KR100682576B1 - 핵산 서열 증폭 방법 - Google Patents

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Abstract

키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 존재에서 DNA 합성 반응에 작용하는 것으로 용이하고 효과적인 핵산 증폭 방법; 대량으로 DNA 증폭 단편을 공급하는 방법; 상기 방법과 또다른 핵산 서열 증폭 방법을 결합하여 핵산 서열을 증폭시키는 효과적인 방법; 바이러스, 박테리아, 진균 또는 효모과 같은 미생물을 검출하거나 측량하기 위한 핵산 서열 검출 방법; 및 상기 방법에 의해 수득한 DNA 증폭 단편 검출 방법.

Description

핵산 서열 증폭 방법{Method for amplifying nucleic acid sequence}
본 발명은 유전공학 분야에서 유용한 DNA 합성 방법에 관한 것이다. 본 발명은 주형으로서 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 방법 및 상기 방법에 의해 증폭된 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다.
DNA 합성은 유전 공학분야의 연구에서 다양한 목적으로 사용된다. 올리고뉴클레오타이드와 같은 단쇄 DNA의 합성을 제외한 대부분의 DNA 합성은 DNA 폴리머라아제를 사용하는 효소적 방법에 의해 수행된다. 상기 방법의 예는 미국 특허 제 4,683,195 호, 제 4,683,202호, 및 4,800,159호에 상세히 기재된 중합효소 연쇄반응(PCR)이다. 또다른 예는 (Trends in Biotechnology, 10:146-152(1992))에 기재된, PCR 방법 및 역전사 효소 반응의 조합인 역전사-PCR 방법이다. 상기-언급된 방법의 개발에 의해 DNA 또는 RNA로부터 관심의 대상이 되는 영역을 증폭시킬 수 있었다.
상기 언급된 DNA 합성 방법은 예를 들면, 3단계로 구성된 반응에 의해 수행된다. 3단계는 더블-스트랜드 DNA를 싱글-스트랜드로 해리(변성)시키는 단계, 싱글-스트랜드에 프라이머를 어닐링하는 단계 및 프라이머로부터 상보적 스트랜드(complementary strand)를 합성(신장)시켜 관심의 대상이 되는 영역을 증 폭시키는 단계이다. 또한, "셔틀 PCR(shuttle PCR)"로 명시되는, 3단계중 2단계, 즉 동일한 온도에서 프라이머를 어닐링하는 단계 및 신장 단계를 수행하는 반응을 사용하여 그것을 수행한다("PCR hosaizensen"(Recent advances in PCR methology: Basic methodology and it's application), Tanpakushitsu Kakusan Kouso, Bessatsu, (Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Supplement), 41(5):425-428(1996)).
또한, 1989년 6월 14일에 공개된 유럽 특허 제 320,308 호에 기재된 리가아제 연쇄반응(ligase chain reation(LCR)) 방법 또는 문헌(PCR Protocols, Academic Press Inc., 1990, pp.245-252)에 기재된 전사-기초 증폭 시스템(transcription-based amplication system(TAS))을 사용할 수 있다. 상기 언급된 4개의 방법은 다음 증폭 사이클을 위한 싱글-스트랜드 표적 분자를 재생시키기 위해 고온 및 저온에서 반응을 여러 차례 반복시키는 것을 필요로 한다. 상기 기재된 바와 같이 반응은 온도에 의해 제한되기 때문에 반응 시스템은 불연속 상 또는 사이클을 사용하여 수행되어야 한다.
따라서, 상기 방법들은 시간동안 광범위한 범위의 온도를 엄격히 조정할 수 있는 고가의 열 싸이클러(thermal cycler)의 사용을 필요로 한다. 또한, 반응은 두개 또는 3개의 예정된 것으로 온도를 조정하기 위한 시간을 필요로 한다. 사이클 수에 비례하여 낭비되는 시간은 증가한다.
상기 문제점을 해결하기 위해 등온에서 수행될 수 있는 핵산 증폭 방법이 개발되었다. 그의 예는 JP-B 7-114718호에 기재된 스트랜드 치환 증폭(SDA) 방법, 자 립복제(self-sustained sequence replicaiotn(3SR)) 방법, 일본 특허 제 2650159 호에 기재된 핵산서열 기초 증폭(NASBA) 방법, 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification(TMA)) 방법, 일본 특허 제 2710159호에 기재된 Qβ레플리카아제(replicase) 방법 및 미국 특허 제 5,824,517 호, WO 99/09211, WO 95/25180 및 WO 99/49081에 기재된 다양한 개량 SDA 방법을 포함한다. 올리고뉴클레오타이드의 등온 효소적 합성 방법은 미국 특허 제 5,916,777호에 기재되어 있다. 등온 핵산 증폭 또는 올리고뉴클레오타이드의 합성 방법의 반응에서 프라이머로부터의 신장 및/또는 프라이머로부터의 신장전에 수행되는 프라이머의 싱글-스트랜드 신장 산물(원 표적 서열)에의 어닐링은 등온에서 인큐베이션된 반응 혼합물중에서 동시에 수행된다.
등온 핵산 증폭 방법중에서, SDA 방법이 DNA를 최종적으로 증폭시키는 시스템의 한 예이다. SDA 방법은 DNA 폴리머라아제 및 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 더블 스트랜드를 치환하여 샘플중에서 표적 핵산 서열(및 그의 상보적 스트랜드)를 증폭시키는 방법이다. 상기 방법은 증폭용 4개의 프라이머를 필요로 하고, 이중 2개는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위를 포함하도록 작제되어야 한다. 이 방법은 DNA를 대량으로 합성하기 위해 기질로서 변형된 데옥시리보클레오타이드 트리포스페이트의 사용을 필요로 한다. 변형된 데옥시리보클레오타이드 트리포스페이트의 예는 α-위치의 인산 그룹의 산소 원자가 황 원자(S)로 치환된 (α-S) 데옥시리보클레오타이드 트리포스페이트이다. 예를 들면, 유전자 시험을 위해 상기 반응을 항상(routinely) 수행하는 경우, 변형된 데옥시리보클레오타이드 트리포스페이트의 사용과 관련된 러닝코스트(running cost) 문제는 심각하다. 또한, 예를 들면, 제한 효소 단편 장다형(restriction enzyme fragment length polymorphism(RELP)) 분석시, 본 발명에서 (α-S) 데옥시리보클레오타이드와 같은 변형된 뉴클레오타이드를 증폭된 DNA 단편에 도입시킴으로써 제한 효소를 사용하여 증폭된 DNA 단편을 절단하는 것을 생략할 수 있다.
미국 특허 제 5,824,517 호에 기재된 바와 같은 개량 SDA 방법은 RNA 및 DNA로 구성되고 필수 요소로서 DNA가 적어도 3'-말단에 위치한 구조를 갖는 키메라성 프라이머를 사용하는 DNA 증폭 방법이다. WO 99/09211에 기재된 바와 같은 개량 SDA 방법은 5'-팽창형의(Protruding) 단(end)을 제조하는 제한 효소의 사용을 필요로 한다. WO 95/25180에 기재된 개량된 SDA 방법은 적어도 두쌍의 프라이머의 사용을 필요로 한다. WO 99/49081에 기재된 개량된 SDA 방법은 적어도 2쌍의 프라이머 및 적어도 하나의 변형된 데옥시리보클레오타이드 트리포스페이트의 사용을 필요로 한다. 한편, 미국 특허 제 5,916,777호에 기재된 올리고뉴클레오타이드 합성 방법은 3'-말단에 리보뉴클레오타이드를 갖는 프라이머를 사용하여 DNA를 합성하고, 프라이머를 사용하여 반응을 종결시키고, 프라이머-신장된 스트랜드중의 프라이머 및 신장된 스트랜드 사이에 엔도뉴클레아제로 닉(nick)를 도입하여 그들을 분리하고, 주형을 분해하고 그것을 재사용하기 위해 프라이머를 회수하는 것을 포함한다. 본 발명에서 반응 시스템으로부터 프라이머를 분리한 후 그것을 주형에 다시 어닐링하여 프라이머를 재사용하는 것이 필요하다.
상기 기재된 바와 같이, 통상의 등온 핵산 증폭 방법은 여전히 다양한 문제 를 갖고 있다. 따라서, 낮은 러닝코스트로 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 방법에 의해 추가로 유전공학적으로 DNA 단편을 수득하는 것이 요구되고 있다.
발명의 목적
본 발명의 목적은 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 존재에서 DNA 합성 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 통상의 효율적인 뉴클레오타이드 서열 증폭 방법 및 그것을 공급하기 위해 증폭된 DNA 단편을 대량으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
발명의 요약
집중적으로 연구한 결과, 본 발명자는 유전자 증폭 반응용의 우수한 시스템을 구축하였다. 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 리보뉴클레오타이드를 갖는 키메라 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 엔도뉴클레아제 및 DNA 폴리머라아제의 존재에 관심의 대상이 되는 DNA 부위를 증폭시는 방법을 개발하여 구축하였다. 따라서, 본 발명은 완성되었다. 본 발명의 방법은 키메라 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 등온 조건하에서 사용하여 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 방법으로 등온 키메라 프라이머 사용 핵산 증폭 방법(isothermally chimeric primer used amplification of nucleic acid(ICAN))으로 명시된다.
본 발명의 제 1의 방법은 하기의 방법을 포함하는 뉴클레오타이드 서열 증폭 방법이다:
(a) 주형으로서 핵산을 실질적으로 핵산의 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 적어도 하나의 프라이머 및 DNA 폴리머라아제로 처리하여 주형에 상보적인 프라이 머-신장된 스트랜드를 합성하고, 여기에서 프라이머는 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성(chimeric) 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 상기 리보뉴클레오타이드는 엔도뉴클레아제로의 절단을 위하여 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
(b) 단계 (a)에서 수득한 더블-스트랜드 핵산의 프라이머-신장된 스트랜드를 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 엔도뉴클레아제로 절단하고;
(c) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 단계 (b)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 주형에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 신장시켜 스트랜드를 치환한다.
본 발명의 제 2의 발명은 하기의 방법을 포함하는 적어도 두개의 프라이머를 사용하는 뉴클레오타이드 서열 증폭 방법에 관한 것이다:
(a) 주형으로서 핵산을 실질적으로 핵산의 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 적어도 하나의 프라이머 및 DNA 폴리머라아제로 처리하여 주형에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고, 여기에서 프라이머는 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 상기 리보뉴클레오타이드는 엔도뉴클레아제로의 절단을 위하여 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
(b) 단계 (a)에서 수득한 더블-스트랜드 핵산의 프라이머-신장된 스트랜드를 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 엔도뉴클레아제로 절단하고;
(c) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 단계 (b)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 주형에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 신장시켜 스트랜드를 치환하고, 여기에서 재생된 프라이머-신장된 스트랜드를 포함하는 더블-스트랜드 핵산을 단계 (b)에서 재사용하고;
(d) 주형으로서 단계 (c)에서 수득한 분리된 치환된(released displaced) 스트랜드를 단계 (a)에서 사용한 것과 상이한 적어도 하나의 프라이머 및 DNA 폴리머라아제로 처리하여 상기 치환된 스트랜드에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고, 여기에서 단계 (a)에서 사용한 것과 상이한 프라이머는 실질적으로 치환된 스트랜드의 뉴클레오타이드 서열에 상보적이고 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 상기 리보뉴클레오타이드는 엔도뉴클레아제로의 절단을 위하여 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
(e) 단계 (d)에서 수득한 더블-스트랜드 핵산의 프라이머-신장된 스트랜드를 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 엔도뉴클레아제로 절단하고;
(f) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 단계 (e)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 주형에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 신장시켜 스트랜드를 치환하고, 여기에서 재생된 프라이머-신장된 스트랜드를 포함하는 더블-스트랜드 핵산을 단계 (e)에서 재사용한다.
본 발명의 제 1 및 제 2 발명의 방법은 등온으로 수행될 수 있다. 주형으로서 뉴클레오타이드 서열은 DNA 서열일 수 있다. 역전사효소 및 주형으로서 RNA를 사용하여 역전사 반응에 의해 싱글-스트랜드 cDNA를 제조하는 단계는 제 1 및 제 2 발명의 방법의 단계 (a) 전에 포함될 수 있다. 싱글-스트랜드 cDNA를 주형으로서 뉴클레오타이드 서열로서 사용할 수 있다. 본 발명의 제 1 및 제 2 발명의 방법에서 싱글-스트랜드 DNA 및 더블-스트랜드 DNA를 주형으로서 DNA를 사용할 수 있다. 더블-스트랜드 DNA를 주형으로서 사용하는 경우, 본 발명의 방법은 더블-스트랜드를 싱글-스트랜드 DNA로 변성시키는 전처리 단계 후에 수행할 수 있다.
상기-언급된 발명에서, 프라이머로부터의 신장은 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 수행한다. 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 DNA 폴리머라아제 I의 클레나우(Klenow) 단편, 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bst DNA 폴리머라아제 및 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bca DNA 폴리머라아제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 DNA 폴리머라아제를 본 발명에서 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 엔도리보뉴클레아제를 엔도뉴클레아제로서 바람직하게 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 엔도리보뉴클레아제는 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면 RNase H이다.
본 발명의 제 3의 방법은 하기의 방법을 포함하는 뉴클레오타이드 서열 증폭 방법이다:
(a) 주형으로서 핵산, 데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제, 적어도 하나의 프라이머 및 프라이머로부터 제조되는 신장된 스트랜드를 절단하는 엔도뉴클레아제를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고, 여기에서 프라이머는 실질적으로 주형으로서의 핵산의 뉴클레오타이드 서열에 상보적이고 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 상기 리보뉴클레오타이드는 엔도뉴클레아제로의 절단을 위하여 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
(b) 반응 혼합물을 충분한 시간동안 인큐베이션시켜 반응산물을 제조한다.
제 3의 발명에서 주형으로서 사용할 수 있는 뉴클레오타이드 서열의 예는, 싱글-스트랜드 DNA, 싱글스트랜드 DNAs로 변성되는 더블-스트랜드 DNA 및 RNA로부터 역전사 반응에 의해 수득한 cDNA로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 두개 이상의 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 반응 혼합물에 포함될 수 있다. 제 1 및 제 2 발명에서 사용된 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제 및 엔도뉴클레아제가 본 발명에 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명의 제 1 내지 제 3의 발명에서 사용되는 프라이머는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이다. 예를 들면, 거기에서 적어도 하나, 바람직하게는 두 개 이상의 연속된 리보뉴클레오타이드 잔기가 프라이머의 3'-말단에서 또는 3'-말단측에 결합된 구조를 갖는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용할 수 있다.
본 발명의 제 1 내지 제 3의 발명에서 사용되는 주형은 앞서 핵산 증폭 방법에 의해 증폭된 핵산일 수 있다. 예를 들면, TAS 방법, 3SR 방법, NASBA 방법, TMA 방법, Qβ레플리카아제 방법, PCR 방법, LCR 방법 및 SDA 방법을 핵산 증폭 방법으로 사용할 수 있지만 핵산 증폭용으로 어느 방법도 제한없이 사용될 수 있다. 본 발명의 방법을 이들 핵삭 증폭 방법들과 함께 사용할 수 있다.
핵산 증폭 반응에서 무작위(random) 프라이머 또는 특이적(specific) 프라이머를 사용할 수 있다. 예를 들면, 제한하지 않고, 적어도 3'-말단에서 또는 3'-말단측에 무작위 서열 또는 특이적 서열을 갖는 프라이머를 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명의 제 4의 발명은 제 1 내지 제 3의 발명에서 사용할 수 있는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 관한 것이다. 프라이머는 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 거기에서 리코뉴클레오타이드가 프라이머의 3'-말단에서 또는 3'-말단측에 위치하는 구조를 갖는 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 거기에 적어도 하나, 바람직하게는 두 개 이상의 연속된 리보뉴클레오타이드 잔기를 포함하고 그의 3'-말단으로부터 DNA 스트랜드를 신장시킬 수 있는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용할 수 있다. 그러한 프라이머는 리보뉴클레오타이드 잔기가 3'-말단에서 RHase H와 같은 리보뉴클레아제의 작용에 의해 절단되어 작제된다.
본 발며의 제 5의 발명은 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제, 엔도뉴클레아제, 및 제 1 및 제 3의 발명에서 사용된 것을 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 제 6의 발명은 본 발명의 제 1 및 제 3의 발명의 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 방법에 의해 표적 핵산을 증폭시킨 후 핵산을 검출하는 것을 포함하는, 표적 핵산의 검출 방법에 관한 것이다. 검출 방법은 소광 상태가 되는 거리에 위치한 두개 이상의 형광 물질로 표지된 리보뉴클레오타이드(RNA) 프로브를 사용하여 표적 핵산을 검출하는 방법을 포함한다.
본 발명의 제 7의 방법은 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제, 엔도뉴클레아제, 및 본 발명의 제 6의 표적 핵산 검출 방법에서 사용되는 것들을 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 제 8의 발명은 본 발명의 제 1 내지 제 3의 발명의 핵산 서열을 증폭시키는 방법에 의해 증폭된 핵산을 기질상의 미리 정해진 영역에 배열하고 고정화시키는 방법을 포함하는, 핵산이 미리 정해진 영역에 배열된 고정화된 핵산을 갖는 물질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상보적인 스트랜드의 실질적으로 분리된 싱글-스트랜드 핵산을 증폭시키고, 미리 정해진 영역에 배열하고 고정화시키는 방법이 특히 바람직할 수 있다.
본 발명의 제 9의 발명은 본 발명의 제 8의 발명의 방법에 의해 제조된 핵산이 미리 정해진 영역에 배열된 고정화된 핵산을 갖는 물질에 관한 것이다. 상보적인 스트랜드의 실질적으로 분리된 싱글-스트랜드 핵산을 증폭시키고, 미리 정해진 영역에 배열하고 고정화된, 고정화된 핵산을 갖는 물질이 특히 바람직할 수 있다.
본 발명의 제 10의 발명은 본 발명의 제 9의 발명의 핵산이 미리 정해진 영역에 배열된 고정화된 핵산을 갖는 물질을 사용하여 물질상에 미리 정해진 영역에 배열되고 고정화된 핵산과 하이브리다이제이션되는 핵산을 검출하는 것을 포함하는 샘플중 표적 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 11의 발명은 하기의 방법을 포함하는, 핵산을 대량으로 제조하는 방법에 관한 것이다:
(a) 주형으로서 핵산을 실질적으로 핵산의 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 적어도 하나의 프라이머 및 DNA 폴리머라아제로 처리하여 주형에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고, 여기에서 프라이머는 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 상기 리보뉴클레오타이드는 엔도뉴클레아제로의 절단을 위하여 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
(b) 단계 (a)에서 수득한 더블-스트랜드 핵산의 프라이머-신장된 스트랜드를 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 엔도뉴클레아제로 절단하고;
(c) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 단계 (b)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 주형에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 신장시켜 스트랜드를 치환한다.
본 발명의 제 12의 발명은 적어도 두개의 프라이머를 사용하여 핵산을 대량으로 제조하는 방법에 관한 것이다:
(a) 주형으로서 핵산을 실질적으로 핵산의 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 적어도 하나의 프라이머 및 DNA 폴리머라아제로 처리하여 주형에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고, 여기에서 프라이머는 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 상기 리보뉴클레오타이드는 엔도뉴클레아제로의 절단을 위하여 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
(b) 단계 (a)에서 수득한 더블-스트랜드 핵산의 프라이머-신장된 스트랜드를 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 엔도뉴클레아제로 절단하고;
(c) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 단계 (b)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 주형에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 신장시켜 스트랜드를 치환하고, 여기에서 재생된 프라이머-신장된 스트랜드를 포함하는 더블-스트랜드 핵산을 (b)에서 재사용하고;
(d) 주형으로서 단계 (c)에서 수득한 분리된 치환된(released displaced) 스트랜드를 단계 (a)에서 사용한 것과 상이한 적어도 하나의 프라이머 및 DNA 폴리머라아제로 처리하여 상기 치환된 스트랜드에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고, 여기에서 단계 (a)에서 사용한 것과 상이한 프라이머는 실질적으로 치환된 스트랜드의 뉴클레오타이드 서열에 상보적이고 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 상기 리보뉴클레오타이드는 엔도뉴클레아제로의 절단을 위하여 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
(e) 단계 (d)에서 수득한 더블-스트랜드 핵산의 프라이머-신장된 스트랜드를 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 엔도뉴클레아제로 절단하고;
(f) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 단계 (e)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 주형에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 신장시켜 스트랜드를 치환하고, 여기에서 재생된 프라이머-신장된 스트랜드를 포함하는 더블-스트랜드 핵산을 단계 (e)에서 재사용한다.
본 발명의 제 13의 발명은 하기를 포함하여 핵산을 대량으로 제조하는 방법에 관한 것이다:
(a) 주형으로서 핵산, 데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제, 적어도 하나의 프라이머 및 프라이머로부터 제조되는 신장된 스트랜드를 절단하는 엔도뉴클레아제를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고, 여기에서 프라이머는 실질적으로 주형으로서의 핵산의 뉴클레오타이드 서열에 상보적이고 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 상기 리보뉴클레오타이드는 엔도뉴클레아제로의 절단을 위하여 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
(b) 반응 혼합물을 충분한 시간동안 인큐베이션시켜 반응산물을 제조한다.
본 발명의 제 14의 발명은 하기의 방법을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 방법에 관한 것이다:
(a) 핵산 증폭 반응에 의해 증폭하고자 하는 서열을 포함하는 핵산을 증폭시켜 주형으로서의 핵산을 제조하고;
(b) 주형으로서 단계 (a)에서 수득한 핵산을 실질적으로 핵산의 뉴클레오타 이드 서열과 상보적인 적어도 하나의 프라이머 및 DNA 폴리머라아제로 처리하여 주형에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고, 여기에서 프라이머는 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 상기 리보뉴클레오타이드는 엔도뉴클레아제로의 절단을 위하여 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
(c) 단계 (b)에서 수득한 더블-스트랜드 핵산의 프라이머-신장된 스트랜드를 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 엔도뉴클레아제로 절단하고;
(d) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 단계 (c)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 주형에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 신장시켜 스트랜드를 치환한다.
본 발명의 제 15의 발명은 하기의 방법을 포함하는, 적어도 두개의 프라이머를 사용하여 핵산을 증폭시키는 방법에 관한 것이다:
(a) 핵산 증폭 반응에 의해 증폭하고자 하는 서열을 포함하는 핵산을 증폭시켜 주형으로서의 핵산을 제조하고;
(b) 주형으로서 단계 (a)에서 수득한 핵산을 실질적으로 핵산의 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 적어도 하나의 프라이머 및 DNA 폴리머라아제로 처리하여 주형에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고, 여기에서 프라이머는 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 상기 리보뉴클레오타이드는 엔도뉴클레아제로의 절단을 위하 여 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
(c) 단계 (b)에서 수득한 더블-스트랜드 핵산의 프라이머-신장된 스트랜드를 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 엔도뉴클레아제로 절단하고;
(d) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 단계 (c)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 주형에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 신장시켜 스트랜드를 치환하고, 여기에서 재생된 프라이머-신장된 스트랜드를 포함하는 더블-스트랜드 핵산을 (c)에서 재사용하고;
(e) 주형으로서 단계 (d)에서 수득한 분리된 치환된 스트랜드를 단계 (b)에서 사용한 것과 상이한 적어도 하나의 프라이머 및 DNA 폴리머라아제로 처리하여 치환된 스트랜드에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고, 여기에서 단계 (b)에서 사용한 것과 상이한 프라이머는 실질적으로 치환된 스트랜드의 뉴클레오타이드 서열에 상보적이고 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 리보뉴클레오타이드는 엔도뉴클레아제로의 절단을 위하여 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
(f) 단계 (e)에서 수득한 더블-스트랜드 핵산의 프라이머-신장된 스트랜드를 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 엔도뉴클레아제로 절단하고;
(g) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 단계 (f)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 주형에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 신장시켜 스트랜드를 치 환하고, 여기에서 재생된 프라이머-신장된 스트랜드를 포함하는 더블-스트랜드 핵산을 단계 (f)에서 재사용한다.
본 발명의 제 16의 발명은 하기의 방법을 포함하여, 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 방법에 관한 것이다:
(a) 핵산 증폭 반응에 의해 증폭하고자 하는 서열을 포함하는 핵산을 증폭시켜 주형으로서의 핵산을 제조하고;
(b) 주형으로서 (a)에서 수득한 핵산, 데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제, 적어도 하나의 프라이머 및 프라이머로부터 제조된 신장된 스트랜드를 절단하는 엔도뉴클레아제를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고, 여기에서 프라이머는 실질적으로 주형으로서 핵산의 뉴클레오타이드 서열에 상보적이고 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 상기 리보뉴클레오타이드는 엔도뉴클레아제로의 절단을 위하여 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
(c) 반응 혼합물을 충분한 시간동안 인큐베이션시켜 반응산물을 제조한다.
본 발명의 제 14내지 제 16의 발명에서, 증폭된 서열을 포함하는 핵산을 앞서 기재된 핵산 증폭 반응에 의해 증폭시킨다. 증폭 산물을 이어서 본발명의 제 1내지 제 3의 발명의 방법에서 주형 핵산으로서 사용한다. 예를 들면, TAS 방법, 3SR 방법, NASBA 방법, TMA 방법, Qβ레플리카아제 방법, PCR 방법, LCR 방법 및 SDA 방법을 제 14 내지 제 16의 발명에서 사용되는 핵산 증폭 방법으로서 사용할 수 있지만 제한 없이 핵산을 증폭시키는 어느 방법도 사용될 수 있다.
