TWI259204B - Method for amplifying nucleic acid sequence by using chimera oligonucleotide primer at isothermal - Google Patents

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TWI259204B
TWI259204B TW089104975A TW89104975A TWI259204B TW I259204 B TWI259204 B TW I259204B TW 089104975 A TW089104975 A TW 089104975A TW 89104975 A TW89104975 A TW 89104975A TW I259204 B TWI259204 B TW I259204B
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nucleic acid
primer
dna polymerase
dna
reaction
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TW089104975A
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Hiroyuki Mukai
Junko Yamamoto
Osamu Takeda
Miyake Kazue
Takashi Uemori
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Takara Bio Inc
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Description

1259204 A7 B7 五、發明說明（93) 序列表自由本文
SEQ ID N0:1 :作爲模板之編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體 序列的合成DNA SEQ ID N0:2 :用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體序 列的經設計之寡核甞酸引子 SEQ ID N0:3 :用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體序 列的經設計之寡核甞酸引子 SEQ ID N0:4 :用以作爲偵測一經放大之編碼部分人類鐵 傳遞蛋白受體序列的經設計之寡核甞酸的探針 SEQ ID N0:5 :設計爲 pUC19 upper (2) NN以放大質體 pUC19之部分的經設計之寡核苷酸引子 SEQ ID N0:6 :設計爲pUC19 lower NN以放大質體pUC19之 部分的經設計之寡核甞酸引子 SEQ ID NO:7 :用以放大質體pUC19之部分的經設計之寡 核甞酸引子 SEQ ID NO:8 :設計爲 pUC19 lower 542 以放大質體 pUC19 之部分的經設計之寡核甞酸引子 SEQ ID NO:9 :用以放大質體pUC19之部分的經設計之寡 核甞酸引子 SEQ ID NO:10 :設計爲 pUC19 upper 150 以放大質體pUC19 之部分的經設計之寡核苷酸引子 SEQ ID ΝΟ:11 :設計爲 pUC19 upper 249 以放大質體 pUC19 之部分的經設計之寡核甞酸引子 SEQ ID NO:12 :用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體 -96- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1259204 A7 B7 五、發明說明（94) 序列的經設計之寡核苷酸引子 SEQ ID N043 :用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體 序列的經設計之寡核甞酸引子 SEQ ID N0:14 :用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體 序列的經設計之寡核甞酸引子 SEQ ID NO: 15 :用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體 序列的經設計之寡核苷酸引子 SEQ ID NO:16 :設計爲 MF2N3(24)以放大質體pUC19_249或 質體PUC19-911的經設計之寡核苷酸引子 SEQ ID NO:17 :設計爲 MR1N3(24)以放大質體 pUC19-249 或質體pUC19- 911的經設計之寡核甞酸引子 SEQIDNO:18:用以放大質體pUC19之部分的經設計之寡 核苷酸引子 SEQ ID NO:19 :設計爲MR1N3以放大質體pUC19之部分的 經設計之寡核甞酸引子 SEQ ID NO:20 :用以作爲偵測一經放大之質體pUC19之部 分的合成RNA的探針 SEQ ID NO:21 :用以放大衍生自出血性大腸桿菌0 - 157之 編碼vero毒素1之部分序列的經設計之寡核嘗酸引子 SEQ ID NO:22 :用以放大衍生自出血性大腸桿菌0 - 157之 編碼vero毒素1之部分序列的經設計之寡核甞酸引子 SEQ ID NO:23 :用以放大衍生自出血性大腸桿菌〇 - 157之 編碼vero毒素2之部分序列的經設計之寡核嘗酸引子 SEQ ID NO:24 :用以放大衍生自出血性大腸桿菌0 _ 157之 -97- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂·--------
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1259204 A7 B7 五、發明說明（95) 編碼vero毒素2之部分序列的經設計之寡核甞酸引子 SEQ ID NO:25 :設計爲MCR_ F以放大一長DNA片段的經 設計之寡核苷酸引子 SEQ ID NO:26 :設計爲M C R R以放大一長DNA片段的經 設計之寡核甞酸引子 SEQ ID ΝΟ:27 :設計爲MF2N3(24)以放大一長DNA片段的 經設計之寡核苷酸引子 SEQ ID NO:28 :設計爲MR1N3(24)以放大一長DNA片段的 經設計之寡核苷酸引子 SEQ ID NO:29 :用以放大噬菌體A DNA之部分的經設計 之寡核甞酸引子 SEQ ID NO:30 :用以放大噬菌體；I DNA之部分的經設計 之寡核苷酸引子 SEQ ID N0:31 :用以放大噬菌體λ DNA之部分的經設計 之寡核甞酸引子 SEQ ID ΝΟ:32 :用以放大噬菌體λ DNA之部分的經設計 之寡核甞酸引子 SEQ ID ΝΟ:33 :用以放大噬菌體λ DNA之部分的經設計 之寡核甞酸引子 SEQ ID N0J4 :用以放大噬菌體λ DNA之部分的經設計 之寡核甞酸引子 SEQ ID ΝΟ:35 :用以放大噬菌體λ DNA之部分的經設計 之寡核苷酸引子 SEQ ID ΝΟ:36 :設計爲R1-S1以放大噬菌體；I DNA之部分 -98- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂---------
