CN109715783A

CN109715783A - 生产乳酸的方法

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Publication number: CN109715783A
Application number: CN201780037725.XA
Authority: CN
Inventors: M·阿斯克; R·科普拉姆; D·马塔诺维赫; M·绍尔
Original assignee: Syconium Lactic Acid GmbH
Current assignee: Syconium Lactic Acid GmbH
Priority date: 2016-04-18
Filing date: 2017-04-14
Publication date: 2019-05-03
Also published as: JP7034088B2; ZA201806519B; IL262149A; CA3020061A1; WO2017182403A1; CL2018002968A1; US20190127766A1; JP2019513408A; BR112018071250A2; EP3445845A1; IL262149B; MX2018012297A; CO2018011096A2; US10947571B2; UA127433C2

Abstract

本发明提供了一种使用葡萄糖作为碳源在重组酵母细胞培养中生产乳酸的方法，其包括第一种子发酵阶段产生生物质，其中在pH为5至7的培养基中培养酵母，然后是用来自种子发酵的生物质产生乳酸的第二生产发酵阶段，其中使用酵母菌株在低pH的培养基中培养酵母，该酵母菌株经工程化为具有乳酸脱氢酶(LDH)活性并任选地具有降低或敲除的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。

Description

生产乳酸的方法

技术领域

本发明提供了一种使用葡萄糖作为碳源在重组酵母细胞培养中生产乳酸的方法，包括第一种子发酵阶段产生生物质，其中在pH为5至7的培养基中培养酵母，然后是用来自种子发酵的生物质产生乳酸的第二生产发酵阶段，其中使用酵母菌株在低pH的培养基中培养所述酵母，该酵母菌株被工程化(engineered)为具有乳酸脱氢酶(LDH)活性或具有乳酸脱氢酶(LDH)活性和降低或敲除的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。

背景技术

乳酸被美国能源部列为糖类排名前30的化学结构单元的候选药物，显示出显著的市场增长。2013年，全球乳酸市场估计为714200吨，预计到2020年将扩大至1960100吨，2014年至2020年的增长率为15.5％的复合年增长率(CAGR)。

长期以来，乳酸被用作食品工业中的防腐剂和酸化剂。乳酸的价格目前约为每公斤$1.30-$1.60。它还用作溶剂(特别是酯化形式的溶剂)和制药、化妆品和化学工业中的原料以及用于乳酸酯的生产。乳酸越来越多地用作生产聚乳酸(PLA)的起始物料，聚乳酸是一种由可再生资源制成的可生物降解的塑料。

乳酸市场增长的主要力量是用于开发可生物降解的聚合物和乳酸盐溶剂。预计个人护理也将成为一个快速增长的领域，因为乳酸用于皮肤增白、抗痤疮、抗皱和抗衰老的产品。

2013年，聚乳酸(PLA)占全球生物塑料市场的11.4％(约185kt)。预计PLA的年均市场增长为18.8％CAGR，2018年的市场容量为438kt。在过去几年中，PLA的质量及其技术应用范围迅速发展。现今，PLA主要用于三个应用领域：

1.纤维：用于服装、地毯、家具、无纺布和其它工业应用

2.薄膜和包装：新鲜食品包装和其它应用，如餐饮服务器皿

3.工程应用：电子、消费品、汽车工业

与石化塑料相比，来自可再生资源(生物塑料)的可生物降解塑料具有广泛的优势。与石化塑料相比，克服PLA的价格障碍将使这些优势获得广泛的应用。

在其生命周期中，生物塑料的好处是：

·源自可再生原料

·不消耗宝贵的原油资源

·低碳足迹-人们认为比传统的油基塑料低至少30％

·可生物降解

·避免与垃圾填埋和乱扔垃圾相关的问题。

以目前价格的一半来生产PLA的起始物料——乳酸，将显著影响PLA产品的成本。与更昂贵的石化塑料产品相比，这提供了提升PLA市场地位的机会。

传统上使用乳酸菌生产乳酸。特别是对于食品工业而言，这些是生产生物的选择，因为它们自然地产生酸。含有乳酸的传统食品的例子是酸菜和酸奶。通过乳酸发酵细菌从源自葡萄糖分离的乳酸也用于现代食品加工工业中。乳酸在化学工业中的主要用途是制备塑料聚乳酸(PLA)。

但是，对乳酸作为制造塑料的原料的要求远高于用于食品的乳酸。乳酸必须具有高纯度，特别是光学纯(即必须是纯D-或L-乳酸)并且它必须非常便宜，因为PLA目前与廉价的常规石化塑料竞争。乳酸价格的关键因素是发酵后的纯化。纯化是困难且昂贵的，部分是因为乳酸菌在发酵过程中不能耐受低pH值，部分是因为它们依赖于有机氮源。此外，乳酸菌通常积累酸的两种对映体(Sauer et al.,2008,Trends Biotechnol.26,100-108和SauerM.et al.,2010,Biotechnol.Gen.Engineering,27,229-256)。特别是pH值造成的问题，因为游离乳酸的纯化仅可以受到低pH溶液的影响。这意味着在发酵期间，必须通过添加碱来保持高pH。为了纯化乳酸，必须将发酵液酸化并且必须处理或再循环所得的盐(石膏)，这是一个技术上复杂的工序。

这些问题的解决方案是通过重组酵母生产乳酸。它们比乳酸菌更耐酸，可以在矿物培养基上生长和产生，并且仅积累所需的乳酸对映体。奈琪沃克有限责任公司(NatureWorks LLC)(嘉吉(Cargill))是为数不多的PLA商业制造商之一。乳酸(作为制造PLA的基础)通过基于酵母的方法生产(每年约140000吨)。奈琪沃克的方法基于重组克拉布特里阴性(Crabtree-negative)酵母(Miller et al.2011，Industrial production oflactic acid，Elsevier，179-188)。该发酵过程在40-45小时内产生100-130g/l的乳酸，最终pH值为3。但是，这种乳酸不能在开放市场上买到，而是在相同地点加工成PLA。

通过面包酵母将葡萄糖发酵成乙醇是现存最有效的生物过程之一。人们认为生产率仅受从培养基到细胞的葡萄糖摄取速率的限制。丙酮酸(丙酮酸盐)是用于生产乙醇的关键葡萄糖衍生代谢物。如果通过删除丙酮酸脱羧酶(PDC)活性并同时插入将丙酮酸转化为乳酸的乳酸脱氢酶(LDH)来消除乙醇的代谢途径，则生成酵母菌株，该酵母菌株产生乳酸而不是乙醇。已经在各种初步项目中开发了这种菌株(Branduardi et al.2006,MicrobialCell Factories,5:4,1-12)。

WO2004/099425涉及使用在具有葡萄糖好氧环境中生长的单倍体克拉布特里阳性酵母生产乳酸而不产生大量乙醇的方法，其中该单倍体克拉布特里阳性酵母缺乏丙酮酸脱羧酶活性并且包含外源乳酸脱氢酶基因。

WO2009/144013描述了使用过表达己糖转运蛋白基因的酵母生产乳酸的方法，该基因导致有机酸生产率提高。

但是，尽管已经进行了多次尝试来改进生产乳酸的酵母，但是仍然存在未满足的提供用于再生大量纯的异构乳酸的改进工艺而无需昂贵的纯化工艺的需求。

发明内容

通过本发明的实施方式解决了所述需求。

本发明提供了遗传修饰的酵母菌株来产生乳酸的光学纯异构体，L(+)-乳酸或D(-)-乳酸，这取决于所用的遗传修饰的酵母菌株。将这些酵母菌株的特定代谢需求与生物工程中的本发明方法比对时，本发明方法可以显著降低乳酸的生产成本。与使用乳酸菌的常规方法相比，本发明方法中发酵液的纯度是一个很大的优势，因为这些方法需要有机氮源和高pH值，这两者都增加了纯化成本。与已建立的基于酵母系统的方法相比，本发明方法具有更高生产率的独特优势，由于明显减少的发酵时间和因此产品的价格更低，从而能够实现更高的产量。本方法的特征在于在低pH值的基本培养基上特别高的生产率。

在低pH值下发酵的主要问题是菌株有限的生存力，特别是在高乳酸浓度下。这显著限制了整体生产率。本方法的创新方面涉及保持在有效生产乳酸期间将细胞暴露于胁迫条件(stress conditions)的时间降低到最小限度。这通过两步法实现，在时间上和任选地在空间上将细胞生长期与乳酸生产期分开。

发酵过程的第一阶段涉及酵母生物质的快速增加，在第二阶段中葡萄糖被转化为乳酸。这避免了乳酸对酵母增殖期间生长的抑制作用，并且一旦达到高细胞密度，它就以高生产率实现最大乳酸产率。

随后的乳酸纯化可以通过标准方法进行。所述方法提供了可以通过常规技术纯化的发酵液。此外，低pH值的发酵方法使得纯化过程更便宜，因为在纯化之前不再需要酸化发酵液，这反过来不需要去除大量的盐。

本发明提供使用葡萄糖作为碳源在重组酵母细胞培养中生产乳酸的方法，其包括种子发酵阶段的连续阶段以产生生物质，其中在pH为5至7的培养基中培养酵母，然后用来自种子发酵的生物质生产乳酸的生产发酵阶段，其中在pH<5的培养基中培养酵母，并且其中所述酵母被修饰为具有乳酸脱氢酶(LDH)活性或LDH活性和降低或敲除的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。

在实施方式中，还有一种在含有葡萄糖作为碳源的重组酵母细胞培养中生产乳酸的方法，包括以下步骤：

a)在种子发酵中，在pH为5至7下，培养酵母细胞以产生生物质

b)收获并任选洗涤步骤a)的细胞，

c)用OD⁶⁰⁰至少为3.0的所述细胞接种生产发酵

d)在pH<5的条件下孵育所述细胞以产生乳酸，特别是直至最终pH达到小于2.5，以及

e)从细胞培养物或细胞培养上清液中纯化乳酸，

其中所述酵母是二倍体，或任选地具有重组乳酸脱氢酶(LDH)活性和任选降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性的多倍体或非整倍体酵母。

a)在种子发酵中，在5至7的恒定pH条件下培养酵母细胞，以达到OD至少为10，

b)培养所述细胞直至最终pH达到小于2.5以产生乳酸，以及

c)从细胞培养物或细胞培养上清液中纯化乳酸，

其中所述酵母是二倍体酵母，或任选地具有乳酸脱氢酶(LDH)活性和任选降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性的多倍体或非整倍体酵母。

因此，将用于本发明方法的所述重组酵母代谢工程化以有效地产生乳酸。

根据本发明的实施方式，所述酵母菌株能够产生约80g/L LA/100g/L葡萄糖，具体地每120g/L葡萄糖产生约100g/L LA，更具体地每150g/L葡萄糖产生约120g/L LA或甚至产生更多的量。具体地，这种生产培养基的最终pH<3。

根据本发明的实施方式，通过常规工业方法从发酵阶段纯化乳酸，并且具体地具有至少90％的纯度，具体地至少95％，具体地至少99％，更具体地其不含任何杂质。

在具体实施方式中，生产发酵阶段的pH≤4.5，具体地≤4，具体地≤3.5，更具体地生产发酵阶段的最终pH为3，更具体地生产发酵阶段的最终pH≤2.9、≤2.8、≤2.7、≤2.6、≤2.5、≤2.4、≤2.3、≤2.2、≤2.15或更低。

在一些实施方式中，种子发酵阶段在补料分批条件下进行。

在一些实施方式中，生产发酵阶段在分批过程条件下进行。

根据本发明，种子发酵和生产发酵可以在同一容器中进行。

根据本发明的具体实施方式，种子发酵阶段和生产发酵阶段在不同的发酵罐中。

根据本发明的某一实施方式，生产发酵阶段中糖的初始浓度为至少10％(w/w)，具体地12％(w/w)或更高，更具体地15％或更高，更优选20％或更高。

根据本发明的某一实施方式，生产发酵阶段中葡萄糖的初始浓度为至少10％(w/w)，具体地12％(w/w)或更高，更具体地15％或更高，更优选20％或更高。

在另一实施方式中，所述方法基于蔗糖。生产发酵阶段中蔗糖的初始浓度为至少10％(w/w)，具体地12％(w/w)或更高，更具体地15％或更高，更优选20％或更高。

根据实施方式，乳酸以游离形式产生，具体地其以光学纯异构形式产生，具体地为D(-)-乳酸或L(+)-乳酸。

本发明方法可以通过包含异源乳酸脱氢酶(LDH)基因的重组酵母实施，该基因可稳定整合到基因组中或适用于功能性和稳定基因表达的质粒或载体或表达盒上。所述酵母能够在小于3.5的pH，具体地在小于3的pH，更具体地在小于2.8的pH，更具体地在小于2.5的pH，更具体地在小于2.2的pH下产生乳酸。

可以通过本领域技术人员已知的方法引入外源LDH基因，例如转化，具体地通过电穿孔、微粒轰击(microprojectile bombardment)、LiAc/ss/DNA/PEG方法、CRISPR-cas9系统的使用等等。

根据另一实施方式，所述重组酵母降低或敲除了一种或多种编码PDC1、PDC5和/或PDC6的基因的表达。

根据具体实施方式，由于PDC1、PDC5和/或PDC6基因的一种或多种启动子的取代和/或缺失，重组酵母降低或敲除了一种或多种编码PDC1、PDC5和/或PDC6的基因的表达。

在一可选的实施方式中，重组酵母具有编码有条件地表达的PDC1、PDC5和/或PDC6的基因，具体地是由于异源启动子的控制，具体地是由于葡萄糖阻抑型启动子的控制，更具体地是由于HXT2或HXT4基因启动子的控制。

在一可选的实施方式中，在重组酵母中缺失至少一种编码PDC1、PDC5和/或PDC6的基因。

在本发明的另一具体实施方式中，酵母降低或敲除了的一种或多种基因的表达，该基因编码与葡萄糖传感器相互作用的蛋白质，该葡萄糖传感器控制葡萄糖调节的基因表达，具体是Std1或Mth1蛋白的表达。

具体地，部分或完全缺失MTH1基因。

在另一实施方式中，修饰酵母以过表达至少一种己糖转运蛋白基因，具体地，修饰酵母以过表达至少一种选自HXT1、HXT2、HXT3、HXT4、HXT5、HXT6、HXT7、HXT8、HXT9、HXT10、HXT11、HXT12、HXT13、HXT14、HXT15、HXT16、HXT17、GAL2、SNF3和RGT2的己糖转运蛋白基因。

本发明的实施方式进一步提供了具有乳酸脱氢酶(LDH)活性的重组酵母，并且任选还降低或敲除了如本文所述的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。

