CN113430127A - 一种产l-乳酸的重组菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产L‑乳酸的重组菌及其应用，本发明的重组菌在酿酒酵母宿主中过表达了D‑乳酸脱氢酶Dld1基因，并采用来源于凝结芽孢杆菌的乳酸脱氢酶LDH基因替换丙酮酸脱羧酶Pdc1基因和丙酮酸脱羧酶Pdc6基因，采用来源于可合成L‑乳酸的乳酸乳球菌的L乳酸脱氢酶LLDH基因替换乙醇脱氢酶Adh1、甘油三磷酸脱氢酶1Gpd1或甘油三磷酸脱氢酶2Gpd2基因，敲除酿酒酵母中的转化乳酸为丙酮的L‑乳酸氧化还原酶基因Cyb2和羧基转运蛋白Jen1基因。通过本发明的生物改造技术，最终实现L‑LA的提升，摇瓶产量从最初的0.98g/L提升至29.55g/L，较原始耐酸菌株提高了30倍。

Description

一种产L-乳酸的重组菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种产L-乳酸的重组菌及其应用，属于定向代谢技术领域。

背景技术

乳酸因具有光学异构特性，可以形成L-乳酸和D-乳酸。L-乳酸(L-LA，CH₃CHCOOH)是人和动物体内正常的代谢物，是一种天然的有机酸；广泛应用于食品、医药、化妆品、烟草及化工领域。同时，L-乳酸还可用来生产生物降解塑料-聚乳酸(PLA)和绿色环保溶剂-L乳酸甲酯、L-乳酸乙酯等。PLA是一种性能优异、价格合适的可降解材料。可降解塑料的需求量以年均复合增长33％的速率在增长，全球均处于发展早期，聚乳酸未来发展潜力巨大。因此，提升L-乳酸的生产能力及降低L-乳酸生产成本，对于促进全球可降解塑料产业的发展至关重要。

L-乳酸的制备工艺主要有化学合成法、酶法转化法和微生物发酵法。美国Monsanto公司首次开始利用化学合成法，使用乙醛与剧毒化合物氢氰酸在碱性催化剂作用下经多步反应合成乳酸。然而，该方法不但生产成本高、污染严重，而且安全性无法确定。乳酸酶法是以丙酮酸或2-氯丙酸为底物，经过乳酸脱氢酶或L-2-卤代酸脱卤酶催化后获得，专一性较高，但工艺要求严格且繁琐，在工业上没有广泛应用。微生物发酵法，原料来源除了能利用葡萄糖、乳糖等单糖外，还能以淀粉、纤维素等多糖发酵；正以成本低廉、产物安全性高等优点占据L-乳酸生产的重要位置。

在生产乳酸过程中，常常会面临因产物累积而导致的酸胁迫问题。有机酸会导致发酵细胞生长减慢，从而影响发酵过程的产率。工业水平的乳酸生产需要添加大量的中和剂，如CaCO3、NaOH和NH₄OH。这限制了乳酸的生物生产，因为它损害了沉淀乳酸盐的再生，并且涉及更高的成本。

目前，发酵生产L-乳酸常用的菌种为乳杆菌、米根霉、酿酒酵母等。乳杆菌具有较高的乳酸脱氢酶(LDH)活性，但发酵营养需求比较高、培养组分复杂、无法耐受低pH产物；米根霉营养要求低，但发酵过程中需要通气搅拌，副产物积累比较严重，成本比较高；酿酒酵母具有清晰的遗传背景。近年来，通过代谢工程手段将外源LDH引入酿酒酵母，辅以加强前体供给、途径改造等策略，使其具备了异源生产L-乳酸的能力；同时，酿酒酵母具有可耐受低pH这一特殊优势，使其成为大规模生产有机酸的优选菌株。

工业生产过程中，基于经济效益的考虑，生产商对有机酸产量要求较高，但在宿主细胞构建过程中，随着有机酸浓度的不断积累形成了低pH环境，对宿主细胞的生长有很大程度的抑制。目前报道的微生物生产短链有机酸主要是添加中和剂(CaCO₃)来调节发酵过程的低pH，生成的产物主要以有机酸盐的形式存在，后续要先经过酸解，才能进一步的分离、纯化。一方面增加了产物分离、纯化的成本和工序，另一方面如果前期添加的中和剂，或者后续酸解所用的酸反应不完全，还会造成资源的浪费和环境的污染。

