CN112921029A - 一种快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库的方法及其应用 - Google Patents

一种快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库的方法及其应用，可有效解决快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库，实现定向选择所需性质优化酶的问题，方法是，将目的基因构建到毕赤酵母载体pGAPZα系列载体中，构建质粒；进行聚合酶链式反应，得PCR产物，PCR产物加入饱和醋酸钠和乙醇，离心，沉淀室温晾干，再加入无菌去离子水溶解，按照酵母转化法将PCR产物电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布在含博来霉素的YPDS培养基平板上筛选阳性克隆，提取酵母基因组DNA，再对PCR产物进行测序，计算碱基突变率、基因突变率，实现快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库，本发明方法易操作，省时省力，工作效率高，应用面广，经济和社会效益巨大。

Description

一种快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库的方法及其 应用
技术领域
本发明涉及蛋白质工程领域，特别是一种快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库的方法及其应用。
背景技术
蛋白质类的产品在生活生产中有着广泛的应用，以各种酶制剂的应用最为突出，包括洗涤试剂、饲用酶制剂、食品添加剂、科研工具酶、造纸用酶、环保用酶、医疗用酶等等，为了获得性质更加优越、更符合实际应用需求的酶，需要对天然来源的酶进行人工突变来改变酶的热稳定性、pH耐受性、蛋白酶耐受性、单位活力值等特性。突变的方法包括定点设计突变和体外定向进化，易错PCR为一种常用的随机突变技术，属于酶体外定向进化范畴，利用Taq DNA聚合酶不具有3’→5’校对功能的特性，配合适当条件，以很低的几率向目的基因中随机引入突变，构建突变体文库，凭借定向选择的方法选出所需性质的优化酶(蛋白质)。但现有易错PCR随机突变方法构建突变体文库操作复杂，工作效率低，不易定向选择所需性质的优化酶，满足不了蛋白质产品生产的实际需要。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库的方法及其应用，可有效解决快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库，实现定向选择所需性质优化酶的问题。
本发明解决的技术方案是，一种快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库的方法，省去传统DNA易错PCR后质粒的构建与后续质粒处理工作，快速实现含有目的基因突变体的毕赤酵母工程菌株文库的构建，包括以下步骤：
(1)、将目的基因构建到毕赤酵母载体pGAPZα系列载体中(载体购自Invitrogen公司)，构建质粒；
(2)、进行聚合酶链式反应：
采用引物GAP-mF：5'CCTAGGAAATTTTACTCTGCTGGAG 3'
GAP-mR：5'GACGGTAACGGGCGGTGGAAGGAGAG 3'
进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)，以Taq酶作为聚合酶，在反应体系中先加入等量0.2-0.3mM的4种dNTP(脱氧腺苷三磷酸)，为dATP、dCTP、dGTP、dTTP，再补加0-0.6mM的任意一种dNTP以及0-0.5mM的氯化锰(MnCl2)，以步骤(1)构建的质粒为模板进行聚合酶链式反应，方法是：95℃预变性5分钟、95℃变性30秒、52℃退火30秒、72℃延伸5-10分钟，循环30次，72℃反应10分钟，得PCR产物；
(3)、用PCR产物回收试剂盒回收步骤(2)的PCR产物，加入0.1倍体积的饱和醋酸钠(pH5.3)和3倍体积的乙醇，12000转/分钟离心10分钟，弃掉上清液，沉淀加入200μl体积浓度70％乙醇清洗，12000转/分钟离心10分钟，弃掉上清液，沉淀室温晾干，再加入10μl无菌去离子水溶解PCR产物；
(4)、按照酵母转化法(如Invitrogen公司的酵母转化法)，将步骤(3)回收的PCR产物电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布在含100μg/mL博来霉素的YPDS培养基平板上筛选阳性克隆；
所述的YPDS培养基平板是：酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、琼脂20g和1M山梨醇制成，溶解酵母膏、蛋白胨于900mL水中，加入琼脂，加入葡萄糖、1M山梨醇溶解至1L，115℃灭菌15min，即成；
(5)、提取酵母基因组DNA：挑选步骤(4)任意的5-10个阳性克隆，分别转入由0.2M乙酸锂和质量浓度1％十二烷基磺酸钠制成的裂解液100μL中重悬细胞，75℃加热10分钟，加入300μL无水乙醇，混匀，12000转/分钟离心5分钟，除去上清液，沉淀加入400μL体积浓度70％乙醇漂洗沉淀，12000转/分钟离心5分钟，除去上清液，沉淀室温晾干，加入50μL无菌水溶解沉淀，12000转/分钟离心5分钟，以上清液为模板，用引物GAP-F5'GTCCCTATTTCAATCAATTGAA 3'、3’AOX1 5'GCAAATGGCATTCTGACATCC3'和高保真DNA聚合酶进行聚合酶链式反应(PCR)，再对PCR产物进行测序，计算碱基突变率、基因突变率，满足实验需求，根据需要进行突变克隆筛选，实现快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库，突变率的计算公式是：
突变率＝碱基突变总数/(测序克隆数×基因总碱基数)×100％。
本发明方法快速构建的蛋白质突变体毕赤酵母表达文库在定向选择所需性质的优化酶蛋白质中的应用。
本发明目的是提供一种方便快捷的蛋白质突变体毕赤酵母表达文库构建方法，省去了传统DNA易错PCR后质粒的构建与后续质粒处理工作，快速实现含有目的基因突变体的毕赤酵母工程菌株文库的构建，方法易操作，省时省力，工作效率高，应用面广，经济和社会效益巨大。
具体实施方式
以下结合具体情况和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。
实施例1
本发明一种快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库的方法，包括以下步骤：
(1)、将目的基因构建到毕赤酵母载体pGAPZα系列载体中，构建质粒：
以人工合成的费氏弧菌(fecheri)的一个α-半乳糖苷酶基因GalA为目的基因，序列为SEQ1，用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对基因GalA和毕赤酵母组成型表达载体pGAPZαA同时进行双酶切，之后用T4 DNA连接酶将基因GalA连接进载体质粒pGAPZαA中，形成表达质粒pGAPZαA-GalA，用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对质粒进行酶切检测以确保质粒构建成功，看到酶切后，有质粒pGAPZαA的条带和GalA的DNA条带，质粒构建成功；
SEQ1：
