CN1844401A - 一种快速构建基因打靶重组用载体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种借助于Gateway克隆系统的快速构建基因打靶重组用载体的方法。首先，它用特殊设计的PCR引物进行PCR扩增，得到用于同源重组的5’和3’同源臂，通过BP重组反应分别装入pDONRP4－P1R和pDONRP2R－P3载体中；然后，将目的片段装入我们创造性构建的中间载体pDONR loxP/MCS/loxP－FRT/NEO/FRT中；最后，将以上3种载体与pDEST R4－R3TK载体的混合物在通过1小时快速LR重组反应后，5’同源臂，中间片段，3’同源臂，以及TK负筛选元件便会自动按照设计的顺序拼接，转化并纯化后即得到基因打靶用载体。该方法具有快速、灵活、省时、省力等优点，并突破了传统方法中内切酶位点分布的限制，在基因功能研究方面有重要意义。
Description
一、技术领域
本发明涉及分子生物学及遗传学前沿领域，是一种通过对来源于λ噬菌体的Gateway重组反应系统进行创造性改造，而发明的一种快速、灵活、便捷的构建基因打靶重组用载体的方法。
二、技术背景
人类基因组测序计划的完成，既是近数十年来生物学领域中的巨大成果，也给生物工作者提出了新的挑战。由于基因组序列并不能直接演绎出基因组编码的RNA和蛋白质是如何相互整合来执行细胞生长、发育、分化等功能，以致形成整个人体的形态、生理和行为的，后基因组时代的主要任务既是研究和阐明数以万计基因的功能。然而由于人类生理和病理过程的复杂性，以人体作为试验研究对象受到了严格的限制。作为哺乳动物的小鼠，其基因总数、基因组结构和生理组织与人类极其相似，两个物种的染色体有大于99％的同源性，加之在小鼠生理、病理、药理、毒理、感染、免疫、行为和认知方面积累的大量实验资料，使得小鼠成为诠释人类基因组的结构和功能及生物医药学领域中最具科学价值的生物。转基因、基因敲除、基因打靶是小鼠遗传学研究中最为常用的手段。自从1987年美国Utah大学的Mario Capecchi构建了第一只基因敲除小鼠以来，人们已经在世界范围内构建了3000余种不同类型的基因敲除小鼠。在我国，这项技术也业已成熟和完善起来，成为生物学领域中一个举足轻重的研究热点。为了避免某些重要基因在缺失后造成生物胚胎期死亡的限制，人们还发明了利用Cre-loxP重组酶系统所构建的条件基因敲除的方法，即只在特定的时间或特定的组织中让目的基因灭活。这极大的扩展了基因敲除技术的应用。
构建基因敲除的首要工作也是最关键的一步是要构建一个合理、高效的、用于改造胚胎干细胞基因组DNA的同源重组载体，载体构建的质量直接决定了最终实验的成败。一个典型的条件基因敲除载体通常由五部分组成：(1)5’和3’同源臂，即与靶基因两端基因组DNA完全相同的序列，用于提供发生同源重组的位点；(2)NEO正筛选元件，用于选取发生了重组的干细胞阳性克隆；(3)TK负筛选元件，用于拚弃发生随机插入的干细胞假阳性克隆；(4)需要条件敲除的基因片段；(5)位于该片段两端两个同方向排列的Cre重组酶特异识别位点loxP(如图1)。对于以上五部分的拼装，以往的传统方法主要依赖不同的限制性内切酶进行各片段的切割再连接的经典方案。如果实验进展顺利，一个条件基因敲除载体的构建往往花费3～6个月时间。但传统方法的限制并不仅局限在时间上，更重要的是，需要敲除的目的基因两端的限制性内切酶位点具有很大的偶然性，而各部分又不可使用相同的内切酶，从而使得在实验操作时可供选择的余地极小，这不仅增加了实验的难度，还限制了基因敲除的灵活性，更难以达到实验设计的预期效果。另一方面，在传统方法对同源臂的获取上采用BAC筛选的方法，这不仅费时(约1个月)、费力、费钱(约2000～4000美元)，其中放射性同位素的使用也对工作者的健康造成极大的危害。总上所述的这些，都很大程度上延缓了对基因功能的研究。世界各地的科学家们也一直努力探索着其中的捷径。
三、发明内容
1、发明目的
针对传统方法的诸多局限，为使基因敲除载体的构建更加迅速、便捷、灵活、安全，我们借助非常成熟的Gateway同源重组技术发明了一种构建基因打靶重组用载体的方法。。
2、技术方案
这种快速构建基因打靶重组用载体的方法，其特征在于该方法的步骤如下：
(A)5’和3’同源臂载体的构建(如图2，3)：利用特殊设计的PCR引物，以基因组DNA为模板，用LA Taq酶扩增用于同源重组的5’和3’同源臂片段；目的PCR片段通过琼脂糖凝胶分离并切胶回收后，分别与100～200ng pDONRP4-P1R或pDONRP2R-P3载体混合，在BP Clonase II酶切混合物的作用下进行Gateway同源重组反应，37℃保温1小时后转化至DH5α大肠杆菌后于卡那霉素抗性的LB固体培养基上进行筛选培养，序列的正确性用M13F、M13R引物正反测序验证，装配好的载体我们分别命名为pENTR5’和pENTR3’；
