TWI730383B - 重組型假絲酵母菌菌株及其製備方法與用途 - Google Patents

重組型假絲酵母菌菌株及其製備方法與用途 Download PDF

Info

Publication number
TWI730383B
TWI730383B TW108129823A TW108129823A TWI730383B TW I730383 B TWI730383 B TW I730383B TW 108129823 A TW108129823 A TW 108129823A TW 108129823 A TW108129823 A TW 108129823A TW I730383 B TWI730383 B TW I730383B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
candida
lactic acid
fermentation
sequence
protein
Prior art date
Application number
TW108129823A
Other languages
English (en)
Other versions
TW202108755A (zh
Inventor
王楚鈞
莊育泉
施淑銀
張玴群
Original Assignee
遠東新世紀股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 遠東新世紀股份有限公司 filed Critical 遠東新世紀股份有限公司
Priority to TW108129823A priority Critical patent/TWI730383B/zh
Priority to CN201910966090.2A priority patent/CN112410233B/zh
Priority to US16/745,983 priority patent/US11667923B2/en
Publication of TW202108755A publication Critical patent/TW202108755A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI730383B publication Critical patent/TWI730383B/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/905—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01028—D-Lactate dehydrogenase (1.1.1.28)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/165—Yeast isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/72—Candida
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01001—Pyruvate decarboxylase (4.1.1.1)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明揭示一種重組型假絲酵母菌菌株暨其製備方法。本發明亦揭示使用該重組型假絲酵母菌菌株來產生D-乳酸的方法。

Description

重組型假絲酵母菌菌株及其製備方法與用途
本發明是有關於一種重組型假絲酵母菌菌株暨其製備方法。本發明亦有關於使用該重組型假絲酵母菌菌株來產生D-乳酸的方法。
乳酸(lactic acid)具有D-乳酸(D-lactic acid)(亦被稱為右旋乳酸)與L-乳酸(L-lactic acid)(亦被稱為左旋乳酸)這兩種立體異構物(stereoisomer)，它們被廣泛地應用於食品、化妝品(cosmetic)、藥品(pharmaceutical)以及化學工業(chemical industry)，因而已被視為是一種具有發展價值的化合物。特別地，在化學工業中，經常藉由調控D-乳酸與L-乳酸各自聚合而成的聚右乳酸(poly-D-lactic acid, PDLA)與聚左乳酸(poly-L-lactic acid, PLLA)的比例來合成出具有不同性質[熱化學性質(thermochemical properties)、物理性質(physical properties)以及生物降解率(biodegradation rate)]的生物可降解塑膠(biodegradable plastics)，以因應不同需求。因此，如何大量地生產單一種類的乳酸立體異構物已逐漸成為本技術領域的研究人員所關注與研究的重點。
目前已有許多研究是藉由對酵母菌進行基因修飾(gene modification)來使其具有生產單一種類的乳酸立體異構物的能力。例如，EP 1513923 B1揭示對馬克斯克魯維酵母菌(Kluyveromyces marxianus ) CD21菌株進行內生性pdc1 基因[其編碼丙酮酸去羧酶1 (pyruvate decarboxylase 1, PDC1)]的刪除以及外源性d-ldh 基因[其編碼D-乳酸去氫酶(D-lactate dehydrogenase, D-LDH)]的導入而得到一會表現d-ldh 基因的Δpdc1 重組型馬克斯克魯維酵母菌。該重組型馬克斯克魯維酵母菌在一具有葡萄糖與CaCO3 的培養條件下歷經54小時的發酵，可以達到92-95%的D-乳酸產率(以單位重量的葡萄糖所產生之乳酸重量來計算)。
US 2012/0058529 A1揭示對一具有優異的碳同化作用(carbon assimilation)的高蛋白假絲酵母菌(Candida utilis )進行基因修飾而得到一具有生產L-乳酸之能力的菌株。該基因修飾的步驟包括先藉由使用Cre-lox系統來對該高蛋白假絲酵母菌進行內生性pdc 基因的多次破壞，而得到一內生性pdc 基因完全被剔除的Cu8402g菌株，接著，同樣藉由使用Cre-lox系統對Cu8402g菌株進行外源性l-ldh 基因[其編碼L-乳酸去氫酶(L-lactate dehydrogenase, L-LDH)]的多次導入，而得到一表現外源性l-ldh 基因且內生性pdc 基因完全被剔除的Pj0957菌株。Pj0957菌株經由實驗而被證實具有良好的L-乳酸生產能力。但由於高蛋白假絲酵母菌為多套染色體(hyperploid)而帶有四個內生性pdc 基因的複本，因此，使用Cre-lox系統的基因修飾時，需要進行多次的轉形，才可使pdc 基因完全被剔除。
另外，為了進一步提高上述基因修飾的效率，已有研究是利用CRISPR/Cas9系統的技術來達到一次性刪除或插入多個目標基因的效用。例如，在Ozaki A.et al . (2017),Metab. Eng. Commun ., 5：60-67中，Ozaki A.等人使用CRISPR/Cas9系統來對裂殖性酵母菌(Saccharomyces pombe ) FY12804菌株進行多個基因的置換與破壞，包括將eutE 基因與mhpF 基因分別導入至pdc101 基因位置與pdc202 基因位置、將d-ldh 基因導入至gpd2 基因位置，以及刪除l-ldh 基因與adh SPBC337.11 基因，所得到的裂殖性酵母菌轉形株ATR5-LA1在葡萄糖的存在下歷經55小時的發酵，僅可達到33%的D-乳酸產率(以單位重量的葡萄糖所產生之乳酸重量來計算)。Ozaki A.等人進一步將d-ldh 基因導入至該裂殖性酵母菌轉形株ATR5-LA1的adh8 基因位置，而所得到的裂殖性酵母菌轉形株ATR5-LA2在歷經55小時的發酵，則可以達到71%的D-乳酸產率。