根据另一实施方式，重组酵母还可具有降低或敲除的丙酮酸脱氢酶活性。

本发明还提供了重组酵母菌株，包括：

i)功能缺失的PDC1、PDC5和PDC6基因，

ii)功能缺失的MTH1基因，

iii)过表达的HXT1基因，和

iv)至少一种异源LDH基因。

根据本发明使用的重组酵母菌株可以属于选自酵母属、假丝酵母属、裂殖酵母属、孢圆酵母属(Torulaspora)、克鲁维酵母属、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、杉山珊瑚属(Sugiyamaella)、毕赤酵母属(Komagataella)和德克酵母属(Dekkera)的属。

在某些实施方式中，所述酵母菌株选自耐热克鲁维酵母属(Kluyveromycesthermotolerans)、乳酸克鲁维酵母属(Kluyveromyces lactis)、德氏克鲁维酵母属(Torulaspora delbrueckii)、拜氏接合酵母属(Zygosaccharomyces bailii)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、Sugiyamaella lignohabitans、巴斯德毕赤酵母(Komagataella pastoris)、巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii)和光滑念珠菌(Candida glabrata)。

最优选的属于酵母属，特别是酿酒酵母、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)或奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)。

所述重组酵母可以是单倍体或二倍体，优选二倍体。

作为替代方案，所述酵母细胞也可以是非整倍体或多倍体细胞。

根据优选的实施方式，所述重组酵母细胞是胁迫抗性的(stress resistant)。

优选地，所述酵母细胞是二倍体酵母细胞，因为二倍体酵母通常更具胁迫抗性和强壮性。所述酵母也应优选地从胁迫环境中分离，例如高糖环境，如果汁或甘蔗汁，或使用选择性压力进行进化工程的自适应实验室进化(ALE)分离，如Cakar Z.P.等人作为范例描述的(FEMS Yeast Res.12,2012,171-182)。进化工程涉及在选择性压力存在下进行的重复分批培养的更系统的方法，或者在选择的条件下进行的延长的恒化培养。这些培养可以用野生型进行，或者为了增加遗传多样性，可以用化学或物理诱变的菌株进行。初始单克隆群体的自发或诱导的突变导致在初始单克隆群体中形成适合的变体，这是由于在整个培养中施加的选择压力。在选择条件下，这些适合的变体可以比原始细胞更好地存活和生长。因此，在恒化器或连续批次培养中，培养物中适合的细胞的数量占细胞总数的比例将周期性地增加，并且适合的细胞将主导培养(Cakar,2012,Sauer U(2001),Adv Biochem EngBiotechnol 73:130–166)。

在具体实施方式中，在将细胞转移至种子发酵和生产发酵之前，可以在胁迫条件下预培养或培养酵母细胞至少50、60、70、80、90、100或更多代。所述胁迫条件可以是但不限于高的糖类浓度，具体地是蔗糖或葡萄糖浓度，糖限制、氮耗尽、亚硫酸盐、低pH、由高溶质浓度引起的高渗透挑战、低渗透压、由于好氧或厌氧生成的氧化应激、液体静压、乙醛或乙醇浓度增加、内部酸化、饥饿、热应力，即在约25-30℃的最佳温度以外的培养。

具体地，酵母细胞的应激调节(stress conditioning)在增加的葡萄糖浓度下进行。具体地，葡萄糖浓度可以是约110g/l、120g/l、130g/l、150g/l、160g/l或更高。

根据实施方式，所述重组胁迫抗性二倍体酵母细胞如本文所述进行遗传修饰。具体地，当它们在相同培养基上生长时，所述细胞是葡萄糖耐受的，具有比亲本菌株更高的生长速率。

酿酒酵母可从多种来源获得，包括但不限于美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)、Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS)真菌生物多样性中心、乐斯福公司(LeSaffre)、Gert Strand AB、Ferm Solutions、北美洲生物制品(NorthAmerican Bioproducts)、Martrex和拉曼集团(Lallemand)。酿酒酵母包括但不限于BY4741、CEN.PK 113-7D、酵母(Ethanolyeast)、Bio-XR酵母、GertStrand Prestige Batch Turbo酒精酵母、Gert Strand Pot Distillers酵母、GertStrand Distillers Turbo酵母、FerMax^TM Green酵母、FerMax^TM Gold酵母、酵母、GRF18U、BG-1、PE-2、CAT-1、CBS1585、CBS2910、CBS7833、CBS7834、7835、CBS7836、CBS7837、CBS7838、7839、CBS7840、CBS7959、CBS7960和CBS7961、CBS7962、CBS9562、CBS9563、CBS9564、CBS9565、CEN.PK1 13-7D、CLIB215、CLIB324、CLIB382、EC1118、EC9-8、FL100、曼斯(Fleischmanns)烘焙酵母、FostersB、FostersO、FY、G600、GSY1135、II4、IL-01、IR-2、JAY291、JWY6147、KRY8、LAN211、Lindquist 5672、M1-2、M13、M14、M2-8、M22、M32、M34、M3707、M3836、M3837、M3838、M3839、M5、M52bB、M52cW、M8、MMY112、MUCL28177、N85、NAM34-4C、NC-02、NRRL Y-12632、NY1308、P283、P301、PE-2、PW5、E008、R103、红星烘焙酵母(RedStar baking yeast)、RM11-1A、S228、S288c、SGU57、Sigma1278b、SK1、T7、T73、UC5、UFMG A905、Vin13、VL3、W303、WE372、Y10、Y12、Y2209、Y389、Y9、YB210、YJM1004、YJMI1005、YJMI1006、YJMI1978、YJMI1083、YJMI1094、YJMI1095、YJMI1096、YJMI1097、YJMI1098、YJMI1099、YJMI1100、YJMI1101、YJMI1102、YJMI1103、YJMI1104-YJMI1122、YJMI1124、YJMI1125、YJMI1129、YJMI1133、YJMI1135、YJMI1138、YJMI1139、YJMI1140、YJMI1141、YJMI1142、YJMI1143、YJMI1144、YJMI1145、YJMI1146、YJMI1178、YJMI1190、YJMI1199、YJMI1202、YJMI1208、YJMI1242、YJMI1244、YJMI1248、YJMI1250、YJMI1252、YJMI1259、YJMI1273、YJMI1289、YJMI1292、YJMI1304、YJMI1307、YJMI1311、YJMI1326、YJMI1336、YJMI1338、YJMI1341、YJMI1342、YJMI1355、YJMI1356、YJMI1381、YJMI1383、YJMI1385、YJMI1386、YJMI1387、YJMI1388、YJMI1389、YJMI1399、YJMI1400、YJMI1401、YJMI1402、YJMI1415、YJMI1417、YJMI1418、YJMI1419、YJMI1433、YJMI1434、YJMI1439、YJMI1443、YJMI1447、YJMI145、YJMI1450、YJMI1460、YJMI1463、YJMI1477、YJMI1478、YJMI1479、YJMI1526、YJMI1527、YJMI1549、YJMI1573、YJMI1574、YJMI1592、YJMI1615、YJMI189、YJMI193、YJMI195、YJMI223、YJMI244、YJMI248、YJMI269、YJMI270、YJMI271、YJMI280、YJMI308、YJMI320、YJMI326、YJMI332、YJMI339、YJMI421、YJMI428、YJMI432、YJMI434、YJMI435、YJMI436、YJMI437、YJMI439、YJMI440、YJMI450、YJMI451、YJMI453、YJMI454、YJMI455、YJMI456、YJMI464、YJMI466、YJMI467、YJMI470、YJMI521、YJMI525、YJMI541、YJMI554、YJMI555、YJMI560、YJMI561、YJMI627、YJMI634、YJMI653、YJMI669、YJMI670、YJMI671、YJMI672、YJMI674、YJMI676、YJMI677、YJMI678、YJMI681、YJMI682、YJMI683、YJMI689、YJMI693、YJMI789、YJMI810、YJMI811、YJMI813、YJMI815、YJMI816、YJMI936、YJMI945、YJMI946、YJMI947、YJMI948、YJMI949、YJMI950、YJMI951、YJMI952、YJMI953、YJMI954、YJMI955、YJMI956、YJMI957、YJMI958、YJMI959、YJMI960、YJMI961、YJMI962、YJMI963、YJMI964、YJMI965、YJMI966、YJMI967、YJMI969、YJMI972、YJMI975、YJMI978、YJMI981、YJMI984、YJMI987、YJMI990、YJMI993、YJMI996、YJSH1、YPH499N、YPS1009、YPS163、ZTW1。

在具体实施方式中，酿酒酵母是菌株CBS7962、CBS7959、CBS7960或CBS7961。

在具体实施方式中，酵母菌株可以是尿嘧啶、亮氨酸、色氨酸和/或组氨酸的营养缺陷型。具体地，该菌株是尿嘧啶(ura)、色氨酸(trp)和组氨酸(his)的营养缺陷型，通过灭活编码其的基因。

本发明的实施方式还提供了连续两步发酵系统，其使用重组酵母菌株以糖(例如葡萄糖或蔗糖)作为碳源生产乳酸，由以下组成：

a)种子发酵阶段产生生物质，其中在pH为5至7的培养基中培养酵母，然后

b)生产发酵阶段产生乳酸，其中在pH小于3.5的细胞培养基中培养酵母，具体地直至最终pH约为3，更具体地直至最终pH为约2.8、约2.7、约2.6、约2.5、约2.4、约2.3、约2.2，更具体地直至最终pH约为2.1，

其中酵母编码异源乳酸脱氢酶(LDH)活性并且具有降低或减小的PDC活性。

或者，提供了使用重组酵母菌株以糖(例如葡萄糖或蔗糖)作为碳源生产乳酸的两阶段发酵系统，由以下组成：

a)在第一发酵罐中的种子发酵阶段产生生物质，其中在pH为5至7的培养基中培养酵母，然后

b)从种子发酵接种的第二发酵罐中的生产发酵阶段产生乳酸，其中在pH小于3.5的细胞培养基中培养酵母，具体地直至pH约为3，更具体地直至pH为约2.8、约2.7、约2.6、约2.5、约2.4、约2.3、约2.2，更具体地，直至pH约为2.1，

其中酵母被修饰为具有乳酸脱氢酶(LDH)和/或降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。

在又一实施方式中，使用重组酵母菌株以葡萄糖作为碳源生产乳酸的两种发酵罐系统的组合，由以下组成：

a)种子发酵罐产生生物质，其中在pH为5至7的培养基中培养酵母，然后

b)从种子发酵接种的生产发酵罐产生乳酸，其中在pH小于3.5的细胞培养基中培养酵母，具体地在约3或更低的最终pH下，更具体地直至pH值为约2.8、约2.7、约2.6、约2.5、约2.4、约2.3、约2.2，更具体地直至pH为约2.1，

其中酵母具有乳酸脱氢酶(LDH)活性和降低的或没有丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。

附图说明

图1：在两阶段发酵方法(本发明的方法)中使用乳酸菌与遗传修饰的酵母的制造方法的差异。

图2：两阶段发酵方法分为生物质生长和乳酸形成。

具体实施方式

本发明提供了一种使用重组酵母生产乳酸的新方法。

乳酸(2-羟基丙酸)是一有机化合物，分子式为CH₃CH(OH)CO₂H。具有与羧基相邻的羟基，乳酸被分类为α-羟基酸(AHA)。它的共轭碱形式称为乳酸，它在一些生化过程中起作用。

在溶液中，它可以从羧基电离出质子，产生乳酸根离子CH₃CH(OH)CO₂ ^-。与乙酸相比，其pK_a小于1单位，这意味着乳酸去质子化比乙酸容易十倍。这种更高的酸度是α-羟基和羧酸酯基团之间的分子内氢键结合的结果。

乳酸是手性的，由两种光学异构体组成。乳酸是最简单的具有光学活性的羟基酸。L(+)-乳酸可以在没有D(-)-乳酸的情况下通过发酵直接产生(例如，已知的化学合成产生两种异构体的外消旋混合物)。同样地，D(-)-乳酸可以在没有L(+)-乳酸的的情况下通过发酵来产生。一种被称为L(+)-乳酸或(S)-乳酸，另一种，其镜像，是D(-)-乳酸或(R)-乳酸。两种等量的混合物称为DL-乳酸。

乳酸具有吸湿性。DL-乳酸可与水和乙醇混溶，其熔点大约17或18℃。D-乳酸和L-乳酸具有更高的熔点。

术语“培养基”是指包含足够营养物的固体或液体培养基，包括糖，例如但不限于葡萄糖或蔗糖作为碳源，重组酵母可在其上生长。在恒化器、补料分批或分批培养中，培养基是液体。

本文所用的术语“种子发酵阶段”和“接种发育阶段”是指提供培养条件，其中重组酵母生长至高密度，其可用于接种生产发酵阶段。因此，在对重组酵母生长最佳的条件下(生物质生长期)进行种子发酵。

种子发酵在pH约5.0至7.0下进行，具体地，pH约为5.0。

任选地，第一阶段是葡萄糖或蔗糖限制的(例如，小于约10g/l，优选小于5g/L，更优选小于2g/L)。葡萄糖或蔗糖在本文中用作种子发酵的主要碳源，具体地，接种时种子发酵培养基的葡萄糖含量为10至25g/l，具体地15至25g/l，更具体地为约20g/l。

在该上下文中，低葡萄糖浓度是指用于培养的葡萄糖小于10g/L，具体地小于5g/L，具体地小于2g/L。

作为替代方案，可以应用其它碳源，例如但不限于木质纤维素衍生的糖、木质纤维素水解产物、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖或果糖或其任何混合物。

此外，提供氮源。

种子发酵可以具体地作为补料分批过程或分批过程进行，优选补料分批。

在补料分批条件下，进行分批培养到直至完全或几乎完全消耗葡萄糖和乙醇，然后将新鲜培养基加入培养物中。供给培养基(feed-medium)优选含有高浓度的葡萄糖或蔗糖，具体地20g/l至约500g/L。酵母以维持比生长速率在临界值所需的流速培养，该临界值是菌株特异性的并且能够在使用恒化培养之前确定。如果生长速率超过临界值，则将超过酵母的呼吸能力，并且即使在氧气存在下也会发生基质的发酵。将比生长速率保持在临界值确保了每个基质消耗的高生物质产率而不形成副产物，例如乙醇、乳酸盐、甘油和乙酸盐。