TTGGTTAGACCAGGTAACGTTGGTAAGTTGCCAGCTTTGGGTTGGAACTCTTGGAACGCTTTCGGTTGTGATATTGATGCCACCAAGATTATGACTGCCGCTAACGAAGTTGTTAACTTGGGTTTGAAGAACTTGGGTTACGAGTACATCAACATTGATGATTGCTGGTCCGTTAAGTCTGGTAGAGATGCTTCTACTCAAAGAATGGTTCCAGACCCAGAAAAGTTTCCAGATGGCATTTCTGGTTTGGCTGACCAAATTCACGATTTGGGTTTGAAGGTTGGTATTTACTCTTCTGCTGGTTTGACTACTTGTGCTGGTTACCCAGCTTCTTTGGGTTACGAAGATATTGACGCCCAAACTTTTGCTGAATGGGGTATCGATTACTTGAAGTACGACAACTGTGGTGTTCCATCTAACTGGACTGATGCTTACTCTTACTGTGTTCCAGATCCAGGTTCTAAGGCTACTAACGGTACTTGTCCAGATAACAAGAACCCAGCTCCAGCTGGTTACGATTGGAGAACTTCTTTGACTGCTGAGAGATACAGAAGAATGAGAGATGCTTTGGTTTCTGTCGACAGAACCATTTTGTACTCTTTGTGCAACTGGGGTCAAGCTGATGTTAACAACTGGGGTAACGAAACTGGTAACTCTTGGAGAACTACCGGTGATATTACTCCATCTTGGCCAAGAATTGCTGCTATTGCTAACGAAAACTCCTTCTTGATGAACTACGTCGACTTTTGGGGTTACCCAGATCCAGATATGTTGGAAGTTGGTAACGGTAACTTGACTTTGGCTGAAAACCGTGCTCATTTTGCTTTGTGGGCTGCTATGAAGTCTCCATTGATTATTGGTACTGCCTTGGATTCCATTTCCCAAGACCATTTGGCTATTTTGTCCAACAAAATCTTGTTGAAGTTCCACCAAGATCCAGTTGTTGGTAGACCAGCTCATCCATACAAGTGGGGTTACAACCCAGATTGGACTTTTGATCCAGCTCATCCAGCTGAATACTGGTCTGGTGTTTCTTCTGCTTTGGGTGGTACTTTGGTTTTGATGTTGAACTCTGAAGACACCAAGCAAAGAAGAACTGCTGTCTGGAAGGAAATTCCAGAGTTGAAGGATGTTTTGGGTAGACAAGGTAAAAGACGTACTGGTTTTAGAGTTACCGATGTTTGGACTGGTAAGGATTTGGGTTGTGTCAGAGATCATTACTCTGTCGAATTGGAGTCTCATGATGTTGCTGCTTTGGTTGTTGGTAGAGCTTGT
(2)、进行聚合酶链式反应：
采用引物GAP-mF：5'CCTAGGAAATTTTACTCTGCTGGAG 3'
GAP-mR：5'GACGGTAACGGGCGGTGGAAGGAGAG 3'
进行聚合酶链式反应，以Taq酶作为聚合酶，在反应体系中先加入等量0.25mM的4种dNTP，为dATP、dCTP、dGTP、dTTP，再补加0.5mM的dGTP，以pGAPZαA-GalA为模板进行易错聚合酶链式反应(PCR)，方法是：95℃预变性5分钟、95℃变性30秒、52℃退火30秒、72℃延伸5-10分钟，循环30次，72℃反应10分钟，得PCR产物，在PCR产物中有明显的pGAPZαA-GalA条带；
(3)、用PCR产物回收试剂盒回收步骤(2)的PCR产物，加入0.1倍体积的饱和醋酸钠(pH5.3)和3倍体积的乙醇，12000转/分钟离心10分钟，弃掉上清液，沉淀加入200μl体积浓度70％乙醇清洗，12000转/分钟离心10分钟，弃掉上清液，沉淀室温晾干，再加入10μl无菌去离子水溶解PCR产物，取1μl用微量核酸测定仪Nanodrop测定溶液中DNA浓度为1.4μg/μl；
(4)、按照酵母转化法(如Invitrogen公司的酵母转化法)，将步骤(3)回收的PCR产物9μl电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布在含100μg/mL博来霉素的YPDS培养基平板上筛选1889个阳性克隆；
(5)、提取酵母基因组DNA：挑选步骤(4)任意的5个阳性克隆，分别转入由0.2M乙酸锂和质量浓度1％十二烷基磺酸钠制成的裂解液100μL中重悬细胞，75℃加热10分钟，加入300μL无水乙醇，混匀，12000转/分钟离心5分钟，除去上清液，沉淀加入400μL体积浓度70％乙醇漂洗沉淀，12000转/分钟离心5分钟，除去上清液，沉淀室温晾干，加入50μL无菌水溶解沉淀，12000转/分钟离心5分钟，以上清液为模板，用引物GAP-F5'GTCCCTATTTCAATCAATTGAA3'、3’AOX1 5'GCAAATGGCATTCTGACATCC3'和高保真DNA聚合酶进行聚合酶链式反应(PCR)，看到分子量正确的特异性PCR条带，GalA已经成功重组进酵母基因组中，再对PCR产物进行测序，基因突变见下表：
克隆编号 碱基突变 相应氨基酸突变
1 T869C L290S
2 T36C、T600C、T1254C A12A、S200S、A418A(均为同义突变)
3 G1274A C425Y
4 A563G D188G
5 无突变 无突变
计算碱基突变率为0.094％。
实施例2
本发明一种快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库的方法，包括以下步骤：
(1)、将目的基因构建到毕赤酵母载体pGAPZα系列载体中，构建质粒：
以人工合成的费氏弧菌(fecheri)的一个α-半乳糖苷酶基因GalB为目的基因，序列为SEQ2，用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对基因GalB和毕赤酵母组成型表达载体pGAPZαA同时进行双酶切，之后用T4 DNA连接酶将基因GalB连接进载体pGAPZαA中，形成表达质粒pGAPZαA-GalB，用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对质粒进行酶切检测以确保质粒构建成功，看到酶切后，有质粒pGAPZαA的条带和GalB的DNA条带，质粒构建成功；
SEQ2：
TTGAACAACGGTTTGGCTAGAACTCCACAAATGGGTTGGAACACTTGGAACTCTTTCGCTTGTGAATTGAACGAAACCGTCATTTTGAACGCTGCTGAGCGTATTGTTTCTTTGGGTTTCAGAGATTTGGGTTACGAATACGTTGTCTTGGATGATTGTTGGTCTGCTGGTAGAAACTCTTCTGGTTACTTGATTGCCGATTCTGAGAAGTTTCCAAACGGTATTGCTCATTTGGCTGACAAGGTTCATGAATTGGGTTTGAAGATCGGTATCTACTCTTCTGCTGGTACTTGGACTTGTGCTAGATACGAAGGTTCTTTGGGTTACGAAGAAAAGGATGCTGCTTTGTGGGCTTCTTGGGGTATTGATTACTTGAAGTACGACAACTGTTACAACGAAGGTGAAGAAGGTACTCCAAAGTTGTCTTTCGATAGATACAACGCCATGTTTAAGGCTTTGAACGCTACTGGTAGACCAATGTTGTACTCTTTGTGTAACTGGGGTGTTGATGGTCCATGGAACTTTGCTCCAACTATTGCTAACTCTTGGAGAACTGCTGGTGATTTGTCTAACGTTTGGGACAGAGATGATGTTAACTGTCCCTGTTCTGAATTGGAAGGCTTGGATTGTAAGACTCCAGGTTACAAGTGTTCTATCATGAACGTCTTGAACAAGGCTGTTTACTACCCATCTAAGGCTATTCCAGGTGCTTGGAACGATTTGGATATGTTGCAAGTTGGTAACGGTGGTTTGACTGATGATGAGTCCATTGCTCATATGTCTTTGTGGGCTGCTTTGAAGTCTCCATTGTTGATGACTAACGTCATGACCAAGATTGATCCACCAACCTTGTCTATTTTGCAGAACCCAGCTGTTTTGGCTGTTTCTCAAGATCCAGTTGCTTCTACTCCAGTTAGACAATGGCGTTACTTTGTTGATGACGTCGATGAAAACGGTAAGGGTGAGATTCAAATGTACTCCGGTCCATTGTCTGGTGGTGATCAATTGGTTTTGTTGTTGAACGCTGGTTCTAAGGCTAGAGAAATGAACGCTACTTTGGTCGACATTTTTTGGGAATCTGGTCCAAAGGGTACTGCTAAGCAAGTTAAGCAACATTGGGACGTTTACGATTTGTGGGCTAACAGAATGTCTAACGAAGATGCTGCCGCTATTATTAACGGTACCTTCACTGGTCCATCTCCATACAACTTGACTGCTATGGGTGGTGCTCATGAAGTTTACTCTAGACCATTGCCATCTAACTCTAAGGTTTTGATGGGTTCTAAGGTTGGTTCTGTTCAACCATCTGGTACTGTTACTGCTCATGTTAGACCACATGGTATTGCTATGTTGAGATTGAGAGCTACCGATAAGAAGGATGAGTTGTAG
