CN103088434B - 树干毕赤酵母大片段dna基因组文库的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种树干毕赤酵母大片段DNA基因组文库的构建方法，包括如下步骤：（1）提取保藏号为ATCC NO：58376的树干毕赤酵母基因组DNA；（2）重组载体的构建；（3）阳性克隆的筛选；（4）阳性克隆的酶切鉴定及文库的保存。本发明首次成功构建了树干毕赤酵母大片段DNA基因组文库，文库库容量大（克隆概率97％），覆盖率高（N=1.08），运用该基因组文库成功筛选到了纤维二糖酶相关基因，为未知功能目的基因的筛选、相关基因的功能性研究以及进一步基因水平上的改造以获得理想工业化生产菌株奠定了基础。

Description

树干毕赤酵母大片段DNA基因组文库的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及构建树干毕赤酵母大片段DNA基因组文库的方法及该基因组文库在筛选未知的功能基因上的应用。

背景技术

随着分子生物学及生物工程技术的发展，发现新基因，研究新基因的功能已成为功能基因组学研究的热点，构建大片段DNA基因组文库是功能基因组学研究的基本手段。基因组文库是指含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群体，可真实地反映出该物种基因组的全部信息。基因组文库主要用来保存物种的遗传信息，并可用于筛选具有特定功能的未知目的基因。

近年来，以植物纤维素为原料发酵生产燃料乙醇已逐渐成为研究热点，酿酒酵母是传统的在工业生产中广为应用的高产乙醇发酵菌种，但该菌种只能发酵葡萄糖，不能发酵木糖。树干毕赤酵母具有发酵木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、纤维二糖以及木二糖的能力，对于纤维质原料发酵产燃料乙醇具有重要意义。当前许多学者通过改变发酵条件来提高树干毕赤酵母发酵产乙醇的得率，但实际生产能力还达不到工业化需求，因此，通过基因水平上的改造来获得理想菌株十分必要。然而，树干毕赤酵母基因水平上的研究尚处于起步阶段，能够检索到的文献甚少，其基因组测序虽已初步完成，但许多关键的功能目的基因序列（如纤维二糖酶相关基因）仍未知。

因此，有必要构建树干毕赤酵母大片段DNA基因组文库，通过在此基础上进行未知功能目的基因（如纤维二糖酶相关基因）的筛选以及相关基因的功能性研究，为进一步基因水平上的改造以获得理想工业化生产菌株奠定基础。

发明内容

针对现有技术存在的上述缺陷，本发明的目的是提供一种树干毕赤酵母大片段DNA基因组文库的构建方法，本发明的另一个目的是提供一种上述树干毕赤酵母大片段DNA基因组文库在筛选未知的功能目的基因上的应用。

本发明的技术方案如下：

一种树干毕赤酵母大片段DNA基因组文库的构建方法，包括如下步骤：

（1）基因组DNA的提取：

提取保藏号为ATCC NO：58376的树干毕赤酵母基因组DNA；

（2）重组载体的构建：

将步骤（1）所得基因组DNA以及酿酒酵母表达载体YEpLac181分别用限制性内切酶Sau3AⅠ和BamHⅠ于37℃进行酶切，回收酶切后的目的基因片段并连接，得到重组载体；

（3）阳性克隆的筛选：

将步骤（2）所得重组载体转化大肠杆菌感受态细胞，采用蓝白斑筛选法筛选出阳性克隆并计算出阳性克隆子数；

（4）阳性克隆的酶切鉴定及文库的保存：

随机挑取步骤（3）所得阳性克隆进行扩大培养，提取质粒，用限制性内切酶BamH Ⅰ进行单酶切鉴定；经鉴定正确后，挑取步骤（3）所得全部阳性克隆混合培养，于-70℃保藏，即构建得到树干毕赤酵母大片段DNA基因组文库。

其进一步的技术方案为：

步骤（2）所述限制性内切酶Sau3AⅠ的酶切为采用微量稀释法对所述基因组DNA进行部分酶切，所述Sau3AⅠ的稀释倍数为50～150倍，酶切时间为4～8h，优选地，所述Sau3AⅠ的稀释倍数为100倍，酶切时间为6h。

步骤（3）所述大肠杆菌感受态细胞为JM109。

本发明还提供了上述树干毕赤酵母大片段DNA基因组文库在筛选未知的功能基因上的应用。

本发明具有如下有益技术效果：

本发明提供了一种高效的构建树干毕赤酵母大片段DNA基因组文库的方法。本申请人通过该方法首次成功构建了树干毕赤酵母大片段DNA基因组文库，该基因组文库所包含的目的基因片段平均大小可达5000bp，阳性克隆子数目多（3000个），文库库容量大（克隆概率97％），覆盖率高（N=1.08），已覆盖树干毕赤酵母Pichia stipitis CBS 5773全部基因；此外，运用该基因组文库成功筛选到了纤维二糖酶相关基因；本发明所建基因组文库为未知功能目的基因的筛选、相关基因的功能性研究以及进一步基因水平上的改造以获得理想工业化生产菌株奠定了基础。