在该上下文中，高的糖浓度是指10g/L糖，具体地20g/L糖或更高的用于培养。

在该上下文中，高的葡萄糖浓度是指10g/L葡萄糖，具体地20g/L葡萄糖或更高的用于培养。

在该上下文中，高的蔗糖浓度是指10g/L蔗糖，具体地20g/L蔗糖或更高的用于培养。

优选地，种子发酵阶段是需氧的。

在某些实施方式中，用于增加生物质的受控变量可选自呼吸商(RQ)、比耗氧速率、比二氧化碳释放速率、pH、生物质水平、比生长速率、氧分压(pO₂)、发热速率，比副产物生产率及其组合。

可以从冷却器数据(例如冷却器流速，和/或冷却器的入口和出口温度)的散热速率估算热生成速率。

在一些实施方式中，其中受控变量是副产物浓度，该副产物选自异丁酸酯、异丁酸、二羟基异戊酸酯、酮异戊酸酯、异丁醛、乳酸酯、乙酰乳酸酯、乙酸酯、甲酸酯、甘油及其组合。

通过测量空气的流速、进气和排气成分(CO₂、O₂等)，可以计算出比二氧化碳释放速率(CER，毫摩尔/克/小时)和比耗氧速率(OUR，毫摩尔/克/小时)，例如，使用质谱法和/或细胞密度测量法。比二氧化碳释放速率是产生的二氧化碳(空气流速乘以出口和入口的二氧化碳浓度之差)与每单位时间的细胞密度的比率。比耗氧速率是消耗的氧气(空气流速乘以入口和出口的氧气浓度之差)与细胞密度的比率。在一些实施方式中，直接测量OUR，例如使用排气分析。在一些实施方式中，直接测量CER，例如使用排气分析。

在一些实施方式中，生物质生长期期间的OUR设定值为约2至约10，约2至约9，约2至约8，约2至约7，约2至约6，约2至约5，约2至约4，或约2至约3，约3至约10，约3至约9，约3至约8，约3至约7，约3至约6，或约3至约5毫摩尔每克细胞每小时(mmol/(细胞g×h)。

在一些实施方式中，生物质生长期期间的CER设定值为约1至约10，约1至约9，约1至约8，约1至约7，约1至约6，约1至约5.5，约1至约4，约1至约3，约2.5至约10，约2.5至约9，约2.5至约8，约2.5至约7，约2.5至约6，约2.5至5，约2.5至约4，约2.5至约3，约2至约10，约2至约9，约2至约8，约2至约7，约2至约6，约2至5，约2至约4，或约2至约3mmol/(细胞g×h)。

呼吸商(RQ)是CER和OUR的比率。对于给定的恒定空气流速，仅需要来自质谱的入口和出口气体成分来计算RQ。RQ用作控制变量，其将耗氧速率与通过生物反应器系统的碳通量联系起来。RQ本质上与规模无关。例如，可以使用排气分析来测量RQ。

比定生长速率可以从细胞密度或OD₆₀₀数据估算，或间接从经验模型的OUR数据估算。

在一些实施方式中，生物质生长期期间的RQ设定值为约0.5至约5，约1至约5，约2至约5，约3至约5，约2至约4，约2至约3，约3至约4，约0.5至约5，约0.7至约5，约0.9至约5，约1.2至约5，约1.4至约5，约1.6至约5，约1.8至约5，约2.2至约5，约2.4至约5，约2.6至约5，约2.8至约5，约3.2至约5，约3.4至约5，约3.6至约5，约3.8至约5，约4.2至约5，约4.4至约5，约4.6至约5，约4.8至约5，约0.5至约4，约0.7至约4，约0.9至约4，约1.2至约4，约1.4至约4，约1.6至约4，约1.8至约4，约2.2至约4，约2.4至约4，约2.6至约4，约2.8至约4，约3.2至约4，约3.4至约4，约3.6至约4，约3.8至约4，约0.5至约1.5，约0.6至约1.5，约0.65至约1.5，约0.67至约1.5，约0.7至约1.5，约0.75至约1.5，约0.8至约1.5，约0.9至约1.5，约0.5至约1.2，约0.6至约1.2，约0.65至约1.2，约0.67至约1.2，约0.7至约1.2，约0.75至约1.2，约0.8至约1.2，约0.9至约1.2，约0.5至约1.05，约0.6至约1.05，约0.7至约1.05，约0.75至约1.05，约0.8至约1.05，约0.9至约1.05，约0.95至约1.5，约0.95至约1.4，约0.95至约1.3，约0.95至约1.2，约0.95至约1.1，或约0.95至约1.05。

在某些实施方式中，用于增加生物质的受操纵变量选自进料速率、进料组成、空气流速、空气成分、搅拌速率、压力及其组合。

根据本发明，术语“约”包括最大10％(具体地最大5％，更具体地最大1％)的数值的偏差。作为示例，因此术语“约10μg”限定9至11μg的范围，具体地9.5至10.5μg，具体地，9.9至1.1μg。

如本文所用的术语“生产发酵阶段”是指培养条件规定为其中可以实现乳酸由重组酵母在3或更低的最终pH下产生，具体地在≤2.9、≤2.8、≤2.7、≤2.6、≤2.5、≤2.4、≤2.3、≤2.2、≤2.15或更低的最终pH。

将由种子发酵获得的酵母细胞接种到生产反应器中开始生产发酵。优选地，接种使用具有高细胞密度的酵母细胞，其>5g/L，优选>10g/L、>20g/L、>30g/L、>40g/L、>50g/L。在确定发酵性能中，接种量可以起重要作用。

用于接种或开始发酵生产的酵母细胞的细胞密度的OD₆₀₀应至少为3，优选OD₆₀₀约为5，优选OD₆₀₀约为6，优选OD₆₀₀约为7，优选OD₆₀₀约为8，优选OD₆₀₀约为9，更优选OD₆₀₀为10。

生产培养基含有高的糖浓度，具体地葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、水解淀粉、乳糖的浓度以确保高乳酸滴度。培养基优选补充有营养物以支持高的糖浓度下的细胞代谢，具体为葡萄糖浓度。

术语“分批培养”是指微生物的封闭培养，其在固定体积的培养基中生长，通过生长的生物的作用，该培养基不断被改变直至其不再适合生长。在分批培养中，微生物生长所需的所有营养物在开始培养之前存在于培养基中，除了需氧培养中的分子氧。

进行分批培养到直至完全或几乎完全消耗葡萄糖。

用于种子和乳酸生产发酵的发酵培养基可以是基本培养基，该基本培养基基本上包含葡萄糖(或者作为替代，蔗糖)，至少一种氮源和水。

用于发酵培养基的氮源可以是但不限于尿素、磷酸铵、硝酸铵、硫酸铵。

此外，可以加入其它盐，例如磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铜、氯化铁、锰、硫酸盐、钼酸钠、硫酸锌、生物素、肌醇和硫胺素。

具体地，基本培养基可以通过选自(NH₄)₂SO₄、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、维生素溶液和痕量元素的基本培养基盐来补充。

有用的维生素溶液可含有，例如D-生物素、Ca-D-泛酸盐、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醛和对氨基苯甲酸。

有用的痕量元素可以是Na₂EDTA、ZnSO₄·7H₂O、MnCl₂·2H₂O、CoCl₂·6H₂O、CuSO₄·5H₂O、Na₂MoO₄·2H₂O、CaCl₂·2H₂O、FeSO₄·7H₂O、H₃BO₃、KI。

通常选择其它发酵条件，例如温度、细胞密度、底物的选择、营养物的选择等，以提供经济的方法。优选的温度，特别是在生产阶段期间，为约25-45℃，具体地约30℃。

可以缓冲培养基或可以添加碱以维持或调节pH。

可以通过在种子发酵阶段期间添加试剂来缓冲培养基，或者来调节pH，使得pH调节或维持在约3.5至约9.0的范围内，具体地约4.5至约7.0，具体地约5.0至约7.0。

可以使用本领域技术人员已知的任何合适的缓冲液，具体地，其是磷酸盐缓冲液。

调节优选的pH的合适试剂是碱性物质，包括例如氢氧化钙、碳酸钙、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠、碳酸铵、氨、氢氧化铵、氢氧化镁等。在常规发酵过程中使用的缓冲剂也适用于此。

优选使生产发酵阶段的pH从起始pH(通常为5.5或更高)降至等于或低于酸性发酵产物的pKa，例如在1.5至3.5的范围内，具体地在1.5至3.0的范围内，或在1.5至2.5的范围内。

或者，在整个过程中，生产发酵阶段的pH保持在或低于乳酸的pKa。因此，在生产发酵过程之前或开始时，将发酵培养基的pH调节至等于或低于乳酸的pKa，并在生产发酵过程中保持在该水平。在该具体实施方式中，pH优选保持在1.5至3.5的范围内，在2.0至3.0的范围内。

在具体实施方式中，生产发酵培养基的最终pH小于5，具体地≤4.5，具体地≤4，具体地≤3.5，具体地≤3，具体地≤2.5，具体地≤2.15。

生产发酵可以具体地作为补料分批过程或分批过程进行，优选分批过程。

根据具体实施方式，在整个生产发酵阶段期间保持pH小于5，具体地≤4.5，具体地≤4，具体地≤3.5，具体地≤3，具体地≤2.5，具体地≤2.15。

根据又一具体实施方式，在整个生产发酵阶段期间保持pH小于或等于3。在另一实施方式中，pH值应保持在≤2.9、≤2.8、≤2.7、≤2.6、≤2.5、≤2.4、≤2.3、≤2.2、≤2.15或更低的pH。

发酵、发酵过程或发酵反应和本文所用的类似术语旨在包括所述过程的生长期和乳酸生物合成期。

如本文进一步描述的，在一些实施方式中，生物反应器可包括第一种子生长反应器和第二发酵反应器。

根据本发明的术语“生物反应器”或“发酵罐”是指支持生物活性环境的任何装置或系统，并且包括由一个或多个容器和/或塔器或管道布置组成的发酵装置。生物反应器通常是圆柱形的，尺寸范围从升到立方米，并且通常由不锈钢制成，包括连续搅拌釜反应器(CSTR)、泡罩塔反应器(BCR)或滴流床反应器(TBR)或其它容器或其它适用于气液接触的装置。在操作模式的基础上，生物反应器可以分为分批、补料分批或连续(例如连续搅拌釜反应器模型)。连续生物反应器的例子是恒化器。

如上所述，种子和生产发酵可以在不同的发酵罐中。因此，生物反应器可以包括培养重组酵母的第一种子生长反应器，和第二生产发酵反应器，来自生长反应器的酵母接种物进料到第二生产发酵反应器中，并且大部分乳酸在第二生产发酵反应器中产生。

如本文所用的初级或第一或种子发酵生物反应器还可包括一个或多个与二级生产发酵生物反应器串联并联连接的反应器。

用于接种生产发酵生物反应器的接种密度优选的OD₆₀₀至少为3。

如本文所用的二级生产发酵生物反应器可包括可与主要生物反应器串联或并联连接的任何数量的其它生物反应器。这些其它生物反应器中的任何一个或多个也可以连接到另外的分离器。

可以使用本领域技术人员已知的方法从低pH发酵培养基中回收乳酸。可以通过已知技术进行纯化，例如通过离心、过滤如微滤、超滤、纳滤、液-液萃取、结晶、色谱法等。

在一些实施方式中，生产发酵导致乳酸产生超过500mM，优选超过60g/L，超过80g/L，超过100g/L，超过120g/L。

可用于本发明方法的重组酵母菌株由于一种或多种异源LDH基因而具有乳酸脱氢酶活性，并且还具有降低或降低丙酮酸脱羧酶活性。

在本发明中，对于任何遗传物质，“异源”或“外源”是指遗传物质对宿主细胞不是天然的。

术语“基因”是指染色体DNA、质粒DNA、cDNA、合成DNA，或编码肽、多肽、蛋白质或RNA分子的其它DNA，以及参与表达调控的编码序列的侧翼区。

术语“突变”是指核酸序列中的任何改变或修改。存在几种类型，包括点、移码和剪接。突变可以特异性地或随机地进行。

术语“质粒”是指圆形的、染色体外的，任选地自我复制的DNA片段。

术语“基因组”包括重组酵母细胞内的染色体和质粒。

术语“乳酸脱氢酶”是指蛋白质(例如酶)，其催化丙酮酸转化为乳酸。

术语“L-乳酸脱氢酶”是指催化丙酮酸转化为L-乳酸的酶，具体地其被分类为EC1.1.1.27。

术语“D-乳酸脱氢酶”是指催化丙酮酸转化为D-乳酸的酶，具体地其被分类为EC1.1.1.28。

术语“LDH基因”是指在表达后产生具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质的基因。本申请中使用的LDH基因可包括任何基因，其在表达时产生具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质。乳酸脱氢酶基因可以是立体特异性的。也就是说，乳酸脱氢酶基因可以催化反应以仅产生L-乳酸或仅产生D-乳酸。其它乳酸脱氢酶催化反应以产生L-乳酸和D-乳酸。L-乳酸脱氢酶基因催化丙酮酸转化为L-乳酸。

合适的LDH基因包括但不限于从细菌、真菌、酵母或哺乳动物来源获得的那些。LDH基因的实例是从瑞士乳杆菌(L.helveticus)、干酪乳杆菌(L.casei)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、嗜热脂肪芽胞杆菌(B.stearothermophilus)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、L.diolivorans、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、酒类酒球菌(Oenococcusoenii)、Bos taurus、嗜酸乳杆菌(P.acidilactici)、植物乳芽孢杆菌(Lactobacillusplantarum)、汉逊氏乳杆菌(L.johnsonii)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、植物乳杆菌(L.plantarum)和戊糖乳杆菌(L.pentosus)获得的那些。优选地，编码的LDH酶不依赖于二磷酸果糖，例如来自植物乳杆菌的L-LDH。

特定L-LDH基因的实例是从植物乳杆芽孢菌、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、B.taurus、嗜酸乳杆菌和人或牛来源获得的那些。

特定D-LDH基因的实例是从瑞士乳杆菌、汉逊氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌、植物乳杆菌和戊糖乳杆菌获得的那些。

与任何这些L-LDH或D-LDH基因相同或至少80％、85％、90％或95％同源的功能基因是合适的。如果需要，可以对从任何这些来源获得的天然基因进行诱变，以提供用真核起始密码子(ATG)开始的编码序列。

可以使用具有默认参数的BLAST或SmartBLAST软件方便地计算DNA、RNA或其它遗传物质和蛋白质氨基酸序列的同一性百分比。

重组酵母细胞可含有单个LDH基因或多个LDH基因，例如1至10个LDH基因，尤其是1至5个LDH基因。当转化的酵母含有多个LDH基因时，个别基因可以是相同基因的拷贝，或包括两个或更多个不同LDH基因的拷贝。外源LDH基因的多个拷贝可以整合在单一基因座上，因此它们彼此相邻，或在酵母基因组内的几个基因座处。

