CN110358817B - 脱氨酶辅助的dna中5-羧基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脱氨酶辅助的DNA中5‑羧基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法。本发明使用胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A蛋白对DNA中正常的胞嘧啶、5‑甲基胞嘧啶、5‑羟甲基胞嘧啶和5‑醛基胞嘧啶有效的脱氨基，对5‑羧基基胞嘧啶不脱氨基的策略，随后进行聚合酶链式反应扩增进而测序获得5‑羧基胞嘧啶的位点信息。该方法灵敏度高、选择性高、操作简便，且无需对DNA样品进行亚硫酸氢盐的处理，就可以直接获得DNA中5‑羧基胞嘧啶的单碱基分辨率定位。

Description

脱氨酶辅助的DNA中5-羧基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分 析方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是指一种脱氨酶辅助的DNA中5-羧基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法。

背景技术

在哺乳动物的DNA中，胞嘧啶5位会在DNA甲基转移酶的作用下发生甲基化修饰，形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。5-mC参与许多重要生物学过程，如基因组印迹、基因表达调控等是一种重要的表观遗传学修饰。5-甲基胞嘧啶可以被TET蛋白进一步地连续氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)、5-醛基胞嘧啶(5-foC)和5-羧基胞嘧啶(5-caC)，形成新的修饰。这些新发现的修饰成分与多种重要生理功能密切相关，例如细胞分化、细胞重编程、神经系统发育、疾病的发生与发展等等。正常人的DNA修饰水平是稳定的，异常的DNA修饰水平只会导致一系列疾病的发生，比如癌症、老年痴呆症、糖尿病等需要。

研究这些DNA修饰的生物学功能需要对其进行准确的定位分析，然而这些DNA修饰的丰度非常低，甚至每10⁶个胞嘧啶中还不到1个，并且DNA中其它大量的未修饰成分(胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤)化学结构与修饰成分类似，在检测这些修饰成分时会对其造成严重干扰。所以上述两点是导致单碱基分辨定位分析需要高灵敏度、高选择性且准确检测的原因。

传统的亚硫酸氢盐测序方法是通过利用亚硫酸氢盐对未修饰的胞嘧啶(C)进行脱氨基而5-甲基胞嘧啶(5-mC)、5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)不脱氨基的原理对DNA进行处理；同样的，在处理过程中，5-醛基胞嘧啶(5-fC)和5-羧基胞嘧啶(5-caC)也会被亚硫酸氢盐脱氨基。在后续的测序过程中C被读作胸腺嘧啶(T)，这种由C到T的转化可以直接获得5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的定位信息总和。

目前对于全基因组5-羧基胞嘧啶的单碱基分辨率测序的方法有两种，一种是EDC化学辅助的亚硫酸氢盐测序方法，另一种为甲基酶辅助的亚硫酸氢盐测序方法。DEC化学辅助亚硫酸氢盐测序方法的反应可以在相对温和的水溶液中进行，pH值为中性，可以防止DNA降解。5-caC上的羧酸基团可以与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)反应生成o-酰基异脲酯中间体，然后再被初级胺攻击，将羧基作为酰胺键保护起来可以阻断亚硫酸氢盐的脱羧过程，显著减缓亚硫酸氢盐介导的脱胺反应。在EDC的帮助下，叠氮胺可以被修饰到含有5-caC的DNA上，再通过亲和富集将目标DNA富集出来。该方法需要与传统的亚硫酸氢盐测序方法进行对比，才能比较得到5-caC的定位信息。而甲基酶辅助的亚硫酸氢盐测序方法5-fC首先被NaBH₄还原为5-hmC。在NaBH₄还原处理与M.SssI甲基化酶处理后，再进行亚硫酸氢盐处理。亚硫酸氢盐转化后的5-caC在测序过程中被读作为T，而C、5-mC、5-hmC和5-fC读作C。该方法可以直接获得5-caC的单碱基分辨率定位信息。因为M.SssI酶仅对CpG二核苷酸上的胞嘧啶甲基化，其他随机分布的5-caC位点不能被检测到；除此之外，NaBH₄处理和M.SssI酶处理会增加额外的纯化步骤，在此过程中会有部分的DNA会被流失。