(2)、进行聚合酶链式反应：
采用引物GAP-mF：5'CCTAGGAAATTTTACTCTGCTGGAG 3'
GAP-mR：5'GACGGTAACGGGCGGTGGAAGGAGAG 3'
进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)，以Taq酶作为聚合酶，在反应体系中先加入等量0.3mM的4种dNTP，为dATP、dCTP、dGTP、dTTP，再补加0.5mM的任意一种dGTP，以pGAPZαA-GalB为模板进行聚合酶链式反应，方法是：95℃预变性5分钟、95℃变性30秒、52℃退火30秒、72℃延伸5-10分钟，循环30次，72℃反应10分钟，得PCR产物，PCR产物中有明显的pGAPZαA-GalB条带；
(3)、用PCR产物回收试剂盒回收步骤(2)的PCR产物，加入0.1倍体积的饱和醋酸钠(pH5.3)和3倍体积的乙醇，12000转/分钟离心10分钟，弃掉上清液，沉淀加入200μl体积浓度70％乙醇清洗，12000转/分钟离心10分钟，弃掉上清液，沉淀室温晾干，再加入10μl无菌去离子水溶解PCR产物，取1μl用微量核酸测定仪Nanodrop仪器测定溶液中DNA浓度为1.2μg/μl；
(4)、按照酵母转化法(如Invitrogen公司的酵母转化法)，将步骤(3)回收的PCR产物电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布在含100μg/mL博来霉素的YPDS培养基平板上筛选1399个阳性克隆；
(5)、提取酵母基因组DNA：挑选步骤(4)任意的5个阳性克隆，分别转入由0.2M乙酸锂和质量浓度1％十二烷基磺酸钠制成的裂解液100μL中重悬细胞，75℃加热10分钟，加入300μL无水乙醇，混匀，12000转/分钟离心5分钟，除去上清液，沉淀加入400μL体积浓度70％乙醇漂洗沉淀，12000转/分钟离心5分钟，除去上清液，沉淀室温晾干，加入50μL无菌水溶解沉淀，12000转/分钟离心5分钟，以上清液为模板，用引物GAP-F5'GTCCCTATTTCAATCAATTGAA3'、3’AOX1 5'GCAAATGGCATTCTGACATCC3'和高保真DNA聚合酶进行聚合酶链式反应(PCR)，看到分子量正确的特异性PCR条带，GalA已经成功重组进酵母基因组中，再对PCR产物进行测序，基因突变见下表：
克隆编号 碱基突变 相应氨基酸突变
1 T1227C、A1268G G409G(同义突变)、K423R
2 T349C F117R
3 无突变 无突变
4 A385G N129D
5 A445G M149V
计算碱基突变率为0.072％。
实施例3
本发明一种快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库的方法，包括以下步骤：
(1)、将目的基因构建到毕赤酵母载体pGAPZα系列载体中，构建质粒；
以人工合成的黑曲霉(Aspergillus niger)的一个葡萄糖氧化酶基因GOD为目的基因，序列为SEQ3，用DNA限制性内切酶KpnⅠ/NotⅠ对基因GalB和毕赤酵母组成型表达载体pGAPZαA同时进行双酶切，之后用T4 DNA连接酶将基因GOD连接进载体pGAPZαA中，形成表达质粒pGAPZαA-GOD，用DNA限制性内切酶KpnⅠ/NotⅠ对质粒进行酶切检测以确保质粒构建成功，看到酶切后有质粒pGAPZαA的条带和GOD的DNA条带，质粒构建成功；
SEQ3：
AGCAATGGCATTGAAGCCAGCCTCCTGACTGATCCCAAGGATGTCTCCGGCCGCACGGTCGACTACATCATCGCTGGTGGAGGTCTGACTGGACTCACCACCGCTGCTCGTCTGACGGAGAACCCCAACATCAGTGTGCTCGTCATCGAAAGTGGCTCCTACGAGTCGGACAGAGGTCCTATCATTGAGGACCTGAACGCCTACGGCGACATCTTTGGCAGCAGTGTAGACCACGCCTACGAGACCGTGGAGCTCGCTACCAACAATCAAACCGCGCTGATCCGCTCCGGAAATGGTCTCGGTGGCTCTACTCTAGTGAATGGTGGCACCTGGACTCGCCCCCACAAGGCACAGGTTGACTCTTGGGAGACTGTCTTTGGAAATGAGGGCTGGAACTGGGACAATGTGGCCGCCTACTCCCTCCAGGCTGAGCGTGCTCGCGCACCAAATGCCAAACAGATCGCTGCTGGCCACTACTTCAACGCATCCTGCCATGGTGTTAATGGTACTGTCCATGCCGGACCCCGCGACACCGGCGATGACTATTCTCCCATCGTCAAGGCTCTCATGAGCGCTGTCGAAGACCGGGGCGTTCCCACCAAGAAAGACTTCGGATGCGGTGACCCCCATGGTGTGTCCATGTTCCCCAACACCTTGCACGAAGACCAAGTGCGCTCCGATGCCGCTCGCGAATGGCTACTTCCCAACTACCAACGTCCCAACCTGCAAGTCCTGACCGGACAGTATGTTGGTAAGGTGCTCCTTAGCCAGAACGGCACCACCCCTCGTGCCGTTGGCGTGGAATTCGGCACCCACAAGGGCAACACCCACAACGTTTACGCTAAGCACGAGGTCCTCCTGGCCGCGGGCTCCGCTGTCTCTCCCACAATCCTCGAATATTCCGGTATCGGAATGAAGTCCATCCTGGAGCCCCTTGGTATCGACACCGTCGTTGACCTGCCCGTCGGCTTGAACCTGCAGGACCAGACCACCGCTACCGTCCGCTCCCGCATCACCTCTGCTGGTGCAGGACAGGGACAGGCCGCTTGGTTCGCCACCTTCAACGAGACCTTTGGTGACTATTCCGAAAAGGCACACGAGCTGCTCAACACCAAGCTGGAGCAGTGGGCCGAAGAGGCCGTCGCCCGTGGCGGATTCCACAACACCACCGCCTTGCTCATCCAGTACGAGAACTACCGCGACTGGATTGTCAACCACAACGTCGCGTACTCGGAACTCTTCCTCGACACTGCCGGAGTAGCCAGCTTCGATGTGTGGGACCTTCTGCCCTTCACCCGAGGATACGTTCACATCCTCGACAAGGACCCCTACCTTCACCACTTCGCCTACGACCCTCAGTACTTCCTCAACGAGCTGGACCTGCTCGGTCAGGCTGCCGCTACTCAACTGGCCCGCAACATCTCCAACTCCGGTGCCATGCAGACCTACTTCGCTGGGGAGACTATCCCCGGTGATAACCTCGCGTATGATGCCGATTTGAGCGCCTGGACTGAGTACATCCCGTACCACTTCCGTCCTAACTACCATGGCGTGGGTACTTGCTCCATGATGCCGAAGGAGATGGGCGGTGTTGTTGATAATGCTGCCCGTGTGTATGGTGTGCAGGGACTGCGTGTCATTGATGGTTCTATTCCTCCTACGCAAATGTCGTCCCATGTCATGACGGTGTTCTATGCCATGGCGCTAAAAATTTCGGATGCTATCTTGGAAGATTATGCTTCCATGCAGTGA
(2)、进行聚合酶链式反应：
采用引物GAP-mF：5'CCTAGGAAATTTTACTCTGCTGGAG 3'
GAP-mR：5'GACGGTAACGGGCGGTGGAAGGAGAG 3'