附图说明

图1为本发明重组质粒的构建策略图。

图2为本发明树干毕赤酵母基因组DNA的Sau3AⅠ酶切琼脂糖凝胶电泳分析图谱，其中，泳道1为Lambda DNA/PstⅠMarker，泳道2为经Sau3AⅠ酶切后的树干毕赤酵母基因组DNA。

具体实施方式

以下结合附图，并通过实施例对本发明进行具体说明。

下述实施例中所使用实验材料如下：

细胞系：树干毕赤酵母Pichia stipitis CBS 5773购自美国模式培养物寄存库（ATCC），其保藏号为ATCC NO：58376；酿酒酵母W303-1A购自上海北诺生物科技有限公司；大肠杆菌感受态细胞E.coli JM10购自宝生物工程（大连）有限公司。

质粒和酶：酿酒酵母表达载体YEpLac181购自上海北诺生物科技有限公司；限制性内切酶Sau3AⅠ和BamHⅠ以及Buffer购自NEB；蜗牛酶购自Fermentas公司；T4DNA连接酶以及Buffer购自宝生物工程（大连）有限公司。

其他试剂：X-Gal和IPTG购自宝生物工程（大连）有限公司；氨苄青霉素购自上海生工生物工程公司；其他试剂均为国产货及进口分析纯试剂。

实施例1树干毕赤酵母Pichia stipitis CBS 5773大片段DNA基因组文库的构建

1.1树干毕赤酵母基因组DNA提取

取树干毕赤酵母Pichia stipitis CBS 5773接种于YEPD液体培养基中，于30℃振荡培养过夜，摇床转速200r/min；取2mL培养物至5mL离心管中，于6000r/min离心5min，弃去上清液，收集菌体，加入0.5mL酵母染色体提取试剂Ⅰ（0.1mol/L Na2EDTA-0.9mol/L山梨醇，pH7.5），重悬菌体；加入30μL质量浓度为5mg/mL的蜗牛酶，于37℃处理菌体细胞5h（此时大多数细胞形成原生质体），于6000r/min离心5min，弃去上清液，收集菌体；加入0.5mL酵母染色体提取试剂Ⅱ（20mmol/L Na2EDTA-50mmol/L Tris-HCl，pH7.4），重悬菌体，并加入50μL质量体积浓度为10％的SDS，于65℃保温30min以裂解细胞；加入200μL 5mol/L的醋酸钾溶液，冰浴1h；于8000r/min离心8min，取上清液移至一干净离心管中，置于冰浴并加入等体积的异丙醇，静置15min；于6000r/min离心5min，弃去上清液，收集菌体沉淀，用75％的酒精洗涤沉淀两次；将洗涤后的沉淀物自然晾干，加入30μLTE缓冲液（pH7.4）溶解沉淀，于4℃保存备用。

1.2重组载体的构建

本发明重组载体的构建策略参见图1。限制性内切酶Sau3AⅠ和BamHⅠ为同尾酶，用Sau3AⅠ对树干毕赤酵母基因组DNA进行部分酶切获得平均大小为5000bp的DNA片段，同时用BamH Ⅰ将酿酒酵母表达载体YEpLac181酶切成线性，将上述酶切产物进行连接，即可构建得到7546bp的重组载体。

采用微量稀释法，取限制性内切酶Sau3AⅠ进行系列稀释(50×,60×,70×,80×,90×，100×，110×，120×，130×，140×，150×)，在37℃的条件于不同反应时间（4h，4.5h，5h，5.5h，6h，6.5h，7h，7.5h，8h），对上述提取所得基因组DNA进行部分酶切，以获得最佳酶切反应条件。酶切反应体系为10μL：Buffer 1μL、Sau3AⅠ0.5μL、基因组DNA 8.5μL，酶切产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，结果显示，Sau3AⅠ稀释倍数为100倍，酶切时间为6h时，可获得较高纯度的5000bp的DNA大片段，符合期望值，为最佳酶切反应条件，试验结果参见图2；回收酶切后的DNA片段。

用限制性内切酶BamHⅠ对酿酒酵母表达载体YEpLac181进行酶切，酶切反应体系为10μL：Buffer 1μL、BamHⅠ0.5μL、载体8.5μL，回收酶切后的载体。

将回收的DNA和载体于16℃进行过夜连接，连接反应体系10μL：Buffer1μL、T4DNA连接酶0.5μL、DNA 6μL、载体2.5μL，具体操作步骤参见T4DNA连接酶使用说明书，得到重组载体。

1.3重组载体的转化和阳性克隆的筛选

在无菌操作的条件下取200μL大肠杆菌感受态细胞E.coli JM109置于冰浴，加入10μL上述连接产物，轻轻吹打混匀，继续冰浴30min，取出于42℃热休克90s，立即冰浴3min，加入1mL LB液体培养基于37℃振荡培养1h，摇床转速150r/min；取50μL培养物均匀涂布于LB平板培养基（含终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素、20μL 100mg/mL的IPTG和100μL 20mg/mL的X-gal），置于37℃培养箱中过夜培养；上述试验中共涂布10块LB平板培养基，平均每块平板获得300个白色单菌落（白斑），55个蓝色单菌落（蓝斑），因此共计得到3000个阳性克隆子。