然而，這些先前研究因需要較長的發酵時間才可達致較高的D-乳酸產率而提高了所需的成本，不敷產業上的實際應用。因此，若能利用CRISPR/Cas9系統並使用特定的導引RNA (guide RNA)來製備出一能夠在短時間內生產大量D-乳酸的重組型假絲酵母菌菌株以供產業界之所需，會是吾人所企望達成的。
發明概要
於是，在第一個方面，本發明提供一種用於製備一具有D-乳酸生產能力的重組型假絲酵母菌菌株的方法，該方法包括： 將一CRISPR/Cas9系統導入至一親代假絲酵母菌細胞中，而使得該親代假絲酵母菌細胞的一內生性pdc 基因的所有複本皆被置換為外源性d -ldh 基因，其中該CRISPR/Cas9系統包含有： (a)  一導引RNA (guide RNA)，其包含有一選自於由下列所構成的群組中的導引序列(guide sequence)：序列辨識編號:22、序列辨識編號:23、序列辨識編號:24以及序列辨識編號:25； (b) 一Cas9蛋白質；以及 (c)  一同源重組片段(homologous recombination fragment)，沿一轉錄方向依序地包含有：一5’同源臂(5' homology arm)、該外源性d -ldh 基因以及一3’同源臂(3' homology arm)，其中，該5’同源臂具有一對應於pdc 基因的上游至少100 bp的序列，該3’同源臂具有一對應於pdc 基因的下游至少100 bp的序列。
在第二個方面，本發明提供一種重組型假絲酵母菌菌株，它是藉由使用一如上所述的方法而被生成。
在第三個方面，本發明提供一種重組型高蛋白假絲酵母菌轉形株D813，它以寄存編號BCRC 920114被寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心。
在第四個方面，本發明提供一種從一含有可發酵糖的基質中來產生D-乳酸的方法，其包含以一如上所述的重組型高蛋白假絲酵母菌轉形株D813來對該基質進行發酵。
發明的詳細說明
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。為表清楚，下面的界定被使用於本文中。
如本文中所使用的，“核酸”、“核酸序列”或“核苷酸序列”等術語意指呈單股或雙股形式的去氧核糖核苷酸序列或核糖核苷酸序列，且當中包含有已知的天然存在的核苷酸(naturally occurring nucleotides)或人造化學仿效物(artificial chemical mimics)。如本文中所使用的，“核酸”此術語可與“基因”、“DNA”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“聚核苷酸”交換使用。
如本文中所使用的，術語“核酸片段”與“DNA片段”可被互換地使用，並且意指一種DNA聚合物(DNA polymer)，該DNA聚合物是呈一獨立節段(separate segment)的形式或者是作為一較大的DNA建構物(DNA construct)的一組分(component)，其可以是衍生自經分離的DNA (isolated DNA)或是藉由本技術領域中所熟知的方法而被化學地或酵素地合成。
除非另有指明，一核酸序列除了於本文中所揭示的特定序列外，亦涵蓋其互補序列(complementary sequences)，以及它們的守恆性類似物(conservative analogs)、相關的自然存在的結構變異體和/或合成的非天然存在的類似物。
如本文中所使用的，術語“轉形(transformation)”與術語“轉染(transfection)”可被交替地使用，並且泛指將一外源性核酸分子引入一選定的宿主細胞內的方式。依據本技藝中已知的技術，一核酸分子(例如，一重組型DNA建構物或一重組型載體)可藉由多種方式而被引入至一選定的宿主細胞內，例如磷酸鈣或氯化鈣媒介的轉染作用(transfection)、電穿孔法(electroporation)、微注射法(microinjection)、粒子撞擊法(particle bombardment)、脂質體媒介的轉染作用(liposome-mediated transfection)、利用細菌噬菌體的轉染作用或其他方法。
如本文中所使用的，“細胞”、“宿主細胞(host cell)”、“轉形宿主細胞(transformed host cell)”與“重組型宿主細胞(recombinant host cell)”等術語可被交替地使用，而且不僅指特定的個體細胞(individual cells)還包括其繼代培養的子代(sub-cultured offsprings)或可能的子代(potential offsprings)。繼代培養的子代細胞可能在後續世代中因為突變作用或環境影響而包括特定的遺傳修飾(genetic modification)，而致使子代細胞事實上可能與母細胞並不完全一致，但子代細胞仍被涵蓋在本文中所用的術語的範疇內。
如本文中所使用的，術語“親代假絲酵母菌細胞(parentCandida cell)”與“假絲酵母菌母株(Candida mother strain)”可被交替地使用，並且意指一被使用來進行一或多個基因修飾處理的假絲酵母菌細胞。適用於本發明的親代假絲酵母菌細胞可以是未轉形的細胞(non-transformed cells)，或是已被至少一種其它重組型核酸序列轉形的細胞(transformed cells)。
依據本發明，適用於本發明的親代假絲酵母菌細胞包括，但不限於，源自於下列的細胞：高蛋白假絲酵母菌(Candida utilis )、博伊丁假絲酵母(Candida boidinii )、熱帶念珠菌(Candida tropicalis )以及近平滑念珠菌(Candida parapsilosis )。在本發明的一個較佳具體例中，該親代假絲酵母菌細胞是高蛋白假絲酵母菌。
本發明提供一種用於製備一具有D-乳酸生產能力的重組型假絲酵母菌菌株的方法，該方法包括： 將一CRISPR/Cas9系統導入至一親代假絲酵母菌細胞中，而使得該親代假絲酵母菌細胞的一內生性pdc 基因的所有複本皆被置換為外源性d -ldh 基因，其中該CRISPR/Cas9系統包含有： (a)  一導引RNA (guide RNA)，其包含有一選自於由下列所構成的群組中的導引序列(guide sequence)：序列辨識編號:22、序列辨識編號:23、序列辨識編號:24以及序列辨識編號:25； (b) 一Cas9蛋白質；以及 (c)  一同源重組片段(homologous recombination fragment)，沿一轉錄方向依序地包含有：一5’同源臂(5' homology arm)、該外源性d -ldh 基因以及一3’同源臂(3' homology arm)，其中，該5’同源臂具有一對應於pdc 基因的上游至少100 bp的序列，該3’同源臂具有一對應於pdc 基因的下游至少100 bp的序列。
較佳地，該內生性pdc 基因具有多個複本。在本發明的一個較佳具體例中，該內生性pdc 基因具有四個複本。
在本發明的一個較佳具體例中，該親代假絲酵母菌細胞是高蛋白假絲酵母菌BCRC 20325。
如本文中所使用的，術語“導引RNA (guide RNA, gRNA)”意指一在CRISPR/Cas9系統中將一CRISPR蛋白質(例如，Cas9或Cas9相關的多肽)標靶至一目標DNA內的一特定位置來進行基因編輯(gene editing)的RNA分子，其包含有：一導引序列，它含有一與該目標DNA互補的核苷酸序列；一tracr序列(tracr sequence)，它作用於與該CRISPR蛋白質結合，亦被稱為轉錄-活化的crRNA (trans-activating crRNA, tracrRNA)；以及一tracr-配對序列(tracr-mate sequence)，它融合至該導引序列之3’端[這兩個序列一起被稱為CRISPR RNA (crRNA)]，並且可與該tracrRNA雜交。該crRNA與該tracrRNA可以是呈分開(separate)的兩個RNA分子，或是被融合成一個單一的RNA分子[亦被稱為單一導引RNA (single guide RNA, sgRNA)]。