(B)中间载体的构建(如图4)：根据不同的实验要求，对我们构建的质粒载体pDONR loxP/MCS/loxP-FRT/NEO/FRT进行改造，(1)常规基因敲除：不必做任何改造；(2)条件基因敲除或基因插入：将需要敲除或插入的片段用限制性内切酶消化，然后用T4连接酶连接至pDONR loxP/MCS/loxP-FRT/NEO/FRT载体中位于两个loxP位点之间的多克隆位点(Multi Cloning Site，MCS)，将连接产物转化至DH5a大肠杆菌后于卡那霉素抗性的LB固体培养基上进行筛选培养；
(C)最终载体的拼装(如图5)：将以上3种载体与pDEST-R4R3-TK载体各60~100ng相互混合，加入LR Clonase Plus酶切混合物进行Gateway同源重组反应，37℃保温1小时后转化至DH5a大肠杆菌后于氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上进行筛选培养，对长出来的克隆进行扩增、纯化即可得到最终的重组载体。
上述的方法步骤A中同源臂的构建，所述的同源臂片段是用LA Taq酶进行PCR扩增获得；PCR片段是用BR Gateway重组的方法装入载体；在对PCR引物的进行设计时的三个要求：(1)5’同源臂正向引物5’端加attB4序列，反向引物5’端加attB1序列；(2)3’同源臂正向引物5’端加attB2序列，反向引物5’端加attB3序列；(3)引物与模板互补的部分长度在30~35bp之间，Tm值不小于70℃，引物以碱基G或C结尾。
上述的方法步骤B中中间载体的构建，其特征在于中间模板载体pDONRloxP/MCS/loxP-FRT/NEO/FRT的使用；上述的方法步骤C中最终载体的拼接，其特征在于pDEST-R4R3-TK载体的使用。
上述方法步骤A和B中所述的LB固体培养基按《分子克隆》配制。
上述的这种方法，主要用于小鼠及其它模式动物中的基因敲除、基于Cre/loxP系统的条件基因敲除或基因插入载体的构建。
3、有益效果
使用本方法进行载体构建，与传统方法相比有以下几大优点：(1)省时，可以将原本至少3～6月的工作时间缩短至1个月之内；(2)高效，由于空载的pDONRP4-P1R、pDONRP2R-P3和pDEST R4R3 TK载体的重组位点之间装了ccdB自杀元件，极大的减少了假阳性克隆的产生；(3)灵活，采用PCR直接扩增同源臂的方法，避开了限制性内切酶位点的困扰，理论上可以作用于基因组DNA的任何一段区间。经我们多次实验验证，这样扩增的同源臂有可靠的保真性。(4)便捷，我们创造性构建的质粒pDONR loxP/MCS/loxP-FRT/NEO/FRT、pDEST-R4R3-TK大大的简化了各部分拼装的步骤。
四、附图说明
图1是外源构建的条件基因敲除载体与内源基因组DNA同源重组原理图。
图2是5’同源臂与pDONRP4-P1R载体的同源重组图。
图3是3’同源臂与pDONRP2R-P3载体的同源重组图。
图4是中间载体的构建示意图。
图5是各片段通过LR重组反应进行最终拼接的示意图。
五、具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
(A)5’和3’同源臂载体的构建(如图2，3)：
该方法是通过PCR扩增获得5’和3’同源臂：PCR引物按照以下方案设计：对于5’同源臂，正向引物5’-GGGG-
ACAACTTTGTATA-GAAAAGTTG-(模板特异序列)-3’；反向引物5’-GGGG-
ACTGCTTTTTTG-TACAAACTTG-(模板特异序列)-3’；对于3’同源臂，正向引物5’-GGGG-ACAGCTTTCTTGTACAAAGTGG-(模板特异序列)-3’；反向引物5’-GGGG-ACAACTTTGTATAATAAAGTTG-(模板特异序列)-3’，其中模板特异序列除了人工设计外，也可以用软件完成，比如Primer3；PCR反应以129系小鼠基因组DNA为模板，在LA Taq体系中完成，推荐的程序为：94℃ 5min；94℃ 30sec，68℃7min，40循环；68℃ 10min。经我们多次实验证明，当引物长度在30～35bp，Tm值大于70℃时，LA Taq可以很好的对基因组DNA长片段(1～5Kb)进行扩增，产物质量完全可以满足同源臂的需要；