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1259204 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 發明說明（96) 的經設計之寡核甞酸引子 SEQ ID NO:37 :設計爲R1-A3以放大噬菌體λ DNA之部分 的經設計之寡核甞酸引子 SEQ ID ΝΟ:38 :設計爲R2-S1以放大噬菌體λ DNA之部分 的經設計之寡核苷酸引子 SEQ ID ΝΟ:39 :設計爲R2-A3以放大噬菌體λ DNA之部分 的經設計之寡核甞酸引子 SEQ ID ΝΟ:40 :設計爲R3- S1以放大噬菌體λ DNA之部分 的經設計之寡核甞酸引子 SEQ ID Ν0:41 :設計爲R3-A3以放大噬菌體；I DNA之部分 的經設計之寡核甞酸引子 SEQ ID ΝΟ:42 :設計爲M13RV-2Ν 17mer的經設計之寡核 苷酸引子 SEQ ID N0.43 :設計爲M13RV- 2N 20mer的經設計之寡核 嘗酸引子
SEQ ID NO:44 :用以放大CDC2-相關之蛋白質酶PISSLRE 基因之部分的經設計之寡核甞酸引子
SEQ ID NO:45 :用以放大CDC2-相關之蛋白質酶PISSLRE 基因之部分的經設計之寡核苷酸引子 SEQ ID NO:46 :用以放大II型細胞骨骼性11角蛋白基因之 部分的經設計之寡核甞酸引子 SEQ ID NO:47 :用以放大II型細胞骨骼性11角蛋白基因之 部分的經設計之寡核甞酸引子 SEQ ID NO:48 :用以放大噬菌體λ DNA之部分的經設計 -99- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1259204 A7 B7 五、發明說明（97) 之寡核甞酸引子 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) SEQ ID NO:49 :用以放大噬菌體λ DNA之部分的經設計 之寡核苷酸引子 SEQ ID ΝΟ:50 :用以放大噬菌體λ DNA之部分的經設計 之寡核甞酸引子 SEQ ID Ν0:51 :用以放大噬菌體凡DNA之部分的經設計 之寡核苷酸引子 SEQ ID NO:52 ：設計爲5’ID以放大細胞週期調節蛋白 (cyclin)A DNA之部分的經設計之寡核甞酸引子 SEQ ID NO:53 :設計爲3’ID以放大細胞週期調節蛋白 (cyclin)A DNA之部分的經設計之寡核苷酸引子 SEQ ID NO:54 :設計爲M13RV-2N 16mer的經設計之寡核 苷酸引子 SEQ ID NO:55 ··設計爲M13M4-3N 16mer的經設計之寡核 線 甞酸引子 SEQ ID NO:56 :設計爲M13M4-3N 24mer的經設計之寡核 苷酸引子 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 SEQ ID NO:57 :設計爲M13RV-3N 24mer的經設計之寡核 苷酸引子 SEQ ID NO:58 ··設計爲M13M4 17mer的經設計之寡核苷酸 引子 SEQ ID NO:59 :用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體 序列的經設計之寡核苷酸引子 SEQ ID NO:60 :用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體 -100- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) 1259204 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（98) 序列的經設計之寡核苷酸引子 SEQ ID N0:61 :用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體 序列的經設計之寡核甞酸引子 SEQ ID NO:62 :用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體 序列的經設計之寡核甞酸引子 SEQ ID NO:63 :用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體 序列的經設計之寡核甞酸引子 SEQ ID NO:64 :用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體 序列的經設計之寡核苷酸引子 SEQ ID N045 :用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體 序列的經設計之寡核甞酸引子 SEQ ID ΝΟ··66 :用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體 序列的經設計之寡核苷酸引子 SEQ ID ΝΟ:67 :用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體 序列的經設計之寡核苷酸引子 SEQ ID ΝΟ:68 :用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體 序列的經設計之寡核甞酸引子 序列表（SEQUENCE LISTING) <110>寶酒造股份有限公司 <120>核酸序列之放大方法 <130661724 <150>JP 11-076966 <151>1999_03_19 -101 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂--------- •線 A7 B7 1259204 五、發明說明（99) <150>JP 11-370035 <151>1999-12-27 <16068 <210>1 <211>99 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>作爲模板之編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體序列的合成DNA <400>1 ggacagcaac tgggccagca aagttgagaa actcacttta gagaattctg ctttcccttt 60 ccttgcatat tctgagcagt ttctttctgt ttttgcgag 99 <210>2 <211>22
<212>DNA <213>人工序列 <220〉 <223>用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體序列的經設計之寡核甞酸 引子 <400>2 cagcaactgg gccagcaaag tt 22 <2103 -102- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---------訂·--------
