CN112410233A - 重组型假丝酵母菌菌株及其制备方法与用途 - Google Patents

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Abstract

一种重组型假丝酵母菌菌株及其制备方法。本发明亦揭示使用该重组型假丝酵母菌菌株来产生D‑乳酸的方法。

Description

重组型假丝酵母菌菌株及其制备方法与用途
技术领域
本发明是有关于一种重组型假丝酵母菌菌株及其制备方法。本发明亦有关于使用该重组型假丝酵母菌菌株来产生D-乳酸的方法。
背景技术
乳酸(lactic acid)具有D-乳酸(D-lactic acid)(亦被称为右旋乳酸)与L-乳酸(L-lactic acid)(亦被称为左旋乳酸)这两种立体异构物(stereoisomer)，它们被广泛地应用于食品、化妆品(cosmetic)、药品(pharmaceutical)以及化学工业(chemicalindustry)，因而已被视为是一种具有发展价值的化合物。特别地，在化学工业中，经常通过调控D-乳酸与L-乳酸各自聚合而成的聚右乳酸(poly-D-lactic acid,PDLA)与聚左乳酸(poly-L-lactic acid,PLLA)的比例来合成出具有不同性质[热化学性质(thermochemicalproperties)、物理性质(physical properties)以及生物降解率(biodegradation rate)]的生物可降解塑料(biodegradable plastics)，以因应不同需求。因此，如何大量地生产单一种类的乳酸立体异构物已逐渐成为本技术领域的研究人员所关注与研究的重点。
目前已有许多研究是通过对酵母菌进行基因修饰(gene modification)来使其具有生产单一种类的乳酸立体异构物的能力。例如，EP 1513923 B1揭示对马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)CD21菌株进行内生性pdc1基因[其编码丙酮酸去羧酶1(pyruvate decarboxylase 1,PDC1)]的删除以及外源性d-ldh基因[其编码D-乳酸去氢酶(D-lactate dehydrogenase,D-LDH)]的导入而得到一会表现d-ldh基因的Δpdc1重组型马克斯克鲁维酵母菌。该重组型马克斯克鲁维酵母菌在一具有葡萄糖与CaCO3的培养条件下历经54小时的发酵，可以达到92-95％的D-乳酸产率(以单位重量的葡萄糖所产生的乳酸重量来计算)。
US 2012/0058529 A1揭示对一具有优异的碳同化作用(carbon assimilation)的高蛋白假丝酵母菌(Candida utilis)进行基因修饰而得到一具有生产L-乳酸能力的菌株。该基因修饰的步骤包括先通过使用Cre-lox系统来对该高蛋白假丝酵母菌进行内生性pdc基因的多次破坏，而得到一内生性pdc基因完全被剔除的Cu8402g菌株，接着，同样通过使用Cre-lox系统对Cu8402g菌株进行外源性l-ldh基因[其编码L-乳酸去氢酶(L-lactatedehydrogenase,L-LDH)]的多次导入，而得到一表现外源性l-ldh基因且内生性pdc基因完全被剔除的Pj0957菌株。Pj0957菌株经由实验而被证实具有良好的L-乳酸生产能力。但由于高蛋白假丝酵母菌为多套染色体(hyperploid)而带有四个内生性pdc基因的拷贝，因此，使用Cre-lox系统的基因修饰时，需要进行多次的转形，才可使pdc基因完全被剔除。
另外，为了进一步提高上述基因修饰的效率，已有研究是利用CRISPR/Cas9系统的技术来达到一次性删除或插入多个目标基因的效用。例如，在Ozaki A.et al.(2017),Metab.Eng.Commun.,5：60-67中，Ozaki A.等人使用CRISPR/Cas9系统来对裂殖性酵母菌(Saccharomycespombe)FY12804菌株进行多个基因的置换与破坏，包括将eutE基因与mhpF基因分别导入至pdc101基因位置与pdc202基因位置、将d-ldh基因导入至gpd2基因位置，以及删除l-ldh基因与adh SPBC337.11基因，所得到的裂殖性酵母菌转形株ATR5-LA1在葡萄糖的存在下历经55小时的发酵，仅可达到33％的D-乳酸产率(以单位重量的葡萄糖所产生的乳酸重量来计算)。Ozaki A.等人进一步将d-ldh基因导入至该裂殖性酵母菌转形株ATR5-LA1的adh8基因位置，而所得到的裂殖性酵母菌转形株ATR5-LA2在历经55小时的发酵，则可以达到71％的D-乳酸产率。
然而，这些先前研究因需要较长的发酵时间才可达致较高的D-乳酸产率而提高了所需的成本，不敷产业上的实际应用。因此，若能利用CRISPR/Cas9系统并使用特定的导引RNA(guide RNA)来制备出一能够在短时间内生产大量D-乳酸的重组型假丝酵母菌菌株以供产业界所需，会是吾人所企望达成的。
发明内容
于是，在第一个方面，本发明提供一种用于制备一具有D-乳酸生产能力的重组型假丝酵母菌菌株的方法，该方法包括：
将一CRISPR/Cas9系统导入至一亲代假丝酵母菌细胞中，而使得该亲代假丝酵母菌细胞的一内生性pdc基因的所有拷贝皆被置换为外源性d-ldh基因，其中该CRISPR/Cas9系统包含有：
(a)一导引RNA(guide RNA)，其包含有一选自于由下列所构成的群组中的导引序列(guide sequence)：序列辨识编号:22、序列辨识编号:23、序列辨识编号:24以及序列辨识编号:25；
(b)一Cas9蛋白质；以及
(c)一同源重组片段(homologous recombination fragment)，沿一转录方向依序地包含有：一5’同源臂(5'homology arm)、该外源性d-ldh基因以及一3’同源臂(3'homology arm)，其中，该5’同源臂具有一对应于pdc基因的上游至少100bp的序列，该3’同源臂具有一对应于pdc基因的下游至少100bp的序列。
较佳地，该CRISPR/Cas9系统包含有一第一导引RNA与一第二导引RNA，该第一导引RNA包含有序列辨识编号:22所示的导引序列以及该第二导引RNA包含有序列辨识编号:25所示的导引序列。
较佳地，该5’同源臂具有一如序列辨识编号:16所示的序列。
较佳地，该3’同源臂具有一如序列辨识编号:19所示的序列。
较佳地，该亲代假丝酵母菌细胞是高蛋白假丝酵母菌ATCC 9950。
在第二个方面，本发明提供一种重组型假丝酵母菌菌株，它是通过使用一如上所述的方法而被生成。
在第三个方面，本发明提供一种重组型高蛋白假丝酵母菌转形株D813，它以保藏编号CCTCC M 2019431被保藏于中国典型培养物保藏中心。
在第四个方面，本发明提供一种从一含有可发酵糖的底物中来产生D-乳酸的方法，其包含以一如上所述的重组型高蛋白假丝酵母菌转形株D813来对该底物进行发酵。
较佳地，该可发酵糖是选自于由下列所构成的群组：葡萄糖、蔗糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、纤维双糖，以及它们的组合。
较佳地，该底物进一步被添加以一选自于由下列所构成的群组中的中和剂：CaCO3、NH4OH、NaOH，以及它们的组合。
较佳地，该发酵是在一范围落在25℃至37℃的温度下被进行。
较佳地，该发酵是在一范围落在0.1vvm至1vvm的通气量下被进行。
生物材料保藏信息说明
保藏编号：M2019431，
分类命名：高蛋白假丝酵母(Candida utilis)D813，
保藏日期：2019年06月05日，
保藏单位：CCTCC-中国典型培养物保藏中心，
保藏单位地址：中国武汉武汉大学。
附图说明
下面结合附图及实施例来对本发明进行详细说明，所以本发明在上述以及其他目的与特征，可借由参照下文的描述、随文检附的权利要求书和伴随的图式而变得更为明显，附图中：
图1是带有d-ldh基因的同源重组片段的一架构图。
具体实施方式
为了清楚地说明本发明的目的，将被了解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限于”，以及文字“包括(comprises)”具有一对应的意义。
除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有本领域技术人员所共同了解的意义。一熟悉本领域者会认知到许多与那些被描述于本文中者相似或等效的方法和材料，它们可被用于实施本发明。当然，本发明决不受到所描述的方法和材料的限制。为表清楚，下面的界定被使用于本文中。
如本文中所使用的，“核酸”、“核酸序列”或“核苷酸序列”等术语意指呈单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸序列或核糖核苷酸序列，且当中包含有已知的天然存在的核苷酸(naturally occurring nucleotides)或人造化学仿效物(artificial chemicalmimics)。如本文中所使用的，“核酸”此术语可与“基因”、“DNA”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“聚核苷酸”交换使用。
