CN116790733A - 一种脱氨酶辅助的rna中n6-甲基腺嘌呤的定位分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脱氨酶辅助的RNA中N6‑甲基腺嘌呤的定位分析方法，属于生物技术领域。本发明方法包括如下步骤：对待检RNA进行变性处理；使用脱氨酶对变性处理后的RNA进行脱氨基反应；经脱氨基反应处理后的RNA进行逆转录反应，合成cDNA；cDNA再进行PCR扩增；扩增产物进行测序，测序仍读作A的位点为原N6‑甲基腺嘌呤位点。本发明使用的脱氨酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示的TadA8e或TadA‑TadA8e，其能对RNA中的腺嘌呤可以实现有效的脱氨基，而对N6‑甲基腺嘌呤不脱氨基。本发明方法灵敏度高、选择性高、操作简便，可以直接实现RNA中N6‑甲基腺嘌呤的单碱基分辨率定位。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种脱氨酶辅助的RNA中N6-甲基腺嘌呤的定位分析方法。
背景技术
RNA分子含有多种化学修饰，在许多生理和病理过程中发挥关键作用。迄今为止，已经在不同生物体的不同RNA分子中鉴定出超过150种不同的修饰。N6-甲基腺苷(m6A)已在许多真核生物中发现，从植物到哺乳动物，甚至在病毒中，m6A是哺乳动物中最丰富和最普遍的RNA修饰之一。m6A存在于多种RNA物种中，包括mRNA、rRNA、tRNA、miRNA和长链非编码RNA。m6A测序和检测技术的进步揭示了其在多种生物过程中的调控功能和机制。研究表明，m6A可以在不改变RNA序列的情况下调节RNA的结构、稳定性和翻译。m6A目前被广泛认为是一个调控网络，参与广泛的关键功能，从基因表达的调控，发育，癌变到病毒感染。
基于测序的方法可以告诉RNA中修饰的位点信息。例如，通过抗体介导的免疫沉淀或酶辅助的化学标记富集，然后进行测序(如m6A-seq、MeRIP-se1和m6A-SEAL)，可以在大约100～200个核苷酸分辨率下对m6A进行定位。然而，这些方法不能识别特定的m6A位点。
目前已开发出用于m6A表达谱分析的其他一些方法，如交联和免疫沉淀(miCLIP)、基于m6A敏感的核酸内切酶裂解分析(MAZTER-seq和m6A-REF-seq)、化学转换的代谢标记(m6A-label-seq)、通过与RNA编辑酶融合的m6A识别蛋白诱导m6A残基附近的突变(DART-seq)以及m6A选择性烯丙基化学标记和测序(m6A-SAC-seq)。然而，这些方法的应用受到交联效率、抗体特异性、有偏倚的序列背景和复杂的程序的限制。此外，有人提出了寡核苷酸连接介导的检测方法来鉴定m6A位点。然而，寡核苷酸退火过程在检测特异性方面也面临挑战。目前，仍缺乏一种能够在单碱基分辨率下简单而经济地检测RNA中m6A的方法。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术缺乏简单而经济地检测RNA中m6A的方法的问题，提供一种脱氨酶辅助的RNA中N6-甲基腺嘌呤的定位分析方法，该方法是一种具有高灵敏度和高选择性的单碱基分辨率的m6A定位方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种脱氨酶辅助的RNA中N6-甲基腺嘌呤的定位分析方法，包括如下步骤：
(1)对待检RNA进行变性处理使其消除二级结构。
(2)使用脱氨酶TadA8e或TadA-TadA8e对变性处理后的RNA进行脱氨基反应。所述的脱氨酶TadA8e的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的脱氨酶TadA-TadA8e的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
(3)经脱氨基反应处理后的RNA进行逆转录反应，合成cDNA；cDNA再进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。