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 1259204 B7__ 五、發明說明（1〇Φ <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體序列的經設計之寡核甞酸 引子 <400>3 gcaaaaacag aaagaaactg ct 22 <210>4 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>用以作爲偵測一經放大之編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體序列的經 設計之寡核苷酸的探針 <400>4 tgctttccct ttccttgcat attctg 26 <210>5 <211>25 <212>DNA <213>人工序列 <220〉 <223>設計爲PUC19 upper (2) NN以放大質體PUC19之部分的經設計 之寡核苷酸引子 -103 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) --------訂---------線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 251259204 A7 B7
五、發明說明（1〇D <400>5 attgcttaat cagtgaggca cctat <210>6 <211>25 <212>DNA <213>人工序列 <220〉 <223>設計爲pUCl9 lower NN以放大質體pUC19之部分的細乂』 經詨計之 核甞酸引子 <400>6 gataacactg cggccaactt acttc <210>7 <211>25 <212>DNA <213>人工序列 <220〉 25 寡 (請先閱讀背面之注咅P事項再填寫本頁) <223>用以放大質體pUC19之部分的經設計之寡 核苷酸引子 訂---------線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <400>7 actggcgaac tacttactct agctt <210>8 <211>25 <212>DNA <213>人工序列 <220> 25 -104. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297 1259204 A7 B71、發明說明（10含 <223>設計爲pUC19 lower 542以放大質體pUC19之部分的經設計之寡 核嘗酸引子 <400>8 agtcaccagaa aagcatctta cggat 25 <210>9 <211>25 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>用以放大質體PUC19之部分的經設計之寡核誓酸引子 <400>9 gctcatgaga caataaccct gataa 25 <210>10 <211>25 <212>DNA <213>人工序列 <220> (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 訂---------線
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <223〉設計爲pUC19 upper 150以放大質體pUC19之部分上 核菩酸引子 ”峡設計之
<400>10 ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatg <21011 <211>25 <212>DNA -105 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 寡 25 1259204 A7 ------ B7 五、發明說明（1〇令 <213>人工序列 <220〉 <223>設計爲pUC19 upper 249以放大質體PUC19之部分的經設計之寡 核苷酸引子 <400>11 cgcctccatc cagtctatta attgt 25 <210>12 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體序列的經設計之寡核甞酸 引子 <400>12 ctgattgaga ggattcctga gt 22 <21013 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體序列的經譟計之寡核甞酸 引子 <400>13 tagggagaga ggaagtgata ct 22 -106- ___ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) --------^. I-----—
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1259204 A7 B7 五、發明說明（1〇4 <21014 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223〉用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體序列的經設計之寡核菩酸 引子 <400>14 caacttcaag gtttctgcca gc ? <210>15 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體序列的經設計之寡核甞酸 引子 <40015 aatagtccaa gtagctagag c 21 <210>16 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>設計爲MF2N3(24)以放大質體pUC19-249或質體pUCl9_9ll的 -107- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) # 訂---------線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1259204 A7 B7 五、發明說明（10今 經設計之寡核苷酸引子 <40016 gctgcaaggc gattaagttg ggta 24 <210>17 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>設計爲MR1N3(24)以放大質體pUC19-249或質體pUC19_911的 經設計之寡核甞酸引子 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
<40017 ctttatgctt ccggctcgta tgtt <21018 <211>30 <212>DNA <213>人工序列 <220> 24 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <223>用以放大質體pUC19之部分的經於 & 又η 核甞酸引子 <400>18 ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta <210>19 <211>30 <212>DNA <213>人工序列 -108 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297If 線 30 A7 B7