如本文中所使用的，术语“核酸片段”与“DNA片段”可被互换地使用，并且意指一种DNA聚合物(DNA polymer)，该DNA聚合物是呈一独立节段(separate segment)的形式或者是作为一较大的DNA建构物(DNA construct)的一组分(component)，其可以是衍生自经分离的DNA(isolated DNA)或是通过本技术领域中所熟知的方法而被化学地或酵素地合成。
除非另有指明，一核酸序列除了于本文中所揭示的特定序列外，亦涵盖其互补序列(complementary sequences)，以及它们的守恒性类似物(conservative analogs)、相关的自然存在的结构变异体和/或合成的非天然存在的类似物。
如本文中所使用的，术语“转形(transformation)”与术语“转染(transfection)”可被交替地使用，并且泛指将一外源性核酸分子引入一选定的宿主细胞内的方式。依据本技艺中已知的技术，一核酸分子(例如，一重组型DNA建构物或一重组型载体)可通过多种方式而被引入至一选定的宿主细胞内，例如磷酸钙或氯化钙媒介的转染作用(transfection)、电穿孔法(electroporation)、微注射法(microinjection)、粒子撞击法(particle bombardment)、脂质体媒介的转染作用(liposome-mediated transfection)、利用细菌噬菌体的转染作用或其他方法。
如本文中所使用的，“细胞”、“宿主细胞(host cell)”、“转形宿主细胞(transformed host cell)”与“重组型宿主细胞(recombinant host cell)”等术语可被交替地使用，而且不仅指特定的个体细胞(individual cells)还包括其继代培养的子代(sub-cultured offsprings)或可能的子代(potential offsprings)。继代培养的子代细胞可能在后续世代中因为突变作用或环境影响而包括特定的遗传修饰(geneticmodification)，而致使子代细胞事实上可能与母细胞并不完全一致，但子代细胞仍被涵盖在本文中所用的术语的范畴内。
如本文中所使用的，术语“亲代假丝酵母菌细胞(parent Candida cell)”与“假丝酵母菌母株(Candida mother strain)”可被交替地使用，并且意指一被使用来进行一或多个基因修饰处理的假丝酵母菌细胞。适用于本发明的亲代假丝酵母菌细胞可以是未转形的细胞(non-transformed cells)，或是已被至少一种其它重组型核酸序列转形的细胞(transformed cells)。
依据本发明，适用于本发明的亲代假丝酵母菌细胞包括，但不限于，源自于下列的细胞：高蛋白假丝酵母菌(Candida utilis)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、热带念珠菌(Candida tropicalis)以及近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)。在本发明的一个较佳具体例中，该亲代假丝酵母菌细胞是高蛋白假丝酵母菌。
本发明提供一种用于制备一具有D-乳酸生产能力的重组型假丝酵母菌菌株的方法，该方法包括：
将一CRISPR/Cas9系统导入至一亲代假丝酵母菌细胞中，而使得该亲代假丝酵母菌细胞的一内生性pdc基因的所有拷贝皆被置换为外源性d-ldh基因，其中该CRISPR/Cas9系统包含有：
(a)一导引RNA(guide RNA)，其包含有一选自于由下列所构成的群组中的导引序列(guide sequence)：序列辨识编号:22、序列辨识编号:23、序列辨识编号:24以及序列辨识编号:25；
(b)一Cas9蛋白质；以及
(c)一同源重组片段(homologous recombination fragment)，沿一转录方向依序地包含有：一5’同源臂(5'homology arm)、该外源性d-ldh基因以及一3’同源臂(3'homology arm)，其中，该5’同源臂具有一对应于pdc基因的上游至少100bp的序列，该3’同源臂具有一对应于pdc基因的下游至少100bp的序列。
较佳地，该内生性pdc基因具有多个拷贝。在本发明的一个较佳具体例中，该内生性pdc基因具有四个拷贝。
在本发明的一个较佳具体例中，该亲代假丝酵母菌细胞是高蛋白假丝酵母菌ATCC9950。
如本文中所使用的，术语“导引RNA(guide RNA,gRNA)”意指一在CRISPR/Cas9系统中将一CRISPR蛋白质(例如，Cas9或Cas9相关的多肽)靶向至一目标DNA内的一特定位置来进行基因编辑(gene editing)的RNA分子，其包含有：一导引序列，它含有一与该目标DNA互补的核苷酸序列；一tracr序列(tracr sequence)，它作用于与该CRISPR蛋白质结合，亦被称为转录-活化的crRNA(trans-activating crRNA,tracrRNA)；以及一tracr-配对序列(tracr-mate sequence)，它融合至该导引序列的3’端[这两个序列一起被称为CRISPR RNA(crRNA)]，并且可与该tracrRNA杂交。该crRNA与该tracrRNA可以是呈分开(separate)的两个RNA分子，或是被融合成一个单一的RNA分子[亦被称为单一导引RNA(single guide RNA,sgRNA)]。
依据本发明，该tracr序列的选用可以是自行设计的，或者是商业上可购得的产品，例如，Edit-R tracrRNA(厂牌为Dharmacon，货号为U-002005-20)、Alt-RTM CRISPRtracrRNA(厂牌为Integrated DNA Technologies，货号为1072532)以及
Figure BDA0002230518940000071
SpCas9tracrRNA(厂牌为Merck，货号为TRACRRNA05N-5NMOL)。该tracr-配对序列的选用则视所采用的tracr序列而定。在本发明的一个较佳具体例中，该tracr序列是Edit-RtracrRNA。
在本发明的一个较佳具体例中，该CRISPR/Cas9系统包含有一第一导引RNA与一第二导引RNA，该第一导引RNA包含有序列辨识编号:22所示的导引序列以及该第二导引RNA包含有序列辨识编号:25所示的导引序列。
依据本发明，该CRISPR/Cas9系统的导入可以采用熟习此项技艺者所详知且惯用的技术来进行。
可了解到的是，有关该CRISPR/Cas9系统的操作条件会进一步随着所使用的导引RNA、CRISPR蛋白质以及所欲表现的外源性基因的种类与用量比例等因素而被变动，以便达致最佳的基因修饰(gene modification)效果。而这些操作条件的选择是熟习此项技艺者能例行性地自行决定的。
依据本发明，该同源重组片段中的5’同源臂、外源性d-ldh基因以及3’同源臂的核酸序列分别是通过使用熟习此项技艺者所熟知且惯用的DNA选殖(DNA cloning)或基因合成(gene synthesis)的相关技术而被选殖或合成。参见，例如，US 20120058529A1以及US20160177321 A1等。
较佳地，该5’同源臂具有一对应于pdc基因的上游100bp至2,000bp范围内的序列。在本发明的一个较佳具体例中，该5’同源臂具有一如序列辨识编号:16所示的序列。
较佳地，该3’同源臂具有一对应于pdc基因的下游100bp至2,000bp范围内的序列。在本发明的一个较佳具体例中，该3’同源臂具有一如序列辨识编号:19所示的序列。
依据本发明，适用于本发明的d-ldh基因是源自于：肠膜明串珠菌肠膜亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp.Mesenteroides)、胚芽乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、戴白氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)、红面包霉菌(Neurospora crassa)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)以及乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。在本发明的一个较佳具体例中，该d-ldh基因是源自于肠膜明串珠菌肠膜亚种。
在本发明的一个较佳具体例中，该d-ldh基因具有一如序列辨识编号:1所示的序列。
本发明亦提供一种重组型假丝酵母菌菌株，它是通过使用一如上所述的方法而被生成。
