EA004327B1

EA004327B1 - Способ амплификации последовательности нуклеиновой кислоты

Info

Publication number: EA004327B1
Application number: EA200100990A
Authority: EA
Inventors: Хироюки Мукаи; Юнко Ямамото; Осаму Такеда; Казуе Мияке; Такаси Уемори; Есими Сато; Марико Морияма; Харухиза Савараги; Митио Хагия; Киезо Асада; Икуносин Като
Original assignee: Такара Био. Инк.
Priority date: 1999-03-19
Filing date: 2000-03-14
Publication date: 2004-04-29
Also published as: CA2365135C; WO2000056877A1; CA2365135A1; DE60034878D1; EA200100990A1; AU2944200A; EA200300991A1; ATE362532T1; KR20010104720A; CN1227357C; AU773536B2; KR100682576B1; EP1167524A1; CN1350581A; TWI259204B; EP1167524A4; EA005577B1; DE60034878T2; JP3433929B2; EP1167524B1

Abstract

Удобный и эффективный способ амплификации последовательности нуклеиновой кислоты, отличающийся проведением реакции синтеза ДНК в присутствие химерных олигонуклеотидных праймеров; способ получения большого количества амплифицированных фрагментов ДНК; эффективный способ амплификации последовательности нуклеиновой кислоты на основе сочетания упомянутого выше способа с другим способом амплификации последовательности нуклеиновой кислоты; способ выявления последовательности нуклеиновой кислоты, предназначенный для выявления или количественного анализа микроорганизма, такого как вирус, бактерия, грибок или дрожжи; и способ выявления амплифицированного ДНК-фрагмента, полученного in situ с помощью указанного выше способа.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу синтеза ДНК, который применим в области генетической инженерии. Оно относится к способу амплификации нуклеотидной последовательности, служащей матрицей, и к способу выявления нуклеиновой кислоты, амплифицированной с помощью указанного способа.

Уровень техники

Синтез ДНК применяют для различных целей при исследованиях в области генетической инженерии. В большинстве случаев синтез ДНК, за исключением синтеза короткоцепочечных ДНК, таких как олигонуклеотид, осуществляют с помощью каталитических способов, в которых используют ДНК-полимеразу. Примером таких способов является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), подробно описанный в патентах США №№ 4683195, 4683202 и 4800159. Другим примером является метод ПЦР с ревертированием (с обратной транскрипцией) (ОТ-ПЦР), который представляет собой сочетание метода ПЦР и реакции обратной транскрипции, что описано в Тгепбк ίη Вю1есйпо1оду, 1992, 10, 146-152. Развитие упомянутых выше способов позволяет амплифицировать представляющий интерес участок из состава ДНК или РНК.

Упомянутые выше способы синтеза ДНК осуществляют, например, с использованием реакции, состоящей из трёх стадий. Тремя стадиями являются стадия диссоциации (денатурации) двухцепочечной ДНК на одноцепочечные ДНК, стадия отжига (присоединения) праймера на одноцепочечные ДНК и стадия синтеза (достройки) комплементарной цепи от праймера с целью амплификации интересующего участка ДНК. Как альтернатива, они могут быть осуществлены с использованием реакции, обозначаемой как «челночная ПЦР» («РСК йо 8а1/еп8еп» (Кесеп! Абуапсех ίη РСК те!йобо1оду: Ваис те!йобо1оду апб й'к аррйсайоп), Тапракикййкц Какикап Коико, Воккабки (Рго1еш, Ыис1е1с Ааб апб Еп/уте, 8ирр1етеп1), 41 (5), 425-428 (1996)), в которой две из трёх стадий, а именно стадию отжига и стадию достройки, проводят при одной и той же температуре.

Как альтернатива, могут быть использованы способ лигазной цепной реакции (ЛЦР) в соответствии с описанным в европейской патентной заявке ЕР 320-308, опубликованной 14 июня 1989 г., или транскрипционная амплификационная система (ΤΑ8), описанная в РСК Рго1осо1к, Асабетю Ргекк 1пс., 1990, рр. 245252. В четырёх способах, упоминавшихся выше, необходимым является повтор реакции при высокой температуре, а также несколько раз при низкой температуре с целью регенерации одноцепочечной молекулы-мишени для следующего цикла амплификации. Реакционная система должна быть реализована с использованием дискретных фаз или циклов, потому что реакция ограничена указанной выше температурой.

Таким образом, для таких способов необходимо использование дорогостоящего амплификатора («термоячейки»), который позволяет по ходу процесса быстро и точно корректировать температуру в широком диапазоне. Более того, в реакции требуется время для корректировки температуры до двух или трёх заранее определённых значений. Потери времени повышаются пропорционально числу циклов.

С целью решения указанных проблем были разработаны способы амплификации нуклеиновых кислот, которые можно проводить в изотермическом режиме. Их примерами являются способ амплификации с вытеснением (смещением) цепи (8ΌΑ) в соответствии с описанным в японской патентной заявке 1Р-В 7-114718, способ самоподдерживающейся репликации последовательности (38К), способ специфичной по конкретной последовательности амплификации нуклеиновой кислоты (ΝΑ8ΒΑ) в соответствии с описанным в японском патенте № 2650159, способ амплификации, опосредованной транскрипцией (ТМА), способ с репликазой Οβ в соответствии с описанным в японском патенте № 2710159 и различные модификации способа 8ΌΑ в соответствии с описанным в патенте США № 5824517 и международных патентных заявках XVО 99/09211, XVО 95/25180 и XVО 99/49081. Способ изотермического каталитического синтеза олигонуклеотида описан в патенте США № 5916777. В реакции в соответствии с данными способами изотермической амплификации нуклеиновых кислот или синтеза олигонуклеотида достройка с праймера и/или отжиг праймера на одноцепочечный продукт достройки (или на исходную последовательность-мишень) с последующей достройкой с праймера происходит «параллельно» в реакционной смеси, инкубируемой при постоянной температуре.

Среди способов изотермической амплификации нуклеиновых кислот способ 8ΌΑ является примером систем, в которых конечным результатом является амплификация ДНК. Способ 8ΌΑ представляет собой способ амплификации последовательности-мишени нуклеиновой кислоты (и комплементарной ей цепи) в образце за счёт вытеснения двойных цепей с использованием ДНК-полимеразы и рестриктазы. Способ требует использования четырёх праймеров для амплификации, два из которых должны быть сконструированы так, чтобы включать рестрикционные сайты для рестриктаз. Способ требует использования модифицированных дезоксирибонуклеотидтрифосфатов в качестве субстрата для синтеза ДНК в больших количествах. Примером модифицированных дезоксирибонуклеотидтрифосфатов является (а-8)-дезоксирибонуклеотидтрифосфат, в котором атом кислорода фосфатной группы по α-положению заменён на атом серы (8). Проблема текущих расходов, связанная с использованием модифицированного дезоксирибонуклеотидтрифосфата, становится серьёзной тогда, когда реакцию проводят как стандартную процедуру, например, при генетическом тестировании. Более того, включение модифицированного нуклеотида, такого как (α8)-дезоксирибонуклеотид, в состав амплифицированного фрагмента ДНК в данном способе может исключить отщепляемость амплифицированного фрагмента ДНК рестриктазой, например, если его подвергают анализу методом ПДРФ (выявление полиморфизма длин рестрикционных фрагментов).

Модифицированный способ 8ΌΆ в соответствии с описанным в патенте США № 5824517 представляет собой способ амплификации ДНК, в котором используют химерный праймер, который состоит из РНК и ДНК и который характеризуется ключевым структурным элементом, в котором ДНК располагается на самом 3'-конце. Модифицированный способ 8ΌΑ в соответствии с описанным в международной патентной заявке XVО 99/09211 требует использования рестриктазы, которая образует 5'-выступающий конец. Модифицированный способ 8ΌΑ в соответствии с описанным в международной патентной заявке νθ 95/25180 требует использования по крайней мере двух пар праймеров. Модифицированный способ 8ΌΑ в соответствии с описанным в международной патентной заявке νθ 99/49081 требует использования по крайней мере двух пар праймеров и по крайней мере одного модифицированного дезоксирибонуклеотидтрифосфата. С другой стороны, способ синтеза олигонуклеотида в соответствии с описанным в патенте США № 5916777 включает синтез ДНК с использованием праймера, имеющего на 3'-конце рибонуклеотид, завершение реакции с использованием праймера, внесение с помощью эндонуклеазы ника между праймером и достроенным праймером в составе достроенной с праймера цепи с целью её отделения, отщепление матрицы и выделение праймера для его повторного использования. Необходимым для данного способа является выделение праймера из реакционной системы и затем снова отжиг его на матрицу с целью повторного использования праймера.

Как было описано выше, стандартные способы изотермической амплификации нуклеиновых кислот создают ряд различных проблем. Следовательно, желательным является способ амплификации нуклеотидной последовательности при низкой стоимости расходов, в котором получают фрагмент ДНК, который может быть далее использован в генетической инженерии.

Объекты изобретения

Основным объектом настоящего изобретения является удобный и эффективный способ амплификации нуклеотидной последовательности, отличающийся тем, что реакцию синтеза ДНК проводят в присутствии олигонуклеотидного праймера, а также способ получения амплифицированного фрагмента ДНК в больших количествах для создания его запасов.

Сущность изобретения

В результате интенсивных исследований авторы настоящего изобретения сконструировали эффективную систему для реакции амплификации гена. Конструирование было осуществлено путём разработки способа, в котором представляющий интерес участок ДНК амплифицируют в присутствии химерного олигонуклеотидного праймера, включающего рибонуклеотид, расположенный на 3'-конце или со стороны 3'-конца, эндонуклеазы и ДНК-полимеразы. Таким образом, настоящее изобретение было завершено. Способ по настоящему изобретению был определён как способ изотермической амплификации нуклеиновой кислоты (ΙΟΑΝ) с использованием химерного праймера, который является способом амплификации нуклеотидной последовательности, в котором химерный олигонуклеотидный праймер используют в изотермических условиях.

Первый аспект настоящего изобретения касается способа амплификации нуклеотидной последовательности, характеризующегося тем, что способ включает (a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на З'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3 '-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (Ь), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи.

Второй аспект настоящего изобретения касается способа амплификации нуклеотидной последовательности с использованием по крайней мере двух праймеров, характеризующегося тем, что способ включает (а) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним прай мером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на З'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид;

(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (Ь), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (Ь);

(б) обработку высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (с), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который отличается от использованного на стадии (а) праймера, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причём праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (а), является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности вытесненной цепи и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на З'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(е) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (б), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (ί) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (е), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (е).

Способ по первому и второму аспектам настоящего изобретения может быть осуществлён в изотермических условиях. Нуклеотидная последовательность, служащая матрицей, может быть последовательностью ДНК. Стадия получения одноцепочечной кДНК в реакции обратной транскрипции с использованием обратной транскриптазы и РНК в качестве матрицы может быть выполнена до стадии (а) первого и второго аспектов. Одноцепочечная кДНК может быть использована в качестве нуклеотидной последовательности, служащей матрицей. И одноцепочечная ДНК, и двухцепочечная ДНК могут быть предпочтительно использованы в качестве ДНК-матрицы в первом и втором аспектах настоящего изобретения. Если в качестве матрицы используют двухцепочечную ДНК, то способ по настоящему изобретению может быть осуществлён после стадии предварительной обработки по денатурации двухцепочечной ДНК в одноцепочечные ДНК.

В названных выше аспектах достройку с праймера осуществляют с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи. ДНК-полимераза, выбранная из группы, которая включает фрагмент Клёнова ДНК-полимеразы I ЕксйейсШа сой, ДНКполимеразу Вк1 ВасШик 51еато1йегторЫ1ик, лишённую экзонуклеазной активности 5'^3', и ДНК-полимеразу Вса ВасШик са1бо!епах, лишённую экзонуклеазной активности 5'^3', может быть предпочтительно использована для настоящего изобретения. Дополнительно в качестве эндонуклеазы можно предпочтительно использовать эндорибонуклеазу. Эндорибонуклеазой, которую можно использовать, является, например, тем самым не ограничиваясь, РНКаза-Н.

Третий аспект настоящего изобретения касается способа амплификации нуклеотидной последовательности, характеризующегося тем, что способ включает (a) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную цепь, образованную от праймера, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой; и (b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.

Примером нуклеотидных последовательностей, служащих матрицами, которые можно использовать в третьем аспекте изобретения, является нуклеотидная последовательность, выбранная из группы, которая включает одноцепочечную ДНК, двухцепочечную ДНК, денатурированную на одноцепочечные ДНК, и кДНК, полученную в реакции обратной транскрипции на материале РНК. В состав реакционной смеси могут входить два или большее число химерных олигонуклеотидных праймеров. Предпочтительно в данном аспекте изобретения можно использовать ДНК-полимеразу, обладающую активностью по вытеснению цепи, и эндонуклеазу, использованные в первом и втором аспектах изобретения.

Праймер, использованный в первом, втором и третьем аспектах настоящего изобретения, является химерным олигонуклеотидным праймером. Например, может быть использован химерный олигонуклеотид, в структуре которого имеется по крайней мере один, предпочтительно два или большее число последовательно расположенных рибонуклеотидных остатков, присоединённых к 3'-концу или со стороны 3'конца праймера.

Матрицей, использованной в первомтретьем аспектах настоящего изобретения, может являться нуклеиновая кислота, которая заранее была амплифицирована с помощью способа амплификации нуклеиновых кислот. Например, способ ТЛБ, способ 3БК, способ ΝΑ8ΒΑ, способ ТМА, способ с репликазой Οβ. способ ПЦР, способ ЛЦР и способ 8ΌΑ может быть использован в качестве способа амплификации нуклеиновой кислоты, хотя могут быть использованы без какого-либо ограничения любые способы амплификации нуклеиновых кислот. Способ по настоящему изобретению может быть использован в сочетании с этими способами амплификации нуклеиновых кислот.

Случайный праймер или вырожденный праймер может быть использован в реакции амплификации нуклеиновой кислоты. Например, предпочтительно без каких-либо ограничений может быть использован праймер, имеющий случайную последовательность или вырожденную последовательность, находящуюся на самом З'-конце или со стороны З'-конца.

Четвёртый аспект настоящего изобретения касается химерного олигонуклеотидного праймера, который можно использовать в первомтретьем аспектах. Праймер отличается тем, что он включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид и обладает структурой, в которой рибонуклеотид располагается на З'-конце или со стороны З'-конца праймера. Например, может быть использован химерный олигонуклеотидный праймер, который включает по крайней мере один, предпочтительно два или большее число расположенных подряд остатков рибонуклеотидов и который обеспечивает достройку цепи ДНК от своего З'-конца. Такой праймер конструируют таким образом, чтобы он отщеплялся действием рибонуклеазы, такой как РНКаза-Н, по З '-концу рибонуклеотидного остатка.

Пятый аспект настоящего изобретения касается ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, эндонуклеазы и набора, который содержит их и используется в первом-третьем аспектах изобретения.

Шестой аспект настоящего изобретения касается способа выявления нуклеиновой кислоты-мишени, характеризующегося тем, что способ включает амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени с помощью способа амплификации нуклеотидной последовательности по первому-третьему аспектам настоящего изобретения с последующим выявлением нуклеиновой кислоты. Способы выявления включают способ, в котором нуклеиновую кислоту-мишень выявляют с использованием рибонуклеотидного (РНК) зонда, помеченного двумя или большим числом флуоресцентных красителей, расположенных на таком расстоянии, которое обеспечивает гашение сигнала.

Седьмой аспект настоящего изобретения касается ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, эндонуклеазы и набора, который содержит их, используемого в способе выявления нуклеиновой кислотымишени по шестому аспекту настоящего изобретения.

Восьмой аспект настоящего изобретения касается способа получения продукта, имеющего иммобилизованную нуклеиновую кислоту, на котором нуклеиновую кислоту располагают в заранее определённом участке, характеризующегося тем, что способ включает размещение и иммобилизацию нуклеиновой кислоты, амплифицированной с помощью способа амплификации нуклеотидной последовательности по первому-третьему аспектам настоящего изобретения, в заданном участке субстрата. В частности, предпочтительным является способ, в котором амплифицируют, размещают и иммобилизуют в заданном участке одноцепочечную нуклеотидную кислоту, которая, по существу, свободна от комплементарных ей последовательностей.

Девятый аспект настоящего изобретения касается продукта, имеющего иммобилизованную нуклеиновую кислоту, причём нуклеиновая кислота размещена в заданном участке и получена с помощью способа по восьмому аспекту настоящего изобретения. В частности, предпочтительным является продукт, имеющий иммобилизованную нуклеиновую кислоту, на котором размещают и иммобилизуют в заданном участке одноцепочечную нуклеиновую кислоту, которая, по существу, свободна от комплементарных ей цепей.

Десятый аспект настоящего изобретения касается способа выявления нуклеиновой кислоты-мишени в образце, характеризующегося тем, что в способе используют продукт, имеющий иммобилизованную нуклеиновую кислоту, причём нуклеиновая кислота размещена в заданном участке в соответствии с девятым аспектом настоящего изобретения, с целью выявления нуклеиновой кислоты, которая гибридизует с нуклеиновой кислотой, размещённой и иммобилизованной в заданном участке данного продукта.

Одиннадцатый аспект настоящего изобретения касается способа получения нуклеиновой кислоты в больших количествах, характеризующегося тем, что способ включает (a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на З'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (Ь), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи.

Двенадцатый аспект настоящего изобретения касается способа получения нуклеиновой кислоты в больших количествах с использованием по крайней мере двух праймеров, характеризующегося тем, что способ включает (a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеи новой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (Ь), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (Ь);

(6) обработку высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (с), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который отличается от использованного на стадии (а) праймера, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причём праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (а), является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности вытесненной цепи и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на З'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(е) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (6), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (1) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (е), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (е).

Тринадцатый аспект настоящего изобретения касается способа получения нуклеиновой кислоты в больших количествах, характеризующегося тем, что способ включает (а) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную цепь, образованную от праймера, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой; и (Ь) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.

Четырнадцатый аспект настоящего изобретения касается способа амплификации нуклеотидной последовательности, характеризующегося тем, что способ включает (a) амплификацию нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, предназначенную для амплификации, с помощью реакции амплификации нуклеиновой кислоты для получения нуклеиновой кислоты, служащей матрицей;

(b) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, полученной на стадии (а), по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(c) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (Ь), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (6) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (с), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи.

Пятнадцатый аспект настоящего изобретения касается способа амплификации нуклеотидной последовательности с использованием по крайней мере двух праймеров, характеризующегося тем, что способ включает (a) амплификацию нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, предназначенную для амплификации, с помощью реакции амплификации нуклеиновой кислоты для получения нуклеиновой кислоты, служащей матрицей;

(с) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (Ь), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид;

(6) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (с), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (с);

(е) обработку высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (6), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который отличается от праймера, использованного на стадии (Ь), и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причём праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (Ь), является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности вытесненной цепи и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(1) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (е), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (д) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (1), отщепляют с целью вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (1).

Шестнадцатый аспект настоящего изобретения касается способа амплификации нуклеотидной последовательности, характеризующегося тем, что способ включает (a) амплификацию нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, предназначенную для амплификации, с помощью реакции амплификации нуклеиновой кислоты для получения нуклеиновой кислоты, служащей матрицей;

(b) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служа щей матрицей, полученной на стадии (а), дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одной праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную цепь, образованную от праймера, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на З'-конце или со стороны З'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой; и (с) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.

В четырнадцатом-шестнадцатом аспектах настоящего изобретения нуклеиновую кислоту, включающую последовательность, которая должна быть амплифицирована, амплифицируют до проведения реакции амплификации нуклеиновой кислоты. После этого продукт амплификации используют в качестве нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, в способе по первому-третьему аспектам настоящего изобретения. Например, способ ΤΑ8, способ 38В, способ ΝΑ8ΒΑ, способ ТМА, способ с репликазой Οβ способ ПЦР, способ ЛЦР и способ 8ΌΑ могут быть использованы в качестве способа амплификации нуклеиновой кислоты, используемого в четырнадцатом-шестнадцатом аспектах, хотя любые способы амплификации нуклеиновой кислоты могут быть применены без какого-либо ограничения.

В реакции амплификации нуклеиновой кислоты можно использовать случайный праймер или вырожденный праймер. Например, предпочтительно может быть использован праймер, имеющий без какого-либо ограничения случайную последовательность или вырожденную последовательность на самом З'-конце или со стороны З'-конца.

Семнадцатый аспект настоящего изобретения касается способа амплификации нуклеотидной последовательности, характеризующегося тем, что способ включает (a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на З'-конце или со стороны З'-конца праймера;

(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеа зой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (с) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от З'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (Ь), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи.

Восемнадцатый аспект настоящего изобретения касается способа амплификации нуклеотидной последовательности с использованием по крайней мере двух праймеров, характеризующийся тем, что способ включает (a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на З'-конце или со стороны З'-конца праймера;

(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от З'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (Ь), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (Ь);

(ά) обработку высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (с), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который отличается от праймера, использованного на стадии (а), и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причём праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (а), является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности вытесненной цепи и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на З'-конце или со стороны З'-конца праймера;

(е) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (ά), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид;

(ί) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (е), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (е).

Девятнадцатый аспект настоящего изобретения касается способа амплификации нуклеотидной последовательности, характеризующегося тем, что способ включает (a) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную цепь, образованную от праймера, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера; и (b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.

Двадцатый аспект настоящего изобретения касается способа амплификации нуклеотидной последовательности, характеризующегося тем, что способ включает (a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на З'-конце или со стороны 3'-конца праймера, причём эндонуклеаза отщепляет по сайту, который включает рибонуклеотид;

Двадцать первый аспект настоящего изобретения касается способа амплификации нуклеотидной последовательности с использованием по крайней мере двух праймеров, характеризующегося тем, что способ включает (a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера, причём эндонуклеаза отщепляет по сайту, который включает рибонуклеотид;

(б) обработку высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (с), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который отличается от праймера, использованного на стадии (а), и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причём праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (а), является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности вытесненной цепи и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера, причём эндонуклеаза отщепляет по сайту, который включает рибонуклеотид;

Двадцать второй аспект настоящего изобретения касается способа амплификации нуклеотидной последовательности, характеризующегося тем, что способ включает (a) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную цепь, образованную от праймера, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, который по существу комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера, причём эндонуклеаза отщепляет по сайту, который включает рибонуклеотид; и (b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.

Двадцать третий аспект настоящего изобретения касается способа определения нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, характеризующегося тем, что способ включает амплификацию нуклеотидной последовательности в соответствии со способом по любому из первого-третьего и четырнадцатогодвадцать второго аспектов изобретения.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показана схема, иллюстрирующая пример способа по настоящему изобретению, в котором используют одноцепочечную ДНК. На фигуре высвобожденная цепь ДНК, обозначенная закрашенным кружочком, выполняет роль ДНК-матрицы для (6).

На фиг. 2 показаны результаты электрофореза в агарозном геле в отношении ДНКфрагментов, амплифицированных с помощью способа по настоящему изобретению при различном времени реакции.

Подробное описание изобретения

В данном тексте термин «дезоксирибонуклеотид» (также обозначаемый как άΝ) обозначает нуклеотид, сахарный компонент которого представлен Ό-2-дезоксирибозой. Дезоксирибонуклеотиды включают, например, те дезоксирибонуклеотиды, основаниями в которых являются аденин, цитозин, гуанин или тимин.

«Рибонуклеотид» (также обозначаемый как Ν) обозначает нуклеотид, сахарный компонент которого представлен Ό-рибозой. Рибо нуклеотиды включают, например, те рибонуклеотиды, основаниями в которых являются аденин, цитозин, гуанин или урацил. Рибонуклеотиды также включают модифицированные рибонуклеотиды, такие как модифицированный рибонуклеотид, в котором атом кислорода в составе фосфатной группы по α-положению заменён на атом серы (также обозначается как (а-Б)-рибонуклеотид или как (α-δ)-Ν), или другие производные.

«Химерный олигонуклеотидный праймер» обозначает праймер, который включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид. Праймер может включать немодифицированный дезоксирибонуклеотид и/или модифицированный дезоксирибонуклеотид. Как альтернатива, он может включать немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид.