무작위 프라이머 또는 특이적 프라이머를 핵산 증폭 반응에서 사용할 수 있다. 예를 들면, 제한하지 않고 적어도 3-'말단 또는 3'-말단측에 무작위 서열 또는 특이적 서열을 갖는 프라이머를 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명의 제 17의 발명은 하기의 방법을 포함하는, 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 방법에 관한 것이다:
(a) 주형으로서 핵산을 실질적으로 핵산의 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 적어도 하나의 프라이머 및 DNA 폴리머라아제로 처리하여 주형에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고, 여기에서 프라이머는 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 상기 리보뉴클레오타이드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
(b) 단계 (a)에서 수득한 더블-스트랜드 핵산의 프라이머-신장된 스트랜드를 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 엔도뉴클레아제로 절단하고;
(c) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 단계 (b)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 주형에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 신장시켜 스트랜드를 치환한다.
본 발명의 제 18의 발명은 하기의 방법을 포함하는, 적어도 두개의 프라이머를 사용하여 뉴클레오타이드를 증폭시키는 방법에 관한 것이다:
(a) 주형으로서 핵산을 실질적으로 핵산의 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 적어도 하나의 프라이머 및 DNA 폴리머라아제로 처리하여 주형에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고, 여기에서 프라이머는 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 상기 리보뉴클레오타이드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
(b) 단계 (a)에서 수득한 더블-스트랜드 핵산의 프라이머-신장된 스트랜드를 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 엔도뉴클레아제로 절단하고;
(c) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 단계 (b)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 주형에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 신장시켜 스트랜드를 치환하고, 여기에서 재생된 프라이머-신장된 스트랜드를 포함하는 더블-스트랜드 핵산을 단계 (b)에서 재사용하고;
(d) 주형으로서 단계 (c)에서 수득한 분리된 치환된(released displaced) 스트랜드를 단계 (a)에서 사용한 것과 상이한 적어도 하나의 프라이머 및 DNA 폴리머라아제로 처리하여 상기 치환된 스트랜드에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고, 여기에서 단계 (a)에서 사용한 것과 상이한 프라이머는 실질적으로 치환된 스트랜드의 뉴클레오타이드 서열에 상보적이고 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 상기 리보뉴클레오타이드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
(e) 단계 (d)에서 수득한 더블-스트랜드 핵산의 프라이머-신장된 스트랜드를 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 엔도뉴클레아제로 절단하고;
(f) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 단계 (e)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 주형에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 신장시켜 스트랜드를 치환하고, 여기에서 재생된 프라이머-신장된 스트랜드를 포함하는 더블-스트랜드 핵산을 단계 (e)에서 재사용한다.
본 발명의 제 19의 발명은 하기의 방법을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 방법에 관한 것이다:
(a) 주형으로서 핵산, 데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제, 적어도 하나의 프라이머 및 프라이머로부터 제조되는 신장된 스트랜드를 절단하는 엔도뉴클레아제를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고, 여기에서 프라이머는 실질적으로 주형으로서 핵산의 뉴클레오타이드 서열에 상보적이고 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 상기 리보뉴클레오타이드는 엔도뉴클레아제로의 절단을 위하여 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
(b) 반응 혼합물을 충분한 시간동안 인큐베이션시켜 반응산물을 제조한다.
본 발명의 제 20의 발명은 하기 방법을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 방법에 관한 것이다:
(a) 주형으로서 핵산을 실질적으로 핵산의 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 적어도 하나의 프라이머 및 DNA 폴리머라아제로 처리하여 주형에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고, 여기에서 프라이머는 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 상기 리보뉴클레오타이드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고, 여기에서 엔도뉴클레아제는 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 절단하고;
(b) 단계 (a)에서 수득한 더블-스트랜드 핵산의 프라이머-신장된 스트랜드를 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 엔도뉴클레아제로 절단하고;
(c) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 단계 (b)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 주형에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 신장시켜 스트랜드를 치환한다.
본 발명의 제 21의 발명은 하기의 방법을 포함하는 적어도 두개의 프라이머를 사용하여 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 방법에 관한 것이다:
(a) 주형으로서 핵산을 실질적으로 핵산의 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 적어도 하나의 프라이머 및 DNA 폴리머라아제로 처리하여 주형에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고, 여기에서 프라이머는 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 상기 리보뉴클레오타이드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고, 엔도뉴클레아제는 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 절단하고;
(b) 단계 (a)에서 수득한 더블-스트랜드 핵산의 프라이머-신장된 스트랜드를 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 엔도뉴클레아제로 절단하고;
(c) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 단계 (b)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 주형에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 신장시켜 스트랜드를 치환하고, 여기에서 재생된 프라이머-신장된 스트랜드를 포함하는 더블-스트랜드 핵산을 단계 (b)에서 재사용하고;
(d) 주형으로서 단계 (c)에서 수득한 분리된 치환된 스트랜드를 단계 (a)에서 사용한 것과 상이한 적어도 하나의 프라이머 및 DNA 폴리머라아제로 처리하여 상기 치환된 스트랜드에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고, 여기에서 단계 (a)에서 사용한 것과 상이한 프라이머는 실질적으로 치환된 스트랜드의 뉴클레오타이드 서열에 상보적이고 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 상기 리보뉴클레오타이드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고, 엔도뉴클레아제는 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 절단하고;
(e) 단계 (d)에서 수득한 더블-스트랜드 핵산의 프라이머-신장된 스트랜드를 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 엔도뉴클레아제로 절단하고;
(f) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 단계 (e)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 주형에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 신장시켜 스트랜드를 치환하고, 여기에서 재생된 프라이머-신장된 스트랜드를 포함하는 더블-스트랜드 핵산을 단계 (e)에서 재사용한다.
본 발명의 제 22의 발명은 하기의 방법을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 방법에 관한 것이다:
(a) 주형으로서 핵산, 데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제, 적어도 하나의 프라이머 및 프라이머로부터 제조되는 신장된 스트랜드를 절단하는 엔도뉴클레아제를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고, 여기에서 프라이머는 실질적으로 주형으로서 핵산의 뉴클레오타이드 서열에 상보적이고 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 상기 리보뉴클레오타이드는 엔도뉴클레아제로의 절단을 위하여 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고, 엔도뉴클레아제는 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 절단하고;
(b) 반응 혼합물을 충분한 시간동안 인큐베이션시켜 반응산물을 제조한다.
본 발명의 제 23의 발명은 제 1 내지 3 및 14 내지 22의 발명중 어느 하나의 방법에 따라 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 방법을 포함하는, 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 방법에 관한 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 싱글-스트랜드 DNA를 사용하는 본 발명의 방법의 예를 설명하는 흐름도이다. 도에서, 폐쇄원으로서 표지된 분리된 DNA 스트랜드를 (6)에서 주형 DNA로서 사용한다.
도 2는 본 발명의 방법에 의해 증폭된 DNA 단편을 다양한 반응 시간을 사용하여 아가로스 겔 영동시킨 결과를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 명세서에서 사용되는 바, 데옥시리보뉴클레오타이드(또한 dN으로서 언급됨)는 당 부위가 D-2-데옥시리보오스로 구성된 뉴클레오타이드를 언급한다. 예를 들면, 데옥시리보뉴클레오타이드는 염기 부위로서 아데닌, 사이토신, 구아닌 또는 티민을 갖는 것들을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 리보뉴클레오타이드(또한 N으로서 언급됨)는 당 부위가 D-리보오스로 구성된 뉴클레오타이드를 언급한다. 예를 들면, 데옥시리보뉴클레오타이드는 염기 부위로서 아데닌, 사이토신, 구아닌 또는 우라실 갖는 것들을 포함한다. 또한 리보뉴클레오타이드는 α-위치의 인산 그룹의 산소 원자가 황원자로 치환된(또한 ( α-S)로서 언급됨) 변형된 리보뉴클레오타이드와 같은 변형된 리보뉴클레오타이드 또는 다른 유도체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 프라이머를 언급한다. 프라이머는 변형되지 않은 데옥시리보뉴클레오타이드 및/또는 변형된 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 그것은 변형되지 않은 리보뉴클레오타이드 및/또는 변형된 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 리보뉴클레오타이드를 갖고, 본 발명의 방법에서 핵산 스트랜드를 신장시키기 위하여 사용할 수 있고, 엔도뉴클레아제로 절단될 수 있고, 스트랜드 치환 반응을 위해 사용될 수 있는 어느 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 3'-말단측은 예를 들면, 프라이머와 같이 핵산의 중심으로부터 3'-말단까지의 부위를 언급한다. 또한, 5'-말단측은 핵산의 중심으로부터 5'-말단까지의 부위를 언급한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 엔도뉴클레아제는 주형으로서 핵산에 어닐링된 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머로부터 DNA를 신장시켜 제조된 더블-스트랜드 DNA에 작용하고, 특히 리보뉴클레오타이드를 포함하는 프라이머의 부위에서 그것을 절단하는 어느 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바, DNA 폴리머라아제는 주형으로서 DNA 스트랜드를 사용하여 새롭게 DNA 스트랜드를 합성하는 효소를 언급한다. DNA 폴리머라아제는 제한하는 것은 아니지만, 폴 I-형 DNA 폴리머라아제(예: 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) DNA 폴리머라아제 I, 클레나우 단편 및 Taq DNA 폴리머라아제), α-형 DNA 폴리머라아제(예: 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus(Stratagene))로부터의 DNA 폴리머라아제, VENT DNA 폴리머라아제(New England Biolabs), KOD DNA 폴리머라아제(Toyabo) 및 DEEP VENT DNA 폴리머라아제(New England Biolabs)) 및 비-α-, 비-폴 I-형 DNA 폴리머라아제(예: WO 97/24444에 기재되어 있는 DNA 폴리머라아제)를 포함한다. 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제는 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)(이하, B. ca로서 언급함) 및 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus)(이하, B. st로서 언급함)와 같은 바실러스 속의 고온성 세균으로부터의 DNA 폴리머라아제 및 그들의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 이들 DNA 폴리머라아제의 변 이체를 포함한다. 또한, 스트랜드 치환형의 DNA 폴리머라아제는 스트랜드 치환 활성은 갖고 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성은 갖지 않는 DNA 폴리머라아제, 예로서 클레나우 단편를 포함한다. 또한, DNA 폴리머라아제는 제한하지 않고, 예를 들면, 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제 및 치환 활성을 갖지 않는 DNA 폴리머라아제의 혼합물과 같은 다수의 DNA 폴리머라아제의 혼합물일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바, "스트랜드 치환 활성"은 스트랜드를 치환할 수 있는 활성, 즉, DNA 스트랜드를 치환하여 주형 스트랜드에 어닐링된 상보적인 스트랜드를 분리시키면서 주형으로 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 DNA를 복제할 수 있는 활성을 언급한다. 또한, 본 명세서에서 스트랜드 치환으로부터 수득한 주형으로서 뉴클레오타이드 서열로부터 분리된 DNA 스트랜드를 "치환된 스트랜드"로서 언급한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명할 것이다.
(1) 본 발명에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머
본 발명의 방법에서 사용되는 프라이머는 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이다. 그러한 프라이머는 변형되지 않는 리보뉴클레오타이드 및/또는 변형된 리보뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머이다.
본 발명의 방법에서 사용되는 키메라성 프라이머는 주형으로서 핵산의 일부의 뉴클레오타이드 서열에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖고, 그의 3'-말단으로부터 DNA 스트랜드를 신장시키기 위해 사용할 수 있고, DNA 합성 반응 동안 엔도뉴클레아제가 절단하는 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 부위를 갖는 어느 키메라성 올리고뉴크레오타이드 프라이머일 수 있다. 예를 들면, 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 리보뉴클레오타이드를 갖는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용할 수 있다. 프라이머는 일반적으로 증폭되는 영역의 상류, 즉, 주형으로서 핵산중에 증폭되는 부위에 대응하는 뉴클레오타이드 서열의 3' 부위에 상보적으로 작제된다. 본 명세서에서 사용되는 바, "실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열"은 사용되는 반응 조건하에서 주형으로서 DNA에 어닐링할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 그러한 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 공지된 방법, 예를 들면, Labo Manual PCR(Takara Shuzo, pp.13-16, 1996)를 참고하여 디자인할 수 있다. OLIGOTM 프라이머 어날리시스 소프트웨어(Takara Shuzo)와 같은 프라이머 작제용의 시판되는 소프트웨어를 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 하나 이상의 변형된 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, 리보뉴클레오타이드는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치할 수 있고 엔도뉴클레아제에 의해 인식되거나 절단되는 변형되지 않은 리보뉴클레오타이드 또는 변형된 리보뉴클레오타이드중 어느 하나일 수 있다. 리보뉴클레오타이드는 상기 언급된 변형되지 않은 리보뉴클레오타이드 및 변형된 리보뉴클레오타이드 둘 모두를 포함할 수 있다. 변형되지 않은 리보뉴클레오 타이드, 변형된 리보뉴클레오타이드 또는 그의 혼합물이 프라이머의 기능을 없애지 않는 한 본 발명의 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 위해 사용할 수 있다. 변형된 리보뉴클레오타이드의 예로는 제한되는 것은 아니지만, 인산 그룹에 결합된 산소원자가 황 원자로 치환된 (α-S) 리보뉴클레오타이드, 및 리보오스의 2번-위치에 하이드록시 그룹이 메톡시 그룹으로 치환된 리보뉴클레오타이드를 포함한다. 변형된 리보뉴클레오타이드를 포함하는 그러한 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 예를 들면, 황화 반응제(Glen Research), 또는 2-OMe-RNA-CE 포스포르아미다이트제(Glen Research)를 사용하는 미국 특허 제 5,003,097 호에 기재된 방법에 의해 제조된 (α-S) 리보뉴클레오타이드를 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 증폭 방법에서 사용될 수 있는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 엔도뉴클레아제를 사용하는 절단에 대하여 내성을 갖도록 하기 위해 변형된 리보뉴클레오타이드를 포함하도록 디자인될 수 있다. 그러한 프라이머는 증폭 반응 단계동안 그것이 엔도뉴클레아제로 절단 부위를 조정할 수 있게 하는데 유용한다.
하나 이상의 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 증폭 후 원하는 형태의 DNA 단편(싱글-스트랜드 또는 더블-스트랜드)에 따라 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 특히, 싱글-스트랜드 DNA가 필요한 경우, 하나의 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하고, 더블-스트랜드 DNA가 필요한 경구, 두개의 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용한다.
본 발명의 방법에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 길 이는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 바람직하게 약 12 뉴클레오타이드 내지 약 100 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게 약 15뉴클레오타이드 내지 약 40뉴클레오타이드이다. 키메라성 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이 사용되는 반응 조건하에서 주형으로서 핵산에 어닐링할 수 있도록 실질적으로 주형으로서 핵산과 상보적인 것이 바람직할 수 있다. 프라이머는 하기에 기재된 단계에서 사용되는 엔도뉴클레아제에 의해 3'-말단 또는 3'-말단측에서 인식되는 서열을 포함한다.
예를 들면, 하기 일반식으로 표시되는 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 본 발명의 DNA 합성 방법에서 프라이머로서 사용할 있지만, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 것은 아니다:
일반식 : 5'-dNa-Nb-dNc3'
(a: 11이상의 정수이고; b: 0 또는 1이상의 정수이며 c: 0 또는 1이상의 정수이고(단, b 및 c는 동시에 0이 아니다); dN: 데옥시리보뉴클레오타이드이며; N: 변형되지 않은 리보뉴클레오타이드 및/또는 변형된 리보뉴클레오타이드이다).
예를 들면, a가 11이상인 정수이고; b가 1이며; c가 0-5인 일반식으로 표시되는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 본 발명에서 바람직하게 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 리보뉴클레오타이드의 길이는 바람직하게 1-mer 내지 15-mer, 더욱 바람직하게 1-mer 내지 10-mer, 가장 바람직하게 1-mer 내지 5-mer이다. 일반식에서 c의 수는 특정하게 제한되는 것은 아니지만, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 어느 수가 선택될 수 있다. 일반적으로, 5이하가 바람직하다. c에 대하여 4보다 3, 3보다 2, 2보다 1을 선택한 반응에서 더욱 우수한 결과를 수득하였다. 특히, c가 0인 경우 가장 효과적인 반응을 수행할 수 있었다.
본 발명에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 프라이머로부터 신장된 DNA 스트랜드(프라이머-신장된 스트랜다)를 엔도뉴클레아제가 리보뉴클레오타이들 포함하는 부위에서 절단하는 구조를 갖는다. 즉, 리보뉴클레오타이드는 엔도뉴클레아제를 사용하여 절단되기 위해 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치한다. 예를 들면, 주형으로서 핵산에 어닐링된 일반식에 의해 표시된 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머로부터 DNA 신장에 의해 제조된 더블-스트랜드 DNA에 RAas H를 작용시키는 경우, 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 리보뉴클레오타이드 부위에서 절단된다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 신장에 의해 합성된 DNA 사이에 닉(nick)이 도입된 더블-스트랜드가 제조된다. 이어서, 닉 부위로부터 DNA 폴리머라아제로 스트랜드 치환 반응을 수행한다. 따라서, 프라이머의 3'-말단으로부터 핵산 스트랜드를 신장시키기 위해 사용될 수 있고, 엔도뉴클레아제로 절단될 수 있고, 그것과 함께 DNA 폴리머라아제로 스트랜드 치환시킬 수 있는 어느 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다.
예를 들면, 포스포르아미다이트 방법에 따라 어플라이드 바이오시스템사(Appliced Biosystems Inc. (ABI))의 394형 DNA 합성기를 사용하여 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 어느 뉴클레오타이드 서열을 갖도록 합 성할 수 있다. 또한, 포스페이트 트리에스테르 방법, H-포스포네이트 방법 및 티오포스포네이트 방법을 사용하여 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 합성할 수 있다.
(2) 본 발명에서 사용되는 엔도뉴클레아제
상기 (1)에 기재된 바와 같은 주형으로서 핵산에 어닐링되는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머로부터 DNA 신장에 의해 제조된 더블-스트랜드 DNA상에 작용하고 스트랜드를 치환시키기 위해 신장된 스트랜드를 절단하는 어느 엔도뉴클레아제를 본 발명에서 사용할 수 있다. 즉, 엔도뉴클레아제는 더블-스트랜드 DNA의 키메라성 올리보뉴클레오타이드 부위에 닉을 제조하는 효소이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 엔도뉴클레아제의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 리보뉴클레아제들이다. 이들중에서, DNA 및 RNA로 구성된 더블-스트랜드 핵산의 RNA 부분에 작용하는 엔도리보뉴클레아제 H(RNase H)를 바람직하게 사용할 수 있다. 중온성 및 열-내성의 것을 포함하고, 상기 언급된 활성을 갖는 어느 리보뉴클레아제를 본 발명에서 바람직하게 사용할 수 있다. 예를 들면, 하기 실시예에 기재된 바와 같이 본 발명의 방법에서 E.Coli로부터의 RNase H를 약 50℃ 내지 약 70℃에 반응을 위해 사용할 수 있다. 상업상 사용가능한 열-내성의 리보뉴클레아제, HybridaseTM Thermostable RNase H(Epicenter Technologies)를 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 리보뉴클레아제는 천연의 것 또는 변이체일 수 있다. 본 명세서에서 언급하는 RNase H의 효소 유니트는 참조 실시예에 기재된 바와 같이 효소 유니트를 측정 방 법에 따라 나타낸 값이다.
본 발명의 방법에서 사용되는 RNase H와 같은 엔도뉴클레아제를 사용하는 절단 반응의 효율은 프라이머의 3'-말단 주위의 뉴클레오타이드 서열에 따라 달라질 수 있고 원하는 DNA의 증폭 효율에 영향을 줄 수 있다. 그러므노, 사용되는 Rase H 를 위해 최적의 프라이머를 작제하는 것이 적절하다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "닉의 도입" 또는 "닉킹(nicking)"은 더블-스트랜드 핵산의 두개의 스트랜드중 하나를 내부적으로 절단하는 것을 의미한다. 예를 들면, RNase H는 DNA 및 리보뉴클레오타이드-포함 DNA로 구성된 하이브리드 더블-스트랜드 핵산에 작용하여 두개의 스트랜드중에서 리보뉴클레오타이드 부분에서 리보뉴클레오타이드-포함 스트랜드를 선택적으로 절단한다.
(3) 본 발명에서 사용되는 DNA 폴리머라아제
본 발명에서 DNA상에 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제가 사용될 수 있다. 특히, 실질적으로 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 DNA 폴리머라아제가 바람직하게 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바, "스트랜드 치환 활성"은 스트랜드를 치환시킬 수 있는, 즉, DNA 스트랜드를 치환하여 주형 스트랜드에 어닐링된 상보적인 스트랜드를 분리시키면서 주형으로서 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 DNA 복제를 수행할 수 있는 활성을 언급한다. 또한, 본 멩세서에서 스트랜드 치환 결과 주형으로서 뉴클레오타이드 서열로부터 분리된 DNA 스트랜드를 "치환된 스트랜드"로서 언급한다.
본 발명에서 스트랜드 치환 활성을 갖는 어느 DNA 폴리머라아제를 사용할 수 있다. 그의 예는 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)(이하, B. ca로서 언급함) 및 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus)(이하, B. st로서 언급함)와 같은 바실러스 속의 고온성 세균으로부터 유래된, 그들의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 DNA 폴리머라아제, 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 DNA 폴리머라아제 I의 거대 단편(클레나우 단편)의 변이체를 포함한다. 중온성 및 열-내성 DNA 폴리머라아제 둘 모두를 본 발명에서 바람직하게 사용할 수 있다.
B. ca는 약 70℃의 최적 성장 온도를 갖는 고온성 세균이다. 이 세균으로부터의 Bca DNA 폴리머라아제가 DNA-의존 DNA 폴리머라아제 활성, RNA-의존 DNA 폴리머라아제 활성(역전사 활성), 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는다고 공지되어 있다.
효소는 그의 기원으로부터의 정제된 효소 또는 유전 공학 기술에 의해 생산된 재조합 단백질일 수 있다. 효소를 유전 공학 기술 또는 다른 방법을 사용하여 치환, 결실, 첨가 또는 삽입에 의해 변형시킬 수 있다. 변형된 효소의 예는 그의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 Bca DNA 폴리머라아제인 Bca BEST DNA 폴리머라아제(Takara Shuzo)를 포함한다.
(4) 본 발명에서 사용되는 반응 완충액의 조성
본 발명에서 완충 성분, 마그네슘염 및 dNTPs를 포함하는 반응 완충액을 사용할 수 있다. 바람직하게 사용될 수 있는 완충 성분의 예는, 제한하는 것은 아니지만, 트리신(Tricine), 트리스-하이드로클로라이드 및 인산염(예; 인산나트륨 및 인산칼륨)을 포함한다. 이들중에서, 완충 성분으로서 트리신 또는 인산염을 포함하는 완충액이 본 발명에서 바람직하다. 완충 성분의 최종 농도는 5-100mM, 바람직하게 20-50mM 범위이다. pH는 6.0-9.5, 바람직하게 7.0-9.2 범위이다. 예를 들면, pH 7.5-9.2에 22-46mM 트리신을 함유하는 완충액 또는 pH 7.0-8.0에 25-50mM 인산칼륨을 함유하는 완충액이 바람직하다. 바람직하게 사용될 수 있는 마그네슘염의 예는, 제한하는 것은 아니지만, 염화마그네슘, 마그네슘 아세테이트 또는 황산마그네슘을 포함한다. 마그네슘염의 최종 농도는 1-20mM, 바람직하게 2-10mM 범위이다. 혼합물중 DNA 신장 반응용 기질로서 dNTPs(dATP, dCTP, dCTP 및 dTTP)의 최종 농도는 0.1-3.0mM, 바람직하게 0.2-1.2mM 범위이다. 50㎕ 반응 용량중에 사용되는 프라이머의 양은 1-1000pmol, 바람직하게 10-100pmol이다. 또한, 예를 들면, 반응 혼합물은 증폭 반응을 안정화시키기 위해 첨가제를 포함할 수 있다. 최종 농도 0.1% 이하의 BSA, 최종 농도 10% 이하의 디메틸설폭사이드, 최종 농도 4mM 이하의 푸트레신 디하이드로클로라이드, 또는 최종 농도 0.01% 이하의 프로필렌디아민을 첨가할 수 있다. 또한, NMP(1-메틸-2-피롤리디논), 글리세롤, 폴리(에틸렌 글리콜), 디메틸설폭사이드 및/또는 포름아미드를 포함할 수 있다. 그러한 유기 용매를 첨가하여 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 비특이적인 어닐링이 감소될 것으로 예상된다.
50㎕ 반응 용량중에 엔도뉴클레아제의 샘플로서 E. coli로부터의 RNas의 양은 바람직하게 3-200U, 더욱 바람직하게 15-60U 범위이다. 50㎕ 반응 용량중에 엔도뉴클레아제의 샘플로서 Bca BEST DNA 폴리머라아제의 양은 바람직하게 0.5-100U, 더욱 바람직하게 1-22U 범위이다. 이들 중에, 바람직한 엔도뉴클레아제의 유니트 수는 그의 형에 따라 달라질 수 있다고 예상된다. 그러한 경우, 첨가되는 완충액의 조성 및 효소의 양은 조정되어 증폭 산물의 약을 최대화할 수 있다. 어느 경우에도, 사용되는 효소의 형에 따라 반응 완충액의 조성 등을 최적화하는 것이 적절하다.