1259204 五、發明說明（1〇Φ <220> <223>設計爲MR1N3磁mpUC19之部麵轉狀寡核嘗 子 <400>19 tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt 3〇 <21020 <211>30 <212>RNA <213>人工序列 <220〉 <223>用以作爲偵測一經放大之質體puci9之部分的合成RNA的探針 <400>20 ugauccccca uguugugcaa aaaagcgguu 3 〇 <210>21 <211>18 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>用以放大衍生自出血性大腸样菌〇_157之編碼ver0毒素1之部 分序列的經設計之寡核苷酸引子 <400>21 agttaatgtg gtggcgaa 18 <210>22 ______-109-_ ___ 尺度綱中關家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） "'' '^" (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁} 訂---------綠
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1259204 Δ7 Α7 Β7 五、發明說明（1〇力 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) <211>17 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>用以放大衍生自出血性大腸桿菌0-157之編碼vero毒素1之部 分序列的經設計之寡核苷酸引子 <400>22 gactcttcca tctgcca 17 <210>23 <211>18 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>用以放大衍生自出血性大腸桿菌0-157之編碼vero毒素2之部 分序列的經設計之寡核苷酸引子 <40023 ttcggtatcc tattcccg 18 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <21024 <211>18 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>用以放大衍生自出血性大腸样菌0-157之編碼vero毒素2之部 分序列的經設計之寡核苷酸引子 _-110- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1259204 A7 B7 五、發明說明（1〇合 <400>24 tctctggtca ttgtatta 18 <21025 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>設計爲MCR-F以放大一長DNA片段的經設計之寡核答酸引子 <400>25 ccattcaggc tgcgcaactg tt 22 <21026 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>設計爲MCR-R以放大一長DNA片段的經設計之寡核菩酸引子 <40026 tggcacgaca ggtttcccga ct 22 <21027 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>設計爲MF2N3(24)以放大一長DNA片段的經設計之寡核苷酸引 -111 - _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·111111 A7 1259204 __B7 五、發明說明（10令 <400>27 gctgcaaggc gattaagttg ggta 24 <210>28 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>設計爲MR1N3(24)以放大一長DNA片段的經設計之寡核苷酸引 子 <400>28 ctttatgctt ccggctcgta tgtt 24 <21029 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>用以放大鋪ff 1 DNA之科崎設計之雜|酸引子 <400>29 aacaacaaga aactggtttc 20 <21030 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 一 _ -112- $張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐Γ"·----------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -----—I I —--- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1259204 A7 B7 五、發明說明（ <220> <223>用以放大嗤菌體Λ DNA之部分的經設計之寡核芬酸引子 <400>30 gcaatgcatg acgactgggg <21031 <211>17 <212>DNA <213>人工序列 20 <220> <400>31 gttttcccag tcacgac <210>32 <211>17 <212>DNA <213>人工序列 17 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <220> <223>用以放大韻DNA之部分的減計之雜替酸引子 <40032 caggaaacag ctatgac <210>33 <211>20 <212>DNA ______ 113 _ ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297 -------- 1259204
五、發明說明（11令 <213>人工序列 <220> <223>用以放大噬菌體;^ DNA之部分的經設計之寡核菩酸引子 <40033 gtacggtcat catctgacac <21034 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>用以放大噬菌體;t DNA之部分的經設計之寡核:y：酸引子 <4〇〇>34 gcaatcggca tgttaaacgc <210>35 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>用以放大噬菌體Λ DNA之部分的經設計之寡核苷酸引子 <400>35 cgccatcctg ggaagactcc <210>36 <211>44 -114- _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規袼（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --- I ! I 訂-------11 · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1259204 A7 B7 五、發明說明（11^ <212>DNA <213>人工序列 <220> <223〉設計爲R1-S1以放大噬菌體凡DNA之部分的經設計之寡核瞀酸 引子 <400>36 tttcacacag gaaacagcta tgacaacaac