CN101886048A

CN101886048A - 一种产乳酸工程菌及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN101886048A
Application number: CN 201010232730
Authority: CN
Inventors: 刘立明; 赵亮亮; 陈坚
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2010-07-21
Filing date: 2010-07-21
Publication date: 2010-11-17
Anticipated expiration: 2030-07-21
Also published as: CN101886048B

Abstract

本发明公布了一种产乳酸工程菌及其构建方法和应用，属于发酵工程领域。本发明提供的基因工程菌株通过同源重组的方法将来源于Bovine的乳酸脱氢酶(LDH)基因片段整合入S.cerevisiae基因组中，同沉默了菌株自身丙酮酸脱羧酶(PDC1)基因。将构建得到的工程株用于发酵生产乳酸，发酵100h后，乳酸产量达15g/L，乙醇产量比出发菌株下降了45％，为16.2g/L，具有广阔的应用前景。

Description

一种产乳酸工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种产乳酸工程菌及其构建方法，属于遗传工程领域。本发明还涉及一种产乳酸工程菌的应用，特别是发酵生产乳酸，属于发酵工程领域。

背景技术

作为一种重要的平台化合物，L-乳酸的需求随着石油资源的枯竭而不断增加。在L-乳酸合成工艺中，以生物质为原料采用微生物发酵(乳酸菌和霉菌)的工艺具有广泛的应用。然而由于乳酸菌营养需求高和难以耐受恶劣环境胁迫，以及霉菌易形成菌丝团和副产物较多等原因，限制了L-乳酸发酵产业的发展。Saccharomy cescerevisiae作为模式微生物具有：(1)作为单细胞微生物，易利用简单培养基快速生长；(2)存在单倍体与双倍体两种形式而易于基因工程改造和筛选；(3)可通过多种代谢工程策略进行生长或代谢表型改造；(4)具有丰富的单倍体和二倍体单基因缺失菌株；(5)具有丰富的生理功能信息(SGD)和组学分析技术等优点，为L-乳酸的微生物制造提供了菌株平台。但由于S.cerevisiae自身的基因特性决定其不能过量合成L-乳酸，为此需要借助代谢工程策略，引入外源乳酸脱氢酶(LDH)基因，同时沉默PDC1，使丙酮酸节点的代谢流流向L-乳酸途径，同时降低副产物乙醇的积累以提高乳酸的转化率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种产乳酸工程菌。

所述产乳酸工程菌基因组中携带外源乳酸脱氢酶(LDH)基因且沉默了丙酮酸脱羧酶(PDC1)基因。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种上述产乳酸工程菌的构建方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

1)克降Bovine LDH基因；

2)克隆PDC1基因上下游序列；

3)融合PCR构建两端为PDC1基因的上下游序列，中间为LDH基因的同源重组片段；

4)将步骤3)得到的同源重组片段导入受体菌；

5)验证所述工程菌。

步骤4)中所述受体菌为酵母菌。

所述酵母菌为低产乳酸，高产乙醇酵母菌。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种所述产乳酸工程菌在发酵生产乳酸中的应用。

发酵生产丙酸的工艺为：30℃、200r/min摇瓶培养所述工程菌至对数中期，以8％接种量接种入发酵罐；发酵参数为：pH 5.5，通气量1.5L/min，溶氧50％。

本发明利用同源重组的方法，获得一株高产乳酸工程菌。用本发明提供的工程菌生产乳酸，可以突破乳酸菌及霉菌生产的瓶颈，简单易行，发酵100h后乳酸产量达15g/L。

附图说明

图1pY13TEF1-LDH物理图谱及其菌落PCR验证

A：pY13TEF1-LDH物理图谱

B：pY13TEF1-LDH菌落PCR验证

M：Market 1-7：pY13TEF1-LDH阳性转化子 8：阴性对照 9：阳性对照

图2同源重组片段PDC1启动子-LDH-CYC1-His3-PDC1下游序列的构建

(A)：融合PCR示意图；(B)：PDC1启动子、LDH-CYC1-His3及PDC1下游序列的独立扩增电泳图.M：DNA marker；1：PDC1下游序列；2：LDH-CYC1-His3；3：PDC1启动子.；(C)：LDH整合表达片段电泳图.M：DNA marker；1：LDH整合表达片段