(5) 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 방법
본 발명의 방법은 상기 (1)에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 상기 (2)에 기재된 바와 같은 엔도뉴클레아제 및 상기 (3)에 기재된 바와 같은 DNA 폴리머라아제와 조합하여 사용함으로써 수행될 수 있다. PCR 방법에 사용되는 dNTPs 등(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP)등을 방법중에서 신장 반응에서 기질로서 뉴클레오타이드 트리포스페이트로서 바람직하게 사용할 수 있다. dNTPs는 그것이 사용되는 DNA 폴리머라아제에 대한 기질로서 작용하는 한 7-데자(deaza)-dGTP와 같은 dNTP 아날로그를 포함할 수 있다. 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 본 발명에서 사용할 수 있다. 상기 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 표준 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 조합하여 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에서 주형으로서 사용되는 핵산(DNA 또는 RNA)은 핵산을 포함할 수 있는 어느 샘플로부터 분리하거나 제조할 수 있다. 핵산을 포함할 수 있는 샘플의 예는, 제한하는 것은 아니지만, 전체 혈액, 혈청, 백혈구층(buffy coat), 소변, 대변, 뇌척수액, 정액, 침, 조직(예: 종양 조직 또는 림프절) 및 세포 배양액(예: 포유류 세포 배양액 또는 박테리아성 세포 배양액)과 같이 유기체로부터의 샘플, 비로이드(viroid), 바이러스, 박테리아, 진균, 효모, 식물 및 동물과 같이 핵산을 포함하는 샘플, 바이러스 또는 박테리아와 같은 미생물로 오염되거나 감염감염된 것으로 예측되는 샘플(예; 식품 또는 생물학적 제제), 및 토양 및 폐수와 같이 유기체를 포함할 수 있는 샘플을 포함한다. 상기 샘플은 공지된 방법에 따라 상기 기재된 바와 같은 샘플을 공정화하여 수득된 핵산을 함유하는 표본(preparation)일 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 표본의 예는 세포 파괴 산물 또는 상기 산물을 분별하여 수득한 샘플, 샘플중에 핵산, 또는 mRNAs가 풍부한 샘플과 같은 특이적인 핵산 분자들을 포함한다. 또한, 샘플중에 포함된 핵산을 공지된 방법에 따라 증폭시켜 수득한 DNA 또는 RNA와 같은 핵산을 바람직하게 사용할 수 있다.
핵산을 포함하는 표본을 제한하지 않고, 예를 들면, 세제를 사용하는 세포 용해, 초음파 처리, 글래스 비드 또는 프렌치 프레스(French press)를 사용하는 진탕/교반을 사용하여 상기 언급된 물질로부터 제조할 수 있다. 일부 경우에는, 추가로 표본을 공정하여 핵산을 정제하는 것이 유리하다(예: 엔도뉴클레아제가 존재하는 경우). 그러한 경우에, 핵산은 공지된 방법, 예를 들면, 페놀 추출, 크로마토그래피, 이온 교환, 겔 전기 영동 또는 밀도-구배 농축에 의해 정제된다.
RNA로부터 유래된 서열을 갖는 핵산을 증폭시켜야 하는 경우, 주형으로서 RNA를 사용하는 역전사반응에 의해 합성된 cDNA를 주형으로서 사용하여 본 발명의 발명을 수행할 수 있다. 샘플중에 총 RNA, tRNA 및 rRNA와 같은 RNA 분자 및 특이 RNA 종을 포함하여, 역전사 반응용 프라이머를 제조할 수 있는 어느 RNA도 본 발명 의 방법에 적용될 수 있다.
사용된 반응 조건하에서 주형으로서 RNA에 어닐링하는 어느 프라이머가 역전사 반응에서 사용될 수 있다. 프라이머는 주형으로서 특이 RNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 프라이머(특이적 프라이머), 올리고-dT 프라이머(데옥시티민)프라이머 및 무작위 프라이머를 갖는 프라이머(무작위 프라이머) 일 수 있다. 특이적인 어닐링과 관련하여, 역전사용 프라이머의 길이는 바람직하게 6 뉴클레오타이드 이상, 더욱 바람직하게 9 뉴클레오타이드 이상이다. 올리고뉴클레오타이드 합성과 관련하여, 길이는 바람직하게 100 뉴클레오타이드 이하, 더욱 바람직하게 30 뉴클레오타이드 이하이다.
또한, 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 역전사용 프라이머로서 사용될 수 있다. 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 또한 본 발명의 주형으로서 역전사후 수득된 cDNA를 사용하여 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 방법에서 스트랜드 치환 반응용 프라이머로서 사용될 수 있다. 그러한 프라이머는 상기 (1)에 기재된 특성을 갖고 RNA로부터 역전사 반응에 사용될 수 있는 어느 것일 수 있다.
주형으로서 RNA를 사용하여 cDNA를 합성하는 활성을 갖는 어느 효소가 역전사 반응에서 사용될 수 있다. 그의 예는 다양한 원으로부터 기원한 역전사효소, 예를 들면, 조류 골수아세포증바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase(AMV RTase)), 마우스 백혈병 바이러스-유래된 역전사 효소( murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase(MMLV RTase) 및 라우스=관련 바이러스 2 역전자 효소(Rous-associated virus 2 reverse transcriptase(RAV-2 RTase)를 포함한다. 또한, 역전사효소 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용할 수 있다. 써모스속 박테리아로부터의 DNA 폴리머라아제(예: Tth DNA 폴리머라아제) 및 바실러스(Bacillus)속의 고온성 박테리아로부터의 DNA 폴리머라아제와 같이 고온에서 역전사 활성을 갖는 어느 효소가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, B. st로부터의 DNA 폴리머라아제(Bst DNA 폴리머라아제) 및 B. ca로부터의 DNA 폴리머라아제(Bca DNA 폴리머라아제)와 같은 바실러스(Bacillus)속의 고온성 박테리아로부터의 DNA 폴리머라아제가 바람직할 수 있지만, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 예를 들면, Bca DNA 폴리머라아제는 역전사 반응을 위해 마그네슘 이온을 필요로하지 않는다. 또한, 그것은 고온 조건하에서 주형으로서 RNA의 2차 구조 형성을 억제시키면서 cDNA를 합성할 수 있다. 역전사 효소활성을 갖는 천연의 것 및 상기 효소의 변이체는 그들이 상기 활성을 갖는 한 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 핵산을 증폭시킬 때, 상기와 같이 주형으로서 핵산을 증폭시켜 관심의 대상이 되는 핵산을 더욱 효율적으로 증폭시킬 수 있다. 예를 들면, 미량의 게놈 DNA에 존재하는 뉴클레오타이드를 증폭시키는 경우, 첫째로 관심의 대상이 되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 단편을 적절한 핵산 증폭 방법에 의해 증폭시킨다. 이어서, 그렇게 수득한 증폭된 DNA 단편을 주형으로서 사용하여 본 발명의 증폭 방법을 수행한다. 제 1의 증폭 단계를 본 발명의 방법에 의해 수행할 수 있다. 또한, PCR 방법과 같은 공지된 핵산 증폭 방법에 의해 수행할 수 있다. 또한, 증폭 단계에서 사용되는 프라이머의 5'-말단측에 특이적 뉴클레오타이드 서열을 첨가할 수 있다. 그러한 프라이머를 사용하여 증폭된 단편을 주형으로서 사용하는 경우, 상기 언급된 프라이머에 첨가된 특이적 뉴클레오타이드 서열을 갖는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 본 발명의 증폭 방법을 수행할 수 있다. 즉, PCR에 의해 증폭된 DNA 단편을 주형으로서 사용하는 본 발명의 방법에서 증폭되는 영역의 뉴클레오타이드 서열과 상관없이 표준 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 핵산 증폭 단계를 수행할 수 있다. 이것은 본 발명의 방법 및 상기 기재된 바와 같이 5'-말단측에 첨가된 특이적 뉴클레오타이드 서열을 갖는 프라이머를 사용하는 PCR 방법을 조합하여 수행할 수 있다.
일반적으로, 특히 제 1의 핵산 증폭 단계에서 관심의 대상이 되는 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키기 위해 상기의 서열에 특이적인 한쌍의 프라이머를 제조하여야 한다. 그러나, 주형으로서 핵산은 관심의 대상이 되는 뉴클레오타이드 서열에 특이적인 프라이머를 사용하지 않고, 핵산 단편을 비특이적으로 증폭시키는 무작위 프라이머, 또는 한 세트의 레디-메이드(ready-made) 축퇴(degenerate) 프라이머로부터 선택되는 한쌍의 프라이머를 사용하여 증폭시킬 수 있다. 주형들로서 다수의 핵산들을 증폭시키기 위해 요구되는 프라이머쌍의 수를 감소시킬 수 있다. 예를 들면, 태그(tag) 서열을 갖는 무작위 프라이머를 사용하는 PCR 방법(Nucleic Acids Research, 24(19):3778-3783(1996)) 또는 태그 서열을 갖는 축퇴 프라이머를 사용하는 축퇴 올리고뉴클레오타이드-프라임드(primed) PCR 방법(DOP-PCR;Genomics, 13:718-725(1992)을 사용하여 수행함으로써 감소된다. 각각의 그러한 프라이머는 3'-말단에 무작위 서열 또는 축퇴 서열을 갖는다. 태그 서열을 갖는 프라이머로 증폭된 핵산을 주형으로서 사용하여 본 발명의 증폭 방법을 수행하는 경우, 본 발명의 방법은 하나의 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 수행할 수 있다. 그러한 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 태그 서열의 것과 일치하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 그러한 프라이머를 사용하여, 동일한 태그 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 증폭된 모든 핵산을 주형으로서 사용한다. 따라서, 본 발명의 방법을 무작위 프라이머 또는 축퇴 프라이머를 사용하는 핵산 증폭 방법과 결합시켜 다양한 뉴클레오타이드 서열을 적은 비용으로 다량 공급할 수 있다.
주형으로서 DNA 스트랜드를 사용하여 새로 DNA 스트랜드를 합성하는 어느 DNA 폴리머라아제 핵산 증폭 방법에서 사용할 수 있다. 그러한 DNA 폴리머라아제는 폴 I-형 DNA 폴리머라아제(예: E. coli DNA 폴리머라아제 I, 클레나우 단편 및 태그 DNA 폴리머라아제), α-형 DNA 폴리머라아제(예: 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus), VENT DNA 폴리머라아제, KOD DNA 폴리머라아제 및 DEEP VENT DNA 폴리머라아제) 및 비-α-, 비-폴 I-형 DNA 폴리머라아제(예: WO 97/24444에 기재된 DNA 폴리머라아제). 또한, TaKaRa Ex Taq DNA 폴리머라아제(Takara Shuzo) 또는 KOD 대쉬(dash) DNA 폴리머라아제(Toyobo)와 같은 적어도 두개의 DNA 폴리머라아제의 혼합물을 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, B. ca로부터의 DNA 폴리머라아제, B. st로부터의 DNA 폴리머라아제와 같은 DNA 폴리머라아제, 그들의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 이들 DNA 폴리머라아제의 변이체, 9°N DNA 폴리머라아제, Pfu(엑소-) DNA 폴리머라아제(Stratagene), Tth DNA 폴리머라아제(Toyobo) 및 Tfl DNA 폴리머라아제(Promega)를 바람직하게 사용할 수 있다.
선형 DNA 단편(예: PCR-증폭된 단편)을 본 발명의 증폭 방법에서 주형으로서 사용하는 경우, 스페이서 부위로서 디자인된 서열을 도입시키는 것이 증폭 효율을 증가시킬 수 있다. 스페이서 부위는 주형으로서 선형 DNA 단편의 3'-말단 및 본 발명의 방법에서 사용되는 프라이머의 5'-말단에 어닐링 부위사이에 위치한다. 예를 들면, 예를 들면, 제한하지 않고 스페이서 부위의 길이가 바람직하게 1 내지 약 70 염기, 더욱 바람직하게 약 5 내지 60 염기이도록 본 발명의 증폭용 프라이머를 디자인한다. 스페이서 부위 염기의 바람직한 수는 본 발명의 증폭용 프라이머의 서열에 따라 달라질 수 있다. 최적의 스페이서 부위는 본 명세서의 실시예를 참조하여 결정될 수 있다. 본 발명에서 스페이서 부위를 본 발명의 증폭 프라이머의 어닐링 영역 3'에 첨가하기 위하여 주형으로서 예를 들면, PCR에 의해 앞서 증폭된 단편을 사용할 수 있다. 일례에서, 주형으로서 핵산을 프라이머를 사용하여 앞서 증폭시킨다. 그러한, 프라이머는 5'→3' 방향으로 스페이서 부위의 영역, 본 발명의 증폭 프라이머 영역 및 핵산을 증폭시키기 위한 또다른 프라이머 영역을 갖는다. 이어서, 그렇게 증폭된 단편을 본 발명의 증폭 방법에서 주형으로서 사용할 수 있다. 핵산을 증폭시키기 위한 또다른 프라이머 영역은 PCR 방법과 같은 핵산 증폭 방법용 프라이머의 어느 영역일 수 있다. 또한, 핵산을 증폭시키기 위한 또다른 프라이머 영역은 본 발명의 또다른 증폭 프라이머의 영역일 수 있다.
분리된 게놈 DNA 또는 PCR 단편과 같은 더블-스트랜드 DNA 및 총 RNA 또는 mRNA로부터의 역전사 반응에 의해 제조된 cDNA와 같은 싱글-스트랜드 DNA 둘 모두를 본 발명에서 주형 DNA로서 바람직하게 사용할 수 있다. 더블-스트랜드 DNA는 그것을 싱글-스트랜드 DNA로 변성시킨 후 사용하는 것이 바람직하다.
PCR 증폭 산물과 같은 선형의 더블-스트랜드 DNA를 주형으로서 사용하는 경우, 본 발명의 증폭 방법에서 변성 단계는 삭제될 수 있다. 본 발명의 프라이머에 대한 어닐링 부위에 DNA의 말단으로로부터 내부로 약 50개의 염기를 위치시켜 삭제를 수행할 수 있다. 본 발명의 DNA 합성 방법에서 하나의 DNA 폴리머라아제를 사용하여 RNA으로부터의 서열을 갖는 핵산을 증폭시키는 경우, 주형으로서 RNA를 사용하는 역전사반응 및 역전사 반응에 의해 제조된 cDAN를 주형으로서 사용하는 DNA 증폭 반응을 수행할 수 있다. 그러한 DNA 폴리머라아제는 역전사 효소 활성 및 스트랜드 치환 활성을 갖는다.
단편중에 전체 표적 서열 또는 적어도 충분한 부분의 표적 서열이 존재하기 때문에 적절한 길이의 주형은 프라이머 서열이 충분하게 결합할 수 있게 제공하는 것이다.
주형으로서 DNA가 더블-스트랜드 DNA인 경우, DNA를 싱글-스트랜드 DNA로 변성시켜 본 발명의 방법에서 프라이머가 주형으로서 DNA 스트랜드에 결합할 수 있도록 한다. 더블-스트랜드 DNA가 변성되는 온도(예: 약 95℃)에서 그것을 유지시키는 것이 변성을 위해 바람직할 수 있다. 다른 방법은 증가된 pH를 사용하는 것을 포함한다. 이러한 경우, pH를 감소시켜 증폭 반응에서 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 표적에 결합할 수 있도록 하여야 한다. 더블-스트랜드 DNA를 싱글-스트랜드 DNAs로 변성시키거나, RNA를 주형으로서 사용하는 경우, 역전사 반응에 의해 cDNA(싱글-스트랜드 DNA)를 제조한 후, 순차적으로 등온 조건하에서 뉴클레오타이드 서열을 증폭시킨다.
"순차적으로"는 반응 온도 또는 반응 혼합물의 조성을 변화시키지 않고 반응을 수행하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바, "등온"은 실직적으로 그 온도하에서 각 단계에서 효소 및 핵산 스트랜드가 작용하는 상온(constant temperature) 조건을 의미한다.
이론에 의해 제한하지 않고, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 방법에서 하기 단계를 순차적으로 반복하여 동일하게(예: 등온 조건하에서) 수행한다고 판단된다:
[1] 주형으로서 DNA를 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 어닐링시키는 단계;
[2] 주형으로서 DNA에 상보적인 DNA를 프라이머의 3'-말단으로부터 신장시키는 반응시키는 단계;
[3] 단계 [2]에서 신장된 DNA 스트랜드를 엔도뉴클레아제로 절단시키는 단계;
[4] 단계 [2]에서 신장된 DNA 스트랜드를 주형으로서 DNA로부터 분해시키지 않고 분리시키면서, 단계 [3]에서 절단된 3'-말단 부위으로부터 DNA를 신장시키는 단계;
[5] 단계 [4]에서 수득한 더블-스트랜드 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 단 계 [3] 및 [4]를 반복하는 단계.
상기 언급된 반응은 클레나우 단편과 같은 중온성 DNA 폴리어라아제를 사용하여 표준 온도(예: 37℃)에서 수행할 수 있다. 또한, 그것은 열-내성 효소(엔도뉴클레아제 또는 DNA 폴리어라아제)를 사용하여 고온 온도(예: 50℃ 이상, 또는 60℃ 이상)에서 수행할 수 있다. 이러한 경우, 프라이머의 비특이적 어닐링은 억제되어 DNA 증폭의 특이성은 증가한다. 또한, 주형으로서 DNA의 2차 구조 형성의 문제점을 해결함으로써, DNA 폴리머라아제의 신장 능력을 증가시킨다. 일례에서, 본 발명에서 역전사 반응 및 뉴클레오타이드 서열 증폭을 순차적으로 수행할 수 있다. 이러한 경우, 역전사 효소를 상기 언급된 반응과 사용하거나 역전사 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 RNA로부터 유래된 서열을 갖는 DNA를 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 제 1면은 주형으로서 싱글-스트랜드 DNA 및 적어도 하나의 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 방법에 관한 것이다.
그것은 하기의 방법을 특징으로 하여 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 방법이다:
(a) 주형으로서 핵산을 실질적으로 핵산의 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 적어도 하나의 프라이머 및 DNA 폴리머라아제로 처리하여 주형에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고, 여기에서 프라이머는 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 리보뉴클레오타이드는 엔도뉴클레아제로의 절단을 위하여 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
(b) 단계 (a)에서 수득한 더블-스트랜드 핵산의 프라이머-신장된 스트랜드를 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 엔도뉴클레아제로 절단하고;
(c) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 단계 (b)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 주형에 상보적인 핵산 서열을 신장시켜 스트랜드를 치환한다.
본 발명의 제 2면은 주형으로서 싱글-스트랜드 DNA 및 본 발명의 적어도 두개의 프라이머를 사용하여 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 방법이다.
그것은 하기의 방법을 특징으로 하는, 적어도 두개의 프라이머를 사용하여 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 방법이다:
(a) 주형으로서 핵산을 실질적으로 핵산의 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 적어도 하나의 프라이머 및 DNA 폴리머라아제로 처리하여 주형에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고, 여기에서 프라이머는 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 리보뉴클레오타이드는 엔도뉴클레아제로의 절단을 위하여 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
(b) 단계 (a)에서 수득한 더블-스트랜드 핵산의 프라이머-신장된 스트랜드를 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 엔도뉴클레아제로 절단하고;
(c) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 단계 (b)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 주형에 상보적인 핵산 서열을 신장시켜 스트랜드를 치환하고, 여기에서 재생된 프라이머-신장된 스트랜드를 포함하는 더블-스트랜드 핵산을 (b)에서 재사용하고;
(d) 주형으로서 단계 (c)에서 수득한 분리된 치환된 스트랜드를 단계 (a)에서 사용한 것과 상이한 적어도 하나의 프라이머 및 DNA 폴리머라아제로 처리하여 치환된 스트랜드에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고, 여기에서 단계 (a)에서 사용한 것과 상이한 프라이머는 실질적으로 치환된 스트랜드의 뉴클레오타이드 서열에 상보적이고 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 리보뉴클레오타이드는 엔도뉴클레아제로의 절단을 위하여 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
(e) 단계 (d)에서 수득한 더블-스트랜드 핵산의 프라이머-신장된 스트랜드를 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 엔도뉴클레아제로 절단하고;
(f) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 단계 (b)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 주형에 상보적인 핵산 서열을 신장시켜 스트랜드를 치환하고, 여기에서 재생된 프라이머-신장된 스트랜드를 포함하는 더블-스트랜드 핵산을 (d)에서 재사용한다.
본 발명의 제 3 또는 제 4면은 더블-스트랜드 DNA를 싱글-스트랜드 DNAs로 변성시킨 후 수득한 싱글-스트랜드 DNAs를 주형으로서 사용하여 제 1 또는 제 2면에 따라 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 방법이다.
본 발명의 제 5 또는 제 6면은 주형으로서 RNA를 사용하여 역전사 반응에 의해 싱글-스트랜드 cDNA를 제조하여 수득한 cDNA를 주형으로서 사용하여 제 1 또는 제 2면에 따라 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 방법이다.
본 명세서에서 사용되는 바, "재생된 프라이머-신장된 스트랜드"는 스트랜드 치환 결과 복제를 위해 새로 사용되는 올리고뉴클레오타이드 프라이머로부터 신장된, 주형으로서 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 DNA 스트랜드를 언급한다.
본 명세서에서 사용되는 바, "재사용"은 주형으로서 뉴클레오타이드 서열 및 재생된 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 DNA를 스트랜드 치환 단계에서 다시 사용하는 것을 의미한다.
본 발명의 상기 언급된 각각의 일면에서, 첫째로 주형으로서 싱글-스트랜드 DNA에 상보적인 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 DNA에 어닐링시킨다. 이어서, DNA 폴리머라아제의 작용에 의해 프라이머의 3'-말단으로부터 주형으로서 DNA의 잔존 서열을 따라 주형으로서 DNA에 상보적인 DNA(프라이머-신장된 스트랜드)를 신장시켜 더블-스트랜드 DNA를 합성한다. 엔도뉴클레아제를 더블-스트랜드 DNA에 작용시켜 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머중에 리보뉴클레오타이드 부위의 3'-말단상에서 그것을 절단한다. 엔도뉴클레아제는 다른 부위에서 DNA를 절단하지 않는다. 따라서, 엔도뉴클레아제는 더블-스트랜드 DNA에 닉을 도입시키는 닉 효소로서 작용한다. 본 발명으로 이론으로서 제한하는 것은 아니지만, 엔도뉴클레아제는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 주형으로서 DNA로 구성된 더블-스트랜드 DNA의 구조를 변경시킬 수 있다. 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리 머라아제는 닉의 3'-말단의 하류에서 DNA를 분리시키면서 더블-스트랜드 DNA중에 도입된 닉의 3'-말단으로부터 DNA 스트랜드를 재-신장시켜 신규의 프라이머-신장된 스트랜드를 제조한다. 따라서, 신규의 프라이머-신장된 스트랜드가 앞서 합성된 프라이머-신장된 스트랜드를 대신한다.
두개의 프라이머, 즉, 주형으로서 핵산에 상보적인 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 치환된 스트랜드에 상보적인 또다른 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머을 사용하여 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 방법은 수행할 수 있다. 이러한 경우, 하나의 프라이머는 주형으로서 DNA 스트랜드에 결합하여 스트랜드 치환 반응시키는 반면, 또다른 프라이머는 스트랜드 치환 반응 결과 분리된 치환된 스트랜드에 결합하여 또다른 스트랜드 치환 반응을 개시한다. 이 면이 사용되는 경우, 하나의 프라이머를 갖는 반응산물이 또다른 프라이머에 대한 주형으로서 작용할 수 있다는 것은 자명하다. 따라서, 비-선형 방법에서 주형의 양이 증가함에 따라 증폭산물의 양이 증가한다.
주형으로서 더블-스트랜드 DNA를 사용하여 본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 증폭 방법을 수행하는 경우, 더블-스트랜드 DNA의 변성 전후로 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 4개의 데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트(dNTPs), DNA 폴리머라아제 및 엔도뉴클레아제를 반응 혼합물에 첨가한다. 더블-스트랜드 DNA를 변성시키기 위해 열처리를 사용하고 열-내성 효소를 사용하지 않는 경우, 변성 후 효소를 첨가하는 것이 바람직하다.
상기 (2)에 기재된 바와 같이, 본 방법에서 사용되는 엔도뉴클레아제는 그것 인 프라이머의 리보뉴클레오타이드 부위에서 스트랜드를 절단하기 위하여 선택되어야야 한다. 바람직하게, 스트랜드는 리보뉴클레오타이드에 3'에서 절단된다. 적절한 속도로 닉킹된(nicked) DNA 스트랜드를 해리시키기 위하여 DNA 폴리머라아제를 선택하여야 한다.
본 발명에서 사용되는 DNA 폴리머라아제는 앞서 신장된 DNA 스트랜드를 치환하면서 닉킹된 부위로부터 하뷰 방향으로 신장되는 스트랜드를 합성하여야 한다. DNA 폴리머라아제는 치환된 스트랜드을 분해할 수 있는 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 나타내지 않는 것이 중요하다. 예를 들면, E. coli로부터의 DNA 폴리머라아제 I의 에고뉴클레아제-결핍 변이체인 클레나우 단편, Bst DNA 폴리머라아제로부터 유래된 유사한 단편(New England Biolabs), 및 B. ca로부터의 Bca BEST DNA 폴리머라아제(Takara Shuzo)를 그러한 DNA 폴리머라아제로서 사용한다. 시쿼나아제(Sequenase) 1.0 및 시쿼나아제 2.0(United States Biochemical), 및 (Gene, 97:13-19(1991))에 기재된 T5 DNA 폴리머라아제 및 φ29 DNA 폴리머라아제를 또한 사용할 수 있다. 적절한 억제제를 첨가하여 활성을 억제시키는 경우, 일반적으로 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 폴리머라아제를 DNA 합성 방법에서 사용할 수 있다.