依據本發明，該tracr序列的選用可以是自行設計的，或者是商業上可購得的產品，例如，Edit-R tracrRNA (廠牌為Dharmacon，貨號為U-002005-20)、Alt-R™ CRISPR tracrRNA (廠牌為Integrated DNA Technologies，貨號為1072532)以及SygRNA® SpCas9 tracrRNA (廠牌為Merck，貨號為TRACRRNA05N-5NMOL)。該tracr-配對序列的選用則視所採用的tracr序列而定。在本發明的一個較佳具體例中，該tracr序列是Edit-R tracrRNA。
在本發明的一個較佳具體例中，該CRISPR/Cas9系統包含有一第一導引RNA與一第二導引RNA，該第一導引RNA包含有序列辨識編號:22所示的導引序列以及該第二導引RNA包含有序列辨識編號:25所示的導引序列。
依據本發明，該CRISPR/Cas9系統的導入可以採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行。
可瞭解到的是，有關該CRISPR/Cas9系統的操作條件會進一步隨著所使用的導引RNA、CRISPR蛋白質以及所欲表現的外源性基因的種類與用量比例等因素而被變動，以便達致最佳的基因修飾(gene modification)效果。而這些操作條件的選擇是熟習此項技藝者能例行性地自行決定的。
依據本發明，該同源重組片段中的5’同源臂、外源性d -ldh 基因以及3’同源臂的核酸序列分別是藉由使用熟習此項技藝者所熟知且慣用的DNA選殖(DNA cloning)或基因合成(gene synthesis)的相關技術而被選殖或合成。參見，例如，US 20120058529 A1以及US 20160177321 A1等。
較佳地，該5’同源臂具有一對應於pdc 基因的上游100 bp至2,000 bp範圍內的序列。在本發明的一個較佳具體例中，該5’同源臂具有一如序列辨識編號:16所示的序列。
較佳地，該3’同源臂具有一對應於pdc 基因的下游100 bp至2,000 bp範圍內的序列。在本發明的一個較佳具體例中，該3’同源臂具有一如序列辨識編號:19所示的序列。
依據本發明，適用於本發明的d-ldh 基因是源自於：腸膜明串珠菌腸膜亞種(Leuconostoc mesenteroides subsp.Mesenteroides )、胚芽乳桿菌(Lactobacillus plantarum )、戴白氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus )、紅麵包黴菌(Neurospora crassa )、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus )以及乳酸乳球菌(Lactococcus lactis )。在本發明的一個較佳具體例中，該d-ldh 基因是源自於腸膜明串珠菌腸膜亞種。
在本發明的一個較佳具體例中，該d-ldh 基因具有一如序列辨識編號:1所示的序列。
本發明亦提供一種重組型假絲酵母菌菌株，它是藉由使用一如上所述的方法而被生成。
在本發明的一個較佳具體例中，該重組型假絲酵母菌菌株為一寄存編號為BCRC 920114 (寄存於BCRC)或者CCTCC M 2019431 (寄存於CCTCC)的重組型高蛋白假絲酵母菌轉形株D813。
本發明亦提供一種從一含有可發酵糖的基質中來產生D-乳酸的方法，其包含以一如上所述的重組型高蛋白假絲酵母菌轉形株D813來對該基質進行發酵。
依據本發明，該含有可發酵糖的基質可以是一糖液或纖維素水解液(cellulosic hydrolysate)。
依據本發明，該纖維素水解液是藉由對一纖維素生質(cellulosic biomass)依序地進行一前處理及一水解處理而被製得。
如本文中所使用的，術語“纖維素水解液”與“木質纖維素水解液(lignocellulosic hydrolysate)”和“生質水解液(biomass hydrolysate)”係可被交替地使用，並且意指由生質之糖化(saccharification)所產生的產物。
依據本發明，該可發酵糖是選自於由下列所構成的群組：葡萄糖、蔗糖、果糖(fructose)、阿拉伯糖(arabinose)、半乳糖(galactose)、甘露糖(mannose)、纖維雙糖(cellobiose)，以及它們的組合。
在本發明的一個較佳具體例中，該含有可發酵糖的基質是一含有葡萄糖的糖液，當使用本發明的重組型假絲酵母菌菌株來對該含有葡萄糖的糖液進行發酵時，可得到一至少約為82.5%的D-乳酸產率；較佳地，可得到一至少約為90%的D-乳酸產率；更佳地，可得到一約為97.2%的D-乳酸產率。
在本發明的另一個較佳具體例中，該含有可發酵糖的基質是一含有蔗糖的糖液，當使用本發明的重組型假絲酵母菌菌株來對該含有蔗糖的糖液進行發酵時，可得到一至少約為86.56%的D-乳酸產率；較佳地，可得到一至少約為90%的D-乳酸產率；更佳地，可得到一約為94.32%的D-乳酸產率。
依據本發明，在該發酵之前或在該發酵的期間，該基質可進一步被添加以一選自於由下列所構成之群組中的中和劑，而使得該基質的pH值在該發酵的期間被維持在5至7的範圍內：CaCO3 、NH4 OH、NaOH，以及它們的組合。較佳地，在該發酵的期間，對該基質添加以45 g/L CaCO3 ，而使得該基質的pH值在該發酵的期間被維持在pH 6。
依據本發明，該發酵是在一範圍落在25℃至37℃的溫度下被進行歷時18至60小時。
較佳地，該發酵是在30℃下被進行歷時48小時。
較佳地，該發酵是在35℃下被進行歷時22小時。更佳地，該發酵是在35℃下被進行歷時26小時。
依據本發明，該發酵是在一範圍落在0.1 vvm至1 vvm的通氣量下被進行。較佳地，該發酵是在一範圍落在0.5 vvm至1 vvm的通氣量下被進行。更佳地，該發酵是在1 vvm的通氣量下被進行。
較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。實施例 一般實驗材料： 1.  下面實施例中被使用來進行聚合酶鏈反應的引子(primers)是委託明欣生物科技有限公司來代為合成。 2.  在下面的實施例中，所使用到的高蛋白假絲酵母菌(Candida utilis )是購自於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute, FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center, BCRC)(300新竹市食品路331號，台灣)，其包括： (1)      高蛋白假絲酵母菌BCRC 20325 (對應於ATCC 9950)； (2)      高蛋白假絲酵母菌BCRC 21691 (對應於ATCC 36178)；以及 (3)      高蛋白假絲酵母菌BCRC 21645 (對應於DSM 70163)。 3.  在下面實施例中所使用的葡萄糖、蛋白腖以及酵母萃取物分別是購自於景明化工股份有限公司(Echo Chemical Co., LTD)、上鼎生技有限公司(ST BIO, INC.)以及精展生物科技有限公司(Genezyme biotech)。 4.  在下面實施例中所使用的CaCO3 、NH4 OH以及NaOH皆購自於Sigma-Aldrich。 一般實驗方法： 1.  除非另有指明，在本發明中所採用的實驗方法是使用本領域中熟悉此項技術人士所詳知的技術或者依據製造商所提供的操作指南來進行，例如下列DNA選殖(DNA cloning)的相關技術：基因組DNA的萃取(extraction of genomic DNA)、使用限制酶的DNA切割反應(DNA cleavage reaction by restriction enzymes)、使用T4 DNA接合酶的DNA接合反應(DNA ligation with T4 DNA ligase)以及瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)。 2.  聚合酶鏈反應(PCR)：