Используемые в настоящем изобретении химерные олигонуклеотидные праймеры включают любой химерный олигонуклеотидный праймер, который включает рибонуклеотид, размещённый на 3'-конце или со стороны 3'конца праймера, может быть использован для достройки цепи нуклеиновой кислоты в способе по настоящему изобретению, может быть отщеплён эндонуклеазой и может быть использован для осуществления реакции вытеснения цепи.

Выражение «со стороны 3'-конца» указывает на участок от середины до 3'-конца нуклеиновой кислоты, такой как праймер. Таким же образом выражение «со стороны 5'-конца» указывает на участок от середины до 5'-конца нуклеиновой кислоты.

«Эндонуклеаза» может являться любой эндонуклеазой, которая действует на двухцепочечную ДНК, образованную в результате достройки ДНК от химерного олигонуклеотидного праймера, присоединённого к нуклеиновой кислоте, служащей матрицей, и которая специфическим образом отщепляет её по праймерному сегменту, включающему рибонуклеотид.

«ДНК-полимераза» обозначает фермент, который синтезирует цепь ДНК йе ηονο с использованием цепи ДНК в качестве матрицы. ДНК-полимеразой являются, тем самым не ограничиваясь, ДНК-полимераза ροϊ Ι-го типа (например, ДНК-полимераза I ЕксйепсЫа сой, фрагмент Клёнова и ДНК-полимераза Тад), ДНК-полимеразы α-типа (например, ДНКполимераза Ругососсик Гигюкик (§1га!адепе), ДНК-полимераза ΥΕΝΤ (№\ν Епд1апй Вю1аЬ5). ДНК-полимераза ΚΘΌ (ΤοуοЬο) и ДНКполимераза ИЕЕР νΕΝΤ (№\ν Епд1апй Вю1аЬ§)) и ДНК-полимеразы, не относящиеся к α-типу или ροϊΙ-типу (например, ДНК-полимераза в соответствии с описанным в международной патентной заявке XV О 97/24444). ДНКполимеразы, обладающие активностью по вытеснению цепи, включают ДНК-полимеразы термофильных бактерий рода ВасШик, таких как ВасШик са1бо!епах (здесь и далее обозначаемой как В.са) и ВасШик к1еагоШегторЫ1ик (здесь и далее обозначаемая как Β.κΐ), а также варианты этих ДНК-полимераз, утратившие свою 5'^3'экзонуклеазную активность. Более того, ДНКполимеразы с активностью по вытеснению цепи включают ДНК-полимеразы, например, фрагмент Клёнова, которые имеют активность по вытеснению цепи и не имеют 5'^3'экзонуклеазной активности. Кроме того, ДНКполимераза может являться смесью нескольких ДНК-полимераз, такой как без каких-либо ограничений смесь ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, и ДНКполимеразы, которая не имеет активности по вытеснению цепи.

Выражение «активность по вытеснению цепи» указывает на активность, которая может обусловливать вытеснение цепи, а именно активность, которая может обеспечивать удвоение ДНК на основе нуклеотидной последовательности, служащей матрицей, путём вытеснения цепи ДНК с высвобождением комплементарной цепи, которая была присоединена к цепиматрице. Кроме того, цепь ДНК, высвобожденная в результате вытеснения цепи с нуклеотидной последовательности, являющейся матрицей, обозначается здесь как «вытесненная цепь».

Далее настоящее изобретение будет описано подробно.

(1) Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в настоящем изобретении.

Праймер, используемый в способе по настоящему изобретению, является химерным олигонуклеотидным праймером, который включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид. Такие праймеры включают олигонуклеотидный праймер, который включает немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид.

Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в способе по настоящему изобретению, может быть любым химерным олигонуклеотидным праймером, имеющим нуклеотидную последовательность, которая, по существу, комплементарна части нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, который можно использовать для достройки цепи ДНК от его 3'-конца и который имеет сайт на 3'-конце или со стороны 3'конца, по которому эндонуклеаза отщепляет его в процессе реакции синтеза ДНК. Например, может быть использован химерный олигонуклеотидный праймер, включающий рибонуклеотид, размещённый на 3'-конце или со стороны 3'конца. Праймер обычно конструируют таким образом, чтобы он был комплементарен участку, расположенному выше сегмента, предназначенного для амплификации, т.е. участку, находящемуся с 3'-стороны нуклеотидной последо вательности, соответствующей сегменту, предназначенному для амплификации, в составе нуклеиновой кислоты, служащей матрицей. В данном тексте выражение «по существу комплементарная нуклеотидная последовательность» обозначает нуклеотидную последовательность, которая может соединиться с ДНК, являющейся матрицей, в используемых условиях проведения реакции. Такой химерный олигонуклеотидный праймер или олигонуклеотидный праймер может быть сконструирован специалистом в данной области техники в соответствии с известными процедурами, например, в соответствии со ссылкой на ЬаЬо Мапиа1 РСК (Такага Шшхо. рр. 13-16, 1996). Можно использовать имеющийся в продаже программный пакет для конструирования праймера, такой как компьютерная программа ОЫСО™ Рптег Апа1ук1к (Такага Шшхо).

Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в настоящем изобретении, может включать один или несколько модифицированных рибонуклеотидов. Рибонуклеотид может быть либо немодифицированным рибонуклеотидом, либо модифицированным рибонуклеотидом, который может быть размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца химерного олигонуклеотидного праймера и который распознаётся эндонуклеазой или отщепляется ею. Рибонуклеотиды включают и немодифицированный рибонуклеотид, и модифицированный рибонуклеотид в соответствии с описанным выше. Немодифицированный рибонуклеотид, модифицированный рибонуклеотид или их сочетание могут быть использованы для химерного олигонуклеотидного праймера по настоящему изобретению, лишь бы они не нарушали функцию праймера. Примерами модифицированных рибонуклеотидов являются, тем самым не ограничиваясь, (а-8)-рибонуклеотид, в котором атом кислорода, связанный с фосфатной группой, заменён на атом серы, и рибонуклеотид, в котором гидроксильная группа во 2 положении в составе рибозы заменена на метоксигруппу. Такой химерный олигонуклеотидный праймер, включающий модифицированный рибонуклеотид, может быть получен с использованием, например, (а-8)-рибонуклеотидтрифосфата, который получают с помощью способа, описанного в патенте США № 5003097, с использованием реагента для реакции сульфирования (С1еп Кекеагсй) или 2-ОМе-КЫА-СЕ-фосфоамидитного реагента (С1еп Кекеагсй).

Химерный олигонуклеотидный праймер, который можно использовать в способе амплификации по настоящему изобретению, может быть сконструирован так, чтобы он включал модифицированный рибонуклеотид, который обеспечивает устойчивость к отщеплению эндонуклеазой. Такой праймер применим для того, чтобы можно было контролировать сайт от щепления эндонуклеазой в процессе стадий реакции амплификации.

В способе по настоящему изобретению могут быть использованы один или два химерных олигонуклеотидных праймера, что зависит от желательной формы ДНК-фрагмента, получаемого в результате амплификации (одноцепочечного или двухцепочечного). В частности, один химерный олигонуклеотидный праймер используют тогда, когда желательной является одноцепочечная ДНК, в то время как два праймера используют тогда, когда желательной является двухцепочечная ДНК.

Длина химерного олигонуклеотидного праймера, используемого в способе по настоящему изобретению, конкретным образом не ограничивается, но предпочтительно составляет от примерно 12 нуклеотидов до примерно 100 нуклеотидов, более предпочтительно от примерно 15 нуклеотидов до примерно 40 нуклеотидов. Предпочтительно, чтобы нуклеотидная последовательность химерного олигонуклеотида была, по существу, комплементарна нуклеиновой кислоте, служащей матрицей, таким образом, чтобы он соединялся с нуклеиновой кислотой, служащей матрицей, при используемых условиях проведения реакции. Праймер включает последовательность, распознаваемую эндонуклеазой, которую используют на стадии, описанной далее, находящуюся на 3'-конце или со стороны З'-конца.

Например, олигонуклеотид, имеющий структуру, представляемую нижеследующей общей формулой, можно использовать в способе синтеза ДНК по настоящему изобретению в качестве праймера, хотя она и не призвана ограничить настоящее изобретение.

Общая формула: 5'-άΝ₃-Ν_Β-άΝ₀-3', где (а целое число от 11 или больше; Ь - 0 или целое число от 1 или больше; с - 0 или целое число от или больше, при условии, что Ь и с одновременно не могут быть равны 0; 6Ν - дезоксирибонуклеотид; Ν - немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид).

Например, в настоящем изобретении предпочтительно может быть использован химерный олигонуклеотидный праймер, представленный общей формулой, в которой «а» является целым числом 11 или больше; и «Ь» = 1 и «с» = 0, «Ь» = и «с» = 0, «Ь» = 3-5 и «с» = 0 или «Ь» = 2 и «с» = 0-5. Длина рибонуклеотидов на 3'-конце или со стороны 3'-конца химерного олигонуклеотидного праймера, используемого в способе по настоящему изобретению, предпочтительно является от мономерной до 15-мерной, более предпочтительно от мономерной до 10-мерной, наиболее предпочтительно от мономерной до пентамерной. Число «с» в базовой формуле конкретным образом не ограничивается, но можно выбрать любое число, которое может быть использовано в способе по настоящему изобретению. Обычно предпочтительным является 5 или меньше. Лучшие результаты получают в реакции, выбирая для «с» 3, нежели 4, выбирая 2, нежели 3, и выбирая 1, нежели 2. В частности, наиболее эффективно реакция может быть осуществлена в случае «с»=0.

Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в настоящем изобретении, имеет структуру, в которой эндонуклеаза отщепляет цепь ДНК, достроенную с праймера с использованием ДНК-полимеразы (достроенная с праймера цепь), по сайту, который включает рибонуклеотид. Другими словами, рибонуклеотид размещают на 3'-конце или со стороны 3'-конца химерного олигонуклеотидного праймера для отщепления эндонуклеазой. Например, когда РНКаза-Н действует на двухцепочечную ДНК, образованную в результате достройки ДНК с химерного олигонуклеотидного праймера, представленного общей формулой, который был присоединён к нуклеиновой кислоте, служащей матрицей, то химерный олигонуклеотидный праймер отщепляется по рибонуклеотидному участку. Затем получают двухцепочечную ДНК, в которую ник внесён между олигонуклеотидным праймером и цепью ДНК, синтезированной в результате достройки. Затем реакция вытеснения цепи с участием ДНК-полимеразы происходит от сайта внесённого ника. Таким образом, в способе по настоящему изобретению можно использовать любой химерный олигонуклеотидный праймер, который можно использовать для достройки цепи нуклеиновой кислоты от 3'конца праймера, который может быть отщеплён эндонуклеазой и с помощью которого ДНКполимераза может осуществлять реакцию вытеснения цепи.

Химерный олигонуклеотидный праймер может быть синтезирован так, чтобы иметь любую нуклеотидную последовательность, с использованием, например, ДНК-синтезатора модели 394 от фирмы Аррйеб Вю^уЧепъ 1пс. (АВ1) в соответствии с фосфоамидитным методом. Как альтернатива, любые способы, включая фосфотриэфирный метод, Н-фосфонатный метод и тиофосфонатный метод, могут быть использованы для синтеза химерного олигонуклеотидного праймера.

(2) Эндонуклеаза, используемая в настоящем изобретении.

Любая эндонуклеаза, которая действует на двухцепочечную ДНК, образованную в результате достройки ДНК с химерного олигонуклеотидного праймера в соответствии с описанным выше в (1), который был соединён с нуклеиновой кислотой, служащей матрицей, и которая отщепляет достроенную цепь, обеспечивая реакцию вытеснения цепи, может быть использована в настоящем изобретении. Таким образом, эндонуклеаза является ферментом, который создаёт ник (разрыв) на участке химерного олигонуклеотидного праймера в составе двухцепо чечной ДНК. Примерами эндонуклеаз, которые можно использовать в настоящем изобретении, являются, тем самым не ограничиваясь, рибонуклеазы. Среди них предпочтительно может быть использована эндорибонуклеаза-Н (РНКаза-Н), которая действует на РНК-часть двухцепочечной нуклеиновой кислоты, составленной ДНК и РНК. Любая рибонуклеаза, которая обладает указанными выше активностями, может быть предпочтительно использована в настоящем изобретении, включая мезофильные и устойчивые к нагреванию рибонуклеазы. Например, РНКаза-Н Е.сой может быть использована в реакции при температуре от примерно 50 до примерно 70°С в способе по настоящему изобретению в соответствии с описанным далее в примерах. Также предпочтительно можно использовать имеющуюся в продаже термоустойчивую рибонуклеазу термостабильную РНКазуН НуЬпйакс™ (ЕрюсШсг Тсс11по1ощск). Более того, рибонуклеаза может являться встречающейся в нативных условиях или быть вариантом. Единица каталитической активности указанной здесь РНКазы-Н представляет собой величину, определённую в соответствии со способом измерения единицы каталитической активности, описанном в сравнительных примерах.

Эффективность реакции отщепления с участием эндонуклеазы, такой как РНКаза-Н, используемой в способе по настоящему изобретению, может зависеть от нуклеотидной последовательности вблизи от 3'-конца праймера и влиять на эффективность амплификации желательной ДНК. Следовательно, вполне естественно конструировать праймер, оптимальный для используемой РНКазы-Н.

В данном тексте термин «внесение ника (разрыва)» или «никинг» обозначает внутреннее отщепление одной из двух цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Например, РНКаза-Н действует на гибридную двухцепочечную нуклеиновую кислоту, состоящую из ДНК и содержащей рибонуклеотиды ДНК, избирательным среди двух цепей образом расщепляя содержащую рибонуклеотид цепь на участке присутствия рибонуклеотидов, тем самым внося ник в гибридную двухцепочечную нуклеиновую кислоту.

(3) ДНК-полимераза, используемая в настоящем изобретении.

ДНК-полимераза, обладающая активностью по вытеснению цепи в ДНК, может быть использована в настоящем изобретении. В частности, предпочтительно может быть использована ДНК-полимераза, по существу, лишённая 5'та3'-экзонуклеазной активности.

Выражение «активность по вытеснению цепи» обозначает активность, которая может обеспечивать вытеснение цепи, т. е. тем самым может обеспечивать удвоение ДНК на основе нуклеотидной последовательности, служащей матрицей, путём вытеснения цепи ДНК с вы свобождением комплементарной цепи, которая была присоединена к цепи-матрице. Кроме того, цепь ДНК, высвобожденная в результате вытеснения цепи с нуклеотидной последовательности, являющейся матрицей, обозначается здесь как «вытесненная цепь».

В настоящем изобретении могут быть использованы любые ДНК-полимеразы, обладающие активностью по вытеснению цепи. Их примерами являются варианты ДНК-полимераз, лишённые 5'та3'-экзонуклеазной активности, происходящие от термофильных бактерий рода ВасШик, таких как ВасШик са1йо1спах (здесь и далее обозначается как «В.са») и ВасШик к1сагоШсгторЫ1ик (здесь и далее обозначается как «В.к1»), равно как и крупный фрагмент (фрагмент Клёнова) ДНК-полимеразы I Ексйсг1сЫа со11 (Е.со11). И мезофильные, и термоустойчивые ДНК-полимеразы могут быть предпочтительно использованы в настоящем изобретении.

В. са является термофильной бактерией, характеризующейся оптимальной температурой роста примерно 70°С. ДНК-полимераза В.са от этой бактерии известна, как обладающая ДНКзависимой ДНК-полимеразной активностью, РНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью (обратно-транскриптазной активностью), 5'та3'-экзонуклеазной активностью и 3'та5'экзонуклеазной активностью.

Фермент может быть либо ферментом, очищенным из его оригинального источника, либо рекомбинантным белком, полученным с использованием методов генетической инженерии. Фермент может быть подвергнут модификации, такой как замена, делеция, добавление или вставка, с применением методов генетической инженерии или иных способов. Примером модифицированных ферментов являются ДНКполимераза Вса ВЕ8Т (Такага 811ихо). которая является ДНК-полимеразой Вса, лишённой 5'та3'-экзонуклеазной активности.

(4) Состав реакционного буфера, используемого в настоящем изобретении.

Реакционный буфер, который содержит буферный компонент, соль магния и άΝΤΡκ, используют в настоящем изобретении. Примерами буферных компонентов, которые предпочтительно можно использовать, являются, тем самым не ограничиваясь, трицин, Трисгидрохлорид и фосфат (такой как фосфат натрия и фосфат калия). Среди них предпочтительным для настоящего изобретения является буфер, который содержит трицин или фосфат в качестве буферного компонента. Конечная концентрация буферного компонента находится в диапазоне 5-100 мМ, предпочтительно 20-50 мМ. Диапазон рН составляет 6,0-9,5, предпочтительно 7,0-9,2. Например, предпочтительно используют буфер, содержащий 22-46 мМ трицина, при рН=7,5-9,2 или буфер, содержащий 25-50 мМ фосфата калия, при рН=7,0-8,0. Примерами солей магния, которые можно предпочтительно использовать, являются, тем самым не ограничиваясь, хлорид магния, ацетат магния или сульфат магния. Конечная концентрация соли магния находится в диапазоне 1-20 мМ, предпочтительно 2-10 мМ. Конечная концентрация άΝΤΡδ (άΑΤΡ, астр, астр и аТТР) в смеси, являющихся субстратами для реакции достройки ДНК, находится в диапазоне 0,1-3,0 мМ, предпочтительно 0,2-1,2 мМ. Содержание праймеров, используемых в реакционном объёме 50 мкл, составляет 1-1000 пкмоль, предпочтительно 10-100 пкмоль. Кроме того, реакционная смесь может содержать добавки, обеспечивающие, например, стабилизацию реакции амплификации.

Могут быть добавлены БСА в конечной концентрации 0,1% или меньше, диметилсульфоксид в конечной концентрации 10% или меньше, путресцина дигидрохлорид в конечной концентрации 4 мМ или меньше или пропилендиамин в концентрации 0,01% или меньше. Как альтернатива, могут включаться ΝΜΡ (1-метил-

2- пирролидинон), глицерин, полиэтиленгликоль, диметилсульфоксид и/или формамид. Ожидается, что добавление таких органических растворителей снижает неспецифический отжиг олигонуклеотидных праймеров.

Количество РНКазы-Н Ε.οοίί, являющейся примером эндонуклеаз, в реакционном объёме 50 мкл находится в диапазоне предпочтительно

3- 200 ед., более предпочтительно 15-60 ед. Количество ДНК-полимеразы Вса ΒΕ8Τ, являющейся примером ДНК-полимераз, в реакционном объёме 50 мкл составляет предпочтительно 0,5-100 ед., более предпочтительно 1-22 ед. Предпочтительно количество единиц эндонуклеазы в этих диапазонах может варьироваться в зависимости от её типа. В таком случае состав буфера и количество фермента, которое необходимо добавить, корректируют таким образом, чтобы количество продукта амплификации достигало максимума. В любом случае естественной является оптимизация состава реакционного буфера и подобного с учётом типа используемого фермента.

(5) Способ амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению.

Способ по настоящему изобретению может быть осуществлён с использованием по крайней мере одного олигонуклеотидного праймера в соответствии с описанным выше в (1) в сочетании с эндонуклеазой в соответствии с описанным выше в (2) и ДНК-полимеразой в соответствии с описанным выше в (3). аКТРк, используемые в методе ПЦР или подобном (смесь аАТР, аСТР, астр и аТТР), могут быть предпочтительно использованы в качестве нуклеотидтрифосфатов, служащих субстратами для реакции достройки в данном способе. аКТРк могут включать аналог а№ТР, такой как 7-деазааСТР, лишь бы он выполнял роль субстрата для используемой ДНК-полимеразы. В данном способе используют химерный олигонуклеотидный праймер. Праймер может быть получен, например, с использованием ДНК-синтезатора в соответствии со стандартным методом синтеза. В способе по настоящему изобретению можно использовать сочетание химерного олигонуклеотидного праймера и нормального олигонуклеотидного праймера.

Нуклеиновая кислота (ДНК или РНК), используемая в качестве матрицы в способе по настоящему изобретению, может быть получена или выделена из любого образца, который может содержать нуклеиновую кислоту. Примерами образцов, которые могут содержать нуклеиновую кислоту, являются, тем самым не ограничиваясь, образцы, взятые от организмов, такие как цельная кровь, сыворотка, лейкоцитарная плёнка, моча, фекалии, спинно-мозговая жидкость, семенная жидкость, слюна, ткань (например, раковая ткань или лимфатический узел) и клеточная культура (например, культура клеток млекопитающего или бактериальная клеточная культура), образцы, которые содержат нуклеиновую кислоту, такие как вироид, вирус, бактерия, грибок, дрожжи, растение и животное, образцы, для которых предполагается загрязнение или инфицирование микроорганизмом, таким как вирус или бактерия (например, пища или биологический препарат), и образцы, которые могут содержать организм, такие как почва и сточные воды. Образец может являться препаратом, содержащим нуклеиновую кислоту, полученным в результате обработки образцов, описанных выше, в соответствии с известным методом. Примерами препаратов, которые можно использовать в настоящем изобретении, являются продукт разрушения клеток или образец, полученный в результате фракционирования продукта, нуклеиновая кислота из образца или конкретные молекулы нуклеиновых кислот, такие как образец, обогащённый по содержанию мРНК. Более того, предпочтительно может быть использована нуклеиновая кислота, такая как ДНК или РНК, полученная в результате амплификации нуклеиновой кислоты, содержащейся в образце, с помощью известных способов.

Препарат, содержащий нуклеиновую кислоту, может быть приготовлен из упоминавшихся выше материалов с помощью, например, лизиса действием детергента, ультразвука, встряхивания/перемешивания со стеклянными шариками или французского пресса без какихлибо ограничений. В некоторых случаях предпочтение имеет дополнительная обработка препарата с целью очистки нуклеиновой кислоты (например, в случае, когда имеется эндогенная эндонуклеаза). В таких случаях нуклеиновую кислоту очищают с помощью известных методов, таких как фенольная экстракция, хромато графия, ион-обменные реакции, гельэлектрофорез или центрифугирование в градиенте плотности.

Когда желательно амплифицировать нуклеиновую кислоту, имеющую последовательность, производную от РНК, способ по настоящему изобретению может быть осуществлён с использованием в качестве матрицы кДНК, синтезированной в реакции обратной транскрипции, в которой РНК используется в качестве матрицы.

Любая РНК, для которой можно сформировать праймер для реакции обратной транскрипции, может быть использована в способе по настоящему изобретению, включая молекулы РНК, такие как тотальная РНК, мРНК, тРНК и рРНК в образце, равно как и конкретные виды РНК.

Любой праймер, который соединяется с РНК, служащей матрицей, в используемых условиях реакции, может быть использован в реакции обратной транскрипции. Праймер может являться праймером, характеризующимся нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна конкретной РНК, служащей матрицей (специфичный праймер), олиго-дТ (олиготиминовым) праймером и праймером, имеющим случайную последовательность (случайный праймер). С точки зрения специфичности отжига длина праймера для обратной транскрипции составляет предпочтительно 6 нуклеотидов или больше, более предпочтительно 9 нуклеотидов или больше. С точки зрения синтеза олигонуклеотидов длина предпочтительно составляет 100 нуклеотидов или меньше, более предпочтительно 30 нуклеотидов или меньше.

Кроме того, химерный олигонуклеотидный праймер можно использовать в качестве праймера для обратной транскрипции. Химерный олигонуклеотидный праймер также можно использовать в качестве праймера для реакции вытеснения цепи в способе амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению с использованием кДНК, полученной в результате обратной транскрипции, в качестве матрицы. Такой праймер может быть любым праймером, который обладает свойствами, описанными выше в (1), и который можно использовать в реакции обратной транскрипции на материале РНК.

