CN101550605A - 一种基于体内同源重组构建酵母整合型基因突变文库的方法 - Google Patents

Abstract

一种基于体内同源重组构建酵母整合型基因突变文库的方法，属于蛋白质工程，分子生物学技术，基因工程领域。本发明方法为：构建目标基因的重组表达质粒；以此为模板，设计长引物片段，易错PCR扩增得到两端带有表达载体20～70bp同源序列的突变基因；分别对表达载体的与突变基因两端同源区域以及与基因组同源区域进行酶切线性化；将易错PCR扩增产物与线性化后的表达载体以一定的摩尔比混合电转化酵母，通过同源重组，外源突变目标基因整合入酵母基因组，获得基因突变文库。本方法效率高，操作方便，建库周期由1～2周缩短为3天，建库不需要任何亚克隆步骤，降低了突变基因容量与丰度的损失，具有通用性，可用于各种能在酵母中表达的目标基因。

Description

一种基于体内同源重组构建酵母整合型基因突变文库的方法

技术领域

一种基于体内同源重组构建酵母整合型基因突变文库的方法，涉及一种通过同源重组构建基因突变文库的方法。属于蛋白质工程，分子生物学技术，基因工程领域。

背景技术

酶的体外定向进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。

酵母是表达外源基因的最重要的表达系统之一。酵母作为单细胞生物，在生产和操作上具有细菌表达系统易于大规模扩增的特点，又具有真核细胞对蛋白质的翻译后加工及修饰的作用。酵母表达系统的表达载体主要分为两种，即整合型载体和附加型载体。整合型载体不含自主复制序列，转化入酵母后整合到酵母宿主菌的染色体上，具有稳定性好的优点，尤其适合于工业化生产。而附加型载体能够在酵母体内自主复制，达到较高的拷贝数，但是在非选择条件下多不稳定。

易错PCR是在体外随机引入基因突变的一种基本方法，其原理是在PCR过程中加入高浓度的Mg²⁺和Mn²⁺，利用不平衡的dNTP(脱氧核苷三磷酸)，以提高Taq酶在PCR扩增过程中随机引入突变的概率(Kammann et al.，NucleicAcids Res.1989，17(13)：5404)。传统易错PCR构建酵母外源基因整合型突变文库的步骤一般包括：以目的基因作为模板进行易错PCR，得到含有随机突变的扩增片段；用限制性内切酶对扩增片段和表达载体进行处理；用DNA连接酶将二者连接；将重组表达载体导入大肠杆菌；培养大肠杆菌，大量扩增表达质粒；提取质粒进行酶切线性化；转化酵母，最终获得带有各种不同突变基因的重组细胞，即基因突变文库。这个过程步骤繁琐、效率低、耗时耗力，极大的损失了突变基因的容量，而基因突变文库需要从成千上万个转化子中才能筛选到目的转化子，因此传统方法不能满足构建酵母整合型基因突变文库的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速高效的基于体内同源重组构建酵母整合型基因突变文库的方法。

本发明的技术方案：一种构建酵母整合型基因突变文库的方法，基于体内同源重组，其步骤为：

(1)将需要突变的目标基因克隆到表达载体的多克隆位点中构建成重组表达质粒，并将重组表达质粒导入酵母进行整合性表达；

(2)以重组表达质粒为模板，使用长引物进行易错PCR扩增得到上下游与表达载体有20～70bp同源序列的突变基因；

(3)对表达载体的两个区域：①与突变基因两端同源区域，②与酵母基因组同源区域，进行酶切线性化；

(4)将线性化表达载体按照一定的比例与易错PCR扩增产物混合，将混合物电转化酵母，由于易错PCR扩增产物两端与线性化后的表达载体两端具有同源区域，两端同源重组形成线型产物；由于线型产物两端具有与酵母基因组同源区域，根据同源区域的末端不同，外源目标基因片段插入或者双交换整合入酵母基因组中，涂布酵母筛选平板，获得基因突变文库。