以pGAPZαA-GOD为模板，进行3个聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)，第一个以Taq酶作为聚合酶，在反应体系中先加入等量0.25mM的4种dNTP，4种dNTP为dATP、dCTP、dGTP、dTTP，再添加0.2mM的MnCl2；第二个以Taq酶作为聚合酶，在反应体系中先加入等量0.25mM的4种dNTP，4种dNTP为dATP、dCTP、dGTP、dTTP，再添加0.15mM的MnCl2和0.5mM的dGTP；第三个以Taq酶作为聚合酶，在反应体系中先加入等量0.25mM的4种dNTP，4种dNTP为dATP、dCTP、dGTP、dTTP，再添加0.25mM的MnCl2和0.5mM的dGTP；以构建的质粒pGAPZαA-GOD为模板进行3个聚合酶链式反应的程序是，95℃预变性5分钟、95℃变性30秒、52℃退火30秒、72℃延伸5-10分钟，循环30次，72℃反应10分钟，得PCR产物，有明显的pGAPZαA-GOD条带；
(3)、用PCR产物回收试剂盒分别回收步骤(2)3个反应的PCR产物，分别加入其0.1倍体积的饱和醋酸钠和3倍体积的乙醇，12000转/分钟离心10分钟，弃掉上清液，沉淀加入200μl体积浓度70％乙醇清洗，12000转/分钟离心10分钟，弃掉上清液，沉淀室温晾干，再加入10μl无菌去离子水溶解PCR产物，取1μl用Nanodrop仪器测定溶液中DNA浓度，第1个反应为0.97μg/μl，第2个反应为0.80μg/μl，第3个反应为0.76μg/μl；
(4)、按照酵母转化法，将3个反应中各自的PCR产物9μl电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布在含100μg/mL博来霉素的YPDS培养基平板上，30℃倒置培养3天，计克隆数，第1个反应为242个，第2个反应为269个，第3个反应为244个；
(5)、提取酵母基因组DNA：在3个平板上任意挑选5个阳性克隆，分别转入由0.2M乙酸锂和质量浓度1％十二烷基磺酸钠制成的裂解液100μL中重悬细胞，75℃加热10分钟，加入300μL无水乙醇，混匀，12000转/分钟离心5分钟，除去上清液，沉淀加入400μL体积浓度70％乙醇漂洗沉淀，12000转/分钟离心5分钟，除去上清液，沉淀室温晾干，加入50μL无菌水溶解沉淀，12000转/分钟离心5分钟，以上清液为模板，用引物GAP-F5'GTCCCTATTTCAATCAATTGAA 3'、3’AOX1 5'GCAAATGGCATTCTGACATCC3'和高保真DNA聚合酶进行聚合酶链式反应，再对PCR产物进行测序，计算碱基突变率，第1个反应碱基突变率为0.137％，第2个反应碱基突变率为0.342％，第3个反应碱基突变率为0.342％，基因突变结果如下表：
Figure BDA0002984244710000081
Figure BDA0002984244710000091
实施例4
本发明一种快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库的方法，包括以下步骤：
(1)、将目的基因构建到毕赤酵母载体pGAPZα系列载体中，构建质粒：
以人工合成的黑曲霉(Aspergillus niger)的一个β-甘露聚糖酶基因ManA为目的基因，序列为SEQ4，用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对基因GalB和毕赤酵母组成型表达载体pGAPZαA同时进行双酶切，之后用T4 DNA连接酶将基因ManA连接进载体pGAPZαA中，形成表达质粒pGAPZαA-ManA，用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对质粒进行酶切检测以确保质粒构建成功，看到酶切后有质粒pGAPZαA的条带和ManA的DNA条带，质粒构建成功；
SEQ4：
TCTTTCGCTTCTACTTCTGGTTTGCAATTTACTATTGACGGTGAGACTGGTTACTTTGCCGGTACTAACTCTTACTGGATTGGATTTTTGACTGACAACGCCGATGTTGATTTGGTCATGGGTCATTTGAAGTCTTCTGGTTTGAAGATTTTGCGTGTCTGGGGTTTTAACGATGTTACTTCTCAACCATCTTCTGGCACTGTTTGGTACCAATTGCATCAAGATGGTAAGTCTACTATTAACACCGGTGCTGATGGTTTGCAAAGATTGGATTACGTTGTTTCTTCTGCCGAACAACATGATATTAAGTTGATCATCAACTTCGTTAACTACTGGACCGATTACGGTGGTATGTCTGCTTACGTTTCTGCTTACGGTGGTTCTGGTGAAACTGATTTTTACACTTCTGATACCATGCAGTCTGCCTACCAAACTTACATTAAGACTGTCGTTGAACGCTACTCTAACTCTTCTGCTGTTTTTGCTTGGGAATTGGCTAACGAACCAAGATGTCCATCTTGTGATACTTCTGTTTTGTACAACTGGATTGAGAAGACTTCTAAGTTTATCAAGGGTTTGGACGCTGACAGAATGGTTTGTATTGGTGATGAAGGTTTTGGTTTGAACATTGACTCTGACGGTTCTTACCCATACCAATTTTCTGAAGGTTTGAACTTTACTATGAACTTGGGTATTGACACCATCGACTTCGGTACCTTGCACTTGTACCCAGATTCTTGGGGTACTTCTGATGATTGGGGTAACGGTTGGATTACTGCTCATGGTGCTGCTTGTAAGGCTGCTGGTAAGCCATGTTTGTTGGAAGAATACGGTGTTACTTCTAACCATTGTTCTGTTGAAGGTTCTTGGCAAAAGACTGCTTTGTCTACTACTGGTGTTGGTGCTGATTTGTTTTGGCAATACGGTGATGATTTGTCTACTGGTAAGTCTCCAGATGATGGTAACACTATTTACTACGGTACTTCTGATTACCAGTGCTTGGTTACTGATCATGTTGCTGCTATTGGTTCTGCT
(2)、进行聚合酶链式反应：
采用引物GAP-mF：5'CCTAGGAAATTTTACTCTGCTGGAG 3'
GAP-mR：5'GACGGTAACGGGCGGTGGAAGGAGAG 3'
以pGAPZαA-ManA为模板，进行2个聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)，第一个以Taq酶作为聚合酶，在反应体系中先加入等量0.25mM的4种dNTP，4种dNTP为dATP、dCTP、dGTP、dTTP，再添加0.1mM的MnCl2；第二个以Taq酶作为聚合酶，在反应体系中先加入等量0.25mM的4种dNTP，4种dNTP为dATP、dCTP、dGTP、dTTP，再添加0.1mM的MnCl2和0.5mM的dGTP；以构建的质粒pGAPZαA-ManA为模板进行2个聚合酶链式反应的程序是，95℃预变性5分钟、95℃变性30秒、52℃退火30秒、72℃延伸5-10分钟，循环30次，72℃反应10分钟，得PCR产物，有明显的pGAPZαA-ManA条带；
(3)、用PCR产物回收试剂盒分别回收步骤(2)的PCR产物，分别加入其0.1倍体积的饱和醋酸钠和3倍体积的乙醇，12000转/分钟离心10分钟，弃掉上清液，沉淀加入200μl体积浓度70％乙醇清洗，12000转/分钟离心10分钟，弃掉上清液，沉淀室温晾干，再加入10μl无菌去离子水溶解PCR产物，取1μl用Nanodrop仪器测定溶液中DNA浓度，第1个反应为1.07μg/μl，第2个反应为0.46μg/μl；
(4)、按照酵母转化法，将步骤(3)回收的PCR产物9μl电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布在含100μg/mL博来霉素的YPDS培养基平板上，30℃倒置培养3天后，计克隆数，第1个反应为1230个，第2个反应为236个；
(5)、提取酵母基因组DNA：在2个转化平板上分别随意挑选5个克隆，分别转入由0.2M乙酸锂和质量浓度1％十二烷基磺酸钠制成的裂解液100μL中重悬细胞，75℃加热10分钟，加入300μL无水乙醇，混匀，12000转/分钟离心5分钟，除去上清液，沉淀加入400μL体积浓度70％乙醇漂洗沉淀，12000转/分钟离心5分钟，除去上清液，沉淀室温晾干，加入50μL无菌水溶解沉淀，12000转/分钟离心5分钟，以上清液为模板，用引物GAP-F5'GTCCCTATTTCAATCAATTGAA 3'、3’AOX1 5'GCAAATGGCATTCTGACATCC3'和高保真DNA聚合酶进行聚合酶链式反应，再对PCR产物进行测序，看到分子量正确的特异性PCR条带，ManA已经成功重组进酵母基因组中，再对PCR产物进行测序，计算碱基突变率，第1个反应突变率为0.039％，第2个反应为0.116％，基因突变结果如下表：