将扩增好的片段于琼脂糖凝胶上分离后纯化，即可与pDONR载体进行BR重组反应，将纯化的PCR 1ul与100～200ng相应的pDONR载体混合，加入去离子水至8ul，然后加入2ul BP Clonase II酶混合物，混匀，将以上反应体系置于37℃保温1小时后，5’PCR的attB4和attB1会在BR重组酶的作用下识别pDONRP4-P1R上的attP4和attP1R位点，从而使5’同源臂替换出载体上的ccdB元件，同理，3’PCR两端的attB2和attB3也会识别pDONRP2RP3上的attP2R和attP3位点，如图2，3所示，加入1ul蛋白酶K溶液(2ug/ul)37℃保温10分钟使重组酶失活，将10ul溶液全部转化到100ul DH5α感受态细胞中，然后将大肠杆菌铺到卡那霉素抗性的LB固体培养基上进行过夜筛选培养，从长出的阳性克隆中抽取的质粒，可以用M13F和M13R常规引物进行测序，以验证PCR扩增产物的正确性，去除含突变位点的克隆；
(B)中间载体的构建(如图4)：
当实验涉及条件基因敲除或基因插入的时候，我们还需要对中间载体进行改造。这步改造由于采用了pDONR loxP/MCS/loxP-FRT/NEO/FRT而变得异常简单，我们只需要将计划敲除或插入的片段用限制性内切酶的常规方法接入载体的多克隆位点即可。如图4所示，在这一载体中，MCS被ccdB元件一分为二，极大的提高了克隆的效率，降低了假阳性的产生。MCS两端我们预加了两个同方向的loxP位点，使用于Cre-loxP体系的使用。在第二个loxP之后，我们预加含FRT重组识别位电的NEO元件，这既满足了筛选的需要，也便于后续工作中利用Flp-FRT系统去除NEO对小鼠染色体的影响。在克隆过程中，我们推荐两种方案，一是直接利用BamHI内切酶直接切掉ccdB，用BglII或BamHI将目的片段接入载体，其缺点是之后需要一步方向的验证；二是使用SalI和NotI的双酶切体系，一方面直接确定了接入的方向，另一方面SalI和NotI均属于基因组中几率较低的酶种；
(C)最终载体的拼装(如图5)：
在最后一步的组装过程中，我们只需要将上述三种载体与pDEST-R4R3-TK载体各80mg混合反应即可，如图5所示，在LR ClonaseII酶的作用下，attL4与attR4、attR1与attL1、attR2与attL2、attL3与attR3将分别发生重组反应，从而把四部分顺序的连接起来，在这一反应中，混合载体pENTR5’、pENTR3’、pDONR loxP/Target/loxP FRT/NEO/FRT、pDEST R4R3TK各60～100ng，加去离子水至12ul，然后加入4ul 5x反应缓冲液，4ul LR Clonase Plus酶混合物，混匀后于37℃保温1小时，或置于室温(25℃)过夜，反应后加入2ul蛋白酶K于37℃保温10分钟灭活，反应液转化入DH5α感受态细胞中，然后将细菌铺到氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上进行过夜筛选培养，选取阳性克隆检验即可得到最终的重组载体。
材料与来源
试剂：PCR引物由IDT公司合成；LA Taq购于Takara生物公司；载体pDONRP4P1R、pDONRP2RP3、BP Clonase II mix(cat No.：11789-020)、LRClonase Plus mix(cat.No.：12538-013)均购于Invitrogen公司；限制性内切酶SalI、NotI购于New England生物公司、LB固体培养基按《分子克隆》配制。
我们已经用四个不同的基因验证了这一方法的可靠性。现举一例如下：
实施例1 HRPT2条件基因敲除小鼠的载体构建
HRPT2是最近几年发现和克隆的抑癌基因，它编码的蛋白叫做Parafibromin。HRPT2基因突变在人类中会导致甲状旁腺瘤综合症。但该基因的生理功能目前并不清楚。构建HRPT2条件敲除小鼠正是研究其正常生理功能的有效手段。在实验设计中，我们准备将该基因的第二个外现子敲除，以造成基因翻译时的移框而导致编码的蛋白无效。在这一实验中，5’同源臂、3’同源臂、以及二号外现子均用PCR扩增的方法获得。引物如下：5’同源臂正向引物5′-GGGG
ACAACTTTGTATAGAAAAGTTGCAGTACAACATCCAGAAG-AAGGAGA-3′，反向引物5′-GGGG-
ACTGCTTTTTTGTACAAACTTGGT-GCTTGAGATCAACTGCAGAGAC-3′。3’同源臂正向引物5′-GGGG
ACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTAGGATGAGGTTCTTGCACT-GGCAA-3′，反向引物5′-GGGG