본 발명의 뉴클레오타이드 서열 증폭 방법은 다양한 온도 또는 등온에서 수행될 수 있다. 다양한 온도는 각 단계에서의 변화가 반응을 방해하지 않도록 각 단계를 위해 반응 온도를 변화시키는 것을 의미한다. 특히, 다양한 온도는 예를 들면, 프라이머의 어닐링, 상보적 스트랜드의 합성 반응, 상보적 스트랜드의 닉킹(nicking) 및 치환 반응의 각각에 적절한 온도의 변화를 언급한다.
한편, 등온은 각 단계에 대한 반응 온도는 불변하고 각 단계를 실질적으로 상온(constant temperature)에서 수행하는 것을 의미한다. 둘 모두의 경우에서 반응 조건을 최적화하기 위해 온도를 선택하는 것이 적절하다.
본 발명의 뉴클레오타이드 서열 증폭 방법의 하나의 특성은 상기 방법은 핵산 합성동안 온도를 상하로 조정할 필요가 없다는 것이다. 따라서, 본 발명은 등온으로 뉴클레오타이드 서열을 합성하는 방법을 제공하는 것이다. 다수의 통상적인 핵산 증폭 방법은 합성된 스트랜드로부터 표적을 해리시키기 위하여 온도를 상하로 조절하는 것을 필요로 한다. 이들 방법은 이 목적을 위해 열 싸이클러(thermal cycler)와 같은 특별한 반응 장치를 필요로 한다. 그러나, 본 발명의 방법은 단지 온도를 일정하게 유지시킬 수 있는 장치만을 사용하여 수행된다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 단일 온도에서 수행될 수 있다. 바람직하게, 프라이머의 비-특이적인 어닐링을 감소시키고 프라이머가 특이적으로 주형으로서 뉴클레오타이드 서열에 어닐링할 수 있도록 반응 온도 및 엄격한(stringency) 수준을 선택하여 수행한다. 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 본 발명의 방법은 상기 기재된 열-내성 효소를 사용하여 고온 조건하에서 수행될 수 있다. 또한, 사용되는 효소의 활성을 충분히 유지하기 위한 적절한 온도에서 본 발명의 방법을 수행하여 반응 효율을 고수준으로 유지시키는 겻이 바람직할 수 있다. 따라서, 반응 온도는 사용되는 효소에 따라 달라질 수 있지만, 바람직하게, 20℃ 내지 약 80℃, 더욱 바람직하게 약 30 ℃ 내지 약 75℃, 가장 바람직하게 약 50℃ 내지 약 70℃이다. 특히 고온 조건하에서 반응을 수행하는 경우, 표준 온도에서의 반응을 위한 것보다 더욱 긴 프라이머를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 반응 온도에 적절한 프라이머의 서열 및 길이는 예를 들면, 그의 Tm 값을 참고로하여 결정될 수 있다. 또한, OLIGOTM 프라이머 어날리시스 소프트웨어(Takara Shuzo)와 같이 프라이머를 다자인하기 위한 상업적으로 시용가능항 소프트웨어를 사용할 수 있다. 예를 들면, 55℃ 내지 60℃ 또는 65℃의 반응 온도를 사용하는 경우, 본 발명의 방법에서 사용되는 프라이머의 길이는 에를 들면, 제한하지 않고, 12-1000 뉴클레오타이드, 바람직하게 14-50 뉴틀레오타이드, 더욱 바람직하게 15-40 뉴클레오타이드이다. 반응 온도를 승온시킴으로써 얻은 효과의 예는 주형으로서 DNA의 2차 구조 형성의 문제를 해결한 것이다. 높은 GC 함량을 갖는 핵산을 주형으로서 사용하여도, 반응 온도를 승온시킴으로써 원하는 핵산을 증폭시킬 수 있다. 또한, 그것은 유사하게 장쇄의 영역을 증폭시키는데 효과적이다. 그러한 효과는 약 100bp 내지 약 20 kbp 사이, 특히 약 200bp 내지 약 4.3 kbp 사이, 더욱 바람직하게 약 250bp 내지 약 1500 bp 사이 범위에서 관찰된다.
RNA로부터 cDNA를 제조하는 단계 (역전사 반응)를 통상적으로 수행하는 것을 포함하여, 본 발명의 방법에서 역전사 효소 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제(예: Bca BEST DNA 폴리머라아제)를 사용하여 RNA로부터 뉴클레오타이드 서열을 증폭시킨다. 또한, RNA로부터 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 단계를 독립적으로 수행하여 수득한 산물, 즉, cDNA를 본 발명의 방법에서 주형으로서 DNA로서 사용할 수 있다.
각 경우에서, 적절한 방법, 예를 들면, 효소를 불활성시키거나 반응 온도를 낮추어 그것이 종결될 때까지, 또는 반응에서 반응물중 하나가 부족할 때까지 본 발명의 방법에서 반응을 반복한다.
도 1은 주형으로서 싱글-스트랜드 DNA 및 두개의 프라이머를 사용하는 일례를 설명하는 것이다. 순차적으로 동일하게 수행되는 각 단계를 하기에 기재한다:
(1) 주형으로서 싱글-스트랜드 DNA를 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 어닐링시키는 단계;
(2) 프라이머의 3'-말단으로부터 신장 반응시켜 프라이머-신장된 스트랜드를 형성하는 단계;
(3) 프라이머중 리보뉴클레오타이를 포함하는 부위에서 엔도뉴클레아제로 절단하는 단계;
(4) DNA 폴리머라아제를 사용하여 단계 (3)에 절단 부위로부터 스트랜드 치환시키는 단계;
(5) 단계 (6) 및 하기 단계의 반응에서 분리된 치환 스트랜드를 사용하면서, 단계 (4)에서 수득한 주형 및 단계 (3)에서의 재생된 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 DNA를 재사용하는 단계;
(6) 단계 (1)에서의 것과 상이한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 주형으로서 단계 (5)에서 분리된 치환 스트랜드에 어닐링시키는 단계;
(7) 프라이머의 3'-말단으로부터 DNA 신장 반응시켜 프라이머-신장된 스트랜드를 형성하는 단계;
(8) 프라이머중에서 리보뉴클레오타이를 포함하는 부위에서 엔도뉴클레아제로 절단하는 단계;
(9) DNA 폴리머라아제를 사용하여 단계 (8)에 절단 부위로부터 스트랜드 치환시키는 단계;
(10) 단계 (9)에서 수득한 주형 및 단계 (8)에서의 재생된 프라이머-신장된 스트랜드를 재사용하는 단계.
더블-스트랜드 DNA를 주헝으로서 사용하는 경우, 더블-스트랜드 DNA를 변성시킨 후 수득한 싱글-스트랜드 DNAs 각각을 단계 (1)에서 주형으로서 사용한다. 그러므로, 증폭 산물의 양은 주형으로서 싱글-스트랜드 DNA를 사용하여 수득한 것 이상이다. 또한, 싱글-스트랜드 DNA를 주형으로서 사용하는 경우보다 더욱 단시간동안 증폭 산물의 검출을 수행할 수 있다.
본 발명의 뉴클레오타이드 서열 증폭 방법은 핵산의 검출, 표지 및 서열화를 포함하는 뉴클레오타이드 서열 증폭을 사용하는 다양한 실험 방법을 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 증폭 방법은 DNA 칩과 같은 고체 기질상의 핵산을 증폭시키는 방법인 인시츄(in situ)에서의 핵산 증폭 방법, 또는 다수의 영역을 동시에 증폭시키는 멀티플렉스 핵산 증폭 방법을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 뉴클레오타이드 서열 증폭 방법의 하나의 특징은 싱글-스트랜드 DNA를 제조하는 그의 능력이다. 이 목적을 위해 하나 또는 두개의 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용할 수 있다. 예를 들면, 두개의 올리고뉴클레오타 이드 프라이머를 사용하는 경우, 본 발명의 방법은, 또다른 것에 대하여 상대적으로 과량의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 수행되는 증폭 방법인 비대칭 PCR 방법을 위해 사용되는 것와 같은 프라이머 비를 적용시켜 수행할 수 있다. 결과적으로, 하나의 스트랜드로부터 치환된 산물의 양은 또다른 것으로부터의 것에 대하여 상대적으로 과량이다.
본 발명의 뉴클레오타이드 서열 증폭 방법에 따라, 그의 상보적인 스트랜드가 실질적으로 결핍된 싱글-스트랜드 DNA를 제조할 수 있다. 예를 들면, DNA 칩과 같이 고정하고자 하는 핵산을 갖는 물질을 제조하기 위한 싱글-스트랜드 DNA, 표적 핵산 을 검출하기 위한 싱글-스트랜드 DNA 프로브, 또는 장쇄 PCR 방법용 메가-프라이머(mega-primer)를 단시간에 용이하게 제조할 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 단지 센스 서열(sense sequence) 또는 안티센스 서열(anti sense sequence)을 선택적으로 증폭시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 센스 서열 또는 안티센트 서열을 갖는 핵산을 제조하는 방법으로서 유용하다.
또한, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 증폭 방법은 시간동안 온도를 조정할 수 있는 반응 장치의 사용을 필요로 하지 않는다. 그러므로, 증폭 반응은 대량의 반응 혼합물중에서 수행될 수 있다. 따라서, 핵산(예: 의료용)을 대량으로 산업적으로 생산할 수 있다.
본 발명의 뉴클레오타이드 서열 증폭 방법에서 사용된 프라이머의 사용 효율은 PCR 방법과 같은 통상의 방법에서 것보다 5- 내지 10배 높은 약 100%이다.
(6) 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 증폭 방법을 위한 키트
본 발명은 상기 기재된 제 1 내지 제 6면의 뉴클레오타이드 서열 증폭 방법을 위한 키트를 제공한다. 일례에서, 키트는 패키지 형태(packaged form)이고 스트랜드 치환 반응과 관련하여 DNA 폴리머라아제 및 엔도뉴클레아제의 사용과 관련된 안내서를 포함한다. 또한, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제, 엔도뉴클레아제, 및 스트랜드 치환 반응용 완충액을 포함하는 키트가 본 발명의 방법에서 바람직하게 사용된다. 또한, 상업적으로 사용가능한 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제 및/또는 엔도뉴클레아제을 안내서에 따라 선택하고 사용할 수 있있다. 또한, RNA를 주형으로서 사용하는 경우, 키트는 사용되는 역전사 반응용 시약을 포함할 수 있다. DNA 폴리머라아제는 상기 (3)에 기재된 바와 같이 본 발명에서 사용되는 DNA 폴리머라아제들로부터 선택될 수 있다. 엔도뉴클레아제는 상기 (2)에 기재된 바와 같은 엔도뉴클레아제들로부터 선택할 수 있다. 상기 (4)에 기재된 바와 같은 반응 완충액 조성을 갖는 것을 바람직하게 스트랜드 치환 반응용 완충액으로서 사용할 수 있다.
"안내서"는 키트 사용법, 예를 들면, 스트랜드 치환 반응용 시약 용액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
(7) 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 검출 방법 및 상기 방법을 위한 키트
본 발명의 뉴클레오타이드 서열 증폭 방법을 사용하여 샘플중 표적 핵산을 검출할 수 있다. 검출은 하기 방법을 포함한다:
(a) 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 증폭 방법에 의해 표적 핵산을 증폭시키고;
(b) 상기 단계에서 증폭된 표적 핵산을 검출한다.
본 발명을 사용하여 샘플중에 특이적 유전자를 검출하거나 측량화할 수 있다. 즉, 특이적 유전자는 검출하거나 측량화된 형태이다. 즉, DNA 또는 RNA와 같은 핵산을 포함할 것으로 예측되는 모든 샘플로부터 특이적 유전자를 검출하거나 측량할 수 있다. 특이적 유전자가 검출하거나 측량화될 수 있는 샘플의 예는, 제한하는 것은 아니지만, 전체 혈액, 혈청, 백혈구층, 소변, 대변, 뇌척수액, 정액, 침, 조직(예: 종양 조직 또는 림프절) 및 세포 배양액(예: 포유류 세포 배양액 또는 박테리아성 세포 배양액)과 같은 유기체로부터의 샘플, 비로이드, 바이러스, 박테리아, 균류, 효모, 식물 및 동물과 같은 핵산을 포함하는 샘플, 바이러스 또는 박테리아와 같은 미생물로 오염되거나 감염된 샘플(예; 식품 또는 생물학적 제제), 및 토양 및 폐수와 같은 유기체를 포함할 수 있는 샘플을 포함한다. 예를 들면, 샘플중의 비로이드, 바이러스, 박테리아, 균류 또는 다른 미생물은 표적으로서 비로이드, 바이러스, 박테리아, 진균 또는 다른 미생물로부터 유래된 특이적 유전자의 존재 또는 함량에 기초하여 검출 또는 측량화될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법을 사용하여 유기체의 유전자형을 식별하거나 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있다. RNA 및 DNA 둘 모두를 검출 방법에서 주형으로서의 핵산으로 바람직하게 사용할 수 있다.
핵산 검출을 위한 공지된 방법을 단계 (b)를 위해 사용할 수 있다. 그러한 방법의 예는 전기영동에 의해 특정 크기를 갖는 반응산물의 검출, 및 프로브와 하이브리다이제이션시키는 검출을 포함한다. 에티디윰 브로마이드와 같은 형광 물질을 사용하여 전기 영동에 의한 검출에서 사용한다. 프로브를 사용하는 하이브리다이제이션을 전기영동에 의한 검출과 조합시킬 수 있다. 프로브는 방사성 동위 원소로 표지할 수 있거나 바이오틴과 같은 비-방사성 동위 원소 물질 또는 형광 물질로 표지할 수 있다. 또한, 단계 (a)에서 표지된 뉴클레오타이드를 사용하여 증폭 산물의 검출을 촉진시킬 수 있다. 또한, 형광 편광법, 형광 에너지 전이 등을 검출을 위해 사용할 수 있다. 적절한 검출 시스템을 구측하여 표적 핵산을 자동적으로 검출하거나 측량화할 수 있다.
소광 상태가 되는 거리에 위치한 두개 이상의 형광 물질로 표지된 리보뉴클레오타이드(RNA) 프로브를 본 발명의 검출 방법에 사용할 수 있다. 프로브는 형광을 발산하지 않는다. 그것이 프로브에 상보적인 표적 핵산으로부터 증폭된 DNA에 어닐링되는 경우, RNase H가 프로브를 분해한다. 이어서, 프로브상에 형광 물질사이에 거리를 증가시켜, 형광을 발산시킨다, 발산은 표적 핵산의 존재를 나타낸다. RNase H를 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 증폭 방법에서 사용하는 경우, 단지 프로브를 반응 혼합물에 첨가하여 표적 핵산을 검출할 수 있다. 예를 들면, 형광 물질, 6-카복시플루오레슨(6-FAM) 및 N,N,N',N'-테트메틸-6-카복시로다민(TAMRA)의 혼합물을 프로브 표지용으로 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명의 등온 조건하에서 뉴클레오타이드 서열 증폭 방법은 열 싸이클러와 같은 장치의 사용을 필요로 하지 않는다. 본 발명의 증폭 방법에서 사용되는 프라이머의 수는 통상의 방법에서 사용되는 것보다 적은 하나 또는 둘이다. PCR용 dNTPs 등과 같은 시약을 본 발명의 방법에 사용하기 때문에, 통상의 방법과 비교하여 러닝 코스트(running cost)를 감소시킬 수 있다. 그러므로, 본 발명의 방법은 검출을 항상 수행하는 유전자 시험을 포함하는 분야에서 바람직하게 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 PCR 방법보다 더욱 단시간에 증폭 산물을 대량으로 제공한다. 그러므로, 본 발명의 방법은 편리하고 신속하고 민감한 유전자 검출 방법으로서 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 표적 핵산 검출 방법에서 사용되는 키트를 제공한다. 상기 기재된 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 증폭 방법을 위해 사용되는 키트를 이 키트로서 사용할 수 있다. 또한 키트는 표적 핵산을 증폭시키기 위한 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브와 같이 증폭된 표적 핵산을 검출하기 위한 시약을 포함할 수 있다.
(8) 본 발명의 미리 정해진 영역에 배열되고 고정화된 핵산을 갖는 물질 및 그를 제조하는 방법.
DNA 칩(또는 DNA 마이크로어레이 또는 DNA 어레이로서 언급함)은 그것에 다양한 유전자 단편 또는 DNAs가 슬라이드 글라스와 같은 고체 기질상의 미리 정해진 영역 또는 미리 정해진 위치에 배열되고 고정화된, 고정화된 핵산을 갖는 물질이다. DNA 칩은 DNA 칩상에 미리 정해진 영역에 배열되고 고정화된 DNA에 상보적인 서열을 갖는 핵산의 핵산 샘플중의 존재 여부를 조사하기 위해 사용된다. 하이브리 다이제이션시키기 위해 DNA 칩을 샘플, 바람직하게 표지된 핵산 샘플로부터 제조된 핵산 샘플과 접촉시킨다. 하나의 방법에서 DNA 칩을 사용하여 샘플중의 핵산을 검출하거나 핵산의 수를 측량할 수 있기 때문에, 그것은 유전자 발현 분석, 또는 돌연 변이 또는 다형(polymorphism)의 분석을 매우 효과적으로 촉진시키는 유용한 방법이다. 더블-스트랜드 핵산이 미리 정해진 영역에 배열되고 고정화된 DNA 칩은 적절히 변성시킨 후에 하이브리다이제이션을 위해 사용한다. 검출되는 표적 핵산에 상보적인 싱글-스트랜드 DNA가 미리 정해진 영역에 배열되고 고정화된 DNA 칩이 표적 핵산 검출용으로 특히 바람직할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 원하는 DNA를 본 발명의 방법에 의해 싱글-스트랜드 형태로 증폭시킬 수 있다. 증폭 산물을 정제시키는 어느 방법도 사용될 수 있지만, 이소프로판올 침전을 사용하는 정제법이 바람직할 수 있다. 그렇게 수득한 DNA, 바람직하게 실질적으로 그의 상보적 스트랜드가 없는 싱글-스트랜드 DNA를 바람직하게 DNA 칩상에 고정하고자 하는 DNA 단편으로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법을 DNA 칩을 생산하기 위해 미리 정해진 영역에 배열되고 고정하고자 DNA를 제조하는 방법으로서 바람직하게 사용한다. 어느 불용성 기질도 그렇게 수득한 DNA를 그것위에 미리 정해진 영역에 배열하고 고정화하는 기질로서 사용할 수 있지만, 글래스 또는플라스틱으로부터 제조된 프레이트-형태의 기질, 및 니트로셀룰로오스 또는 나일론으로부터 제조된 막-형태의 기질을 바람직하게 사용한다. 고정화시키는 공지된 방법을 사용하여 핵산을 고정화시킬 수 있다. DNA는 그대로 기질상의 고정화될 수 있다. 또한, DNA는 적절한 링커(linker)를 통해 고정화될 수 있거나 다수 의 DNA 분자를 결찰(ligating)시켜 고정화될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 증폭된 DNA가 미리 정해진 영역에 배열되고 고정화된, 고정화된 핵산을 갖는 물질(예: DNA 칩)상에서 핵산과 하이브리다이제이션되는 표적 핵산을 검출 또는 측량할 수 있다. 그러한 검출 또는 측량은 표적 핵산을 함유할 것으로 예상되는 샘플로부터 제조된 핵산 샘플과 물질을 접촉시켜 하이브리다이제이션시켜 수행될 수 있다. 이들 중에서, 본 발명의 방법에 의해 증폭된 싱글-스트랜드 DNA가 미리 정해진 영역에 배열되고 고정화된 DNA 칩은 통상의 물질과 비교하여 더욱 편리하고 높고감도 및 더욱 높은 생산력으로 표적 핵산을 검출할 수 있게 한다.
(9) 본 발명의 핵산을 대량 생산하는 방법
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 일면은 등온 조건하에서 수행될 수 있는 뉴클레오타이드 서열 증폭 방법을 제공한다. 증폭되는 핵산을 위해 주형으로서 핵산 및 반응을 위해 필요한 다양한 성분을 혼합하고 등온 조건하에서 혼합물을 반응시키는 방법에 의해 바람직한 핵산을 생산할 수 있다. PCR 방법은 시간동안 반응 혼합물의 온도를 변화시켜야 하기 때문에, 온도를 조정할 수 있는 반응 용량(일반적으로, 200㎕ 이하)의 것으로 제한한다. 그러므로, 용량을 증가시키는 것은 어렵다. 한편, 본 발명의 방법에는 그러한 제한은 없다. 반응 혼합물의 용량을 증가시켜 다량의 핵산을 생산할 수 있다. 본 발명의 방법에서, 다수의 상보적 스트랜드 분자를 하나의 주형 분자로부터 합성한다. 또한, 주형들로서 이들 상보적 스트랜드 분자들을 사용하여 핵산을 합성할 수 있다. 따라서, 적절하게 주형 및 프라이머를 선택하여 원하는 핵산을 효율적으로 다량 생산할 수 있다. 또한, PCR 방법과는 달리, 본 발명의 방법은 특정 장치 또는 복잡한 온도 변화를 요구하지 않는다는 사실이 장치 및 에너지 비용과 관련하여 그것을 이롭게 한다. 그러므로, 상기 방법은 핵산을 다량 생산하는 산업상 우수한 방법이다.
또한, 본 발명의 방법은 DNA 칩상에 고정하고자 하는 것과 같은, 다양한 DNA 단편을 다량 공급하는 방법으로서 유용하다. 특히, 일례에서 DNA 단편을 단순 반응 단계에서 다량 수득할 수 있다. 또다른 일례에서, 제한된 수의 프라이머드을 사용하여 다양한 DNA 단편을 수득할 수 있다. PCR 방법과 같으 공지된 핵산 증폭 방법에 의해 앞서 본 발명의 방법에서 주형으로서 작용하는 핵산을 증폭시키는 단게를 이후의 일례에서 인용할 수 있다. 예를 들면, 태그 서열을 갖는 무작위 프라이머를 사용하여 핵산을 증폭시키는 방법(Nucleic Acids Reseach, 24(19):3778-3783(1996)) 또는 축퇴 프라이머를 사용하는 축퇴-올리고뉴클레오타이드-프라임드 PCR(DOP-PCR, Genomics, 13:718-725(1992))에 기초하여, 주형으로서 모든 종류의 핵산을 제한된 수의 프라이머를 사용하여 증폭시킬 수 있다. 주형으로서 상기 언급된 단계에서 제조된 모든 핵산에 대한 일부의 프라이머중 하나를 사용하여 본 발명의 증폭 방법을 수행할 수 있다. 이것은 그것을 무작위 또는 축퇴 프라이머에 첨가된 태그 서열에 일치시키기 위해 본 발명의 증폭 방법에서 사용되는 프라이머를 디자인하여 수행될 수 있다. 따라서, 주형으로서 핵산을 제조하는 적절한 단계 및 본 발명의 방법을 결합시킴으로써 통상의 방법과 비교하여 더욱 저렴한 비용으로 다양한 DNA 단편을 다량 공급할 수 있다.
핵산을 포함하는 약제학적 조성물은 세포중에서 유용한 폴리펩티드를 발현시키는 더블-스트랜드 DNA 또는 관심의 대상이 되는 유전자의 발현을 억제하는 싱글-스트랜드 안티센스 DNA를 포함할 수 있다. 적절한 방법, 예를 들면, 리보솜과 같은 유전자 전달용 전달체를 사용하여 그러한 핵산을 유기체내로 투여한다. 의료용 싱글-스트랜드 또는 더블-스트랜드 핵산을 다량 생산하기 위해 본 발명의 핵산 제조 방법이 바람직할 수 있다. 또한, 예를 들면, 생체내에서 핵산의 축퇴를 억제시키는, dNTP 아날로그를 포함하는 핵산을 본 발명의 방법에 의해 용이하게 생산할 수 있다.
본 발명에서 증폭된 DNA 단편은 표준의 뉴클레오타이드로 구성되기 때문에, DNA중에 제한효소 부위를 사용하여 증폭된 DNA는 적절한 벡터내로 서브클로닝될 수 있다. 또한, 예를 들면, DNA는 별 문제없이 RFLP용 제한 효소로 처리될 수 있다. 그러므로, DNA는 유전자 시험 분야에서 광범위하게 사용될 수 있다. 본 발명에서 증폭된 DNA 단편은 표준의 뉴클레오타이드로 구성되기 때문에, RNA 폴리머라아제를 위한 프로모터 서열을 증폭된 단편내로 혼입시킬 수 있다. 예를 들면, 증폭된 단편을 주형으로서 사용하여 프로브로서 사용할 수 있는 RNA를 합성할 수 있다. 물론, 표준 dNTP를 대신하여 형광-표지된 dNTP를 사용하여 본 발명의 뉴클레오타이드 증폭 방법을 수행하여 형광-표지된 DNA 프로브를 생산할 수 있다.