Figure BDA0002984244710000111
以上清楚表明，构建不同酶(蛋白质)突变体毕赤酵母表达文库的实施例(应用实例)结果可以看到，本发明方法方便快捷，可对含有野生型基因的质粒直接进行易错PCR后转化毕赤酵母，省略了传统方法中对野生型基因进行易错PCR后再进行载体构建、扩增、提取以及线性化的过程，省时省力，效率提高50％以上；通过改变易错PCR反应体系中的dGTP浓度和MnCl2浓度可以获得突变率在0.039％-0.342％的蛋白质突变体文库，满足实际的突变需求，如果需要获得更多的突变克隆，只需进行多个重复即可，非常方便、灵活、快捷，可广泛应用于蛋白质类的产品，选取所需性质的优化酶(蛋白质)，蛋白质产品优化酶中的应用及在生产蛋白质产品中的应用，有巨大的经济和社会效益。
序列表
<110> 河南省科学院生物研究所有限责任公司；河南省科学院
<120> 一种快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库的方法及其应用
<130> 2021
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1275
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ttggttagac caggtaacgt tggtaagttg ccagctttgg gttggaactc ttggaacgct 60
ttcggttgtg atattgatgc caccaagatt atgactgccg ctaacgaagt tgttaacttg 120
ggtttgaaga acttgggtta cgagtacatc aacattgatg attgctggtc cgttaagtct 180
ggtagagatg cttctactca aagaatggtt ccagacccag aaaagtttcc agatggcatt 240
tctggtttgg ctgaccaaat tcacgatttg ggtttgaagg ttggtattta ctcttctgct 300
ggtttgacta cttgtgctgg ttacccagct tctttgggtt acgaagatat tgacgcccaa 360
acttttgctg aatggggtat cgattacttg aagtacgaca actgtggtgt tccatctaac 420
tggactgatg cttactctta ctgtgttcca gatccaggtt ctaaggctac taacggtact 480
tgtccagata acaagaaccc agctccagct ggttacgatt ggagaacttc tttgactgct 540
gagagataca gaagaatgag agatgctttg gtttctgtcg acagaaccat tttgtactct 600
ttgtgcaact ggggtcaagc tgatgttaac aactggggta acgaaactgg taactcttgg 660
agaactaccg gtgatattac tccatcttgg ccaagaattg ctgctattgc taacgaaaac 720
tccttcttga tgaactacgt cgacttttgg ggttacccag atccagatat gttggaagtt 780
ggtaacggta acttgacttt ggctgaaaac cgtgctcatt ttgctttgtg ggctgctatg 840
aagtctccat tgattattgg tactgccttg gattccattt cccaagacca tttggctatt 900
ttgtccaaca aaatcttgtt gaagttccac caagatccag ttgttggtag accagctcat 960
ccatacaagt ggggttacaa cccagattgg acttttgatc cagctcatcc agctgaatac 1020
tggtctggtg tttcttctgc tttgggtggt actttggttt tgatgttgaa ctctgaagac 1080
accaagcaaa gaagaactgc tgtctggaag gaaattccag agttgaagga tgttttgggt 1140
agacaaggta aaagacgtac tggttttaga gttaccgatg tttggactgg taaggatttg 1200
ggttgtgtca gagatcatta ctctgtcgaa ttggagtctc atgatgttgc tgctttggtt 1260
gttggtagag cttgt 1275
<210> 2
<211> 1389
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
ttgaacaacg gtttggctag aactccacaa atgggttgga acacttggaa ctctttcgct 60
tgtgaattga acgaaaccgt cattttgaac gctgctgagc gtattgtttc tttgggtttc 120
agagatttgg gttacgaata cgttgtcttg gatgattgtt ggtctgctgg tagaaactct 180
tctggttact tgattgccga ttctgagaag tttccaaacg gtattgctca tttggctgac 240
aaggttcatg aattgggttt gaagatcggt atctactctt ctgctggtac ttggacttgt 300
gctagatacg aaggttcttt gggttacgaa gaaaaggatg ctgctttgtg ggcttcttgg 360
ggtattgatt acttgaagta cgacaactgt tacaacgaag gtgaagaagg tactccaaag 420
ttgtctttcg atagatacaa cgccatgttt aaggctttga acgctactgg tagaccaatg 480
ttgtactctt tgtgtaactg gggtgttgat ggtccatgga actttgctcc aactattgct 540
aactcttgga gaactgctgg tgatttgtct aacgtttggg acagagatga tgttaactgt 600
ccctgttctg aattggaagg cttggattgt aagactccag gttacaagtg ttctatcatg 660
aacgtcttga acaaggctgt ttactaccca tctaaggcta ttccaggtgc ttggaacgat 720
ttggatatgt tgcaagttgg taacggtggt ttgactgatg atgagtccat tgctcatatg 780
tctttgtggg ctgctttgaa gtctccattg ttgatgacta acgtcatgac caagattgat 840
ccaccaacct tgtctatttt gcagaaccca gctgttttgg ctgtttctca agatccagtt 900
gcttctactc cagttagaca atggcgttac tttgttgatg acgtcgatga aaacggtaag 960
ggtgagattc aaatgtactc cggtccattg tctggtggtg atcaattggt tttgttgttg 1020
aacgctggtt ctaaggctag agaaatgaac gctactttgg tcgacatttt ttgggaatct 1080
ggtccaaagg gtactgctaa gcaagttaag caacattggg acgtttacga tttgtgggct 1140
aacagaatgt ctaacgaaga tgctgccgct attattaacg gtaccttcac tggtccatct 1200
