で発現させたＨＰＴ遺伝子は１コピーのみの導入によってＨｙｇＢｒの表現型を示す形質転換体を選択できることから、Ｐｊ０９５７株は、２コピーのＬ−ＬＤＨ遺伝子が組込まれた株であると考えられる。

キャンディダ・ユティリスにおけるＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムは、遺伝子の破壊だけでなく、任意の遺伝子の導入にも利用できることが確認された。

実施例４：フラスコでの発酵試験
以下に示すとおり、ＮＢＲＣ０９８８株および新たに構築した組換え酵母菌株の乳酸製造能の評価を実施した。培地中のエタノール濃度はＧＣあるいはＨＰＬＣを用いて、培地中のグルコース濃度およびＬ−乳酸濃度はワイエスアイジャパン社製バイオケミストリーアナライザー（ＢＡ）を用いて測定した。光学異性体の判別には、Ｊ．Ｋ．インターナショナル社製のＦ−キットＤ−乳酸／Ｌ−乳酸を用い、方法は添付のプロトコールに従った。その他の各種有機酸製造量はＨＰＬＣを用いて行った。分析に供した試料には、培養液を０．２２μｍのフィルターで事前に濾過したものを用いた。各種データは、少なくとも３回、独立に試行した結果の平均値である。

ＹＰＤ寒天培地で２〜３日間３０℃で培養した酵母菌体から白金耳で１回かきとったペレット状の菌株を、１５ｍＬのチューブに入れた３ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種し、ＴＡＩＴＥＣ社製卓上培養装置により振幅３５ｍｍ、１３０ｒｐｍ、３０℃で２０〜３０時間、前々培養を行った。これをＯＤ６００が約０．１になるように、坂口フラスコに入った１００ｍＬのＹＰＤ培地に接種し、ＴＡＩＴＥＣ社製卓上培養装置により振幅３５ｍｍ、１３０ｒｐｍ、３０℃で通常１５〜２２時間、前培養を行った。そして４℃、３，０００ｒｐｍ、５分間の条件で遠心分離によって集菌し、さらに上清を除した後、発酵に用いる培地（中和剤は含まない）で洗浄した。こうして得られた菌体を、バッフル付きの１００ｍＬ三角フラスコに入った１００〜１１５ｇ／Ｌのグルコースを含む液量１５ｍＬの培地に接種し、ＴＡＩＴＥＣ社製卓上培養装置により振幅３５ｍｍ、８０ｒｐｍで発酵させた。前培養により得た菌体を発酵のために接種する量は、特に記述がない場合、ＯＤ６００が１０となるように植えた。特記しない限り、中和剤として４．５％（ｗ／ｖ）の濃度になるように炭酸カルシウムを培地に加えた。発酵時の温度は２５℃、３０℃、あるいは３５℃とした。培地には上記濃度（１００〜１１５ｇ／Ｌ）のグルコースの他に１０ｇ／Ｌの酵母エキスと２０ｇ／Ｌのペプトンを加えており、この組成の培地を以降はＹＰＤ１０培地と記載する。

全糖換算率（％）とは、培地中のＬ−乳酸重量を培地中の初期グルコース重量で除し、さらに１００を乗じた値である。Ｌ−乳酸の光学純度（％）は、Ｌ−乳酸濃度の値を、Ｌ−乳酸濃度にＤ−乳酸濃度を加えた値で除し、さらに１００を乗じた値である。

ＮＢＲＣ０９８８株、Ｃｕ８４０２ｇ株、およびＰｊ０２０２株について、発酵開始２４時間後の培地中のグルコース濃度、エタノール濃度、Ｌ−乳酸濃度、Ｄ−乳酸濃度、他の有機酸濃度を調べた。発酵温度を３０℃とした場合の結果を表２に記載する。

以上の結果より、ＮＢＲＣ０９８８株に比べ、ＣｕＰＤＣ１遺伝子が完全に破壊されているＣｕ８４０２ｇ株は、Ｌ−乳酸およびエタノールをほとんど全く製造せず、ピルビン酸およびＤ−乳酸を多量に蓄積することがわかった。