В реакции обратной транскрипции может быть использован любой фермент, который обладает активностью по синтезу кДНК с использованием РНК в качестве матрицы. Их примерами являются обратные транскриптазы, происходящие от различных источников, такие как обратная транскриптаза, происходящая от вируса миелобластоза птиц (ОТаза АМУ), обратная транскриптаза, происходящая от вируса лейкоза Молони мышей (ОТаза ММЬУ), и обратная транскриптаза вируса-2, ассоциированного с вирусом саркомы Рауса (ОТаза КА.У-2). Кроме того, может быть использована ДНКполимераза, которая также обладает обратнотранскриптазной активностью. Предпочтительным для настоящего изобретения является фермент, обладающий обратно-транскриптазной активностью при высокой температуре, такой как ДНК-полимераза бактерии рода Тйегшик (например, ДНК-полимераза Т1Н) и ДНКполимераза термофильной бактерии рода ВасИ1и8. Например, предпочтительны ДНК-полимеразы термофильных бактерий рода Васй1и8, такие как ДНК-полимераза В. 81 (ДНК-полимераза В81) и ДНК-полимераза Вса (ДНК-полимераза Вса), хотя это не призвано ограничить настоящее изобретение. Например, для ДНКполимеразы Вса необязательно присутствие иона магния для реакции обратной транскрипции. Более того, она может синтезировать кДНК, подавляя при этом образование вторичной структуры РНК, служащей матрицей, в условиях высокой температуры. И встречающийся в нативных условиях, и вариантный фермент, обладающий обратнотранскриптазной активностью, может быть использован, лишь бы он проявлял такую активность.

При амплификации нуклеиновой кислоты в способе по настоящему изобретению представляющая интерес нуклеиновая кислота может быть более эффективно амплифицирована путём предварительной амплификации нуклеиновой кислоты, служащей матрицей. Например, когда амплифицируют нуклеотидную последовательность, присутствующую в геномной ДНК в следовых количествах, то ДНК-фрагмент, включающий интересующую нуклеотидную последовательность, сначала амплифицируют с помощью подходящего способа амплификации нуклеиновых кислот. Полученный таким образом амплифицированный ДНК-фрагмент затем используют в качестве матрицы для осуществления способа амплификации по настоящему изобретению. Стадия первой амплификации может быть осуществлена с помощью способа по настоящему изобретению. Как альтернатива, её можно осуществить с помощью известного способа амплификации нуклеиновых кислот, такого как метод ПЦР. Более того, специфическая нуклеотидная последовательность может быть добавлена со стороны 5'-конца праймера, предназначенного для использования на стадии амплификации. Когда фрагмент, амплифицированный с использованием такого праймера, используют в качестве матрицы, способ амплификации по настоящему изобретению может быть осуществлён с использованием химерного олигонуклеотидного праймера, имеющего конкретную нуклеотидную последовательность, добавленную к указанному выше праймеру. Другими словами, возможно осуществить стадию амплификации нуклеиновой кислоты в соответствии со способом по настоящему изобретению, на которой ПЦР-амплифицированный ДНК фрагмент используют в качестве матрицы, с использованием общего химерного олигонуклеотидного праймера, независимо от нуклеотидной последовательности участка, предназначенного для амплификации. Это осуществляют путём сочетания способа по настоящему изобретению и ПЦР с использованием праймера, включающего конкретную нуклеотидную последовательность, добавленную со стороны 5'конца в соответствии с описанным выше.

Обычно необходимо сформировать пару праймеров, специфичных для интересующей нуклеотидной последовательности, с целью специфичной амплификации последовательности на первой стадии амплификации нуклеиновой кислоты. Однако нуклеиновая кислота, служащая матрицей, может быть амплифицирована без использования праймера, специфичного для интересующей нуклеотидной последовательности, путём использования случайного праймера, который амплифицирует фрагменты нуклеиновой кислоты по неспецифичному типу, или использования пары праймеров, выбранных из набора уже имеющихся вырожденных праймеров. Число пар праймеров, необходимых для амплификации множества нуклеиновых кислот, служащих матрицами, может быть сокращено. Сокращение обеспечивают путём использования, например, метода ПЦР со случайным праймером, включающим последовательностьметку (М.1с1с1с Лабк Векеагск, 1996, 24 [19], 3778-3783), или метода ПЦР с праймированием вырожденными праймерами (ВП-ПЦР: Сепоппск, 1992, 13, 718-725), в котором используется вырожденный праймер с последовательностью-меткой. Каждый из таких праймеров включает случайную последовательность или вырожденную последовательность на 3'-конце. Если способ амплификации по настоящему изобретению осуществляют с использованием в качестве матрицы нуклеиновой кислоты, амплифицированной с помощью праймера, имеющего последовательность-метку, то способ по настоящему изобретению может быть осуществлён с использованием одного химерного олигонуклеотидного праймера. Такой химерный олигонуклеотидный праймер характеризуется нуклеотидной последовательностью, идентичной таковой у последовательности-метки. За счёт использования такого праймера все нуклеиновые кислоты, которые были амплифицированы с использованием праймера, имеющего такую же последовательность-метку, используют в качестве матриц. Следовательно, различные нуклеотидные последовательности могут быть получены при очень низкой стоимости и в больших количествах путём сочетания способа по настоящему изобретению со способом амплификации нуклеиновых кислот, в котором используют случайный праймер или вырожденный праймер.

Любая ДНК-полимераза, которая синтезирует цепь ДНК бе ηονο с использованием цепи ДНК в качестве матрицы, может быть использована в способе амплификации нуклеиновой кислоты. Такими ДНК-полимеразами являются ДНК-полимеразы ро1 Ι-типа (например, ДНКполимераза I Е.сой, фрагмент Клёнова и ДНКполимераза Тад), ДНК-полимеразы α-типа (например, ДНК-полимераза Ругососсик Гипокик, ДНК-полимераза ΥΕΝΤ, ДНК-полимераза ΚΟΌ и ДНК-полимераза ΌΕΕΡ νΕΝΤ) и ДНКполимеразы, не относящиеся к α- или ро11типам (например, ДНК-полимераза, описанная в международной патентной заявке νΟ 97/24444). Кроме того, предпочтительно может быть использована смесь по крайней мере двух ДНК-полимераз, таких как ДНК-полимераза ТаКаВа Ех Тад (Такага 811ихо) или ДНКполимераза КОЭ-бакк (ТоуоЬо). Более того, предпочтительно могут быть использованы ДНК-полимеразы, такие как ДНК-полимераза В.са, ДНК-полимераза В.81, варианты этих ДНКполимераз, лишённые своей 5' ^3'экзонуклеазной активности, ДНК-полимераза 9°Ν, ДНК-полимераза РГи (экзо-) (81га1адепе), ДНК-полимераза НИ (ТоуоЬо) и ДНКполимераза ТГ1 (Рготеда).

Если линейный фрагмент ДНК (например, ПЦР-амплифицированный фрагмент) используют в способе амплификации по настоящему изобретению в качестве матрицы, то включение последовательности, сконструированной в качестве спейсерного участка, может повышать эффективность амплификации. Спейсерный участок расположен между 3'-концом линейного ДНК-фрагмента, являющегося матрицей, и сайтом отжига на 5'-конце праймера, использованного в способе по настоящему изобретению. Например, предпочтительным является конструирование праймера для способа амплификации по настоящему изобретению таким образом, чтобы длина спейсерного участка составляла без какого-либо ограничения от 1 до примерно 70 нуклеотидов, более предпочтительно примерно от 5 до примерно 60 нуклеотидов. Предпочтительное число нуклеотидов в спейсерном участке может варьироваться в зависимости от последовательности праймера, предназначенного для способа амплификации по настоящему изобретению. Оптимальный спейсерный участок может быть определён в соответствии с описанным в примерах настоящей заявки. Фрагмент, предварительно амплифицированный с помощью, например, ПЦР, таким образом, что спейсерный участок добавлен с 3'-стороны к участку отжига амплификационного праймера по настоящему изобретению, может быть использован в качестве матрицы в способе амплификации по настоящему изобретению. В одном варианте нуклеиновую кислоту, служащую матрицей, амплифицируют заранее с использовани ем праймера. Такой праймер в ориентации 5'^3' имеет сегмент спейсерного участка, сегмент амплификационного праймера по настоящему изобретению и сегмент другого праймера для амплификации нуклеиновой кислоты. Амплифицированный таким образом фрагмент может быть затем использован в качестве матрицы в способе амплификации по настоящему изобретению. Сегмент другого праймера для амплификации нуклеиновой кислоты может являться любым сегментом праймера для способа амплификации нуклеиновой кислоты, такого как метод ПЦР. Как альтернатива, сегмент другого праймера для амплификации нуклеиновой кислоты может являться сегментом другого амплификационного праймера по настоящему изобретению.

И двухцепочечная ДНК, такая как выделенная геномная ДНК или ПЦР-фрагмент, и одноцепочечная ДНК, такая как кДНК, полученная в реакции обратной транскрипции на материале тотальной РНК, или мРНК могут быть предпочтительно использованы в качестве ДНК-матрицы в настоящем изобретении. Предпочтительно двухцепочечную ДНК используют после её денатурации на одноцепочечные ДНК.

Стадия денатурации может быть исключена из способа амплификации по настоящему изобретению, если в качестве матрицы используют линейную двухцепочечную ДНК, такую как ПЦР-амплифицированный продукт. Исключение может быть осуществлено размещением сайта отжига праймера по настоящему изобретению примерно на 50 нуклеотидах внутрь от конца ДНК. Если должна быть амплифицирована нуклеиновая кислота, характеризующаяся последовательностью РНК, то реакция обратной транскрипции с использованием РНК в качестве матрицы и реакция амплификации ДНК с использованием в качестве матрицы кДНК, полученной в реакции обратной транскрипции, могут быть осуществлены с одной ДНКполимеразой в способе синтеза ДНК по настоящему изобретению. Такая ДНК-полимераза обладает обратно-транскриптазной активностью и активностью по вытеснению цепи.

Подходящей длиной матрицы является такая длина, которая обеспечивает достаточное связывание праймерной последовательности вследствие присутствия полной последовательности-мишени или, по крайней мере, достаточной части последовательности-мишени в составе фрагмента.

Если ДНК, служащая матрицей, является двухцепочечной ДНК, то такую ДНК денатурируют на одноцепочечные ДНК, чтобы обеспечить связывание праймера с цепью ДНК, служащей матрицей, в способе по настоящему изобретению. Предпочтительным для денатурации является выдерживание двухцепочечной ДНК при температуре, при которой она денатурируется (например, при примерно 95°С). Другими подходами являются такие, при которых используют повышение рН. В этом случае величина рН должна быть снижена с целью обеспечения связывания олигонуклеотидного праймера с мишенью в реакции амплификации. Нуклеотидная последовательность последовательно амплифицируется в изотермических условиях после денатурации двухцепочечной ДНК на одноцепочечные ДНК или, если в качестве матрицы используют РНК, после получения кДНК (одноцепочечной ДНК) в реакции обратной транскрипции.

«Последовательно» означает то, что реакция проходит без изменения температуры реакции или состава реакционной смеси. Понятие «изотермические» указывает на условия по существу постоянной температуры, при которой фермент и цепь нуклеиновой кислоты функционируют на каждой стадии.

Не ограничиваясь какой-либо теорией, предусматривается, что следующие стадии последовательно и повторяющимся образом протекают параллельно (например, в изотермических условиях) в способе амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению:

[1] стадия отжига ДНК, служащей матрицей, по крайней мере на один олигонуклеотидный праймер;

[2] стадия осуществления реакции достройки ДНК, которая комплементарна ДНКматрице, от 3'-конца праймера;

[3] стадия отщепления цепи ДНК, достроенной на стадии [2], действием эндонуклеазы;

[4] стадия осуществления реакции достройки ДНК от 3'-конца сайта отщепления стадии [3], при том, что высвобождение цепи ДНК, достроенной на стадии [2], происходит без отделения от ДНК, служащей матрицей; и [5] стадия повтора стадии [3] и стадии [4] с использованием двухцепочечного полинуклеотида, полученного на стадии [4].

Упоминавшаяся выше реакция может быть проведена при нормальной температуре (например, 37°С) с использованием мезофильной ДНК-полимеразы, такой как фрагмент Клёнова. Она также может быть проведена при высокой температуре (например, 50°С или выше или 60°С или выше) с использованием термостабильного фермента (эндонуклеазы и ДНКполимеразы). В этом случае неспецифический отжиг праймера подавлен, в результате чего повышается специфичность амплификации ДНК. Более того, решается проблема формирования вторичной структуры ДНК, являющейся матрицей, результатом чего является повышение способности к достройке у ДНКполимеразы. В одном варианте реакция обратной транскрипции и амплификация нуклеотидной последовательности могут быть проведены последовательно в данном способе. В этом случае ДНК, имеющая последовательность, произ водную от РНК, может быть амплифицирована путём объединённого использования обратной транскриптазы с упомянутой выше реакцией или путём использования ДНК-полимеразы, обладающей обратно-транскриптазной активностью.

Первым аспектом настоящего изобретения является способ амплификации нуклеотидной последовательности с использованием одноцепочечной ДНК в качестве матрицы и по крайней мере одного химерного олигонуклеотидного праймера.

Этот способ амплификации нуклеотидной последовательности включает (a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен части нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймером является химерный олигонуклеотидный праймер, включающий дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на З'-конце или со стороны З'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от З'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, в которой достроенная с праймера цепь, полученная на стадии (Ь), отщеплена с обеспечением эффекта вытеснения цепи.

Вторым аспектом настоящего изобретения является способ амплификации нуклеотидной последовательности с использованием одноцепочечной ДНК в качестве матрицы и по крайней мере двух химерных олигонуклеотидных праймеров по настоящему изобретению.

Этот способ амплификации нуклеотидной последовательности с использованием по крайней мере двух праймеров включает (а) обработку нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен части нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на З'-конце или со стороны З'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от З'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (Ь), отщепляют с целью обеспечения эффекта вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (Ь);

(ά) обработку высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (с), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который отличается от праймера, использованного на стадии (а), и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причём праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (а), является химерным олигонуклеотидным праймером, который по существу комплементарен части нуклеотидной последовательности вытесненной цепи и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на З'конце или со стороны З'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(е) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (ά), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (ί) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от З'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (е), отщепляют с целью достижения эффекта вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (е).

Третьим или четвёртым аспектом настоящего изобретения является способ, в котором амплификацию нуклеотидной последовательности в соответствии с первым или вторым аспектом проводят с использованием в качестве матрицы одноцепочечной ДНК, полученной после стадии предварительной денатурации двухцепочечной ДНК на одноцепочечные ДНК.

Пятым или шестым аспектом настоящего изобретения является способ, в котором амплификацию нуклеотидной последовательности в соответствии с первым или вторым аспектом проводят с использованием в качестве матрицы кДНК, полученной после стадии синтеза одноцепочечной кДНК в реакции обратной транскрипции, используя РНК в качестве матрицы.

В данном тексте выражение «регенерированная достроенная с праймера цепь» обозначает цепь ДНК, комплементарную нуклеотидной последовательности, служащей матрицей, которая достроена от олигонуклеотидного праймера, заново используемого для удвоения, являющегося результатом вытеснения цепи.

Термин «повторное использование» обозначает то, что двухцепочечную ДНК, составленную нуклеотидной последовательностью матрицы и регенерированной достроенной с праймера цепью, используют снова на стадии вытеснения цепи.

В каждом из упоминавшихся выше аспектов настоящего изобретения химерный олигонуклеотидный праймер, который комплементарен одноцепочечной ДНК, служащей матрицей, сначала отжигают на ДНК. ДНК, которая комплементарна ДНК-матрице (достроенная с праймера цепь), затем достраивают вдоль оставшейся последовательности ДНК-матрицы, начиная от З'-конца праймера, за счёт действия ДНК-полимеразы с целью синтеза двухцепочечной ДНК. Эндонуклеаза действует на двухцепочечную ДНК, расщепляя её по сайту со стороны З'-конца рибонуклеотидной части химерного олигонуклеотидного праймера. Эндонуклеаза не расщепляет ДНК по другим сайтам. Таким образом, эндонуклеаза действует как никвносящий фермент, который вносит ник («одноцепочечный разрыв») в двухцепочечную ДНК. Эндонуклеаза способна изменять структуру двухцепочечной ДНК, составленной химерным олигонуклеотидным праймером и ДНК, служащей матрицей, хотя настоящее изобретение не ограничено какой-либо теорией. ДНКполимераза, обладающая активностью по вытеснению цепи, повторно достраивает цепь ДНК от З'-конца ника, внесённого в двухцепочечную ДНК, в результате чего образуется новая достроенная с праймера цепь, приводя к высвобождению ДНК вниз от З'-конца ника. Следовательно, новая достроенная с праймера цепь замещает ранее синтезированную достроенную с праймера цепь.

Способ амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению может быть осуществлён с использованием двух праймеров, а именно химерного олигонуклеотидного праймера, который комплементарен нуклеиновой кислоте, являющейся матрицей, и другого химерного олигонуклеотидного праймера, который комплементарен вытесненной цепи. В этом случае один праймер связывается с цепью ДНК, являющейся матрицей, инициируя реакцию вытеснения цепи, в то время как другой праймер связывается с вытесненной цепью, высвобожденной в результате реакции вытеснения цепи, инициируя следующую реакцию вы теснения цепи. Ясно, что продукт реакции, проводимой с одним праймером, может служить матрицей для другого праймера в случае использования данного аспекта изобретения. Таким образом, количество продукта амплификации возрастает в нелинейной зависимости по мере возрастания количества матрицы.

В случае, когда способ амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению осуществляют с использованием в качестве матрицы двухцепочечной ДНК, химерный олигонуклеотидный праймер, четыре дезоксирибонуклеотидтрифосфата (άΝΤΡδ), ДНК-полимеразу и эндонуклеазу добавляют в реакционную смесь перед денатурацией двухцепочечной ДНК или после неё. Если для денатурации двухцепочечной ДНК используют нагревание и при этом не используют теплоустойчивый фермент, то предпочтительно добавлять фермент после проведения денатурации.

Как было описано выше в (2), эндонуклеаза для использования в способе должна быть выбрана таким образом, чтобы она отщепляла цепь по рибонуклеотидному сайту праймера. Предпочтительно цепь отщепляют по З'-сайту рибонуклеотида. Необходимо выбрать ДНКполимеразу так, чтобы она с подходящей скоростью диссоциировала цепь ДНК, в которую был внесён ник.

ДНК-полимераза, используемая в настоящем изобретении, должна синтезировать достроенную цепь от сайта ника в направлении З', тем самым вытесняя ранее достроенную цепь ДНК. Важно, чтобы ДНК-полимераза не проявляла экзонуклеазной активности 5'^З', которая могла бы разрушить вытесненную цепь. Например, фрагмент Клёнова, который представляет собой дефицитный по экзонуклеазной активности вариант ДНК-полимеразы I Ε.οοΙί, сходный фрагмент, происходящий от ДНК-полимеразы Βδΐ (№\ν Епд1ап6 В1о1аЬ§), и ДНК-полимераза Вса ВЕ8Т от В.са (Такага 81ιιιζο) применимы в качестве такой ДНК-полимеразы. Также могут быть использованы 8ес.|иепа5е 1.0 и Бссщспахс 2.0 (ИпИеб 81а1е§ ВюсйешкаЦ а также ДНКполимераза фага Т5 и ДНК-полимераза фага φ29 в соответствии с описанным в Сепе, 97, 1З19 (1991). Полимераза, которая в норме обладает экзонуклеазной активностью, может быть использована в способе синтеза ДНК по настоящему изобретению, если включение подходящего ингибитора сможет подавить такую активность.

Способ амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению может быть осуществлён при различной температуре или он может быть осуществлён в изотермических условиях. Варьирование температур означает, что температура реакции изменяется на соответствующих стадиях таким образом, что такое изменение не препятствует реак циям на этих стадиях. В частности, варьирующиеся температуры указывают на изменение до такой температуры, которая подходит, например, для каждого этапа отжига праймера, реакции синтеза комплементарной цепи, внесения ника в комплементарную цепь и реакции вытеснения цепи.

С другой стороны, изотермия означает, что температура реакции на каждой из стадий остаётся неизменной, и каждую стадию осуществляют, по существу, при постоянной температуре. В обоих случаях естествен выбор такой температуры, которая является оптимальной для условий проведения реакции.

Одним из свойств способа амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению является то, что способ не требует повышающей и понижающей корректировки температуры в ходе синтеза нуклеиновой кислоты. Следовательно, настоящее изобретение представляет способ изотермического синтеза нуклеотидной последовательности. Многие из стандартных способов амплификации нуклеиновых кислот требуют повышающей и понижающей корректировки температуры с целью диссоциации мишени от синтезированной цепи. В этих способах для решения такой задачи необходимо специальное оборудование, такое как амплификатор («термоячейка»). Однако способ по настоящему изобретению может быть осуществлён с использованием только такого оборудования, которое поддерживает постоянную температуру.

Как было описано выше, способ по настоящему изобретению может быть осуществлён при одной и той же температуре. Предпочтительно его осуществляют путём выбора температуры реакции и степени жёсткости таким образом, чтобы неспецифический отжиг праймера был снижен, и таким образом, чтобы праймер специфически соединялся с нуклеотидной последовательностью, служащей матрицей. Хотя это и не призвано в чём-либо ограничить настоящее изобретение, способ по настоящему изобретению может быть осуществлён при условиях высокой температуры с использованием термоустойчивого фермента в соответствии с описанным выше.

Кроме того, предпочтительно осуществлять способ по настоящему изобретению при температуре, подходящей для сохранения достаточной активности используемого фермента с целью поддержания эффективности реакции на высоком уровне. Так, температура реакции предпочтительно составляет примерно от 20 до примерно 80°С, более предпочтительно от примерно 30 до примерно 75°С, наиболее предпочтительно от примерно 50 до примерно 70°С, хотя это варьируется в зависимости от используемого фермента. Когда реакцию осуществляют при условиях высокой температуры, в частности, предпочтительно использовать более длинный праймер, чем тот, который используется в реакции при нормальной температуре. Последовательность и длина праймера, подходящие для температуры реакции, можно определить, например, с учётом величины Тт. Как альтернатива, для конструирования праймера можно использовать имеющиеся в продаже программные продукты, такие как программа ОЫОО™ Рптег Лпа1у818 (Такага δΐιιιζο). Например, когда используют температуру реакции от 55 до 60 или 65°С, то праймер, используемый в способе по настоящему изобретению, может, например, иметь без какого-либо ограничения длину 12-100 нуклеотидов, предпочтительно 1450 нуклеотидов в длину, более предпочтительно 15-40 нуклеотидов в длину. Примером эффекта, обусловливаемого повышением температуры реакции, является решение проблемы образования вторичной структуры у ДНК, служащей матрицей. Повышенная температура реакции обеспечивает амплификацию желательной нуклеиновой кислоты, даже если в качестве матрицы используется нуклеиновая кислота с высоким содержанием пары ОС. Более того, это в одинаковой степени эффективно при амплификации длинноцепочечного участка. Такой эффект наблюдается в диапазоне от примерно 100 п.н. до примерно 20 т.п.н., в частности от примерно 200 п.н. до примерно 4,3 т.п.н., более конкретно от примерно 250 п.н. до примерно 1500 п.н.

Использование ДНК-полимеразы, обладающей обратно-транскриптазной активностью (например, ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т), в способе по настоящему изобретению делает осуществимой стандартным образом амплификацию нуклеотидной последовательности на материале РНК, которая включает стадию получения кДНК на матрице РНК (в реакции обратной транскрипции). Как альтернатива, продукт, полученный на независимо проведённой стадии получения кДНК на матрице РНК, т. е. кДНК, может быть использован в способе по настоящему изобретению в качестве ДНК, служащей матрицей.

В каждом случае реакцию в способе по настоящему изобретению повторяют до тех пор, как её останавливают подходящим путём, например, с помощью инактивации фермента или снижения температуры реакции, или до тех пор, как в реакции не закончится один из реагентов.