在下面實施例中所使用的PCR是藉由使用KOD DNA聚合酶(KOD DNA polymerase)(台灣默克股份有限公司)並依照製造商所提供的操作指南來進行。 3.  高效能液相層析(high performance liquid chromatography, HPLC)分析：
在下面的實施例中，被拿來進行HPLC分析的待測樣品中所含有的D-乳酸及其濃度(g/L)是藉由使用一配備有一個DAD-3000 UV偵測器(DAD-3000 UV detector)的HPLC儀器(DIONEX Ultimate 3000)來進行測定，其中所使用的管柱以及操作條件如下：分析管柱為SUMICHIRAL OA-6000管柱，溫度設定為38℃；流動相：2 mM CuSO4 / 5%乙腈(acetonitrile)；流速被控制為0.8 mL/分鐘；樣品注射體積為20 μL；以及偵測波長為UV-254 nm。
此外，為供比對，使用不同濃度的D-乳酸(0.5至12 mg/mL)(購自於Sigma-Aldrich)來分別作為對照標準品(control standard)並進行相同的分析。實施例1. 具有D- 乳酸生產能力的高蛋白假絲酵母菌轉形株的製備與篩選
為了得到一能夠表現外源性d- ldh 基因且全套內生性pdc 基因完全被剔除的轉形株，申請人構築一帶有d-ldh 基因的同源重組片段(homologous recombination fragment)，接著使用CRISPR/Cas9系統的技術來進行同源重組，以將高蛋白假絲酵母菌的基因體內的pdc 基因[其編碼丙酮酸去羧酶(pyruvate decarboxylase , PDC)]置換為d- ldh 基因[其編碼D-乳酸去氫酶(D-lactate dehydrogenase, D-LDH)]。 實驗材料： 1.       勝任高蛋白假絲酵母菌細胞的製備(preparation of competentCandida utilis cells)：
首先，將高蛋白假絲酵母菌BCRC 20325、21691以及21645分別接種至如下面表1中所示的YPD20培養基中，並於30℃下以200 rpm進行震盪培養直到該培養物的OD600 值達至1.3-1.5 (約0.32 g菌體/L)。 表1. YPD20培養基的配方
成分 濃度(g/L)
葡萄糖 20
酵母萃取物 10
蛋白腖 20
餘量為去離子水
接著，將適量的培養物吸取至無菌離心管中，繼而於4℃下以6,000 g來進行離心歷時6分鐘。之後，倒除上澄液並加入10 mL的轉形溶液(transformation solution)[含有100 mM乙酸鋰(lithium acetate, LiAc)、10 mM Tris-HCl以及1 mM EDTA]以充份懸浮菌體，並於30℃下以200 rpm進行震盪培養歷時1小時，然後加入1 mL的1 M DTT並繼續進行震盪培養歷時30分鐘，繼而在4℃下以6,000 g來進行離心歷時6分鐘，接著，倒除上澄液並加入20 mL的冰冷二次水(ddH2 O)以充份懸浮菌體，繼而在4℃下以6,000 g來進行離心歷時6分鐘，然後倒除上澄液並加入15 mL的冰冷二次水以充份懸浮菌體，繼而在4℃下以6,000 g來進行離心歷時6分鐘。
之後，倒除上澄液並加入1 mL的冰冷山梨糖醇(sorbitol)(1 M)以充份懸浮菌體，繼而在4℃下以6,000 g來進行離心歷時6分鐘，然後倒除上澄液並加入80 μL的冰冷山梨糖醇(1 M)以充份懸浮菌體，藉此而得到3種含有經山梨糖醇處理的勝任高蛋白假絲酵母菌細胞(sorbitol-treated competentCandida utilis cell)的懸浮液。最後，將所得到的3種含有勝任高蛋白假絲酵母菌細胞的懸浮液分裝至微量離心管(每管約70 μL)並且保存於-80℃下備用。 實驗方法： A、 最適化 d-ldh 基因的基因合成 (gene synthesis) ：
首先，為了得到一可在高蛋白假絲酵母菌中表現的最適化d-ldh 基因，申請人將腸膜明串珠菌腸膜亞種(Leuconostoc mesenteroides subsp.Mesenteroides )的d- ldh 基因的完整編碼序列(complete coding sequence)(GenBank登錄編號：AB233384.1)作鹼基的最適化調整，藉此而得到一如序列辨識編號：1所示之最適化d-ldh 基因的核苷酸序列(996 bp)。該最適化d-ldh 基因的核苷酸序列是委託明欣生物科技有限公司來進行合成。接著，以所得到的合成產物作為模板，藉由使用1組具有如下所示之核苷酸序列的引子對(其中底線表示限制酶切割位址)並依據上面“一般實驗方法”的第2項「聚合酶鏈反應」當中所述的方法來進行PCR，藉此而得到一帶有最適化d-ldh 基因的核苷酸序列以及Pac I/Sal I切割位址的PCR產物A1 (1,022 bp)。 前向引子D-LDH-PacI-F 5’-gataccttaattaa atgaagatttttgcttac-3’     (序列辨識編號：2)Pac I 反向引子D-LDH-SalI-R 5’-ttgcaggtcgac ttaatattcaacagcaatagctg-3’Sal I                                    (序列辨識編號：3)B、 分別選殖 PGK 終結子 (PGK terminator) 、 PGK 啟動子 (PGK promoter) 以及 GAP 終結子 ( GAP terminator) 片段 ：
有關PGK終結子、PGK啟動子以及GAP終結子的選殖大體上是參考US 20120058529 A1當中所述的方法而被進行。簡言之，申請人取適量之高蛋白假絲酵母菌BCRC 20325的培養物並使用UniversAll™組織萃取緩衝液來進行基因組DNA的萃取，繼而以所得到的基因組DNA作為模板，並且分別使用針對PGK終結子、PGK啟動子以及GAP終結子所設計出之具有如下面表2中所示之3組引子對並依據上面“一般實驗方法”的第2項「聚合酶鏈反應」當中所述的方法來進行PCR，藉此而擴增出一帶有PGK終結子以及Sal I/Not I切割位址的PCR產物A2 (906 bp)、一帶有PGK啟動子以及Not I/Kpn I切割位址的PCR產物A3 (1,406 bp)以及一帶有GAP終結子以及Bam HI/Bsi WI切割位址的PCR產物A4 (859 bp)。 表2. 被設計用於擴增PGK終結子、PGK啟動子以及GAP終結子的引子對
目標DNA片段 核苷酸序列(5’→3’) PCR產物 大小(bp)
PGK終結子 (序列辨識編號：4) 前向引子PGKt-SalI-FSal I tattaagtcgac ctgcaagctactttgtaattaaac     (序列辨識編號：5) 906
反向引子PGKt-NotI-RNot I acggtagcggccgc gaattcaacatgaatgacacg (序列辨識編號：6)