表２の結果から、まず、野生株であるＮＢＲＣ０９８８株はグルコースをほとんど全て消費し、エタノールを製造した。また、ＮＢＲＣ０９８８株ではＬ−乳酸の濃度は低下していた。Ｐｊ０２０２株は、破壊されていないＣｕＰＤＣ１遺伝子とＬ−ＬＤＨ遺伝子の両方を有している株であり、当該菌株はエタノールとＬ−乳酸を両方製造した。グルコースからのＬ−乳酸の製造効率を向上させるためには、エタノールの製造量を低下させる、例えばＣｕＰＤＣ１遺伝子を全て欠損させるなどの手段が有効であると考えられた。

Ｐｊ０４０４株とＰｊ０９５７株について、発酵開始４時間後から１３時間後までの培地中のＬ−乳酸濃度を１時間ごとに測定した。発酵温度については、Ｐｊ０４０４株は３０℃の１条件、Ｐｊ０９５７株では３０℃と３５℃の２条件とした。各データについて１次の近似式も求めた。この結果を図１１に記載した。

単位時間あたりのＬ−乳酸製造速度については、Ｐｊ０４０４株（３０℃）で３．４１ｇ／Ｌ／時間（ｒ２乗値＝０．９９８）、Ｐｊ０９５７株（３０℃）で４．１３ｇ／Ｌ／時間（ｒ２乗値＝０．９９７）、Ｐｊ０９５７株（３５℃）で４．８０ｇ／Ｌ／時間（ｒ２乗値＝０．９９８）であった。このことから、Ｌ−ＬＤＨ遺伝子のコピー数がＰｊ０４０４株よりも高いＰｊ０９５７株の方が、速く乳酸を製造する能力を有していることがわかった。また、Ｐｊ０９５７株の発酵速度を高めるためには、３０℃よりも３５℃の方を選択することがよいと考えられた。

Ｐｊ０４０４株とＰｊ０９５７株について、発酵開始２４時間後の培地中のグルコース濃度、エタノール濃度、Ｌ−乳酸濃度、Ｄ−乳酸濃度、他種有機酸濃度を調べた。発酵温度については、Ｐｊ０４０４株は３０℃の１条件、Ｐｊ０９５７株では３０℃と３５℃の２条件とした。この結果を表３に記載する。

発酵開始２４時間後においては全ての試料で、中和剤として加えた４．５％（ｗ／ｖ）の炭酸カルシウムが粉末状態で残っていた。また、Ｐｊ０４０４株はＰｊ０９５７株よりも乳酸製造量が低かった。このことからＬ−ＬＤＨ遺伝子のコピー数が高いほど、乳酸製造が速いことがわかった。

発酵開始２４時間後においては、Ｐｊ０９５７株を３５℃で培養した方が、Ｐｊ０９５７株を３０℃で培養するよりも乳酸製造量が高かった。このことから発酵温度は３０℃よりも３５℃の方がＬ−乳酸の製造に好ましいと考えられた。

Ｐｊ０９５７株について、中和剤を加えた条件および加えない条件でそれぞれ発酵を行った。発酵温度は３５℃とした。表４に３３時間後の培地中のグルコース濃度、エタノール濃度、Ｌ−乳酸濃度、Ｄ−乳酸濃度、他種有機酸濃度を調べた結果を記載する。

中和剤を加えない場合には、中和剤を加えた場合に比べ、乳酸製造量が少なかった。これは培地の酸度が高いことが原因であると考えられる。このことから中和剤を添加することは、効率的な乳酸製造に有効であると考えられた。

ＣｕＰＤＣ１遺伝子を完全に破壊し、さらにＬ−ＬＤＨ遺伝子を導入したＰｊ０９５７株は、１０８．７ｇ／Ｌのグルコースを含む培地から、全糖換算率９５．１０％という高効率でＬ−乳酸を短時間のうちに製造した。

Ｐｊ０９５７株について、初期ＯＤを１０とし、発酵温度を２５℃として、４．５％（ｗ／ｖ）炭酸カルシウムを添加したＹＰＤ１０培地（１００ｇ／Ｌグルコースを含有）中のＬ−乳酸濃度を、発酵開始４時間後から１２時間後まで２時間ごとに測定した。その１次の近似式を求め、単位時間あたりのＬ−乳酸製造速度を算出したところ、３．０ｇ／Ｌ／ｈであった。さらに、発酵開始３３時間後のＬ−乳酸濃度を調べたところ、培地中のＬ−乳酸濃度は９５ｇ／Ｌであった。２５℃の条件では、３０℃および３５℃の条件に比べてＬ−乳酸製造速度が劣るものの、相当量のＬ−乳酸が製造された。よって、Ｐｊ０９５７株は、２５℃から３５℃という幅広い温度でＬ−乳酸を高効率で生産できることが明らかとなった。