본 발명의 방법에서 최종적으로 증폭된 단편이 양단에 증폭용 프라이머에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖지 않기 때문에, 증폭 산물의 캐리-오버(carry-over)에 기인하는 오염을 줄일 수 있다. 그러므로, 본 발명의 방법은 동일한 영역 을 계속하여 증폭시키는 유전자 시험 등에서 유용하다.
본 발명의 뉴클레오타이드 서열 증폭 방법의 특징을 하기에 나열한다.
1. 소량의 주형으로부터 다량의 핵산을 증폭시킬 수 있다. 두개의 프라이머를 사용하는 경우 증폭 산물은 2차 함수적으로 증가한다.
2. 등온으로 수행될 수 있다. 이러한 경우, 열 싸이클러와 같은 장치의 사용을 필요로 않는다. 그러므로, 반응 용량을 용이하게 증가시킬 수 있다.
3. 일반적으로, 하나 또는 두개의 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 주개의 효소(DNA 폴리머라아제 및 엔도뉴클레아제)를 사용하여 증폭 반응을 수행한다.
4. 다수의 DNA 스트랜드가 한 분자의 프라이머로부터 합성될 수 있기 때문에, 프라이머의 양이 증폭 산물의 양을 제한하지 않는다. 또한, 프라이머 사용 효율은 PCR 방법의 것과 비교하여 더욱 높은 약 100%이다.
5. 목적에 따라 싱글-스트랜드 또는 더블-스트랜드를 선택적으로 증폭시킬 수 있다.
6. 그것은 증폭 반응을 위해 (α-S) dNTP와 같은 dNTP 아날로그를 필요로 하지 않기 때문에, 시약의 비용은 저렴하다. 또한, dNTP 아날로그 없이 천연 형태의 핵산을 수득할 수 있다.
7, 본 발명의 방법을 또다른 핵산 증폭 방법과 결합하여 저렴한 비용으로 증폭된 DNA 단편을 다량 공급할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 상업상 핵산을 생산하는 것이 적 절하다.
본 발명을 실시예에 따라 더욱 구체적으로 설명하며, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
참고예
본 발명의 방법에 사용되는 RNase H의 유니트 수를, 이하의 방법으로 측정하였다.
(1) 사용하는 시약 용액의 제조
역가측정용 반응 혼합물 : 최종농도가 각각 40mM 트리스-염산(pH 7.7, 37℃), 4mM 염화마그네슘, 1mM DTT, 0.003% BSA, 4% 글리세롤 및 24μM 폴리(dT)가 되도록 멸균수로 제조하였다.
폴리(8-3H)아데닐산 용액 : 370kBq의 폴리(8-3H)아데닐산 용액을 200㎕의 멸균수에 희석하였다.
폴리아데닐산 용액 : 폴리아데닐산을 초순수의 멸균수(sterile ultraqure water)를 사용하여 3mM의 농도로 희석시켰다.
효소 희석액 : 최종농도가 각각 25mM 트리스-염산(pH 7.5, 37℃), 5mM 2-머캅토에탄올, 0.5mM EDTA(pH 7.5, 37℃), 30mM 염화나트륨 및 50% 글리세롤이 되도록 멸균수로 제조하였다.
열변성 송아지 흉선 DNA의 제조 : 송아지 흉선 DNA 200㎎을 TE 완충액 100㎖ 에 현탁하여 팽윤시켰다. 이 용액을 UV 260㎚에서 측정된 흡광도에 기초하여 1㎎/㎖의 농도가 되도록 멸균 초순수로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 100℃에서 10분간 가열한 후, 얼음조에서 급냉하였다.
(2) 활성 측정 방법
상기 (1)에서 제조한 역가측정용 반응 혼합물 985㎕에 폴리(8-3H)아데닐산 용액 7㎕를 가하였다. 상기 혼합물을 37℃에서 10분간 인큐베이션시켰다. 최종농도가 24μM이 되도록 8㎕의 폴리아데닐산을 가하였다. 추가로 37℃에서 5분간 인큐베이션시켰다. 이렇게 하여 폴리(8-3H)rA-폴리dT 반응 혼합물 1000㎕를 제조하였다. 이어서, 이 반응액 200㎕를 30℃에서 5분간 인큐베이션시켰다. 적절하게 희석된 일련의 효소액 1㎕를 가하였다. 시간동안 이들 반응액을 50㎕씩 샘플링하여, 다음 측정에 사용하였다. 효소첨가로부터 샘플링까지의 시간을 Y분으로 하였다. 또, 총 CPM용 반응 혼합물 50㎕ 또는 블랭크용 반응 혼합물 50㎕를 효소액 대신에 효소 희석액을 1㎕ 가하여 제조하였다. 이 샘플링 용액에 10mM 피롤린산 나트륨 100㎕, 열변성 송아지 흉선 DNA 용액 50㎕ 및 10% 트리클로로 아세트산 300㎕(총 CPM 측정의 경우는, 초순수 300㎕)을 가하였다. 혼합물을 0℃에서 5분간 인큐베이션시킨 후, 10000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리후, 수득된 상등액 250㎕를 바이얼에 넣었다. 아쿠아졸-2(NEN Life Science Products) 10㎖를 가하였다. 액체 신틸레이션 카운터(Scintillation counter)로 CPM을 측정하였다.
(3) 유니트 계산
각 효소의 유니트 값을 이하의 계산식으로 산출하였다.
유니스/㎖ = {(측정된CPM-블랭크CPM) x 1.2* x 20 x 1000 x 희석율}200(㎕)/(총 CPM x Y(분) x 50(㎕) x 9**)
1.2* : 50㎕당 총 CPM중에 함유된 폴리(8-3H)rA-폴리dT의 양(nmol)
9** : 보정계수
실시예 1
(1) 주형 DNA와 프라이머의 합성
본 실시예에 주형으로서 사용한 99 염기의 싱글-스트랜드 DNA 및 프라이머를 DNA 합성기(Applied Biosystems)를 사용하여 합성하였다. 서열 목록의 서열 번호 1에 상기 99 염기의 싱글-스트랜드 DNA 염기서열을 나타내었다. 또, 서열 목록의 서열 번호 2 및 3에 각각 상류 프라이머 및 하류 프라이머의 기본적인 염기서열을 나타내었다. 본 실시예에 사용된 프라이머의 상세 구조는 이하에 나타낸다:
프라이머쌍 1 : 서열 목록의 서열 번호 2 및 3에 나타낸 염기서열을 가지며, 그 전체가 모두 데옥시리보뉴클레오타이드로 구성된 프라이머의 조합;
프라이머쌍 2 : 프라이머쌍 1의 프라이머 각각의 3' 말단으로부터 두 번째의 데옥시뉴클레오타이드가 리보뉴클레오타이드로 치환되고, 또한 3' 말단으로부터 두 번째의 리보뉴클레오타이드의 5'측 인산결합이 포스포로티오에이트 결합에 의해 치 환된 프라이머의 조합;
프라이머쌍 3 : 프라이머쌍 1의 프라이머 각각의 3' 말단 데옥시뉴클레오타이드만이 리보뉴클레오타이드로 치환되고, 또한 이 리보뉴클레오타이드의 5'측 인산결합이 포스포로티오에이트 결합에 의해 치환된 프라이머의 조합;
프라이머쌍 4 : 프라이머쌍 1의 프라이머 각각의 3' 말단으로부터 두 번째의 데옥시뉴클레오타이드가 리보뉴클레오타이드로 치환된 프라이머의 조합;
프라이머쌍 5 : 프라이머쌍 1의 프라이머 각각의 3' 말단으로부터 세 번째 및 4 번재의 데옥시뉴클레오타이드가 리보뉴클레오타이드로 치환되고, 또한 3' 말단으로부터 4 번째의 리보뉴클레오타이드의 5'측 인산결합이 포스포로티오에이트 결합에 의해 치환된 프라이머의 조합.
(2) 증폭반응
바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 결손시킨 DNA 폴리머라아제인 Bca DNA 폴리머라아제(Takara Shuzo)와 대장균으로부터 유래된 RNase H인 Cloned 리보뉴클레아제 H(Takara Shuzo)를 사용하여 이하의 모델 1∼7의 반응계에 대하여 검토하였다.
반응액은 하기와 같이 제조하였다.
35mM 트리스-염산 완충액(pH 7.5), 0.1㎎/㎖ BSA(소혈청 알부민), 2.7% 글리세롤, 5% 디메틸설폭사이드, 각 1.4mM dNTP 혼합물, 10mM 염화마그네슘, 각각 20 pmol의 상기 (1)의 프라이머쌍 또는 그의 일측 프라이머, 및 주형으로서 0.6ng의 합성 싱글-스트랜드 DNA, 5U BcaBEST DNA 폴리머라아제, 60U의 클로닝된 리보뉴클레아제 H, 반응액의 최종 용량 50㎕. 상기 반응액을 균일하게 혼합하고, 55℃에서 60분간 보온한 후, 90℃에서 2분간 가열하여 효소를 비활성화시켰다. 그 후, 각 반응액의 8㎕를 3% 누시브(누시브) 3:1 아가로스(Takara Shuzo) 겔로 전기영동시켰다. 이하에 각 모델에 사용된 프라이머를 나타내었다:
모델 1∼5 : 각각 프라이머쌍 1 ∼ 프라이머쌍 5가 사용됨;
모델 6 : 프라이머쌍 2중 하류 프라이머만이 사용됨;
모델 7 : 프라이머쌍 4를 사용하고, RNase H를 첨가하지 않음.
그 결과, 모델 2∼5의 반응액을 사용한 경우, 약 40bp(base pair)∼약 90bp의 범위에서 목적하는 사이즈의 증폭단편이 확인되었다. 이들 반응계에서 DNA가 증폭된다는 것이 분명해졌다. 또, 일측 프라이머만을 사용한 모델 6에서도 예상되는 약 70b(base)의 증폭단편(싱글-스트랜드 DNA 단편)이 확인되었다. 또한, 모델 1 및 7의 반응에서는 DNA 증폭이 전혀 확인되지 않았다.
(3) 증폭산물의 확인
상기 (2)의 모델 4의 반응에 의해 수득된 반응액을 마이크로콘-100 (Microcon-100, Takara Shuzo)을 사용하여 여과한 후, 필터에 걸린 증폭 DNA 단편을 회수하였다. 이 DNA 단편의 염기서열을 디데옥시법으로 해석하였다. 그 결과, 상기 반응에 의해 증폭된 단편은 주형 DNA와 동일한 염기서열을 가진 DNA인 것으로 확인되었다.
(4) 반응시간의 검토
상기 (1)의 모델 2의 반응액을 제조하고, 이것을 여러 시간 반응시킨 경우의 증폭산물양의 변화를 조사하였다. 해당 반응액을 0, 15, 30, 60, 90, 120분간 각각 55℃에서 보온한 후, 90℃에서 2분간 처리하여 효소를 비활성화시켰다. 각 반응액 8㎕를 3% 누시브 3:1 아가로스 겔을 사용하여 전기영동으로 해석하였다. 전기영동의 결과를 도 2에 나타내었다. 도면 중 1 내지 6은 각각 0, 15, 30, 60, 90, 120분간 반응한 반응액이 영동된 레인을, 또한 M은 분자량 마커로서 100bp DNA ladder marker(Takara Shuzo)가 영동된 레인을 나타낸다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 반응시간이 0분에서는 증폭산물이 확인되지 않았지만, 반응시간이 15분, 30분, 60분으로 길어짐에 따라 증폭산물양이 증대되는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 60분이상의 반응에서는 전기영동에 의해 확인되는 증폭산물양의 변화가 거의 없었고, 사용된 반응계에서의 증폭은 약 60분에서 플래토우(plateau)에 도달하는 것이 확인되었다.
실시예 2
(1) RNA의 제조
본 실시예에 주형으로서 사용하는 RNA는 인간 배양세포 HT29(ATCC HTB-38)(Dainippon Pharmaceutical사 제품)로부터 트라이졸 시약(TRIzol reagent, Life Technologies사 제품)을 제조하였다. 수득된 총 RNA는 그 농도를 1㎍/㎕로 제조하였다. 또, RNA의 순도를 분광학으로 조사한 바, OD260/OD280=1.8이었다.
(2) 증폭반응
역전사활성 및 DNA 폴리머라아제 활성을 갖는 Bca BEST DNA 폴리머라아제와 RNase H 엔도뉴클레아제를 사용하여 RNA로부터 cDNA가 증폭되는지를 검토하였다.
반응액에는 1㎍ 상당의 상기 총 RNA를 가하여 실시예 2와 동일한 조성으로 제조하였다. 인간 트랜스페린 수용체(GenBank 등록번호 X01060)를 코딩하는 표적 영역을 실시예 1에 기재한 프라이머쌍 2를 프로이머로서 사용하여 증폭시켰다.
상기 반응액을 55℃에서 60분간 보온한 후, 90℃에서 2분간 가열하여 효소를 비활성화시켰다. 이 반응액 중 8㎕를 3% 누시브 3:1 아가로스 겔로 전기영동한 결과, 예상되는 56bp의 증폭단편이 확인되었다. 또, 표적으로 한 염기서열을 갖는 프로브를 사용하여 서던 하이브리다이제이션(Southern hybridization)을 실시하였다.
그의 5' 말단에 비오틴으로 표지된 서열 목록의 서열 번호 4에 나타낸 바와 같은 염기서열을 갖는 DNA 프로브를 사용하여 서던 하이브리다이제이션을 실시하였다. 그 결과, 이 프로브가 상기 증폭단편에 하이브리다이제이션시켰다. 즉, 본 발명의 방법에 의해 표적으로 한 영역이 정확히 증폭되었음이 확인되었다.
실시예 3
(1) 프라이머의 합성
더블-스트랜드 DNA를 주형으로 한 경우의 본 발명의 증폭방법에 대하여 검토하였다. 사용하는 프라이머는 DNA 합성기(Applied Biosystems)를 사용하여 합성하였다. 서열 목록의 서열 번호 5∼13에 프라이머의 기본적인 염기서열을 나타내었다. 또한, 본 실시예에 사용된 프라이머의 상세한 구조를 이하에 나타내었다. 프라이머쌍 A∼F까지는 pUC19DNA(Takara Shuzo)을 주형으로 하였다. pUC19의 뉴클레오타이드 서열은 데이터베이스(GenBank 등록번호 L09137)로부터 입수가능하다. 프라이머쌍 G의 경우는 주형으로서 증폭된 더블-스트랜드 DNA 단편을 사용하였다. 이 단편은 서열 목록의 서열 번호 14 및 15에 기재된 프라이머 및 TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver. 2.1(Takara Shuzo)을 사용하여 첨부된 표준 프로토콜에 따라 실시예 2에서 수득된 인간 총 RNA로부터 제조하였다.
프라이머쌍 A (증폭단편길이 약 450bp) : 서열 목록의 서열 번호 5 및 6에 나타낸 염기서열을 가지며, 그의 3' 말단으로부터 첫 번째 및 두 번째 염기가 리보뉴클레아타이드로 치환된 프라이머의 조합;
프라이머쌍 B (증폭단편길이 약 250bp) : 서열 목록의 서열 번호 5 및 7에 나타낸 염기서열을 가지며, 그의 3' 말단으로부터 첫 번째 및 두 번째 염기가 리보뉴클레아타이드로 치환된 프라이머의 조합;
프라이머쌍 C (증폭단편길이 약 520bp) : 서열 목록의 서열 번호 5 및 8에 나타낸 염기서열을 가지며, 그의 3' 말단으로부터 첫 번째 및 두 번째 염기가 리보뉴클레아타이드로 치환된 프라이머의 조합;
프라이머쌍 D (증폭단편길이 약 890bp) : 서열 목록의 서열 번호 5 및 9에 나타낸 염기서열을 가지며, 그의 3' 말단으로부터 첫 번째 및 두 번째 염기가 리보뉴클레아타이드로 치환된 프라이머의 조합;
프라이머쌍 E (증폭단편길이 약 130bp) : 서열 목록의 서열 번호 10 및 6에 나타낸 염기서열을 가지며, 그의 3' 말단으로부터 첫 번째 내지 세 번째 염기가 리보뉴클레아타이드로 치환된 프라이머의 조합;
프라이머쌍 F (증폭단편길이 약 220bp) : 서열 목록의 서열 번호 11 및 6에 나타낸 염기서열을 가지며, 그의 3' 말단으로부터 첫 번째 내지 세 번째 염기가 리보뉴클레아타이드로 치환된 프라이머의 조합;
프라이머쌍 G (증폭단편길이 약 320bp) : 서열 목록의 서열 번호 12 및 6에 나타낸 염기서열을 가지며, 그의 3' 말단으로부터 첫 번째 및 세 번째 염기가 리보뉴클레아타이드로 치환된 프라이머의 조합.
(2) 증폭반응
반응액은 하기와 같이 제조하였다.
35mM 인산칼륨 완충액(pH 7.5), 0.1㎎/㎖ BSA(소혈청 알부민), 5% 디메틸설폭사이드, 각 1.4mM dNTP 혼합물, 10mM 염화마그네슘, 각각 60 pmol의 상기 (1)의 프라이머쌍, 및 100ng의 pUC19 주형 DNA, 5.5U Bca BEST DNA 폴리머라아제, 60U의 RNase H, 반응액의 최종 용량 50㎕.
반응조건은 하기와 같다. DNA 폴리머라아제 및 RNase H를 첨가하지 않은 반응액을 98℃에서 1분간 열변성 처리한 후, 55℃에서 60분간 보온하였다. 반응 종료후, 90℃에서 2분간 가열하여 효소를 비활성화시켰다. 그후, 각 반응액 8㎕를 3% 누시브 3:1 아가로스 겔로 전기영동을 실시하였다.
그 결과, 모든 프라이머쌍에서 목적하는 증폭단편이 수득되는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명의 증폭방법에서 더블-스트랜드 DNA를 주형으로 하여 증폭반응을 실시할 수 있다는 것을 확인하였다.
(3) 증폭산물의 제한 효소 분해
본 발명의 증폭방법을 사용하여 수득된 증폭단편의 제한 효소 분해에 대하여 검토하였다. 주형 DNA로서, pUC19 플라스미드 DNA를 사용하였다. 서열 목록의 서열 번호 5∼6에 기재된 pUC19 어퍼(upper) (2) NN 프라이머 및 pUC19 로어(lower) NN 프라이머를 사용하였다. 또한, 이 프라이머는 모두 3' 말단의 첫 번째 및 두 번째 염기가 리보뉴클레오타이드로 치환된 것을 사용하였다. 하기에 반응액 조성을 나타내었다.
반응액 A : 35mM 인산칼륨 완충액(pH 7.5), 10mM 염화마그네슘, 1.4mM dNTP 혼합물, 0.01% BSA, 5% DMSO, 2.7% 글리세롤, 각 100pmol씩의 pUC19 어퍼 (2) NN 프라이머 및 pUC19 로어 NN 프라이머, 500ng pUC19 DNA, 및 멸균증류수로 반응액 용량을 48㎕로 제조하였다.
상기 반응액을 98℃에서 1분간 열변성 처리한 후, 55℃로 냉각시켰다. 이어, 60U의 E. coli RNase H 및 5.5U의 Bca BEST를 첨가하여 반응용량을 50㎕로 하였다. 이 반응액을 55℃에서 1시간 인큐베이션시켰다. 반응종료후, 90℃에서 2분간 가열처리하여 효소를 비활성화시켰다. 이 반응액을 3% 아가로스 겔 전기영동하고, 수득된 증폭산물을 정제하였다. 회수된 증폭산물은 100㎕의 멸균증류수에 다시 현탁하였다.
상기 DNA 용액을 사용하여 제한 효소 분해를 실시하였다. 제한 효소는 AccII(Takara Shuzo) 및 BcnI(Takara Shuzo)를 사용하였다. 이하에 반응액 조성을 나타내었다.
DNA 용액 3㎕, 10 ×AccII 첨부 완충액 또는 10 ×BcnI 첨부 완충액을 1㎕, 제한효소 AccII 또는 BcnI를 1㎕, 추가로 멸균증류수로 반응액용량을 10㎕로 제조 하였다. 이 반응액을 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 10 ×로딩 완충액(loading buffer) 1.5㎕를 가하고, 그 중 6㎕를 3% 누시브 아가로스 겔로 전기영동하였다.
그 결과, AccII 및 BcnI의 제한효소 모두에서 목적하는 제한효소 분해 D N A가 수득되었다.
(4) 돌연 변이 검출
본 발명의 증폭방법을 사용한 돌연 변이 검출에 대하여 검토하였다. 주형으로서 pUC19를 사용하였다. 서열 목록의 서열 번호 5∼6에 pUC19 어퍼 (2) NN 프라이머 및 pUC19 로어 NN 프라이머의 기본적인 염기서열을 나타내었다. 상기 프라이머는 모두 그의 3' 말단의 첫 번째 및 두 번째 염기가 리보핵산인 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이다. 또한, pUC19 어퍼 (2) NN 프라이머의 3' 말단에서 염기가 주형과 상보적인 U 및 비상보적인(mismatched) A, C, G로 치환된 4 종류의 프라이머(각각 pUC19 어퍼 (2) NN-U, pUC19 어퍼 (2) NN-A, pUC19 어퍼 (2) NN-C 및 pUC19 어퍼 (2) NN-G라 함)를 만들었다. 이들 프라이머의 조합에 대하여 하기에 나타내었다.
프라이머쌍 1 : pUC19 어퍼 (2) NN-U 및 pUC19 로어 NN
프라이머쌍 2 : pUC19 어퍼 (2) NN-A 및 pUC19 로어 NN
프라이머쌍 3 : pUC19 어퍼 (2) NN-C 및 pUC19 로어 NN
프라이머쌍 4 : pUC19 어퍼 (2) NN-G 및 pUC19 로어 NN
반응액은 하기와 같이 제조하였다.
30mM 인산칼륨 완충액(pH 7.3), 0.01% BSA(소혈청 알부민), 5% DMSO,
각 1mM dNTP 혼합물, 8mM 아세트산 마그네슘, 각각 60pmol의 상기 프라이머쌍 및 50ng의 주형 DNA, 및 멸균증류수로 반응액 용량을 48㎕로 하였다.
상기 반응액을 98℃에서 1분간 열변성 처리한 후, 55℃로 냉각시켰다. 이어, 5.5U의 Bca BEST DNA 폴리머라아제, 60U의 E. coli RNase H를 첨가하고 55℃에서 60분간 인큐베이션시켰다. 그 후, 90℃에서 2분간 가열하여 효소를 비활성화시켰다. 각 반응액 8㎕를 사용하여 4% 누시브 3:1 아가로스(Takara Shuzo) 겔로 전기영동을 실시하였다. 그 결과, pUC19 어퍼 (2) NN의 3' 말단이 상보적인 프라이머 조합에서만 목적하는 약 450bp의 증폭단편이 검출되었다. 한편, pUC19 어퍼 (2) NN의 3' 말단이 비상보적인 프라이머 조합에서는 어디에서도 증폭단편이 확인되지 않았다.
실시예 4
(1) 마이크로 튜브에서의 반응
본 발명의 증폭방법에 대하여 반응용량의 검토를 실시하였다. 증폭영역으로서는, 인간 트랜스페린 수용체를 코딩하는 영역을 선택하였다. 서열 목록의 서열 번호 12 및 13에 기재된 서열을 갖는 프라이머를 사용하였다. 또한, 이 프라이머는 3' 말단의 첫 번째 및 두 번째 염기가 리보핵산으로 치환된 것을 사용하였다. 주형이 되는 DNA는 미리 RT-PCR법에 따라 수득된 증폭단편 약 750bp를 사용하였다. 반응용량은, 50㎕, 100㎕, 300㎕ 및 500㎕가 되도록 제조하였다. 하기에 반응액 조성을 나타내었다.
반응액 A : 5 ×전용 완충액(135mM 인산칼륨 완충액(pH 7.5), 0.5㎎/㎖ BSA, 2.5% DMSO) 10㎕, 100mM 아세트산 마그네슘 4㎕, 10mM dNTP 혼합물 5㎕, 10μM ATP 10㎕, Bca BEST DNA 폴리머라아제(22U/㎕) 1㎕, RNase H(60U/㎕) 1㎕, 및 멸균증류수로 39㎕로 제조하였다.
반응액 B : 20μM 인간 트랜스페린 수용체 S 프라이머(서열 번호 12) 및 20μM 인간트랜스페린 수용체 프라이머(서열 번호 13)를 각각 3㎕, 주형 DNA 약 10ng 및 멸균증류수로 11㎕로 하였다. 용량이 50㎕이상인 경우는, 상기 조성에 기초하여 증가(scale-up)하였다.
증폭반응은, 상기 B 액을 98℃에서 2분간 처리한 후, 55℃에서 3분간 인큐베이션시켰다. 이어, 1500㎕용 마이크로튜브내에 55℃에서 프리인큐베이션한 A액에 전술한 B액을 첨가하고 혼화한 후 55℃에서 1시간 인큐베이션시켰다. 반응종료후 얼음조로 옮기고 반응액 8㎕를 3% 아가로스겔 전기영동하였다.
그 결과, 모든 반응용량에서 효율이 좋고 목적하는 약 300bp 증폭단편을 검출할 수 있었다. 또, 주형 DNA가 PCR 증폭단편이더라도 문제없이 목적하는 증폭단편을 수득할 수 있음을 확인하였다.