PGK啟動子 (序列辨識編號：7) 前向引子PGKp-NotI-FNot I gaattcgcggccgc taccgttcgtatagcatacattatacgaagttat aagcttttgtcttttaggagccttc                                       (序列辨識編號：8) 1,406
反向引子PGKp-KpnI-RKpn I acccatggtacc ctttatccgccagtatgttag         (序列辨識編號：9)
GAP終結子 (序列辨識編號：10) 前向引子GAPt-BamHI-FBam HI ttctaaggatcc attgtatgacttttatttatg           (序列辨識編號：11) 859
反向引子GAPt-BsiWI-RBsi WI ttccttcgtacg taccgttcgtataatgtatgctatacgaagttat acgtgtaatacctcaggagtcagtag                                       (序列辨識編號：12)
註：位於引子內的限制酶切割位址是如底線所標示者，斜體字表示loxp序列。C、 選殖 KanMX 片段：
有關KanMX片段的選殖大體上是參照US 20160177321 A1當中所述的方法而被進行。簡言之，以pFA6a-link-yEGFP-Kan載體作為模板，並且使用1組針對該載體中所含之KanMX抗性基因(序列辨識編號：13)所設計出之具有如下所示之核苷酸序列的引子對(其中底線表示限制酶切割位址)並依據上面“一般實驗方法”的第2項「聚合酶鏈反應」當中所述的方法來進行PCR，藉此而擴增出一帶有KanMX片段以及Kpn I/Bam HI切割位址的PCR產物A5 (834 bp)。 前向引子KanMX-KpnI-F 5’-ataaagggtacc atgggtaaggaaaagac-3’     (序列辨識編號：14)Kpn I 反向引子KanMX-BamHI-R 5’-tacaatggatcc ttagaaaaactcatcgag-3’      (序列辨識編號：15)Bam HID、 分別選殖 PDC1 啟動子 以及 PDC1 終結子 片段 ：
首先，為了選殖出高蛋白假絲酵母菌BCRC 20325的pdc1 基因的啟動子(下稱PDC1啟動子)與終結子(下稱PDC1終結子)(分別對應於NCBI登錄編號AB489119.1當中所示的核苷酸殘基位置1660至2246處與4192至4701處)，申請人分別設計出如下面表3中所示之2組引子對。 表3. 被設計用於擴增PDC1啟動子與PDC1終結子的引子對
目標DNA片段 引子的核苷酸序列(5’→3’) PCR產物大小(bp)
PDC1啟動子 (序列辨識編號：16) 前向引子PDC1p-ApaI-FApa I acatgtgggccc attgcacaccgcacgtctg          (序列辨識編號：17) 613
反向引子PDC1p-PacI-RPac I caacatttaattaa ggtatcgattgttttag               (序列辨識編號：18)
PDC1終結子 (序列辨識編號：19) 前向引子PDC1t-BsiWI-FBsi WI acggtacgtacg ctcccgtgtacgcgttctag         (序列辨識編號：20) 534
反向引子PDC1t-AvrII-RAvr II gacgtccctagg atttcacctggttgaaggag         (序列辨識編號：21)
註：位於引子內的限制酶切割位址是如底線所標示者。
之後，取適量之高蛋白假絲酵母菌BCRC 20325的培養物並使用UniversAll™組織萃取緩衝液來進行基因組DNA的萃取，繼而以所得到的基因組DNA作為模板，並且分別使用如上面表3所示的2組引子對並依據上面“一般實驗方法”的第2項「聚合酶鏈反應」當中所述的方法來進行PCR，藉此而擴增出一帶有PDC1啟動子以及Apa I/Pac I切割位址的PCR產物A6 (613 bp)以及一帶有PDC1終結子以及Bsi WI/Avr II切割位址的PCR產物A7 (534 bp)。E、 帶有 d-ldh 基因的同源重組片段的構築：
使用T4 DNA接合酶(購自於益生生技開發股份有限公司，貨號為FYC003)來將上面第A至D項當中所得到的PCR產物A1至A7進行接合(ligation)，藉此而得到一帶有d-ldh 基因的同源重組片段(6,050 bp，其架構如圖1所示)。F、 使用 CRISPR/Cas9 系統來將同源重組片段轉形 (transformation) 至高蛋白假絲酵母菌中：
首先，申請人委託Dharmacon公司來合成4個依據NCBI登錄編AB489119.1 {杰丁畢赤酵母菌(Pichia jadinii )[它為高蛋白假絲酵母菌的無性型(anamorph)]中針對丙酮酸去羧酶(pyruvate decarboxylase, PDC)的CuPDC1基因的完整序列(complete sequence)}當中所示的核苷酸序列所設計的CRISPR RNA (crRNA)(下稱crRNA1至4)，而有關該等crRNA的相關資訊(包括：核苷酸序列、對應於標的基因的所在位置等)已被整合於下面表4中。 表4. 被設計用於CRISPR/Cas9系統的crRNA
  標的基因 對應於標的基因內的核苷酸殘基位置 核苷酸序列(5’→3’)
crRNA1 pdc1 (NCBI登錄編號AB489119.1) 2295-2276 序列辨識編號：22 cuuguuugagucucucgaagguuuuagagcuaugcuguuuug
crRNA2 2304-2323 序列辨識編號：23 aacaccgucuucggucuuccguuuuagagcuaugcuguuuug
crRNA3 2414-2395 序列辨識編號：24 guaggcggcguucaacucguguuuuagagcuaugcuguuuug
crRNA4 2438-2419 序列辨識編號：25 aacucuggaguaaccaucagguuuuagagcuaugcuguuuug
註：方框內所示之序列為導引序列(guide sequence)，分別以序列辨識編號22至25來記載；而方框外所示之序列為tracr-配對序列(tracr-mate sequence)，其與轉錄-活化的crRNA (trans-activating crRNA, tracrRNA)互補。
接著，將該等crRNA與轉錄-活化的crRNA (購自於Dharmacon公司，貨號為U-002005-20)[這兩者被使用作為導引RNA (guide RNA)]、Cas9核酸酶蛋白質(Cas9 nuclease protein)(購自於Dharmacon，生產批號為CAS 11201)以及在上面第E項中所得到的同源重組片段依據下面表5所示用量進行混合，藉此而分別得到混合物1與2。 表5. 被使用於CRISPR/Cas9系統的混合物
混合物 內容物 用量
1 同源重組片段(200 ng/µL) 1 µg
Cas9核酸酶蛋白質(1,000 pmol) 24 pmol
crRNA1 (2 nmol) 14.4 pmol
crRNA4 (2 nmol) 14.4 pmol
tracrRNA (20 nmol) 28.8 pmol
2 同源重組片段(200 ng/µL) 1 µg
Cas9核酸酶蛋白質(1,000 pmol) 24 pmol
crRNA2 (2 nmol) 14.4 pmol
crRNA3 (2 nmol) 14.4 pmol
tracrRNA (20 nmol) 28.8 pmol
接著，該混合物1是藉由使用電穿孔法(electroporation)(操作參數為：0.75 kV、25 μF以及800 Ω)而被轉形至依照上面“實驗材料”的第1項「勝任高蛋白假絲酵母菌細胞的製備」中所得到的3種勝任高蛋白假絲酵母菌細胞中。