1.4阳性克隆的鉴定和文库的保存

从上述每块平板上随机挑取100个白色单菌落接种于LB液体培养基（含终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素），于37℃振荡培养10-12h，摇床转速150r/min，提取质粒DNA，用限制性内切酶BamH Ⅰ进行单酶切鉴定，酶切产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析；试验结果显示所有阳性克隆均鉴定正确；挑取上述3000个阳性克隆接种于50ml的LB液体培养基（含终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素），于37℃振荡培养过夜，摇床转速150r/min；取混合培养的菌液800μL与等体积的30％的甘油混匀，于-70℃保藏，即构建得到树干毕赤酵母大片段DNA基因组文库。

实施例2树干毕赤酵母大片段DNA基因组文库的质量评价

根据所获得的基因组文库的阳性克隆子数目及平均插入片段的大小，依据公式：库容量=文库中阳性克隆子的数目×插人片段的平均大小／该生物基因组的大小，计算该基因组文库的库容量大小。

其中，已知树干毕赤酵母Pichia stipitis CBS 5773的基因组大小为15441179bp，该文库中阳性克隆子的数目为3000个，插入片段的平均大小5000bp，计算得到该基因组文库的库容量为：库容量=3000×5000／15441179=97％，即该文库中所含插入片段的总长度为树干毕赤酵母Pichiastipitis CBS 5773基因组总长度的0.97倍，即从该文库中筛选到树干毕赤酵母任一DNA序列的精确概率（克隆概率）为97％。

根据Clarke-Carbon公式：

N=当要求的克隆概率为P时，一个基因组文库中所需的含有重组DNA的克隆数；P=克隆概率，即任一DNA片断至少一份拷贝存在于该文库的概率；f＝限制片断的平均长度与基因组DNA总长度之比。

其中，已知P为97％，f为5000／15441179，计算得到N为1.08，N＞1，表示该基因文库已经覆盖了树干毕赤酵母Pichia stipitis CBS 5773全部基因。

应用实施例1从树干毕赤酵母大片段DNA基因组文库中筛选纤维二糖酶相关基因

取实施例1-1.4中保藏的基因组文库的混合菌液并提取质粒，用醋酸锂转化法将所得混合质粒转化酿酒酵母W303-1A中进行游离表达，并涂布于YNBC培养基（YNBC培养基成分如下：YNB 6.7g/L，纤维二糖20g/L，亮氨酸0.12g/L，色氨酸0.12g/L，组氨酸0.12g/L，腺嘌呤0.12g/L，其余成分为水）于30℃培养6天；随机筛选可在上述YNBC培养基生长的阳性克隆，用pNPG法测得该阳性克隆表现出纤维二糖酶活性；将上述阳性克隆送至上海生工生物工程公司进行测序并分析，获得纤维二糖酶相关基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

综上所述，通过本发明方法成功构建了树干毕赤酵母大片段DNA基因组文库，文库库容量大（克隆概率97％），覆盖率高（N=1.08），此外，运用该基因组文库成功筛选到了纤维二糖酶相关基因。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，均应认为包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种树干毕赤酵母大片段DNA基因组文库的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）基因组DNA的提取：

提取保藏号为ATCC NO:58376的树干毕赤酵母基因组DNA;

（2）重组载体的构建：

将步骤（1）所得基因组DNA以及酿酒酵母表达载体YEpLac181分别用限制性内切酶Sau3AⅠ和BamHⅠ于37℃进行酶切，回收酶切后的目的基因片段并连接，得到重组载体；所述限制性内切酶Sau3AⅠ的酶切为采用微量稀释法对所述基因组DNA进行部分酶切，所述Sau3AⅠ的稀释倍数为50~150倍，酶切时间为4~8 h；

（3）阳性克隆的筛选：

将步骤（2）所得重组载体转化大肠杆菌感受态细胞，采用蓝白斑筛选法筛选出阳性克隆并计算出阳性克隆子数；

（4）阳性克隆的酶切鉴定及文库的保存：

随机挑取步骤（3）所得阳性克隆进行扩大培养，提取质粒，用限制性内切酶BamHⅠ进行单酶切鉴定；经鉴定正确后，挑取步骤（3）所得全部阳性克隆混合培养，于-70℃保藏，即构建得到树干毕赤酵母大片段DNA基因组文库。

2.根据权利要求1所述树干毕赤酵母大片段DNA基因组文库的构建方法，其特征在于：步骤（2）所述限制性内切酶Sau3AⅠ的稀释倍数为100倍，酶切反应时间为6h。

3.根据权利要求1所述树干毕赤酵母大片段DNA基因组文库的构建方法，其特征在于：步骤（3）所述大肠杆菌感受态细胞为E.coli JM109。

4.权利要求1~3任一项所述树干毕赤酵母大片段DNA基因组文库的构建方法所构建的基因组文库在筛选未知的功能基因上的应用。

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