在本发明的一个较佳具体例中，该重组型假丝酵母菌菌株为一保藏编号为BCRC920114(保藏于BCRC)或者CCTCC M 2019431(保藏于CCTCC)的重组型高蛋白假丝酵母菌转形株D813。
本发明亦提供一种从一含有可发酵糖的底物中来产生D-乳酸的方法，其包含以一如上所述的重组型高蛋白假丝酵母菌转形株D813来对该底物进行发酵。
依据本发明，该含有可发酵糖的底物可以是一糖液或纤维素水解液(cellulosichydrolysate)。
依据本发明，该纤维素水解液是通过对一纤维素生质(cellulosic biomass)依序地进行一前处理及一水解处理而被制得。
如本文中所使用的，术语“纤维素水解液”与“木质纤维素水解液(lignocellulosic hydrolysate)”和“生质水解液(biomass hydrolysate)”可被交替地使用，并且意指由生质的糖化(saccharification)所产生的产物。
依据本发明，该可发酵糖是选自于由下列所构成的群组：葡萄糖、蔗糖、果糖(fructose)、阿拉伯糖(arabinose)、半乳糖(galactose)、甘露糖(mannose)、纤维双糖(cellobiose)，以及它们的组合。
在本发明的一个较佳具体例中，该含有可发酵糖的底物是一含有葡萄糖的糖液，当使用本发明的重组型假丝酵母菌菌株来对该含有葡萄糖的糖液进行发酵时，可得到一至少约为82.5％的D-乳酸产率；较佳地，可得到一至少约为90％的D-乳酸产率；更佳地，可得到一约为97.2％的D-乳酸产率。
在本发明的另一个较佳具体例中，该含有可发酵糖的底物是一含有蔗糖的糖液，当使用本发明的重组型假丝酵母菌菌株来对该含有蔗糖的糖液进行发酵时，可得到一至少约为86.56％的D-乳酸产率；较佳地，可得到一至少约为90％的D-乳酸产率；更佳地，可得到一约为94.32％的D-乳酸产率。
依据本发明，在该发酵前或在该发酵的期间，该底物可进一步被添加以一选自于由下列所构成的群组中的中和剂，而使得该底物的pH值在该发酵的期间被维持在5至7的范围内：CaCO3、NH4OH、NaOH，以及它们的组合。较佳地，在该发酵的期间，对该底物添加以45g/LCaCO3，而使得该底物的pH值在该发酵的期间被维持在pH6。
依据本发明，该发酵是在一范围落在25℃至37℃的温度下被进行历时18至60小时。
较佳地，该发酵是在30℃下被进行历时48小时。
较佳地，该发酵是在35℃下被进行历时22小时。更佳地，该发酵是在35℃下被进行历时26小时。
依据本发明，该发酵是在一范围落在0.1vvm至1vvm的通气量下被进行。较佳地，该发酵是在一范围落在0.5vvm至1vvm的通气量下被进行。更佳地，该发酵是在1vvm的通气量下被进行。
本发明将就下面的实施例来做进一步说明，但应了解的是，所述实施例只是供例示说明用，而不应被解释为本发明的实施上的限制。
<实施例>
一般实验材料：
1.下面实施例中被使用来进行聚合酶链式反应的引物(primers)是委托明欣生物科技有限公司来代为合成。
2.在下面的实施例中，所使用到的高蛋白假丝酵母菌(Candida utilis)是购自于食品工业发展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物资源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC)(300新竹市食品路331号)，其包括：
(1)高蛋白假丝酵母菌BCRC 20325(对应于ATCC 9950)；
(2)高蛋白假丝酵母菌BCRC 21691(对应于ATCC 36178)；以及
(3)高蛋白假丝酵母菌BCRC 21645(对应于DSM 70163)。
3.在下面实施例中所使用的葡萄糖、蛋白胨以及酵母萃取物分别是购自于景明化工股份有限公司(Echo Chemical Co.,LTD)、上鼎生技有限公司(ST BIO,INC.)以及精展生物科技有限公司(Genezyme biotech)。
4.在下面实施例中所使用的CaCO3、NH4OH以及NaOH皆购自于Sigma-Aldrich。
一般实验方法：
1.除非另有指明，在本发明中所采用的实验方法是使用本领域中熟悉此项技术人士所详知的技术或者依据制造商所提供的操作指南来进行，例如下列DNA选殖(DNAcloning)的相关技术：基因组DNA的提取(extraction of genomic DNA)、使用限制酶的DNA切割反应(DNA cleavage reaction by restriction enzymes)、使用T4 DNA接合酶的DNA接合反应(DNA ligation with T4 DNA ligase)以及琼脂糖凝胶电泳(agarose gelelectrophoresis)。
2.聚合酶链式反应(PCR)：
在下面实施例中所使用的PCR是通过使用KOD DNA聚合酶(KOD DNA polymerase)(Merck Group)并依照制造商所提供的操作指南来进行。
3.高效能液相层析(high performance liquid chromatography,HPLC)分析：
在下面的实施例中，被拿来进行HPLC分析的待测样品中所含有的D-乳酸及其浓度(g/L)是通过使用一配备有一个DAD-3000UV检测器(DAD-3000UV detector)的HPLC仪器(DIONEX Ultimate 3000)来进行测定，其中所使用的管柱以及操作条件如下：分析柱为SUMICHIRAL OA-6000管柱，温度设定为38℃；流动相：2mM CuSO4/5％乙腈(acetonitrile)；流速被控制为0.8mL/分钟；样品注射体积为20μL；以及检测波长为UV-254nm。
此外，为供比对，使用不同浓度的D-乳酸(0.5至12mg/mL)(购自于Sigma-Aldrich)来分别作为对照标准品(control standard)并进行相同的分析。
实施例1.具有D-乳酸生产能力的高蛋白假丝酵母菌转形株的制备与筛选
为了得到一能够表现外源性d-ldh基因且全套内生性pdc基因完全被剔除的转形株，申请人构筑一带有d-ldh基因的同源重组片段(homologous recombinationfragment)，接着使用CRISPR/Cas9系统的技术来进行同源重组，以将高蛋白假丝酵母菌的基因体内的pdc基因[其编码丙酮酸去羧酶(pyruvate decarboxylase,PDC)]置换为d-ldh基因[其编码D-乳酸去氢酶(D-lactate dehydrogenase,D-LDH)]。
实验材料：
1.胜任高蛋白假丝酵母菌细胞的制备(preparation of competent Candidautilis cells)：
首先，将高蛋白假丝酵母菌BCRC 20325、21691以及21645分别接种至如下面表1中所示的YPD20培养基中，并于30℃下以200rpm进行振荡培养直到该培养物的OD600值达至1.3-1.5(约0.32g菌体/L)。
表1.YPD20培养基的配方
Figure BDA0002230518940000111
接着，将适量的培养物吸取至无菌离心管中，继而于4℃下以6,000g来进行离心历时6分钟。之后，倒除上清液并加入10mL的转形溶液(transformation solution)[含有100mM乙酸锂(lithium acetate,LiAc)、10mM Tris-HCl以及1mM EDTA]以充分悬浮菌体，并于30℃下以200rpm进行振荡培养历时1小时，然后加入1mL的1M DTT并继续进行振荡培养历时30分钟，继而在4℃下以6,000g来进行离心历时6分钟，接着，倒除上清液并加入20mL的冰冷二次水(ddH2O)以充分悬浮菌体，继而在4℃下以6,000g来进行离心历时6分钟，然后倒除上清液并加入15mL的冰冷二次水以充分悬浮菌体，继而在4℃下以6,000g来进行离心历时6分钟。
之后，倒除上清液并加入1mL的冰冷山梨糖醇(sorbitol)(1M)以充分悬浮菌体，继而在4℃下以6,000g来进行离心历时6分钟，然后倒除上清液并加入80μL的冰冷山梨糖醇(1M)以充分悬浮菌体，借此而得到3种含有经山梨糖醇处理的胜任高蛋白假丝酵母菌细胞(sorbitol-treated competent Candida utilis cell)的悬浮液。最后，将所得到的3种含有胜任高蛋白假丝酵母菌细胞的悬浮液分装至微量离心管(每管约70μL)并且保存于-80℃下备用。
实验方法：
A.最适化d-ldh基因的基因合成(gene synthesis)：
首先，为了得到一可在高蛋白假丝酵母菌中表现的最适化d-ldh基因，申请人将肠膜明串珠菌肠膜亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp.Mesenteroides)的d-ldh基因的完整编码序列(complete coding sequence)(GenBank登录编号：AB233384.1)作碱基的最适化调整，借此而得到一如序列辨识编号：1所示的最适化d-ldh基因的核苷酸序列(996bp)。该最适化d-ldh基因的核苷酸序列是委托明欣生物科技有限公司来进行合成。接着，以所得到的合成产物作为模板，通过使用1组具有如下所示的核苷酸序列的引物对(其中底线表示限制酶切割位点)并依据上面“一般实验方法”的第2项「聚合酶链式反应」当中所述的方法来进行PCR，借此而得到一带有最适化d-ldh基因的核苷酸序列以及PacI/SalI切割位点的PCR产物A1(1,022bp)。