На фиг. 1 показан один вариант, в котором используют одноцепочечную ДНК в качестве матрицы и два праймера. Соответствующие стадии, которые проводят последовательно, описаны далее:

(1) стадия отжига одноцепочечной ДНК, служащей матрицей, на химерный олигонуклеотидный праймер;

(2) стадия осуществления реакции достройки ДНК от 3'-конца праймера с образованием достроенной с праймера цепи;

(3) стадия отщепления эндонуклеазой по сайту праймера, который включает рибонуклеотид;

(4) стадия осуществления вытеснения цепи с использованием ДНК-полимеразы от сайта отщепления стадии (3);

(5) стадия повторного использования двухцепочечной ДНК, которая составлена матрицей, полученной на стадии (4), и регенерированной достроенной с праймера цепью стадии (3), с последующим использованием высвобожденной вытесненной цепи в реакции на стадии (6) и последующих стадиях;

(6) стадия отжига олигонуклеотидного праймера, который отличается от праймера стадии (1), на высвобожденную вытесненную цепь стадии (5), служащую матрицей;

(7) стадия осуществления реакции достройки ДНК от 3'-конца праймера с образованием достроенной с праймера цепи;

(8) стадия отщепления эндонуклеазой по сайту праймера, который включает рибонуклеотид;

(9) стадия осуществления вытеснения цепи с использованием ДНК-полимеразы от сайта отщепления стадии (8); и (10) стадия повторного использования матрицы, полученной на стадии (9), и регенерированной достроенной с праймера цепи стадии (8).

В случае, когда в качестве матрицы используют двухцепочечную ДНК, каждая из одноцепочечных ДНК, полученных после денатурации двухцепочечной ДНК, служит матрицей для стадии (1). Следовательно, количество продукта амплификации больше, чем то количество, которое получают при использовании в качестве матрицы одноцепочечной ДНК. Кроме того, выявление продукта амплификации может быть осуществлено за более короткое время по сравнению с тем временем, которое требуется при использовании в качестве матрицы одноцепочечной ДНК.

Способ амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению может быть использован в различных экспериментальных процедурах, в которых используется амплификация нуклеотидной последовательности, включая выявление, мечение и секвенирование нуклеиновых кислот.

Более того, способ амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению может быть использован в способе амплификации нуклеиновой кислоты ίη δίΐιι, в способе амплификации нуклеиновой кислоты на твёрдом субстрате, таком как ДНК-чип, или в способе множественной амплификации нуклеиновых кислот, в котором одновременно амплифицируется значительное число сегментов.

Одним из свойств способа амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению является способность полу чать в нём одноцепочечную ДНК. Для данной цели в способе можно использовать один или два химерных олигонуклеотидных праймера. Например, если используются два олигонуклеотидных праймера, то способ по настоящему изобретению может быть осуществлён с применением отношения праймеров в соответствии с использованием т.н. способа «асимметричной ПЦР», в котором реакцию амплификации проводят с использованием избыточного количества одного олигонуклеотидного праймера по отношению ко второму. В результате количество продукта, вытесненного с одной цепи, становится выше по сравнению с продуктом другой цепи.

В соответствии со способом амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению может быть получена одноцепочечная ДНК, по существу свободная от цепи, которая ей комплементарна. Например, одноцепочечная ДНК для получения продукта, имеющего иммобилизованную нуклеиновую кислоту, такого как ДНК-чип, одноцепочечный ДНК-зонд для выявления нуклеиновой кислотымишени или мегапраймер для метода ПЦР длинных цепей могут быть легко получены за короткое время. Избирательным образом только смысловая последовательность или антисмысловая последовательность могут быть амплифицированы с использованием способа по настоящему изобретению. Следовательно, настоящее изобретение применимо в качестве способа получения нуклеиновой кислоты, имеющей смысловую последовательность или антисмысловую последовательность.

Более того, способы амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению не требуют использования оборудования для реакции, которое может корректировать температуру в зависимости от времени. Следовательно, реакцию амплификации можно проводить в большом объёме реакционной смеси. Это значит, что нуклеиновая кислота (например, для медицинского применения) может быть получена в больших количествах на промышленном уровне.

Эффективность использования праймера, используемого в способе амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению, составляет примерно 100%, что может быть в 5-10 раз выше, чем в стандартном способе, таком как метод ПЦР.

(6) Набор для способа амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение представляет набор, используемый в способе амплификации нуклеотидной последовательности по первомушестому аспектам, описанным выше. В одном варианте набор представлен в упакованной форме и содержит инструкции, касающиеся использования ДНК-полимеразы и эндонуклеазы в реакции вытеснения цепи. Также набор, который содержит ДНК-полимеразу, обладающую активностью по вытеснению цепи, эндонуклеазу и буфер для реакции вытеснения цепи, предпочтительно используют в способе по настоящему изобретению. Как альтернатива, имеющаяся в продаже ДНК-полимераза, обладающая активностью по вытеснению цепи, и/или эндонуклеаза могут быть выбраны и использованы в соответствии с инструкциями. Кроме того, набор может содержать реагент для реакции обратной транскрипции, который используют тогда, когда роль матрицы выполняет РНК. ДНК-полимераза может быть выбрана из ДНК-полимераз, предназначенных для использования в настоящем изобретении в соответствии с описанным выше в (3). Эндонуклеаза может быть выбрана из эндонуклеаз в соответствии с описанным выше в (2). Буфер реакции, характеризующийся композицией, описанной выше в (4), может предпочтительно быть использован в качестве буфера для реакции вытеснения цепи.

«Инструкциями» является печатный материал, описывающий способ использования набора, например, способ приготовления раствора реагента для реакции вытеснения цепи, рекомендуемые условия реакции и подобное. Инструкции включают руководство в форме брошюры или листовки, этикетку к набору и описание на поверхности упаковки, в которой находится набор. Инструкции также включают информацию, предоставляемую электронными средствами связи, такими как Интернет.

(7) Способ выявления нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению и набор для этого способа.

Нуклеиновая кислота-мишень в образце может быть выявлена с использованием способа амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению. Способ выявления включает (a) амплификацию нуклеиновой кислотымишени с помощью способа амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению в соответствии с описанным выше; и (b) выявление нуклеиновой кислотымишени, амплифицированной на предыдущей стадии.

Способ может быть использован для выявления или количественной оценки конкретного гена в образце. Другими словами, конкретный ген может быть выявлен или количественно оценен во всех образцах, в которых предполагается присутствие нуклеиновой кислоты, такой как ДНК или РНК. Примерами образцов, в которых конкретный ген может быть выявлен или количественно оценен, являются, тем самым не ограничиваясь, образцы из организмов, такие как цельная кровь, сыворотка, лейкоцитарная плёнка, моча, фекалии, спинномозговая жидкость, семенная жидкость, слюна, ткань (напри мер, раковая ткань или лимфатический узел) и клеточная культура (например, культура клеток млекопитающего или культура бактериальных клеток), образцы, которые содержат нуклеиновую кислоту, такие как вироид, вирус, бактерия, грибок, дрожжи, растение и животное, образцы, которые, как предполагается, загрязнены или инфицированы микроорганизмом, таким как вирус или бактерия (например, пища или биологический препарат), и образцы, которые могут содержать организм, такие как почва или сточные воды. Например, вироид, вирус, грибок, бактерия или другой микроорганизм в образце могут быть выявлены или количественно оценены на основании присутствия или содержания конкретного гена, являющегося мишенью, происходящего от вироида, вируса, грибка, бактерии или других микроорганизмов. Более того, способ по настоящему изобретению может быть использован для определения генотипа организма или для определения уровня экспрессии гена. Предпочтительно в способе выявления и РНК, и ДНК могут быть использованы в качестве нуклеиновой кислоты, служащей матрицей.

Известные способы выявления нуклеиновой кислоты могут быть использованы на стадии (Ь). Примерами таких способов являются выявление продукта реакции, имеющего конкретный размер, с помощью электрофореза и выявление с помощью гибридизации с зондом. Флуоресцентное вещество, такое как бромистый этидий, используют для выявления с помощью электрофореза. Гибридизация с зондом может быть объединена с электрофоретическим выявлением. Зонд может быть помечен радиоактивным изотопом или нерадиоактивным веществом, таким как биотин или флуоресцирующее вещество. Кроме того, использование помеченного нуклеотида на стадии (а) может облегчить выявление продукта амплификации. Для выявления можно использовать метод флуоресцентной поляризации, метод переноса энергии флуоресценции или подобное. Нуклеиновая кислота-мишень может быть выявлена автоматически или количественно оценена с помощью создания подходящей системы выявления.

Рибонуклеотидный (РНК) зонд, помеченный двумя или несколькими флуоресцирующими веществами, расположенными на расстоянии, обеспечивающем эффект гашения флуоресценции, могут быть использованы в способе выявления по настоящему изобретению. Зонд не флуоресцирует. Когда проводят его отжиг на ДНК, амплифицированную с нуклеиновой кислоты-мишени, которая комплементарна зонду, РНКаза-Н расщепляет зонд. В результате расстояние между флуоресцирующими веществами в зонде увеличивается, что приводит к флуоресценции. Следовательно, флуоресценция указывает на присутствие нуклеиновой кислотымишени. Если РНКаза-Н используется в способе амплификации нуклеотидной последовательно сти по настоящему изобретению, то нуклеиновая кислота-мишень может быть выявлена только при добавлении зонда в реакционную смесь. Например, сочетание флуоресцентных веществ 6-карбоксифлуоресцеина (6-ЕЛМ) и Ν,Ν,Ν',Ν'тетраметил-6-карбоксиродамина (ТЛМКЛ) может быть предпочтительно использовано для мечения зонда.

Способ амплификации нуклеотидной последовательности в изотермических условиях по настоящему изобретению не требует использования такого оборудования как амплификатор. Число праймеров, используемых в способе амплификации по настоящему изобретению, может составлять один или два, что меньше того, что используется в стандартном способе. Поскольку такие реагенты, как 6ΝΤΡ5. используемые в ПЦР и подобных методах, могут быть использованы в способе по настоящему изобретению, то расходы могут быть снижены по сравнению со стандартным способом. Следовательно, способ по настоящему изобретению предпочтительно может быть использован в области, включающей генетическое тестирование, в котором проводят рутинное выявление. Способ по настоящему изобретению предоставляет большее количество амплифицированного продукта за более короткое время по сравнению с методом ПЦР. Следовательно, способ по настоящему изобретению может быть использован в качестве удобного, быстрого и чувствительного способа выявления гена.

Далее настоящее изобретение представляет набор, используемый в способе выявления нуклеиновой кислоты-мишени. Набор для способа амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению в соответствии с описанным выше может быть использован в качестве указанного набора. Набор может дополнительно содержать олигонуклеотидный праймер для амплификации нуклеиновой кислоты-мишени и реагент для выявления амплифицированной нуклеиновой кислотымишени, являющейся зондом.

(8) Продукт по настоящему изобретению, имеющий иммобилизованную нуклеиновую кислоту, размещённую в заданном участке, и способ его получения.

ДНК-чип (также называемый микроматрицей ДНК или матрицей ДНК) является продуктом, несущим иммобилизованную нуклеиновую кислоту, на котором различные фрагменты генов или ДНК размещены и иммобилизованы в заданном участке или в заранее определённых положениях на твёрдом субстрате, таком как предметное стекло. ДНК-чип используют для анализа присутствия нуклеиновой кислоты в образце нуклеиновых кислот, характеризущейся последовательностью, которая комплементарна размещённой и иммобилизованной ДНК на заданном участке ДНК-чипа. Анализ проводят путём контактирования ДНК-чипа с образцом нуклеиновых кислот, приготовленным для гибридизации на материале образца, предпочтительно образца помеченных нуклеиновых кислот. Поскольку ДНК-чип может быть использован для выявления или количественного анализа ряда нуклеиновых кислот в образце в одной процедуре, то он является весьма эффективным средством, которое в значительной степени ускоряет анализ экспрессии генов или анализ мутаций или полиморфизма. ДНК-чип, на котором в заданном участке размещена и иммобилизована двухцепочечная ДНК, используют для гибридизации после того, как его подвергают соответствующей денатурации. ДНК-чип, на котором в заданном участке размещена и иммобилизована одноцепочечная ДНК, комплементарная нуклеиновой кислоте-мишени, которую предстоит выявить, является конкретно предпочтительным для выявления нуклеиновой кислоты-мишени.

Как было описано выше, желательная ДНК может быть амплифицирована в одноцепочечной форме с помощью способа по настоящему изобретению. Хотя может быть использован любой способ очистки продукта амплификации, предпочтительной является очистка с помощью преципитации изопропанолом. Полученную таким путём ДНК, предпочтительно одноцепочечную ДНК, которая, по существу, свободна от комплементарной ей цепи, предпочтительно можно использовать в качестве ДНК-фрагмента, который необходимо иммобилизовать на ДНКчип. Таким образом, способ по настоящему изобретению предпочтительно используется в качестве способа получения ДНК, предназначенной для размещения и иммобилизации в заданном участке с целью конструирования ДНКчипа. Любой нерастворимый субстрат можно использовать в качестве субстрата, на котором полученную таким путём ДНК размещают и иммобилизуют в заданном участке, но предпочтительно используют имеющий плоскую поверхность субстрат, изготовленный из стекла или пластмассы, и субстрат в форме мембраны, изготовленный из нитроцеллюлозы или нейлона. Известный способ иммобилизации нуклеиновых кислот можно использовать для иммобилизации. ДНК может быть иммобилизована на субстрат так, как она есть. Как альтернатива, ДНК может быть иммобилизована с помощью подходящего линкера или после лигирования нескольких молекул ДНК.

Нуклеиновая кислота-мишень, которая гибридизует с нуклеиновой кислотой на продукте, имеющим иммобилизованную нуклеиновую кислоту, на котором ДНК, амплифицированная с помощью способа по настоящему изобретению, размещена и иммобилизована в заданном участке (например, ДНК-чип), может быть выявлена или оценена количественно. Такие выявление или количественная оценка могут быть осуществлены путём контактирования с целью гибридизации продукта с образцом нуклеиновых кислот, приготовленным на материале образца, для которого предполагается присутствие нуклеиновой кислоты. В связи с этим ДНК-чип, на котором одноцепочечная ДНК, амплифицированная с помощью способа по настоящему изобретению, размещена и иммобилизована в заданном участке, обеспечивает выявление нуклеиновой кислоты-мишени с большим удобством процедуры, более высокой чувствительностью и более высокой воспроизводимостью данных по сравнению со стандартным продуктом.

(9) Способ получения нуклеиновой кислоты в больших количествах по настоящему изобретению.

В соответствии с описанным выше один из аспектов настоящего изобретения представляет способ амплификации нуклеотидной последовательности, который может быть осуществлён в изотермических условиях. Желательная нуклеиновая кислота может быть получена с помощью данного способа путём смешивания нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей для нуклеиновой кислоты, которая должна быть амплифицирована, с различными компонентами, необходимыми для реакции, и проведения реакции в смеси при изотермических условиях. Поскольку метод ПЦР требует изменения температуры реакционной смеси в зависимости от времени, то объём реакции ограничен таким объёмом, в котором можно контролировать температуру (обычно 200 мкл или меньше). Следовательно, трудно промасштабировать объём в сторону увеличения. С другой стороны, такого ограничения не существует в способе по настоящему изобретению. Большое количество нуклеиновой кислоты может быть получено путём увеличения объёма реакционной смеси. В способе по настоящему изобретению ряд молекул комплементарной цепи синтезируют с одной молекулы-матрицы. Более того, нуклеиновые кислоты могут быть синтезированы с использованием таких молекул комплементарных цепей, взятых в качестве матриц. Следовательно, желательная нуклеиновая кислота может быть эффективно выработана в больших количествах путём соответствующего подбора матрицы и праймера. Помимо того, тот факт, что, в отличие от метода ПЦР, способ по настоящему изобретению не требует специального оборудования или сложного цикла изменений температуры, делает такой способ преимущественным с точки зрения стоимости оборудования и затрат энергии. Следовательно, способ является прекрасным промышленным способом получения нуклеиновой кислоты в больших количествах.

Более того, способ по настоящему изобретению применим в качестве способа предоставления ряда ДНК-фрагментов в больших количествах, таких как количества, необходимые для иммобилизации на ДНК-чип. В частности, фрагменты ДНК могут быть получены в больших количествах в простых стадиях реакций одного варианта. В другом варианте ограниченное число праймеров может быть использовано для получения ряда фрагментов ДНК. Стадия предварительной амплификации нуклеиновой кислоты, которая служит матрицей в способе по настоящему изобретению, с помощью известного способа амплификации нуклеиновых кислот, такого как метод ПЦР, может быть включена в последний вариант. Все типы нуклеиновых кислот, являющихся матрицами, могут быть амплифицированы с использованием ограниченного числа праймеров, например, основываясь на способе амплификации нуклеиновых кислоты с использованием случайного праймера, включающего последовательность-метку (Νυс1е1с Αοΐάδ Кекеагсй, 1996, 24 (19), 3778-3783), или на способе олигонуклеотид-праймируемой ПЦР (ЭОР-ПЦР: Сепоткк, 1992, 13, 718-725), в котором используют вырожденный праймер. Способ амплификации по настоящему изобретению может быть осуществлён с использованием одного или нескольких праймеров для всех нуклеиновых кислот, служащих матрицами, полученных на упомянутой выше стадии. Это можно осуществить путём конструирования праймера, используемого в способе по настоящему изобретению, таким образом, чтобы он соответствовал последовательности-метке, добавляемой к случайному или вырожденному праймеру. Следовательно, сочетание подходящей стадии получения нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей, и способа по настоящему изобретению может предоставить ряд фрагментов ДНК в больших количествах при меньшей стоимости по сравнению со стандартным способом.

Фармацевтическая композиция, содержащая нуклеиновую кислоту, может содержать двухцепочечную ДНК для экспрессии полезного полипептида в клетке или одноцепочечную антисмысловую ДНК для подавления экспрессии интересующего гена. Такую нуклеиновую кислоту вводят в организм с использованием подходящего средства, например, носителя для переноса гена, такого как липосома. Способ получения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению является предпочтительным для получения в больших количествах одноцепочечной или двухцепочечной нуклеиновой кислоты, предназначенной для медицинского применения. Кроме того, нуклеиновая кислота, включающая аналог 6№ГР, который, например, подавляет разрушение нуклеиновой кислоты т У1уо, может быть легко получена с помощью способа по настоящему изобретению.

Поскольку ДНК-фрагмент, амплифицированный в настоящем изобретении, составлен нормальными нуклеотидами, то амплифицированная ДНК может быть субклонирована в состав подходящего вектора с использованием рестрикционного сайта в составе ДНК. Более того, ДНК без каких-либо проблем может быть обработана рестриктазой, например, с целью выявления ПДРФ. Следовательно, ДНК может быть широко использована в области генетического тестирования. Поскольку фрагмент ДНК, амплифицированный в настоящем изобретении, составлен нормальными нуклеотидами, то промоторная последовательность для РНКполимеразы может быть встроена в состав амплифицированного фрагмента. Амплифицированный фрагмент может быть использован в качестве матрицы для синтеза РНК, которую можно использовать в качестве, например, зонда. Понятно, что флуоресцентным образом помеченный ДНК-зонд может быть получен путём осуществления способа амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению с использованием флуоресцентно помеченного 6ΝΤΡ вместо нормального 6ΝΤΡ.

Поскольку фрагмент, в конечном счёте амплифицированный в способе по настоящему изобретению, не имеет нуклеотидной последовательности, комплементарной амплификационному праймеру по обоим его концам, то может быть снижено загрязнение из-за переноса амплификационного продукта. Следовательно, способ по настоящему изобретению применим в генетическом тестировании и подобном, где такой же участок амплифицируется стандартным образом.

Свойства способа амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению перечислены ниже.

1. Он способен амплифицировать большое количество нуклеиновой кислоты из малого количества матрицы. При использовании двух праймеров количество амплифицированного продукта возрастает в квадратичной зависимости.

2. Он может быть проведён в изотермических условиях. В этом случае для него не требуется использование такого оборудования, как амплификатор. Следовательно, объём реакции может быть легко промасштабирован в сторону увеличения.

3. Обычно реакцию амплификации осуществляют с использованием одного или двух химерных олигонуклеотидных праймеров и двух ферментов (ДНК-полимеразы и эндонуклеазы).

4. Поскольку несколько цепей ДНК синтезируется с одной молекулы праймера, то количество праймера не ограничивает количество амплификационного продукта. Более того, эффективность использования праймера равна примерно 100%, что намного выше, чем в методе ПЦР.

5. Исходя из конкретной цели, избирательным образом может быть амплифицирована одноцепочечная или двухцепочечная ДНК.

6. Поскольку нет необходимости в использовании аналога 6ΝΤΡ, такого как (α-δ)-άΝΤΡ, для реакции амплификации, то стоимость реагентов низка. Более того, может быть получена нуклеиновая кислота в нативной форме, т.е. без аналога 6ΝΤΡ в составе.

7. Он может предоставить амплифицированный фрагмент ДНК при низкой себестоимости и в больших количествах путём сочетания способа по настоящему изобретению с другим способом амплификации нуклеиновых кислот.

Как было описано выше, способ по настоящему изобретению пригоден для получения нуклеиновой кислоты в промышленном масштабе.

Примеры

Нижеследующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение более подробно, но не призваны ограничить его объем.

Референсный пример.

Величина единицы активности РНКазы-Н, использованной в способе по настоящему изобретению, была определена в соответствии со следующим способом.

(1) Приготовление использованных растворов реагентов.

Реакционная смесь для определения активности. Следующие вещества при указанных конечных концентрациях содержались в стерильной воде: 40 мМ Трис-гидрохлорида (рН=7,7 при 37°С), 4 мМ хлорида магния, 1 мМ дитиотреитола (ДТТ), 0,003% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 4% глицерина и 24 мкМ поли-άΤ.

Раствор поли[8-³Н]адениловой кислоты: раствор 370 кБк поли[8-³Н]адениловой кислоты растворяли в 200 мкл стерильной воды.

Раствор полиадениловой кислоты: полиадениловую кислоту растворяли до концентрации 3 мМ в стерильной сверхчистой воде.

Раствор разведения фермента. Следующие вещества при указанных конечных концентрациях содержались в стерильной воде: 25 мМ Трис-гидрохлорида (рН=7,5 при 37°С), 5 мМ 2меркаптоэтанола, 0,5 мМ ЭДТА (рН=7,5 при 37°С), 30 мМ хлорида натрия и 50% глицерина.

Приготовление денатурированной нагреванием ДНК вилочковой железы телёнка: 200 мг ДНК вилочковой железы телёнка суспендировали и переливали в 100 мл буфера ТЕ. Раствор разбавляли до концентрации 1 мг/мл стерильной сверхчистой водой, исходя из уровня поглощения, измеренного в УФ при 260 нм. Разведённый раствор нагревали до 100°С на 10 мин и затем быстро охлаждали на ледяной бане.

(2) Способ измерения активности.

мкл раствора поли[8-³Н]адениловой кислоты добавляли к 985 мкл реакционной смеси для определения активности, приготовленной в (1) выше. Смесь инкубировали при 37°С в течение 10 мин. 8 мкл полиадениловой кислоты добавляли к смеси до достижения конечной концентрации 24 мкМ. Далее смесь инкубировали при 37°С в течение 5 мин. В результате было получено 1000 мкл реакционной смеси поли[8³Н]гА-поли-аТ. Затем 200 мкл реакционной смеси инкубировали при 30°С в течение 5 мин. К полученному добавляли 1 мкл соответствующего серийного разведения фермента. В течение времени по 50 мкл каждого из образцов отбирали из реакционной смеси для использования в последующем измерении. Время в минутах после добавления фермента к образцу определяли как «Υ». 50 мкл реакционной смеси для общей величины СРМ или для «пустого» контроля приготавливали добавлением 1 мкл раствора разведённого фермента вместо раствора фермента. К образцу добавляли 100 мкл 100 мМ пирофосфата натрия, 50 мкл раствора денатурированной нагреванием ДНК вилочковой железы телёнка и 300 мкл 10%-ной трихлоруксусной кислоты (300 мкл сверхчистой воды для измерения общего СРМ). Смесь инкубировали в течение 5 мин при 0°С и затем центрифугировали при 10000 об./мин в течение 10 мин. После центрифугирования 250 мкл полученной в результате надосадочной фракции помещали в ёмкость. К этому добавляли 10 мл Ас.|иа5о1-2 (ΝΕΝ Ь1£е ЗсЬепсе Ргоаис18). СРМ (имп/мин) определяли с помощью жидкостного сцинтилляционного счётчика.

(3) Подсчёт единиц.