ACAACTTTGTATAATAAAGTTGCTCTGGCTTCAGAGAGAC-AGGGAGG-3′。外现子2正向引物：5′-GCAGTCGACATACAGTGAGATATGGTGGAGAG-3′，反向引物：5′-AGCAGACTGCGGCCGCAATCTCTGTGAAATGAGATACTT-3′。外现子片段用SalI和NotI双酶切后装入中间载体的SalI和NotI位点。最终载体完后，我们用AclI进行线性化，纯化后电转入129/SVJ小鼠胚胎干细胞。细胞用G418(250ug/ml)和Ganciclovir(2uM)进行筛选，阳性克隆用Southern杂交的方法进行筛选。在300个细胞克隆中，我们筛选到了24个阳性，重组率达8％，是传统方法1～3％的2.5～8倍。
Claims (5)
1.一种快速构建基因打靶重组用载体的方法，其特征在于该方法的步骤为：
A.5’和3’同源臂载体的构建：利用特殊设计的PCR引物，以基因组DNA为模板，用LA Taq酶扩增用于同源重组的5’和3’同源臂片段，目的PCR片段通过琼脂糖凝胶分离并切胶回收后，分别与100-200ng pDONRP4-P1R或pDONRP2R-P3载体混合，在BP Clonase II酶切混合物的作用下进行Gateway同源重组反应，37℃保温1小时后转化至DH5α大肠杆菌后于卡那霉素抗性的LB固体培养基上进行筛选培养，序列的正确性用M13F、M13R引物正反测序验证，装配好的载体我们分别命名为pENTR5’和pENTR3’；
B.中间载体的构建：根据不同的实验要求，对我们构建的质粒载体pDONRloxP/MCS/loxP-FRT/NEO/FRT进行改造，(1)常规基因敲除：不必做任何改造；(2)条件基因敲除或基因插入：将需要敲除或插入的片段用限制性内切酶消化，然后用T4连接酶连接至pDONRloxP/MCS/loxP-FRT/NEO/FRT载体中位于两个loxP位点之间的多克隆位点即MCS，将连接产物转化至DH5α大肠杆菌后于卡那霉素抗性的LB固体培养基上进行筛选培养；
C.最终载体的拼装：将以上3种载体与pDEST-R4R3-TK载体各60-100ng混合，加入LR Clonase Plus酶切混合物进行Gateway同源重组反应，37℃保温1小时后转化至DH5α大肠杆菌后于氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上进行筛选培养，对长出来的克隆进行扩增、纯化即可得到最终的重组载体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤A中所述的同源臂片段用LATaq酶进行PCR扩增获得；PCR片段用BR Gateway重组的方法装入载体；在对PCR引物进行设计时的三个要求：(1)5’同源臂正向引物5’端加attB4序列，反向引物5’端加attB1序列；(2)3’同源臂正向引物5’端加attB2序列，反向引物5’端加attB3序列；(3)引物与模板互补的部分长度在30-35bp之间，Tm值不小于70℃，引物以碱基G或C结尾。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤B中中间模板载体pDONRloxP/MCS/loxP-FRT/NEO/FRT的使用。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤C中pDEST-R4R3-TK载体的使用。
5.权利要求1所述的一种快速构建基因打靶重组用载体的方法在小鼠及其它模式动物的基因敲除、基于Cre/loxP系统的条件基因敲除或基因插入载体构建中的应用。
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Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101886048A (zh) * | 2010-07-21 | 2010-11-17 | 江南大学 | 一种产乳酸工程菌及其构建方法和应用 |
| CN102277382A (zh) * | 2011-05-25 | 2011-12-14 | 南京大学 | 用BAC-retrieve的方法同时构建条件基因打靶载体和传统打靶载体 |
| CN102559729A (zh) * | 2012-03-08 | 2012-07-11 | 中山大学 | 一种用于染色体整合、进化的表达质粒 |
| CN102719471A (zh) * | 2012-06-05 | 2012-10-10 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 整合质粒pOPHI及无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌 |
| WO2013143438A1 (zh) * | 2012-03-30 | 2013-10-03 | 深圳市中联生物科技开发有限公司 | 基于同源重组的核酸分子克隆方法及相关试剂盒 |