正向引物D-LDH-PacI-F
5’-gataccttaattaaatgaagatttttgcttac-3’(序列辨识编号：2)
PacI
反向引物D-LDH-SalI-R
5’-ttgcaggtcgacttaatattcaacagcaatagctg-3’
SalI (序列辨识编号：3)
B.分别选殖PGK终结子(PGK terminator)、PGK启动子(PGK promoter)以及GAP终结子(GAP terminator)片段：
有关PGK终结子、PGK启动子以及GAP终结子的选殖大体上是参考US 20120058529A1当中所述的方法而被进行。简言之，申请人取适量的高蛋白假丝酵母菌BCRC 20325的培养物并使用UniversAllTM组织提取缓冲液来进行基因组DNA的提取，继而以所得到的基因组DNA作为模板，并且分别使用针对PGK终结子、PGK启动子以及GAP终结子所设计出的具有如下面表2中所示的3组引物对并依据上面“一般实验方法”的第2项「聚合酶链式反应」当中所述的方法来进行PCR，借此而扩增出一带有PGK终结子以及SalI/NotI切割位点的PCR产物A2(906bp)、一带有PGK启动子以及NotI/KpnI切割位点的PCR产物A3(1,406bp)以及一带有GAP终结子以及BamHI/BsiWI切割位点的PCR产物A4(859bp)。
表2.被设计用于扩增PGK终结子、PGK启动子以及GAP终结子的引物对
Figure BDA0002230518940000141
注：位于引物内的限制酶切割位点是如底线所标示者，斜体字表示loxp序列。
C.选殖KanMX片段：
有关KanMX片段的选殖大体上是参照US 20160177321 A1当中所述的方法而被进行。简言之，以pFA6a-link-yEGFP-Kan载体作为模板，并且使用1组针对该载体中所含的KanMX抗性基因(序列辨识编号：13)所设计出的具有如下所示的核苷酸序列的引物对(其中底线表示限制酶切割位点)并依据上面“一般实验方法”的第2项「聚合酶链式反应」当中所述的方法来进行PCR，借此而扩增出一带有KanMX片段以及KpnI/BamHI切割位点的PCR产物A5(834bp)。
正向引物KanMX-KpnI-F
5’-ataaagggtaccatgggtaaggaaaagac-3’(序列辨识编号：14)
KpnI
反向引物KanMX-BamHI-R
5’-tacaatggatccttagaaaaactcatcgag-3’(序列辨识编号：15)
BamHI
D.分别选殖PDC1启动子以及PDC1终结子片段：
首先，为了选殖出高蛋白假丝酵母菌BCRC 20325的pdc1基因的启动子(下称PDC1启动子)与终结子(下称PDC1终结子)(分别对应于NCBI登录编号AB489119.1当中所示的核苷酸残基位置1660至2246处与4192至4701处)，申请人分别设计出如下面表3中所示的2组引物对。
表3.被设计用于扩增PDC1启动子与PDC1终结子的引物对
Figure BDA0002230518940000151
注：位于引物内的限制酶切割位点是如底线所标示者。
之后，取适量的高蛋白假丝酵母菌BCRC 20325的培养物并使用UniversAllTM组织提取缓冲液来进行基因组DNA的提取，继而以所得到的基因组DNA作为模板，并且分别使用如上面表3所示的2组引物对并依据上面“一般实验方法”的第2项「聚合酶链式反应」当中所述的方法来进行PCR，借此而扩增出一带有PDC1启动子以及ApaI/PacI切割位点的PCR产物A6(613bp)以及一带有PDC1终结子以及BsiWI/AvrII切割位点的PCR产物A7(534bp)。
E.带有d-ldh基因的同源重组片段的构筑：
使用T4DNA接合酶(购自于益生生技开发股份有限公司，货号为FYC003)来将上面第A至D项当中所得到的PCR产物A1至A7进行接合(ligation)，借此而得到一带有d-ldh基因的同源重组片段(6,050bp，其架构如图1所示)。
F.使用CRISPR/Cas9系统来将同源重组片段转形(transformation)至高蛋白假丝酵母菌中：
首先，申请人委托Dharmacon公司来合成4个依据NCBI登录编AB489119.1{杰丁毕赤酵母菌(Pichia jadinii)[它为高蛋白假丝酵母菌的无性型(anamorph)]中针对丙酮酸去羧酶(pyruvate decarboxylase,PDC)的CuPDC1基因的完整序列(complete sequence)}当中所示的核苷酸序列所设计的CRISPR RNA(crRNA)(下称crRNA1至4)，而有关所述crRNA的相关信息(包括：核苷酸序列、对应于靶基因的所在位置等)已被整合于下面表4中。
表4.被设计用于CRISPR/Cas9系统的crRNA
Figure BDA0002230518940000161
注：方框内所示的序列为导引序列(guide sequence)，分别以序列辨识编号22至25来记载；而方框外所示的序列为tracr-配对序列(tracr-mate sequence)，其与转录-活化的crRNA(trans-activating crRNA,tracrRNA)互补。
接着，将所述crRNA与转录-活化的crRNA(购自于Dharmacon公司，货号为U-002005-20)[这两者被使用作为导引RNA(guide RNA)]、Cas9核酸酶蛋白质(Cas9nucleaseprotein)(购自于Dharmacon，生产批号为CAS 11201)以及在上面第E项中所得到的同源重组片段依据下面表5所示用量进行混合，借此而分别得到混合物1与2。
表5.被使用于CRISPR/Cas9系统的混合物
Figure BDA0002230518940000171
接着，该混合物1是通过使用电穿孔法(electroporation)(操作参数为：0.75kV、25μF以及800Ω)而被转形至依照上面“实验材料”的第1项「胜任高蛋白假丝酵母菌细胞的制备」中所得到的3种胜任高蛋白假丝酵母菌细胞中。
之后，使用一含有适当抗生素浓度(200μg/mL G418)的YPD固态培养基进行筛选，并且使用1组依据NCBI登录编号AB489119.1[杰丁毕赤酵母菌(Pichia jadinii)(它为高蛋白假丝酵母菌的无性型)中针对丙酮酸去羧酶(PDC)的CuPDC1基因的完整序列]当中所示的核苷酸序列而被设计出的具有如下所示的核苷酸序列的引物对(分别对应于NCBI登录编号AB489119.1当中所示的核苷酸残基位置2247至2268处与3030至3006处)并依据上面“一般实验方法”的第2项「聚合酶链式反应」当中所述的方法来进行PCR，借此来确认所得到的高蛋白假丝酵母菌转形株中原有的4套pdc基因是否完全被剔除。
正向引物PDC1-1-F
5’-atgagcgaaatcacattgggac-3’(序列辨识编号：26)
反向引物PDC1-784-R
5’-caccaccgaatcttgggtgttgttc-3’(序列辨识编号：27)
接着，所有的高蛋白假丝酵母菌转形株中全套pdc基因完全被剔除者所占的比率[亦即剔除率(％)]被计算出。所得到的结果被显示于下面的表6中。从表6可见，使用高蛋白假丝酵母菌BCRC 20325、21691以及21645来进行转形皆能够得到全套pdc基因完全被剔除的高蛋白假丝酵母菌转形株，其中又以使用高蛋白假丝酵母菌BCRC 20325所得到的剔除率最高。
表6.高蛋白假丝酵母菌BCRC 20325、21691以及21645的pdc基因的剔除情形
Figure BDA0002230518940000181
此外，该混合物2亦被拿来进行相同的实验，不同处在于：只有对高蛋白假丝酵母菌BCRC 20325进行转形。而所得到的结果显示，使用该混合物2来进行转形也能够得到全套pdc基因完全被剔除的高蛋白假丝酵母菌转形株(剔除率为0.5％)。
综合以上的实验结果可知：使用混合物1与混合物2来对高蛋白假丝酵母菌进行转形皆能够得到全套pdc基因完全被置换为d-ldh基因的高蛋白假丝酵母菌转形株，其中选用crRNA1与crRNA4以及高蛋白假丝酵母菌BCRC 20325能够获致最佳的置换率。
G.筛选具有高D-乳酸生产能力的高蛋白假丝酵母菌转形株：
首先，申请人从在上面第F项中所得到的45株高蛋白假丝酵母菌BCRC 20325转形株中随机挑选出39株转形株并将它们分别接种至一含有10mL YPD60培养基(添加有1％酵母萃取物、2％蛋白胨以及6％葡萄糖)的50mL试管中，并在30℃以及200rpm下进行培养历时48小时。接着，对所得到的各个培养物分别各取0.9-1.2mL并以12,000rpm来进行离心历时5分钟，接着收集上清液来作为待测样品并依据上面“一般实验方法”的第3项「高效能液相层析分析」当中所述的方法来进行D-乳酸含量的分析。