之後，使用一含有適當抗生素濃度(200 μg/mL G418)的YPD固態培養基進行篩選，並且使用1組依據NCBI登錄編號AB489119.1 [杰丁畢赤酵母菌(Pichia jadinii )(它為高蛋白假絲酵母菌的無性型)中針對丙酮酸去羧酶(PDC)的CuPDC1基因的完整序列]當中所示的核苷酸序列而被設計出之具有如下所示之核苷酸序列的引子對(分別對應於NCBI登錄編號AB489119.1當中所示的核苷酸殘基位置2247至2268處與3030至3006處)並依據上面“一般實驗方法”的第2項「聚合酶鏈反應」當中所述的方法來進行PCR，藉此來確認所得到的高蛋白假絲酵母菌轉形株中原有的4套pdc 基因是否完全被剔除。 前向引子PDC1-1-F 5’-atgagcgaaatcacattgggac-3’            (序列辨識編號：26) 反向引子PDC1-784-R 5’-caccaccgaatcttgggtgttgttc-3’          (序列辨識編號：27)
接著，所有的高蛋白假絲酵母菌轉形株中全套pdc 基因完全被剔除者所佔的比率[亦即剔除率(%)]被計算出。所得到的結果被顯示於下面的表6中。從表6可見，使用高蛋白假絲酵母菌BCRC 20325、21691以及21645來進行轉形皆能夠得到全套pdc 基因完全被剔除的高蛋白假絲酵母菌轉形株，其中又以使用高蛋白假絲酵母菌BCRC 20325所得到的剔除率最高。 表6. 高蛋白假絲酵母菌BCRC 20325、21691以及21645的pdc 基因的剔除情形
  BCRC 20325 BCRC 21691 BCRC 21645
pdc 基因完全被剔除的轉形株數量 45 4 2
總轉形株數量 691 490 199
剔除率(%) 6.5 0.8 1
此外，該混合物2亦被拿來進行相同的實驗，不同之處在於：只有對高蛋白假絲酵母菌BCRC 20325進行轉形。而所得到的結果顯示，使用該混合物2來進行轉形也能夠得到全套pdc 基因完全被剔除的高蛋白假絲酵母菌轉形株(剔除率為0.5%)。
綜合以上的實驗結果可知：使用混合物1與混合物2來對高蛋白假絲酵母菌進行轉形皆能夠得到全套pdc 基因完全被置換為d-ldh 基因的高蛋白假絲酵母菌轉形株，其中選用crRNA1與crRNA4以及高蛋白假絲酵母菌BCRC 20325能夠獲致最佳的置換率。G、 篩選具有高 D- 乳酸生產能力的高蛋白假絲酵母菌轉形株：
首先，申請人從在上面第F項中所得到的45株高蛋白假絲酵母菌BCRC 20325轉形株中隨機挑選出39株轉形株並將它們分別接種至一含有10 mL YPD60培養基(添加有1%酵母菌萃取物、2%蛋白腖以及6%葡萄糖)的50 mL試管中，並在30℃以及200 rpm下進行培養歷時48小時。接著，對所得到的各個培養物分別各取0.9-1.2 mL並以12,000 rpm來進行離心歷時5分鐘，接著收集上澄液來作為待測樣品並依據上面“一般實驗方法”的第3項「高效能液相層析分析」當中所述的方法來進行D-乳酸含量的分析。
D-乳酸產率是藉由將所測得的D-乳酸含量以及發酵前發酵培養基中所含有的葡萄糖含量代入下列公式(1)而被計算出：公式 (1) ： A ＝ ( B/C)×100 其中：A＝D-乳酸產率(%) B＝所測得的D-乳酸含量(g) C＝發酵前發酵培養基中所含有的葡萄糖含量(g)
所得到的結果被顯示於下面的表7中。從表7可見，各個高蛋白假絲酵母菌BCRC 20325轉形株皆具有生產D-乳酸的能力，特別地，高蛋白假絲酵母菌BCRC 20325轉形株D813 (下稱高蛋白假絲酵母菌轉形株D813)的D-乳酸產率高達82.5%，明顯優於其他高蛋白假絲酵母菌BCRC 20325轉形株所具者。申請人據此而認為：高蛋白假絲酵母菌轉形株D813具有開發潛力。高蛋白假絲酵母菌轉形株D813已於西元2019年4月22日以寄存編號BCRC 920114被寄存於財團法人食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)(300新竹市食品路331號，台灣)，以及於西元2019年6月5日以寄存編號CCTCC M 2019431被寄存於中國典型培養物保藏中心(China Center for Type Culture Collection, CCTCC)。 表7. 各個高蛋白假絲酵母菌BCRC 20325轉形株的D-乳酸產率
轉形株 D-乳酸產率(%) 轉形株 D-乳酸產率(%)
D701 45.3 D723 59.1
D702 54.1 D726 55.2
D703 45.5 D801 52.0
D704 60.6 D802 45.8
D705 65.1 D803 44.5
D707 63.5 D804 50.3
D708 60.9 D805 60.0
D709 62.8 D807 64.0
D710 53.1 D808 56.1
D711 52.8 D809 60.6
D712 63.9 D811 67.5
D713 53.1 D812 62.7
D714 51.1 D813 82.5
D716 67.7 D814 35.3
D717 61.3 D815 38.6
D718 59.2 D816 44.9
D719 48.4 D817 43.2
D720 68.3 D818 40.4
D721 58.8 D819 42.5
D722 44.2 － －
實施例2. 使用高蛋白假絲酵母菌轉形株D813 的大規模培養(large-scale culture) 來生產D- 乳酸
首先，將依據上面實施例1的第G項所得到的高蛋白假絲酵母菌轉形株D813的培養物以2×108 細胞/mL的接種量接種於一含有100 mL的如下面表8中所示的發酵培養基的錐形瓶中，然後於一好氧條件下以及一恆溫培養箱(35℃、80 rpm)中進行發酵反應歷時26小時。 表8. 用於發酵培養高蛋白假絲酵母菌轉形株D813的發酵培養基的配方
成分 濃度(g/L)
葡萄糖 105
酵母萃取物 10
蛋白腖 20
CaCO3 45
餘量為去離子水
之後，所得到的發酵培養物是參照實施例1當中所述的方式來進行D-乳酸含量的分析以及D-乳酸產率的計算。而實驗結果顯示：高蛋白假絲酵母菌轉形株D813在歷經26小時的發酵後，其D-乳酸產率可高達97.2%。實施例3. 不同 的 發酵條件 對於 高蛋白假絲酵母菌轉形株D813 發酵 產D- 乳酸的影響 實驗方法： A、 使用不同中和劑 (neutralizing agent) 來調控 pH 值對於高蛋白假絲酵母菌轉形株 D813 發酵產 D- 乳酸的影響：
首先，將依據上面實施例1的第G項所得到的高蛋白假絲酵母菌轉形株D813的培養物分成4組，其中包括3個實驗組(亦即實驗組1至3)以及1個對照組。接著，將各組培養物分別接種至上面實施例1的第G項中所使用的YPD60培養基(2 L)中。
接著，將各組培養物分別置於發酵槽(購自於一升科技股份有限公司)中，並在一為30℃的溫度、一為1 vvm的通氣量以及一為400 rpm的攪拌速率下進行培養歷時21-27小時，而使得該培養物的OD600 值能達至10 (約2×108 細胞/mL)。接著，所形成的細胞培養物以6,000 g來進行離心歷時6分鐘，去除上澄液並加入一含有2 L的如下面表9中所示的發酵培養基的發酵槽中，繼而在一為35℃的溫度、一為1 vvm的通氣量以及一為250 rpm的攪拌速率下進行發酵反應歷時22小時。在整個發酵期間，對實驗組1至3分別適時地添加以45 g/L CaCO3 、250 g/L NH4 OH以及5 N NaOH來將pH值控制在5至7的範圍內。 表9. 用於發酵培養高蛋白假絲酵母菌轉形株D813的發酵培養基的配方
成分 濃度(g/L)
葡萄糖 110
酵母萃取物 10