| CN105200074A (zh) * | 2015-09-21 | 2015-12-30 | 华侨大学 | 一种利用dna非特异性结合蛋白hu蛋白构建克隆载体的方法 |
| WO2016173555A1 (zh) * | 2015-04-30 | 2016-11-03 | 杭州菁因康生物科技有限公司 | 新型基因打靶方法 |
| CN108715864A (zh) * | 2018-06-06 | 2018-10-30 | 中国科学院水生生物研究所 | 一种用于小鼠胚胎干细胞的基因插入突变系统及其突变方法和应用 |
| WO2018205977A1 (zh) * | 2017-05-11 | 2018-11-15 | 杭州菁因康生物科技有限公司 | 一种高效的基因工程载体 |
-
2006
- 2006-01-17 CN CN200610037837.9A patent/CN1844401A/zh active Pending
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101886048B (zh) * | 2010-07-21 | 2012-05-30 | 江南大学 | 一种产乳酸工程菌及其构建方法和应用 |
| CN101886048A (zh) * | 2010-07-21 | 2010-11-17 | 江南大学 | 一种产乳酸工程菌及其构建方法和应用 |
| CN102277382A (zh) * | 2011-05-25 | 2011-12-14 | 南京大学 | 用BAC-retrieve的方法同时构建条件基因打靶载体和传统打靶载体 |
| CN102559729B (zh) * | 2012-03-08 | 2013-06-19 | 中山大学 | 一种用于染色体整合、进化的表达质粒 |
| CN102559729A (zh) * | 2012-03-08 | 2012-07-11 | 中山大学 | 一种用于染色体整合、进化的表达质粒 |
| WO2013143438A1 (zh) * | 2012-03-30 | 2013-10-03 | 深圳市中联生物科技开发有限公司 | 基于同源重组的核酸分子克隆方法及相关试剂盒 |
| CN102719471A (zh) * | 2012-06-05 | 2012-10-10 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 整合质粒pOPHI及无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌 |
| CN102719471B (zh) * | 2012-06-05 | 2013-10-30 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 整合质粒pOPHI及无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌 |
| WO2016173555A1 (zh) * | 2015-04-30 | 2016-11-03 | 杭州菁因康生物科技有限公司 | 新型基因打靶方法 |
| US20180355381A1 (en) * | 2015-04-30 | 2018-12-13 | Hangzhou Genekine Biotech Co., Ltd | Novel gene targeting method |
| US11299754B2 (en) | 2015-04-30 | 2022-04-12 | Hangzhou Genekine Biotech Co., Ltd | Gene targeting method |
| CN105200074A (zh) * | 2015-09-21 | 2015-12-30 | 华侨大学 | 一种利用dna非特异性结合蛋白hu蛋白构建克隆载体的方法 |
| CN105200074B (zh) * | 2015-09-21 | 2019-02-22 | 华侨大学 | 一种利用dna非特异性结合蛋白hu蛋白构建克隆载体的方法 |
| WO2018205977A1 (zh) * | 2017-05-11 | 2018-11-15 | 杭州菁因康生物科技有限公司 | 一种高效的基因工程载体 |
| CN108715864A (zh) * | 2018-06-06 | 2018-10-30 | 中国科学院水生生物研究所 | 一种用于小鼠胚胎干细胞的基因插入突变系统及其突变方法和应用 |
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