图3同源重组表达示意图

图4产乳酸工程菌验证

(A)：PCR验证引物示意图；

(B)CEN.PK2-1C和工程菌CENPK2-1C[LDH]的PCR验证电泳图.M1：1kb markers；1：引物YZ5和YZ6以CEN.PK2-1C为模板；2：引物YZ5和YZ6以CENPK2-1C[LDH]为模板；3：引物YZ4和YZ7以CEN.PK2-1C为模板；4：引物YZ4和YZ7以工程菌为模板；5：引物YZ3和YZ7以CEN.PK2-1C为模板；6：引物YZ3和YZ7以工程菌为模板；7：引物YZ1和YZ2以CEN.PK2-1C为模板；8：引物YZ1和YZ2以工程菌为模板。

图5乳酸产量对比

图6乙醇产量对比

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克降手册所述的条件进行操作。

实施例1产乳酸工程菌的构建

1、克隆Bovine LDH基因

以质粒pLAZ 10(Bianchi，2010.Efficient Homolactic Fermentation by Kluyveromyces lactisStrains Defective in Pyruvate Utilization and Transformed with the Heterologous LDH Gene.ApplEnviron Microbiol，67(12)：5621-5625.)为模板，PCR扩增得到LDH片段。采用带有XbaI和ClaI酶切位点的LDH-F和LDH-R为引物，用相应的内切酶对LDH片段和质粒pY13TEF1(购自德尔宝生物科技有限公司)进行双酶切、纯化、连接构建质粒pY13TEF1-LDH(图1A)。将连接产物转化JM109感受态细胞中后，涂布带有氨苄抗性的LB平板，经37℃过夜培养，挑取转化子进行验证，如图1B。将阳性转化子接种液体LB培养基，提取质粒、酶切、验证并测序确认质粒pY13TEF1-LDH已构建成功。

2、克隆PDC1基因上下游序列

如图2A所述，采用试剂盒G-biosciences(St Louis，Mo，USA)提取S.cerevisiae CEN.PK2-1C(MATa ura3-52 leu2-3，112trp1-289 his3ΔMAL2-8^cSUC2，购于EUROSCARF菌种保藏中心)基因组并以其为模板，经PCR扩增得到PDC1 Promoter片段，引物为PDC1 Promote-F和PDC1Promoter-R。同样方法获得PDC1 3′末端片段，引物为PDC1 3′End-F和PDC1 3′End-R(图2B)。

3、构建同源重组片段PDC1启动子-LDH-CYC1-His3-PDC1下游序列

以质粒pY13TEF1-LDH为模板，PCR扩增得到LDH-CYC1 terminator-His3片段，引物为L-C-H-F和L-C-H-R。将上述三种片段进行纯化并用1％的琼脂糖凝胶电泳进行验证，结果如图2B所示。按等摩尔的比例将3种片段进行混合(总浓度≥800ng)，加入由Pyrobest^TM DNA聚合酶、dNTPs和MgCl₂组成的混合液进行PCR扩增。PCR程序为94℃，30Sec；56℃，1min；72℃，4min；进行5个循环，然后以该轮PCR产物为模板，引物为PDC1 Promoter-F，PDC13′End-R，按照相同程序进行28个循环后得到整合表达片段，如图2C所示。

表1LDH整合表达片段构建所需引物及其序列

4、构建产乳酸工程菌

采用LiAc转化法将经过凝胶回收试剂盒纯化的整合片段转化S.cerevisiae CEN.PK2-1C，按照双交换的原理，整合片段中与S.cerevisiae基因组同源的片段在PDC1位点发生整合，达到沉默PDC1并整合表达LDH的目的，其中LDH受PDC1启动子的调控(图3)。以质粒和水做阴阳性对照，转化液经后培养后，涂布SC组氨酸缺陷筛选培养基平板，放置于30℃恒温培养箱中，培养3至5d后长出转化子，对照则无转化子。挑取其中较大的转化子划线于新的组氨酸筛选平板中以进行传代培养，重复同样操作3次。