発酵に供する菌体量の検討を行った。発酵開始時のＯＤ６００を２、５、あるいは１０としてＰｊ０４０４株とＰｊ０９５７株を接種し、発酵開始４２．５時間後の培地中のグルコース濃度、Ｌ−乳酸濃度を調べた。糖濃度が１００ｇ／Ｌとした培地を使用した。液量は１５ｍＬとした。

Ｐｊ０４０４株についてＯＤ２の条件では８８．２ｇ／Ｌ、ＯＤ５の条件では９２．０ｇ／Ｌ、ＯＤ１０の条件では９３．０ｇ／Ｌ、Ｐｊ０９５７株についてＯＤ２の条件では９３．８ｇ／Ｌ、ＯＤ５の条件では９２．２ｇ／Ｌ、ＯＤ１０の条件では９２．８ｇ／Ｌとなった。このことから、初期ＯＤが１０よりも低い場合でも、発酵時間を長くすることにより、ＯＤ１０の条件とほぼ同程度の効率でＬ−乳酸を製造させることが可能となることが示された。

実施例５：ジャーファーメンターを利用した発酵試験
以下に示すとおり、Ｐｊ０９５７株の乳酸製造能の評価を実施した。培地中のエタノール濃度はＧＣあるいはＨＰＬＣを用いて、培地中のグルコース濃度およびＬ−乳酸濃度はワイエスアイジャパン社製バイオケミストリーアナライザー（ＢＡ）を用いて測定した。光学異性体の判別には、Ｊ．Ｋ．インターナショナル社製のＦ−キットＤ−乳酸／Ｌ−乳酸を用い、方法は添付のプロトコールに従った。その他の各種有機酸製造量はＨＰＬＣを用いて行った。分析に供した試料には、培養液を０．２２μｍのフィルターで事前に濾過したものを用いた。

ＹＰＤ寒天培地で２〜３日間３０℃で培養した酵母菌体から白金耳で１回かきとったペレット状の菌株を、１５ｍＬのチューブに入れた３ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種し、ＴＡＩＴＥＣ社製卓上培養装置により振幅３５ｍｍ、１３０ｒｐｍ、３０℃で６〜１５時間、前前々培養を行った。次に、前前培養として、培地として５０ｍＬのＹＰＤ液体培地を用い、前前々培養の菌体を、ＯＤ６００が約０．１になるよう新たな培地に接種したうえで１３０ｒｐｍ、３０℃で通常１２〜１８時間培養し、ＯＤ６００が１０〜２５を示す対数増殖期または定常期まで培養した。なお、この培養では坂口フラスコを用いた。発酵に供するための菌体を調製する前培養での条件としては、５Ｌ容量のジャーファーメンター（卓上型培養装置 Ｂｉｏｎｅｅｒ−Ｃ ５Ｌ（Ｓ）、丸菱バイオエンジ社製）にてＹＰＤ培地２．５Ｌに前々培養の菌体を全量接種し、４００ｒｐｍ、３０℃、１ｖｖｍにて２１〜２７時間培養した。この際、ＯＤ６００は通常１０〜２５を示した。そして、４℃、３，０００ｒｐｍ、５分間の条件で遠心分離によって集菌し、さらに上清を除した後、発酵に用いる培地（中和剤は含まない）で洗浄した。こうして得られた菌体を、１００〜１２０ｇ／Ｌのグルコースを含む液量２Ｌの培地に接種し、５Ｌ容量のジャーファーメンター（卓上型培養装置 Ｂｉｏｎｅｅｒ−Ｃ ５Ｌ（Ｓ）、丸菱バイオエンジ社製）にて発酵させた。なお、前培養により得た菌体を発酵のために接種する量は、ＯＤ６００が１０となるように植えた。本発酵試験にはＰｊ０９５７株を使用した。撹拌速度は２５０ｒｐｍ、温度は３５℃、通気量は１ｖｖｍとした。中和条件としては、発酵開始時に５％（ｗ／ｖ）の濃度になるように炭酸カルシウムを培地に加えた場合と、２．５Ｎの水酸化ナトリウムで発酵中のｐＨが５．５となるようにフィードバック制御するようにプログラムを組んだ場合を検討した。炭酸カルシウムを用いた際の結果は１回のみの試行から得た値であり、水酸化ナトリウムを用いた際の結果は独立に２回の試行から得た値の平均である。また、水酸化ナトリウムを使用した場合、発酵液の容量が大きく変化することから、添加された水酸化ナトリウムの量から培地量を測定した。本検討においては、ＨＰＬＣやＢＡなどの分析で得られる値は濃度であることから、その値に培地量を乗じた値、すなわち物質の総重量を求めた。