D-乳酸产率是通过将所测得的D-乳酸含量以及发酵前发酵培养基中所含有的葡萄糖含量代入下列公式(1)而被计算出：
公式(1)：A＝(B/C)×100
其中：A＝D-乳酸产率(％)
B＝所测得的D-乳酸含量(g)
C＝发酵前发酵培养基中所含有的葡萄糖含量(g)
所得到的结果被显示于下面的表7中。从表7可见，各个高蛋白假丝酵母菌BCRC20325转形株皆具有生产D-乳酸的能力，特别地，高蛋白假丝酵母菌BCRC 20325转形株D813(下称高蛋白假丝酵母菌转形株D813)的D-乳酸产率高达82.5％，明显优于其他高蛋白假丝酵母菌BCRC 20325转形株所具者。申请人据此而认为：高蛋白假丝酵母菌转形株D813具有开发潜力。高蛋白假丝酵母菌转形株D813已于2019年4月22日以保藏编号BCRC 920114被保藏于财团法人食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)(300新竹市食品路331号)，以及于2019年6月5日以保藏编号CCTCC M 2019431被保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,CCTCC)。
表7.各个高蛋白假丝酵母菌BCRC 20325转形株的D-乳酸产率
转形株 D-乳酸产率(％) 转形株 D-乳酸产率(％)
D701 45.3 D723 59.1
D702 54.1 D726 55.2
D703 45.5 D801 52.0
D704 60.6 D802 45.8
D705 65.1 D803 44.5
D707 63.5 D804 50.3
D708 60.9 D805 60.0
D709 62.8 D807 64.0
D710 53.1 D808 56.1
D711 52.8 D809 60.6
D712 63.9 D811 67.5
D713 53.1 D812 62.7
D714 51.1 D813 82.5
D716 67.7 D814 35.3
D717 61.3 D815 38.6
D718 59.2 D816 44.9
D719 48.4 D817 43.2
D720 68.3 D818 40.4
D721 58.8 D819 42.5
D722 44.2 － －
实施例2.使用高蛋白假丝酵母菌转形株D813的大规模培养(large-scaleculture)来生产D-乳酸
首先，将依据上面实施例1的第G项所得到的高蛋白假丝酵母菌转形株D813的培养物以2×108细胞/mL的接种量接种于一含有100mL的如下面表8中所示的发酵培养基的锥形瓶中，然后于一好氧条件下以及一恒温培养箱(35℃、80rpm)中进行发酵反应历时26小时。
表8.用于发酵培养高蛋白假丝酵母菌转形株D813的发酵培养基的配方
Figure BDA0002230518940000211
之后，所得到的发酵培养物是参照实施例1当中所述的方式来进行D-乳酸含量的分析以及D-乳酸产率的计算。而实验结果显示：高蛋白假丝酵母菌转形株D813在历经26小时的发酵后，其D-乳酸产率可高达97.2％。
实施例3.不同的发酵条件对于高蛋白假丝酵母菌转形株D813发酵产D-乳酸的影响
实验方法：
A.使用不同中和剂(neutralizing agent)来调控pH值对于高蛋白假丝酵母菌转形株D813发酵产D-乳酸的影响：
首先，将依据上面实施例1的第G项所得到的高蛋白假丝酵母菌转形株D813的培养物分成4组，其中包括3个实验组(亦即实验组1至3)以及1个对照组。接着，将各组培养物分别接种至上面实施例1的第G项中所使用的YPD60培养基(2L)中。
接着，将各组培养物分别置于发酵槽(购自于一升科技股份有限公司)中，并在一为30℃的温度、一为1vvm的通气量以及一为400rpm的搅拌速率下进行培养历时21-27小时，而使得该培养物的OD600值能达至10(约2×108细胞/mL)。接着，所形成的细胞培养物以6,000g来进行离心历时6分钟，去除上清液并加入一含有2L的如下面表9中所示的发酵培养基的发酵槽中，继而在一为35℃的温度、一为1vvm的通气量以及一为250rpm的搅拌速率下进行发酵反应历时22小时。在整个发酵期间，对实验组1至3分别适时地添加以45g/L CaCO3、250g/L NH4OH以及5N NaOH来将pH值控制在5至7的范围内。
表9.用于发酵培养高蛋白假丝酵母菌转形株D813的发酵培养基的配方
Figure BDA0002230518940000221
之后，所得到的各组发酵培养物是参照实施例1当中所述的方式来进行D-乳酸含量的分析以及D-乳酸产率的计算。
B.不同通气条件对于高蛋白假丝酵母菌转形株D813发酵产D-乳酸的影响
首先，将依据上面实施例1的第G项所得到的高蛋白假丝酵母菌转形株D813的培养物分成3个实验组(亦即实验组4至6)。接着，依照上面第A项当中所述的方式来进行发酵反应、D-乳酸含量的分析以及D-乳酸产率的计算，不同处在于：各组发酵培养基皆被添加以45g/L CaCO3，以及实验组4至6分别是在0.5、0.75以及1vvm的通气量下进行发酵。
C.不同温度条件对于高蛋白假丝酵母菌转形株D813发酵产D-乳酸的影响
首先，将依据上面实施例1的第G项所得到的高蛋白假丝酵母菌转形株D813的培养物分成2个实验组(亦即实验组7与8)。接着，依照上面第A项当中所述的方式来进行发酵反应、D-乳酸含量的分析以及D-乳酸产率的计算，不同处在于：各组发酵培养基的110g/L葡萄糖被替换为100g/L蔗糖，并且皆被添加以45g/L CaCO3，以及实验组7与8分别是在30℃与35℃的温度下进行发酵。
结果：
A.使用不同中和剂来调控pH值对于高蛋白假丝酵母菌转形株D813发酵产D-乳酸的影响：
本实验所测得的结果被显示于表10中。从表10可见，在高蛋白假丝酵母菌转形株D813发酵产D-乳酸的期间，分别使用CaCO3、NH4OH以及NaOH来调整pH值所得到的D-乳酸产率皆能够达至85％以上，至于未使用中和剂所得到的D-乳酸产率则仅有57.09％。这个实验结果显示，在存在有中和剂的发酵条件下皆能够有效地提升发酵制程的D-乳酸产率，其中以CaCO3的效果最佳。
表10.各组所测得的D-乳酸产率
组别 中和剂 D-乳酸产率(％)
对照组 － 57.09±1.41
实验组1 CaCO<sub>3</sub> 95.64±0.51
实验组2 NH<sub>4</sub>OH 90.80±0.06
实验组3 NaOH 86.90±1.03
B.不同通气条件对于高蛋白假丝酵母菌转形株D813发酵产D-乳酸的影响
本实验所测得的结果被显示于表11中。从表11可见，在0.5、0.75以及1vvm的通气量下进行高蛋白假丝酵母菌转形株D813发酵产D-乳酸所得到的D-乳酸产率皆能够达至92％以上。这个实验结果显示，在0.5至1vvm的通气量下皆能够有效地提升发酵制程的D-乳酸产率，其中以1vvm的通气量的效果最佳。
表11.各组所测得的D-乳酸产率
组别 通气量(vvm) D-乳酸产率(％)
实验组4 0.5 92.80±1.44
实验组5 0.75 92.98±0.15
实验组6 1 95.92±0.40
C.不同温度条件对于高蛋白假丝酵母菌转形株D813发酵产D-乳酸的影响
本实验所测得的结果被显示于12中。从表12可见，在30℃与35℃的温度下进行高蛋白假丝酵母菌转形株D813发酵产D-乳酸所得到的D-乳酸产率皆能够达至86％以上。这个实验结果显示，在30℃至35℃的温度下皆能够有效地提升发酵制程的D-乳酸产率，其中以35℃的温度的效果最佳。
表12.各组所测得的D-乳酸产率
组别 温度(℃) D-乳酸产率(％)
实验组7 30 86.56±0.36
实验组8 35 94.32±0.58
基于上述的实验结果，申请人认为：在一为35℃的温度以及一为1vvm的通气量的发酵条件下，使用CaCO3来调控发酵期间的发酵培养基的pH值，在高蛋白假丝酵母菌转形株D813发酵产D-乳酸上能够得到最佳的D-乳酸产率。
于本说明书中被引述的所有专利和文献以其整体被并入本案作为参考数据。若有所冲突时，本案详细说明(包含界定在内)将占上风。
虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神之下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明仅受如随文检附的权利要求所示者的限制。
序列表
<110> 远东新世纪股份有限公司
<120> 重组型假丝酵母菌菌株及其制备方法与用途
<160> 27
<150> 108129823
<151> 2019-08-21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 996
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 最适化d-ldh基因