为解决上述存在的低pH抑制宿主细胞生长，添加中和剂提高成本、增加后续分离和纯化工序、容易造成环境污染等问题。本实验室前期以酿酒酵母CEN.PK2-1C为出发菌株，连续定向进化筛选得到可以耐受pH 2.44的突变体MTPfo-4(申请号为202010631510.4)。以MTPfo-4作为生产菌株可以提升菌种对于有机酸产物的耐受性，但是目前突变体MTPfo-4的L-乳酸的产量还不够高，还不适用于工业生产。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种利用碳流代谢调控提高酿酒酵母菌中L-乳酸产量的方法，利用代谢工程手段分别调控了丙酮酸合成途径、L-LA异源合成、乙醇合成途径、Jen1蛋白转运途径及甘油的合成途径。

本发明的第一个目的是提供一种产L-乳酸的重组菌，所述重组菌在酿酒酵母宿主中过表达了D-乳酸脱氢酶Dld1基因，并采用来源于凝结芽孢杆菌的乳酸脱氢酶LDH基因替换丙酮酸脱羧酶基因Pdc1和丙酮酸脱羧酶基因Pdc6，采用来源于可合成L-乳酸的乳酸乳球菌的L乳酸脱氢酶LLDH基因替换乙醇脱氢酶基因Adh1、甘油三磷酸脱氢酶1基因Gpd1或甘油三磷酸脱氢酶2基因Gpd2，敲除酿酒酵母中的转化乳酸为丙酮的L-乳酸氧化还原酶基因Cyb2和羧基转运蛋白基因Jen1。

进一步地，所述的酿酒酵母宿主为酿酒酵母MTPfo-4，保藏编号为CCTCC NO:M2020199。在申请号为202010631510.4的专利中公开。

进一步地，所述的D-乳酸脱氢酶DLD1的NCBI基因编号为NM_001180234.1。

进一步地，所述的来源于凝结芽孢杆菌的乳酸脱氢酶LDH的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的来源于乳酸乳球菌的乳酸脱氢酶LLDH的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述的丙酮酸脱羧酶PDC1的NCBI基因编号为NM_001181931.1，丙酮酸脱羧酶PDC6的NCBI基因编号为NM_001181216.3。

进一步地，所述的乙醇脱氢酶ADH1的NCBI基因编号为NM_001183340.1，甘油三磷酸脱氢酶1GPD1的NCBI基因编号为NM_001180081.1，甘油三磷酸脱氢酶2GPD2的NCBI基因编号为NM_001183314.1。

进一步地，所述的酿酒酵母中的L-乳酸脱氢酶LLDH的NCBI基因编号为NM_001182412.1，羧基转运蛋白JEN1的NCBI基因编号为NM_001179782.1。

进一步地，过表达D-乳酸脱氢酶DLD1基因是通过将TEF1强启动子插入DLD1基因序列前端进行强化表达。

本发明的第二个目的是提供所述的重组菌在发酵生产L-乳酸中的应用。

进一步地，所述的应用具体是以所述重组菌为发酵菌株，以葡萄糖为底物，发酵生产L-乳酸。

本发明的有益效果是：

本发明以耐酸酿酒酵母MTPfo-4作为生产菌株，在发酵有机酸过程中无需添加中和剂。经济有效且对污染环境友好，并且利用代谢工程手段分别调控了丙酮酸合成途径、L-LA异源合成、乙醇合成途径、JEN11蛋白转运途径及甘油的合成途径，通过我们的生物改造技术，最终实现L-LA的提升，摇瓶产量从最初的0.98g/L提升至29.55g/L，较原始耐酸菌株提高了30倍。

附图说明：

图1为酿酒酵母碳流代谢调控生产L-LA概论图；

图2为L-LA标品高效液相图；

图3为酿酒酵母菌株TJG12发酵L-LA高效液相结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

涉及的检测方法：

通过高效液相色谱对酿酒酵母中的L-LA进行检测，将发酵36h的酿酒酵母菌液，取1ml加入0.5mm的玻璃珠，使用高速匀浆破碎仪破碎20min，取出破碎后的混合液离心取上清，0.55μm过滤后进行高效液相色谱分析。流动相使用稀硫酸，检测器使用紫外检测器，检测波长为210nm，检测温度50℃。