步骤(1)中所述的表达载体为整合型载体pPIC9K、pPIC3.5K、pPIC9、pPIC3.5、或pAO815。

构建基因突变文库的优选酵母宿主菌为巴斯德毕赤酵母GS115或巴斯德毕赤酵母KM71。

本发明的原理如图1所示，以宿主菌巴斯德毕赤酵母GS115、整合型表达载体pPIC9K为例，外源基因用gene表示。

(1)以重组表达质粒pPIC9K-gene为模板，易错PCR扩增得到上下游与表达载体有20～70bp同源区段a和b的突变基因；

(2)对表达载体pPIC9K酶切线性化：分为两步，一是酶切表达载体的需插入外源片段处的酶切位点，二是酶切整合入酵母基因组的同源区段；

(3)将两者混合共转化毕赤酵母GS115，在毕赤酵母体内发生两种同源重组事件：如图1a所示为双交换同源重组，当酶切整合入酵母基因组的同源区段时，产生两个不同区域的交换末端，则外源基因片段替换部分酵母基因组片段；如图1b所示为插入型同源重组，当酶切整合入酵母基因组的同源区段时，产生同一区域的两个交换末端，则外源基因片段在此处插入酵母基因组。

(4)根据同源重组入酵母基因组的筛选标记来筛选重组酵母。

本发明的有效益果：

(1)该方法效率高，操作方便：在构建得到重组表达质粒的基础上，整个建库步骤只需要一次易错PCR、载体酶切和电转化过程，省略了传统构建过程中连接、突变质粒构建、转化大肠杆菌、提取质粒等繁琐而且耗时的工作，将建库周期由1～2周缩短为3天。

(2)利用该方法构建酵母基因突变文库不需要任何亚克隆步骤，降低了亚克隆步骤带来的突变基因容量与丰度的损失。

(3)材料与方法具有通用性：该方法可用于各种可以在酵母中获得表达的目标基因。

附图说明

图1a.双交换型同源重组示意图。

图1b.插入型同源重组示意图。

图中标记说明：

5’_PAOX1醇氧化酶AOX1的启动子

ColE1   复制起点

Amp     大肠杆菌筛选标记

3’AOX1 醇氧化酶AOX1的3’端序列

NotI、AvrII、SacI、BglII：限制性酶切位点

TT      终止子

a、b：  同源区段

gene：  外源基因

图2.具体实施方式中的华根霉脂肪酶基因易错PCR扩增电泳图。

泳道1，2，3，4：易错PCR产物；M：DNA Ladder Marker

图3.基因突变库中重组酵母表达脂肪酶的活力，阳性对照为未经突变的阳性重组子的发酵上清活力，1～8为突变库中挑取的突变重组子的发酵上清活力。

图4.酵母发酵上清液SDS-PAGE检测图谱。

Lane 1：蛋白分子量标准；lane 2：建立的突变库中随机挑取的一株突变重组子的发酵上清液。

具体实施方式

实施例1

下面通过构建华根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶基因突变文库的例子来具体描述本发明方法，构建步骤参考原理示意图1。

菌株与试剂：华根霉(Rhizopus chinensis CCTCC M 201021)由江南大学保存。毕赤酵母Pichia pastoris GS115和表达载体pPIC9K购自Invitrogen公司。

华根霉发酵培养基(g/L)：葡萄糖10，豆饼粉40，蛋白胨60，CaCl₂ 6，ZnSO₄ 1.5，橄榄油20，pH 5.5。

酵母培养基YPD、MD、MM、BMGY、BMMY、YPD-G418按《Invitrogen公司操作手册》(Carlsbad C A，Multi-copy Pichia Expression Kit，VersionE，.Invitrogen，1999)方法配制。