蛋白腖 20
餘量為去離子水
之後，所得到的各組發酵培養物是參照實施例1當中所述的方式來進行D-乳酸含量的分析以及D-乳酸產率的計算。B、 不同通氣條件對於高蛋白假絲酵母菌轉形株 D813 發酵產 D- 乳酸 的影響
首先，將依據上面實施例1的第G項所得到的高蛋白假絲酵母菌轉形株D813的培養物分成3個實驗組(亦即實驗組4至6)。接著，依照上面第A項當中所述的方式來進行發酵反應、D-乳酸含量的分析以及D-乳酸產率的計算，不同之處在於：各組發酵培養基皆被添加以45 g/L CaCO3 ，以及實驗組4至6分別是在0.5、0.75以及1 vvm的通氣量下進行發酵。C、 不同溫度條件對於高蛋白假絲酵母菌轉形株 D813 發酵產 D- 乳酸的影響
首先，將依據上面實施例1的第G項所得到的高蛋白假絲酵母菌轉形株D813的培養物分成2個實驗組(亦即實驗組7與8)。接著，依照上面第A項當中所述的方式來進行發酵反應、D-乳酸含量的分析以及D-乳酸產率的計算，不同之處在於：各組發酵培養基的110 g/L葡萄糖被替換為100 g/L蔗糖，並且皆被添加以45 g/L CaCO3 ，以及實驗組7與8分別是在30℃與35℃的溫度下進行發酵。 結果： A、 使用不同中和劑來調控 pH 值對於高蛋白假絲酵母菌轉形株 D813 發酵產 D- 乳酸的影響：
本實驗所測得的結果被顯示於表10中。從表10可見，在高蛋白假絲酵母菌轉形株D813發酵產D-乳酸的期間，分別使用CaCO3 、NH4 OH以及NaOH來調整pH值所得到的D-乳酸產率皆能夠達至85%以上，至於未使用中和劑所得到的D-乳酸產率則僅有57.09%。這個實驗結果顯示，在存在有中和劑的發酵條件下皆能夠有效地提升發酵製程的D-乳酸產率，其中以CaCO3 的效果最佳。 表10. 各組所測得的D-乳酸產率
組別 中和劑 D-乳酸產率(%)
對照組 － 57.09±1.41
實驗組1 CaCO3 95.64±0.51
實驗組2 NH4 OH 90.80±0.06
實驗組3 NaOH 86.90±1.03
B、 不同通氣條件對於高蛋白假絲酵母菌轉形株 D813 發酵產 D- 乳酸的影響
本實驗所測得的結果被顯示於表11中。從表11可見，在0.5、0.75以及1 vvm的通氣量下進行高蛋白假絲酵母菌轉形株D813發酵產D-乳酸所得到的D-乳酸產率皆能夠達至92%以上。這個實驗結果顯示，在0.5至1 vvm的通氣量下皆能夠有效地提升發酵製程的D-乳酸產率，其中以1 vvm的通氣量的效果最佳。 表11. 各組所測得的D-乳酸產率
組別 通氣量(vvm) D-乳酸產率(%)
實驗組4 0.5 92.80±1.44
實驗組5 0.75 92.98±0.15
實驗組6 1 95.92±0.40
C、 不同溫度條件對於高蛋白假絲酵母菌轉形株 D813 發酵產 D- 乳酸的影響
本實驗所測得的結果被顯示於12中。從表12可見，在30℃與35℃的溫度下進行高蛋白假絲酵母菌轉形株D813發酵產D-乳酸所得到的D-乳酸產率皆能夠達至86%以上。這個實驗結果顯示，在30℃至35℃的溫度下皆能夠有效地提升發酵製程的D-乳酸產率，其中以35℃的溫度的效果最佳。 表12. 各組所測得的D-乳酸產率
組別 溫度(℃) D-乳酸產率(%)
實驗組7 30 86.56±0.36
實驗組8 35 94.32±0.58
基於上述的實驗結果，申請人認為：在一為35℃的溫度以及一為1 vvm的通氣量的發酵條件下，使用CaCO3 來調控發酵期間的發酵培養基的pH值，在高蛋白假絲酵母菌轉形株D813發酵產D-乳酸上能夠得到最佳的D-乳酸產率。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中： 圖1是帶有d-ldh 基因的同源重組片段的一架構圖。
TW中華民國；食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)；2019/04/22；BCRC 920114。
CN中國大陸；中國典型培養物保藏中心(CCTCC)；2019/06/05；CCTCC M 2019431。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014

Claims (6)

  1. 一種重組型高蛋白假絲酵母菌(Candida utilis)轉形株D813，它以寄存編號BCRC 920114被寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心。
  2. 一種從一含有可發酵糖的基質中來產生D-乳酸的方法，其包含以一如請求項1的重組型高蛋白假絲酵母菌轉形株D813來對該基質進行發酵。
  3. 如請求項2的方法，其中該可發酵糖是選自於由下列所構成的群組：葡萄糖、蔗糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、纖維雙糖，以及它們的組合。
  4. 如請求項2的方法，其中該基質進一步被添加以一選自於由下列所構成之群組中的中和劑：CaCO3、NH4OH、NaOH，以及它們的組合。
  5. 如請求項2的方法，其中該發酵是在一範圍落在25℃至37℃的溫度下被進行。
  6. 如請求項2的方法，其中該發酵是在一範圍落在0.1vvm至1vvm的通氣量下被進行。
TW108129823A 2019-08-21 2019-08-21 重組型假絲酵母菌菌株及其製備方法與用途 TWI730383B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW108129823A TWI730383B (zh) 2019-08-21 2019-08-21 重組型假絲酵母菌菌株及其製備方法與用途
CN201910966090.2A CN112410233B (zh) 2019-08-21 2019-10-12 重组型假丝酵母菌菌株及其制备方法与用途
US16/745,983 US11667923B2 (en) 2019-08-21 2020-01-17 Recombinant Candida cell and preparation process and use thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW108129823A TWI730383B (zh) 2019-08-21 2019-08-21 重組型假絲酵母菌菌株及其製備方法與用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW202108755A TW202108755A (zh) 2021-03-01
TWI730383B true TWI730383B (zh) 2021-06-11

Family

ID=74646835

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW108129823A TWI730383B (zh) 2019-08-21 2019-08-21 重組型假絲酵母菌菌株及其製備方法與用途

Country Status (3)

Country Link
US (1) US11667923B2 (zh)
CN (1) CN112410233B (zh)
TW (1) TWI730383B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120058529A1 (en) * 2008-08-25 2012-03-08 Kirin Holdings Kabushiki Kaisha Method for highly efficient production of lactic acid using candida utilis