实施例1：构建酿酒酵母菌TSL

(a)人工合成基因片段P₁-P_HIS-P_TEF1-P₄，将TEF1强启动子插入Dld1基因序列前端进行强化表达，减少D-乳酸生成，增强丙酮酸累积，提高L-LA前体的供应。以酿酒酵母S228C基因组为模板，使用引物P₁-F、P₁-R扩增得到基因片段P₁；使用引物P_HIS-F、P_HIS-R扩增得到基因片段P_HIS；使用引物P_TEF1-F、P_TEF1-R扩增得到基因片段P_TEF1；使用引物P₄-F、P₄-R扩增得到基因片段P₄。随后进行重叠延伸PCR，1％的琼脂糖凝胶电泳验证正确后，切胶回收片段，得到融合基因片段。

(b)将步骤(a)得到的基因片段，转化进入酿酒酵母S288C菌株的感受态中，涂布在HIS^-平板上，30℃培养3天，使用引物PY-F、PY-R进行菌落PCR验证得到菌株TS。

(c)将步骤(b)得到的菌株TS制成感受态，同(a)的方法一致人工合成基因片段P1-lld、P_LEU-lld、P_TLDHC-lld、P₄-lld，并将这四片段转化进入酿酒酵母中Cyb2基因的位置上，涂布于HIS^-/LEU^-板上，将长出来的菌落通过PY1-F/R-lld和PY2-F/R-lld引物验证，得到菌株TSL。并制作感受态加入Cre质粒进行标签消除，最终消掉标签的菌株只长在YPD平板而无法生长在HIS^-或LEU^-培养板上。

引物序列：

P₁-F tgacccaccttcatccaccatatcc

P₁-R cgtaatcatggtcatagctgtttcctgatggctacgttcaacccacaaaac

P_HIS-F cgttttgtgggttgaacgtagccatcaggaaacagctatgaccatgattacg

P_HIS-R gagtaaaaaaggagtagaaacattttgaagctattaaaacgacggccagtgccaag

P_TEF1-F cttggcactggccgtcgttttaatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttc

P_TEF1-R caagtacgcttccacaacataaacttagattagattgctatgctttctttctaatgagc

P₄-F gaaagaaagcatagcaatctaatctaagtttatgttgtggaagcgtacttgcac

P₄-R catgacacttgacagtagcttcagtaacaatac

P₁-F-lld cagagcctcttatattcactctgttcctccatc

P₁-R-lld catggtcatagctgtttcctgtgactacttttgtttgctttcttctctatgcgg

P_LEU-F-lld gagaagaaagcaaacaaaagtagtcacaggaaacagctatgaccatgattacgcc

P_LEU-R-lld ggagtagaaacattttgaagctattaaaacgacggccagtgccaag

P_TLDHC-F-lld tttgcggccttatagcctagctttaaggctactttaaaaactttttatttattcataca

P_TLDHC-R-lld cgtccctcaagtctatcataacaattttatgtattgatggag

PY-F gcatcgccgtaccacttcaaaac

PY-R caggtccagcttgtcaaattttacgac

PY1-F-lld ttttattgaaaaggggactgtttatgtgggaaaga

PY1-R-lld ggtattatatgtgtgcccaatagaaagagaacaatt

PY2-F-lld caattaacagatagtttgccggtgataattctcttaacctcccac

PY2-R-lld gaagctgctgttactttggctaaagctgttatgttgg

实施例2：构建含有外源乳酸脱氢酶的酿酒酵母

(a)以酿酒酵母工程菌S228C基因组为模板，从NCBI上获取来源于凝结芽孢杆菌的LDH基因，并在酵母菌416d结合位点上进行引物设计。在PY13TEF1质粒上构建了外源基因LDH的新质粒，并通过大肠表达。采用引物TEF1，CYC1扩增得到质粒TLDHC。利用Y-F,Y-R验证成功转入质粒的外源LDH菌株。

(b)将实例1中得到的TSL菌株制成酵母感受态细胞，将步骤(a)中得到的TLDHC质粒整合到416位点中，使用引物PY3-F/R、PY4-F/R进行菌落PCR验证，得到菌株TSL4。