外源LDH基因处于一种或多种启动子和一种或多种终止子的转录控制下，它们在修饰的酵母细胞中都是功能性的。

如根据本发明所使用的，术语“启动子”是指位于结构基因的翻译起始密码子上游(即5’)的未转录序列(通常在约1至1000bp内，优选1-500bp，尤其是1-100bp)并且其控制结构基因的转录起点。

术语“终止序列”是指位于结构基因的翻译终止密码子下游(即3’)的未转录序列(通常在约1至1000bp内，更通常为1-500个碱基对，尤其是1-100个碱基对)并控制结构基因的转录终点。

如果启动子或终止子在基因组中相对于结构基因的位置使得启动子或终止子(视情况而定)执行其转录控制功能，则启动子或终止子与结构基因“可操作地连接”。

启动子和终止子序列对于本发明的重组酵母细胞可以是天然的或外源的。

特别合适的LDH基因包括编码酶的基因，与UniProtKB-P56512(LDH1_LACPL)，SEQID No.1相比，该酶具有至少60％，特别是至少80％、85％或95％的同一性评分(identitiesscore)的氨基酸序列，SEQ ID No.1：

使用天然酵母细胞启动子和终止子，连同各自的上游和下游侧翼区一起可以允许LDH基因靶向整合到酵母基因组的特定基因座中，并且同时整合LDH基因和缺失或破坏另一个天然基因(例如PDC基因)。

当将多个外源LDH基因引入酵母细胞时，不同LDH基因可能处于不同类型的启动子和/或终止子的控制之下。

外源LDH基因可以随机整合到酵母基因组中或插入一个或多个靶向位置。靶向位置的实例包括希望缺失或破坏的一种或多种基因的基因座，例如PDC或MTH1基因的基因座。

术语“缺失”和“破坏”是指消除基因的整个编码区，或修饰相应的启动子和/或终止子区，例如通过缺失、插入或突变，使得基因不表达蛋白质或蛋白质的活性形式，或产生活性显著降低的酶。可以通过基因工程法，强制进化或诱变，然后通过适当选择或筛选以鉴定所需的突变体来完成缺失或破坏。

本发明的重组酵母还具有PDC1、PDC5和/或PDC6基因的其它遗传修饰，例如其缺失或破坏，从而降低酵母产生乙醇的能力。

PDC1和PDC5在葡萄糖发酵过程中是活跃的，其中PDC1的表达强度是PDC5的约六倍。PDC6的表达很弱且似乎在乙醇培养基中被诱导。

具体地，重组酵母是丙酮酸脱羧酶阴性的或无活性的或降低的酵母菌株，其具有降低的或不可检测的丙酮酸脱羧酶活性，并且在葡萄糖作为唯一碳源的合成培养基中的有氧环境中不生长或显示生长受损，并且在基本培养基中的有氧环境中的生长期间可以不产生可检测量的乙醇(例如，小于约1ppm)。

具体地，PDC1、PDC5和PDC6基因中的一个、两个或全部被功能性敲除或缺失。具体地，重组酵母菌株缺乏PDC1、PDC5和PDC6的等位基因。

或者，PDC1、PDC5和PDC6基因中的一个、两个或全部由于组成型条件型/诱导型启动子的控制而有条件地表达，即在某些条件下或在添加所选补充物时下调或上调基因表达的启动子。在具体实施方式中，条件型启动子是葡萄糖可抑制的。在另一具体实施方式中，条件型启动子是pH依赖性的，优选在pH>5时有活性，但在pH<4时无活性。在具体实施方式中，条件型启动子来自HXT基因，具体地来自HXT2、HXT4、HXT1或HXT7。

合适的组成型启动子的实例是来自糖酵解酶的启动子。这种糖酵解启动子的实例是TPI1(磷酸丙糖异构酶1启动子、TDH3(GAPH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶)启动子、PGK1(3-磷酸甘油酸激酶)启动子和PGI1磷酸葡萄糖异构酶)启动子。

酿酒酵母具有20个编码类似于葡萄糖(己糖)转运蛋白(HXT1至HXT17、GAL2、SNF3和RGT2)的蛋白质的基因。这些Hxt蛋白属于转运蛋白的主要促进子超家族(MFS)。MFS蛋白通过被动的，与能量无关的促进扩散来运输它们的底物，其中葡萄糖下移浓度梯度。己糖转运蛋白基因是HXT1、HXT2、HXT3、HXT4、HXT5、HXT6、HXT7、HXT8、HXT9、HXT10、HXT11、HXT12、HXT13、HXT14、HXT15、HXT16、HXT17、GAL2、SNF3和RGT2，但是本文也包括编码可用于酵母的己糖转运系统的任何其它未知基因。

根据一个实施方式，使用异源组成型或诱导型启动子过表达一种或多种上文列出的己糖转运蛋白基因。

根据进一步的实施方式，酵母包含MTH1或STD1基因的功能性缺失。根据进一步的实施方式，酵母包含MTH1基因的过表达。Std1蛋白调节葡萄糖调节基因(glucose-regulated genes)的表达，并且应该与葡萄糖传感器Snf3和Rgt2相互作用。假设Std1、Mth1的同源物与Snf3相互作用而不与Rgt2相互作用。STD1、MTH1、SNF3和RGT2之间的遗传相互作用表明葡萄糖信号传导至少部分地通过这些基因的产物的相互作用介导。在缺乏葡萄糖或葡萄糖含量低的培养基中，己糖转运蛋白基因受到需要Std1和Mth1蛋白的机制的抑制。

根据本发明的具体实施方式，MTH1基因包含至少部分缺失，导致基因表达产物缺乏功能性。

对本文所述方法特别有用的是重组二倍体酵母菌株，优选酿酒酵母，包括PDC1、PDC5和PDC6基因的功能性缺失，MTH1基因的功能性缺失，HXT1基因的过表达和至少一种异源LDH基因。

如本文所用，术语“单倍体”是指具有每个染色体的一个拷贝的单倍体酵母细胞，即单组未配对的染色体。

如本文所用，术语“二倍体”是指具有每个染色体的两个同源拷贝的二倍体酵母细胞。在二倍体状态下，单倍体数量加倍，因此，这种情况也称为2n。

“同源染色体”或“每条染色体的同源拷贝”是指染色体在相同基因座中具有相同的基因，其中它们沿每条染色体提供点，使得一对染色体能够彼此正确对齐。但是，染色体(和基因)不一定相同。相同的基因可以由两个不同的等位基因编码。等位基因是给定基因的变体形式。

多倍体是指含有两个以上配对的同源染色体组的细胞，即它指的是整组染色体的数值变化。多倍体是细胞具有超出基本组(通常为3或更多)的多组染色体的状态。

非整倍性是细胞中存在异常数量的染色体，例如正常组的一个或多个染色体缺失或存在超过其通常的拷贝数的状态。与整倍性不同，非整倍体核型不是单倍体数的倍数。非整倍性还描述了一个或多个染色体的重要部分缺失或存在超过其通常的拷贝数的状态。

如本文所述的二倍体酵母细胞能够在非常低的pH，即甚至低于2.5的条件下产生80g/100g或更多的葡萄糖的量的游离乳酸。

本发明包括以下项目：

1.一种使用糖，具体是葡萄糖或蔗糖作为碳源在重组酵母细胞培养中生产乳酸的方法，包括：

b)用来自种子发酵的生物质生产乳酸的生产发酵阶段，其中在pH<5的培养基中培养酵母，和

其中所述酵母具有乳酸脱氢酶(LDH)活性和/或降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。

2.根据项目2所述的方法，其中所述酵母细胞是二倍体、多倍体或非整倍体细胞，具体地所述酵母细胞在胁迫条件下进行选择并且经遗传修饰。

3.根据项目1或2所述的方法，其中种子发酵处于高葡萄糖浓度。

4.根据项目1至3所述的方法，其中生产发酵处于低葡萄糖浓度。

5.根据项目1至4中任一项所述的方法，其中通过常规工业方法纯化乳酸。

6.根据项目1至5中任一项所述的方法，其中从发酵阶段纯化乳酸，纯度至少为90％。

7.根据项目1至6中任一项所述的方法，其中生产发酵阶段的pH≤4.5，具体地≤4，具体地≤3.5。

8.根据项目1至7中任一项所述的方法，其中生产发酵阶段的最终pH为3或更低，具体地最终pH≤2.9、≤2.8、≤2.7、≤2.6、≤2.5、≤2.4、≤2.3、≤2.2、≤2.15或更低。

9.根据项目1至8中任一项所述的方法，其中所述种子发酵阶段在补料分批条件下进行。

10.根据项目1至9中任一项所述的方法，其中所述生产发酵阶段在分批过程条件下进行。

11.根据项目1至10中任一项所述的方法，其中所述种子发酵阶段和生产发酵阶段在不同的发酵罐中。

12.根据项目1至11中任一项所述的方法，其中乳酸以游离形式产生，具体地它以光学纯异构形式产生，具体地它是D(-)-乳酸或L(+)-乳酸。

13.根据项目1至12中任一项所述的方法，其中所述酵母降低或敲除了一种或多种基因PDC1、PDC5和/或PDC6的表达。

14.根据项目13中任一项所述的方法，其中PDC1、PDC5和/或PDC6基因的一种或多种启动子被取代或缺失。

15.根据项目14所述的方法，其中基因PDC1、PDC5和/或PDC6是条件性表达的，具体地是由于异源启动子的控制，具体地是葡萄糖阻抑型启动子的控制，更具体地是由于HXT2或HXT4基因启动子的控制。

16.根据项目13至15中任一项所述的方法，其中缺失基因PDC1、PDC5和/或PDC6中的至少一种。

17.根据项目1至16中任一项所述的方法，其中酵母具有降低或敲除的一种或多种基因的表达，该基因编码与葡萄糖传感器相互作用的蛋白质，该葡萄糖传感器控制葡萄糖调节的基因表达，具体是Std1或Mth1蛋白的表达。

18.根据项目1至17中任一项所述的方法，其中部分或完全缺失MTH1基因。

19.根据项目1至18中任一项所述的方法，其中修饰所述酵母以过表达至少一种己糖转运蛋白基因。

20.根据项目1至19中任一项所述的方法，其中修饰所述酵母以过表达选自HXT1、HXT2、HXT3、HXT4、HXT5、HXT6、HXT7、HXT8、HXT9、HXT10、HXT11、HXT12、HXT13、HXT14、HXT15、HXT16、HXT17、GAL2、SNF3和RGT2中的至少一种己糖转运蛋白基因。

21.根据项目1至20中任一项所述的方法，其中生产阶段中葡萄糖的初始浓度为至少10％(w/w)，具体地20％(w/w)或更高，更具体地25％或更高。

22.一种重组酵母，其包含一种或多种异源乳酸脱氢酶(LDH)基因并具有降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)。

23.根据项目22所述的重组酵母，其具有降低或敲除的编码PDC1、PDC5和/或PDC6的一种或多种基因的表达。

24.根据项目23所述的重组酵母，其中PDC1、PDC5和/或PDC6基因的一种或多种启动子被取代或缺失。

25.根据项目23或24所述的重组酵母，其中编码PDC1、PDC5和/或PDC6的基因是条件性表达的，具体地是由于异源启动子的控制，具体地是葡萄糖阻抑型启动子的控制，更具体地是由于HXT2或HXT4基因启动子的控制。

26.根据项目23至25所述的重组酵母，其中缺失编码PDC1、PDC5和/或PDC6的至少一种基因。

27.根据项目23至26中任一项所述的重组酵母，其具有降低或敲除的一种或多种基因的表达，该基因编码与葡萄糖传感器相互作用的蛋白质，该葡萄糖传感器控制葡萄糖调节的基因表达，具体是Std1或Mth1蛋白的表达。

28.根据项目23至27中任一项所述的重组酵母，其中部分或完全缺失MTH1基因。

29.根据项目23至28中任一项所述的重组酵母，其经修饰以过表达至少一种己糖转运蛋白基因。

30.根据项目23至29中任一项所述的重组酵母，其经修饰以过表达选自HXT1、HXT2、HXT3、HXT4、HXT5、HXT6、HXT7、HXT8、HXT9、HXT10、HXT11、HXT12、HXT13、HXT14、HXT15、HXT16、HXT17、GAL2、SNF3和RGT2中的至少一种己糖转运蛋白基因。

31.重组酵母菌株，具体是二倍体、多倍体或非整倍体酵母细胞，其包含：

i)PDC1、PDC5和PDC6基因的功能缺失，

ii)MTH1基因的功能缺失，

iii)HXT1基因的过表达，和

iv)LDH基因的异源表达。

32.根据项目23至31中任一项所述的重组酵母菌株，其为酿酒酵母种类。

33.使用重组酵母菌株以葡萄糖作为碳源生产乳酸的两步发酵系统，由以下组成：

a)种子发酵阶段产生生物质，其中在pH为5至7的培养基中培养酵母细胞，然后

b)生产发酵阶段产生乳酸，其中在细胞培养基中培养酵母细胞直至最终pH为3.5或更低，具体地达到pH≤3.4、≤3.3、≤3.2、≤3.1、≤3.0、≤2.9、≤2.8、≤2.7、≤2.6、≤2.5、≤2.4、≤2.3、≤2.2、≤2.15或更低，

其中所述酵母编码异源乳酸脱氢酶(LDH)并具有降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。

34.使用重组酵母菌株以葡萄糖作为碳源生产乳酸的两阶段发酵系统，由以下组成：

a)第一发酵罐中的种子发酵阶段产生生物质，其中在pH为5至7的细胞培养基中培养酵母细胞，然后

b)从种子发酵接种的第二发酵罐中的生产发酵阶段产生乳酸，其中所述在pH小于3.5的细胞培养基中培养酵母细胞，具体地pH≤2.9、≤2.8、≤2.7、≤2.6、≤2.5、≤2.4、≤2.3、≤2.2、≤2.15或更低，

其中酵母经修饰为具有乳酸脱氢酶(LDH)活性和/或降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。

35.使用重组酵母菌株以葡萄糖作为碳源生产乳酸的两种或更多种发酵罐系统的组合，由以下组成：

a)种子发酵罐产生生物质，其中在pH为5至7的细胞培养基中培养所述酵母细胞，然后

b)从种子发酵接种的生产发酵罐产生乳酸，其中在pH小于3.5的细胞培养基中培养酵母细胞，具体地pH≤3.4、≤3.3、≤3.2、≤3.1、≤3.0、≤2.9、≤2.8、≤2.7、≤2.6、≤2.5、≤2.4、≤2.3、≤2.2、≤2.15或更低，

其中所述酵母编码异源乳酸脱氢酶(LDH)基因并且具有降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)和。