Величину единиц активности для каждого фермента подсчитывали в соответствии со следующим уравнением:

Ед./мл = {(измеренный СРМ - контрольный СРМ) х 1,2* х 20 х 1000 х уровень разведения} 200 (мкл)/(общий СРМ х Υ (минуты) х 50 (мкл) х 9**)

1,2* - количество наномолей поли[8-³Н]гАполи-аТ, содержащихся в общих СРМ, в расчёте на 50 мкл.

9** - коэффициент корреляции.

Пример 1.

(1) Синтез ДНК-матрицы и праймеров.

Одноцепочечная ДНК из 99 нуклеотидов, являющаяся матрицей, и праймеры, используемые в данном примере, были синтезированы с использованием ДНК-синтезатора (Аррйеа ΒίοхуЧепъ). Нуклеотидная последовательность одноцепочечной ДНК из 99 нуклеотидов показана в 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ 1 списка последовательностей. Основные нуклеотидные последовательности прямого праймера и обратного праймера показаны в 8ЕЦ ГО ΝΟ 2 и 3 списка последовательностей соответственно. Структура праймеров, использованных в данном примере, описана далее подробно.

Пара праймеров 1: комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕЦ ГО ΝΟ 2 или 3 списка последовательностей, и полностью состоящих из дезоксирибонуклеотидов;

пара праймеров 2: комбинация праймеров, в которых первый и второй дезоксрибонуклеотиды с 3'-конца заменены рибонуклеотидами, а фосфатная связь со стороны 5'-конца второго с 3'-конца рибонуклеотида заменена на фосфотиоатную связь в каждом из праймеров в составе пары праймеров 1;

пара праймеров 3: комбинация праймеров, в которой дезоксирибонуклеотид на 3'-конце заменён рибонуклеотидом, а фосфатная связь со стороны 5'-конца рибонуклеотида заменена фосфотиоатную связь в каждом из праймеров в составе пары праймеров 1;

пара праймеров 4: комбинация праймеров, в которых первый и второй дезоксирибонуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды в каждом из праймеров в паре праймеров 1; и пара праймеров 5: комбинация праймеров, в которых третий и четвёртый дезоксирибонуклеотиды от 3'-конца заменены на рибонуклеотиды, а фосфатная связь со стороны 5'-конца четвёртого рибонуклеотида 3'-конца заменена на фосфотиоатную связь в каждом из праймеров в составе пары праймеров 1.

(2) Реакция амплификации.

ДНК-полимеразу Вса ВЕ8Т (Такага 81шхо). которая является ДНК-полимеразой, не имеющей экзонуклеазной 5'^3'-активности, от ВасШц8 са1ао!епах, и клонированную рибонуклеазу-Н (Такага ЗИн/о), которая является РНКазойН Е.со11, использовали для анализа реакционных систем в моделях 1-7, описанных далее.

Реакционную смесь приготавливали следующим образом.

мМ Трис-гидрохлоридного буфера (рН=7,5), 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 2,7% глицерина, 5% диметилсульфоксида, по 1,4 мМ каждого из аКТРз, 10 мМ хлорида магния, 20 пкмоль одного или обоих праймеров из одной из пар праймеров в соответствии с описанным выше в (1), 0,6 нг синтетической одноцепочечной ДНК, служащей матрицей, 5 ед. ДНК-полимеразы Вса ВЕЗТ и 60 ед. клонированной рибонуклеазы-Н при конечном объёме 50 мкл. Реакционную смесь смешивали до гомогенного состояния, инкубировали при 55°С в течение 60 мин и затем нагревали до 90°С на 2 мин с целью инактивации ферментов. 8 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле №18|еме 3:1 (Такага 81шхо). Праймеры, использованные в соответствующих моделях, описаны далее.

Модели 1-5: использовали одну из пар праймеров 1-5;

модель 6: использовали только обратный праймер из пары праймеров 2; и модель 7: пару праймеров 4 использовали без добавления РНКазы-Н.

В результате амплифицированные фрагменты, характеризующиеся размером в интересующем диапазоне от примерно 40 пар нуклеотидов (п.н.) до примерно 90 п.н., были получены тогда, когда использовали реакционную смесь моделей 2-5: это указывает на то, что при использовании этих схем реакции ДНК были амплифицированы. Амплифицированный фрагмент, который характеризовался ожидаемой длиной примерно 70 нуклеотидов (н.) (фрагмент одноцепочечной ДНК), был получен в модели 6, в которой использовали только один из двух праймеров. Не происходило амплификации ДНК при проведении реакций в моделях 1 или

7.

(3) Подтверждение продуктов амплификации.

Реакционную смесь, полученную с помощью реакции в модели 4 в соответствии с описанным в (2), отфильтровывали с использованием М1сгосоп-100 (Такага Зкихо) с выделением амплифицированного фрагмента ДНК, улавливаемого фильтром. Нуклеотидную последовательность данного фрагмента ДНК определяли с помощью метода (дизокси) Сэйнджера. В результате для фрагмента, амплифицированного с помощью указанной выше реакции, было подтверждено наличие ДНК, характеризующейся той же нуклеотидной последовательностью, как в ДНК, служащей матрицей.

(4) Анализ времени реакции.

Реакционную смесь модели 2 в соответствии с описанным выше в (2) приготавливали с целью анализа изменения количества амплифицированного продукта в случае, когда взаимодействие происходило в течение разного времени. Реакционную смесь инкубировали в течение 0, 15, 30, 60, 90 или 120 мин при 55°С. Затем смесь нагревали до 90°С в течение 2 мин с целью инактивации ферментов. 8 мкл реакционной смеси анализировали методом электрофореза в 3%-ном агарозном геле №81сус 3:1. Результаты электрофореза показаны на фиг 2. Числа от 1 до 6 на фигуре представляют дорожки, которые соответствуют взаимодействию в реакционной смеси в течение 0, 15, 30, 60, 90 или 120 мин соответственно. М обозначает дорожку, на которую внесён ступенчатый маркёр молекулярной массы ДНК 100 п.н. (Такага Зкихо).

Как показано на фиг. 2, при времени реакции в 0 мин продукт амплификации не выявляется. Было подтверждено, что количество продукта амплификации увеличивалось со временем реакции, которое возрастало от 15 до 30 или 60 мин. Однако количество продукта амплификации по данным электрофореза было практически неизменным при времени реакции 60 мин или больше: это указывает на то, что амплификация в использованной системе реакции примерно за 60 мин выходит на «плато»-фазу.

Пример 2.

(1) Приготовление РНК.

РНК, использованная в качестве матрицы в данном примере, была приготовлена из культивируемых клеток НТ29 человека (АТСС НТВ38) ГОайирроп РкагтассиНса!) с использованием реагента ТЯ1хо1 (ЫЕс ТссЬпо1од1ск). Концентрацию полученного в результате тотального пула РНК доводили до 1 мкг/мкл. Величина ΟΌ₂₆₀/ΟΌ₂₈₀ составила 1,8: это указывает на спектрофотометрическую чистоту РНК.

(2) Реакция амплификации.

ДНК-полимеразу Вса ВЕ8Т, которая обладает активностью обратной транскриптазы и активностью ДНК-полимеразы, а также эндонуклеазу РНКазу-Н использовали для определения того, амплифицировалась ли кДНК на матрице РНК.

Реакционную смесь, состав которой был описан в примере 2, приготавливали добавлением 1 мкг упомянутой выше тотальной РНК. Сегмент-мишень, кодирующий рецептор трансферрина человека (ОспВапк: депозитарный № Х01060), амплифицировали с использованием в качестве праймеров пары праймеров 2 из примера 1.

Реакционную смесь инкубировали при 55°С в течение 60 мин и затем нагревали до 90°С на 2 мин с целью инактивации ферментов. Когда 8 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле №81сус 3:1, был получен амплифицированный фрагмент, характеризующийся ожидаемым размером 56 п.н. Более того, Саузерн-блотгибридизацию проводили с использованием зонда, соответствующего мишени нуклеотидной последовательности. ДНК-зонд, имеющий нуклеотидную последовательность, показанную в 8ЕО ГО ΝΟ 4 списка последовательностей, помеченный биотином по 5'-концу, использовали для проведения гибридизации по Саузерну. В результате этот зонд гибридизовал с упомянутым выше амплифицированным фрагментом: это подтверждает, что участок-мишень был безошибочно амплифицирован с помощью способа по настоящему изобретению.

Пример 3.

(1) Синтез праймеров.

Способ амплификации по настоящему изобретению был протестирован с использованием в качестве матрицы двухцепочечной ДНК. Использованные праймеры были синтезированы на ДНК-синтезаторе (Аррйсй Вюкуйстк). Основные нуклеотидные последовательности праймеров показаны в 8ЕО ΙΌ ΝΟ 5-13 списка последовательностей. Структура праймеров, использованных в данном примере, подробно описана далее. ДНК плазмиды рИС19 (Такага 81шхо) использовали в качестве матрицы для пар праймеров А-Е. Нуклеотидная последовательность рИС 19 доступна из базы данных (ОспВапк: депозитарный № Ь09137). Амплифицированный фрагмент двухцепочечной ДНК использовали в качестве матрицы для пары праймеров О. Фрагмент был сформирован на материале тотального пула РНК человека, полученного в примере 2, с использованием праймеров, имеющих последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0 14 или 15 списка последовательностей, и набора реактивов ТаКаВа ΚΝΑ РСВ КН (АМУ), уег8. 2.1 (Такага 81ιιιζο) в соответствии с прилагающейся стандартной прописью.

Пара праймеров А (длина амплифицированного фрагмента примерно 450 п.н.): комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0 5 или 6 списка последовательностей, в которых первый и второй нуклеотиды с З'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Пара праймеров В (длина амплифицированного фрагмента примерно 250 п.н.): комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0 5 или 7 списка последовательностей, в которых первый и второй нуклеотиды с З'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Пара праймеров С (длина амплифицированного фрагмента примерно 520 п.н.): комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0 5 или 8 списка последовательностей, в которых первый и второй нуклеотиды с З'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Пара праймеров Ό (длина амплифицированного фрагмента примерно 890 п.н.): комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0 5 или 9 списка последовательностей, в которых первый и второй нуклеотиды с З'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Пара праймеров Е (длина амплифицированного фрагмента примерно 1З0 п.н.): комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0 10 или 6 списка последовательностей, в которых нуклеотиды с первого по третий с З 'конца заменены на рибонуклеотиды.

Пара праймеров Р (длина амплифицированного фрагмента примерно 220 п.н.): комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0 11 или 6 списка последовательностей, в которых нуклеотиды с первого по третий с З'конца заменены на рибонуклеотиды.

Пара праймеров С (длина амплифицированного фрагмента примерно З20 п.н.): комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0 12 или 1З списка последовательностей, в которых нуклеотиды с первого по третий с З'конца заменены на рибонуклеотиды.

(2) Реакция амплификации.

З5 мМ калий-фосфатного буфера (рН=7,5), 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 5% диметилсульфоксида, по 1,4 мМ каждого из άNΤР8, 10 мМ хлорида магния, 60 пкмоль каждого праймера из одной из пар праймеров в соответствии с описанным выше в (1), 100 нг ДНК риС19, являющейся матрицей, 5,5 ед. ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т и 60 ед. РНКазы-Н до конечного объёма реакции 50 мкл.

Условия реакции были следующими. Реакционную смесь без ДНК-полимеразы или РНКазы-Н денатурировали нагреванием до 98°С на 1 мин и затем охлаждали до 55°С. Затем добавляли ДНК-полимеразу и РНКазу-Н, и полученную смесь инкубировали при 55°С в течение 60 мин. По завершении реакции смесь нагревали до 90°С на 2 мин с целью инактивации ферментов. 8 мкл реакционной смеси затем подвергали электрофорезу в З%-ном агарозном геле М.18|еуе З:1.

В результате было подтверждено, что интересующий амплифицированный фрагмент образовывался с использованием любой из пар праймеров. Таким образом, было подтверждено, что двухцепочечную ДНК можно использовать в качестве матрицы для осуществления реакции амплификации в способе амплификации по настоящему изобретению.

(З) Отщепление продукта амплификации рестриктазой.

Было проанализировано рестрикционное отщепление амплифицированного фрагмента, полученного с использованием способа амплификации по настоящему изобретению. В качестве ДНК-матрицы использовали ДНК плазмиды риС19. Использовали прямой праймер рИС19 иррег (2) NN и обратный праймер рИС19 1о\гег NN в соответствии с показанным в 8Е0 ΙΌ N0 5 и 6 списка последовательностей, соответственно. В этих праймерах первый и второй нуклеотиды с З'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Состав реакционной смеси был следующим.

Реакционная смесь А: З5 мМ калийфосфатного буфера (рН=7,5), 10 мМ хлорида магния, по 1,4 мМ каждого άΚΤΡδ, 0,01% БСА, 5% ДМСО, 2,7% глицерина, по 100 пкмоль каждого из праймеров рИС19 иррег (2) NN и рИС19 1о\гег NN 500 нг ДНК рИС19 и стерильная дистиллированная вода до объёма реакции 48 мкл.

Реакционную смесь денатурировали нагреванием до 98°С на 1 мин и затем охлаждали до 55°С. Затем добавляли 60 ед. РНКазы-Н Е.соН и 5,5 ед. Вса ВЕ8Т с доведением объёма реакции до 50 мкл. Реакционную смесь инкубировали при 55°С в течение 1 ч. По завершении реакции смесь нагревали до 90°С на 2 мин с целью инактивации ферментов. Реакционную смесь подвергали электрофорезу в З%-ном агарозном геле с целью очистки полученного в результате амплифицированного продукта. Выделенный продукт амплификации ресуспендировали в 100 мкл стерильной дистиллированной воды.

Раствор полученной таким образом ДНК использовали для отщепления рестриктазой. Использованными рестриктазами были АссП (Такага 81ιιιζο) и Всп! (Такага 81ιιιζο).

Состав реакционной смеси был следующим.

мкл раствора ДНК, 1 мкл буфера 10хАсс11 или буфера 10хВсп1, прилагающегося к каждой из рестриктаз, 1 мкл рестриктазы Асс11 или Всп1 и стерильная дистиллированная вода до объёма реакции 10 мкл. Реакцию в реакционной смеси проводили при 37°С в течение 30 мин. К полученному добавляли 1,5 мкл 10х загрузочного буфера, 6 мкл полученной смеси подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле Ыи81еуе.

В результате интересующие отщеплённые рестриктазой фрагменты ДНК были получены при использовании обеих рестриктаз - и Асс11, и Всп1.

(4) Выявление мутаций.

Анализировали выявление мутации с помощью способа амплификации по настоящему изобретению. В качестве матрицы использовали риС19. Основные нуклеотидные последовательности прямого и обратного праймеров риС19 иррег (2) NN рптег и рИС19 1о\гег NN показаны в 8ЕЦ ГО N0 5 и 6 списка последовательностей, соответственно. Оба этих праймера являются химерными олигонуклеотидными праймерами, в которых первый и второй нуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеиновые кислоты. Кроме того, были сконструированы четыре праймера, в которых 3'-концевой нуклеотид праймера рИС19 иррег (2) NN заменён на и (который комплементарен соответствующему нуклеотиду в матрице) или А, С или С (который является неправильно встроенным нуклеотидом), обозначенные как рИС19 иррег (2) ЦЦ-и, рИС19 иррег (2) ЦЦ-Л, рИС19 иррег (2) NN-0’ или рИС19 иррег (2) NN-6, соответственно.

Комбинации праймеров были следующими.

Пара праймеров 1: прямой рИС19 иррег (2) ХХ-Е и обратный рИС19 1о\гег NN пара праймеров 2: прямой рИС19 иррег (2) КЫ-Л и обратный рИС19 1о\гег NN пара праймеров 3: прямой рИС19 иррег (2) НН-С и обратный рИС19 1о\гег НИ; и пара праймеров 4: прямой рИС19 иррег (2) NN-6 и обратный рИС19 1о\гег NN.

мМ калий-фосфатного буфера (рН=7,3), 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 5% ДМСО, по 1 мМ каждого ιΝ'ΙΊΝ. 8 мМ ацетата магния, по 60 пкмоль каждого праймера, 50 нг ДНК-матрицы и стерильная дистиллированная вода до объёма реакции 48 мкл.

Реакционную смесь денатурировали нагреванием до 98°С на 1 мин и затем охлаждали до 55°С. Затем в нее добавляли 5,5 ед. ДНКполимеразы Вса ВЕ8Т и 60 ед. РНКазы-Н Е.соН, и реакционную смесь инкубировали при 55°С в течение 60 мин. Затем смесь нагревали до 90°С на 2 мин с целью инактивации ферментов. 8 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 4%-ном агарозном геле М.18|еуе 3:1 (Такага 811ихо). В результате интересующий амплифицированный фрагмент длиной примерно 450 п. н. был выявлен только в случае использования комбинации праймеров, которая включает праймер, имеющий комплементарный нуклеотид на 3'-конце рИС19 иррег (2) NN. С другой стороны, амплифицированный фрагмент отсутствовал в случае комбинаций, включающих праймер, имеющий ошибочный нуклеотид на 3'конце рИС19 иррег (2) NN.

Пример 4.

(1) Реакция в микропробирке.

Анализировали реакционный объём для способа амплификации по настоящему изобретению. Участок, кодирующий рецептор трансферрина человека, был выбран в качестве сегмента для амплификации. Использовали праймеры, характеризующиеся последовательностью, показанной в 8ЕЦ ГО N0 12 или 13 списка последовательностей. В составе праймеров первый и второй нуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды. Фрагмент длиной примерно 750 п.н., амплифицированный методом ОТПЦР, использовали в качестве ДНК-матрицы. Реакционный объём доводили до 50, 100, 300 или 500 мкл.

Состав реакционной смеси был следующим.

Реакционная смесь А: 10 мкл 5х специального буфера (135 мМ калийфосфатного буфера рН=7,5, 0,5 мг/мл БСА, 2,5% ДМСО), 4 мкл 100 мМ ацетата магния, по 5 мкл 10 мМ бОТРк, 10 мкл 10 мкМ АТФ, 1 мкл ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т (22 ед./мкл), 1 мкл РНКазы-Н (60 ед./мкл) и стерильная дистиллированная вода до 39 мкл.

Реакционная смесь В: 3 мкл 20 мкМ праймера 8 для рецептора трансферрина человека (8ЕЦ ГО N0 12) и 20 мкМ праймера для рецептора трансферрина человека (8ЕЦ ГО N0 13) каждого, примерно 100 нг ДНК, служащей матрицей, и стерильная дистиллированная вода до 11 мкл. Если объём становился 50 мкл или больше, то его масштабировали так, чтобы обеспечить указанный выше состав.

Для реакции амплификации реакционную смесь В нагревали до 98°С на 2 мин и затем инкубировали при 55°С в течение 3 мин. Реакционную смесь В добавляли к реакционной смеси А, которая была предварительно проинкубирована в 1500-мкл микропробирке при 55°С. После смешивания реакционную смесь инкубировали при 55°С в течение 1 ч. По завершении реакции смесь переносили на ледяную баню. 8 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле.

В результате интересующий фрагмент длиной примерно 300 п.н. был эффективно амплифицирован с использованием каждого из объёмов реакции. Кроме того, было подтверждено, что интересующий амплифицированный фрагмент может быть получен без проблем с использованием ПЦР-амплифицированного фрагмента в качестве ДНК-матрицы.

(2) Реакция в чашке Петри.

Анализировали использование чашки Петри с целью предотвращения неоднородности температуры в реакционной смеси, которая могла бы быть вызвана большим объёмом реакции. Участок, кодирующий рецептор трансферрина человека, был выбран как участок, который предстояло амплифицировать. Использовали праймеры, характеризующиеся последовательностью, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0 12 или 13 списка последовательностей. В составе праймеров первый и второй нуклеотиды с 3'-конца заменены рибонуклеотидами. Фрагмент длиной примерно 750 п.н., амплифицированный методом ОТ-ПЦР, использовали в качестве ДНКматрицы. Объём реакции доводили до 10 мл.

Состав реакционной смеси был следующим.

Реакционная смесь А: 2000 мкл 5х специального буфера (135 мМ калий-фосфатного буфера - рН=7,5; 0,5 мг/мл БСА, 2,5% ДМСО), 800 мкл 100 мМ ацетата магния, 1000 мкл 10 мМ άΝΤΡκ и стерильная дистиллированная вода до 9,1 мл.

Реакционная смесь В: по 200 мкл 60 мкМ праймера 8 рецептора трансферрина человека (8ЕЦ ΙΌ N0 12) и 60 мкМ праймера рецептора трансферрина человека (8ЕЦ ΙΌ N0 13) каждого, примерно 10 мкг ДНК, служащей матрицей, и стерильная дистиллированная вода до 500 мкл.

Реакционная смесь С: 200 мкл ДНКполимеразы Вса ВЕ8Т (22 ед./мкл) и 200 мкл РНКазы-Н (60 ед./мкл).

Для реакции амплификации реакционную смесь В нагревали до 98°С на 1 мин и затем инкубировали при 55°С в течение 3 мин. Реакционную смесь В добавляли к реакционной смеси А, которая была предварительно проинкубирована в 60-мм (диаметр) пластиковой чашке Петри при 55°С. Далее к полученному добавляли реакционную смесь С. После смешивания реакционную смесь инкубировали при 55°С в течение 1 ч. По завершении реакции реакционную смесь переносили на ледяную баню. Затем 8 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле.

В результате был эффективно амплифицирован фрагмент длиной примерно 300 п.н., причём даже тогда, когда объём реакции составлял 10 мл. Кроме того, было подтверждено, что интересующий амплифицированный фрагмент можно без проблем получить с использованием ПЦР-амплифицированного фрагмента в качестве ДНК-матрицы. Таким образом, было подтверждено, что способ по настоящему изобретению предпочтительно по сравнению со стан дартным методом ПЦР можно использовать для изготовления ДНК-чипа, для чего требуется значительное количество ДНК-фрагмента.

Пример 5.

(1) Отношение между типом буфера и количеством используемой РНКазы-Н.

Исследовали отношение между типом буфера и количеством используемой РНКазы-Н. Плазмидные ДНК (обозначенные как рИС19249 и рИС19-911), представляющие собой вектор рИС 19, в состав которого был клонирован фрагмент размером 249 п.н. или 911 п.н., использовали в качестве матриц. В качестве праймеров использовали химерные олигонуклеотидные праймеры, в которых были заменены на рибонуклеотиды первые три нуклеотида с 3'конца праймера ΜΕ2Ν3 (24) или праймера ΜΚ1Ν3 (24), характеризующихся последовательностью, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0 16 или 17 списка последовательностей. При использовании комбинации этих праймеров для рИС 19249 и рИС 19-911 были получены амплифицированные фрагменты длиной примерно 450 п.н. и примерно 1100 п.н. соответственно.

Трис-гидрохлоридный буфер, калийфосфатный буфер и трициновый буфер были выбраны в качестве буферных систем для исследования. Анализируемые количества РНКазы-Н представляли её отсутствие и конечные концентрации в диапазоне от 0,3 до 1,2 ед./мкл. Трис-гидрохлоридная буферная система была приготовлена в соответствии с описанным в примере 1 (2), за исключением того, что использовали 10 нг рИС19-249 или 200 нг рИС19-911, по 60 пкмоль каждого из праймеров и 11 ед. ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т на 50 мкл реакционной смеси. Калий-фосфатный буфер был приготовлен так, чтобы иметь сходный состав. Трициновая буферная система была приготовлена таким образом, чтобы содержать следующее с указанием конечных концентраций: 34 мМ трицинового буфера (рН=8,7), 10 мМ хлорида калия, 10 мМ сульфата аммония, 0,01% БСА, 1% ДМСО, 4 мМ ацетата магния и по 0,5 мМ каждого из άNΤΡк. К данной буферной системе добавляли 10 нг плазмиды рИС19-249 на 50 мкл объёма реакции или 200 нг плазмиды рИС19-911 на 50 мкл объёма реакции, по 60 пкмоль каждого из праймеров на 50 мкл объёма реакции, РНКазу-Н в заданной концентрации и 11 ед. ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т на 50 мкл объёма реакции.