ccatacaact tgactgctat gggtggtgct catgaagttt actctagacc attgccatct 1260
aactctaagg ttttgatggg ttctaaggtt ggttctgttc aaccatctgg tactgttact 1320
gctcatgtta gaccacatgg tattgctatg ttgagattga gagctaccga taagaaggat 1380
gagttgtag 1389
<210> 3
<211> 1752
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
agcaatggca ttgaagccag cctcctgact gatcccaagg atgtctccgg ccgcacggtc 60
gactacatca tcgctggtgg aggtctgact ggactcacca ccgctgctcg tctgacggag 120
aaccccaaca tcagtgtgct cgtcatcgaa agtggctcct acgagtcgga cagaggtcct 180
atcattgagg acctgaacgc ctacggcgac atctttggca gcagtgtaga ccacgcctac 240
gagaccgtgg agctcgctac caacaatcaa accgcgctga tccgctccgg aaatggtctc 300
ggtggctcta ctctagtgaa tggtggcacc tggactcgcc cccacaaggc acaggttgac 360
tcttgggaga ctgtctttgg aaatgagggc tggaactggg acaatgtggc cgcctactcc 420
ctccaggctg agcgtgctcg cgcaccaaat gccaaacaga tcgctgctgg ccactacttc 480
aacgcatcct gccatggtgt taatggtact gtccatgccg gaccccgcga caccggcgat 540
gactattctc ccatcgtcaa ggctctcatg agcgctgtcg aagaccgggg cgttcccacc 600
aagaaagact tcggatgcgg tgacccccat ggtgtgtcca tgttccccaa caccttgcac 660
gaagaccaag tgcgctccga tgccgctcgc gaatggctac ttcccaacta ccaacgtccc 720
aacctgcaag tcctgaccgg acagtatgtt ggtaaggtgc tccttagcca gaacggcacc 780
acccctcgtg ccgttggcgt ggaattcggc acccacaagg gcaacaccca caacgtttac 840
gctaagcacg aggtcctcct ggccgcgggc tccgctgtct ctcccacaat cctcgaatat 900
tccggtatcg gaatgaagtc catcctggag ccccttggta tcgacaccgt cgttgacctg 960
cccgtcggct tgaacctgca ggaccagacc accgctaccg tccgctcccg catcacctct 1020
gctggtgcag gacagggaca ggccgcttgg ttcgccacct tcaacgagac ctttggtgac 1080
tattccgaaa aggcacacga gctgctcaac accaagctgg agcagtgggc cgaagaggcc 1140
gtcgcccgtg gcggattcca caacaccacc gccttgctca tccagtacga gaactaccgc 1200
gactggattg tcaaccacaa cgtcgcgtac tcggaactct tcctcgacac tgccggagta 1260
gccagcttcg atgtgtggga ccttctgccc ttcacccgag gatacgttca catcctcgac 1320
aaggacccct accttcacca cttcgcctac gaccctcagt acttcctcaa cgagctggac 1380
ctgctcggtc aggctgccgc tactcaactg gcccgcaaca tctccaactc cggtgccatg 1440
cagacctact tcgctgggga gactatcccc ggtgataacc tcgcgtatga tgccgatttg 1500
agcgcctgga ctgagtacat cccgtaccac ttccgtccta actaccatgg cgtgggtact 1560
tgctccatga tgccgaagga gatgggcggt gttgttgata atgctgcccg tgtgtatggt 1620
gtgcagggac tgcgtgtcat tgatggttct attcctccta cgcaaatgtc gtcccatgtc 1680
atgacggtgt tctatgccat ggcgctaaaa atttcggatg ctatcttgga agattatgct 1740
tccatgcagt ga 1752
<210> 4
<211> 1035
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
tctttcgctt ctacttctgg tttgcaattt actattgacg gtgagactgg ttactttgcc 60
ggtactaact cttactggat tggatttttg actgacaacg ccgatgttga tttggtcatg 120
ggtcatttga agtcttctgg tttgaagatt ttgcgtgtct ggggttttaa cgatgttact 180
tctcaaccat cttctggcac tgtttggtac caattgcatc aagatggtaa gtctactatt 240
aacaccggtg ctgatggttt gcaaagattg gattacgttg tttcttctgc cgaacaacat 300
gatattaagt tgatcatcaa cttcgttaac tactggaccg attacggtgg tatgtctgct 360
tacgtttctg cttacggtgg ttctggtgaa actgattttt acacttctga taccatgcag 420
tctgcctacc aaacttacat taagactgtc gttgaacgct actctaactc ttctgctgtt 480
tttgcttggg aattggctaa cgaaccaaga tgtccatctt gtgatacttc tgttttgtac 540
aactggattg agaagacttc taagtttatc aagggtttgg acgctgacag aatggtttgt 600
attggtgatg aaggttttgg tttgaacatt gactctgacg gttcttaccc ataccaattt 660
tctgaaggtt tgaactttac tatgaacttg ggtattgaca ccatcgactt cggtaccttg 720
cacttgtacc cagattcttg gggtacttct gatgattggg gtaacggttg gattactgct 780
catggtgctg cttgtaaggc tgctggtaag ccatgtttgt tggaagaata cggtgttact 840
tctaaccatt gttctgttga aggttcttgg caaaagactg ctttgtctac tactggtgtt 900
ggtgctgatt tgttttggca atacggtgat gatttgtcta ctggtaagtc tccagatgat 960
ggtaacacta tttactacgg tacttctgat taccagtgct tggttactga tcatgttgct 1020
gctattggtt ctgct 1035

Claims (6)

1.一种快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、将目的基因构建到毕赤酵母载体pGAPZα系列载体中，构建质粒；