实施例

本文描述的实施例是对本发明的说明而不是对其的限制。已经根据本发明描述了本发明的不同实施例。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本文描述和说明的技术进行许多修改和变化。因此，应该理解这些实施例仅是说明性的，并不限制本发明的范围。

如果没有另外说明，实施例中使用的酵母细胞是二倍体酵母细胞。

实施例1：酿酒酵母(CBS7962)菌株在不同葡萄糖和乳酸浓度和pH下的发酵性能的表征。

在生物反应器和摇瓶中分两个阶段培养酿酒酵母CBS7962菌株。使用含有1.8g/lYNB、5g/l(NH₄)₂SO₄和20g/l葡萄糖的培养基的接种物培育阶段。使用储存在-80℃的甘油小瓶中的细胞接种到50ml的预接种(preinoculum)培养基中，其光密度在600nm(OD600)为0.05。生长24小时后，收获细胞并在培养阶段在摇瓶中和生物反应器(Eppendorf DASGIPDASbox4，德国)中用作接种物，摇瓶和生物反应器的工作体积分别为50ml和700ml。表1和表2列出了培养阶段的培养基组成和发酵参数。所有培养均在30℃下进行；将摇瓶在设定为180rpm的定轨摇床中孵育；加入邻苯二甲酸氢钾缓冲液至浓度为100mM，将摇瓶中的pH维持在3.0；通过自动添加2M NaOH来维持生物反应器培养中的pH。对生物反应器培养进行编程以通过控制通气和搅拌器速度将溶解氧浓度维持在20％及以上。从摇瓶和生物反应器培养中定期取样以通过遵循600nm处的光密度测量生长，并使用设置在HPLC(岛津科学仪器)中的Aminex HPX-87H柱(60℃，5mM H₂SO₄作为洗脱液，流速为0.6ml/min)测量包括葡萄糖、乙醇、甘油和乳酸的代谢物的上清液。结果清楚地表明，通过增加YNB和硫酸铵的浓度并增加初始接种量，可以显著提高在高浓度葡萄糖和培养基存在乳酸时的乙醇生产的发酵速率和产率(表1和表2)。

表1酿酒酵母CBS7962的生物反应器培养

表2酿酒酵母CBS7962的摇瓶培养

实施例2：使用分裂标记(split-maker)缺失方法构建缺少丙酮酸脱羧酶(PDC1、PDC5和PDC6)基因的酿酒酵母菌株。

通过使用卡那霉素和潮霉素作为选择标记物的分裂标记缺失方法促进PDC1、PDC5和PDC6的等位基因的敲除。用于缺失和验证引物的引物序列列于表3中。设计了两个构建体用于缺失其中一个等位基因。每个构建体含有靶基因的侧翼，然后是LoxP位点，和大约一半的其中一种选择标记物。侧翼区和LoxP位点包括在引物中，该引物分别用于从pPM2aK21和pPM2a_hphR扩增部分卡那霉素和潮霉素的选择标记物。将含有靶基因侧翼区、LoxP位点和部分的其中一种选择标记物的两个PCR构建体转化到CBS7962菌株中。根据LiAc/PEG/ss-DNA方案(http://home.cc.umanitoba.ca/～gietz/method.html)进行转化。将转化体接种在选择性YP乙醇-甘油培养基(10g/l酵母提取物、20g/l蛋白胨、10g/l乙醇和10g/l甘油)，并在30℃下孵育3-4天。然后使用针对靶基因的验证引物对单菌落进行菌落PCR。菌落PCR如下进行：用移液管尖端轻触酵母菌落，并转移到含有1.2M山梨糖醇、100mM磷酸氢钠和1500U/ml裂解酶的PCR管中，在37℃下培养15分钟；使用靶基因的验证引物和裂解的细胞悬浮液作为模板进行PCR。使用包含靶基因侧翼区、LoxP位点和部分其它选择标记物的两个PCR构建体，将验证为失去了pdc基因的一个等位基因的酵母菌落用于转化以敲除靶基因的另一个等位基因。使用菌落PCR验证出现在含有G418和潮霉素平板的YP乙醇-甘油培养基上的那些转化体来缺失靶基因的两个等位基因。用CRE质粒转化具有缺失的三个pdc基因之一的所得菌株以除去两种选择标记物。表达CRE质粒的菌株随后在非选择性YP乙醇-甘油平板上生长来获得不含CRE质粒的菌落。然后使用上述相同的程序将具有其中一个缺失的pdc基因的酵母菌株用于敲除其它pdc基因。

表3 PDC缺失和验证引物的引物序列

实施例3：构建具有无活性丙酮酸脱羧酶(PDC1、PDC5和PDC6)基因的酿酒酵母菌株：使用CRISPR-cas9系统敲除pdc基因。

CRISPR-cas9系统，使用RNA引导的内切核酸酶活性诱导靶位点的双链DNA断裂(dsb)并用含有终止密码子的双链(ds)DNA同源寡核苷酸修复dsb，来灭活pdc基因。根据LiAc/PEG/ss-DNA方案(http://home.cc.umanitoba.ca/～gietz/method.html)进行转化。使用golden gate组装，将内切核酸酶cas9构建在TEF1启动子和CYC1终止子下的着丝粒质粒中(Engler等人，2008)。使用ChopChop(https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/)鉴定PDC1、PDC5和PDC6基因的向导RNA(gRNA)。构建20bp gRNA以分别在5’和3’末端含有锤头(HH)核酶的序列和丁型肝炎病毒(HDV)核酶的序列(表4)。使用具有重叠引物的PCR获得核酶-gRNA-核酶(RGR)构建体(表4)。使用四种常见的重叠引物和对pdc基因的gRNA特异的两种正向引物进行构建RGR的PCR(表4)，该重叠引物包括1gRNA_all_rev、2gRNA_all_rev、3gRNA_all_rev和4gRNA_all_fw。使用golden gate组装，将RGR构建体组装在具有TPI1启动子和CYC1终止子的2μ质粒中。用于辅助修复dsb的dsDNA寡核苷酸是PCR构建的，以含有终止密码子，其两末端侧翼为约90bp的同源区。分两步进行pdc的敲除，一次一个基因。在第一步中，通过将含有cas9的着丝粒质粒转化到CBS7962菌株中，获得表达cas9的酵母菌株。用PDC1RGR质粒及其各自的dsDNA寡核苷酸转化cas9表达菌株。将转化体接种在选择性YPD培养基(10g/l酵母提取物、20g/l蛋白胨和20g/l葡萄糖)上，并在30℃孵育3-4天。使用PCR验证单菌落的PDC1敲除。为此，通过用合适的引物扩增来验证PDC基因的存在。采用上述相同的方法，使用含有着丝粒cas9质粒的PDC1敲除菌株敲除两个其它PDC基因。对于最后的PDC敲除，将转化体接种在选择性YP乙醇-甘油培养基(10g/l酵母提取物、20g/l蛋白胨、10g/l乙醇和10g/l甘油)上以使这些敲除菌株生长。

表4使用CRISPR-Cas9用于PDC失活的gRNA序列、引物序列和gRNA构建体序列

实施例4：构建用于尿嘧啶、色氨酸和组氨酸的酿酒酵母(CBS7962)菌株营养缺陷型：使用CRISPR-cas9系统灭活URA3、TRP1和HIS3基因。

CRISPR-cas9系统，使用RNA引导的核酸内切酶活性诱导靶位点的双链DNA断裂(dsb)并用含有终止密码子的双链(ds)DNA同源寡核苷酸修复dsb，来灭活URA3、TRP1和HIS3基因。根据LiAc/PEG/ss-DNA方案(http://home.cc.umanitoba.ca/～gietz/method.html)进行转化。使用golden gate组装将内切核酸酶cas9构建在TEF1启动子和CYC1终止子下的着丝粒质粒中(Engler等人，2008)。使用ChopChop(https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/)鉴定URA3、TRP1和HIS3基因的向导RNA(gRNA)。构建20bpgRNA以分别在5’和3’末端含有锤头(HH)核酶的序列和丁型肝炎病毒(HDV)核酶的序列(表5)。使用具有重叠引物的PCR获得核酶-gRNA-核酶(RGR)构建体。使用四种常见的重叠引物和对URA3、TRP1和HIS3基因的gRNA特异的两种正向引物进行构建RGR的PCR(表5)，该重叠引物包括1gRNA_all_rev、2gRNA_all_rev、3gRNA_all_rev和4gRNA_all_fw。使用golden gate组装，将RGR构建体组装在具有TPI1启动子和CYC1终止子的2μ质粒中。用于辅助修复dsb的dsDNA寡核苷酸是PCR构建的，以含有2个终止密码子，其两末端侧翼具有约40-50bp的同源区(表5)。分两步进行URA3、TRP1和HIS3基因的敲除，一次一个基因。在第一步中，通过将含有cas9的着丝粒质粒转化到CBS7962菌株中，获得表达cas9的酵母菌株。用URA3 RGR质粒及其各自的dsDNA寡核苷酸转化cas9表达菌株。将转化体接种在选择性YPD培养基(10g/l酵母提取物、20g/l蛋白胨和20g/l葡萄糖)上，并在30℃孵育3-4天。然后将单菌落复制接种在YNB-尿嘧啶-FOA培养基(1.8g/l的YNB、5g/l的(NH4)2SO4、20g/l的葡萄糖、1g/l的5'FOA和500μg/ml的尿嘧啶)和YNB脱落(dropout)培养基(1.8g/l的YNB、5g/l的(NH4)2SO4和20g/l的葡萄糖)上。使用上述相同的程序对具有cas9表达质粒的URA3敲除菌株进行TRP1和HIS3基因的逐步敲除。

表5使用CRISPR-Cas9用于ura3、trp1和his3失活的gRNA、引物、dsDNA寡核苷酸和RGR的序列

ENGLER,C.,KANDZIA,R.&MARILLONNET,S.2008.具有高生产力的一罐一步式精密克隆方法(A One Pot,One Step,Precision Cloning Method with High ThroughputCapability).Plos One,3.

实施例5：构建表达来自植物乳杆菌的异源LDH活性的酿酒酵母(CBS7962和ΔΔΔpdc)菌株。

用含有LDH基因的2μ质粒转化缺少PDC1、PDC5和PDC6等位基因的酿酒酵母菌株。作为对照，还用含有LDH基因的2μ质粒转化酿酒酵母CBS7962的野生型菌株。2μ的区域包含两个599bp的反向重复序列，由大和小的独特区域分隔；2μ使得滚环复制能够在每个细胞周期中产生多个质粒拷贝。所述质粒通过golden gate组装程序构建(Engler等人，2008)。先前使用植物乳杆菌ATCC8014(Branduardi等人，2006)的基因组作为模板和含有对骨架1载体适当的融合位点的引物对LDH基因进行PCR扩增。将LDH和骨架1接头的PCR构建体进行BbsI切割以获得含有LDH编码序列的骨架1质粒。类似地，分别使用以酿酒酵母基因组作为模板扩增的各元件的PCR构建体构建含有TPI1启动子和CYC1终止子的骨架1质粒。将LDH、TPI1启动子和CYC1终止子的骨架1质粒与骨架2接头一起进行BpiI切割以获得具有LDH表达盒的骨架2质粒。将得到的质粒连同含有2μ和酿酒酵母的ORI的骨架3接头进行BbsI切割以获得酵母表达质粒，然后将其用于转化上述酵母菌株。根据LiAc/PEG/ss-DNA方案(http://home.cc.umanitoba.ca/～gietz/method.html)进行两种菌株的转化。将ΔΔΔpdc菌株的转化体接种在选择性YP乙醇-甘油培养基(10g/l酵母提取物、20g/l蛋白胨、10g/l乙醇和10g/l甘油)上。然而，将CBS7962菌株的转化体接种在选择性YPD培养基(10g/l酵母提取物、20g/l蛋白胨和20g/l葡萄糖)上。在30℃孵育3-4天后从两个转化体中获得单菌落。

BRANDUARDI,P.,SAUER,M.,DE GIOIA,L.,ZAMPELLA,G.,VALLI,M.,MATTANOVICH,D.&PORRO,D.2006.来自工程化酵母的乳酸生产率取决于宿主背景、乳酸脱氢酶来源和乳酸输出，微生物细胞工厂，5(Lactate production yield from engineered yeasts isdependent from the host background,the lactate dehydrogenase source and thelactate export.Microbial Cell Factories,5).

ENGLER,C.,KANDZIA,R.&MARILLONNET,S.2008.具有高生产力的一罐一步式精密克隆方法(A One Pot,One Step,Precision Cloning Method with High ThroughputCapability).Plos One,3。

实施例6：使用CRISPR-Cas9系统在条件表达系统的控制下构建具有丙酮酸脱羧酶基因的酿酒酵母CBS7962菌株。

丙酮酸脱羧酶基因PDC1、PDC5和PDC6在面包酵母中组成型表达。该实施例提供了禁用pdc基因的组成型表达并在HXT2基因或HXT4基因的启动子控制下实现pdc基因的条件表达的描述。基因HXT2和HXT4在低含量的葡萄糖(0.1％)下表达并在高含量的葡萄糖下被抑制(Ozcan和Johnston，1995)。使用CRISPR-Cas9系统，pdc基因的启动子被HXT2或HXT4基因的启动子取代。CRISPR-cas9系统，RNA引导的核酸内切酶活性在靶位点诱导双链DNA断裂(dsb)，并用含有HXT2或HXT4启动子序列的双链(ds)DNA同源寡核苷酸修复dsb，用于启用pdc基因的条件表达系统。根据LiAc/PEG/ss-DNA方案(http://home.cc.umanitoba.ca/～gietz/method.html)进行转化。使用golden gate组装，将内切核酸酶cas9构建在TEF1启动子和CYC1终止子下的着丝粒质粒中(Engler等人，2008)。使用chopchop(https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/)鉴定靶向PDC1、PDC5和PDC6的启动子的gRNA。构建20bpgRNA以分别在5’和3’末端含有锤头(HH)核酶的序列和丁型肝炎病毒(HDV)核酶的序列。使用四种常见的重叠引物(表6)和对pdc基因的启动子的gRNA特异的两种正向引物进行构建核酶-gRNA-核酶(RGR)的PCR，该重叠引物包括1gRNA_all_rev、2gRNA_all_rev、3gRNA_all_rev和4gRNA_all_fw。使用golden gate组装，将RGR构建体组装在具有TPI1启动子和CYC1终止子的2μ质粒中。设计dsDNA寡核苷酸以包含HXT2或HXT4基因的启动子序列，并且启动子序列的末端设计为包含与pdc基因的天然启动子邻近的区域同源的40bp序列。取代pdc基因的组成型启动子分两步进行，一次一个启动子。在第一步中，通过将含有cas9的着丝粒质粒转化到酵母菌株中获得表达cas9的酵母菌株。然后用含有靶向PDC1启动子的gRNA和含有HXT2或HXT4启动子序列的dsDNA寡核苷酸的RGR转化cas9表达菌株。将CBS792菌株的转化体接种在选择性YPDE培养基(10g/l酵母提取物、20g/l蛋白胨、1g/l葡萄糖和10g/l乙醇)上，并在30℃下孵育3-4天。然后使用针对靶区域的验证引物对单菌落进行菌落PCR。菌落PCR如下进行：用移液管尖端轻轻接触酵母菌落，并转移到含有1.2M山梨糖醇、100mM磷酸氢钠和1500U/ml裂解酶的PCR管中，在37℃下孵育15分钟；使用针对靶区域和裂解的细胞悬浮液的验证引物作为模板进行PCR。然后将经验证为含有代替PDC1启动子的HXT2或HXT4启动子的酵母菌落接种在非选择性培养基上以除去含有PDC1启动子的gRNA的质粒。然后用上述相同的方法，使用含有cas9表达质粒的酵母菌株一次一个地来替换PDC5和PDC6的启动子。

表6

OZCAN,S.&JOHNSTON,M.1995.三种不同的调节机制使得酵母己糖转运蛋白(HXT)基因能够被不同含量的葡萄糖诱导(Three different regulatory mechanisms enableyeast hexose transporter(HXT)genes to be induced by different levels ofglucose).Mol Cell Biol,15,1564-72.