Для реакции амплификации смесь являющихся матрицами рИС19-249 или рИС19-911 и соответствующих праймеров денатурировали нагреванием до 98°С на 1 мин и затем охлаждали до 55°С. К полученному добавляли смесь остальных компонентов реакции. Реакцию в полученной смеси проводили при 55°С в течение 60 мин. По завершении реакции смесь охлаждали до 4°С и к полученному добавляли 1/10 объёма 0,5 М ЭДТА с целью остановки реакции.

мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле Ыи81еуе 3:1 (Такага 81ιιιζο).

В результате при использовании рИС 19249 в качестве матрицы увеличение эффективности амплификации было выявлено в зависимости от использованной буферной системы в следующем порядке: Трис-гидрохлоридный < калий-фосфатный < трициновый. При использовании рИС19-911 в качестве матрицы увеличение эффективности амплификации было выявлено в зависимости от использованной буферной системы в следующем порядке: Трисгидрохлоридный < трициновый < калийфосфатный. Использование РНКазы-Н в конечной концентрации в диапазоне 0,3-1,2 ед./мкл приводило в результате к получению интересующего амплифицированного фрагмента, хотя при отсутствии добавления РНКазы-Н интересующий продукт амплификации отсутствовал.

(2) Анализ количества праймера.

Анализировали влияние количества использованного праймера на способ амплификации по настоящему изобретению. Систему реакционной смеси, в состав которой входит рИС19-249, использовали в качестве матрицы, выбрав её из композиций, описанных выше в (1). Для калий-фосфатной буферной системы использовали 60 ед. РНКазы-Н на 50 мкл объёма реакции, в то время как для Трисгидрохлоридной или трициновой буферной системы использовали 30 ед. РНКазы-Н на 50 мкл объёма реакции. Анализируемые концентрации праймера варьировались в пределах от 10 до 100 пкмоль на 50 мкл. Условия реакции и подтверждения амплификации соответствовали описанному выше в (1).

В результате интересующий амплифицированный фрагмент был получен при использовании каждой из буферных систем, содержащих праймер в концентрации в диапазоне 10-100 пкмоль на 50 мкл.

(3) Влияние рН реакционного буфера.

Анализировали влияние рН реакционной смеси на способ амплификации по настоящему изобретению. Состав реакционной смеси соответствовал описанному выше в (2). Исследованные рН составляли 7,0-8,0 для калий-фосфатной буферной системы, 7,5-9,2 для трициновой буферной системы и 7,5-9,0 для Трисгидрохлоридной буферной системы. Условия реакции и подтверждения амплификации соответствовали описанному выше в (1).

В результате интересующий амплифицированный фрагмент был получен в использованном диапазоне рН для соответствующих буферных систем.

(4) Влияние добавок.

Влияние добавления диметилсульфоксида (ДМСО) анализировали с использованием состава реакционной смеси с фосфатной буферной системой (рН=7,5) в соответствии с описанным выше в (3). Кроме того, также исследовали влияние добавления полиамина. Анализируемое количество добавляемого ДМСО варьировалось от 0 до 10%. С другой стороны, в качестве полиамина использовали спермина тетрагидрохлорид (81§та), спермидина тригидрохлорид (81§та), ацетилпутресцин (ЫасаЫ Текцие), путресцина дигидрохлорид (Ыаса1а1 Текцие), триметилендиамин (Ыаса1а1 Текцие), пропилендиамин (Ыаса1а1 Текцие) и диаминометана дигидрохлорид (ЫасаЫ Текцие). Количество добавляемых пропилендиамина и триметилендиамина колебалось от 0 до 2%. Другие полиамины использовали в диапазоне концентраций от 0 до 5 мМ. Условия реакции и подтверждения амплификации соответствовали описанному выше в (1).

В результате интересующий ДНКфрагмент был эффективно амплифицирован с использованием добавки в концентрации в пределах указанных диапазонов: от 0 до 5% ДМСО; от 0 до 200 мкМ спермина тетрагидрохлорида или спермидина; от 40 мкМ до 40 мМ ацетилпутресцина или путресцина дигидрохлорида; 0,002-0,02% триметилендиамина; 0,0001-0,01% пропилендиамина; и 0,1-10 мкМ диаминометана дигидрохлорида.

(5) Анализ типа соли магния.

Исследовали влияние типа соли магния на способ амплификации по настоящему изобретению. ДНК риС19 использовали в качестве матрицы. В качестве праймеров использовали праймер рИС19 иррег NN 249 и праймер рИС19 1о\гег ΝΝ, характеризующиеся последовательностями, показанными в 8ЕЦ Ш ΝΟ 11 и 6 списка последовательностей, соответственно. Амплифицированный фрагмент длиной примерно 225 п.н. был получен с использованием пары этих праймеров. В качестве солей магния использовали хлорид магния, ацетат магния и сульфат магния. Состав реакционной смеси был следующим.

мМ калий-фосфатного буфера (рН=7,3), 8 мМ (конечная концентрация) хлорида магния, ацетата магния или сульфата магния, по 1,0 мМ (конечная концентрация) каждого άΝΓΡδ, 50 нг ДНК рИС19, по 60 пкмоль каждого из праймеров, 60 ед. РНКазы-Н, 5,5 ед. ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т и стерильная дистиллированная вода до объёма реакции 50 мкл. Условия реакции и подтверждения амплификации соответствовали описанному выше в (3).

В результате интересующий амплифицированный фрагмент был получен с использованием каждой из солей магния.

(6) Анализ концентраций магния и бКТРк.

Анализировали влияние концентраций магния и άΝΓΡδ на способ амплификации по настоящему изобретению. Состав реакционной смеси соответствовал описанному выше в (5), за исключением того, что использовали 25 нг ДНК рИС19 и различные концентрации магния и άΝΓΡδ. Условия реакции и подтверждения ам плификации соответствовали описанному выше в (1).

В реакционной системе, в которой конечная концентрация каждого из άΝΤΡκ была зафиксирована на уровне 1 мМ, интересующий амплифицированный фрагмент был получен тогда, когда использовали конечную концентрацию магния в диапазоне от 6 до 10 мМ. В реакционной системе, в которой конечная концентрация магния была зафиксирована на уровне 8 мМ, интересующий амплифицированный фрагмент был получен тогда, когда использовалась конечная концентрация каждого из άΝΤΡκ в диапазоне от 0,6 до 1,2 мМ. Более того, в реакционной системе, в которой конечная концентрация каждого из άΝΤΡκ была зафиксирована на уровне 0,5 мМ, интересующий амплифицированный фрагмент был получен тогда, когда использовалась конечная концентрация магния в диапазоне от 2 до 6 мМ. В реакционной системе, в которой конечная концентрация магния была зафиксирована на уровне 4 мМ, интересующий амплифицированный фрагмент был получен тогда, когда использовалась конечная концентрация каждого из άΝΤΡκ в диапазоне от 0,2 до 0,8 мМ.

(7) Анализ изменения концентрации калий-фосфатного буфера или трицинового буфера и реактивности.

Анализировали влияние концентрации калий-фосфатного буфера или трицинового буфера на способ амплификации по настоящему изобретению. Состав реакционной смеси соответствовал описанному выше в (1) в случае, когда рИС19-249 использовали в качестве матрицы, за исключением того, что использовали калийфосфатный буфер в конечной концентрации 2050 мМ или трициновый буфер в конечной концентрации 22-46 мМ. Условия реакции и подтверждения амплификации соответствовали описанному выше в (1).

В результате интересующий амплифицированный фрагмент был получен тогда, когда использовали калий-фосфатный буфер в конечной концентрации в диапазоне от 20 до 50 мМ или трициновый буфер в конечной концентрации в диапазоне от 22 до 46 мМ.

(8) Анализ концентрации ДНК-полимеразы Вса ВЕБТ

Исследовали влияние концентрации ДНКполимеразы Вса ВЕШ на способ амплификации по настоящему изобретению. Состав реакционной смеси соответствовал описанному выше в (1) в случае, когда рИС 19-249 использовали в качестве матрицы, за исключением того, что использовали калий-фосфатную буферную систему или трициновую буферную систему и ДНК-полимеразу Вса ВЕШ в концентрации в диапазоне 1-22 ед. на 50 мкл объёма реакции. Условия реакции и подтверждения амплификации соответствовали описанному выше в (1).

В результате интересующий амплифицированный фрагмент был получен тогда, когда ДНК-полимеразу Вса ВЕШ использовали в концентрации в диапазоне 1-22 ед. на 50 мкл.

Пример 6.

Сравнение с методом ПЦР.

Способ амплификации по настоящему изобретению сравнивали с методом ПЦР. Конструкции, в которых ДНК-фрагмент длиной примерно 150 п.н. или примерно 250 п.н. встроен по сайту для множественного клонирования плазмиды риС19, использовали в качестве матриц.

Матрицы были приготовлены следующим образом.

Прямой праймер рИС19 иррег 150, прямой праймер рИС19 иррег 249 и обратный праймер рИС19 1ο\\όγ ΝΝ, которые характеризуются последовательностями, показанными в ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ 10, 11 и 6 списка последовательностей, соответственно, использовали для осуществления реакции ПЦР с использования 100 пкг ДНК плазмиды рИС19 в качестве матрицы. Амплифицированный фрагмент размером примерно 150 п.н. был получен с использованием комбинации прямого праймера рИС19 иррег 150 и обратного праймера рИС19 1ο\\όγ ΝΝ. Амплифицированный фрагмент длиной примерно 250 п.н. был получен при использовании комбинации прямого рИС19 иррег 249 и обратного праймера рИС19 1ο\\όγ ΝΝ. Каждый из этих амплифицированных фрагментов очищали с использованием Μηιό^1'1-100. затупляли их концы с использованием набора ΌΝΑ Ыипйпд кй (Лаката δΐιι,ιζο) и затем субклонировали по НшсП-сайту в состав плазмиды рИС19. Плазмиды, в которые встроен один из амплифицированных фрагментов, использовали для трансформации клеток Е.той ΙΜ109. Полученных в результате трансформантов культивировали и плазмиды со встроенной ДНК очищали из клеток с использованием реактивов ОI АСЕН Р1а8Ш1й М1ш кй (01адеп). Плазмиды со встроенной ДНК использовали в качестве матриц.

Последовательности праймеров, использованных в данном примере, показаны в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 18 и 19 списка последовательностей. Праймеры, в которых первые три с 3'-конца нуклеотида заменены на рибонуклеотиды, использовали в способе амплификации по настоящему изобретению.

Состав реакционной смеси был следующим.

мМ фосфатного буфера (рН=7,3), 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 5% ДМСО, по 1 мМ каждого из άΝΤΡκ, 8 мМ ацетата магния, по 60 пкмоль каждого из праймеров, 1 нг ДНК, служащей матрицей, и стерильная дистиллированная вода до объёма реакции 48 мкл.

Реакционную смесь денатурировали нагреванием до 98°С на 1 мин и затем охлаждали до 55°С. К полученному добавляли 5,5 ед. ДНКполимеразы Вса ВЕ8Т и 60 ед. РНКазы-Н Е.соЕ, и полученную смесь инкубировали при 55°С в течение 60 мин. После этого смесь нагревали до 90°С на 2 мин с целью инактивации ферментов. 3 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 4%-ном агарозном геле М18|еуе 3:1 (Такага δΐιιιζο).

С другой стороны, амплификацию с применением метода ПЦР осуществляли в качестве контроля. Набор для ПЦР-амплификации от Такага δΐιιιζο, по 10 пкмоль каждого праймера, имеющего последовательность, показанную в 8ЕО ГО N0 18 или 19 списка последовательностей, не имеющую рибонуклеотида, 1 нг ДНКматрицы и стерильную дистиллированную воду до объёма реакции 50 мкл использовали для этой реакции. Условия реакции составили 25 циклов по 30 с при 94°С, 30 с при 55°С и 40 с при 72°С. По завершении реакции 3 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 4%ном агарозном геле М18|еуе 3:1 (Такага δΐιιιζο).

В результате большее количество интересующего фрагмента было амплифицировано для каждой из являющихся матрицами плазмид, несущих вставку длиной 150 п.н. или 249 п.н., в способе амплификации по настоящему изобретению по сравнению с методом ПЦР. 20 мкл реакционной смеси было очищено с использованием М1сгосоп-200, и количество амплифицированного продукта оценивали с помощью бекмановского спектрофотометра Όυ-640 (Весктап) с целью цифрового выражения количества амплифицированного продукта. Количество фрагмента, который был амплифицирован с являющейся матрицей плазмиды, включающей вставку длиной 150 п.н., в способе амплификации по настоящему изобретению было подтверждено как примерно в 60 раз превышающее количество, полученное в методе ПЦР. Количество фрагмента, который был амплифицирован с являющейся матрицей плазмиды, включающей вставку длиной 250 п.н., в способе амплификации по настоящему изобретению было подтверждено как примерно в 40 раз превышающее количество, полученное в методе ПЦР. Основываясь на этих результатах, было подтверждено, что способ по настоящему изобретению может быть преимущественно использован для изготовления ДНК-чипа, для которого требуется значительное количество ДНКфрагмента, по сравнению со стандартным методом ПЦР.

Пример 7.

(1) Приготовление РНК-зонда.

Анализировали способ выявления амплифицированного фрагмента, полученного с помощью способа амплификации по настоящему изобретению. Был сформирован детекционный зонд, состоящий из рибонуклеотидов, в котором два различных флуоресцентных вещества присоединены к рибонуклеотидам по обоим концам зонда. Детекционный РНК-зонд был синтезирован с использованием ДНК-синтезатора (АррйеЕ ВюкуЧетк). Нуклеотидная последовательность зонда показана в 8Е0 ГО N0 20 списка последовательностей. 6-ЕАМ (61еп ВекеагсЕ) и ТАМИЛ (61еп ВекеагсЕ) были использованы в качестве флуоресцентных веществ для мечения зонда по 5'-концу и по 3'-концу соответственно.

(2) Реакция амплификации и выявление.

В качестве матрицы использовали 0,1 или 1 нг ДНК риС19. В качестве праймеров использовали прямой праймер риС19 иррег 150 и обратный праймер риС19 1о\уег 542, характеризующиеся последовательностями, показанными в 8Е0 ГО N0 10 и 8 списка последовательностей, соответственно, в которых первый и второй нуклеотиды с 3'-конца праймера заменены рибонуклеотидами.

Состав реакционной смеси был следующим.

мМ фосфатного буфера (рН=7,3), 0,01% БСА, 5% ДМСО, по 1 мМ каждого из ЕЭТРк, 8 мМ ацетата магния, по 60 пкмоль каждого праймера, 0,1 или 1 нг ДНК-матрицы, 0,1 мкг РНК-зонда и стерильная дистиллированная вода до объёма реакции 48 мкл. В качестве контроля готовили вариант, в котором отсутствовала ДНК-матрица.

Реакционную смесь денатурировали нагреванием до 98°С на 1 мин и затем охлаждали до 55°С. К полученному добавляли 22 ед. ДНКполимеразы Вса ВЕ8Т и стерильной воды и 60 ед. РНКазы-Н Е.соЕ и смесь инкубировали при 55°С в течение 60 мин. После этого 5 мкл 10%ного додецилсульфата натрия (ДСН; №1са1а1 Тексще) добавляли к смеси с целью инактивации ферментов. 50 мкл реакционной смеси разводили равным объёмом стерильной воды и переносили на микропланшет. Анализатор изображения ЕМ В10 II Ми1Ц-У|е\\· (Такага 8Е^о) использовали для выявления при длине волны возбуждения 505 нм.

В результате не было выявлено флуоресцентного сигнала при использовании любой из матриц в отсутствие ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т. Также не было выявлено флуоресцентного сигнала в случае реакционной смеси, содержащей ДНК-полимеразу Вса ВЕ8Т, когда не добавляли ДНК, служащую матрицей. С другой стороны, флуоресцентный сигнал был выявлен тогда, когда добавляли либо 0,1, либо 1 нг ДНК, являющейся матрицей. Интересующий амплифицированный фрагмент длиной примерно 190 п. н. также был выявлен с помощью электрофореза в 3%-ном агарозном геле, содержащем 0,00003% бромистого этидия, причём только тогда, когда 0,1 или 1 нг ДНК, являющейся матрицей, добавляли в присутствии ДНКполимеразы Вса ВЕ8Т. Такие же результаты были получены с помощью способа выявления с использованием РНК-зонда и стандартного метода электрофореза. Таким образом, был разра ботан способ выявления амплифицированного фрагмента, полученного с помощью способа амплификации по настоящему изобретению, с использованием РНК-зонда.

Пример 8.

Анализировали использование праймера, составленного дезоксирибонуклеотидами, в качестве одного из двух праймеров в способе по настоящему изобретению. В качестве праймеров использовали праймер ΜΚ.1Ν3 (30), имеющий последовательность, показанную в БЕЦ ΙΌ N0 19 списка последовательностей, и праймер М4 (Такага БНихо), имеющий последовательность, показанную в БЕЦ ΙΌ N0 58 списка последовательностей. В составе праймера ΜΒ1Ν3 первые три нуклеотида с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Состав реакционной смеси был следующим.

мМ фосфатного буфера (рН=7,3), 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 5% ДМСО, по 1 мМ каждого из 6ΝΤΡκ, 8 мМ ацетата магния, по 30 пкмоль каждого из праймеров, 1 нг ДНК-матрицы и стерильная дистиллированная вода до объёма реакции 24 мкл.

Реакционную смесь денатурировали нагреванием до 98°С на 2 мин и затем охлаждали до 55°С. К полученному добавляли 11 ед. ДНКполимеразы Вса ВЕБТ и 30 ед. РНКазы-Н Е.соН, достигая объёма реакции 25 мкл. Реакционную смесь инкубировали при 55°С в течение 60 мин. После этого смесь нагревали до 90°С на 2 минуты с целью инактивации ферментов. 5 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 4%ном агарозном геле ШБ1еуе 3:1. В результате был выявлен интересующий амплифицированный фрагмент.

Пример 9.

Способ по настоящему изобретению был использован для выявления геморрагического штамма Е.соН 0-157.

Последовательности праймеров, использованных в данном примере, показаны в БЕЦ ΙΌ N0 21-24 списка последовательностей. Комбинация праймеров, характеризующихся последовательностью БЕЦ ΙΌ N0 21 или 22, и комбинация праймеров, характеризующихся последовательностью БЕЦ ΙΌ N0 23 или 24, были сконструированы для выявления последовательности, кодирующей веротоксин-1 и веротоксин-2 О157 в соответствии с описанным в Е1пкйо То В1ке1Ьи1ки (С11шса1 М1сгоЫо1оду), 18 (4), 507-513 (1991). Праймеры, в которых три первых с 3'конца нуклеотида заменены рибонуклеотидами, использовали в способе амплификации по настоящему изобретению. Обработанный нагреванием экстракт, приготовленный путём сбора культуры геморрагического штамма Е.соН 0157 (АТСС, депозитарный № 43895), суспендирования его в стерильной воде при подходящей плотности клеток и обработки его при темпера туре 98°С в течение 10 мин, использовали в качестве матрицы.

Состав реакционной смеси был следующим.

мМ фосфатного буфера (рН=7,3), 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 5% ДМСО, по 1 мМ каждого из бКТРк, 8 мМ ацетата магния, по 60 пкмоль каждого праймера, ДНК-матрица (обработанный нагреванием экстракт), соответствующая 10⁴-10⁶ клеток, и стерильная дистиллированная вода до объёма реакции 48 мкл.

Реакционную смесь денатурировали нагреванием до 98°С на 1 мин и затем охлаждали до 55°С. К полученному добавляли 5,5 ед. ДНКполимеразы Вса ВЕБТ и 60 ед. РНКазы-Н Е.соН. Реакционную смесь инкубировали при 55°С в течение 60 мин. После этого смесь нагревали до 90°С в течение 2 мин с целью инактивации ферментов. 3 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 4%-ном агарозном геле №Б1еуе 3:1 (Такага БНнхо).

В результате веротоксины 1 и 2 О-157 могут быть выявлены с использованием любой из пар праймеров и ДНК-матрицы, соответствующей 10⁴ клеток: это подтверждает, что способ по настоящему изобретению может быть использован в качестве способа выявления патогенной бактерии.

Пример 10.

Анализировали амплификацию длинноцепочечного фрагмента ДНК с помощью способа по настоящему изобретению. Двухцепочечную ДНК, служащую матрицей, приготавливали следующим образом. Сначала конструировали библиотеку на материале мРНК, происходящей из ткани нормального желудка, с использованием вектора Иш-2ар ХЕ (Б1га1адепе) в соответствии со стандартным методом. Библиотеку подвергали скринингу с целью отбора клонов, несущих вставку длиной примерно 2,1 т.п.н. или примерно 4,3 т.п.н. Клоны были использованы для получения фаговых векторов рВ1иекспр1 БК(-) с помощью вырезания ίη уйго. Амплифицированные фрагменты длиной примерно 2,2 т.п.н. и примерно 4,4 т.п.н. были получены с использованием плазмид в качестве матриц, праймера МСК-Е и праймера МСЕ-Е, характеризующихся последовательностями, показанными в БЕЦ ΙΌ N0 25 и 26 списка последовательностей, соответственно, и набора для ПЦРамплификации от Такага Б1шхо. Полученные ПЦР-фрагменты использовали в качестве матриц для способа амплификации по настоящему изобретению. В качестве праймеров использовали праймер МЕ2Ш (24) и праймер МВШ3 (24), имеющие последовательности, показанные в БЕЦ ΙΌ N0 27 и 28 списка последовательностей, соответственно, в которых первые три нуклеотида с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Состав реакционной смеси был следующим.

мМ фосфатного буфера (рН=7,5), 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1% ДМСО, по 0,5 мМ каждого из бЭТРк, 4 мМ ацетата магния, по 30 пкмоль каждого праймера, 0,2 мМ путресцина и стерильная дистиллированная вода до 24,25 мкл. Реакционную смесь нагревали до 92°С на 2 мин и затем охлаждали до 55°С. К полученному добавляли 30 ед. РНКазы-Н и 5,5 ед. ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т, доводя объём реакции до 25 мкл. Реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч. По завершении реакции смесь охлаждали до 4°С и к полученному добавляли 2,5 мкл 0,5 М раствора ЭДТА с целью остановки реакции. 5 мкл смеси подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле.

В результате амплифицированный фрагмент размером примерно 2,2 т.п.н. или примерно 4,4 т.п.н. был получен с помощью способа по настоящему изобретению: это подтверждает, что способ по настоящему изобретению может быть использован для амплификации длинноцепочечного фрагмента ДНК.

Пример 11.

Была сформирована микроматрица ДНК, на которую поместили фрагмент ДНК λ-фага длиной примерно 400 п.н., амплифицированный с помощью способа по настоящему изобретению, и фрагменты ДНК λ-фага длиной примерно 300 п.н. и 1000 п.н., амплифицированные с помощью ПЦР. Нуклеотидная последовательность ДНК λ-фага доступна из базы данных СепВапк под депозитарными №№ ν00636, 102459, М17233 и Х00906. Последовательности праймеров, использованных в данном примере, показаны в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 25-26 и 29-35 списка последовательностей.

Реакционная смесь для способа амплификации по настоящему изобретению была приготовлена следующим образом.

мМ Трицин-гидрохлоридного буфера (рН=8,7), 10 мМ хлорида калия, 10 мМ сульфата аммония, 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1% диметилсульфоксида, 4 мМ ацетата магния, по 0,5 мМ каждого бКТРк, по 500 пкмоль каждого праймера, 100 нг продукта ПЦР-амплификации, взятого в качестве матрицы, 110 ед. ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т и 300 ед. клонированной РНКазы-Н при конечном объёме реакции 500 мкл. Реакционную смесь смешивали до однородного состояния, инкубировали при 55°С в течение 60 мин и затем нагревали до 90°С на 2 мин с целью инактивации ферментов. Этот раствор использовали в последующих стадиях.

Размещённые на матрице («раскапанные») фрагменты ДНК были следующими.