（2）、进行聚合酶链式反应：
采用引物GAP-mF：5' CCTAGGAAATTTTACTCTGCTGGAG 3'
GAP-mR：5' GACGGTAACGGGCGGTGGAAGGAGAG 3'
进行聚合酶链式反应，以Taq酶作为聚合酶，在反应体系中先加入等量0.2-0.3mM的4种dNTP，为dATP、dCTP、dGTP、dTTP，再补加0-0.6mM的任意一种dNTP以及0-0.5 mM的氯化锰，以步骤（1）构建的质粒为模板进行聚合酶链式反应，方法是：95℃预变性5分钟、95℃变性30秒、52℃退火30秒、72℃延伸5-10分钟，循环30次，72℃反应10分钟，得PCR产物；
（3）、用PCR产物回收试剂盒回收步骤（2）的PCR产物，加入0.1倍体积的饱和醋酸钠和3倍体积的乙醇，12000转/分钟离心10分钟，弃掉上清液，沉淀加入200μl体积浓度70%乙醇清洗，12000转/分钟离心10分钟，弃掉上清液，沉淀室温晾干，再加入10μl无菌去离子水溶解PCR产物；
（4）、按照酵母转化法，将步骤（3）回收的PCR产物电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布在含100 μg/mL博来霉素的YPDS培养基平板上筛选阳性克隆；
所述的YPDS培养基平板是：酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、琼脂20g和1M山梨醇制成，溶解酵母膏、蛋白胨于900mL水中，加入琼脂，加入葡萄糖、1M山梨醇溶解至1L，115℃灭菌15min，即成；
（5）、提取酵母基因组DNA：挑选步骤（4）任意的5-10个阳性克隆，分别转入由0.2 M 乙酸锂和质量浓度1%十二烷基磺酸钠制成的裂解液100µL中重悬细胞，75℃加热10分钟，加入300µL无水乙醇，混匀，12000转/分钟离心5分钟，除去上清液，沉淀加入400µL体积浓度70%乙醇漂洗沉淀，12000转/分钟离心5分钟，除去上清液，沉淀室温晾干，加入50µL无菌水溶解沉淀，12000转/分钟离心5分钟，以上清液为模板，用引物GAP-F 5'GTCCCTATTTCAATCAATTGAA 3'、3’AOX1 5' GCAAATGGCATTCTGACATCC3'和高保真DNA聚合酶进行聚合酶链式反应，再对PCR产物进行测序，计算碱基突变率、基因突变率，满足实验需求，根据需要进行突变克隆筛选，实现快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库，突变率的计算公式是：
突变率=碱基突变总数/（测序克隆数×基因总碱基数）×100%。
2.根据权利要求1所述的快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、将目的基因构建到毕赤酵母载体pGAPZα系列载体中，构建质粒：
以人工合成的费氏弧菌（fecheri）的一个α-半乳糖苷酶基因GalA为目的基因，序列为SEQ1，用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对基因GalA和毕赤酵母组成型表达载体pGAPZαA同时进行双酶切，之后用T4 DNA连接酶将基因GalA连接进载体质粒pGAPZαA中，形成表达质粒pGAPZαA-GalA，用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对质粒进行酶切检测以确保质粒构建成功，看到酶切后，有质粒pGAPZαA的条带和GalA的DNA条带，质粒构建成功；
（2）、进行聚合酶链式反应：
采用引物GAP-mF：5' CCTAGGAAATTTTACTCTGCTGGAG 3'
GAP-mR：5' GACGGTAACGGGCGGTGGAAGGAGAG 3'
进行聚合酶链式反应，以Taq酶作为聚合酶，在反应体系中先加入等量0.25mM的4种dNTP，为dATP、dCTP、dGTP、dTTP，再补加0.5mM的dGTP，以pGAPZαA-GalA为模板进行易错聚合酶链式反应，方法是：95℃预变性5分钟、95℃变性30秒、52℃退火30秒、72℃延伸5-10分钟，循环30次，72℃反应10分钟，得PCR产物，在PCR产物中有明显的pGAPZαA-GalA条带；
（3）、用PCR产物回收试剂盒回收步骤（2）的PCR产物，加入0.1倍体积的饱和醋酸钠和3倍体积的乙醇，12000转/分钟离心10分钟，弃掉上清液，沉淀加入200μl体积浓度70%乙醇清洗，12000转/分钟离心10分钟，弃掉上清液，沉淀室温晾干，再加入10μl无菌去离子水溶解PCR产物，取1 μl用微量核酸测定仪Nanodrop测定溶液中DNA浓度为1.4 μg/μl；
（4）、按照酵母转化法，将步骤（3）回收的PCR产物9μl电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布在含100 μg/mL博来霉素的YPDS培养基平板上筛选1889个阳性克隆；
（5）、提取酵母基因组DNA：挑选步骤（4）任意的5个阳性克隆，分别转入由0.2 M 乙酸锂和质量浓度1%十二烷基磺酸钠制成的裂解液100µL中重悬细胞，75℃加热10分钟，加入300µL无水乙醇，混匀，12000转/分钟离心5分钟，除去上清液，沉淀加入400µL体积浓度70%乙醇漂洗沉淀，12000转/分钟离心5分钟，除去上清液，沉淀室温晾干，加入50µL无菌水溶解沉淀，12000转/分钟离心5分钟，以上清液为模板，用引物GAP-F 5'GTCCCTATTTCAATCAATTGAA 3'、3’AOX1 5' GCAAATGGCATTCTGACATCC3'和高保真DNA聚合酶进行聚合酶链式反应，看到分子量正确的特异性PCR条带，GalA已经成功重组进酵母基因组中，再对PCR产物进行测序，计算碱基突变率为0.094%。
3.根据权利要求1所述的快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、将目的基因构建到毕赤酵母载体pGAPZα系列载体中，构建质粒：
以人工合成的费氏弧菌（fecheri）的一个α-半乳糖苷酶基因GalB为目的基因，序列为SEQ2，用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对基因GalB和毕赤酵母组成型表达载体pGAPZαA同时进行双酶切，之后用T4 DNA连接酶将基因GalB连接进载体pGAPZαA中，形成表达质粒pGAPZαA-GalB，用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对质粒进行酶切检测以确保质粒构建成功，看到酶切后，有质粒pGAPZαA的条带和GalB的DNA条带，质粒构建成功；
（2）、进行聚合酶链式反应：
采用引物GAP-mF：5' CCTAGGAAATTTTACTCTGCTGGAG 3'
GAP-mR：5' GACGGTAACGGGCGGTGGAAGGAGAG 3'
进行聚合酶链式反应，以Taq酶作为聚合酶，在反应体系中先加入等量0.3mM的4种dNTP，为dATP、dCTP、dGTP、dTTP，再补加0.5mM的dGTP，以pGAPZαA-GalB为模板进行聚合酶链式反应，方法是：95℃预变性5分钟、95℃变性30秒、52℃退火30秒、72℃延伸5-10分钟，循环30次，72℃反应10分钟，得PCR产物，PCR产物中有明显的pGAPZαA-GalB条带，保持16℃；
（3）、用PCR产物回收试剂盒回收步骤（2）的PCR产物，加入0.1倍体积的饱和醋酸钠和3倍体积的乙醇，12000转/分钟离心10分钟，弃掉上清液，沉淀加入200μl体积浓度70%乙醇清洗，12000转/分钟离心10分钟，弃掉上清液，沉淀室温晾干，再加入10μl无菌去离子水溶解PCR产物，取1μl用微量核酸测定仪Nanodrop仪器测定溶液中DNA浓度为1.2 μg/μl；
（4）、按照酵母转化法，将步骤（3）回收的PCR产物电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布在含100 μg/mL博来霉素的YPDS培养基平板上筛选1399个阳性克隆；