实施例7：使用CRISPR-Cas9系统构建用于缺失MTH1基因中225bp内部区域的酿酒酵母(CBS7962和ΔΔΔpdc)菌株。

CRISPR-cas9系统，RNA引导的核酸内切酶活性在靶位点诱导双链DNA断裂(dsb)，并用双链(ds)DNA同源寡核苷酸修复dsb，用于缺失MTH1基因中225bp(169至393bp)的区域(表8)。两种向导RNA(gRNA)用于诱导两种dsb，并且内部缺失序列的500bp侧翼区的dsDNA寡核苷酸用于修复dsb。根据LiAc/PEG/ss-DNA方案(http://home.cc.umanitoba.ca/～gietz/method.html)进行转化。使用golden gate组装，将内切核酸酶cas9构建在TEF1启动子和CYC1终止子下的着丝粒质粒中(Engler等人，2008)。使用chopchop(https:// chopchop.rc.fas.harvard.edu/)鉴定位于待缺失的MTH1区域内的两个gRNA(MTH1_A和MTH1_B)(表8)。类似地，鉴定该区域外的两个gRNA(MTH1_C和MTH1_D)。构建20bp gRNA以分别在5’和3’末端含有锤头(HH)核酶的序列和丁型肝炎病毒(HDV)核酶的序列(表8)。使用具有重叠引物的PCR获得核酶-gRNA-核酶(RGR)构建体(表8)。使用四种常见重叠引物和对MTH1_A和MTH1_B gRNA特异的两个正向引物进行用于构建RGR的PCR(表8)，该重叠引物包括1gRNA_all_rev、2gRNA_all_rev、3gRNA_all_rev和4gRNA_all_fw。使用golden gate组装，将两种RGR构建体组装在具有TPI1启动子和CYC1终止子的2μ质粒中。用于通过同源重组辅助225bp缺失的dsDNA寡核苷酸被PCR构建成含有500bp同源区(表8)，该同源区位于内部缺失区域两侧。使用具有重叠引物组的CBS7962菌株的基因组DNA在融合PCR中扩增dsDNA寡核苷酸(表8)。分两步进行MTH1基因的部分框内缺失。在第一步中，通过将含有cas9的着丝粒质粒转化到酵母菌株中获得表达cas9的酵母菌株。cas9表达菌株用MTH1_A和MTH1_B(或分别为MTH1_C和MTH1_D)质粒和各自的dsDNA寡核苷酸的RGR转化。将CBS792和ΔΔΔpdc菌株的转化体接种在选择性YPD培养基(10g/l酵母提取物、20g/l蛋白胨和20g/l葡萄糖)上，并在30℃孵育3-4天。然后使用针对靶基因的验证引物(表8)对单菌落进行菌落PCR。菌落PCR如下进行：用移液管尖端轻轻接触酵母菌落，转移到含有1.2M山梨糖醇、100mM磷酸氢钠和1500U/ml裂解酶的PCR管中，在37℃下孵育15分钟；使用靶基因的验证引物和裂解的细胞悬浮液作为模板进行PCR。

表7使用CRISPR-Cas9用于MTH1内部框内缺失的gRNA、引物、dsDNA寡核苷酸和RGR的序列

实施例8：构建酿酒酵母(CBS7962和ΔΔΔpdc)菌株以过表达内源MTH1基因。

用含有MTH1基因的2μ质粒转化缺少PDC1、PDC5和PDC6等位基因的酿酒酵母菌株。作为对照，还用含有MTH1基因的2μ质粒转化酿酒酵母CBS7962的野生型菌株。2μ的区域包含由大和小的独特区域分隔的两个599bp的反向重复序列；2μ使得滚环复制能够在每个细胞周期中产生多个质粒拷贝。所述质粒通过golden gate组装程序构建(Engler等人，2008)。先前使用CBS7962菌株的基因组作为模板和含有对骨架1载体适当的融合位点的扩增引物(表9)PCR扩增MTH1基因。将MTH1和骨架1接头的PCR构建体进行BbsI切割，以获得含有MTH1编码序列的骨架1质粒。类似地，使用CBS7962基因组作为模板扩增的各元件的PCR构建体分别构建含有TPI1启动子和CYC1终止子的骨架1质粒。将MTH1、TPI1启动子和CYC1终止子的骨架1质粒与骨架2接头一起进行BpiI切割，以获得具有MTH1表达盒的骨架2质粒。将得到的质粒连同含有2μ和酿酒酵母的ORI的骨架3接头进行BbsI切割以获得酵母表达质粒，然后将其用于转化上述酵母菌株。根据LiAc/PEG/ss-DNA方案(http://home.cc.umanitoba.ca/～gietz/method.html)进行两种菌株的转化。将CBS7962和ΔΔΔpdc菌株的转化体接种在选择性YPD培养基(10g/l酵母提取物、20g/l蛋白胨和20g/l葡萄糖)上。在30℃下孵育3-4天后从两个转化体中获得单菌落。

表8 MTH1扩增引物

实施例9：使用酿酒酵母(CBS7962-LDH和ΔΔΔpdc-LDH)菌株生产乳酸。

在摇瓶中分两个阶段培养表达来自植物乳杆菌的异源LDH基因的酿酒酵母CBS7962菌株。接种物培育阶段，其中使用具有20g/l葡萄糖的YPD作为预接种培养基，和生产阶段，其中使用具有250g/l葡萄糖的YPD作为发酵培养基。在30℃下在100ml摇瓶中进行分批培养。将储存在-80℃的甘油小瓶中的细胞用于接种20ml的预接种培养基，其光密度600nm(OD600)为0.05。生长24小时后，收获细胞并用于接种50ml发酵培养基，其OD600为0.1。

将表达异源LDH基因的ΔΔΔpdc菌株在摇瓶中在两种不同的液体培养基中培养。一种为含有1.8g/l酵母氮碱(YNB)(该酵母氮碱不含氨基酸且不含(NH4)2SO4)、1g/l尿素、20g/l乙醇和0.5g/l葡萄糖的预接种培养基和一种为含有4.5g/l CaCO3、1.8g/l YNB(该YNB不含氨基酸且不含(NH4)2SO4)、1g/l尿素、1g/l乙醇和40g/l葡萄糖，pH为5的发酵培养基。在30℃下在100ml摇瓶中进行分批培养。将储存在-80℃的甘油小瓶中的细胞用于接种50ml的预接种培养基，其光密度600nm(OD600)为0.1。生长36小时后，收获细胞并用于接种50ml发酵培养基，其OD600为4.5。

将培养物在30℃以180rpm孵育，并以频繁的间隔收集样本通过OD600测量监测生长。使用设置在HPLC(岛津科学仪器)中的Aminex HPX-87H柱在60℃下分析上清液中的代谢物(包括葡萄糖、乙醇和乳酸)，并使用5mM H₂SO₄作为洗脱液，流速为0.6ml/min。

孵育40小时后，表达LDH的CBS7962菌株消耗250g/l葡萄糖并产生9.4g/l乳酸，每克消耗的葡萄糖产生0.04g乳酸。值得注意的是，当将表达LDH的ΔΔΔpdc菌株用于乳酸生产时，观察到乳酸产量的显著增加。虽然表达LDH的ΔΔΔpdc菌株在孵育96小时后没有完全消耗40g/l的葡萄糖，但该菌株产生21.3g/l的乳酸，每克消耗的葡萄糖产生0.71g乳酸。

实施例10：在受控条件下用于乳酸生产的两步法。

乳酸的生产方法遵循两步法：第一步是在补料分批过程中将酵母细胞培养至高细胞密度，第二步是用高初始接种物生产乳酸的分批过程。如先前(实施例1)所示，在低pH3.0的摇瓶实验中，在含有乳酸和高葡萄糖浓度的培养基中，高初始接种物显著提高了发酵速率和乙醇产率。这表明接种物量在确定发酵性能中起重要作用。

第一步开始于在含有1.8g/l YNB、5g/l(NH4)2SO4和20g/l葡萄糖的培养基中的分批培养。通过控制搅拌器速度和通气速率将溶解氧浓度保持在20％。温度和pH分别保持在30℃和5.0的最佳值。进行分批培养直至完全消耗葡萄糖和乙醇，然后将新鲜培养基加入反应器中。进料培养基含有高浓度的葡萄糖、5.4g/l的YNB和10g/l的(NH4)2SO4。在分批培养中耗尽乙醇后，将进料培养基以必要的流速进料到反应器中，以将比生长速率维持在菌株特定的临界值，并且可以使用现有的恒化器培养来确定。将比生长速率保持在临界值确保了每基质消耗的高生物质产率而不形成诸如乙醇和乙酸盐的副产物。

在补料分批培养后收获细胞并接种至高细胞密度进入生产反应器。生产培养基含有高葡萄糖浓度以确保高乳酸滴度。培养基补充有必需的营养素以支持高葡萄糖浓度下的细胞代谢。pH是决定发酵性能的关键因素，因此，基于该方法的总体经济分析，通过从开始添加盐碱或将CaCO3添加到培养基中将pH维持在5.0可以是优选的选择。

实施例11：用于乳酸生产的可选的两步法

乳酸的生产过程遵循两步法：第一步是在补料分批过程中将酵母细胞培养至高细胞密度，

第二步是用高初始接种物生产乳酸的分批过程。

乳酸生产的第一步：

根据下表制备用于第一培养步骤的培养基，加入葡萄糖至25g/L的浓度：

基本培养基盐

将成分溶解在H₂O中，加入维生素溶液和痕量元素，用盐酸将pH调节至5.0。将培养基无菌过滤。

1000x维生素溶液用于基本葡萄糖培养基

将生物素溶解在0.1M NaOH中并在H₂O中稀释，然后用1M盐酸将pH调节至6.5。添加所有其它组分并将溶液无菌过滤。

100x痕量元素用于基本葡萄糖培养基

将EDTA和硫酸锌溶解在H₂O中并用氢氧化钠将pH调节至6.0。加入所有其它组分，用盐酸将pH调节至4.0。将溶液无菌过滤。

将分批培养物接种在搅拌釜反应器中，光密度为1，在YPD培养基上用洗涤的酵母细胞过夜预培养。通过控制搅拌器速度和通气速率将溶解氧浓度保持在20％。温度和pH分别保持在30℃和5.0。进行分批培养直至完全消耗葡萄糖。当葡萄糖耗尽时，开始进料。如上所述，进料培养基含有500g/L葡萄糖和2x培养基组合物。进料速率是指数并且对应于酵母菌株的最大生长速率的80％。温度和pH分别保持在30℃和5.0。进料维持生物质浓度为100g/L。

通过收获细胞并接种到生产反应器中至浓度为50g/L干细胞重量来开始所述方法的第二步。生产培养基含有150g/L葡萄糖。通过控制搅拌器速度和通气速率将溶解氧浓度保持在20％。温度保持在30℃。pH值保持不受控制，并在生成乳酸时降至3以下。进行分批培养直至完全消耗葡萄糖。

所述方法的第二步的替代方案是向第一反应器中加入培养基以获得150g/L的葡萄糖浓度和50g/L的生物质浓度。通过控制搅拌器速度和通气速率将溶解氧浓度保持在20％。温度保持在30℃。pH保持不受控制并在生成乳酸时降至3以下。进行分批培养直至完全消耗葡萄糖。

实施例12：表达异源LDH基因的ΔΔΔpdc酿酒酵母(CBS7962)菌株的适应性实验室进化(ALE)

将表达来自植物乳杆菌的异源LDH基因的ΔΔΔpdc酿酒酵母菌株(实施例5)进行适应性实验室进化(ALE)。通过将过夜培养物定期传代到新鲜液体发酵培养基中直至培养物达到100代，在含有10mL培养基的100mL摇瓶中进行ALE。

根据碳源的浓度，使用预接种培养基和两种不同的发酵培养基：使用含有3.4g/L酵母氮碱(YNB)(该酵母氮碱不含氨基酸且不含(NH4)₂SO₄)、4.54g/L尿素和10g/L乙醇的预接种培养基。分别使用含有3.4g/L酵母氮碱(YNB)(该酵母氮碱不含氨基酸且不含(NH4)₂SO₄)、4.54g/L尿素、5g/L乙醇和100g/L葡萄糖或150g/L葡萄糖的发酵培养基。对每种发酵培养基(100和150g/L葡萄糖)进行四次独立的进化实验(总共八次)。

将储存在-80℃的来自甘油小瓶的未进化的细胞用于接种25mL的预接种培养基，光密度600nm(OD⁶⁰⁰)为0.25。生长24小时后，收获、洗涤细胞并用于ALE以接种10mL的发酵培养基，其OD⁶⁰⁰为0.5。进行ALE实验直至培养物达到100代，其对应于约40次转移。将培养物在28℃、180rpm下孵育。通过OD⁶⁰⁰测量每天监测生长。使用设置在60℃的HPLC(岛津科学仪器)中的Aminex HPX-87H柱(5mM H₂SO₄作为流动相，流速为0.6mL/min，RID检测器)定期分析上清液的代谢物，包括葡萄糖、乙醇、乙酸、甘油和乳酸。