(4)扩增产物进行测序，测序仍读作A的位点为原N6-甲基腺嘌呤位点。
步骤(1)中，RNA的变性处理优选为：将RNA在65℃下孵育5分钟，而后立刻转入冰水浴2分钟，消除RNA的二级结构。
步骤(2)中，脱氨基反应优选为在20mM Tris-HCl、pH 7.5的缓冲液中进行。脱氨基反应的条件优选为37～45℃反应2～6小时；其中，TadA8e脱氨基反应温度为优选37℃，TadA-TadA8e脱氨基反应温度优选为45℃。
步骤(2)中，脱氨基反应后将应体系中的脱氨酶进行高温灭活处理，优选在95℃灭活10分钟，待温度冷却至室温可进行下一步操作。
所述的脱氨酶辅助的RNA中N6-甲基腺嘌呤的定位分析方法的原理见图1-3，经过TadA8e或者TadA-TadA8e蛋白处理的RNA的A位点转变为I，在逆转录时与C配对，测序时读作G；而m6A抵抗脱氨，在逆转录过程中与T配对，测序时仍读作A。测序被读作A的位点，为原m6A位点，从而实现RNA上m6A的定位分析。
所述的方法中使用到的脱氨酶TadA8e、TadA-TadA8e是从野生型TadA酶(大肠杆菌tRNA特异性腺苷脱氨酶，能催化腺苷在tRNA的摆动位置脱氨形成肌苷)进化的蛋白质。TadA8e、TadA-TadA8e能够对RNA中的腺嘌呤实现有效的脱氨基，而对N6-甲基腺嘌呤不脱氨基，TadA-TadA8e相对于TadA8e效果更优。
表1.TadA8e、TadA-TadA8e的氨基酸序列
本发明还提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示的脱氨酶TadA8e或TadA-TadA8e，及所述脱氨酶在RNA中N6-甲基腺嘌呤定位分析或在制备定位分析RNA中N6-甲基腺嘌呤的试剂盒中的应用。
一种定位分析RNA中N6-甲基腺嘌呤的试剂盒，包含所述的脱氨酶TadA8e或TadA-TadA8e。
本发明的优点和有益效果如下：
1.本发明方法操作简便，无需繁琐的样品前处理，脱氨基处理后可直接进行逆转录和聚合酶链式扩增反应，根据扩增产物测序即可获得m6A的单碱基分辨率定位信息。本发明方法不需要对m6A进行保护。
2.本发明无需利用试剂氧化或衍生化试剂标记，极大的缩短了实验的时间。
3.本发明涉及的脱氨基反应具有较高的脱氨基效率(99％)，利于定位分析。
附图说明
图1为本发明脱氨酶辅助的RNA中N6-甲基腺嘌呤的定位分析方法的示意图。
图2为本发明中TadA8e或者TadA-TadA8e蛋白对腺嘌呤和N6-甲基腺嘌呤的脱氨基所用示意图。
图3为本发明中利用TadA8e或者TadA-TadA8e蛋白对DNA中N6-甲基腺嘌呤进行定位。
图4为本发明中人工合成的含有m6A的60寡核苷酸长度RNA链脱氨基处理前后Sanger测序结果图。
图5为本发明中人工合成的含有m6A的60寡核苷酸长度RNA链脱氨基处理后单克隆测序结果统计。
图6为本发明中提取的大肠杆菌的含有m6A的23S rRNA链脱氨基处理前后Sanger测序结果图。
图7为本发明中体外转录合成的不含有m6A的RNA链脱氨基处理前后Sanger测序结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种脱氨酶辅助的RNA中N6-甲基腺嘌呤的定位分析方法，其具体包括如下步骤：
(1)首先配制工作溶液：将Tris溶解于去离子水中，浓度为200mM，并用盐酸调节pH为7.5。
(2)取10ng从生物样品组织或细胞中提取的RNA。
(3)RNA进行变性处理，在65℃水浴中孵育5分钟，随后立即转移至冰水浴中冷却。
(4)取步骤(3)中所述的RNA样品10ng，加入一定量的TadA8e或TadA-TadA8e蛋白，1μL的Tris-HCl反应缓冲液，加去离子水至反应体系为10μL。用小型加热水浴锅在37℃或者45℃下反应4个小时；反应结束后，将样品在95℃下孵育10分钟，并冷却至室温。
(5)取步骤(4)的反应溶液，加入逆转录酶合成cDN。
(6)取2μL步骤(5)的cDNA溶液随后进行聚合酶链式反应对DNA进行扩增，进而进行测序。