YPD-rho平板：YPD培养基中添加100g/L橄榄油和0.5g/L罗丹明B。

未特别说明，则试剂均购自TaKaRa公司。

1.以华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M 201021为模版，PCR扩增华根霉脂肪酶基因proRCL(Genbank登录号：EF405962)，插入毕赤酵母整合型表达载体pPIC9K构建酵母整合型表达质粒pPIC9K-proRCL，并电转化酵母获得分泌表达，具体方法参见Yu等(Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic 2009，57：304-311)。

2.以质粒pPIC9K-proRCL为模版，设计长引物，上游引物与pPIC9K有66bp重叠，下游引物与pPIC9K有60bp重叠，如下：

ProF：5’-GCTGCTAAAG AAGAAGGGGT ATCTCTCGAG AAAAGAGAGGCTGAAGCTTA CGTAGAATTC CCTAGG-3’(斜体表示Avr II酶切位点)

ProR：5’-GTAAGTGCCC AACTTGAACT GAGGAACAGT CATGTCTAAGGCGAATTAAT TCGCGGCCGC-3’(斜体表示NotI酶切位点)

配制以下易错PCR反应体系(50μL体系)进行扩增：

dCTP(25mmol/L)            2μL

dTTP(25mmol/L)            2μL

dGTP(10mmol/L)            1μL

dATP(10mmol/L)            1μL

ProF(20pmol/μL)          1μL

ProR(20pmol/μL)          1μL

Mg²⁺(25mM)                16μL

Mn²⁺(5mM)                 2.5μL

pPIC9K-proRCL             0.5μL

Taq DNA聚合酶(2.5U)       1μL

10×PCR缓冲液(不含MgCl₂)  5μL

ddH₂O                     17μL

PCR扩增条件：94℃，3min；(94℃1min，60℃1min，72℃2min)×15个循环；72℃延伸10min。结果表明，扩增得到的片段为1.2kbp(图2)。用DNA纯化试剂盒纯化易错PCR扩增产物。

3.表达载体pPIC9K的线性化处理：载体pPIC9K经限制性内切酶Avr II和NotI处理，产生的大片段具有与易错PCR产物同源的两个末端，再将此大片段用限制性内切酶BglII处理，再产生与毕赤酵母基因组同源的两个末端，一个是醇氧化酶启动子P_AOX1片段末端和3’AOX1末端。

4.将线性化的载体与步骤2所述的纯化易错PCR产物按摩尔比1∶5混合后，共同转化毕赤酵母感受态。

5.巴斯德毕赤酵母感受态细胞的制备：

(1)接种GS115单克隆于5mL YPD液体培养基，30℃、250r/min培养过夜；

(2)接种50μL过夜培养物至100mL YPD液体培养基中，30℃、250r/min培养至OD.₆₀₀为1.1～1.3；

(3)收集菌液，4℃、5000r/min离心5min，去上清，用200mL冰预冷的无菌水重悬沉淀；

(4)按步骤(3)离心，用100mL冰预冷的无菌水重悬沉淀；

(5)按步骤(3)离心，用10mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液重悬沉淀；

(6)按步骤(3)离心，用1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液重悬沉淀，80μL分装，即用于转化。

6.巴斯德毕赤酵母的电转化：

(1)质粒线性化：提取pPIC9k、pPIC9K-proRCL质粒，各取5～10μg酶切线性化，酶切体系为10×buffer 5μL，质粒(约20μg)44μL，BglII 10u 1μL，37℃4h，1％琼脂糖凝胶电泳酶切产物，检测酶切是否完全。用2倍体积(100μL)无水乙醇沉淀回收酶切产物；

(2)取10μL(约5μg～10μg)的线性化质粒与80μL的感受态GS115菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电击杯中；

(3)冰上放置5min，电压1500V，电容25μF，电阻200Ω，电击时间为5ms，进行电击；

(4)电击完毕后，立即加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液，混匀；

(5)30℃静置1h，涂布于MD平板上，30℃培养2天。

7.G418抗性筛选重组巴斯德毕赤酵母：

配制G418浓度梯度为0.25mg/mL、0.50mg/mL、0.75mg/mL、1.0mg/mL的YPD-G418抗性平板，将His⁺转化子用灭菌的牙签分别点到不同浓度梯度的YPD-G418抗性平板上，30℃培养2天左右。