在100代后，与未进化的菌株相比，进化的菌株表现出改善的生长速率和生产率(表1)。未进化菌株的前24小时的比生长速率和乳酸浓度分别为0.054h^-1和2.82g/L。在40次转移后(对应于100代)，前24小时的比生长速率和乳酸浓度(起始葡萄糖浓度为100g/L)分别为0.08h^-1和5.8g/L。还检测到在含有150g/L葡萄糖的发酵培养基中转移40次后培养物的比生长速率提高：μ＝0.108h^-1，乳酸产量从2.5g/L提高到4.2g/L。此外，在进化实验期间和孵育24小时后，在大约100代后，乙醇浓度从未进化菌株的2.9g/L降至进化菌株的2.3g/L。

实施例13：在具有部分控制的pH值的生物反应器中表征ΔΔΔpdc酿酒酵母(CBS7962)在生物反应器中分两个阶段培养表达来自植物乳杆菌的异源LDH基因的ΔΔΔpdc酿酒酵母CBS7962菌株：生物质积累的第一阶段，其中使用10g/L乙醇、3.4g/L酵母氮碱(YNB)(该酵母氮碱不含氨基酸且不含(NH4)₂SO₄)和4.54g/L尿素作为培养基，和生产阶段，其中使用100g/L葡萄糖、5g/L乙醇、3.4g/L酵母氮碱(YNB)(该酵母氮碱不含氨基酸且不含(NH4)₂SO₄)和4.54g/L尿素作为发酵培养基。第一阶段在摇瓶中进行，生产阶段在生物反应器(DASGIP系统)中进行。摇瓶培养物在28℃下在含有225mL培养基的2000ml锥形瓶(Erlenmeyer flasks)中生长。来自ALE实验的细胞在50代后取出并用于以600nm(OD⁶⁰⁰)为2.5的光密度接种第一阶段。生长30小时后，收获细胞，用水洗涤并用于接种在1.5L生物反应器中的330ml的发酵培养基，其OD600为5。通过控制搅拌器速度和通气速率将溶解氧浓度保持在30％。温度保持在28℃的最佳值。保持pH值在5的值18小时，然后不再控制。

定期取样以通过OD⁶⁰⁰监测生长，并使用设置在HPLC(岛津科学仪器)中的AminexHPX-87H柱(在60℃下，5mM H₂SO₄作为流动相，流速为0.6mL/mi，RID检测)分析上清液的代谢物，包括葡萄糖、乙醇、甘油、乙酸和乳酸。在停止pH控制后的第一个64小时内，pH值从5降至3，然后略微降至最终值2.89。乳酸产量为30.7g/L，相当于每克消耗的葡萄糖产生0.66g乳酸。在开始批次后的最初40小时内消耗乙醇。

实施例14：在没有pH控制的生物反应器中表征ΔΔΔpdc酿酒酵母(CBS7962)

在生物反应器中分两个阶段培养表达来自植物乳杆菌的异源LDH基因的ΔΔΔpdc酿酒酵母CBS7962菌株：生物质积累的第一阶段，其中使用10g/L乙醇、3.4g/L酵母氮碱(YNB)(该酵母氮碱不含氨基酸且不含(NH4)₂SO₄)和4.54g/L尿素作为培养基，和生产阶段，其中使用100g/L葡萄糖、5g/L乙醇、3.4g/L酵母氮碱(YNB)(该酵母氮碱不含氨基酸且不含(NH4)₂SO₄)和4.54g/L尿素作为发酵培养基。第一阶段在摇瓶中进行，生产阶段在生物反应器(DASGIP系统)中进行。摇瓶培养物在28℃下在含有225mL培养基的2000ml锥形瓶中生长。在75代后，将来自ALE实验的细胞取出并用于接种第一阶段，其600nm(OD⁶⁰⁰)光密度为2.5。生长30小时后，收获细胞，用水洗涤并用于接种在1.5L生物反应器中的330ml发酵培养基，其OD600为5。通过控制搅拌器速度和通气速率将溶解氧浓度保持在30％。温度保持在28℃的最佳值。从发酵开始，完全不控制pH值。

定期取样以通过OD⁶⁰⁰监测生长，并使用设置在HPLC(岛津科学仪器)中的AminexHPX-87H柱(5mM H₂SO₄作为流动相，流速为0.6mL/mi，RID检测)在60℃下分析上清液的代谢物，包括葡萄糖、乙醇、甘油、乙酸和乳酸。

在培养的前15小时内，pH从最初的5迅速下降到2.45，然后在64小时后略微下降到显著的2.15。在此期间，消耗了27.6g/L的葡萄糖并且产生了24.5g/L的乳酸(这进一步对应于消耗每克葡萄糖产生0.89g乳酸)。乙醇在47小时内完全消耗。

实施例15：在摇瓶中表达异源LDH基因的进化和未进化的ΔΔΔpdc酿酒酵母菌株(CBS7962)的比较

将表达来自植物乳杆菌的异源LDH基因的ΔΔΔpdc酿酒酵母菌株在摇瓶中在两种不同的液体培养基中培养。使用含有3.4g/L酵母氮碱(YNB)(该酵母氮碱不含氨基酸且不含(NH4)₂SO₄)、4.54g/L尿素、10g/L乙醇的预接种培养基，和含有3.4g/L YNB(该YNB不含氨基酸且不含(NH4)₂SO₄)、4.54g/L尿素、5g/L乙醇、100g/L葡萄糖和4.5g/L CaCO₃的发酵培养基。在28℃下在500ml摇瓶中进行分批培养，该摇瓶含有50mL培养基，起始pH值为6。将储存在-80℃的来自甘油小瓶的未进化细胞用于接种25ml的预接种培养基，其光密度在600nm(OD⁶⁰⁰)为1。将来自ALE实验的细胞(在转移33次后和大约75代后获得)用于接种25ml的预接种培养基，其光密度600nm(OD⁶⁰⁰)为2。生长40小时后，收获、洗涤细胞并用于接种50ml发酵培养基，其OD⁶⁰⁰为3。

将培养物在28℃下，载180rpm下孵育，并以频繁的间隔(每24小时)收集样本，以通过OD⁶⁰⁰测量监测生长。使用设置在HPLC(岛津科学仪器)中的Aminex HPX-87H柱(5mM H₂SO₄作为流动相，流速为0.6ml/min和RID检测)在60℃下分析上清液的代谢物，包括葡萄糖、乙醇、乙酸、甘油和乳酸。

孵育48小时后，表达LDH的未进化的ΔΔΔpdc菌株消耗14.6g/L葡萄糖，而进化的ΔΔΔpdc菌株消耗32.8g/L，证明进化的菌株的葡萄糖摄取率更高。孵育90小时后，未进化的菌株消耗23.3g/L。90小时后，进化的菌株消耗了59.5g/L的葡萄糖。90小时(1.22g/L)后，乙醇仍然存在于非进化的菌株的培养物中，而它被进化的菌株完全消耗(通过HPLC检测不到)。未进化的菌株产生29.6g/L的乳酸并达到pH值为3，而进化的菌株最终在2.86的pH下累积51g/L的乳酸。基于g/g葡萄糖，产率为86％。

实施例16：在具有不同葡萄糖浓度的摇瓶中，表达异源LDH基因的进化ΔΔΔpdc酿酒酵母菌株(CBS7962)的表征

将表达来自植物乳杆菌的异源LDH基因的ΔΔΔpdc酿酒酵母菌株在摇瓶中培养。使用具有不同浓度的葡萄糖的预接种培养基和三种不同的发酵培养基。使用含有3.4g/L酵母氮碱(YNB)(该酵母氮碱不含氨基酸且不含(NH4)₂SO₄)、4.54g/L尿素、10g/L乙醇的预接种培养基，和含有3.4g/L YNB(该YNB不含氨基酸且不含(NH4)₂SO₄)、4.54g/L尿素、5g/L乙醇、4.5g/L CaCO₃、60g/L葡萄糖或70g/L葡萄糖或80g/L葡萄糖的发酵培养基。在28℃下在500ml摇瓶中进行分批培养，该摇瓶含有50mL培养基，起始pH值为6。将33次转移(约75代)后获得的、来自自适应实验室进化(ALE)的细胞用于接种25ml的预接种培养基，其光密度在600nm(OD⁶⁰⁰)为2。生长40小时后，收获、洗涤细胞，并用于接种50ml发酵培养基，其OD⁶⁰⁰为3。

将培养物在28℃，在180rpm下孵育，并以频繁的间隔(每24小时)通过OD⁶⁰⁰测量来监测生长。使用设置在HPLC(岛津科学仪器)中的Aminex HPX-87H柱(5mM H₂SO₄作为流动相，流速为0.6ml/min，RID检测)在60℃下分析上清液的代谢物，包括葡萄糖、乙醇、乙酸、甘油和乳酸。

在孵育期间，所有发酵培养基中的葡萄糖浓度降低。孵育96小时后，表达LDH并在80g/L葡萄糖上生长的进化的ΔΔΔpdc菌株将55.3g/L的葡萄糖转化为49.4g/L的乳酸。该转化对应于每克消耗的葡萄糖产生0.89g乳酸。由于在具有60g/L葡萄糖的发酵培养基中孵育72小时后葡萄糖耗尽，乳酸的产生达到最大值，之后保持不变。另一方面，在所有三种发酵培养基中和培养48小时后未检测到乙醇浓度。对于在不同发酵培养基中培养的所有培养物，培养期间的生长特征(OD⁶⁰⁰值)和pH曲线是相似的。