(c)从实验室乳酸乳球菌NZ9000中获取外源LLDH基因，通过P1-R,P1-F引物在PY13TEF1质粒上构建了外源基因LLDH的新质粒，并通过大肠表达。利用L-F,L-R验证成功转入质粒的外源LDH菌株，获得外源质粒TLLC。

(d)将步骤(c)中的质粒通过引物TLLC-F，TLLC-R扩增成片段TLLC；将LLDH外源基因替代丙酮酸脱羧酶1基因PDC1的位置。采用引物P1U-F，P1U-R扩增得到基因片段P1U；采用引物His-F，His-R扩增得到基因片段His；采用引物P1D-F，P1D-R扩增得到基因片段P1D。

(e)将(b)中得到的TSL4菌株制成酵母感受态细胞，将步骤(d)中的TLLC、P1U、His、P1D片段转化入TSL4中，使用引物YP1-F1，YP1-R1，YP1-F2，YP1-R2进行菌落PCR验证，获得菌株TSL41。并制作感受态加入Cre质粒进行标签消除，最终消掉标签的菌株只长在YPD平板而无法生长在HIS^-或LEU^-培养板上。

引物序列：

TEF1 atagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccag

CYC1 ggccgcaaattaaagccttcgagc

Y-F gggtgtcgttaattacccgtactaaaggttt

Y-R catattgaccatgcaaagtagcagaaacaggataaata

PY3-F gaacaacaattggaaattgaattggatgaacaagaaacttcttggtt

PY3-R ggtaacaaaggtgttgcctcacttgtcgcttatgatgattatatac

PY4-F cgaaatcgaacttgacattggaacgaacatcagaaatagctttaag

PY4-R caaccaagaagtttcttgttcatccaattcaatttccaattgttgttc

P1-F cttaaagaagtcatagaatctattaaataaccgggctgcaggaattcgatatc

P1-R ctacttgtaattttcatgggatccactagttctagaaaacttagattagattgctatg

L-F ctagaactagtggatcccatgaaaattacaagtagaaaagtagtcgtgattggaac

L-R ttcctgcagcccggttatttaatagattctatgacttctttaagttgactgacagact

P1U-F ggtgatggcacatttttgcataaacct

P1U-R gtaaaaaaggagtagaaacattttgaagctatggtaccgacgtaaacaccaccg

TLLC-F gtttacgtcggtaccatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccag

TLLC-R cgtaatcatggtcatagctgtttcctgggccgcaaattaaagccttcgag

His-F gacgctcgaaggctttaatttgcggcccaggaaacagctatgaccatgattacgc

His-R caacggcttccttaacttctggcttggacaataaaacgacggccagtgccaa

P1D-F gaccttggcactggccgtcgttttattgtccaagccagaagttaaggaagcc

P1D-R ggtctttccatggtaagtgacagtgcagtaataata

YP1-F1 catttctgaaaccactgctatgatcactgac

YP1-R1 caccagctttaacagaagtatttggcatataagtc

YP1-F2 gttcttcccaccaccaacctcaag

YP1-R2 ccccatctgatcatggtggagatttc

实施例3：构建低乙醇低甘油高乳酸表达的酿酒酵母

(a)以酿酒酵母工程菌S228C基因组为模板。采用引物P6U-F，P6U-R扩增得到基因片段P6U，采用引物LEU-F，LEU-R扩增得到标签基因片段LEU，采用引物TEF-F、TEF-R扩增得到TEF1启动子基因片段，采用引物LDH-F、LDH-R扩增得到外源基因片段LDH，采用引物CYC-F、CYC-R扩增得到终止子基因片段CYC1，采用引物P6D-F、P6D-R扩增基因片段得到P6D。构建LDH基因表达载体插入PDC6基因位置，以达到阻碍PDC6基因表达的同时表达乳酸脱氢酶，促进乳酸的合成。

(b)将实例2中得到的TSL41菌株制成酵母感受态细胞，将步骤(a)中得到的6个基因片段转化进入TSL41中，使用引物YZ-F、YZ-R进行菌落PCR验证。

(c)将步骤(d)中菌落PCR验证正确的单菌落接入HIS^-液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-FOA的YPD固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与LEU^-筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但LEU^-筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为TSL416。