CN109715783A (zh) * 2016-04-18 2019-05-03 隐花果乳酸有限责任公司 生产乳酸的方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7141410B2 (en) * 2000-11-22 2006-11-28 Natureworks Llc Methods and materials for the production of organic products in cells of Candida species
BR0311452A (pt) * 2002-05-30 2005-03-29 Cargill Dow Llc Processos e materiais para a produção de ácido lático em levedura
CN101886048B (zh) * 2010-07-21 2012-05-30 江南大学 一种产乳酸工程菌及其构建方法和应用
KR101704212B1 (ko) * 2015-06-12 2017-02-08 씨제이제일제당 (주) 젖산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 젖산 제조 방법
CN107916235B (zh) * 2017-11-15 2020-12-18 天津大学 一种重组酵母菌株以及微生物混菌产电的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120058529A1 (en) * 2008-08-25 2012-03-08 Kirin Holdings Kabushiki Kaisha Method for highly efficient production of lactic acid using candida utilis
CN109715783A (zh) * 2016-04-18 2019-05-03 隐花果乳酸有限责任公司 生产乳酸的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ozaki et al.,"Metabolic engineering of Schizosaccharomyces pombe via CRISPR-Cas9 genome editing for lactic acid production from glucose and cellobiose" Metabolic Engineering Communications 5 (2017) 60–67
Ozaki et al.,"Metabolic engineering of Schizosaccharomyces pombe via CRISPR-Cas9 genome editing for lactic acid production from glucose and cellobiose" Metabolic Engineering Communications 5 (2017) 60–67 Stovicek et al., "CRISPR/Cas system for yeast genome engineering: advances and applications" FEMS Yeast Research, 17, 2017 *
Stovicek et al., "CRISPR/Cas system for yeast genome engineering: advances and applications" FEMS Yeast Research, 17, 2017

Also Published As

Publication number Publication date
TW202108755A (zh) 2021-03-01
CN112410233A (zh) 2021-02-26
CN112410233B (zh) 2021-11-02
US11667923B2 (en) 2023-06-06
US20210054387A1 (en) 2021-02-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1238490C (zh) 用于将木糖发酵为乙醇的稳定的重组酵母
CN101287824A (zh) 东方伊氏酵母种及密切相关物种的基因修饰的酵母和采用它们的发酵方法
EP2281881B1 (en) Yeast mutant and substance production method using the same
KR102281701B1 (ko) 아세토인을 제조하는 방법
CN107709540A (zh) 新型库德里阿兹威氏毕赤酵母菌种ng7及其用途
AU2016361425B2 (en) Genetically modified yeasts and fermentation processes using genetically modified yeasts
US8198089B2 (en) Flocculent yeast and method for production thereof
CN101356273A (zh) 全局转录机器的改造
EP4257681A1 (en) Recombinant bacterium with a high pha yield and the construction method thereof
CN110804561B (zh) 一种高产c6-c10乙基酯的酿酒酵母及其构建方法与用途
CN108913610A (zh) 共利用葡萄糖和木糖产生木糖醇的工程菌株的构建及应用
TW201437367A (zh) 可利用五碳糖及六碳糖生產乳酸之酵母菌
TWI730383B (zh) 重組型假絲酵母菌菌株及其製備方法與用途
US20210309982A1 (en) Materials and methods for creating strains of saccharomyces cerevisiae that exhibit an increased ability to ferment oligosaccharides into ethanol
JP2010136627A (ja) 酵母にガラクトースを利用させる方法
Stewart et al. Current developments in the genetic manipulation of brewing yeast strains—A review
US7393669B2 (en) Metabolically engineered micro-organisms having improved galactose uptake
JP7452900B2 (ja) 乳酸耐性の向上を有する酵母およびその使用
CN112538451B (zh) 过表达atf基因的生产乙酸丁酯的拜氏梭菌
CN116478893B (zh) 一种产丙酸的工程益生菌的构建与应用
KR101383829B1 (ko) 2,3-부탄다이올 생산을 위한 클렙시엘라 변이 균주
KR0140306B1 (ko) 케이엔알4 유전자를 불활성화시킴으로써 세포벽을 약화시킨 돌연변이 효모 및 그를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법
CN118599744A (zh) 一种利用粗甘油生产pha的嗜盐微生物及其应用
Aguilera et al. chapter seventeen
CN116376726A (zh) 提高赤霉素产量的靶点的鉴定方法及其应用