序列表

<110> 隐花果乳酸有限责任公司（Syconium Lactic Acid GmbH）

<120> 生产乳酸的方法

<130> SY001P

<160> 83

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 320

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LDH基因

<400> 1

Met Ser Ser Met Pro Asn His Gln Lys Val Val Leu Val Gly Asp Gly

1 5 10 15

Ala Val Gly Ser Ser Tyr Ala Phe Ala Met Ala Gln Gln Gly Ile Ala

20 25 30

Glu Glu Phe Val Ile Val Asp Val Val Lys Asp Arg Thr Lys Gly Asp

35 40 45

Ala Leu Asp Leu Glu Asp Ala Gln Ala Phe Thr Ala Pro Lys Lys Ile

50 55 60

Tyr Ser Gly Glu Tyr Ser Asp Cys Lys Asp Ala Asp Leu Val Val Ile

65 70 75 80

Thr Ala Gly Ala Pro Gln Lys Pro Gly Glu Ser Arg Leu Asp Leu Val

85 90 95

Asn Lys Asn Leu Asn Ile Leu Ser Ser Ile Val Lys Pro Val Val Asp

100 105 110

Ser Gly Phe Asp Gly Ile Phe Leu Val Ala Ala Asn Pro Val Asp Ile

115 120 125

Leu Thr Tyr Ala Thr Trp Lys Phe Ser Gly Phe Pro Lys Asp Arg Val

130 135 140

Ile Gly Ser Gly Thr Ser Leu Asp Ser Ser Arg Leu Arg Val Ala Leu

145 150 155 160

Gly Lys Gln Phe Asn Val Asp Pro Arg Ser Val Asp Ala Tyr Ile Met

165 170 175

Gly Glu His Gly Asp Ser Glu Phe Ala Ala Tyr Ser Thr Ala Thr Ile

180 185 190

Gly Thr Arg Pro Val Arg Asp Val Ala Lys Glu Gln Gly Val Ser Asp

195 200 205

Glu Asp Leu Ala Lys Leu Glu Asp Gly Val Arg Asn Lys Ala Tyr Asp

210 215 220

Ile Ile Asn Leu Lys Gly Ala Thr Phe Tyr Gly Ile Gly Thr Ala Leu

225 230 235 240

Met Arg Ile Ser Lys Ala Ile Leu Arg Asp Glu Asn Ala Val Leu Pro

245 250 255

Val Gly Ala Tyr Met Asp Gly Gln Tyr Gly Leu Asn Asp Ile Tyr Ile

260 265 270

Gly Thr Pro Ala Val Ile Gly Gly Thr Gly Leu Lys Gln Ile Ile Glu

275 280 285

Ser Pro Leu Ser Ala Asp Glu Leu Lys Lys Met Gln Asp Ser Ala Ala

290 295 300

Thr Leu Lys Lys Val Leu Asn Asp Gly Leu Ala Glu Leu Glu Asn Lys

305 310 315 320

<210> 2

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 2

caaaatgcat aacctatgca tttaaaagat tatgtatgct cttctgactt ttcg 54

<210> 3

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

taagtgacag tgcagtaata atatgaacca atttattttt cgttacataa aaatgc 56

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

cattatttta attttttttc tattactgtc gctaacacct gtatggttg 49

<210> 5

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

gcatattaat agtatacaac aaaaacaaag gaaaaaaaga aatgaaatc 49

<210> 6

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

ctatgtactt ggcaatagat gagcatttca atgaaggaaa cgcctgagtc agttatg 57

<210> 7

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

gggcggcgtc ccctgttttt ctgctttggc tcatctcttt ggctccgacg gacgaaag 58

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

aaggctcttt cactctcctt gc 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

ttagcggcgt cagcaatagt gg 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

ccactattgc tgacgccgct aa 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

tcgctaacac ctgtatggtt gc 22

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

cttgacatca tgtctagaag c 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

ttctagacat gatgtcaagg c 21

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

actaagtgac aaagaactac gc 22

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

tacagtcggt aatttctttc tgg 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

ggatcaaatc agccgactca acg 23

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

cgttgagtcg gctgatttga tcc 23

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

taaagctgta agctagacca cc 22

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 19

gatacgagcg taaccatcag 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 20

tgaagtcaaa ggtatgagat 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 21

gtaaccatcg gcggcatagg 20

<210> 22

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

catgcgtatc ctgatgagtc cgtgaggacg aaacgagtaa gctcgtcgat a 51

<210> 23

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

aaacgagtaa gctcgtcgat acgagcgtaa ccatcaggtt ttagagctag aaatagcaag 60

<210> 24

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

catgacttca ctgatgagtc cgtgaggacg aaacgagtaa gctcgtctga a 51

<210> 25

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

aaacgagtaa gctcgtctga agtcaaaggt atgagatgtt ttagagctag aaatagcaag 60

<210> 26

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

catgggttac ctgatgagtc cgtgaggacg aaacgagtaa gctcgtcgta a 51

<210> 27

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

aaacgagtaa gctcgtcgta accatcggcg gcatagggtt ttagagctag aaatagcaag 60

<210> 28

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

<210> 29

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

cgccatgccg aagcatgttg cccagccggc gccagcgagg aggctgggac catgccggcc 60

<210> 30

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

aggctgggac catgccggcc aaaagcaccg actcggtgcc actttttcaa gttgataacg 60

<210> 31

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

aagcagtcca aagctgtccc attcgccatg ccgaagcatg ttgcccagcc g 51

<210> 32

<211> 230

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA构建体

<400> 32

catgcgtatc ctgatgagtc cgtgaggacg aaacgagtaa gctcgtcgat acgagcgtaa 60

ccatcaggtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg 120

aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc 180

ggctgggcaa catgcttcgg catggcgaat gggacagctt tggactgctt 230

<210> 33

<211> 230

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA构建体

<400> 33

catgacttca ctgatgagtc cgtgaggacg aaacgagtaa gctcgtctga agtcaaaggt 60

atgagatgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg 120

aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc 180

ggctgggcaa catgcttcgg catggcgaat gggacagctt tggactgctt 230

<210> 34

<211> 230

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA构建体

<400> 34

catgggttac ctgatgagtc cgtgaggacg aaacgagtaa gctcgtcgta accatcggcg 60

gcatagggtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg 120

aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc 180

ggctgggcaa catgcttcgg catggcgaat gggacagctt tggactgctt 230

<210> 35

<211> 180

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsDNA寡核苷酸

<400> 35

aacttgtcct tgttggacaa gatctacgaa gttgaaggta tgagatgggc tggtaacgcc 60

aacgaattga acgctgctta cgctgctgat tgaatggtta cgctcgatca agggtatgtc 120

ttgtatcatc accaccttcg gtgtcggtga attgtctgct ttgaacggta ttgccggttc 180

<210> 36

<211> 180

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsDNA寡核苷酸

<400> 36

tgtctgccaa catttctgaa accactgcca tgatcactga tattgctaac gctccagctg 60

aaattgacag atgtatcaga aacacctact agacactacc caagaccagt ctacttgggt 120

ttgccagcta acttggttga cttgaacgtc ccagccaagt tattggaaac tccaattgac 180

<210> 37

<211> 180

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsDNA寡核苷酸

<400> 37

caggcgactt caacttgtcc ctattggaca agatttacga ggtagatgga ttgagatggg 60

ctggtaatgc aaatgagctg aacgacgcct attgaatgcc gccgatggta cgcacgcatc 120

aagggtttat ctgtgctggt aactactttt ggcgtaggtg aattatccgc cttgaatggt 180

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 38

taactccagt aattccttgg 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 39

ggtccattgg tgaaagtttg 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 40

attgcgatct ctttaaaggg 20

<210> 41

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 41

catggagtta ctgatgagtc cgtgaggacg aaacgagtaa gctcgtctaa c 51

<210> 42

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 42

aaacgagtaa gctcgtctaa ctccagtaat tccttgggtt ttagagctag aaatagcaag 60

<210> 43

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 43

catgtggacc ctgatgagtc cgtgaggacg aaacgagtaa gctcgtcggt c 51

<210> 44

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 44

aaacgagtaa gctcgtcggt ccattggtga aagtttggtt ttagagctag aaatagcaag 60

<210> 45

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 45

catgcgcaat ctgatgagtc cgtgaggacg aaacgagtaa gctcgtcatt g 51

<210> 46

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 46

aaacgagtaa gctcgtcatt gcgatctctt taaaggggtt ttagagctag aaatagcaag 60

<210> 47

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 47

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

<210> 48

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 48

cgccatgccg aagcatgttg cccagccggc gccagcgagg aggctgggac catgccggcc 60

<210> 49

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 49

aggctgggac catgccggcc aaaagcaccg actcggtgcc actttttcaa gttgataacg 60

<210> 50

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 50

aagcagtcca aagctgtccc attcgccatg ccgaagcatg ttgcccagcc g 51

<210> 51

<211> 230

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA构建体

<400> 51

catggagtta ctgatgagtc cgtgaggacg aaacgagtaa gctcgtctaa ctccagtaat 60

tccttgggtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg 120

aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc 180

ggctgggcaa catgcttcgg catggcgaat gggacagctt tggactgctt 230

<210> 52

<211> 230

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA构建体

<400> 52

catgtggacc ctgatgagtc cgtgaggacg aaacgagtaa gctcgtcggt ccattggtga 60

aagtttggtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg 120

aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc 180

ggctgggcaa catgcttcgg catggcgaat gggacagctt tggactgctt 230

<210> 53

<211> 230

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA构建体

<400> 53

catgcgcaat ctgatgagtc cgtgaggacg aaacgagtaa gctcgtcatt gcgatctctt 60

taaaggggtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg 120

aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc 180

ggctgggcaa catgcttcgg catggcgaat gggacagctt tggactgctt 230

<210> 54

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsDNA寡核苷酸

<400> 54

ctgttattaa tttcacaggt agttctggtc cattggtgaa agtatagttg cgccttgcag 60

agcacagagg ccgcagaatg tgctctagat 90

<210> 55

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsDNA寡核苷酸

<400> 55

aagcgtatta caaatgaaac caagattcag attgcgatct cttaactagg ttggtcccct 60

agcgatagag cactcgatct tcccagaaaa 90

<210> 56

<211> 111

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsDNA寡核苷酸

<400> 56

tcatgcacga aaagcaaaca aacttgtgtg cttcattgga tgttcgtacc taactaagta 60

attagttgaa gcattaggtc ccaaaatttg tttactaaaa acacatgtgg a 111

<210> 57

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 57

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

<210> 58

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 58

cgccatgccg aagcatgttg cccagccggc gccagcgagg aggctgggac catgccggcc 60

<210> 59

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 59

aggctgggac catgccggcc aaaagcaccg actcggtgcc actttttcaa gttgataacg 60

<210> 60

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 60

aagcagtcca aagctgtccc attcgccatg ccgaagcatg ttgcccagcc g 51

<210> 61

<211> 225

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MTH1

<400> 61

agtagctctc aatccacgac ttcttcgaga agagagaact ttgtgaatgc tcctccggag 60

tacactgata gagctagaga tgagattaaa aaaagattat tggcctcctc acctagcaga 120

aggtcacatc attcaagcag tatgcattca gcgagcagga gatcaagcgt ggctgaaagt 180

gggagtttac tttcggataa tgcctcgtct tatcaatcaa gtata 225

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 62

ctctcttctc gaagaagtcg 20

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 63

agatcaagcg tggctgaaag 20

<210> 64

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 64

catgagagag ctgatgagtc cgtgaggacg aaacgagtaa gctcgtcctc t 51

<210> 65

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 65

aaacgagtaa gctcgtcctc tcttctcgaa gaagtcggtt ttagagctag aaatagcaag 60

<210> 66

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 66

catgtgatct ctgatgagtc cgtgaggacg aaacgagtaa gctcgtcaga t 51

<210> 67

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 67

aaacgagtaa gctcgtcaga tcaagcgtgg ctgaaaggtt ttagagctag aaatagcaag 60

<210> 68

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重叠引物

<400> 68

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

<210> 69

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重叠引物

<400> 69

cgccatgccg aagcatgttg cccagccggc gccagcgagg aggctgggac catgccggcc 60

<210> 70

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重叠引物

<400> 70

aggctgggac catgccggcc aaaagcaccg actcggtgcc actttttcaa gttgataacg 60

<210> 71

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重叠引物

<400> 71

aagcagtcca aagctgtccc attcgccatg ccgaagcatg ttgcccagcc g 51

<210> 72

<211> 230

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA构建体

<400> 72

catgagagag ctgatgagtc cgtgaggacg aaacgagtaa gctcgtcctc tcttctcgaa 60

gaagtcggtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg 120

aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc 180

ggctgggcaa catgcttcgg catggcgaat gggacagctt tggactgctt 230

<210> 73

<211> 230

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA构建体

<400> 73

catgtgatct ctgatgagtc cgtgaggacg aaacgagtaa gctcgtcaga tcaagcgtgg 60

ctgaaaggtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg 120

aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc 180

ggctgggcaa catgcttcgg catggcgaat gggacagctt tggactgctt 230

<210> 74

<211> 504

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsDNA寡核苷酸

<400> 74

ggaatatctg ccattctacc ccttattcaa gtgccttttt tttttttttt catcccacat 60

tttattgctg cctcaatctc cattaagaaa aaaaatttat ataaccaaat gacatttttc 120

ctttcttctc aaactttgta atgcgcctgt aactgcttct ttttttatta aaaaacagca 180

tggagttttt taataactta aggaaacata caaaaagatt tgttcatttc actccaagta 240

ttttttaaag tatattgaaa gttctcaata gcgaaaccac aagcagcaat acaaagagaa 300

ttttattcga acgcatagag tacacacact caaaggaatg tttgtttcac caccaccagc 360

aacttcgaaa aaccaagttt tacaacgacg tccattagaa tcgactaaca gtaatcatgg 420

gtttgcaagc tccctacagg ccattccgga aaacacgatg agtggcagtg ataatgcttc 480

ttttcaaagt ttgccactat caat 504

<210> 75

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsDNA寡核苷酸

<400> 75

gttttctgcc ccctctactg tgcacacgca actaactaat gactcttcgt tctccgaatt 60

tcctaaccac aagttaatca cgagagtgag cctggatgaa gcattaccca aaacgtttta 120

tgacatgtat tcgccagata ttctattagc agacccatcc aacattctct gtaacgggcg 180

tcccaagttt accaagagag agttattgga ttgggattta aacgatataa gatcgttatt 240

gatagtcgag aagttaaggc ccgaatgggg taatcaacta ccggaagtaa taacggtggg 300

tgataatatg ccccagttta ggttacaatt attaccacta tattctagcg atgagaccat 360

aatcgcaacg ttagtccatt cggatctgta catggaggct aacttagatt atgaattcaa 420

actaaccagc gccaaatata cagtagcgac cgctagaaaa agacatgagc atataactgg 480

tagaaatgaa gccgtcat 498

<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 fw

<400> 76

ggaatatctg ccattctacc 20

<210> 77

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重叠引物 rev

<400> 77

gagggggcag aaaacattga tagtggcaaa c 31

<210> 78

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重叠引物 rev

<400> 78

gtttgccact atcaatgttt tctgccccct c 31

<210> 79

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 rev

<400> 79

atgacggctt catttctacc 20

<210> 80

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 fw

<400> 80

tacgagtcca tttctccagt 20

<210> 81

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 rev

<400> 81

attgtgcctc tactgctata 20

<210> 82

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扩增引物 fw

<400> 82

agaagacgct agcgatgaaa ccataatcgc 30

<210> 83

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扩增引物 rev

<400> 83

ggttacaatt attaccacta tattctagcg cgtcttct 38

Claims

1.一种使用葡萄糖作为碳源在重组酵母细胞培养中生产乳酸的方法，包括：

其中所述酵母具有乳酸脱氢酶(LDH)活性和任选降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述酵母是二倍体酵母。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述酵母是多倍体或非整倍体酵母。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述生产发酵阶段的pH≤4.5，具体地≤4，具体地≤3.5，具体地所述生产发酵阶段的最终pH为3或更低，具体地所述生产发酵阶段的最终pH≤2.9、≤2.8、≤2.7、≤2.6、≤2.5、≤2.4、≤2.3、≤2.2、≤2.15或更低。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述种子发酵阶段在补料分批条件下进行和/或所述生产发酵阶段在分批过程条件下进行，具体地所述种子发酵阶段和所述生产发酵阶段在不同的发酵罐中。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中乳酸以游离形式产生，具体地它以光学纯异构形式产生，具体地它是D(-)-乳酸或L(+)-乳酸。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述酵母具有降低或敲除的一种或多种基因PDC1、PDC5和/或PDC6的表达。

8.根据权利要求7所述的方法，其中PDC1、PDC5和/或PDC6基因的一种或多种启动子经取代或缺失。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述基因PDC1、PDC5和/或PDC6是条件性表达的，具体地是由于异源启动子的控制，具体地是葡萄糖阻抑型启动子的控制，更具体地是由于HXT2或HXT4基因启动子的控制。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中缺失基因PDC1、PDC5和/或PDC6中的至少一种。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述酵母具有降低或敲除的一种或多种基因的表达，该基因编码与葡萄糖传感器相互作用的蛋白质，该葡萄糖传感器控制葡萄糖调节的基因表达，具体是Std1或Mth1蛋白的表达。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中部分或完全缺失MTH1基因。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中修饰所述酵母以过表达至少一种己糖转运蛋白基因。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中修饰所述酵母以过表达至少一种选自HXT1、HXT2、HXT3、HXT4、HXT5、HXT6、HXT7、HXT8、HXT9、HXT10、HXT11、HXT12、HXT13、HXT14、HXT15、HXT16、HXT17、GAL2、SNF3和RGT2的己糖转运蛋白基因。

15.使用重组酵母菌株以葡萄糖为碳源生产乳酸的两步发酵系统，其由以下组成：

a)种子发酵阶段产生生物质，其中在pH为5至7的细胞培养基中培养酵母细胞，然后

b)生产发酵阶段产生乳酸，其中在细胞培养基中培养酵母细胞直至最终pH小于3.5，具体地直至最终pH≤3.4、≤3.3、≤3.2、≤3.1、≤3.0、≤2.9、≤2.8、≤2.7、≤2.6、≤2.5、≤2.4、≤2.3、≤2.2、≤2.15或更低，

其中酵母编码异源乳酸脱氢酶(LDH)并具有降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。

16.使用重组酵母菌株以葡萄糖为碳源生产乳酸的两阶段发酵系统，其由以下组成：

b)从种子发酵接种的第二发酵罐中的生产发酵阶段产生乳酸，其中在细胞培养基中培养酵母细胞直至最终pH小于3.5，

其中修饰该酵母为具有乳酸脱氢酶(LDH)活性和/或降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。

17.两种或更多种发酵罐系统的组合，其用于使用重组酵母菌株以葡萄糖为碳源生产乳酸，其由以下组成：

a)种子发酵罐产生生物质，其中在pH为5至7的细胞培养基中培养酵母细胞，然后

b)从种子发酵接种的生产发酵罐产生乳酸，其中在细胞培养基中培养酵母细胞直至最终pH小于3.5，

其中酵母编码异源乳酸脱氢酶(LDH)基因并且具有降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。

18.重组二倍体酵母菌株，优选酿酒酵母，其包含：

i)PDC1、PDC5和PDC6基因的功能性缺失，

ii)MTH1基因的功能性缺失，

iii)HXT1基因的过表达，和

iv)至少一种异源LDH基因。

19.重组多倍体或非整倍体酵母菌株，优选酿酒酵母，其包含：

i)PDC1、PDC5和PDC6基因的功能性缺失，

ii)MTH1基因的功能性缺失，

iii)HXT1基因的过表达，和

iv)至少一种异源LDH基因。