(d)按照上述步骤将乙醇脱氢酶基因Adh1、甘油三磷酸脱氢酶基因1Gpd1、甘油三磷酸脱氢酶基因6Gpd6基因分别用外源LLDH替换，并敲除羧基转运蛋白Jen1基因，最终得到菌株TJG12。

引物序列：

P6U-F ctaccctattttctcttaccagcgaacacaattc

P6U-F ggtcatagctgtttcctgtttgttggcaatatgtttttgctatattacgtgggtttttt

LEU-F cgtaatatagcaaaaacatattgccaacaaacaggaaacagctatgacc

LEU-R gtaaaaaaggagtagaaacattttgaagctattaaaacgacggccagtgccaag

TEF-F ggcactggccgtcgttttaatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccag

TEF-R cttatattagagcttaaaaacttagattagattgctatgctttctttctaatgagcaag

LDH-F aatctaagtttttaagctctaatataagatttaccagttttaacagaagccatagtatgt

LDH-R gcgtgacataactaattacatgagttagaaaaactaaattggttgttgctggtgttgg

CYC-F caaccaatttagtttttctaactcatgtaattagttatgtcacgcttacattcacgcc

CYC-R caataattcgtttgagtacactactaatggcggccgcaaattaaagccttcgagc

P6D-F gaaggctttaatttgcggccgccattagtagtgtactcaaacgaattattgttgcaaat

P6D-R catagatcaagacacctaatttatcagtgatgtcggaaac

YZ-F atagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccagattttctcgg

YZ-R gtttttgcaatatgacctgtgggccaaaaatcgaaaaaaaaaaaaataag

实施例4：构建成功的酿酒酵母菌进行发酵培养

在2ml YPD培养基中接种固体YPD平板上的酿酒酵母菌TSL416单菌落和TJG12单菌落，30℃，220rpm培养18-24h后，分别按接种量1％接入含有25mL YPD液体培养基的250mL圆底摇瓶内，30℃，220rpm培养60h。发酵至18h时，加入葡萄糖进行碳源的补充。发酵84h结束后，离心取沉淀，除去上清，使用10ml无菌水重悬，加入0.5mm的玻璃珠，使用高速匀浆破碎仪破碎20min，取出破碎后的混合液，0.55μm过滤后进行高效液相色谱分析。流动相使用稀硫酸，检测器使用紫外检测器，检测波长为210nm，检测温度50℃。

经过液相分析，构建成功的线粒体区室化菌株TSL416的L-LA产量为12.32g/L，在TSL416基础上，构建成功的低乙醇低甘油高乳酸菌株TJG12的L-LA产量为29.55g/L。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种产L-乳酸的重组菌及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 984