人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3A(简称APOBEC3A)是一种胞嘧啶脱氨酶，可使单链RNA和单链DNA的序列中的胞嘧啶(C)脱氨基成为尿嘧啶(U)，进而引发病毒DNA降解或突变等后续效应破坏病毒的复制。有研究表明，该蛋白可以有效的对单链DNA中的C、5-mC、5-hmC和5-fC有高效的脱氨基作用，但是5-caC可以抵御APOBEC3A蛋白的脱氨基作用。根据这个特性，利用APOBEC3A脱氨基作用对C及其氧化衍生产物5-mC、5-hmC和5-fC脱氨基处理，但是对5-caC不脱氨基的作用，建立DNA中5-caC的单碱基分辨率测序分析。

发明内容

本发明首要解决的技术问题在于提供一种脱氨酶辅助的DNA中5-羧基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法，即一种能应用于DNA修饰测序领域中，无需亚硫酸氢盐处理的、具有高灵敏度和高选择性的单碱基分辨率的5-caC定位测序方法。

为实现上述目的，本发明提供的脱氨酶辅助的DNA中5-羧基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法，其特征在于：它包含如下步骤：

(1)先对DNA进行变性处理使其形成单链，随后用脱氨酶APOBEC3A蛋白对单链DNA进行脱氨基处理，再将反应体系中的APOBEC3A蛋白进行高温灭活处理；具体步骤为：

DNA变性处理是将DNA在95℃高温下孵育5分钟后立即转入冰浴2分钟，DNA在水中进行变性处理；所使用的APOBEC3A反应缓冲液的终浓度为25mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH为5.0；APOBEC3A蛋白的用量根据实验表达得出的蛋白具体活性进行调整，以保证APOBEC3A蛋白的用量使得反应体系中的DNA上的胞嘧啶及其修饰完全脱氨基；APOBEC3A脱氨基反应温度为37℃，反应时间为2小时；APOBEC3A高温灭活处理是在脱氨基反应结束后对反应体系进行90℃10分钟的孵育，待反应温度冷却至室温可进行下一步操作；

(2)取上述100ng脱氨基样品进行聚合酶链式反应，对脱氨基的DNA片段进行扩增；聚合酶链式反应对DNA片段进行扩增；

(3)扩增后的样品直接进行Sanger测序。

本发明方法通过APOBEC3A蛋白对DNA中C、5-mC、5-hmC和5-fC进行脱氨基作用，无需亚硫酸氢盐处理直接测序获得5-caC的单碱基分辨率定位信息。

本发明提供的测序方案不需要对5-caC进行保护以及对C、5-mC、5-hmC和5-fC脱氨基处理：采用一定量的APOBEC3A蛋白为脱氨酶，4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液(HEPES)为缓冲体系，优化的反应条件为APOBEC3A的浓度(具体根据实际蛋白的活性来确定)；反应温度为37℃，反应时间为2个小时。

上述脱氨基反应是指具有脱氨基作用的APOBEC3A蛋白与含胞嘧啶的化合物之间的脱氨基反应。

上述APOBEC3A辅助的DNA中单碱基分辨率定位分析5-caC的测序方法：将带有胞嘧啶修饰的DNA链脱氨基处理后，将产物进行聚合酶链式反应扩增后直接进行测序分析。

RNA胞嘧啶修饰成分与DNA胞嘧啶修饰成分类似，核苷与脱氨核苷的修饰碱基相同，只是戊糖环2’位有无羟基的区别；只要对APOBEC3A蛋白的脱氨基反应进行优化，或者对APOBEC3A蛋白进行改造，使其更适于RNA就可以对RNA链上的修饰胞嘧啶进行脱氨基处理，所以本发明也可以应用在RNA胞嘧啶修饰的定位分析。

本发明的优点及有益效果如下：

1)本发明中，方法操作简便，无需繁琐的样品前处理，脱氨基处理后课直接进行聚合酶链式扩增反应。

2)本发明无需亚硫酸氢盐处理以及随后的纯化处理。

3)本发明无需利用试剂氧化或衍生化试剂标记，极大的缩短了实验的时间。

4)本发明涉及的脱氨基反应具有较高的脱氨基效率(99％)，利于定位分析。

5)本发明涉及的APOBEC3A蛋白可对其进行进一步研究，使其适用于RNA中的C和5-mC，从而在RNA修饰分析领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明中APOBEC3A对胞嘧啶及其氧化衍生物的脱氨基所用示意图。