（5）、提取酵母基因组DNA：挑选步骤（4）任意的5个阳性克隆，分别转入由0.2 M 乙酸锂和质量浓度1%十二烷基磺酸钠制成的裂解液100µL中重悬细胞，75℃加热10分钟，加入300µL无水乙醇，混匀，12000转/分钟离心5分钟，除去上清液，沉淀加入400µL体积浓度70%乙醇漂洗沉淀，12000转/分钟离心5分钟，除去上清液，沉淀室温晾干，加入50µL无菌水溶解沉淀，12000转/分钟离心5分钟，以上清液为模板，用引物GAP-F 5'GTCCCTATTTCAATCAATTGAA 3'、3’AOX1 5' GCAAATGGCATTCTGACATCC3'和高保真DNA聚合酶进行聚合酶链式反应，看到分子量正确的特异性PCR条带，GalA已经成功重组进酵母基因组中，再对PCR产物进行测序，计算碱基突变率为0.072%。
4.根据权利要求1所述的快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、将目的基因构建到毕赤酵母载体pGAPZα系列载体中，构建质粒；
以人工合成的黑曲霉（Aspergillus niger）的一个葡萄糖氧化酶基因GOD为目的基因，序列为SEQ3，用DNA限制性内切酶KpnⅠ/NotⅠ对基因GalB和毕赤酵母组成型表达载体pGAPZαA同时进行双酶切，之后用T4 DNA连接酶将基因GOD连接进载体pGAPZαA中，形成表达质粒pGAPZαA-GOD，用DNA限制性内切酶KpnⅠ/NotⅠ对质粒进行酶切检测，以确保质粒构建成功，看到酶切后有质粒pGAPZαA的条带和GOD的DNA条带，质粒构建成功；
（2）、进行聚合酶链式反应：
采用引物GAP-mF：5' CCTAGGAAATTTTACTCTGCTGGAG 3'
GAP-mR：5' GACGGTAACGGGCGGTGGAAGGAGAG 3'
以pGAPZαA-GOD为模板，进行3个聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR），第一个以Taq酶作为聚合酶，在反应体系中先加入等量0.25mM的4种dNTP，4种dNTP 为dATP、dCTP、dGTP、dTTP，再添加0.2 mM的MnCl2；第二个以Taq酶作为聚合酶，在反应体系中先加入等量0.25mM的4种dNTP，4种dNTP 为dATP、dCTP、dGTP、dTTP，再添加0.15 mM的MnCl2和0.5mM的dGTP；第三个以Taq酶作为聚合酶，在反应体系中先加入等量0.25mM的4种dNTP，4种dNTP为dATP、dCTP、dGTP、dTTP，再添加0.25 mM的MnCl2和0.5 mM的dGTP；以构建的质粒pGAPZαA-GOD为模板进行3个聚合酶链式反应的程序是，95℃预变性5分钟、95℃变性30秒、52℃退火30秒、72℃延伸5-10分钟，循环30次，72℃反应10分钟，得PCR产物，得PCR产物，有明显的pGAPZαA-GOD条带℃；
（3）、用PCR产物回收试剂盒分别回收步骤（2）3个反应的PCR产物，分别加入其0.1倍体积的饱和醋酸钠和3倍体积的乙醇，12000转/分钟离心10分钟，弃掉上清液，沉淀加入200μl体积浓度70%乙醇清洗，12000转/分钟离心10分钟，弃掉上清液，沉淀室温晾干，再加入10μl无菌去离子水溶解PCR产物，取1 μl用Nanodrop仪器测定溶液中DNA浓度，第1个反应为0.97μg/μl，第2个反应为0.80 μg/μl，第3个反应为0.76 μg/μl；
（4）、按照酵母转化法，将3个反应中各自的PCR产物9μl电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布在含100 μg/mL博来霉素的YPDS培养基平板上，30 ℃倒置培养3天，计克隆数，第1个反应为242个，第2个反应为269个，第3个反应为244个；
（5）、提取酵母基因组DNA：在3个平板上任意挑选5个阳性克隆，分别转入由0.2 M 乙酸锂和质量浓度1%十二烷基磺酸钠制成的裂解液100µL中重悬细胞，75℃加热10分钟，加入300µL无水乙醇，混匀，12000转/分钟离心5分钟，除去上清液，沉淀加入400µL体积浓度70%乙醇漂洗沉淀，12000转/分钟离心5分钟，除去上清液，沉淀室温晾干，加入50µL无菌水溶解沉淀，12000转/分钟离心5分钟，以上清液为模板，用引物GAP-F 5'GTCCCTATTTCAATCAATTGAA 3'、3’AOX1 5' GCAAATGGCATTCTGACATCC3'和高保真DNA聚合酶进行聚合酶链式反应，再对PCR产物进行测序，计算碱基突变率，第1个反应碱基突变率为0.137%，第2个反应碱基突变率为0.342%，第3个反应碱基突变率为0.342%。
5.根据权利要求1所述的快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、将目的基因构建到毕赤酵母载体pGAPZα系列载体中，构建质粒：
以人工合成的黑曲霉（Aspergillus niger）的一个β-甘露聚糖酶基因ManA为目的基因，序列为SEQ4，用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对基因GalB和毕赤酵母组成型表达载体pGAPZαA同时进行双酶切，之后用T4 DNA连接酶将基因ManA连接进载体pGAPZαA中，形成表达质粒pGAPZαA-ManA，用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对质粒进行酶切检测以确保质粒构建成功，看到酶切后有质粒pGAPZαA的条带和ManA的DNA条带，质粒构建成功；
（2）、进行聚合酶链式反应：
采用引物GAP-mF：5' CCTAGGAAATTTTACTCTGCTGGAG 3'
GAP-mR：5' GACGGTAACGGGCGGTGGAAGGAGAG 3'
以pGAPZαA-ManA为模板，进行2个聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR），第一个以Taq酶作为聚合酶，在反应体系中先加入等量0.25mM的4种dNTP，4种dNTP 为dATP、dCTP、dGTP、dTTP，再添加0.1 mM的MnCl2；第二个以Taq酶作为聚合酶，在反应体系中先加入等量0.25mM的4种dNTP，4种dNTP 为dATP、dCTP、dGTP、dTTP，再添加0.1mM的MnCl2和0.5mM的dGTP；以构建的质粒pGAPZαA-ManA为模板进行2个聚合酶链式反应的程序是，95℃预变性5分钟、95℃变性30秒、52℃退火30秒、72℃延伸5-10分钟，循环30次，72℃反应10分钟，得PCR产物，有明显的pGAPZαA-ManA条带℃；
（3）、用PCR产物回收试剂盒分别回收步骤（2）的PCR产物，分别加入其0.1倍体积的饱和醋酸钠和3倍体积的乙醇，12000转/分钟离心10分钟，弃掉上清液，沉淀加入200μl体积浓度70%乙醇清洗，12000转/分钟离心10分钟，弃掉上清液，沉淀室温晾干，再加入10μl无菌去离子水溶解PCR产物，取1 μl用Nanodrop仪器测定溶液中DNA浓度，第1个反应为1.07 μg/μl，第2个反应为0.46 μg/μl；
（4）、按照酵母转化法，将步骤（3）回收的PCR产物9μl电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布在含100 μg/mL博来霉素的YPDS培养基平板上，30 ℃倒置培养3天后，计克隆数，第1个反应为1230个，第2个反应为236个；
（5）、提取酵母基因组DNA：在2个转化平板上分别随意挑选5个克隆，分别转入由0.2 M乙酸锂和质量浓度1%十二烷基磺酸钠制成的裂解液100µL中重悬细胞，75℃加热10分钟，加入300µL无水乙醇，混匀，12000转/分钟离心5分钟，除去上清液，沉淀加入400µL体积浓度70%乙醇漂洗沉淀，12000转/分钟离心5分钟，除去上清液，沉淀室温晾干，加入50µL无菌水溶解沉淀，12000转/分钟离心5分钟，以上清液为模板，用引物GAP-F 5'GTCCCTATTTCAATCAATTGAA 3'、3’AOX1 5' GCAAATGGCATTCTGACATCC3'和高保真DNA聚合酶进行聚合酶链式反应，再对PCR产物进行测序，看到分子量正确的特异性PCR条带，ManA已经成功重组进酵母基因组中，再对PCR产物进行测序，计算碱基突变率，第1个反应突变率为0.039%，第2个反应为0.116%。
6.权利要求1-5任一项所述方法快速构建的蛋白质突变体毕赤酵母表达文库在定向选择所需性质的优化酶蛋白质中的应用。
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