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

gtgagaaaga cgaaattggt ggttgcaggc gtcgggcatg tcggttctta tgtgcttgca 60

aatgcgatga aactgggcct tttttcggaa attgctgtac tggataaaaa ggaaggggtc 120

gcattcgggg aagcgctcga ttggaggcat gccacagcac ttacatatat gccaaacaca 180

agcgtgaaag caggggatta ctcggaatgc gccgatgcgg acgtcattat ttgtgcagca 240

gggccaagcg taattccatc ggaaaaagac gaaatgccgg accggtcagg gcttgccagg 300

acgaatgccg ccgtggtgcg ggaagtcatg gcagggatta cgaaatatac aaaagaagct 360

gtcatcattt ttattacaaa tccgcttgat acgattgtct atattgctga aaatgaattt 420

ggctatccga aagggcggat attcggaaca ggcaccatgc ttgactcggc ccgcctccgc 480

cagattgttg ccgaaaatta cggcattgat ccgaaaagtg taacggggta tatgatgggc 540

gagcatgggt ttaccgcatt tccggttttc agccgtttaa atgtacaggg attccgcgaa 600

aaagaactgg atagcgtgtt taaaggaaaa gaaccgttgg acagagaaac gttcagacaa 660

aaggtggtga aaaccgcttt tgatgtcctg aatgggaaag gatggaccaa tgccggtgtc 720

gctgaggctg cagtcacatt ggcaaaagca gtaatgctgg atgaaaaaag catttatccg 780

gtttccgcca ctttgcacgg tcagtacgga tataacggtg atgtcgcttt aagcatacca 840

agtgtcatcg gccggggcgg gatcgaacaa caacttgaaa ttgaactcga cgaacaggaa 900

acatcctggc tgcacgaatc ggcaaaatcg attcagcata caatggcatc ggtaaaaacc 960

ggaaaatcgt atattcgggc ttga 984

<210> 2

<211> 945

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

atgaaaatta caagtagaaa agtagtcgtg attggaacag gatttgtcgg aacaagtatt 60

gcttattcaa tgattaatca agggcttgtc aacgagttag ttttgataga tgtcaatcaa 120

gataaagctg agggtgaggc tttagattta ttggatggca tatcttgggc tcaagaaaat 180

gttattgtaa gagctggaaa ttacaaggat tgtgaaaatg cagatattgt cgtgattaca 240

gctggtgtga accaaaaacc cggacaatca cgtttagatt tggtcaatac aaatgctaaa 300

attatgcgct caatcgttac tcaagttatg gattcaggtt ttgatggtat ttttgtaatt 360

gcttctaatc ctgtggatat ccttacctat gtcgcttggg aaacttctgg tcttgaccaa 420

tctagaattg tcggaactgg tacaactttg gataccacac gttttagaaa agaattggcc 480

acaaaactag aaattgaccc tcggagtgtt cacggatata ttattggtga gcatggcgat 540

tctgaagttg cagtttggtc acacactacg ataggtggaa aacctattct tgaatttatt 600

gttaaaaata aaaaaattgg tcttgaagat ttgtctaatt tgtcaaataa ggttaaaaat 660

gctgcttatg aaattattga taaaaaacaa gccacttatt acggaattgg aatgagcaca 720

gctagaattg tcaaagccat attaaataat gaacaagtca ttctaccagt ttctgcctat 780

ttgcgtggag aatatggtca agaaggggtc tttactggtg ttccatctgt cgtaaatcaa 840

aatggtgtca gagaaattat tgaactcaat attgatgctt atgaaatgaa acaatttgaa 900

aagtctgtca gtcaacttaa agaagtcata gaatctatta aataa 945

Claims (10)

1.一种产L-乳酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌在酿酒酵母宿主中过表达了D-乳酸脱氢酶Dld1基因，并采用来源于凝结芽孢杆菌的乳酸脱氢酶LDH基因替换丙酮酸脱羧酶基因Pdc1和丙酮酸脱羧酶基因Pdc6，采用来源于可合成L-乳酸的乳酸乳球菌的L乳酸脱氢酶LLDH基因替换乙醇脱氢酶基因Adh1、甘油三磷酸脱氢酶1基因Gpd1或甘油三磷酸脱氢酶2基因Gpd2，敲除酿酒酵母中的转化乳酸为丙酮的L-乳酸氧化还原酶基因Cyb2和羧基转运蛋白基因Jen1。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述的酿酒酵母宿主为酿酒酵母MTPfo-4，保藏编号为CCTCC NO:M2020199。

3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述的D-乳酸脱氢酶DLD1的NCBI基因编号为NM_001180234.1。

4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述的来源于凝结芽孢杆菌的乳酸脱氢酶LDH的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的来源于乳酸乳球菌的乳酸脱氢酶LLDH的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述的丙酮酸脱羧酶PDC1的NCBI基因编号为NM_001181931.1，丙酮酸脱羧酶PDC6的NCBI基因编号为NM_001181216.3。

6.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述的乙醇脱氢酶ADH1的NCBI基因编号为NM_001183340.1，甘油三磷酸脱氢酶1GPD1的NCBI基因编号为NM_001180081.1，甘油三磷酸脱氢酶2GPD2的NCBI基因编号为NM_001183314.1。

7.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述的酿酒酵母中的L-乳酸脱氢酶LLDH的NCBI基因编号为NM_001182412.1，羧基转运蛋白JEN1的NCBI基因编号为NM_001179782.1。

8.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，过表达D-乳酸脱氢酶DLD1基因是通过将TEF1强启动子插入DLD1基因序列前端进行强化表达。

9.权利要求1～8任一项所述的重组菌在发酵生产L-乳酸中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的应用具体是以所述重组菌为发酵菌株，以葡萄糖为底物，发酵生产L-乳酸。

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