全糖換算率（％）とは、培地中のＬ−乳酸重量を培地中の初期グルコース重量で除し、さらに１００を乗じた値である。Ｌ−乳酸の光学純度（％）は、Ｌ−乳酸濃度の値を、Ｌ−乳酸濃度にＤ−乳酸濃度を加えた値で除し、さらに１００を乗じた値である。

中和剤として炭酸カルシウムを用いた試行において、発酵開始後２４時間までに複数回のサンプリングを実施した。培地中のグルコース量とＬ−乳酸量の経時変化を示す図を図１２に示した。

中和剤として水酸化ナトリウムを用いた試行において、発酵開始後２４時間までに複数回のサンプリングを実施した。培地中のグルコース量とＬ−乳酸量の経時変化を示す図を図１３Ａに示した（ｎ＝２）。

発酵開始後２４時間目の培地中のグルコース量、エタノール量、Ｌ−乳酸量、Ｄ−乳酸量、他の有機酸量、ｐＨを調べた。その結果を表５に記載する（ｎ＝２）。なお、２４時間後には、添加した炭酸カルシウムの粉末（固形物）は全く見られなかった。

炭酸カルシウムを用いた条件と水酸化ナトリウムを用いた条件では、２４時間後のＬ−乳酸の生成量には大きな違いはなかった。

炭酸カルシウムを５％（ｗ／ｖ）で加えた条件では、乳酸の濃度が約８０〜１００ｇ／Ｌまで高まると、３０℃や３５℃では乳酸カルシウムが析出し、さらには培地がゲル化した。菌体と乳酸塩が混合された状態でゲル化することから、当該事象によって、Ｌ−乳酸を精製する工程が煩雑になることが予想される。しかし、水酸化ナトリウムを使用する場合は、本現象を回避できると考えられることから、Ｌ−乳酸の精製方法によっては、水酸化ナトリウムを利用できることは、Ｌ−乳酸の製造工程において好ましい性質となりうる。

発酵開始後２４時間目においては、炭酸カルシウムよりも水酸化ナトリウムを用いた方が、Ｌ−乳酸の光学純度が高かった。

発酵開始後２４時間目においては、炭酸カルシウムよりも水酸化ナトリウムを用いた方が、副産物である酢酸量が低かった。

さらに、２回の独立した実験の結果を示す図１３Ａに加え、３回の独立した実験の結果を図１３Ｂに示す。図１３Ｂに示される実験データによれば、培養２４時間後の全糖換算率は９０．４±８．１％である。

実施例６：スクロースを単一糖源とした培地におけるＰｊ０９５７株のＬ−乳酸製造能の評価
以下に示すとおり、Ｐｊ０９５７株の乳酸製造能の評価を実施した。培地中のＬ−乳酸濃度はワイエスアイジャパン社製バイオケミストリーアナライザー（ＢＡ）を用いて測定した。光学異性体の判別には、Ｊ．Ｋ．インターナショナル社製のＦ−キットＤ−乳酸／Ｌ−乳酸を用い、方法は添付のプロトコールに従った。その他の各種有機酸製造量はＨＰＬＣを用いて行った。分析に供した試料には、培養液を０．２２μｍのフィルターで事前に濾過したものを用いた。各種データは、少なくとも３回、独立に試行した結果の平均値である。