<400> 1
atgaagattt ttgcttacgg tattagagat gatgaaaagc catcattgga agaatggaaa 60
gctgctaacc cagagattga agttgactac acacaagagt tgttgacacc tgaaacagtt 120
aagttggctg agggatcaga ttcagctgtt gtttaccaac aattggacta tacaagagaa 180
acattgacag ctttagctaa cgttggtgtt actaacttgt cattgagaaa cgttggtaca 240
gataacattg attttgatgc agcaagagaa tttaacttta acatttcaaa tgttcctgtt 300
tattcaccaa atgctattgc agaacactca atgattcaat tatctaggtt gttgagaaga 360
actaaagcat tggatgccaa aattgctaag cacgacttga gatgggcacc aacaattgga 420
agagaaatga gaatgcaaac agttggtgtt attggtacag gtcatattgg tagagttgct 480
attaacattt tgaaaggttt tggtgcaaag gttattgctt atgataagta cccaaatgct 540
gaattgcaag cagaaggttt gtacgttgac acattagacg aattatatgc acaagctgat 600
gcaatttcat tgtatgttcc tggtgttcct gaaaaccatc atttgatcaa tgcagaggct 660
attgctaaga tgaaggatgg tgttgttatc atgaatgctg ctagaggtaa tttgatggac 720
attgatgcta ttattgatgg tttaaattct ggtaagattt cagacttcgg tatggacgtt 780
tatgaaaatg aagttggttt gttcaatgaa gattggtctg gtaaagaatt tccagatgct 840
aagattgctg acttgatttc aagagaaaat gtattggtta ctccacatac tgctttctat 900
acaactaaag ctgttttgga aatggttcac caatcatttg atgcagcagt tgctttcgcc 960
aaaggtgaga agccagctat tgctgttgaa tattaa 996
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 用于PCR扩增最适化d-ldh基因的正向引物D-LDH-PacI-F
<400> 2
gataccttaa ttaaatgaag atttttgctt ac 32
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 用于PCR扩增最适化d-ldh基因的反向引物D-LDH-SalI-R
<400> 3
ttgcaggtcg acttaatatt caacagcaat agctg 35
<210> 4
<211> 880
<212> DNA
<213> 高蛋白假丝酵母菌(Candida utilis)
<400> 4
ctgcaagcta ctttgtaatt aaacaaataa cgggattata tgtcaatatc attatgatta 60
tttaggaaaa catgtagacc ttacccgatg cacctccacc aacaagccaa ttctgggtgg 120
gatggaagtt acacactgct ggtacgttgg tcaccagtgg gtttgacaaa tgtgccagct 180
gatgaccatc tcggtcgtag acgtcaaagt acttgttcat attggcaatg acaaactttt 240
ctttgtccgg ggtatattgc tgccaccttg ccttcaaaat ggatacccat cttcccgttt 300
gacaattgtg tttgatacga tgacttgggg tcaaatcacc ttcaatagcg aagttcttag 360
gtttagtgct gatgtcctca ccaagattga agatgttaac tgtgtcatcg taaccgttac 420
aaacaaggtc accagatcta ttccaatcca cgatggaaac tgacaatctt gaatcataga 480
cgccaacagt gtgcagagtc tccaggttgt catcccattc atcccaatca cacgtagttg 540
ctgttcttag atcccaaacc ttcaaagttc gatccaatga ggcagtagca atctggttct 600
tattcatcgg attgatagtg aatccaccaa tctttttatt cgacaatctc aaaacttgtc 660
ttcttgagtg atcgcctgct ctcaggtcaa ttctgctgaa ttgtccttgc attgttgtgt 720
agtacatttc attgtcgttg ttgtaattta tgtcagtgat accgacgtca aagtcgttga 780
tgaataactg tgaggacttc atggagcgta gatcaattga gcgaatggac ccatcatacg 840
atgcactgta gaccttcgtc gtgtcattca tgttgaattc 880
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 用于PCR扩增PGK终结子的正向引物PGKt-SalI-F
<400> 5
tattaagtcg acctgcaagc tactttgtaa ttaaac 36
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 用于PCR扩增PGK终结子的反向引物PGKt-NotI-R
<400> 6
acggtagcgg ccgcgaattc aacatgaatg acacg 35
<210> 7
<211> 1346
<212> DNA
<213> 高蛋白假丝酵母菌(Candida utilis)
<400> 7
aagcttttgt cttttaggag ccttcttttc accctggctt tcttcagact ccacgcctct 60
cgcccgtttg ttgttgatct tcttctgttg cttcttcgtg agcttaccag tatccagatg 120
cgttgtcagg gcaagagggt catgttcaag ctcctctttc actttcagtc caatacgttt 180
ccaggcaggg atgtgttcgc tcatcgttcc agactcgagt ggtgaaaact atggcaacct 240
ctacttcctt tccaaacaca cagcgtgctt tgtagtgtgt gcctaagagc tgaatttttt 300
ttccttccat gctgcgctgc gatgagctct gcccgcccgc agcctcggag gctagcgacg 360
tataaaaaag gcctgtgaaa attttatcct cctccttaac gacccttctt tctcttcttc 420
acattcaaaa acttcaagca gctgtctctg ttcctttgct gtgttctacc attggatatt 480
cccattcccc gtggagaacc gaactggagt ctagcagcat gcgagatcaa tattacacgg 540
tttgagtctg atacgcttga gcagccattt tttggcttct cctggtgtgt atccagatat 600
agaagttcgt atacatttcc catagcgatt gtaaaatgat tctgcaatgg aaccatccgt 660
aattgtaggc ctgctgagat ggcactcgca atgcctctgt gtctggtttt ttgccttctc 720
cgtccatcag caccagtggc ttcttagggc ataacgagac ggctccttgg tgaaagatgc 780
cctgctccgt ctgtctgcct gttgctacaa ccactgcgta gtcagatgac ccggtctgtg 840
tgctgtggaa tcaccgggag cgaaattccg gtttcgctgg cagatgagct catcaaccac 900