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段包括核酸的提取、酶解以及聚合酶链式反应为本领域技术人员所熟知的常规手段。
表2.下述实施例中涉及的RNA的序列
表3.下述实施例中涉及的逆转录引物序列
| 引物名称 | 序列(5’→3’) |
| 60-nt RNA-A RT | GGATTTAAAAAATAATCTTA |
| 60-nt RNA-I RT | GGACCCAAAAAACAA |
| 253-nt RNA-A RT | GTTTTATGCGATTACCG |
| 253-nt RNA-I RT | GCCGCCAAGAAGAGG |
| 450-nt RNA-A RT | AGAATGGGTACAATGAGG |
| 450-nt RNA-I RT | AGAACGGGCACAACGAGG |
| 23S rRNA-A RT | CCGCCCCAGTCAAACTACC |
| 23S rRNA-I RT | CCCACCCAGAACCACCG |
表4.下述实施例中涉及的PCR引物序列
| 引物名称 | 序列(5’→3’) |
| 60-nt RNA-A forward primer | AGTAATTACCAACTTAATGT |
| 60-nt RNA-A reverse primer | GGATTTAAAAAATAATCTTA |
| 60-nt RNA-I forward primer | GGTGGTTGCCGGCTTG |
| 60-nt RNA-I reverse primer | GGACCCAAAAAACAA |
| 253-nt RNA-A forward primer | CAGGTCGGTTTCTATCTAC |
| 253-nt RNA-A reverse primer | GTTAAGAAGAGGAATTGAAC |
| 253-nt RNA-I forward primer | GGTCGGTTTCTGTCTGC |
| 253-nt RNA-I reverse primer | CCGCAAAGCCCCAAG |
| 450-nt RNA-A forward primer | TTCGTTTGTTCAACGATTA |
| 450-nt RNA-A reverse primer | AGAATGGGTACAATGAGG |
| 450-nt RNA-I forward primer | TTCGTTTGTTCGGCGGTTG |
| 450-nt RNA-I reverse primer | AGAACGGGCACAACGAGG |
| 23S rRNA-A m6A1618forward primer | GGGGACGGAGAAGGCTATG |
| 23S rRNA-A m6A1618reverse primer | CCACTTTCGTGTTTGCACAGT |
| 23S rRNA-A m6A2030forward primer | ACAGCACTGTGCAAACACGAA |
| 23S rRNA-A m6A2030reverse primer | CCCCAGTCAAACTACCCACCA |
| 23S rRNA-I m6A1618forward primer | TGGTTTTCCGGGCGGGTCC |
| 23S rRNA-I m6A1618reverse primer | CAAACAGCCGCAGCCAG |
| 23S rRNA-I m6A2030forward primer | CCCACCCAGAACCACCG |
| 23S rRNA-I m6A2030reverse primer | GCCAGAACACCAAACA |
实施例1：合成RNA的分析
商品化合成的含有m6A的RNA(60-nt RNA)10ng，在65℃下孵育5分钟后放入冰水浴中，消除RNA的二级结构。然后加入一定量的TadA8e或者TadA-TadA8e蛋白(根据所使用的蛋白的实际活性确定最合适的脱氨基浓度)，1μL 200mM Tris-HCl，加无酶水至反应体系为10μL，在37℃或者45℃水浴中温育4个小时。随后在95℃水浴中温育10分钟。