1. Образец. ПЦР-амплифицированный продукт (300 п.н.), полученный с использовани ем ДНК λ-фага в качестве матрицы и комбинации праймеров, характеризующихся последовательностями, показанными в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 29 или 30 списка последовательностей, был субклонирован в состав вектора рИС19. Субклонированный продукт затем амплифицировали с помощью ПЦР, используя праймеры, последовательности которых показаны в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 25 или 26 списка последовательностей. Полученный таким путём продукт, служащий матрицей, и химерные олигонуклеотидные праймеры, имеющие последовательность в соответствии с показанным в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 31 или 32 списка последовательностей, в которых первый и второй нуклеотиды с 3'-конца праймера заменены на рибонуклеотиды, использовали для амплификации продукта длиной примерно 400 п. н. с помощью способа амплификации по настоящему изобретению с получением указанного образца. Пять растворов ДНК, т.е. реакционная смесь в своей исходной концентрации или её 2-, 4-, 8- или 16кратные разведения в карбонатном буфере (карбонатный буфер в концентрации 50 мМ использовали для разведения в каждом случае), использовали для «раскапывания».

2. Образец. ДНК-фрагмент, амплифицированный в описанном выше (1), обрабатывали с помощью М1сгосоп-100 (Такага 811ихо). Затем пять растворов ДНК приготавливали путём доведения концентраций до 0,125, 0,25, 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/мкл с использованием 50 мМ карбонатного буфера.

3. Положительный контроль. ПЦРамплифицированный продукт (300 п.н.), полученный с использованием ДНК λ-фага в качестве матрицы и комбинации праймеров, характеризующихся последовательностями, показанными в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 29 или 30 списка последовательностей, обрабатывали с помощью Мюгосоп100. Затем пять растворов ДНК приготавливали путём доведения концентраций до 0,125, 0,25, 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/мкл с использованием 50 мМ карбонатного буфера.

4. Положительный контроль. ПЦРамплифицированный продукт (1000 п.н.), полученный с использованием ДНК λ-фага в качестве матрицы и комбинации праймеров, характеризующихся последовательностями, показанными в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 33 или 34 списка последовательностей, обрабатывали с помощью Мюгосоп100. Затем четыре раствора ДНК приготавливали путём доведения концентраций до 0,125, 0,25, 0,5 и 1,0 мкг/мкл с использованием 50 мМ карбонатного буфера.

5. Отрицательный контроль. ПЦРамплифицированный продукт (300 п.н.), полученный с использованием ДНК λ-фага в качестве матрицы и комбинации праймеров, характеризующихся последовательностями, показанными в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 33 или 35 списка последовательностей, субклонировали в состав вектора риС19. Субклонированный продукт затем амплифицировали с помощью ПЦР, используя праймеры, имеющие последовательности, показанные в БЕО ΙΌ N0 25 или 26 списка последовательностей. Полученный таким образом продукт, служащий матрицей, и праймеры, имеющие последовательность, показанную в БЕО ΙΌ N0 З1 или З2 списка последовательностей, использовали для амплификации продукта длиной примерно 400 п.н. с помощью способа амплификации по настоящему изобретению с получением указанного негативного контроля. Пять растворов ДНК , т.е. реакционная смесь в своей исходной концентрации или её 2-, 4-, 8- или 16кратные разведения в карбонатном буфере (карбонатный буфер в концентрации 50 мМ использовали для разведения в каждом случае), использовали для «раскапывания».

6. Отрицательный контроль. ДНКфрагмент, полученный выше в (5), обрабатывали с помощью М1сгосоп-100. Затем пять растворов ДНК приготавливали путём доведения концентраций до 0,125, 0,25, 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/мкл с использованием 50 мМ карбонатного буфера.

Полученные таким образом соответствующие растворы ДНК раскапывали на предметное стекло, на которое были нанесены аминогруппы (Ма18ипат1 С1а88), с использованием оборудования для изготовления ДНК-чипов (СепеЕс МюгокукЮтк (СМБ)), и иммобилизовали с помощью УФ-облучения. Предметное стекло промывали 0,2%-ным ДСН и затем дистиллированной водой, высушивали и затем использовали в качестве матрицы ДНК.

ПЦР-амплифицированный продукт (З00 п.н.), полученный с использованием комбинации праймеров, характеризующихся последовательностью, показанной в БЕО ΙΌ N0 29 или З0 списка последовательностей, помечали Су5 с использованием набора ЬаЬе1 ΙΤ Су5® ЬаЬеНид кН (Такага Б1и^о) для использования его в качестве зонда. Гибридизацию осуществляли с использованием прегибридизационного раствора и гибридизационного раствора, которые описаны в инструкциях, прилагающихся к 1п1еШСепе (Такага Б1и^о). Сначала матрицу ДНК подвергали прегибридизации при комнатной температуре в течение 2 ч. Гибридизационный раствор, содержащий денатурированный Су5-помеченный зонд, наносили каплями на матрицу ДНК. Сверху размещали покровное стекло. Поверхности предметного стекла закрывали плёнкой. Упакованную матрицу ДНК инкубировали при 65°С в течение 1З ч. После этого удаляли покровное стекло, матрицу ДНК промывали в 2хББС при 65°С в течение 5 мин в растворе, содержащем 0,2хББС, и 0,1% ДСН при 65°С - в течение 5 мин и наконец в 0,2хББС при комнатной температуре в течение 5 мин и высушивали на воздухе. Затем матрицу ДНК подвергали микроматричному сканированию (СМБ) с це лью анализа флуоресцентных сигналов на соответствующих пятнах.

В результате флуоресцентный сигнал был выявлен в каждом из положений, на которые были нанесены фрагменты, амплифицированные методом ПЦР (положительные контроля в соответствии с описанным выше в З и 4) и с помощью способа по настоящему изобретению (образцы в соответствии с описанным выше в 1 и 2). Интенсивность сигналов была следующей: образец 2 > положительный контроль 4 > образец 1 > положительный контроль З. С другой стороны, для всех отрицательных контролей 5 и 6 сигналы отсутствовали. Полученные результаты подтверждают, что неочищенный или очищенный ДНК-фрагмент, амплифицированный с помощью способа по настоящему изобретению, может быть предпочтительно использован в качестве ДНК-фрагмента, предназначенного для иммобилизации при изготовлении ДНК-чипа.

Пример 12.

(1) Анализировали конструирование праймера, использованного в способе по настоящему изобретению, в котором ПЦР-амплифицированный фрагмент используют в качестве матрицы. Сначала праймеры, имеющие одну из последовательностей, показанных в БЕО ΙΌ N0 З6-41 списка последовательностей, синтезировали в соответствии со стандартным методом.

Структура соответствующих праймеров такова:

(ί) праймер К1-Б1: от 5'-конца - 7 нуклеотидов спейсерной последовательности, 17 нуклеотидов последовательности М1ЗКУ (или последовательности КУ; нуклеотидная последовательность праймера М1ЗКУ (Такага Б1и.^о)) и 20 нуклеотидов смысловой праймерной последовательности для ПЦР, специфичной для ДНК λфага;

(ίί) праймер К1-АЗ: от 5'-конца - 7 нуклеотидов спейсерной последовательности, 17 нуклеотидов последовательности М1ЗКУ и 20 нуклеотидов антисмысловой праймерной последовательности для ПЦР, специфичной для ДНК λфага;

(ш) праймер К2-Б1: от 5'-конца - 25 нуклеотидов спейсерной последовательности, 17 нуклеотидов последовательности М1ЗКУ и 20 нуклеотидов смысловой праймерной последовательности для ПЦР, специфичной для ДНК λфага;

(ίν) праймер К2-АЗ: от 5'-конца - 25 нуклеотидов спейсерной последовательности, 17 нуклеотидов последовательности М1ЗКУ и 20 нуклеотидов антисмысловой праймерной последовательности для ПЦР, специфичной для ДНК λ-фага;

(ν) праймер КЗ-Б1: от 5'-конца - 58 нуклеотидов спейсерной последовательности, 17 нуклеотидов последовательности М1ЗКУ и 20 нуклеотидов смысловой праймерной последова тельности для ПЦР, специфичной для ДНК λфага;

(νί) праймер К3-А3: от 5'-конца - 58 нуклеотидов спейсерной последовательности, 17 нуклеотидов последовательности М13КУ и 20 нуклеотидов антисмысловой праймерной последовательности для ПЦР, специфичной для ДНК λ-фага.

20-мерная последовательность М13КУ имеет последовательность всего из 20 нуклеотидов и состоит из 17 нуклеотидов последовательности М13КУ и 3 нуклеотидов с 5'-конца. Следовательно, когда 20-мерный М13КУ используется в способе по настоящему изобретению, то длина спейсерных последовательностей у упомянутых выше праймеров составляет 4 нуклеотида, 22 нуклеотида и 55 нуклеотидов, соответственно. Праймеры без спейсерной последовательности также были сформированы в качестве контрольных по отношению к упомянутым выше праймерам.

Например, когда используют пару праймеров - праймер К1-81 и праймер К1-А3, - то получают амплифицированный фрагмент длиной 348 п.н. По 7 нуклеотидов на обоих концах амплифицированного фрагмента соответствуют спейсерным сегментам. Последовательности КУ расположены внутрь от спейсерных сегментов. Последовательности λ-ДНК расположены внутрь от последовательностей КУ.

Сходным образом, когда используют пару праймеров - праймер К2-81 и праймер К2-А3, то получают амплифицированный фрагмент длиной 384 п.н., в котором по 25 нуклеотидов на обоих концах амплифицированного фрагмента соответствуют спейсерным сегментам. Кроме того, когда используют пару праймеров праймер К3-81 и праймер К3-А3, - то получают амплифицированный фрагмент длиной 450 п.н., в котором по 58 нуклеотидов на обоих концах амплифицированного фрагмента соответствуют спейсерным сегментам. С другой стороны, во фрагменте, амплифицированном с использованием контрольных праймеров, не было спейсерного сегмента. Эти ПЦР-амплифицированные фрагменты использовали в качестве матриц для следующего анализа.

Один из двух праймеров - 17-мерный праймер Μ13Κν-2Ν или 20-мерный праймер Μ13Κν-2Ν, имеющие последовательность в соответствии с показанным в 8ЕО ΙΌ ΝΟ 42 или 43 списка последовательностей, - использовали в данном примере. В составе этих праймеров первый и второй нуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды. Реакцию проводили следующим образом. 5 мкл смеси 20 мкМ праймера, примерно 20 нг матрицы и 0,01% пропилендиамина денатурировали при 98°С в течение 2 мин и затем охлаждали до 55°С. После этого 34 мМ трицинового буфера (рН=8,7), 10 мМ хлорида калия, 10 мМ сульфата аммония, 0,01%

БСА, 1% ДМСО, 4 мМ ацетата магния, по 0,5 мМ каждого 6ΝΤΡ5. 1 ед. ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т и 15 ед. РНКазы-Н добавляли к полученному с достижением конечного объёма реакции 25 мкл.

Реакционную смесь инкубировали при 55°С в течение 1 ч. По завершении реакции смесь охлаждали до 4°С и затем к полученному добавляли 2,5 мкл 0,5 М ЭДТА с целью остановки реакции. 3 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле Nи8^еνе 3:1 (Такага 81шхо). В результате, при использовании 17-мерного Μ13Κν-2Ν повышение эффективности амплификации было выявлено в зависимости от длины спейсерной последовательности в следующем порядке: 25нуклеотидный > 7-нуклеотидный > 58-нуклеотидный > без спейсерной последовательности. При использовании 20-мерного праймера Μ13Κν-2Ν повышение эффективности амплификации было выявлено в зависимости от длины спейсерной последовательности в следующем порядке: 22-нуклеотидный > 4-нуклеотидный > 55-нуклеотидный > без спейсерной последовательности. Более того, когда последовательности М13КУ в праймерах, описанных выше в (ί)-(ίν), заменяли на последовательности М13М4, то для отношений между спейсерной последовательностью и эффективностью амплификации была выявлена сходная тенденция. Таким образом, было подтверждено, что, когда линейный фрагмент, такой как ПЦРамплифицированный фрагмент, используют в качестве матрицы, тогда конструирование праймеров, используемых в способе по настоящему изобретению, с внесением спейсерной последовательности (сегмента), приводит к повышению эффективности амплификации.

(2) Анализировали амплификацию матрицы, характеризующейся высоким содержанием пары ОС, с помощью способа амплификации нуклеотидной последовательности с использованием повышения температуры реакции. Сначала были сформированы праймеры, имеющие последовательность, показанную в 8ЕО ΙΌ ΝΟ 44 или 45 списка последовательности, для ПЦРамплификации участка длиной 307 п.н. (содержание пары ОС - 62,5%) из состава гена ΡΙ88 ЬКЕ, кодирующего СБС2-подобную протеинкиназу (ОепВапк: депозитарный № АА789328). Кроме того, были получены праймеры, имеющие последовательность, показанную в 8ЕО ΙΌ ΝΟ 46 или 47 списка последовательностей, для ПЦР-амплификации участка длиной 284 п.н. (содержание пары ОС - 61,3%) из состава гена, кодирующего цитоскелетный кератин-1 ΙΙ-го типа (ОепВапк: депозитарный № АА706022). ПЦР-амплификацию осуществляют с использованием этих праймеров и имеющихся в продаже фрагментов ДНК (Кекеагсй Оепейск) в качестве матриц. Соответствующие ПЦР-амплифицированные фрагменты, полученные с использова73 нием указанных выше пар праймеров, включают спейсерные последовательности и последовательности М13КУ на обоих концах. Фрагменты использовали в качестве матриц для настоящего изобретения.

В данном примере использовали 17мерный праймер М13КУ-2Ы, характеризующийся последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0 42 списка последовательностей, или 20мерный праймер Μ13Κν-2Ν, характеризующийся последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0 43 списка последовательностей. В этих праймерах первый и второй нуклеотиды с 3'конца заменены рибонуклеотидами.

Реакцию осуществляли следующим образом.

мкл смеси 100 пкмоль праймера, 20 нг матрицы и 0,01% пропилендиамина денатурировали при 98°С в течение 2 мин и затем охлаждали до 55 или 60°С. После этого к полученному добавляли 34 мМ трицинового буфера (рН=8,7), 10 мМ КС1, 10 мМ сульфата аммония, 0,01% БСА, 1% ДМСО, 4 мМ ацетата магния, по 0,5 мМ каждого 6ΝΤΡ§, 11 ед. ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т и 30 ед. РНКазы-Н с получением конечного объёма реакции 50 мкл. Реакционную смесь инкубировали при 55 или 60°С в течение 1 ч. По завершении реакции смесь охлаждали до 4°С. 3 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле. Полученные результаты показаны ниже в табл. 1.

Таблица 1

Температура реакции	Использованные праймеры	Ген и результаты амплификации
СЭС2киназа	цитоскелетный кератин ΙΙ
55°С	М13К\’-2\\17-мер	++	++
М13К\’-2\\20-мер	++	++
60°С	М13К\’-2\217-мер	+	+
М13К\’-2\220-мер	++++	++++
от «+» до «++++» - степень амплификации оценивали по 4балльной системе; «-» -амплификация отсутствовала

Как показано в табл. 1, интересующий сегмент эффективно амплифицируется даже тогда, когда используется матрица, характеризующаяся высоким содержанием пары ОС. Такую амплификацию проводили при повышении температуры (с 55 до 60°С) и с использованием в случае проведения реакции при 60°С праймера, характеризующегося более высоким значением Тт по сравнению с праймером, оптимальным для реакции при 55°С.

(3) Анализировали отношение между длиной амплифицированного фрагмента и количеством амплификационного продукта в способе амплификации нуклеотидной последовательности в условиях высокой температуры реакции. Сначала пару праймеров, характеризующихся последовательностью, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0 48 или 49 списка последовательностей, для амплификации участка ДНК λ-фага длиной 800

п.н. (Такага δΐιιιζο). и пару праймеров, характеризующихся последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0 50 или 51 списка последовательностей, для амплификации участка ДНК λ-фага длиной 400 п. н. синтезировали в соответствии со стандартным методом. ПЦР проводили с использованием одной из этих пар праймеров и λДНК в качестве матрицы с получением амплифицированного фрагмента. Амплифицированный фрагмент длиной примерно 1,1 т.п.н. также был получен с использованием плазмиды рИС19-911 в соответствии с описанным в примере 5 (1) в качестве матрицы и праймера МЕ2 (24) и праймера МК1 (24), которые характеризовались последовательностями, показанными в 8Е0 ΙΌ N0 16 и 17 списка последовательностей, соответственно. ПЦР-амплифицированные фрагменты, полученные с использованием указанных выше пар праймеров, имели спейсерные последовательности и последовательности Μ13ΚV или М4 по обоим концам. Эти фрагменты использовали в качестве матриц для настоящего изобретения.

В данном примере в качестве праймера использовали 17-мерный праймер Μ13ΚV-2N, имеющий последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0 42 списка последовательностей, или 20-мерный праймер Μ13ΚV-2N, имеющий последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0 43 списка последовательностей. В этих праймерах первый и второй нуклеотиды с 3’-конца заменены на рибонуклеотиды. Комбинацию 20мерного праймера МЕ3М4-3Н имеющего последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0 55 списка последовательностей, и 20-мерного праймера М13КУ-3^ имеющего последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0 43 списка последовательностей, а также комбинацию 24мерного праймера Μ13Μ4-3N и 24-мерного праймера Μ13ΚV-3N, характеризующихся последовательностями, показанными в 8Е0 ΙΌ N0 56 и 57 списка последовательностей, соответственно использовали для амплификации участка длиной приблизительно 1 т.п.н. В этих праймерах первые три нуклеотида с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Реакцию проводили следующим образом.

мкл смеси 10 пкмоль праймера, примерно 20 нг матрицы и 0,01% пропилендиамина денатурировали при 98°С в течение 2 мин и затем охлаждали до 55 или 60°С. После этого 34 мМ трицинового буфера (рН=8,7), 10 мМ хлорида калия, 10 мМ сульфата аммония, 0,01% БСА, 1% ДМСО, 4 мМ ацетата магния, по 0,5 мМ каждого 6NΤΡ5. 11 ед. ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т и 30 ед. РНКазы-Н добавляли к полученному, достигая конечного объёма реакции 50 мкл. Реакционную смесь инкубировали при 55 или 60°С в течение 1 ч. По завершении реакции смесь охлаждали до 4°С и затем к полученному добавляли 5 мкл раствора 0,5 М ЭДТА с целью остановки реакции. 3 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле М.18|еуе 3:1 (Такага 8Ннхо). Полученные результаты показаны ниже в табл. 2 и 3.

Таблица 2

Температура реакции	Использованные праймеры	Длина амплифицированного фрагмента и результаты
400 п.н.	800 п.н.
55°С	М13КУ-2\,17-мер	++	++
М13КУ-2\,20-мер	++	++
60°С	М13КУ-2\,17-мер	+	+
М13КУ-2\,20-мер	++++	++++
от «+» до «++++» - степень амплификации оценивали по 4балльной системе; «-» -амплификация отсутствовала

Как показано в табл. 2, фрагменты участков 400 п.н. и 800 п.н. были эффективно амплифицированы при наращивании длины праймера для амплификации от 17 до 20 нуклеотидов и путём повышения температуры реакции от 55 до 60°С.

Таблица 3

Температура реакции	Использованные праймеры	Длина амплифицированного фрагмента и результаты: 1034 п.н.
55°С	Μ13Κν-3Ν 20-мер и Μ13Μ4-3Ν 20-мер	++
Μ13Κν-3Ν 24-мер и Μ13Μ4-3Ν 24-мер	++
Μ13Κν-3Ν 20-мер и Μ13Μ4-3Ν 20-мер	+
65°С	Μ13Κν-3Ν 20-мер и Μ13Μ4-3Ν 20-мер	+
Μ13Κν-3Ν 24-мер и Μ13Μ4-3Ν 24-мер	++++
от «+» до «++++» - степень амплификации оценивали по 4балльной системе; «-» -амплификация отсутствовала

Кроме того, как показано в табл. 3, фрагмент участка длиной примерно 1 т.п.н. эффективно амплифицировался путём изменения длины амплификационного праймера с 20нуклеотидного на 24-нуклеотидный и путём повышения температуры реакции с 55 до 65°С. Кроме того, сходные результаты были получены для амплификации длинноцепочечного фрагмента ДНК в соответствии с описанным в примере 10 с использованием более длинных праймеров и повышенной температуры реакции. Повышение эффективности амплификации было выявлено тогда, когда амплифицировали участок длиной примерно 2 т.п.н. или больше.

Пример 13.

(1) В способе по настоящему изобретению анализировали использование теплоустойчивой ДНК-полимеразы, иной нежели ДНКполимераза Вса ВЕ8Т. ДНК-полимеразу Вк1 (№\ν Епд1апб В1о1аЬк) использовали в качестве теплоустойчивой ДНК-полимеразы. Пара праймеров - праймер 5'-ΙΌ и праймер 3'-ГО, характеризующиеся последовательностями, показанными в 8ЕЦ ΙΌ NО 52 и 53 списка последова тельностей соответственно, - была синтезирована в соответствии со стандартным методом. ПЦР осуществляли с использованием пары праймеров и имеющегося в продаже ДНКфрагмента гена циклина-А (Кекеагсй Сепейск) в качестве матрицы, в результате чего получили амплифицированный фрагмент длиной примерно 300 п. н. ПЦР-амплифицированный фрагмент, полученный с использованием пары праймеров, включал по обоим концам последовательность М13КУ. Фрагмент был использован в качестве матрицы в настоящем изобретении.

В качестве праймера в данном примере использовали 17-мерный праймер Μ13Κν-2Ν, имеющий последовательность, показанную в 8ЕЦ ΙΌ NО 42 списка последовательностей. В этом праймере первый и второй нуклеотиды с 3'-конца заменены рибонуклеотидами.

Реакцию проводили следующим образом.

мкл смеси 20 мкМ праймера, примерно 20 нг матрицы и 0,01% пропилендиамина денатурировали при 98°С в течение 2 мин и затем охлаждали до 55°С. После этого 34 мМ трицинового буфера (рН=8,7), 10 мМ хлорида натрия, 10 мМ сульфата аммония, 0,01% БСА, 1% ДМСО, 4 мМ ацетата магния, по 0,5 мМ каждого бЭТРк, 4, 8, 12 или 16 ед. ДНК-полимеразы Вк1 и 30 ед. РНКазы-Н добавляли к полученному с достижением конечного объёма реакции 50 мкл. В качестве контроля была приготовлена реакционная смесь, состав которой идентичен упомянутому выше, за исключением того, что использовали 11 ед. ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т. Реакционную смесь инкубировали при 55°С в течение 1 ч. По завершении реакции смесь охлаждали до 4°С и затем добавляли к полученному 5 мкл 0,5 М раствора ЭДТА для остановки реакции. 3 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле Ш8|еуе 3:1 (Такага 81шхо). В результате интересующий амплифицированный фрагмент был получен при использовании каждого количества единиц ДНК-полимеразы ВкЕ Таким образом, было подтверждено, что теплоустойчивые ДНК-полимеразы могут быть предпочтительно использованы в способе по настоящему изобретению.

(2) Анализировали использование мезофильной ДНК-полимеразы в способе по настоящему изобретению. Фрагмент Клёнова без 5'^3'-экзонуклеазной активности (-) (Такага 81шхо) использовали в качестве мезофильной ДНК-полимеразы. ДНК, приготовленную в соответствии с (1) выше, использовали в качестве ДНК-матрицы для способа по настоящему изобретению.

В качестве праймера в данном примере использовали 16-мерный праймер М13-КУ-2^ характеризующийся последовательностью, показанной в 8ЕЦ ΙΌ NО 54 списка последовательностей. В этом праймере первый и второй нуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Реакцию осуществляли следующим образом.

мкл смеси 20 мкМ праймера, примерно 20 нг матрицы и 0,01% пропилендиамина денатурировали при 98°С в течение 2 мин и затем охлаждали до 40°С. После этого 34 мМ трицинового буфера (рН=8,7), 10 мМ хлорида калия, 10 мМ сульфата аммония, 0,01% БСА, 1% ДМСО, 4 мМ ацетата магния, по 0,5 мМ каждого 6ΝΤΡ8, 0, 2, 4, 6 или 8 ед. фрагмента Клёнова и 30 ед. РНКазы-Н добавляли к полученному с достижением конечного объёма реакции 50 мкл. Реакционную смесь инкубировали при 40°С в течение 1 ч. По завершении реакции смесь охлаждали до 4°С и затем 5 мкл 0,5 М раствора ЭДТА добавляли к полученному с целью остановки реакции. 3 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле Νιιδίονο 3:1 (Лаката δΐιι,ιζο). В результате интересующий амплифицированный фрагмент был получен в случаях, когда использовали различное количество единиц фрагмента Клёнова, за исключением того случая, когда фрагмент Клёнова не был добавлен. Таким образом, было подтверждено, что мезофильные ДНКполимеразы могут быть предпочтительно использованы в способе по настоящему изобретению.