(2) 샤알레에서의 반응
반응용량이 증대함에 따른 반응액의 온도불균일을 막기 위해, 샤알레를 사용하여 검토하였다. 증폭영역으로서는 인간 트랜스페린 수용체를 코딩하는 영역을 선택하였다. 서열 목록의 서열 번호 12 및 13에 기재된 서열을 갖는 프라이머를 사용하였다. 또한, 이 프라이머는 3' 말단의 첫 번째 및 두 번째 염기가 리보핵산으로 치환된 것을 사용하였다. 주형이 되는 DNA는 미리 RT-PCR법에 따라 수득된 증폭단편 약 750bp를 사용하였다. 반응용량은, 10㎖가 되도록 제조하였다. 하기에 반응액 조성을 나타내었다.
반응액 A : 5 ×전용 완충액(135mM 인산칼륨 완충액(pH 7.5), 0.5㎎/㎖ BSA, 2.5% DMSO) 2000㎕, 100mM 아세트산 마그네슘 800㎕, 10mM dNTP 혼합물 1000㎕ 및 멸균증류수로 9.1㎖로 제조하였다.
반응액 B : 60μM 인간 트랜스페린 수용체 S 프라이머(서열 번호 12) 및 60μM 인간트랜스페린 수용체 프라이머(서열 번호 13)를 각각 200㎕, 주형 DNA 약 10㎍ 및 멸균증류수로 500㎕로 하였다.
반응액 C : Bca BEST DNA 폴리머라아제(22U/㎕) 200㎕, RNase H(60U/㎕) 200㎕.
증폭반응은, 상기 B 액을 98℃에서 1분간 처리한 후, 55℃에서 3분간 인큐베이션시켰다. 이어, 직경 60㎜의 플라스틱 샤알레내에 55℃에서 프리인큐베이션한 A액에 전술한 B액을 첨가하고, 추가로 C 액을 첨가하여 혼화한 후 55℃에서 1시간 인큐베이션시켰다. 반응종료후 얼음조로 옮기고 반응액 8㎕를 3% 아가로스겔 전기영동하였다.
그 결과, 모든 반응용량에서 효율이 좋고 목적하는 약 300bp 증폭단편을 검출할 수 있었다. 또, 주형 DNA가 PCR 증폭단편이더라도 문제없이 목적하는 증폭단편을 수득할 수 있음을 확인하였다.
그 결과, 10㎖의 반응용량에서도 목적하는 약 300bp 증폭단편을 효율적으로 검출할 수 있었다. 또, 주형 DNA가 PCR 증폭단편이더라도 문제없이 목적하는 증폭 단편을 수득할 수 있음을 확인하였다. 즉, 다량의 DNA 단편을 필요로 하는 DNA 칩의 제작에 있어서, 본 발명의 방법이 종래의 PCR법에 비해 적합하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 5
(1) 완충액의 종류와 RNase H 사용량의 관계
완충액의 종류와 RNase H 사용량의 관계에 대하여 검토하였다. 주형으로서 pUC19 벡터에 249bp 및 911bp의 단편를 클로닝하여 수득된 플라스미드 DNA(pUC19-249 및 pUC19-911이라 함)를, 프라이머로서 서열 목록의 서열 번호 16∼17에 기재된 서열을 갖는 MF2N3(24) 프라이머 및 MR1N3(24) 프라이머의 3' 말단의 첫 번째 내지 세 번째 염기를 리보뉴클레오타이드로 치환시킨 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하였다. 이 프라이머의 조합에 따라 pUC19-249에서는 약 450bp의 증폭단편이, pUC19-911에서는 약 1100bp의 증폭단편이 수득된다.
검토하는 완충액계는 트리스-염산 완충액, 인산칼륨 완충액, 트리신 완충액계를 선택하였다. 또, RNase H는 무첨가 및 최종농도 0.3U∼1.2U/㎕로 검토하였다. 트리스-염산 완충액계는, 10ng의 pUC19-249 또는 200ng의 pUC19-911, 각 60pmol의 프라이머 및 11U/50㎕ 반응용량의 Bca BEST DNA 폴리머라아제 이외는 실시에 1 (2)와 마찬가지로 제조하였다. 인산칼륨 완충계에 대해서도 동일한 조성으로 하였다. 트리신 완충계에 대해서는 최종농도가 34mM 황산암모늄, 10mM 염화칼륨, 10mM 황산암모늄, 0.01% BSA, 1% DMSO, 4mM 아세트산 마그네슘, 0.5mM dNTP 혼합물이 되도록 제조하였다. 상기 완충계에 대하여 pUC19-249 플라스미드 10ng/50㎕ 반응용량, 및 pUC19-911 플라스미드 200ng/50㎕ 반응용량, 각 60pmol/50㎕ 반응용량의 프라이머, 각 농도의 RNase H, 1U/50㎕ 반응용량의 Bca BEST DNA 폴리머라아제가 되도록 제조하였다.
증폭반응은 주형이 되는 pUC19-249 혹은 pUC19-911과 각 프라이머의 혼합액을 98℃에서 1분간 열변성 처리한 후, 55℃까지 냉각시킨 후에 남아 있는 반응조성 혼합액을 첨가하고 55℃에서 60분간 반응시켰다. 반응종료후, 4℃로 냉각시키고 1/10량의 0.5M EDTA를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 그 후, 각 반응액의 3㎕를 3% 누시브 3:1 아가로스(Takara Shuzo) 겔로 전기영동을 실시하였다.
그 결과, pUC19-249를 주형으로 한 경우는 트리스-염산 완충계, 인산칼륨 완충계, 트리신 완충계의 순으로, pUC19-911을 주형으로 한 경우는 트리스-염산 완충계, 트리신 완충계, 인산칼륨 완충계의 순으로 증폭효율의 향상이 확인되었다. 또한, RNase H는 무첨가에서는 목적하는 증폭단편은 수득되지 않았지만, 최종농도 0.3U∼1.2U/㎕로 사용한 경우는 모두 목적하는 증폭단편이 수득되었다.
(2) 프라이머량의 검토
사용하는 프라이머량이 본 발명의 증폭방법에 미치는 영향을 검토하였다. 반응액은, 상기 (1)에 기재된 조성중 주형으로서 pUC19-249를 사용한 계를 사용하였고, 인산칼륨 완충계는 60U/50㎕ 반응의 RNase H를, 트리스-염산 완충계 및 트리신 완충계는 30U/50㎕ 반응의 RNase H를 사용하여 실시하였다. 프라이머의 농도는 10pmol∼100pmol/50㎕ 범위에서 검토하였다. 반응조건 및 증폭확인은 상기 (1)에 기재된 바와 마찬가지로 실시하였다.
그 결과, 어떤 반응 완충계에서도 10pmol∼100pmol/50㎕의 범위에서 목적하 는 증폭단편을 확인할 수 있었다.
(3) 반응 완충액 pH의 영향
반응액의 pH가 본 발명의 증폭방법에 미치는 영향에 대하여 검토하였다. 반응액은 상기 (2)에 기재된 바와 같은 조성으로 동일하게 하였다. 인산칼륨 완충계는 pH 7.0∼8.0의 범위에서, 트리신 완충계는 pH 7.5∼9.2의 범위에서, 트리스-염산 완충계는 pH 7.5∼9.0의 pH 범위에서 검토하였다. 반응조건 및 증폭확인은 상기 (1)과 동일하게 실시하였다.
그 결과, 각각의 완충계에서 사용한 pH 범위에서 목적하는 증폭단편을 확인할 수 있었다.
(4) 첨가제의 효과
상기 (3)에 기재된 인산 완충계(pH 7.5)의 반응액 조성에서,
디메틸설폭사이드(DMSO)의 첨가효과를 검토하였다. 또, 폴리아민의 첨가효과에 대해서도 검토하였다. DMSO의 첨가량은 무첨가∼10%의 범위에서 검토하였다. 한편, 폴리아민으로서는 스펠민4염산염(Sigma), 스펠미딘3염산염(Sigma), 아세틸프톨레스신(Nacalai Tesque), 프톨레스신2염산염(Nacalai Tesque), 트리메틸렌디아민 (Nacalai Tesque), 프로필렌디아민(Nacalai Tesque), 디아미노메탄2염산염(Nacalai Tesque)을 사용하였다. 첨가량으로서는 프로필렌디아민 및 트리메틸렌디아민이 무첨가∼2%의 범위로, 그 외의 폴리아민이 무첨가∼5mM의 범위로 실시하였다. 반응조건 및 증폭확인은 상기 (1)에 기재된 방법과 동일하게 실시하였다.
그 결과, DMSO는 무첨가∼5%의 범위에서, 스펠민4염산염과 스펠미딘3염산염 은 무첨가∼200μM의 범위에서, 아세틸프톨레스신과 프톨레스신2염산염은 40μM∼40mM의 범위에서, 트리메틸렌디아민은 0.002%∼0.02%의 범위에서, 프로필렌디아민은 0.0001%∼0.01%의 범위에서, 그리고 디아미노메탄2염산염은 0.1μM∼10μM의 범위에서 목적하는 DNA 절편이 효율적으로 증폭되는 것을 확인할 수 있었다.
(5) 마그네슘염 종류의 검토
본 발명의 증폭방법에 대한 마그네슘염의 종류에 대하여 검토하였다. 주형으로서 pUC19 DNA를, 프라이머로서 서열 목록의 서열 번호 11 및 6에 기재된 서열을 갖는 pUC19 어퍼 NN 249 프라이머 및 pUC19 로어 NN 프라이머를 사용하였다. 이 프라이머 쌍에서 약 225bp의 증폭단편이 수득된다. 마그네슘염은 염화마그네슘, 아세트산 마그네슘 및 황산마그네슘을 사용하였다. 이하에 반응액 조성을 나타내었다.
35mM 인산칼륨 완충액(pH 7.3), 최종농도 8mM의 염화마그네슘, 아세트산 마그네슘 또는 황산마그네슘, 최종농도 1.0mM의 dNTP 혼합물, 50ng pUC19DNA, 각 60pmol의 상기 프라이머쌍, 60U RNase H, 5.5U Bca BEST DNA 폴리머라아제, 및 멸균증류수로 반응용량 50㎕. 반응조건 및 증폭확인은 상기 (3)의 방법과 동일하게 하여 실시하였다.
그 결과, 어느 마그네슘염에서도 목적하는 증폭단편을 확인할 수 있었다.
(6) 마그네슘 농도 및 dNTP 농도의 검토
본 발명의 증폭방법에 대한 마그네슘 농도 및 dNTP 농도에 대하여 검토하였 다. 반응액 조성은 25ng의 pUC19 DNA, 여러 농도의 마그네슘, dNTP 이외는 상기 (5)에 기재된 것과 동일하게 하였다. 반응조건 및 증폭확인은 상기 (1)과 동일하게 하여 실시하였다. 최종농도 1mM의 dNTP로 고정한 반응계에서는 최종농도 6mM∼10mM 범위의 마그네슘 농도에서 목적하는 증폭단편이 수득되었고, 또한, 최종농도 8mM의 마그네슘으로 고정한 반응계에서는 최종농도 0.6mM∼1.2mM 범위의 dNTP 농도에서 목적하는 증폭단편이 수득되었다. 또, 최종농도 0.5mM의 dNTP로 고정한 반응계에서는 최종농도 2mM∼6mM 범위의 마그네슘 농도에서 목적하는 증폭단편이 수득되었고, 최종농도 4mM의 마그네슘으로 고정한 반응계에서는 최종농도 0.2mM∼0.8mM 범위의 dNTP 농도에서 목적하는 증폭단편이 수득되었다.
(7) 인산칼륨 완충액 농도 및 트리신 완충액 농도의 변화와 반응성의 검토
본 발명의 증폭방법에 대한 인산칼륨 완충액 농도 및 트리신 완충액 농도에 대하여 검토하였다. 반응액 조성은, 최종농도 20mM∼50mM의 인산칼륨 완충액 및 최종농도 22mM∼46mM의 트리신 완충액으로 한 이외에는 상기 (1)에 기재된 pUC19-249를 주형으로한 반응과 동일하게 실시하였다. 반응조건 및 증폭확인도 상기 (1)과 동일하게 하여 실시하였다.
그 결과, 인산칼륨 완충액 및 트리신 완충액 농도가 각각 최종농도 20∼50mM, 최종농도 22∼46mM의 범위에서 목적하는 증폭단편이 수득되었다.
(8) Bca BEST DNA 폴리머라아제 농도의 검토
본 발명의 증폭방법에 대한 Bca BEST DNA 폴리머라아제 농도에 대하여 검토하였다. 반응액 조성은 인산칼륨 완충액 및 트리신 완충액을 사용하였고, Bca BEST DNA 폴리머라아제를 1∼22U/50㎕ 반응용량의 범위로 사용한 이외에는 상기 (1)에 기재된 pUC19-249를 주형으로 한 반응과 동일하게 하였다.
그 결과, Bca BEST DNA 폴리머라아제의 양이 1∼22U/50㎕의 범위에서 목적하는 증폭단편이 수득되었다.
실시예 6
PCR법과의 비교
본 발명의 증폭방법에 대하여 PCR법과 비교하였다. 주형은, pUC19 플라스미드 DNA의 멀티클로닝 사이트에 약 150bp 및 약 250bp의 DNA 절편을 삽입한 것을 사용하였다. 이 주형은 다음과 같이 하여 제조하였다.
서열 목록의 서열 번호 10, 11 및 6에 기재된 서열을 갖는 pUC19 어퍼 150 프라이머, pUC19 어퍼 249 프라이머 및 pUC19 로어 NN 프라이머를 사용하였고, pUC19 플라스미드 DNA 100pg를 주형으로 하여 PCR 반응을 실시하였다. pUC19 어퍼 150 프라이머 및 pUC19 로어 NN 프라이머의 조합에서는 약 150bp의 증폭단편이, pUC19 어퍼 249 프라이머 및 pUC19 로어 NN 프라이머의 조합에서는 약 250bp의 증폭단편이 수득되었다. 이 증폭단편을 마이크로콘-100으로 정제한 후, DNA blunting kit(Takara Shuzo)를 사용하여 평활말단화하고, pUC19 플라스미드의 HincII 사이트에 서브클로닝하였다. 상기 증폭단편이 삽입된 플라스미드를 사용하여 대장균 JM109를 형질변성시켰다. 이 형질변성체를 배양하여 그의 균체로부터 QIAGEN plasmid mini kit(키아겐사 제품)를 사용하여 DNA 삽입 플라스미드를 정제하였다. 이 DNA 삽입 플라스미드를 주형으로 사용하였다.
본 실시예에서 사용하는 프라이머를 서열 목록의 서열 번호 18∼19에 나타내었다. 또한, 본 발명의 증폭방법에 사용하는 프라이머는 3' 말단의 첫 번째 내지 세 번째 염기가 리보뉴클레오타이드로 치환된 것을 사용하였다. 이하에 반응액 조성을 나타내었다.
27mM 인산 완충액(pH 7.3), 0.01% BSA(소혈청 알부민), 5% DMSO, 각 1mM dNTP 혼합물, 8mM 아세트산 마그네슘, 각각 60pmol의 상기 프라이머쌍및 1ng의 주형 DNA, 및 멸균증류수로 반응액 용량을 48㎕로 하였다.
상기 반응액을 98℃에서 1분간 열변성 처리한 후 55℃로 냉각시켰다. 이어, 5.5U의 Bca BEST DNA 폴리머라아제, 60U의 E. coli RNase H를 첨가하고 55℃에서 60분간 인큐베이션시켰다. 그 후, 90℃에서 2분간 가열하여 효소를 비활성화시켰다. 각 반응액 3㎕를 4% 누시브 3:1 아가로스(Takara Shuzo) 겔로 전기영동을 실시하였다.
한편, 대조군으로서 PCR법에 의한 증폭을 실시하였다. 반응은, PCR Amplification kit(Takara Shuzo)를 사용하였고, 서열 목록의 서열 번호 18∼19에 나타낸 리보뉴클레오타이드를 함유하지 않는 프라이머를 각 10pmol씩, 1ng의 주형 DNA, 및 멸균증류수로 반응액 용량을 50㎕로 하였다. 반응조건은 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 40초를 1 사이클로하여 25 사이클 실시하였다. 반응종료후, 각 반응액 3㎕를 4% 누시브 3:1 아가로스(Takara Shuzo) 겔로 전기영동을 실시하였다.
그 결과, 150bp 및 249bp의 플라스미드를 주형으로 한 경우 모두에서 PCR법 보다 삽입단편을 많이 확인할 수 있었다. 또, 증폭산물량을 수치환하기 위해, 상기 각 반응액 20㎕를 마이크로콘-100으로 정제하고, 그 양을 베크만 DU-640 분광광도계(Beckman)로 정량하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 증폭방법에서, 삽입단편이 150bp 플라스미드를 주형으로 한 경우는 약 60배, 삽입단편이 250bp 플라스미드를 주형으로 한 경우는 약 40배 많게 수득되는 것을 확인할 수 있었다. 이로써, 다량의 DNA 단편을 필요로 하는 DNA 칩에서 본 발명의 방법이 종래의 PCR법에 비해 적합하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 7
(1) RNA 프로브의 제조
본 발명의 증폭방법에 의해 수득된 증폭단편의 검출법에 대하여 검토하였다. 검토용 프로브로서 리보뉴클레오타이드로 구성되고, 이 프로브 양단의 리보뉴클레오타이드에 상이한 두 개의 형광물질이 결합된 것을 제조하였다. 검출용 RNA 프로브는 DNA 합성기(Applied Biosystems)를 사용하여 합성하였다. 그의 염기서열을 배열표의 서열 번호 20에 나타내었다. 또, 형광표식은 5' 말단이 6-FAM(Glen Research), 3' 말단이 TAMRA(Glen Research)을 사용하였다.
(2) 증폭반응 및 검출
주형으로서 0.1 및 1ng의 pUC19 DNA를 사용하였다. 프라이머는 서열 목록의 서열 번호 10 및 8에 기재된 서열을 갖는 pUC19 어퍼 150 프라이머 및 pUC19 로어 542 프라이머로, 이 프라이머 3' 말단의 첫 번째 및 두 번째 염기가 리보뉴클레오타이드로 치환된 것을 사용하였다.
반응액 조성을 다음에 나타내었다.
27mM 인산 완충액(pH 7.3), 0.01% BSA, 5% DMSO, 각 1mM dNTP 혼합물, 8mM 아세트산 마그네슘, 각각 60pmol의 상기 프라이머쌍및 1ng의 주형 DNA, 상기 RNA 프로브 0.1㎍ 및 멸균증류수로 반응액 용량을 48㎕로 하였다. 또한, 대조군으로서 주형 DNA가 없는 것도 제조하였다.
상기 반응액을 98℃에서 1분간 열변성 처리한 후 55℃로 냉각시켰다. 이어, 22U의 Bca BEST DNA 폴리머라아제 또는 멸균수, 및 60U의 E. coli RNase H를 첨가하고 55℃에서 60분간 인큐베이션시켰다. 그 후, 10% SDS(도데실황산나트륨, 나카리이사 제품)을 5㎕ 첨가하여 효소를 비활성화시켰다. 각 반응액 50㎕를 같은 양의 멸균수로 희석하고 마이크로 플레이트로 옮겼다. 검출은 이미지 어날라이저 FM BIO II Multi-View(Takara Shuzo)를 사용하고 여기파장 505㎚로 실시하였다.
그 결과, Bca BEST DNA 폴리머라아제를 첨가하지 않은 경우는,
어느 주형량에서도 무첨가에서는 형광시그날이 검출되지 않았다. 또, Bca BEST DNA 폴리머라아제를 첨가한 경우에서도 주형 DNA 양이 없는 경우는 형광 시그널은 검출되지 않았다. 한편, 주형 DNA가 0.1ng 혹은 1ng인 경우, 모두 형광시그널을 검출할 수 있었다. 또, 동시에 0.00003% 에티디움브로마이드를 함유하는 3% 아가로스 전기영동에서도 Bca BEST DNA 폴리머라아제 존재하, 주형 DNA가 0.1ng 및 1ng의 경우만 목적하는 약 190bp의 증폭단편을 확인할 수 있었다. 즉, RNA 프로브에 의한 검출법과 종래의 전기영동에 의한 검출법에서 같은 결과가 수득되었다. 이와 같이, 본 발명의 증폭방법으로 수득한 증폭단편을 RNA 프로브를 사용하여 검출 하는 방법을 확립하였다.
실시예 8
본 발명의 방법에서 일측 프라이머를 데옥시뉴클레오타이드로 치환한 경우에 대하여 검토하였다. 프라이머는 서열 목록의 서열 번호 19에 기재된 배열을 갖는 MR1N3(30)과 서열 목록의 서열 번호 58에 기재된 서열을 갖는 M4 프라이머(Takara Shuzo)를 사용하였다. 또한, MR1N3 프라이머는, 3' 말단의 첫 번째 내지 세 번째 염기가 리보뉴클레오타이드로 치환된 것을 사용하였다. 다음에 반응액 조성을 나타내었다.
27mM 인산 완충액(pH 7.3), 0.01% BSA(소혈청 알부민), 5% DMSO, 각 1mM dNTP 혼합물, 8mM 아세트산 마그네슘, 각각 30pmol의 상기 프라이머쌍및 1ng의 주형 DNA, 및 멸균증류수로 반응액 용량을 24㎕로 하였다.
상기 반응액을 98℃에서 2분간 열변성 처리한 후 55℃로 냉각시켰다. 이어, 11U의 Bca BEST DNA 폴리머라아제, 30U의 E. coli RNase H를 첨가하여 반응용량을 25㎕로 하였다. 이 반응액을 55℃에서 60분간 인큐베이션시켰다. 그 후, 90℃에서 2분간 가열하여 효소를 비활성화시켰다. 각 반응액 5㎕를 4% 누시브 3:1 아가로스겔로 전기영동을 실시하였다. 그 결과, 목적하는 증폭단편을 확인할 수 있었다.
실시예 9
본 발명의 방법을 사용하여 출혈성 대장균 O-157 검출을 실시하였다.
본 실시예에서 사용하는 프라이머를 서열 목록의 서열 번호 21∼24에 나타내었다. 서열 번호 21과 22의 조합은 O-157이 베로 독소 1을 코딩하는 서열을, 서 열 번호 23과 24의 조합은 베로 독소 2를 코딩하는 서열을 검출하도록, 임상과 미생물, 제18권, 제4호, 507∼513페이지(1991)에 기재된 프라이머를 구축하였다. 또한, 본 발명의 증폭방법을 사용하는 프라이머는 3' 말단의 첫 번째 내지 세 번째 염기가 리보뉴클레오타이드로 치환된 것을 사용하였다. 주형은 ATCC 등록번호 43895의 출혈성 대장균 O-157을 배양한 것을 집균하고, 적당한 세포수로 멸균수로 현탁한 후, 98℃에서 10분간 처리한 열추출물을 사용하였다. 이하에 반응액 조성을 나타내었다.
27mM 인산 완충액(pH 7.3), 0.01% BSA(소혈청 알부민), 5% DMSO, 각 1mM dNTP 혼합물, 8mM 아세트산 마그네슘, 각각 60pmol의 상기 프라이머쌍, 104∼106개의 세포수에 상당하는 주형 DNA(열추추물), 및 멸균증류수로 반응액 용량을 48㎕로 하였다.
상기 반응액을 98℃에서 1분간 열변성 처리한 후 55℃로 냉각시켰다. 이어, 5.5U의 Bca BEST DNA 폴리머라아제, 60U의 E. coli RNase H를 첨가하고, 55℃에서 60분간 인큐베이션시켰다. 그 후, 90℃에서 2분간 가열하여 효소를 비활성화시켰다. 각 반응액 3㎕를 4% 누시브 3:1 아가로스(Takara Shuzo) 겔로 전기영동을 실시하였다.
그 결과, 프라이머쌍 모두에서 104 세포수에 상당하는 DNA를 주형으로 하여 O-157 베로 독소 1 및 2를 검출할 수 있었으며, 본 발명의 방법이 병독성 세균의 검출방법으로서 사용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 10
본 발명의 방법에 따른 장쇄 DNA 단편의 증폭에 대하여 검토하였다. 주형이 되는 더블-스트랜드 DNA는 하기와 같이 하여 제조하였다. 먼저, 위(胃)의 정상조직으로부터 유래된 mRNA로부터 통상법에 따라 Uni-ZAP XR 벡터(Stratagene)를 사용하여 라이브러리를 구축하였다. 이어, 그의 라이브러리를 스크리닝하여 인서트부가 약 2.1kbp 및 약 4.3kbp의 클론을 사용하고 시험관내 절제(excision)에 의해 수득된 pBlue script SK(-) 파지 벡터를 선택하였다. 또, 이 플라스미드를 주형으로 하고, 서열 목록의 서열 번호 25∼26에 기재된 서열을 갖는 MCR-F 프라이머 및 MCR-R 프라이머, PCR Amplification Kit(Takara Shuzo)를 사용하여 약 2.2kbp 및 약 4.4kbp의 증폭단편을 수득하였다. 이 PCR 단편을 본 발명에 따른 증폭방법의 주형으로 하였다. 사용하는 프라이머는 서열 목록의 서열 번호 27∼28에 기재된 서열을 갖는 MF2N3(24) 프라이머 및 MR1N3(24) 프라이머를 사용하였고, 이 프라이머 3' 말단의 첫 번째 내지 세 번째 염기가 리보뉴클레오타이드이였다. 반응액 조성을 다음에 나타내었다.