atcaactgga gcaacctcac cagaggacac gtaacctgcc cggttgaatt ctgtcaaacc 960
gtacatcaca caacaacagc agcagcaaca acaacaacgt cagttgtcgt tcgcatggcg 1020
acgttaccta acggcaccaa catcgtctcg tcctcgccaa tgcctgtttc ccctacccgg 1080
agtggcccgg cccacctgtc gttctttttt cgtcaattgt gtccagctgg tgccatcacc 1140
atatgttcaa gtgcgtggcc tgtactagcg cagtctgctg cagtataaaa gggattgctg 1200
aggccccctt tagcgtttcc aattaacaat tgattccctt ttccccatag tccgtttgta 1260
ctacatccta cataacaaaa gtgagtgtta caagacaagt gtggcggtca attggatcat 1320
ttggactaac atactggcgg ataaag 1346
<210> 8
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 用于PCR扩增PGK启动子的正向引物PGKp-NotI-F
<400> 8
gaattcgcgg ccgctaccgt tcgtatagca tacattatac gaagttataa gcttttgtct 60
tttaggagcc ttc 73
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 用于PCR扩增PGK启动子的反向引物PGKp-KpnI-R
<400> 9
acccatggta ccctttatcc gccagtatgt tag 33
<210> 10
<211> 801
<212> DNA
<213> 高蛋白假丝酵母菌(Candida utilis)
<400> 10
attgtatgac ttttatttat gggattacgt tataaattat gatcctcatg gattatctta 60
ttaagtctcc atcttgtagc ttgtaatatg atgaacactc gtgagttttc caggtaattc 120
accgtgcctc gtccatgcac ttttatcagc ctcgacgtca tacattgcat ggtgagtaac 180
tggaaaacgg ctttttacgt tctgttgtat atggctaaac gcttctatgg cacggcgcta 240
ttaacctgtc tgacatttca acctggtgtt gatggcttaa acgataatac ggtgagatat 300
atagctaaca gaatgggggt gacgcactga ttccactgta tatataggcg atatgtgttg 360
ttggatggac gtttctttgt ctcctgatcc acaatagtag ctcagctccg tgccaactgg 420
ttcgctggta cgatagtgag ggatgaatga aaccttttcg ttttcttctg cgcttccacg 480
gaactgtgta gatttctctc gtgaatagcg agttaagcca cgagtggggt ctgcaattga 540
aggtgtgata ccagagtcaa aagtttggat gtgatggaaa cttcaaaggc ttctcggtgg 600
tatatcaaac gattcacaga ggtagaagcg gatcttgaag gccagaatat gcattaaaac 660
cagcgtatat cagttttctt tcccagagag gacttttgca ttattcttca gctttatccc 720
tggattttgg gagatgaaac attgacaaag ctggttcgtg atcctaaata cttgcctact 780
gactcctgag gtattacacg t 801
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 用于PCR扩增GAP终结子的正向引物GAPt-BamHI-F
<400> 11
ttctaaggat ccattgtatg acttttattt atg 33
<210> 12
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 用于PCR扩增GAP终结子的反向引物GAPt-BsiWI-R
<400> 12
ttccttcgta cgtaccgttc gtataatgta tgctatacga agttatacgt gtaatacctc 60
aggagtcagt ag 72
<210> 13
<211> 810
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> KanMX抗性基因
<400> 13
atgggtaagg aaaagactca cgtttcgagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat 60
ttatatgggt ataaatgggc tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcga 120
ttgtatggga agcccgatgc gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc 180
aatgatgtta cagatgagat ggtcagacta aactggctga cggaatttat gcctcttccg 240
accatcaagc attttatccg tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc 300
ggcaaaacag cattccaggt attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat 360
gcgctggcag tgttcctgcg ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac 420
agcgatcgcg tatttcgtct cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat 480
gcgagtgatt ttgatgacga gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg 540
cataagcttt tgccattctc accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat 600
aaccttattt ttgacgaggg gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc 660
gcagaccgat accaggatct tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca 720
ttacagaaac ggctttttca aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag 780
tttcatttga tgctcgatga gtttttctaa 810
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 用于PCR扩增KanMX抗性基因的正向引物KanMX-KpnI-F
<400> 14
ataaagggta ccatgggtaa ggaaaagac 29
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 用于PCR扩增KanMX抗性基因的反向引物KanMX-BamHI-R
<400> 15
tacaatggat ccttagaaaa actcatcgag 30
<210> 16
<211> 587
<212> DNA
<213> 高蛋白假丝酵母菌(Candida utilis)
<400> 16
attgcacacc gcacgtctgt gcagtttgcc atcaatcgac gtttatagca cacaccatag 60
atcacacaga gcttcggctc tattccgttc cgtagagaaa agcaaccatt gtatacaaac 120