取上述10μL的RNA反应溶液进行逆转录反应合成cDNA。反应体系：5×逆转录反应缓冲液4μL，10μmol/L逆转录引物(60-nt RNA-ART和60-nt RNA-I RT)1μL，模板DNA10μL，逆转录酶终浓度20U，补加无酶水至20μL。逆转录过程程序为：(1)25℃孵育5min；(2)45℃反应30min；(3)85℃反应5min灭活逆转录酶。
取上述反应得到的cDNA2μL进行聚合酶链式扩增反应。反应体系：10×扩增缓冲液2μL，10μmol/L正反向引物(60-nt RNA-A和60-nt RNA-I)各1μL，模板cDNA2μL，Q5 DNA聚合酶终浓度10U，补加去离子水至体系为20μL。扩增反应的退火温度根据不同区域选出不同的退火温度；扩增循环时间程序：(1)95℃变性5min；(2)95℃变性30sec；(3)50-68℃退火30sec；(4)72℃延伸30sec；(2)-(4)步重复25次；72℃延伸10min，放置4℃进行贮存。扩增产物进行Sanger测序。结果见图4，经过处理后的RNA，其A的位点都读作G，m6A的位点仍读作A。经过单克隆测序后，可以由图5的结果得知TadA8e蛋白脱氨基的总体效率为98％，TadA-TadA8e蛋白的脱氨基效率为99％。同时，两个蛋白对m6A的脱氨基效率为0％。
实施例2：大肠杆菌23S rRNA的分析
提取大肠杆菌的总RNA，用0.8％的琼脂糖电泳分离23S rRNA，对23S rRNA切胶纯化。含有m6A的23S rRNA 10ng在65℃下孵育5分钟后放入冰水浴中，消除RNA的二级结构。然后，加入一定量的TadA8e或者TadA-TadA8e蛋白(根据所使用的蛋白的实际活性确定最合适的脱氨基浓度)，1μL 200mM Tris-HCl，加无酶水至反应体系为10μL，在37℃或者45℃水浴中温育4个小时。随后在95℃水浴中温育10分钟。
取上述10μL的RNA反应溶液进行逆转录反应合成cDNA。反应体系：5×逆转录反应缓冲液4μL，10μmol/L逆转录引物(23S rRNA-ART和23S rRNA-I RT)1μL，模板DNA10μL，逆转录酶终浓度20U，补加无酶水至20μL。逆转录过程程序为：(1)25℃孵育5min；(2)45℃反应30min；(3)85℃反应5min灭活逆转录酶。
取上述反应得到的cDNA2μL进行聚合酶链式扩增反应。反应体系：10×扩增缓冲液2μL，10μmol/L正反向引物(23S rRNA-Am6A1618，23S rRNA-Am6A2030，23S rRNA-I m6A1618和23SrRNA-I m6A2030)各1μL，模板cDNA2μL，Q5 DNA聚合酶终浓度10U，补加去离子水至体系为20μL。扩增反应的退火温度根据不同区域选出不同的退火温度；扩增循环时间程序：(1)95℃变性5min；(2)95℃变性30sec；(3)50-68℃退火30sec；(4)72℃延伸30sec；(2)-(4)步重复25次；72℃延伸10min，放置4℃进行贮存。扩增产物进行Sanger测序。结果见图6，TadA-TadA8e蛋白可以将23S rRNA中的A脱氨基，两个已知的m6A位点未脱氨基，表明TadA-TadA8e可以实现对的m6A位点的定位分析。而对于TadA8e蛋白处理的23SrRNA，实现了在2030位点附近A的全部脱氨并且m6A未脱氨。但是在1618位点，有部分的A未脱氨(有些位点的信号为A和G的混合)，表明TadA8e并不能完全实现对m6A位点的定位分析。
实施例3：体外转录合成的RNA的分析
通过体外转录合成的方式得到两种长度的RNA(253-nt RNA和450-nt RNA)，不含有m6A的体外转录合成的RNA10ng在65℃下孵育5分钟后放入冰水浴中，消除RNA的二级结构。然后，加入一定量的TadA8e或者TadA-TadA8e蛋白(根据所使用的蛋白的实际活性确定最合适的脱氨基浓度)，1μL 200mM Tris-HCl，加无酶水至反应体系为10μL，在37℃或者45℃水浴中温育4个小时。随后在95℃水浴中温育10分钟。