28mM 인산 완충액(pH 7.5), 0.01% BSA(소혈청 알부민), 1% DMSO, 각 0.5mM dNTP 혼합물, 4mM 아세트산 마그네슘, 각각 30pmol의 상기 프라이머쌍, 0.2mM 프톨레스신 및 멸균수를 가하여 24.25㎕로 하였다. 이 반응액을 92℃에서 2분간 처리하고 55℃로 냉각시킨 후, 30U의 Bca RNase H 및 5.5U의 Bca BEST DNA 폴리머라아제를 가하여 반응용량을 2.5㎕로 하고 1시간 인큐베이션시켰다. 반응종료후, 4℃로 냉각하고 0.5M EDTA 용액을 2.5㎕를 가하여 반응을 정지시켰다. 그 후, 이 용액 5㎕를 1% 아가로스 전기영동에 공급하였다.
그 결과, 본 발명의 방법에서 2.2kbp 혹은 약 4.4kbp의 증폭단편을 얻을 수 있었고, 본 방법에서 장쇄 DNA 단편을 증폭시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 11
본 발명의 증폭방법으로 증폭된 약 400bp의 λDNA 단편과 PCR로 증폭된 300bp와 1000bp의 λDNA 단편을 스폿한 DNA 마이크로 어레이를 제작하였다. λDNA의 뉴클레오타이드 서열은 진뱅크(GenBan) 등록번호 B00636, J02459, M17233 및 X00906으로부터 입수가능하다. 본 실시예에서 사용하는 프라이머를 서열 목록의 서열 번호 25∼26 및 29∼35에 나타내었다. 또한, 본 발명에 따른 증폭방법의 반응액은 하기와 같이 제조하였다.
34mM 인산 완충액(pH 8.7), 10mM 염화칼륨, 10mM 황산암모늄, 0.01% BSA(소혈청 알부민), 1% 디메틸설폭사이드, 4mM 아세트산암모늄, 각 0.5mM dNTP 혼합물, 각각 500pmol의 프라이머쌍, 및 주형으로서 100ng의 PCR 증폭산물, 110U Bca BEST DNA 폴리머라아제, 300U의 클로니드 RNase H, 반응액의 최종용량은 500㎕. 상기 반응액을 균일하게 혼합하고 55℃에서 60분간 보온한 후, 90℃에서 2분간 가열하여 효소를 비활성화시켰다. 이 용액을 하기의 공정에 사용하였다. 또, 스폿한 DNA 절편은 다음과 같다.
1. 샘플 : λDNA를 주형으로 하고 서열 목록의 서열 번호 29 또는 30에 기재된 서열을 갖는 프라이머의 조합에 의한 PCR 증폭산물(300bp)을 pUC19 벡터에 서브클로닝하였다. 서브클로닝된 산물을 서열 목록의 서열 번호 25 또는 26에 기재 된 서열을 갖는 프라이머로 PCR 증폭시켰다. 그렇게 수득한 산물을 주형으로 하고 서열 목록의 서열 번호 31 또는 32에 기재된 서열을 갖는, 상기 프라이머의 3' 말단의 첫 번째 및 두 번째 염기가 리보뉴클레오타이드로 치환된 키메라성 올리고 뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 본 발명의 증폭방법에 의해 약 400bp의 산물을 증폭시켜 샘플을 수득하였다. 스폿할 때의 DNA 용액으로서는 반응액 원액 및 탄산 완충액으로 각각 2배, 4배, 8배, 16배 희석한 것(희석 용액의 탄산 완충액 농도는 모두 50mM)으로 총 5 종류이다.
2. 샘플 : 상기 1에서 증폭한 DNA 단편을 마이크로콘-100(Takara Shuzo)으로 처리하고, 각각 0.125㎍/㎕, 0.25㎍/㎕, 0.5㎍/㎕, 1.0㎍/㎕, 2.0㎍/㎕의 농도가 되도록 50mM 탄산 완충용액으로 조정한 것, 총 5 종류이다.
3. 양성 대조군 : λDNA를 주형으로 한, 서열 목록의 서열 번호 29 또는 30에 기재된 서열을 갖는 프라이머의 조합에 의한 PCR 증폭산물(300bp)을 마이크로콘-100으로 처리하고, 각각 0.125㎍/㎕, 0.25㎍/㎕, 0.5㎍/㎕, 1.0㎍/㎕, 2.0㎍/㎕의 농도가 되도록 50mM 탄산 완충용액으로 조정한 것, 총 5 종류이다.
4. 양성 대조군 : λDNA를 주형으로 한, 서열 목록의 서열 번호 33 또는34에 기재된 서열을 갖는 프라이머의 조합에 의한 PCR 증폭산물(1000bp)을 마이크로콘-100으로 처리하고, 각각 0.125㎍/㎕, 0.25㎍/㎕, 0.5㎍/㎕, 1.0㎍/㎕의 농도가 되도록 50mM 탄산 완충용액으로 조정한 것, 총 4 종류이다.
5. 음성 대조군 : λDNA를 주형으로 하고 서열 목록의 서열 번호 33 또는 35에 기재된 서열을 갖는 프라이머의 조합을 사용하여 수득한 PCR 증폭산물(300bp)을 pUC19 벡터에 서브클로닝하였다. 서브클로닝된 산물을 서열 목록의 서열 번호 25 또는 26에 기재된 서열을 갖는 프라이머로 PCR 증폭시켰다. 그렇게 수득한 산물을 주형으로 하고 서열 목록의 서열 번호 31 또는 32에 기재된 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 본 발명의 증폭방법에 의해 약 400bp의 산물을 증폭시켜 음성 대조군을 수득하였다. 스폿할 때의 DNA 용액으로서는 반응액 원액 및 탄산 완충액으로 각각 2배, 4배, 8배, 16배 희석한 것(희석 용액의 탄산 완충액 농도는 모두 50mM)으로 총 5 종류이다.
로 본 발명의 증폭방법에 따라 증폭시킨 것(증폭사이즈는 약 400bp). 스폿할 때의 DNA 용액으로서는 반응액 원액 및 탄산 완충액으로 각각 2배, 4배, 8배, 16배 희석한 것(희석 용액의 탄산 완충액 농도는 모두 50mM)으로 총 5 종류.
6. 음성 대조군 : 상기 5에서 수득된 DNA 단편을 마이크로콘-100으로 처리하고, 각각 0.125㎍/㎕, 0.25㎍/㎕, 0.5㎍/㎕, 1.0㎍/㎕, 2.0㎍/㎕의 농도가 되도록 50mM 탄산 완충용액으로 조정한 것, 총 5 종류이다.
제조한 DNA 용액을 DNA 칩 제작장치(Genetic Micro systems : GMS)를 사용하여 아미노기 도입 슬라이드 글래스(Matsunami Glass)에 스폿하고 UV를 조사하여 고정하였다. 슬라이드를 0.2% SDS, 이어 증류수로 세정하고 건조시켜 DNA 어레이로 하였다.
또, 서열 목록의 서열 번호 29와 30에 기재된 서열을 갖는 프라이머의 조합에 의한 PCR 증폭산물(300bp)을 Label IT Cy5R Labeling Kit(Takara Shuzo)로 Cy5 표지하여 프로브로 만들었다. 이어, IntelliGene(Takara Shuzo)의 취급설명서에 기재된 프리하이브리다이제이션 용액 및 하이브리다이제이션 용액을 사용하여 하이브리다이제이션을 실시하였다. 우선, 상기 DNA 어레이를 실온에서 2시간 프리하이브리다이제이션 처리한 후, 변성시킨 Cy5 표지된 프로브를 함유하는 하이브리다이제이션 용액을 DNA 어레이에 적하하고 커버 글래스를 올려 주위를 필름으로 밀봉하였다. 이것을 65℃에서 13시간 보온한 후, 커버 글래스를 제거하고 65℃에서 2 ×SSC 용액으로 5분간, 이어 65℃에서 0.2 ×SSC 용액으로 5분간 세정하고, 공기건조시켰다. 이것을 마이크로 어레이 스캐너(GMS)에 놓고 각 스폿의 형광 시그널을 해석하였다.
그 결과, PCR법으로 증폭시킨 단편(상기 3, 4의 양성 대조군) 및 본 발명의 방법을 증폭시킨 단편(상기 1, 2의 샘플)을 스폿한 위치 모두에서 형광 시그널을 확인할 수 있었다. 또, 시그널의 세기는 샘플 2 > 양성 대조군 4 > 샘플 1 > 양성 대조군 3이었다. 한편, 음성 대조군 5 및 6에서는 시그널이 전혀 확인되지 않았다. 이것으로부터 본 발명의 방법으로 증폭시킨 DNA 단편은 정제전 혹은 정제후 모두 DNA 칩을 제작하기 위한 고정화용 DNA 단편으로서 적합하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 12
(1) PCR 증폭단편을 주형으로 하는 본 발명의 방법에 사용하는 프라이머 디자인에 대하여 검토하였다. 먼저, 서열 목록의 서열 번호 36∼41에 기재된 서열을 갖는 프라이머를 통상법에 따라 합성하였다. 각 프라이머의 구조에 대하여 다 음에 나타내었다.
(ⅰ) R1-S1 프라이머 : 5' 말단으로부터 7개 염기의 스페이서 서열, 17개 염기의 M13RV 서열(또는 RV 서열; M13RV 프라이머(Takara Shuzo)의 뉴클레오타이드 서열을 말함) 및 20개 염기의 λDNA 특이적 PCR용 센스프라이머 서열;
(ⅱ) R1-A3 프라이머 : 5' 말단으로부터 7개 염기의 스페이서 서열, 17개 염기의 M13RV 서열 및 20개 염기의 λDNA 특이적 PCR용 안티센스프라이머 서열;
(ⅲ) R2-S1 프라이머 : 5' 말단으로부터 25개 염기의 스페이서 서열, 17개 염기의 M13RV 서열 및 20개 염기의 λDNA 특이적 PCR용 센스프라이머 서열;
(ⅳ) R2-A3 프라이머 : 5' 말단으로부터 25개 염기의 스페이서 서열, 17개 염기의 M13RV 서열 및 20개 염기의 λDNA 특이적 PCR용 안티센스프라이머 서열;
(ⅴ) R3-S1 프라이머 : 5' 말단으로부터 58개 염기의 스페이서 서열, 17개 염기의 M13RV 서열 및 20개 염기의 λDNA 특이적 PCR용 센스프라이머 서열;
(ⅵ) R3-A3 프라이머 : 5' 말단으로부터 58개 염기의 스페이서 서열, 17개 염기의 M13RV 서열 및 20개 염기의 λDNA 특이적 PCR용 안티센스프라이머 서열.
또한, M13RV 20mer은 17개 염기의 M13RV 서열 및 5'측에 3개의 염기로 이루어지는 총 20개의 염기 서열을 갖는다. 따라서, M13RV 20mer을 사용하여 본 발명의 방법을 실시한 경우, 상기 프라이머 스페이서 서열의 길이는 각각 4 염기, 22 염기 및 55 염기가 된다. 또한, 대조군으로서 상기 프라이머의 스페이서 서열이 없는 프라이머도 작성하였다.
상기 프라이머쌍, 예를 들어 R1-S1 프라이머/R1-A3 프라이머를 사용하면 348bp 증폭단편이 수득된다. 이 증폭단편 양단의 7개의 염기가 스페이서 부분에 상응하고, RV 서열이 스페이서 부분의 내측에 위치하며, λDNA 서열이 RV 서열의 내측에 위치한다.
마찬가지로, R2-S1 프라이머/R2-A3 프라이머를 사용하면 증폭단편 양단의 25개 염기가 스페이서 부분인 384bp의 증폭단편이 수득되고, R3-S1 프라이머/R3-A3 프라이머를 사용하면 증폭단편 양단의 25개 염기가 스페이서 부분인 4504bp의 증폭단편이 수득된다. 한편, 대조용 프라이머를 사용한 증폭단편은 스페이서 부분을 갖지 않는다. 이들 PCR 증폭단편을 다음의 검토에 대하여 주형으로서 사용하였다.
본 실시예에서는 서열 목록의 서열 번호 42 및 43 기재의 서열을 갖는 M13RV-2N 17mer 프라이머 및 M13RV-2N 20mer 프라이머 두 종류를 사용하였다. 또한, 이 프라이머는 3' 말단의 첫 번째 및 두 번째 염기가 리보뉴클레오타이드로 치환된 것을 사용하였다. 반응은 다음과 같이 실시하였다. 즉, 전술한 프라이머 20μM, 약 20ng의 상기 주형 및 0.01% 프로필렌디아민의 혼합액 5㎕를 98℃에서 2분간 변성시킨 후, 55℃까지 냉각시켰다. 그 후, 34mM 트리신 완충액(pH 8.7), 10mM 염화칼륨, 10mM 황산암모늄, 0.01% BSA, 1% DMSO, 4mM 아세트산마그네슘, 0.5mM dNTP, 1U의 Bca BEST DNA 폴리머라아제, 15U의 RNase H를 첨가고 최종 반응용량을 25㎕로 하였다.
이 반응액은 55℃에서 1시간 인큐베이션시켰다. 반응종료후, 4㎕로 냉각하고, 0.5M EDTA 용액 2.5㎕를 첨가하여 반응을 정지시키고, 이 반응액 3㎕를 3% 누시브 3:1 아가로스(Takara Shuzo) 겔 전기영동에 공급하였다. 그 결과, M13RV-2N 17mer을 사용한 경우는 스페이서 서열이 25mer, 7mer, 58mer, 스페이서 서열이 없는 순으로, M13RV-2N 20mer을 사용한 경우는 스페이서 서열이 22mer, 4mer, 55mer, 스페이서 서열이 없는 순으로 양호한 증폭효율을 확인할 수 있었다. 또, 상기 (ⅰ) 내지 (ⅵ)의 프라이머의 M13RV 서열을 M13M4 서열로 변경한 경우에도 스페이서 서열과 증폭효율의 관계가 동일한 경향을 나타내었다. 즉, PCR 증폭단편과 같은 선형 DNA 단편을 주형으로 하는 경우, 본 발명의 방법에서 사용되는 프라이머를 스페이서 서열(부위)를 제조하기 위해 디자인하는 것이 증폭효율을 증가시킨다는 것을 확인하였다.
(2) 반응온도를 높인 경우의 핵산서열 증폭방법에 대하여, GC 함량이 높은 주형 증폭에 대하여 검토하였다. 우선, 진뱅크(GeneBank) 등록번호 AA789328의 CDC2-related protein kinase PISSLRE 유전자 영역 307bp(GC 함량:62.5%)에 대하여 서열 목록의 서열 번호 44와 45에 기재된 PCR 증폭용 프라이머를, 또
진뱅크 등록번호 AA706022의 Type II cyto나딧미 1 keratin 유전자 영역 284bp(GC 함량:61.3%)에 대하여 서열 목록의 서열 번호 46와 47에 기재된 PCR 증폭용 프라이머를 각각 제작하였다. 이들 프라이머를 사용하여 시판되는 DNA 단편(Research Genetics)을 주형으로 하여 PCR 증폭하였다. 상기 프라이머쌍을 사용하여 수득된 PCR 증폭단편은 양단에 스페이서 서열 및 M13RV 서열을 갖는다. 이것을 본 발명의 주형으로 하였다.
다음으로 본 실시예에서 사용하는 프라이머는, 서열 목록의 서열 번호 42에 기재된 서열을 갖는 M13RV-2N 17mer 프라이머 또는 서열 목록의 서열 번호 43에 기재된 서열을 갖는 M13RV-2N 20mer 프라이머를 사용하였다. 또한, 이 프라이머는 모두 3' 말단의 첫 번째 및 두 번째 염기가 리보뉴클레오타이드로 치환된 것을 사용하였다. 반응은 다음과 같이 실시하였다. 즉, 전술한 프라이머 100pmol, 20ng의 주형 및 0.01% 프로필렌디아민의 혼합액 10㎕를 98℃에서 2분간 변성시킨후, 55℃ 또는 60℃까지 냉각시켰다. 그 후, 34mM 트리신 완충액(pH 8.7), 10mM 염화칼륨, 10mM 황산암모늄, 0.01% BSA, 1% DMSO, 4mM 아세트산마그네슘, 0.5mM dNTP, 11U의 Bca BEST DNA 폴리머라아제, 30U의 RNase H를 첨가하고 최종 반응용량을 50㎕로 하였다. 이 반응액을 55℃ 또는 60℃에서 1시간 인큐베이션시켰다. 반응종료후 4㎕로 냉각하고, 이 반응액 3㎕를 3% 누시브 3:1 아가로스 전기영동에 공급하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
표 1
유전자명 및 증폭결과
반응온도 사용프라이머 CD2-related Type II cytosketal
55℃ M13RV-2N 17mer M13RV-2N 20mer ++ ++ ++ ++
60℃ M13RV-2N 17mer M13RV-2N 20mer + ++++ + ++++
+ ∼ ++++ : 증폭의 정도를 4 단계로 나타냄.
- : 증폭이 관찰되지 않음.
표 1에 나타낸 바와 같이, 반응온도를 높게 하는 것(55℃에서 60℃), 또 60℃에서 반응하는 경우 55℃에서 반응시의 최적의 프라이머보다 Tm치가 높은 프라이머를 사용함으로써 GC 함량이 높은 주형인 경우에서도 효율적으로 목적하는 영역을 증폭할 수 있다.
(3) 고온의 반응 조건하에서 뉴클레오타이드 서열 증폭 방법에서 증폭되는 단편의 길이와 증폭 산물의 양과의 상관 관계를 조사하였다. 우선, 람다 DNA의 800-bp 영역을 증폭시키기 위한, 서열 목록의 서열 번호 48 또는 49에 나타낸 서열을 갖는 한 쌍의 프라이머(Takara Shuzo) 및 람다 DNA의 400-bp 영역을 증폭시키기 위한, 서열 목록의 서열 번호 50 또는 51에 나타낸 서열을 갖는 한 쌍의 프라이머를 통상의 방법에 따라 합성하였다. 이들 프라이머들중 하나 및 주형으로서 λDNA를 사용하여 PCR을 수행하여 증폭된 단편을 수득하였다. 또한, 주형으로서 실시예 5 (1)에 기재된 바와 같은 pUC19-911 플라스미드 및 각각 서열 목록의 서열 번호 16 및 17에 나타낸 서열을 갖는 MF2(24) 프라이머 및 MR1(24) 프라이머를 사용하여 약 1.1kbp의 증폭된 단편을 제조하였다. 상기 언급된 프라이머 쌍을 사용하여 수득한 PCR-증폭된 단편은 양단에 스페이서 서열 및 M13RV 또는 M4서열을 갖는다. 이들 단편을 본 발명을 위한 주형으로서 사용하였다.
서열 목록의 서열 번호 42에 나타낸 서열을 갖는 M13RV-2N 17mer 프라이머 또는 서열 목록의 서열 번호 43에 나타낸 서열을 갖는 M13RV-2N 20mer 프라이머를 이 실시예에서 프라이머로서 사용하였다. 프라이머에서, 3'-말단으로부터 첫번째 및 두번째 염기가 리보뉴클레오타이드로 치환된다. 서열 목록의 서열 번호 55에 나타낸 서열을 갖는 M13M4-3N 20mer 프라이머 및 서열 목록의 서열 번호 43에 나타낸 서열을 갖는 M13RV-3N 20mer 프라이머의 결합, 및 서열 목록의 서열 번호 56 및 57에 나타낸 서열을 갖는 M13M4-3N 24mer 프라이머 및 M13RV-3N 24mer 프라이머의 결합을 각각 약 1kbp의 영역을 증폭시키기 위해 사용하였다. 프라이머에서, 3'-말단 으로부터 첫번째 내지 세번째 염기가 리보뉴클레오타이드로 치환된다. 반응을 하기와 같이 수행하였다. 10 pmol의 프라이머, 약 20ng의 주형 및 0.01%의 프로필렌디아민의 혼합물 10μl를 2분동안 98℃에서 변성시킨 후, 55℃ 또는 60℃로 냉각시켰다. 이후, 34mM 트리신 완충액(pH 8.7), 10mM 염화칼륨, 10mM 황산암모늄, 0.01% BSA, 1% DMSO, 4mM 마그네슘 아세테이트, 0.5mM 각각의 dNTPs, 11U의 Bca BEST DNA 폴리머라아제 및 30U의 RNase H를 가하여 최종 반응 용량을 50㎕를로 반들었다. 반응 혼합물을 1시간동안 55℃ 또는 60℃에서 인큐베이션시켰다. 반응을 종결시킨 후, 혼합물을 4℃로 냉각시킨 후, 5㎕의 0.5M EDTA 용액을 가하여 반응을 종결시켰다. 3μl의 반응 혼합물을 3% 누시브 3:1 아가로스(Takara Shuzo) 겔상에서 전기 영동시켰다. 결과를 하기 표 2 및 3에 나타낸다
표 2
증폭된 단편의 길이 및 결과
반응온도 사용프라이머 400bp 800bp
55℃ M13RV-2N 17mer M13RV-2N 20mer ++ ++ ++ ++
60℃ M13RV-2N 17mer M13RV-2N 20mer + ++++ + ++++
+ ∼ ++++ : 증폭의 정도를 4 단계로 나타냄.
- : 증폭이 관찰되지 않음.
표 2에 나타난 바와 같이, 증폭용 프라이머의 길이를 17mer으로부터 20mer으로 제작하고 반응 온도를 55℃로부터 60℃로 승온시켜 400bp 및 800 bp의 영역에 대한 단편을 효율적으로 증폭시켰다.
표 3
반응온도 사용프라이머 증폭된 단편의 길이 및 결과 1034bp
55℃ M13RV-3N 20mer&M13M4-3N 20mer M13RV-3N 24mer&M13M4-3N 24mer ++ ++
65℃ M13RV-3N 20mer&M13M4-3N 20mer M13RV-3N 24mer&M13M4-3N 24mer + ++++
+ ∼ ++++ : 증폭의 정도를 4 단계로 나타냄.
- : 증폭이 관찰되지 않음.
또한 표 3에 나타난 바와 같이, 증폭용 프라이머의 길이를 17mer으로부터 20mer으로 제작하고 반응 온도를 55℃로부터 65℃로 승온시켜 약 1kbp의 영역에 대한 단편을 효율적으로 증폭시켰다. 또한, 더욱 긴 프라이머 및 승온된 반응 온도를 사용하여 실시예 10에 기재된 바와 같은 장쇄의 DNA 단편의 증폭에 대하여도 유사한 결과를 관찰하였다. 약 2kbp 이상의 영역을 증폭시켰을 때 증폭 효율이 증가되었음을 관찰하였다.
실시예 13
(1) 본 발명의 방법에서 Bca BEST DNA 폴리머라아제이외의 열-내성 DNA 폴리머라아제의 사용을 조사하였다. Bst DNA 폴리머라아제(New England Biolabs)를 열-내성 DNA 폴리머라아제로서 사용하였다. 한 쌍의 프라이머, 각각 서열 목록에서 서열 번호 52 및 53에 나타낸 서열을 갖는 5'-ID 프라이머 및 3'-ID 프라이머를 통상의 방법에 따라 합성하였다. 프라이머쌍 및 주형으로서 사이클린 A 유전자(Research Genetics)에 대한 상업적으로 시용가능한 DNA단편을 사용하여 PCR을 수행하여 약 300bp의 증폭된 단편을 수득하였다. 프라이머쌍을 사용하여 수득한 PCR-증폭된 단편은 양 끝에 M13RV 서열을 갖는다. 상기 단편을 본 발명을 위해 주형으로서 사용하였다.
서열 목록의 서열 번호 42에 나타난 서열을 갖는 M13RV-2N 17mer 프라이머을 본 실시예에서 프라이머로서 사용하였다. 하기와 같이 반응을 수행하였다. 20μM의 프라이머, 약 20ng의 주형 및 0.01%의 프로필렌디아민의 혼합물 10㎕를 2분동안 98℃에서 변성시킨 후, 55℃로 냉각시켰다. 이후, 34mM 트리신 완충액(pH 8.7), 10mM 염화칼륨, 10mM 황산암모늄, 0.01% BSA, 1% DMSO, 4mM 마그네슘 아세테이트, 0.5mM 각각의 dNTPs, 4, 8, 12 또는 16U의 Bst DNA 폴리머라아제 및 30U의 RNase H를 가하여 최종 반응 용량을 50㎕로 반들었다. 대조군으로서 11U의 Bca BEST DNA 폴리머라아제를 사용하는 것을 제외하고, 상기 언급된 것과 동일한 조성을 갖는 반응 혼합물을 제조하였다. 반응 혼합물을 1시간동안 55℃에서 인큐베이션시켰다. 반응을 종결시킨 후, 혼합무릉ㄹ 4℃로 냉각시킨 후, 5㎕의 0.5M EDTA 용액을 가하여 반응을 종결시켰다. 3㎕의 반응 혼합물을 3% 누시브 3:1 아가로스(Takara Shuzo) 겔상에서 전기 영동시켰다. 결과적으로 각각의 다양한 유니트의 Bst DNA 폴리머라아제를 사용하여 관심의 대상이 되는 증폭된 단편을 수득하였다. 따라서, 본 발명의 방법에서 열-내성 DNA 폴리머러아제를 바람직하게 사용할 수 있다는 것을 확인하였다.
(2) 본 발명의 방법에서 중온성 DNA 폴리머러아제의 사용을 조사하였다. 5'→3' 엑소 활성(-) 클레나우 단편(Takara Shuzo)를 중온성 DNA 폴리머러아제로서 사용하였다. 상기 (1)에서 제조된 DNA를 본 발명의 방법을 위해 주형 DNA로서 사용 하였다.