8.将YPD-G418抗性平板上的菌落影印到YPD-rho平板，甲醇蒸汽诱导表达重组脂肪酶，菌落周围透明圈大小代表基因突变导致脂肪酶活力的变化，挑取克隆摇瓶发酵培养，并测定活性。

9.摇瓶水平下诱导表达重组脂肪酶如下：

(1)挑选巴斯德毕赤酵母单克隆于装有25mL BMGY培养基的250mL摇瓶中，28℃ 250r/min培养至OD.₆₀₀为2～6；

(2)室温3000g离心5min，收集菌体，用BMMY重悬菌体，使OD.₆₀₀为1.0左右，28℃ 250r/min培养；

(3)每12h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5％；

(4)每隔24h取菌液样品1mL，离心分离样品的上清液，-80℃保存备用。

10.重组脂肪酶活力测定：

(1)原理

脂肪酶水解对硝基苯酚棕榈酸酯产生对硝基苯酚和棕榈酸，对硝基苯酚在水溶液中显黄色，在410nm有最大的光吸收，通过测定对硝基苯酚在410nm处的光吸收，可测得脂肪酶的活力。

(2)脂肪酶活力的测定

(I)底物溶液及其终止液的配制

将溶解有底物30mg对硝基苯酚棕榈酸酯的10mL异丙醇和溶解有207mg脱氧胆酸钠和100mg阿拉伯树胶粉的90mL 0.05mol/L pH值一定的磷酸钾缓冲液混匀备用。

终止液(g/L)：NaOH 40g，EDTA 93.05g。溶液颜色变黄后加入终止液62mL终止其反应。

(II)脂肪酶活力测定体系

在反应体系中加入2.4mL上述底物，加入0.1mL适当稀释的酶液，一定条件下反应(空白用同样稀释的死酶液替代)，在410nm处用空白作为对照测定吸光值A₄₁₀，根据对硝基苯酚标准曲线，由吸光值查出对硝基苯酚的浓度并计算酶活。酶活的定义为：一定反应条件下每分钟产生1μmol对硝基苯酚的酶量为一个脂肪酶水解酶活国际单位。

测定分泌型表达的基因重组巴斯德毕赤酵母发酵液上清，以未突变的脂肪酶基因转化子为阳性对照。

11.挑选的重组酵母表达脂肪酶的活力测定如图3所示，表达产物的SDS-PAGE图如图4所示。

Claims (3)

1、一种构建酵母整合型基因突变文库的方法，其特征是基于体内同源重组，步骤为：

(1)将需要突变的目标基因克隆到表达载体的多克隆位点中构建成重组表达质粒，并将重组表达质粒导入酵母进行整合性表达；

(2)以重组表达质粒为模板，使用长引物进行易错PCR扩增得到上下游与表达载体有20～70bp同源序列的突变基因；

(3)对表达载体的两个区域：①与突变基因两端同源区域，②与酵母基因组同源区域，进行酶切线性化；

(4)将线性化表达载体按照一定的比例与易错PCR扩增产物混合，将混合物电转化酵母，由于易错PCR扩增产物两端与线性化后的表达载体两端具有同源区域，两端同源重组形成线型产物；由于线型产物两端具有与酵母基因组同源区域，根据同源区域的末端不同，外源目标基因片段插入或者双交换整合入酵母基因组中，涂布酵母筛选平板，获得基因突变文库。

2.根据权利要求1所述的构建酵母整合型基因突变文库的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的表达载体为整合型载体pPIC9K、pPIC3.5K、pPIC9、pPIC3.5、或pAO815。

3.根据权利要求1所述的构建酵母整合型基因突变文库的方法，其特征在于，构建基因突变文库的酵母宿主菌为巴斯德毕赤酵母GS115或巴斯德毕赤酵母KM71。

Images