Пример 14.

Анализировали химерные олигонуклеотидные праймеры, предназначенные для использования в способе по настоящему изобретению. ДНК в качестве матрицы и праймеры синтезировали в соответствии с описанным в примере 1 (1). Структура праймеров, использованных в данном примере, подробно описана далее.

Пара праймеров 1. Комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕЦ ГО ΝΟ 2 или 3 списка последовательностей и полностью составленной дезоксирибонуклеотидами.

Пара праймеров 2. Комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕЦ ГО ΝΟ 59 или 60 списка последовательностей, в которой шестой и седьмой дезоксирибонуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Пара праймеров 3. Комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕЦ ГО ΝΟ 61 или 62 списка последовательностей, в которой пятый и шестой дезоксирибонуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Пара праймеров 4. Комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕЦ ГО ΝΟ 63 или 64 списка последовательностей, в которой четвёртый и пятый дезоксирибонуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Пара праймеров 5. Комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕЦ ГО ΝΟ 65 или 66 списка последовательностей, в которой третий и четвёртый дезоксирибонуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Пара праймеров 6. Комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕЦ ГО ΝΟ 67 или 68 списка последовательностей, в которой второй и третий дезоксирибонуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Пара праймеров 7. Комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕЦ ГО ΝΟ 2 или 3 списка последовательностей, в которой первый и второй дезоксирибонуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Пара праймеров 8. Комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕЦ ГО ΝΟ 67 или 68 списка последовательностей, в которой второй и третий дезоксирибонуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды, а фосфатная связь со стороны 5'-конца третьего с 3'-конца рибонуклеотида заменена на фосфотиоатную связь.

Условия амплификации и способ выявления соответствовали описанному в примере 1 (2) и (3). В результате амплифицированный фрагмент, имеющий интересующую длину, был получен для каждой из пар праймеров 2-8. Для пар праймеров 2-7 количество амплифицированного продукта возрастало по мере того, как число дезоксирибонуклеотидов на 3'-конце уменьшалось. В частности, наибольшее количество продукта амплификации было выявлено для пары праймеров 7, у которых на 3'-конце дезоксирибонуклеотидов не было. С другой стороны, не было выявлено амплифицированного фрагмента для пары праймеров 1. Более того, тот факт, что интересующие амплифицированные фрагменты были получены для пар праймеров и 6, и 8, подтверждает, что и модифицированный рибонуклеотид, и немодифицированный рибонуклеотид может быть предпочтительно использован в качестве рибонуклеотида, входящего в состав праймера для способа по настоящему изобретению.

Промышленное применение

Настоящее изобретение представляет удобный и эффективный способ амплификации нуклеотидной последовательности, характеризующийся тем, что реакцию синтеза ДНК осуществляют в присутствии химерного олигонуклеотидного праймера. Настоящее изобретение представляет способ получения амплифицированного ДНК-фрагмента в больших количествах. Эффективный способ амплификации нуклеотидной последовательности также представляется с учётом сочетания способа амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению с другим методом ам плификации нуклеиновых кислот. Более того, настоящее изобретение представляет способ выявления нуклеотидной последовательности для целей выявления или количественного анализа микроорганизма, такого как вирус, бактерия, грибок и дрожжи, равно как и способ выявления в режиме реального времени амплифицированного фрагмента ДНК, полученного с помощью способа по настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение представляет способ крупномасштабного секвенирования генов.

Пояснения к списку последовательностей 8ЕЦ ΙΌ N0 1 - синтетическая ДНК, соответствующая участку используемой в качестве матрицы последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

8ЕЦ ΙΌ N0 2 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

8ЕЦ ΙΌ N0 З - сконструированный олиго нуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

8ЕЦ ΙΌ N0 4 - сконструированный олигонуклеотид, используемый в качестве зонда для выявления амплифицированного сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

8ЕЦ ΙΌ N0 5 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как рИС19 иррег (2) NN для амплификации сегмента плазмиды рИС19.

8ЕЦ ΙΌ N0 6 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как рИС19 1о\\'ег NN для амплификации сегмента плазмиды рИС19.

8ЕЦ ΙΌ N0 7 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента плазмиды рИС19.

8ЕЦ ΙΌ N0 8 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как рИС19 1о\\^гег 542, для амплификации сегмента плазмиды рИС19.

8ЕЦ ΙΌ N0 9 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента плазмиды рИС19.

8ЕЦ ΙΌ N0 10 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как рИС19 иррег 150, для амплификации сегмента плазмиды рИС19.

8ЕЦ ΙΌ N0 11 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как рИС19 иррег 249, для амплификации сегмента плазмиды рИС19.

8ЕЦ ΙΌ N0 12 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

8ЕЦ ΙΌ N0 1З - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

8ЕЦ ΙΌ N0 14 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

8ЕЦ ΙΌ N0 15 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

8ЕЦ ΙΌ N0 16 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как МЕ2Ш (24), для амплификации сегмента плазмиды рИС19-249 или плазмиды рИС 19-911.

8ЕЦ ΙΌ N0 17 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как МВШЗ (24), для амплификации сегмента плазмиды рИС19-249 или плазмиды рИС 19-911.

8ЕЦ ΙΌ N0 18 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента плазмиды рИС19.

8ЕЦ ΙΌ N0 19 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как МВШЗ, для амплификации сегмента плазмиды рИС19.

8ЕЦ Ш N0 20 - синтетическая РНК, используемая в качестве зонда для выявления амплифицированного сегмента плазмиды рИС19.

8ЕЦ ΙΌ N0 21 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей веротоксин-1 геморрагического штамма О-157 ЕксНепсЫа соН.

8ЕЦ ΙΌ N0 22 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей веротоксин-1 геморрагического штамма О-157 ЕксНепсЫа соН.

8ЕЦ ΙΌ N0 2З - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей веротоксин-2 геморрагического штамма О-157 ЕксНепсЫа соН.

8ЕЦ ΙΌ N0 24 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей веротоксин-2 геморрагического штамма О-157 ЕксНепсЫа соН.

8ЕЦ ΙΌ N0 25 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как МСВ-Р, для амплификации длинного ДНКфрагмента.

8ЕЦ ΙΌ N0 26 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как МСВ-В, для амплификации длинного ДНКфрагмента.

8ЕЦ ΙΌ N0 27 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как МЕ2Ш (24), для амплификации длинного ДНКфрагмента.

8ЕЦ ΙΌ N0 28 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как

ΜΒ1Ν3 (24), для амплификации длинного ДНКфрагмента.

8ЕО ΙΌ ΝΟ 29 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8ЕО ΙΌ ΝΟ 30 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8ЕО ΙΌ ΝΟ 31 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8ЕО ΙΌ ΝΟ 32 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8ЕО ΙΌ ΝΟ 33 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8ЕО ΙΌ ΝΟ 34 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8ЕО ΙΌ ΝΟ 35 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8ЕО ΙΌ ΝΟ 36 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как В.1-81, для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 37 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как В1-А3, для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 38 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как К2-81, для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 39 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как К2-А3, для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 40 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как Κ3-81, для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 41 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как К3-А3, для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 42 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как Μ13Βν-2Ν 17-мер.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 43 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как Μ13Βν-2Ν 20-мер.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 44 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента гена СОС2-родственной протеинкиназы Р188РРЕ.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 45 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента гена СОС2-родственной протеинкиназы Р188РРЕ.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 46 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента гена цитоскелетного кератина-11 ΙΙ-го типа.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 47 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента гена цитоскелетного кератина-11 ΙΙ-го типа.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 48 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 49 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 50 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 51 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 52 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как 5ΊΌ, для амплификации сегмента ДНК циклинаА.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 53 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как 3ΊΌ, для амплификации сегмента ДНК циклинаА.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 54 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как Μ13Κ.ν-2Ν 16-мер.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 55 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как Μ13Μ4-3Ν 16-мер.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 56 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как Μ13Μ4-3Ν 24-мер.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 57 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как Μ13Κ.ν-3Ν 24-мер.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 58 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как М13М4 17-мер.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 59 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 60 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 61 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 62 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 63 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

8Е0 ΙΌ N0 64 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

8Е0 ΙΌ N0 65 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

8Е0 ΙΌ N0 66 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

8Е0 ΙΌ N0 67 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

8Е0 ΙΌ N0 68 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ амплификации нуклеотидной последовательности, отличающийся тем, что способ включает (a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (Ь), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи.
2. Способ по п.1, где стадию (Ь) и стадию (с) последовательно повторяют.
3. Способ амплификации нуклеотидной последовательности с использованием по крайней мере двух праймеров, отличающийся тем, что способ включает (а) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид;

(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (Ь), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (Ь);

(б) обработку высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (с), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который отличается от использованного на стадии (а) праймера, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причём праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (а), является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности вытесненной цепи и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(е) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (б), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (ί) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (е), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (е).
4. Способ по любому из пп.1-3, где соответствующие стадии осуществляют в изотермических условиях.
5. Способ по любому из пп.1-4, где используют такую ДНК-полимеразу, которая обладает активностью по вытеснению цепи.
6. Способ по любому из пп.1-5, где ДНКполимеразу выбирают из группы, которая включает фрагмент Клёнова ДНК-полимеразы Ι ЕксйепсЫа сой, ДНК-полимеразу В 51, лишённую 5'^3'-экзонуклеазной активности, от ВасШик 81еаго1йегторй11ц8 и ДНК-полимеразу Вса, лишённую 5'^3'-экзонуклеазной активности, от ВасШик са1ао1епах.
7. Способ по любому из пп.1-6, где эндонуклеаза является эндорибонуклеазой.
8. Способ по п.7, где эндорибонуклеазой является РНКаза-Н.
9. Способ по любому из пп.1-8, где химерный олигонуклеотидный праймер включает два или большее число расположенных подряд рибонуклеотидных остатков.
10. Способ по любому из пп.1-9, где химерный олигонуклеотидный праймер включает один или большее число модифицированных рибонуклеотидов.
11. Способ по п.10, где химерный олигонуклеотидный праймер включает (α-З)рибонуклеотид, в котором атом кислорода, связанный с атомом фосфора по α-положению рибонуклеотида, заменён на атом серы.
12. Способ по любому из пп.1-11, который осуществляют в буфере, содержащем буферный компонент, выбранный из группы, включающей трицин, фосфат и Трис.
13. Способ амплификации нуклеотидной последовательности, отличающийся тем, что способ включает (a) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную с праймера цепь, причём праймером является химерный олигонуклеотидный праймер, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей, и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой; и (b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.
14. Способ по п.13, где реакционную смесь инкубируют в изотермических условиях.
15. Способ по п.13 или 14, где реакционная смесь дополнительно содержит химерный олигонуклеотидный праймер, характеризующийся последовательностью, которая, по существу, гомологична нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей.
16. Способ по любому из пп.13-15, где ДНК-полимеразу выбирают из группы, которая включает фрагмент Клёнова ДНК-полимеразы Ι ЕксйепсЫа сой, ДНК-полимеразу В 81, лишённую 5'^3'-экзонуклеазной активности, от ВасШцк 81еаго1йегторййц8 и ДНК-полимеразу Вса, лишённую 5'^3'-экзонуклеазной активности, от ВасШик са1ао1епах.
17. Способ по любому из пп.13-16, где эндонуклеаза является эндорибонуклеазой.
18. Способ по п.17, где эндорибонуклеазой является РНКаза-Н.
19. Способ по любому из пп.13-18, где химерный олигонуклеотидный праймер включает два или большее число расположенных подряд рибонуклеотидных остатков.
20. Способ по любому из пп.13-19, где химерный олигонуклеотидный праймер включает один или большее число модифицированных рибонуклеотидов.
21. Способ по п.20, где химерный олигонуклеотидный праймер включает (α-З)рибонуклеотид, в котором атом кислорода, связанный с атомом фосфора по α-положению рибонуклеотида, заменён на атом серы.
22. Способ по любому из пп.13-21, который осуществляют в буфере, содержащем буферный компонент, выбранный из группы, включающей трицин, фосфат и Трис.
23. Способ по любому из пп.1-22, где нуклеиновая кислота, служащая матрицей, является одноцепочечной ДНК или двухцепочечной ДНК.
24. Способ по п.23, который осуществляют после конверсии двухцепочечной ДНК, служащей матрицей, в одноцепочечные ДНК.
25. Способ по п.23 или 24, где нуклеиновой кислотой, служащей матрицей, является кДНК, полученная на материале РНК в реакции обратной транскрипции.
26. Способ по п.25, который осуществляют после синтеза кДНК в реакции обратной транскрипции с использованием РНК в качестве матрицы.
27. Способ по п.26, где праймер, выбранный из группы, которая включает олиго-дТпраймер, случайный праймер и специфичный праймер, используют в качестве праймера в реакции обратной транскрипции.
28. Способ по п.26 или 27, где химерный олигонуклеотидный праймер используют в качестве праймера в реакции обратной транскрипции.
29. Способ по любому из пп.26-28, где ДНК-полимеразу, обладающую обратнотранскриптазной активностью, используют в качестве обратной транскриптазы.
30. Способ по любому из пп.26-29, где реакцию обратной транскрипции и синтез достроенной цепи, которая комплементарна матрице, осуществляют с использованием такой ДНК полимеразы, которая обладает активностью обратной транскриптазы и активностью по вытеснению цепи.
31. Способ по п.28, где ДНК-полимеразой является ДНК-полимераза Вк1. лишённая 5'^3'экзонуклеазной активности, от ВасШик к1еагоШегтор11Ш1К или ДНК-полимераза Вса, лишённая 5'^3'-экзонуклеазной активности, от ВасШик са1йо1епах.
32. Способ по любому из пп.25-31, где РНК, служащая матрицей в реакции обратной транскрипции, является РНК, амплифицированной в реакции амплификации нуклеиновых кислот.
33. Способ по п.32, который осуществляют после синтеза амплифицированного РНКфрагмента с помощью реакции амплификации нуклеиновых кислот, используя РНК в качестве матрицы.
34. Способ по п.32 или 33, где реакцию амплификации нуклеиновых кислот выбирают из группы, которая включает метод с транскрипционной амплификационной системой (ТА8), метод самоподдерживающейся репликации последовательности (38К), специфичный по конкретной последовательности метод амплификации ^А8ВА), метод амплификации, опосредованной транскрипцией (ТМА), и метод с репликазой Οβ.
35. Способ по п.23 или 24, где нуклеиновой кислотой, служащей матрицей, является ДНК, полученная в реакции амплификации нуклеиновых кислот.
36. Способ по п.35, который осуществляют после синтеза амплифицированного ДНКфрагмента в реакции амплификации нуклеиновых кислот с использованием ДНК в качестве матрицы.
37. Способ по п.36, где реакцию амплификации нуклеиновых кислот выбирают из группы, которая включает метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), метод лигазной цепной реакции (ЛЦР) и метод амплификации с вытеснением цепи (8ΌΑ).
38. Способ по любому из пп.32-37, где случайный праймер или вырожденный праймер используют в реакции амплификации нуклеиновых кислот.
39. Способ по п.38, где случайный праймер или вырожденный праймер является праймером, характеризующимся случайной последовательностью или вырожденной последовательностью по крайней мере с 3'-конца или со стороны 3'конца.
40. Набор, используемый в способе амплификации нуклеотидной последовательности по любому из пп.1-39, который находится в упакованной форме и содержит инструкции, которые объясняют использование ДНКполимеразы и эндонуклеазы в реакции вытеснения цепи.
41. Набор по п.40, который содержит ДНКполимеразу и/или эндонуклеазу.
42. Набор по п.41, который упакован и содержит:

(a) ДНК-полимеразу, обладающую активностью по вытеснению цепи;

(b) эндонуклеазу; и (c) буфер для реакции вытеснения цепи.
43. Набор, используемый в способе амплификации нуклеотидной последовательности по любому из пп.1-39, который содержит ДНКполимеразу, обладающую активностью по вытеснению цепи и/или эндонуклеазу.
44. Набор по любому из пп.41-43, который содержит ДНК-полимеразу, выбранную из группы, которая включает фрагмент Клёнова ДНК-полимеразы I ЕксНепсЫа со11, ДНКполимеразу Вк1, лишённую 5'^3'-экзонуклеазной активности, от ВасШик к1еагоШегторЫ1ик и ДНК-полимеразу Вса, лишённую 5'^3'-экзонуклеазной активности, от ВасШик са1йо1епах.
45. Набор по любому из пп.41-43, который содержит РНКазу-Н в качестве эндонуклеазы.
46. Способ выявления нуклеиновой кислоты-мишени в образце, отличающийся тем, что способ включает (a) амплификацию нуклеиновой кислотымишени с помощью способа амплификации нуклеотидной последовательности по любому из пп.1-39; и (b) выявление нуклеиновой кислотымишени, амплифицированной на стадии (а).
47. Способ по п.46, где амплифицированную нуклеиновую кислоту-мишень выявляют с использованием рибонуклеотидного (РНК) зонда, помеченного двумя или большим числом флуоресцентных веществ, расположенных на таком расстоянии, которое обеспечивает тушение сигнала.
48. Набор, используемый для способа выявления нуклеиновой кислоты-мишени по п.46 или 47, который находится в упакованной форме и содержит инструкции, которые объясняют использование ДНК-полимеразы и эндонуклеазы в реакции вытеснения цепи.
49. Набор по п.48, который содержит ДНКполимеразу и/или эндонуклеазу.
50. Набор по п.48, который упакован и содержит (a) ДНК-полимеразу, обладающую активностью по вытеснению цепи;

(b) эндонуклеазу и (c) буфер для реакции вытеснения цепи.
51. Набор по любому из пп.48-50, который содержит ДНК-полимеразу, обладающую активностью по вытеснению цепи и/или эндонуклеазу.
52. Набор по любому из пп.49-51, который содержит ДНК-полимеразу, выбранную из группы, которая включает фрагмент Клёнова ДНК-полимеразы I ЕксНепсЫа со11, ДНК полимеразу В 81, лишённую 5'^3'-экзонуклеазной активности, от ВасШик к1еаго1НегторЫ1ик и ДНК-полимеразу Вса, лишённую 5'^3'-экзонуклеазной активности, от ВасШик са1бо1епах.
53. Набор по любому из пп.49-51, который содержит РНКазу-Н в качестве эндонуклеазы.
54. Способ получения продукта, имеющего иммобилизованную нуклеиновую кислоту, на котором нуклеиновая кислота размещена в заданном участке, отличающийся тем, что способ включает (a) амплификацию нуклеиновой кислоты, которая должна быть иммобилизована, с помощью способа амплификации нуклеотидной последовательности по любому из пп.1-39 и (b) размещение и иммобилизацию нуклеиновой кислоты, амплифицированной на стадии (а), в заданном участке субстрата.
55. Способ по п.54, где одноцепочечную нуклеиновую кислоту, которая, по существу, свободна от комплементарной ей цепи, амплифицируют, размещают и иммобилизуют в заданном участке субстрата.
56. Способ выявления нуклеиновой кислоты-мишени в образце, отличающийся тем, что способ включает (a) приготовление образца нуклеиновых кислот, в котором предполагается наличие нуклеиновой кислоты-мишени;

(b) контактирование образца нуклеиновых кислот с продуктом, имеющим иммобилизованную нуклеиновую кислоту, которая размещена в заданном участке и который получен способом по любому из пп.54-55; и (c) выявление нуклеиновой кислотымишени в образце нуклеиновых кислот, которая гибридизует с нуклеиновой кислотой на продукте.
57. Способ получения нуклеиновой кислоты в больших количествах, отличающийся тем, что способ включает (a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (Ь), отщепляют с обеспечением вытеснения цепи.
58. Способ получения нуклеиновой кислоты в больших количествах с использованием по крайней мере двух праймеров, отличающийся тем, что способ включает (a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид;

(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (Ь), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (Ь);

(б) обработку высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (с), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который отличается от праймера, использованного на стадии (а), и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причём праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (а), является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности вытесненной цепи и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(е) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (б), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (Г) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (е), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (е).
59. Способ получения нуклеиновой кислоты в больших количествах, отличающийся тем, что способ включает (a) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную с праймера цепь, причём праймером является химерный олигонуклеотидный праймер, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей, и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой; и (b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.
60. Способ амплификации нуклеотидной последовательности, отличающийся тем, что способ включает (a) амплификацию нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, предназначенную для амплификации, с помощью реакции амплификации нуклеиновой кислоты для получения нуклеиновой кислоты, служащей матрицей;

(b) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, полученной на стадии (а), по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(c) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (Ь), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (б) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (с), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи.
61. Способ амплификации нуклеотидной последовательности с использованием по крайней мере двух праймеров, отличающийся тем, что способ включает (a) амплификацию нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, предназначенную для амплификации, с помощью реакции амплификации нуклеиновой кислоты для получения нуклеиновой кислоты, служащей матрицей;

(b) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, полученной на стадии (а), по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(c) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (Ь), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид;

(б) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (с), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (с);

(е) обработку высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (б), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который отличается от праймера, использованного на стадии (Ь), и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причём праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (Ь), является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности вытесненной цепи и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(Γ) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (е), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (д) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (1), отщепляют с целью вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (1).
62. Способ амплификации нуклеотидной последовательности, отличающийся тем, что способ включает (a) амплификацию нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, предназначенную для амплификации, с помощью реакции амплификации нуклеиновой кислоты для получения нуклеиновой кислоты, служащей матрицей;

(b) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, полученной на стадии (а), дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную цепь, образованную от праймера, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид помещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой; и (c) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.
63. Способ по любому из пп.60-62, где реакцию амплификации нуклеиновой кислоты для получения нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, выбирают из группы, которая включает метод ТА8, метод 38К, метод МАЗВА, метод ТМА, метод с репликазой Οβ, метод ПЦР, метод ЛЦР и метод 8ΌΑ.
64. Способ по п.63, где случайный праймер или вырожденный праймер используют в реакции амплификации нуклеиновой кислоты.
65. Способ по п.64, где случайный праймер или вырожденный праймер является праймером, имеющим случайную последовательность или вырожденную последовательность, по крайней мере, на 3'-конце или со стороны 3'-конца.
66. Способ амплификации нуклеотидной последовательности, отличающийся тем, что способ включает (а) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера;

(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (Ь), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи.
67. Способ амплификации нуклеотидной последовательности с использованием по крайней мере двух праймеров, отличающийся тем, что способ включает (a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера;

(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид;

(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (Ь), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (Ь);

(6) обработку высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (с), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который отличается от праймера, использованного на стадии (а), и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причём праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (а), является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности вытесненной цепи и вклю чает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера;

(е) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (б), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (ί) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (е), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (е).
68. Способ амплификации нуклеотидной последовательности, отличающийся тем, что способ включает (a) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную цепь, образованную от праймера, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера; и (b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.
69. Способ амплификации нуклеотидной последовательности, отличающийся тем, что способ включает (a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера, причём эндонуклеаза отщепляет по сайту, который включает рибонуклеотид;

(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид;

(с) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (Ь), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи.
70. Способ амплификации нуклеотидной последовательности с использованием по крайней мере двух праймеров, отличающийся тем, что способ включает (a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера, причём эндонуклеаза отщепляет по сайту, который включает рибонуклеотид;

(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид;

(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (Ь), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (Ь);

(б) обработку высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (с), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который отличается от праймера, использованного на стадии (а), и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причём праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (а), является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности вытесненной цепи и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера, причём эндонуклеаза отщепляет по сайту, который включает рибонуклеотид;

(е) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (б), эндонуклеа зой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (Γ) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (е), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (е).
71. Способ амплификации нуклеотидной последовательности, отличающийся тем, что способ включает (a) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную цепь, образованную от праймера, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера, причём эндонуклеаза отщепляет по сайту, который включает рибонуклеотид; и (b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.
72. Способ определения нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, отличающийся тем, что способ включает амплификацию нуклеотидной последовательности в соответствии со способом по любому из пп.1-39 и 60-71.