取上述10μL的RNA反应溶液进行逆转录反应合成cDNA。反应体系：5×逆转录反应缓冲液4μL，10μmol/L逆转录引物(253-nt RNA-ART，253-nt RNA-I RT，450-nt RNA-ART和450-nt RNA-I RT)1μL，模板DNA10μL，逆转录酶终浓度20U，补加无酶水至20μL。逆转录过程程序为：(1)25℃孵育5min；(2)45℃反应30min；(3)85℃反应5min灭活逆转录酶。
取上述反应得到的cDNA 2μL进行聚合酶链式扩增反应。反应体系：10×扩增缓冲液2μL，10μmol/L正反向引物(253-nt RNA-A，253-nt RNA-I，450-nt RNA-A和450-nt RNA-I)各1μL，模板cDNA 2μL，Q5 DNA聚合酶终浓度10U，补加去离子水至体系为20μL。扩增反应的退火温度根据不同区域选出不同的退火温度；扩增循环时间程序：(1)95℃变性5min；(2)95℃变性30sec；(3)50-68℃退火30sec；(4)72℃延伸30sec；(2)-(4)步重复25次；72℃延伸10min，放置4℃进行贮存。扩增产物进行Sanger测序。结果见图7，253-nt RNA经过TadA8e和TadA-TadA8e蛋白处理后，全部的A实现脱氨基。但是对更长的450-nt RNA分析时，TadA8e蛋白无法实现全部A脱氨基，仍有部分A的残留，而TadA-TadA8e蛋白可以将全部的A实现脱氨基，测序时信号全部转化为G。
Claims (10)
1.一种脱氨酶辅助的RNA中N6-甲基腺嘌呤的定位分析方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)对待检RNA进行变性处理使其消除二级结构；
(2)使用脱氨酶TadA8e或TadA-TadA8e对变性处理后的RNA进行脱氨基反应；
所述的脱氨酶TadA8e的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的脱氨酶TadA-TadA8e的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(3)经脱氨基反应处理后的RNA进行逆转录反应，合成cDNA；cDNA再进行PCR扩增；
(4)扩增产物进行测序，测序仍读作A的位点为原N6-甲基腺嘌呤位点。
2.根据权利要求1所述的脱氨酶辅助的RNA中N6-甲基腺嘌呤的定位分析方法，其特征在于：步骤(1)中，RNA的变性处理为：将RNA在65℃下孵育5分钟。
3.根据权利要求1所述的脱氨酶辅助的RNA中N6-甲基腺嘌呤的定位分析方法，其特征在于：步骤(2)中，脱氨基反应在20mM Tris-HCl、pH 7.5的缓冲液中进行。
4.根据权利要求1所述的脱氨酶辅助的RNA中N6-甲基腺嘌呤的定位分析方法，其特征在于：步骤(2)中，脱氨基反应的条件为37～45℃反应2～6小时。
5.根据权利要求4所述的脱氨酶辅助的RNA中N6-甲基腺嘌呤的定位分析方法，其特征在于：TadA8e脱氨基反应温度为37℃，TadA-TadA8e脱氨基反应温度为45℃。
6.根据权利要求1所述的脱氨酶辅助的RNA中N6-甲基腺嘌呤的定位分析方法，其特征在于：步骤(2)中，脱氨基反应后将应体系中的脱氨酶进行高温灭活处理。
7.一种脱氨酶，其特征在于：为氨基酸序列如如SEQ ID NO.1或2所示的脱氨酶TadA8e或TadA-TadA8e。
8.权利要求7所述的脱氨酶在RNA中N6-甲基腺嘌呤定位分析中的应用。
9.权利要求7所述的脱氨酶在制备定位分析RNA中N6-甲基腺嘌呤的试剂盒中的应用。
10.一种定位分析RNA中N6-甲基腺嘌呤的试剂盒，其特征在于：包含权利要求7所述的脱氨酶。
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