accaaggcta tcgcttcccg attcgtcaaa tgcacagctt cccttcaggt ggcccagctg 180
agcgcaacat gaaaaccggt cctgcgcaca ctttatccaa gcatgtggat ggcaccatgc 240
ggttaaaaac tatgcactta tgcaacgata cgggcacgat ttgaatgagt tgaacacaca 300
cacgcgtagc acacactggt ttatgcctgg ttaagcagtg ccctctgtat tcgctgtctg 360
cgtcaaatgg tgtcaaaagg actaaaagga atttttagga aagggggagt ggtcagttgt 420
taccgttgtc gtcttacata tataagaagc tagggtttcc cactttgctc tgagcgtagg 480
aatgtttcaa ctcatcatca tctattacag gaaactcaat tgaatcatca ttttcaattg 540
atacccgtta tacacaacaa acaaacaaaa ctaaaacaat cgatacc 587
<210> 17
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 用于PCR扩增PDC1启动子的正向引物PDC1p-ApaI-F
<400> 17
acatgtgggc ccattgcaca ccgcacgtct g 31
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 用于PCR扩增PDC1启动子的反向引物PDC1p-PacI-R
<400> 18
caacatttaa ttaaggtatc gattgtttta g 31
<210> 19
<211> 510
<212> DNA
<213> 高蛋白假丝酵母菌(Candida utilis)
<400> 19
ctcccgtgta cgcgttctag ttaaccattt ttttatgttt tctgccgtcc actttgatct 60
acgttgaagt taaggaacct ttacattgtt ggatttagcc ccttacgctc cctttgtttc 120
acactactag agctggcgct gctgaagatc ctattcaatc catattgatc cagaaacgat 180
aaccgcatag cgagcgctga aagagctgga aaaagataga ggagaaaaca cagctttgtt 240
cttcgcttga gacaaagaca taagtaactg gtgctttcac gagactgctt gggggttatt 300
gttgctgtag ttttgttgtc tactcgagct cgctccgttt cgtcatttac cgctgttttt 360
aactttgcaa tagtccgtgt gtgtgtgtgt tcgtattaac agttaatgtg tggaaaatgg 420
ttcctggaat caacaagcag aagctcgtga atacaacgag acagtattta cacgctgtga 480
acatgaattt ctccttcaac caggtgaaat 510
<210> 20
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 用于PCR扩增PDC1终结子的正向引物PDC1t-BsiWI-F
<400> 20
acggtacgta cgctcccgtg tacgcgttct ag 32
<210> 21
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 用于PCR扩增PDC1终结子的反向引物PDC1t-AvrII-R
<400> 21
gacgtcccta ggatttcacc tggttgaagg ag 32
<210> 22
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> crRNA1的导引序列
<400> 22
cuuguuugag ucucucgaag 20
<210> 23
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> crRNA2的导引序列
<400> 23
aacaccgucu ucggucuucc 20
<210> 24
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> crRNA3的导引序列
<400> 24
guaggcggcg uucaacucgu 20
<210> 25
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> crRNA4的导引序列
<400> 25
aacucuggag uaaccaucag 20
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 用于PCR扩增pdc基因的正向引物PDC1-1-F
<400> 26
atgagcgaaa tcacattggg ac 22
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 用于PCR扩增pdc基因的反向引物PDC1-784-R
<400> 27
caccaccgaa tcttgggtgt tgttc 25

Claims (12)

1.一种用于制备一具有D-乳酸生产能力的重组型假丝酵母菌菌株的方法，其特征在于：该方法包括：
将一CRISPR/Cas9系统导入至一亲代假丝酵母菌细胞中，而使得该亲代假丝酵母菌细胞的一内生性pdc基因的所有拷贝皆被置换为外源性d-ldh基因，其中该CRISPR/Cas9系统包含有：
(a)一导引RNA，其包含有一选自于由下列所构成的群组中的导引序列：序列辨识编号:22、序列辨识编号:23、序列辨识编号:24，以及序列辨识编号:25；
(b)一Cas9蛋白质；以及
(c)一同源重组片段，沿一转录方向依序地包含有：一5’同源臂、该外源性d-ldh基因以及一3’同源臂，其中，该5’同源臂具有一对应于pdc基因的上游至少100bp的序列，该3’同源臂具有一对应于pdc基因的下游至少100bp的序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：该CRISPR/Cas9系统包含有一第一导引RNA与一第二导引RNA，该第一导引RNA包含有序列辨识编号:22所示的导引序列以及该第二导引RNA包含有序列辨识编号:25所示的导引序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：该5’同源臂具有一如序列辨识编号:16所示的序列。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：该3’同源臂具有一如序列辨识编号:19所示的序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：该亲代假丝酵母菌细胞是高蛋白假丝酵母菌ATCC 9950。
6.一种重组型假丝酵母菌菌株，其特征在于：该重组型假丝酵母菌菌株是通过使用一如权利要求1至5中任一项所述的方法而被生成。
7.一种重组型高蛋白假丝酵母菌转形株D813，其特征在于：该重组型高蛋白假丝酵母菌转形株D813以保藏编号CCTCC M2019431被保藏于中国典型培养物保藏中心。
8.一种从一含有可发酵糖的底物中来产生D-乳酸的方法，其特征在于：该方法包含以一如权利要求7的重组型高蛋白假丝酵母菌转形株D813来对该底物进行发酵。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：该可发酵糖是选自于由下列所构成的群组：葡萄糖、蔗糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、纤维双糖，以及它们的组合。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：该底物进一步被添加以一选自于由下列所构成的群组中的中和剂：CaCO3、NH4OH、NaOH，以及它们的组合。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：该发酵是在一范围落在25℃至37℃的温度下被进行。
12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：该发酵是在一范围落在0.1vvm至1vvm的通气量下被进行。
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