서열 목록의 서열 번호 54에 나타난 서열을 갖는 M13RV-2N 16mer 프라이머을 본 실시예에서 프라이머로서 사용하였다. 프라이머에서, 3'-말단으로부터 첫 번째 및 두 번째 염기가 리보뉴클레오타이드에 의해 치환되었다. 하기와 같이 반응을 수행하였다. 20μM의 프라이머, 약 20ng의 주형 및 0.01%의 프로필렌디아민의 혼합물 10㎕를 2분동안 98℃에서 변성시킨 후, 40℃로 냉각시켰다. 이후, 34mM 트리신 완충액(pH 8.7), 10mM 염화칼륨, 10mM 황산암모늄, 0.01% BSA, 1% DMSO, 4mM 마그네슘 아세테이트, 0.5mM 각각의 dNTPs, 0, 2, 4, 6 또는 8U의 클레나우 단편 및 30U의 RNase H를 가하여 최종 반응 용량을 50㎕로 반들었다. 반응 혼합물을 1시간동안 40℃에서 인큐베이션시켰다. 반응을 종결시킨 후, 혼합물을 4℃로 냉각시킨 후, 5㎕의 0.5M EDTA 용액을 가하여 반응을 종결시켰다. 3㎕의 반응 혼합물을 3% 누시브 3:1 아가로스(Takara Shuzo) 겔상에서 전기 영동시켰다. 결과, 클레나우 단편을 첨가하지 않은 경우를 제외하고 다양한 유니트의 클레나우 단편을 사용한 경우 관심의 대상이 되는 증폭된 단편을 수득하였다. 따라서, 본 발명의 방법에서 중온성 DNA 폴리머라아제를 바람직하게 사용할 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 14
본 발명의 방법에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 조사하였다. 주형으로서 DNA 및 프라이머를 실시예 1(1)에 기재된 바왁 같이 합성하였다. 본 실시예세어 사용되는 프라이머의 구조를 하기에 상세히 기재한다:
프라이머쌍 1 : 서열 목록의 서열 번호 2 또는 3에 나타난 서열을 갖고 전체 적으로 데옥시리보뉴클레오타이드로 구성된 프라이머의 조합
프라이머쌍 2 : 3'-말단으로부터 여섯 번째 및 일곱 번째 데옥시리보뉴클레오타이드가 리보뉴클레오타이드로 치환된, 서열 목록의 서열 번호 59 또는 60에 나타난 서열을 갖는 프라이머의 조합
프라이머쌍 3 : 3'-말단으로부터 다섯번째 및 여섯번째 데옥시리보뉴클레오타이드가 리보뉴클레오타이드로 치환된, 서열 목록의 서열 번호 61 또는 62에 나타난 서열을 갖는 프라이머의 조합
프라이머쌍 4 : 3'-말단으로부터 네번째 및 다섯번째 데옥시리보뉴클레오타이드가 리보뉴클레오타이드로 치환된, 서열 목록의 서열 번호 63 또는 64에 나타난 서열을 갖는 프라이머의 조합
프라이머쌍 5 : 3'-말단으로부터 세번째 및 네번째 데옥시리보뉴클레오타이드가 리보뉴클레오타이드로 치환된, 서열 목록의 서열 번호 65 또는 66에 나타난 서열을 갖는 프라이머의 조합
프라이머쌍 6: 3'-말단으로부터 두번째 및 세번째 데옥시리보뉴클레오타이드가 리보뉴클레오타이드로 치환된, 서열 목록의 서열 번호 67 또는 68에 나타난 서열을 갖는 프라이머의 조합
프라이머쌍 7 : 3'-말단으로부터 첫번째 및 두번째 데옥시리보뉴클레오타이드가 리보뉴클레오타이드로 치환된, 서열 목록의 서열 번호 2 또는 3에 나타난 서열을 갖는 프라이머의 조합
프라이머쌍 8 : 3'-말단으로부터 두번째 및 세번째 데옥시리보뉴클레오타이 드가 리보뉴클레오타이드로 치환되고 3'-말단으로부터 세 번째 리보뉴클레오타이드의 5'-말단측에 인산 결합이 포스포로티오에이스 결합으로 치환된, 서열 목록의 서열 번호 63 또는 64에 나타난 서열을 갖는 프라이머의 조합
증폭 조건 및 검출 방법은 실시에 1 (2) 및 (3)에 기재된 바와 동일하였다. 결과 관심의 대상이 되는 길이를 갖는 증폭된 단편을 프라이머쌍 2-8 각각에 대하여 관찰하였다. 프라이머쌍 2-7에 대하여, 증폭 산물의 양은 3'-말단에 데옥시리보뉴클레오타이드의 수가 감소함애 따라 증가하였다. 특히, 3'-말단에 데옥시리보뉴클레오타이드를 갖지 않는 프라이머쌍 7에 대하여 가장 풍부한 증폭 산물을 관찰하였다. 한편, 프라이머쌍 1에 대하여, 단편이 증폭되지 않았음을 관찰하였다. 또한, 관심의 대상이 되는 증폭된 단편이 프라이머쌍 6 및 8에 대하여 관찰되었다는 사실은 변형된 리보뉴클레오타이드 및 변형되지 않는 리보뉴클레오타이드를 본 발명의 방법에서 프라이머중에 포함된 리보뉴클레오타이드로서 바람직하게 사용할 수 있다는 것을 입증한다.
본 발명은 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 존재에서 DNA 합성 반응을 수행하는 것을 특징으로하여 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 편리하고 효율적인 방법을 제공한다. 본 발명은 증폭된 DNA 단편을 다량 공급하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 증폭 방법을 또다른 핵산 증폭 방법과 결합시켜 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 효과적인 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 바이러스, 박테리아, 진균 및 효모와 같은 미생물을 검출하거나 측량하기 위한 뉴클레오타이드 서열 검출 방법, 및 본 발명의 방법에 의해 수득한 증폭된 DNA 단편을 실시간 검출하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 다량의 유전자 서열화 방법을 제공한다.
서열 목록 프리 텍스트
SEQ ID NO. 1: 주형으로서 사용되는 인간 트랜스페린 수용체-코딩 서열 부위와 일치하는 합성 DNA.
SEQ ID NO. 2: 인간 트랜스페린 수용체-코딩 서열 부위를 증폭시키는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 3: 인간 트랜스페린 수용체-코딩 서열 부위를 증폭시키는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머
SEQ ID NO. 4: 인간 트랜스페린 수용체-코딩 서열의 증폭된 부위를 검출하기 위한 프로브로서 사용되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머
SEQ ID NO. 5: 플라스미드 pUC19의 부위를 증폭시키기 위한 pUC19 어퍼 (2) NN로서 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 6: 플라스미드 pUC19의 부위를 증폭시키기 위한 pUC19 로어 NN로서 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 7: 플라스미드 pUC19의 부위를 증폭시키기 위한 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 8: 플라스미드 pUC19의 부위를 증폭시키기 위한 pUC19 로어 542로서 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 9: 플라스미드 pUC19의 부위를 증폭시키기 위한 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 10: 플라스미드 pUC19의 부위를 증폭시키기 위한 pUC19 어퍼 150 으로서 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 11: 플라스미드 pUC19의 부위를 증폭시키기 위한 pUC19 어퍼 249로서 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 12: 인간 트랜스페린 수용체-코딩 서열 부위를 증폭시키기 위한 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 13: 인간 트랜스페린 수용체-코딩 서열 부위를 증폭시키기 위한 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 14: 인간 트랜스페린 수용체-코딩 서열 부위를 증폭시키기 위한 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 15: 인간 트랜스페린 수용체-코딩 서열 부위를 증폭시키기 위한 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 16: 플라스미드 pUC19-249 또는 플라스미드 pUC19-911의 부위를 증폭시키기 위한 MF2N3(24)로서 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 17: 플라스미드 pUC19-249 또는 플라스미드 pUC19-911의 부위를 증폭시키기 위한 MF2N3(24)로서 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 18: 플라스미드 pUC19의 부위를 증폭시키기 위한 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 19: 플라스미드 pUC19의 부위를 증폭시키기 위한 MR1N3으로서 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 20: 플라스미드 pUC19의 증폭된 부위를 검출하기 위한 프로브로 서 사용되는 합성된 RNA.
SEQ ID NO. 21: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli O-157)로부터 베로 독소 1-코딩 서열의 부위를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 22: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli O-157)로부터 베로 독소 1-코딩 서열의 부위를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 23: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli O-157)로부터 베로 독소 2-코딩 서열의 부위를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 24: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli O-157)로부터 베로 독소 2-코딩 서열의 부위를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 25: 장쇄의 DNA 단편을 증폭시키기 위한 MCR-F로서 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 26: 장쇄의 DNA 단편을 증폭시키기 위한 MCR-R로서 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 27: 장쇄의 DNA 단편을 증폭시키기 위한 MF2N3(24)로서 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 28: 장쇄의 DNA 단편을 증폭시키기 위한 MR1N3(24)로서 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 29: 박테리오파지 람다 DNA 단편을 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 30: 박테리오파지 람다 DNA 단편을 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 29: 박테리오파지 람다 DNA 단편을 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 30: 박테리오파지 람다 DNA 단편을 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 31: 박테리오파지 람다 DNA 단편을 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 32: 박테리오파지 람다 DNA 단편을 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 33: 박테리오파지 람다 DNA 단편을 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 34: 박테리오파지 람다 DNA 단편을 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 35: 박테리오파지 람다 DNA 단편을 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 36: 박테리오파지 람다 DNA 단편을 증폭시키기 위한 R1-S1으로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 37: 박테리오파지 람다 DNA 단편을 증폭시키기 위한 R1-A1으로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 38: 박테리오파지 람다 DNA 단편을 증폭시키기 위한 R2-S1으로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 39: 박테리오파지 람다 DNA 단편을 증폭시키기 위한 R1-A3으로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 40: 박테리오파지 람다 DNA 단편을 증폭시키기 위한 R3-S1으로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 41: 박테리오파지 람다 DNA 단편을 증폭시키기 위한 R3-A3으로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 42: M13RV-2N 17mer으로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 43: M13RV-2N 20mer으로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 44: CDC2-연관 프로테인 키나아제 PISSLRE 유전자의 부위를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 45: CDC2-연관 프로테인 키나아제 PISSLRE 유전자의 부위를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 46: 형 II 사이토스켈레톤 11 케라틴 유전자의 부위를 증폭시키 기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 47: 형 II 사이토스켈레톤 11 케라틴 유전자의 부위를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 48: 박테리오파지 람다 DNA 단편을 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 49: 박테리오파지 람다 DNA 단편을 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 50: 박테리오파지 람다 DNA 단편을 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 51: 박테리오파지 람다 DNA 단편을 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 52: 사이클린 A DNA를 증폭시키기 위한 5'ID로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 53: 사이클린 A DNA를 증폭시키기 위한 3'ID로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 54: M13RV-2N 16mer으로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 55: M13M4-3N 16mer으로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 56: M13M4-3N 24mer으로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 57: M13RV-3N 16mer으로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 58: M13M4 17mer으로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 59 인간 트랜스페린 수용체-코딩 서열 부위를 증폭시키는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 60: 인간 트랜스페린 수용체-코딩 서열 부위를 증폭시키는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 61 인간 트랜스페린 수용체-코딩 서열 부위를 증폭시키는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 62: 인간 트랜스페린 수용체-코딩 서열 부위를 증폭시키는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 63 인간 트랜스페린 수용체-코딩 서열 부위를 증폭시키는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 64: 인간 트랜스페린 수용체-코딩 서열 부위를 증폭시키는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 65 인간 트랜스페린 수용체-코딩 서열 부위를 증폭시키는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 66: 인간 트랜스페린 수용체-코딩 서열 부위를 증폭시키는 작제 된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 67 인간 트랜스페린 수용체-코딩 서열 부위를 증폭시키는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
SEQ ID NO. 68: 인간 트랜스페린 수용체-코딩 서열 부위를 증폭시키는 작제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
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  84. (a) 주형으로서 핵산, 데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제, 적어도 하나의 프라이머 및 프라이머로부터 제조되는 신장된 스트랜드를 절단하는 엔도뉴클레아제를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고, 여기에서 프라이머는 실질적으로 주형인 핵산의 염기 서열에 상보적이고 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 상기 리보뉴클레오타이드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
    (b) 반응 혼합물을 충분한 시간동안 인큐베이션시켜 반응산물을 제조하는 것을 포함하는, 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 방법.
  85. 제84항에 있어서, 엔도뉴클레아제가 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 절단하는 방법.
  86. 제84에 있어서, 반응 혼합물을 등온으로 인큐베이션시키는 방법.
  87. 제84항 또는 제85항에 있어서, 반응 혼합물이 주형인 핵산의 염기 서열에 실질적으로 유사한(homologous) 서열을 갖는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 추가로 포함하는 방법.
  88. (a) 주형으로서 핵산을 실질적으로 상기 핵산의 염기 서열과 상보적인 적어도 하나의 프라이머 및 DNA 폴리머라아제로 처리하여 주형에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고, 여기에서 프라이머는 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 상기 리보뉴클레오타이드는 엔도뉴클레아제로의 절단을 위하여 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
    (b) 단계 (a)에서 수득한 더블-스트랜드 핵산의 프라이머-신장된 스트랜드를 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 엔도뉴클레아제로 절단하며;
    (c) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 단계 (b)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 주형에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 신장시켜 스트랜드를 치환하는 것을 포함하는, 뉴클레오타이드를 증폭시키는 방법.
  89. (a) 주형으로서 핵산을 실질적으로 상기 핵산의 염기 서열과 상보적인 적어도 하나의 프라이머 및 DNA 폴리머라아제로 처리하여 주형에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고, 여기에서 프라이머는 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 상기 리보뉴클레오타이드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고, 여기에서 엔도뉴클레아제는 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 절단하고;
    (b) 단계 (a)에서 수득한 더블-스트랜드 핵산의 프라이머-신장된 스트랜드를 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 엔도뉴클레아제로 절단하며;
    (c) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 단계 (b)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 주형에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 신장시켜 스트랜드를 치환시키는 것을 포함하는, 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 방법.
  90. 제88항 또는 제89항에 있어서, 단계 (b) 및 단계 (c)를 순차적으로 반복하는 방법.
  91. 제88항에 있어서, 재생된 프라이머-신장된 스트랜드를 포함하는 더블-스트랜드 핵산을 단계 (b)에서 재사용하고;
    (d) 주형으로서 단계 (c)에서 수득한 분리된 치환된(released displaced) 스트랜드를 단계 (a)에서 사용한 것과 상이한 적어도 하나의 프라이머 및 DNA 폴리머라아제로 처리하여 상기 치환된 스트랜드에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고, 여기에서 단계 (a)에서 사용한 것과 상이한 프라이머는 실질적으로 치환된 스트랜드의 염기 서열에 상보적이고 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 상기 리보뉴클레오타이드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 단계;
    (e) 단계 (d)에서 수득한 더블-스트랜드 핵산의 프라이머-신장된 스트랜드를 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 엔도뉴클레아제로 절단하는 단계; 및
    (f) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 단계 (e)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 주형에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 신장시켜 스트랜드를 치환하고, 여기에서 재생된 프라이머-신장된 스트랜드를 포함하는 더블-스트랜드 핵산을 단계 (e)에서 재사용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  92. 제89항에 있어서, 재생된 프라이머-신장된 스트랜드를 포함하는 더블-스트랜드 핵산을 단계 (b)에서 재사용하고;
    (d) 주형으로서 단계 (c)에서 수득한 분리된 치환된 스트랜드를 단계 (a)에서 사용한 것과 상이한 적어도 하나의 프라이머 및 DNA 폴리머라아제로 처리하여 상기 치환된 스트랜드에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고, 여기에서 단계 (a)에서 사용한 것과 상이한 프라이머는 실질적으로 치환된 스트랜드의 염기 서열에 상보적이고 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 상기 리보뉴클레오타이드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고, 엔도뉴클레아제는 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 절단하는 단계;
    (e) 단계 (d)에서 수득한 더블-스트랜드 핵산의 프라이머-신장된 스트랜드를 리보뉴클레오타이드를 포함하는 위치에서 엔도뉴클레아제로 절단하는 단계; 및
    (f) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 단계 (e)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 주형에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 신장시켜 스트랜드를 치환하고, 여기에서 재생된 프라이머-신장된 스트랜드를 포함하는 더블-스트랜드 핵산을 단계 (e)에서 재사용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  93. 제88항 또는 제89항에 있어서, 각 단계를 등온으로 수행하는 방법.
  94. 제84항, 제88항 또는 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 스트랜드 치환 활성을 갖는 하나의 DNA 폴리머라아제를 사용하는 방법.
  95. 제84항 또는 제89항에 있어서, 리보뉴클레오타이드가 엔도뉴클레아제로 절단되되록 위치하는 방법.
  96. 제84항, 제88항 또는 제89항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 폴리머라아제가 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 DNA 폴리머라아제 I의 클레나우(Klenow) 단편, 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bst DNA 폴리머라아제 및 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bca DNA 폴리머라아제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  97. 제84항, 제88항 또는 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도뉴클레아제가 엔도리보뉴클레아제인 방법.
  98. 제97항에 있어서, 엔도뉴클레아제가 RNase H인 방법.
  99. 제84항, 제88항 또는 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 두개 이상의 연속된 리보뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 방법.
  100. 제84항, 제88항 또는 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 하나 이상의 변형된 리보뉴클레오타이드를 포함하는 방법.
  101. 제100항에 있어서, 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 리보뉴클레오타이드의 α-위치의 인 원자에 결합된 산소 원자가 황 원자로 치환된 (α-S) 리보뉴클레오타이드를 포함하는 방법.
  102. 제84항, 제88항 또는 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 트리신, 인산 및 트리스로 구성된 그룹으로부터 선택된 완충 성분을 포함하는 완충액중에서 수행되는 방법.
  103. 제84항, 제88항 또는 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 주형으로서 핵산이 싱글-스트랜드 DNA 또는 더블-스트랜드 DNA인 방법.
  104. 제103항에 있어서, 주형으로서의 더블-스트랜드 DNA를 싱글-스트랜드 DNA로 전환시킨 후 수행하는 방법.
  105. 제103항에 있어서, 주형으로서의 핵산이 역전사 반응에 의해 RNA로부터 수득된 cDNA인 방법.
  106. 제105항에 있어서, 주형으로서 RNA를 사용하는 역전사 반응에 의해 cDNA를 합성한 후 수행하는 방법.
  107. 제106항에 있어서, 올리고-dT 프라이머, 무작위(random) 프라이머 및 특이적(secific) 프라이머로 구성된 그룹으로터 선택되는 프라이머를 역전사 반응용 프라이머로서 사용하는 방법.
  108. 제106항에 있어서, 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 역전사 반응용 프라이머로서 사용하는 방법.
  109. 제106항에 있어서, 역전사 효소 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 역전사 효소로서 사용하는 방법.
  110. 제106항에 있어서, 역전사 효소 활성 및 스트랜드 치환 활성을 갖는 하나의 DNA 폴리머라아제를 사용하여 역전사 반응 및 주형에 상보적인 신장된 스트랜드 합성을 수행하는 방법.
  111. 제109항에 있어서, DNA 폴리머라아제가 바실러스 스테아로써모필러스 (Bacillus stearothermophilus)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제가 결핍된 Bst DNA 폴리머라아제 또는 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bca DNA 폴리머라아제인 방법.
  112. 제105항에 있어서, 역전사 반응에서 주형으로서의 RNA가 핵산 증폭 반응에 의해 증폭된 RNA인 방법.
  113. 제112항에 있어서, 주형으로서 RNA를 사용하는 핵산 증폭 반응에 의해 증폭된 RNA 단편을 합성한 후 수행하는 방법.
  114. 제112항에 있어서, 핵산 증폭 반응이 전사-기초 증폭 시스템(transcription-based amplification system(TAS)) 방법, 자립복제(self-sustained sequence amplificaition(3SR)) 방법, 핵산 서열 기초 증폭(nucleic acid sequence-based amplification)(NASBA) 방법, 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplificaition)(TMA) 방법 및 Qβ레플리카아제(replicase) 방법으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  115. 제103항에 있어서, 주형으로서의 핵산이 핵산 증폭 반응에 의해 수득된 DNA인 방법.
  116. 제115항에 있어서, 주형으로서 DNA를 사용하여 핵산 증폭 반응에 의해 증폭된 DNA 단편을 합성한 후 수행하는 방법.
  117. 제116항에 있어서, 핵산 증폭 반응이 중합효소 연쇄 반응(PCR) 방법, 리가아제 연쇄반응(ligase chain reation(LCR)) 방법 및 스트랜드 치환 증폭(strand displacement amplification(SDA)) 방법으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  118. 제112항에 있어서, 무작위 프라이머 또는 축퇴(degenerate) 프라이머를 핵산 증폭 반응을 위해 사용하는 방법.
  119. 제118항에 있어서, 무작위 프라이머 또는 축퇴 프라이머가 적어도 3'-말단 또는 3'-말단측에 무작위 서열 또는 축퇴 서열을 갖는 프라이머인 방법.
  120. (a) DNA 폴리머라아제로서, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 DNA 폴리머라아제 I의 클레나우(Klenow) 단편, 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bst DNA 폴리머라아제 및 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bca DNA 폴리머라아제로 구성된 그룹으로부터 선택된 스트랜드 치환 활성을 가지는 DNA 폴리머라아제;
    (b) RNaseH;
    (c) 스트랜드 치환 반응용 완충액; 및
    (d) 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 리보뉴클레오타이드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 포함하는, 제84항, 제88항 또는 제89항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 방법에 사용하는 키트.
  121. (a) 제84항, 제88항 또는 제89항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 서열 증폭 방법에 의해 표적 핵산을 증폭시키고;
    (b) 단계 (a)에서 증폭된 표적 핵산을 검출하는 것을 포함하는, 샘플에서 표적 핵산을 검출하는 방법.
  122. 제121항에 있어서, 소광 상태가 되는 거리에 위치한 두개 이상의 형광 물질로 표지된 리보뉴클레오타이드(RNA) 프로브를 사용하여 증폭된 표적 핵산을 검출하는 방법.
  123. (a) DNA 폴리머라아제로서, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 DNA 폴리머라아제 I의 클레나우(Klenow) 단편, 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bst DNA 폴리머라아제 및 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bca DNA 폴리머라아제로 구성된 그룹으로부터 선택된 스트랜드 치환 활성을 가지는 DNA 폴리머라아제;
    (b) RNaseH;
    (c) 스트랜드 치환 반응용 완충액;
    (d) 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 리보뉴클레오타이드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 및
    (e) 증폭된 표적 핵산을 검출하기 위한 시약을 포함하는 제121항에 따른 표적 핵산을 검출하는 방법에 사용하는 키트.
  124. (a) 제84항, 제88항 또는 제89항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 서열 증폭 방법에 의해 고정화하고자 하는 핵산을 증폭시키고;
    (b) 단계 (a)에서 증폭된 핵산을 기질상의 미리 정해진 영역에 배열하고 고정화시키는 것을 포함하는, 핵산이 미리 정해진 영역에 배열된, 고정화된 핵산을 갖는 물질을 제조하는 방법.
  125. 제124항에 있어서, 실질적으로 상보적인 스트랜드가 없는 싱글-스트랜드 핵산을 증폭시키고, 기질상의 미리 정해진 영역에 배열하고 고정화시키는 방법.
  126. (a) 주형으로서 핵산, 데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제, 적어도 하나의 프라이머 및 프라이머로부터 제조되는 신장된 스트랜드를 절단하는 엔도뉴클레아제를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고, 여기에서 프라이머는 실질적으로 주형으로서의 핵산의 염기 서열에 상보적이고 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머이고, 상기 리보뉴클레오타이드는 엔도뉴클레아제로의 절단을 위하여 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
    (b) 반응 혼합물을 충분한 시간동안 인큐베이션시켜 반응산물을 제조하는 것을 포함하는, 핵산을 대량으로 제조하는 방법.
  127. 제84항, 제88항, 제89항 또는 제126항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 것을 특징으로 하는, 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법.
  128. 제84항, 제88항, 제89항 또는 제126항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 것을 특징으로 하는, 표적 핵산의 돌연변이를 검출하는 방법.
  129. (a) 스트랜드 치환 활성을 가지는 DNA 폴리머라아제;
    (b) 엔도뉴클라아제;
    (c) 스트랜트 치환 반응용 완충액; 및
    (d) 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 리보뉴클레오타이드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 포함하는 제84항, 제88항, 제89항 또는 제126항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 방법에 사용하는 혼합물.
  130. (a) 스트랜드 치환 활성을 가지는 DNA 폴리머라아제;
    (b) 엔도뉴클라아제;
    (c) 스트랜트 치환 반응용 완충액;
    (d) 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 리보뉴클레오타이드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 및
    (e) 증폭된 표적 핵산을 검출하기 위한 시약을 포함하는 제121항에 따른 표적 핵산을 검출하는 방법에 사용하는 혼합물.
  131. 제129항 또는 제130항에 있어서, DNA 폴리머라아제로서, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 DNA 폴리머라아제 I의 클레나우(Klenow) 단편, 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bst DNA 폴리머라아제 및 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bca DNA 폴리머라아제로 구성된 그룹으로부터 선택된 DNA 폴리머라아제를 포함하는 혼합물.
  132. 제129항 또는 제130항에 있어서, 엔도뉴클레아제로서 RNase H를 포함하는 혼합물.
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