筛选培养基组成为(g/L)：葡萄糖20，YNB(without NH₄SO₄)1.7，硫酸铵4，所需氨基酸适量。

5、验证产乳酸工程菌

针对融合表达片段的特点，采用表2的序列构建如图4A所示的验证引物。针对整合后的基因组设计引物YZ1、YZ2和YZ5、YZ6，采用原菌基因组和转化子的基因组为模板进行PCR扩增，在转化子基因组中获得大小分别为897bp和1179bp的条带。类似地，以原菌基因组为模板设计引物YZ3、YZ7，扩增得到544bp的条带。若控制延伸时间为1min，仅以原菌基因组为模板设计引物YZ4、YZ7扩增得到1152bp的条带，而以整合基因组为模板则无法获得类似片段。电泳结果如图4B所示。验证正确的产乳酸工程菌命名为：S.cerevisiaeCENPK2-1C[LDH]。

表2整合表达验证引物

实施例2发酵生产乳酸

从新鲜斜面接一环所述产乳酸工程菌到种子培养基(80mL SC/250mL锥形瓶)，于30℃、200r/min摇瓶培养至对数中期(24h)后，以8％接种量(v/v)接入装有700mL YNB发酵培养基的1.3L发酵罐中。发酵过程中以4mol/L的NaOH维持pH保持5.5，通气量为1.5L/min，溶氧控制为50％。发酵100h后，乳酸产量达15g/L。

种子培养基成分为(g/L)：葡萄糖20，YNB(withoutNH₄SO₄)1.7，硫酸铵4，所需氨基酸适量。

YNB发酵培养基组成为(g/L)：CaCO₃4.5，YNB(without NH₄SO₄)1.7，尿素1，乙醇5，葡萄糖70，所需氨基酸适量。

实施例3L-乳酸、乙醇及葡萄糖的检测

L-乳酸和乙醇浓度的测定：采用Agilent A1200高效液相色谱(HPLC)仪测定。

色谱条件

色谱柱：Aminex HPX-87H(Bio-Rad)

流动相：0.005mol/L^-1H₂SO₄

流速：0.6mL/min^-1

柱温：35℃

进样量：5μL

检测器：示差折光

样品制备：5mL发酵液在10000rpm下离心10min，取上清液移入试管中以备测L-乳酸、乙醇和残余葡糖糖时用。测L-乳酸时，取1mL上清液移入10mL容量瓶中，去离子水定容至刻线，经0.45μm滤膜过滤后，滤液供液相色谱分析用。

结果表明：(1)本发明构建的工程菌积累15g/L的L-乳酸，而出发菌株CENPK2-1C的发酵液中未检测出L-乳酸(图5)。表明，经外源LDH的导入使S.cerevisiae具有积累L-乳酸的代谢功能；(2)与出发菌株比较，本发明构建的工程菌乙醇产量下降了46％(16.2g/L)(图6)，这是PDC1缺失和LDH竞争的双重结果。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种产乳酸工程菌，其特征在于基因组中携带外源乳酸脱氢酶(LDH)基因且沉默了丙酮酸脱羧酶(PDC1)基因。

2.权利要求1所述产乳酸工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

1)克隆Bovine的LDH基因；

2)克降PDC1基因的上下游序列；

4)将步骤3)得到的同源重组片段导入受体菌；

5)验证所述工程菌。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于步骤4)中所述受体菌为酵母菌。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于所述酵母菌为低产乳酸、高产乙醇的酿酒酵母。

5.权利要求1所述产乳酸工程菌在发酵生产乳酸中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于发酵生产的工艺为：30℃、200r/min摇瓶培养所述工程菌至对数中期，以8％接种量接种入发酵罐，发酵培养100小时；发酵参数为：pH5.5，通气量1.5L/min，溶氧50％。