ＹＰＤ寒天培地で２〜３日間３０℃で培養した酵母菌体から白金耳で１回かきとったペレット状の菌株を、１５ｍＬのチューブに入れた３ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種し、ＴＡＩＴＥＣ社製卓上培養装置により振幅３５ｍｍ、１３０ｒｐｍ、３０℃で２０〜３０時間、前々培養を行った。これをＯＤ６００が約０．１になるように、坂口フラスコに入った１００ｍＬのＹＰＤ培地に接種し、ＴＡＩＴＥＣ社製卓上培養装置により振幅３５ｍｍ、１３０ｒｐｍ、３０℃で通常１５〜２２時間、前培養を行った。そして４℃、３，０００ｒｐｍ、５分間の条件で遠心分離によって集菌し、さらに上清を除した後、発酵に用いる培地（中和剤は含まない）で洗浄した。

こうして得られた菌体を、バッフル付きの１００ｍＬ三角フラスコに入った１００ｇ／Ｌのスクロースを含む液量１５ｍＬの培地に接種し、ＴＡＩＴＥＣ社製卓上培養装置により振幅３５ｍｍ、８０ｒｐｍ、３５℃で発酵させた。前培養により得た菌体を発酵のために接種する量は、特に記述がない場合、ＯＤ６００が１０となるように植えた。特記しない限り、中和剤として４．５％（ｗ／ｖ）の濃度になるように炭酸カルシウムを培地に加えた。発酵時の温度は３０℃、あるいは３５℃とした。培地には上記濃度のスクロースの他に１０ｇ／Ｌの酵母エキスと２０ｇ／Ｌのペプトンを加えており、この組成の培地を以降はＹＰＳｕｃ１０培地と記載する。

全糖換算率（％）を、培地中のＬ−乳酸重量を培地中の初期スクロース重量で除し、さらに（３４２／３６０）と１００を乗じた値である。Ｌ−乳酸の光学純度（％）は、Ｌ−乳酸濃度の値を、Ｌ−乳酸濃度にＤ−乳酸濃度を加えた値で除し、さらに１００を乗じた値である。

その結果、３３時間後のＬ−乳酸製造量について、その全糖換算率は９４．８±３．５％であり、Ｌ−乳酸の光学純度は９９．９％を超えていた。ＨＰＬＣでエタノール濃度の定量を行ったところ、エタノール濃度は検出限界未満（０．０１ｇ／Ｌ未満）であった。