图2为本发明中人工合成的未含有修饰的150寡核苷酸长度DNA链脱氨基处理前后LC-MS/MS检测效果对比图。

图3为本发明中人工合成的未含有修饰的150寡核苷酸长度DNA链脱氨基处理前后测序效果对比图。

图4为本发明中人工合成的含有5-mC修饰的150寡核苷酸长度DNA链脱氨基处理前后LC-MS/MS检测效果对比图。

图5为本发明中人工合成的含有5-mC修饰的150寡核苷酸长度DNA链脱氨基处理前后测序效果对比图。

图6为本发明中人工合成的含有5-hmC修饰的150寡核苷酸长度DNA链脱氨基处理前后LC-MS/MS检测效果对比图。

图7为本发明中人工合成的含有5-hmC修饰的150寡核苷酸长度DNA链脱氨基处理前后测序效果对比图。

图8为本发明中人工合成的含有5-fC修饰的150寡核苷酸长度DNA链脱氨基处理前后LC-MS/MS检测效果对比图。

图9为本发明中人工合成的含有5-fC修饰的150寡核苷酸长度DNA链脱氨基处理前后测序效果对比图。

图10为本发明中人工合成的含有5-caC修饰的150寡核苷酸长度DNA链脱氨基处理前后LC-MS/MS检测效果对比图。

图11为本发明中人工合成的含有5-caC修饰的150寡核苷酸长度DNA链脱氨基处理前后测序效果对比图。

图12为本发明的流程示意图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明进行进一步说明。

本发明脱氨酶辅助的DNA中5-羧基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法，具体步骤如下：

1、首先配置工作溶液：将4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶解于去离子水中，浓度为250mM。

2、取10-30μg从生物样品组织或细胞中提取的DNA，用RNase酶将DNA中的RNA除干净。

3、利用商品化的dsDNAfragmentase对DNA进行片段化处理；片段化DNA进行变性处理，在95℃水浴中孵育5分钟，随后立即转移至冰盒中猝火。

4、取步骤3中所述的DNA样品100ng，加入一定量的APOBEC3A蛋白，2μL的4-羟乙基哌嗪乙磺酸反应缓冲液，加去离子水至反应体系为20μL。在37℃下用小型加热水浴锅反应2个小时；反应结束后，将样品在90℃下孵育10分钟。

5、随后进行聚合酶链式反应对DNA进行扩增，进而进行测序。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段包括核酸的提取、酶解以及聚合酶链式反应为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例：

标准合成DNA分析

商品化合成的分别含有C、5-mC、5-hmC、5-fC和5-caC的DNA 100ng，加入一定量的APOBEC3A蛋白(根据所使用的APOBEC3A蛋白的实际活性确定最合适的脱氨基浓度)，2μL250mM HEPES，加去离子水至反应体系为20μL，在37℃水浴中温育2个小时。随后在90℃水浴中温育10分钟。

取上述反应DNA进行聚合酶链式扩增反应。反应体系：10x扩增缓冲液2μL，10μmol/L正反向引物各1μL，模板DNA 5ng，taq DNA聚合酶终浓度10U，补加去离子水至体系为20μL。扩增反应的退火温度根据不同区域选出不同的退火温度；扩增循环时间程序：(1)95℃变性5min；(2)95℃变性30sec；(3)50-68℃退火30sec；(4)72℃延伸30sec；(2)-(4)步重复25次；72℃延伸10min，放置4℃进行贮存。样品可直接进行桑格(Sanger)测序。

Claims (1)

1.一种脱氨酶辅助的DNA中5-羧基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法，其特征在于：它包含如下步骤：

(1)先对DNA进行变性处理使其形成单链，随后用脱氨酶APOBEC3A蛋白对单链DNA进行脱氨基处理，再将反应体系中的APOBEC3A蛋白进行高温灭活处理；具体步骤为：

DNA变性处理是将DNA在95℃高温下孵育5分钟后立即转入冰浴2分钟，DNA在水中进行变性处理；所使用的APOBEC3A反应缓冲液的终浓度为25mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH为5.0；APOBEC3A蛋白的用量根据实验表达得出的蛋白具体活性进行调整，以保证APOBEC3A蛋白的用量使得反应体系中的DNA上的胞嘧啶及其修饰完全脱氨基；APOBEC3A脱氨基反应温度为37℃，反应时间为2小时；APOBEC3A高温灭活处理是在脱氨基反应结束后对反应体系进行90℃10分钟的孵育，待反应温度冷却至室温可进行下一步操作；

(2)取上述100ng脱氨基样品进行聚合酶链式反应，对脱氨基的DNA片段进行扩增；聚合酶链式反应对DNA片段进行扩增；

(3)扩增后的样品直接进行Sanger测序。

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