配列番号３６のうち、１３番目のaから１０１１番目のa（２つの翻訳終了コドンのうち、上流域のＴＧＡ）までのヌクレオチド配列（コドン最適化配列）と配列番号３８で表される配列（ウシ由来の野生型配列）のアライメントを示す図である。 プラスミドｐＣＵ５６３の構造を示す図である。 プラスミドｐＣＵ５９５の構造を示す図である。 ＣｕＵＲＡ３遺伝子の破壊に利用したプライマーのアニーリング部位を示す図である。 ＩＭ−６３（配列番号５８）とＩＭ−９２（配列番号５９）をプライマーとしてＰＣＲを行った結果を示す図である。それぞれの鋳型ＤＮＡとしては、ＮＢＲＣ０９８８株（レーン１）、ＮＢＲＣ０９８８株由来のＣｕＵＲＡ３遺伝子が１コピー破壊されたＨｙｇｒかつＧ４１８ｓ株（レーン２）、ｐＣＵ５９５を有するＨｙｇｓかつＧ４１８ｒのＣｕＵＲＡ３遺伝子が１コピー破壊された株（レーン３）、ｐＣＵ５９５が脱落したＣｕＵＲＡ３遺伝子が１コピー破壊されたＨｙｇｓかつＧ４１８ｓの株（レーン４）である。なお、ＭはＬａｍｄａＤＮＡをＳｔｙＩで消化したＤＮＡである。 ＩＭ−６３（配列番号５８）とＩＭ−２２３（配列番号６０）をプライマーとしてＰＣＲを行った結果を示す図である。それぞれの鋳型ＤＮＡとしては、ＮＢＲＣ０９８８株（レーン１）、ＮＢＲＣ０９８８株由来のＣｕＵＲＡ３遺伝子が１コピー破壊されたＨｙｇｒかつＧ４１８ｓ株（レーン２）、ｐＣＵ５９５を有するＨｙｇｓかつＧ４１８ｒのＣｕＵＲＡ３遺伝子が１コピー破壊された株（レーン３）、ｐＣＵ５９５が脱落したＣｕＵＲＡ３遺伝子が１コピー破壊されたＨｙｇｓかつＧ４１８ｓの株（レーン４）である。なお、ＭはＬａｍｄａＤＮＡをＳｔｙＩで消化したＤＮＡである。 ＮＢＲＣ０９８８株、およびＮＢＲＣ０９８８株を宿主としたＣｕＵＲＡ３遺伝子破壊株の非選択培地、および選択培地での生育能を示す図である。 キャンディダ・ユティリスにＰＤＣ遺伝子が何種類あるかを調べるためのサザンハイブリダイゼーション法による解析結果を示す図である。レーン１はサッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃから抽出したゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化した試料である。その他のレーンはキャンディダ・ユティリスＮＢＲＣ０９８８株から抽出したゲノムＤＮＡをＸｂａＩ（レーン２）、ＨｉｎｄＩＩＩ（レーン３）、ＢｇｌＩＩ（レーン４）、ＥｃｏＲＩ（レーン５）、ＢａｍＨＩ（レーン６）、ＰｓｔＩ（レーン７）で消化した試料である。プライマーＩＫＳＭ−２９（配列番号１）とＩＫＳＭ−３０（配列番号２）を作製し、ＮＢＲＣ０９８８株のゲノムを鋳型としたＰＣＲを行うことによって増幅された約２２０ｂｐのＤＮＡ断片（配列番号３）をプローブＤＮＡとして利用した。 ＣｕＰＤＣ１遺伝子の破壊に利用したプライマーのアニーリング部位を示す図である。 プラスミドｐＣＵ６８１の構造を示す図である。 Ｐｊ０４０４株およびＰｊ０９５７株について、発酵開始４時間後から１３時間後までの培地中のＬ−乳酸濃度の経時変化を示す図である。 中和剤として炭酸カルシウムを用いた試行において、発酵開始後２４時間までに複数回のサンプリングを実施した。培地中のグルコース量とＬ−乳酸量の経時変化を示す図である。 中和剤として水酸化ナトリウムを用いた試行において、発酵開始後２４時間までに複数回のサンプリングを実施した。培地中のグルコース量とＬ−乳酸量の経時変化を示す図である（ｎ＝２）。 中和剤として水酸化ナトリウムを用いた試行において、発酵開始後２４時間までに複数回のサンプリングを実施した。培地中のグルコース量とＬ−乳酸量の経時変化を示す図である（ｎ＝３）。

Claims (10)

1. 乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードしている遺伝子の発現を可能にするプロモーター配列が機能的に結合した該遺伝子の少なくとも１コピーにより形質転換されてなる、キャンディダ・ユティリスの酵母菌株。
2. ピルビン酸脱炭酸酵素の活性を有するポリペプチドをコードしている内因性遺伝子が破壊されている、請求項１に記載の酵母菌株。
3. ピルビン酸脱炭酸酵素の活性を有するポリペプチドをコードしている内因性遺伝子が、選択マーカー配列の挿入による該遺伝子の欠失によって破壊されている、請求項１に記載の酵母菌株。
4. プロモーター配列および該プロモーター配列の制御下にある乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列を含有する発現ベクターによって形質転換されてなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵母菌株。
5. 乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドが、
   （ａ）配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
   （ｂ）配列番号３７で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチド
   である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵母菌株。
6. 乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードしている遺伝子が、
   （ａ）配列番号３６のうち、１３番目のaから１，０１１番目のaまでのヌクレオチド配列、または
   （ｂ）配列番号３６のうち、１３番目のaから１，０１１番目のaまでのヌクレオチド配列と８５％以上の相同性があり、かつ乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
   （ｃ）配列番号３６のうち、１３番目のaから１，０１１番目のaまでのヌクレオチド配列もしくはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ乳酸脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
   を含むものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵母菌株。
7. ピルビン酸脱炭酸酵素の活性を有するポリペプチドをコードしている内因性遺伝子が、配列番号６４で表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、または配列番号６３で表されるヌクレオチド配列を含むものである、請求項２〜４のいずれか一項に記載の酵母菌株。
8. プロモーター配列が、ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする内因性遺伝子のプロモーター部分であるか、または配列番号３で表されるヌクレオチド配列を含むものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵母菌株。
9. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の酵母菌株を培養することを含んでなる、乳酸を製造する方法。
10. 酵母菌株の培養において、発酵培養初期の菌体のＯＤ６００が１〜３０である、請求項９に記載の方法。