aagaaactgg tttc 44 <21037 <211>44 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>設計爲ΐα_Α3以放大噬菌體;t DNA之部分的經設計之寡核苷酸 引子 / <400>37 tttcacacag gaaacagcta tgacgcaatg catgacgact gggg 44 <21038 <211>62 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>設計爲R2-S1以放大邹體A DNA之部分的經設計之寡 引子 I敗 <400>38 -115- 尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ' 1^ _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) k#-----——tr--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1259204 A7 B7 五、發明說明（11令 attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg acaacaacaa gaaactggtt 60 tc 62 <210>39 <211>62 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>設計爲R2-A3以放大嗟菌體;l DNA之部分的經設計之寡核:y：酸 引子 <400>39 attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg acgcaatgca tgacgactgg 60 路 62 <210>40 <211>95 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223〉设计爲R3-S1以放大嗟菌體λ DNA之邵分的經設計之寡核菩酸 引子 ' <400>40 cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 60 ggaaacagct atgacaacaa caagaaactg gtttc 95 <21041 <211>95
<212>DNA -116- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 訂---------線』 1259204 A7 B7 五、發明說明（114» <213>人工序列 <220〉 <223>設計爲R3_A3以放大嗤菌體λ DNA之部分的經設計之寡核甞酸 引子 <400>41 cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 60 ggaaacagct atgacgcaat gcatgacgac tggg 95 <210>42 <211>17 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>設計爲M13RV-2N 17mer的經設計之寡核誓酸引子 <400>42 caggaaacag ctatgac γη <21043 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>設計爲M13RV-2N 20mer的經設計之寡核答酸引子 <40043 acacaggaaa cagctatgac 2〇 _-117 二一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐^ " ------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂---------. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1259204 A7 B7 五、發明說明（11今 <210>44 <211>70 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>用以放大CDC2-相關之蛋白質酶pisSLRE基因之部分的經設計 之寡核甞酸引子 <4〇〇>44 gagttcgtgt ccgtacaact atttcacaca ggaaacagct atgacccaac aagagcctat 60 agcttcgctc 7〇 <21045 <211>44 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223〉用以放大CDC2·相關之蛋白質酶PISSLRE基因之部分的經設計 之寡核甞酸引子 ’ <4〇〇>45 tcgaaatcag ccacagcgcc atttcacaca ggaaacagct atgacccgct gtctttgagt 60 tgtggtg 67 <21046 <211>44 <212>DNA <213>人工序列 <220> _ -118- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1259204 A7 B7 五、發明說明（iid <223>用以放大Π型細胞骨骨各性11角蛋白基因之部分的經設計之寡核 甞酸引子 人 <400>46 gagttcgtgt ccgtacaact atttcacaca ggaaacagct atgacgctat tctgacatca 60 ctttccagac 7〇 <21047 <211>44 <212>DNA <213>人工序列 <220〉 <223>用以放大Π型細胞骨骼性11角蛋白基因之部分的經設計之寡柱 苷酸引子 人 <4〇〇>47 tcgaaatcag ccacagcgcc atttcacaca ggaaacagct atgacgaatt ccactggtgg 60 cagtag 66 <210>48 <211>62 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>用以放大嗟菌體；I DNA之邵分的經設計之寡核嘗酸引子 <400>48 attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg acgtacggtc atcatctgac 6〇 C請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁} ----I I I I a叮·11111111 ^^ · 119-
1259204 A7 五、發明說明（11乃 <210>49 <211>62 <212>DNA <213>人工序列 <220〉 <223>用以放大嗟菌體X DNA之邵分的經設計之寡核菩酸引子 <400>49 attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg acatgcgccg cctgaaccac ca <21050 <211>62 <212>DNA <213>人工序列 <220> 60 62 <223>用以放大噬菌體Λ DNA之部分的經設計之寡核苷酸引子 <400>50 attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg acctgctctg ccgcttcacg 6〇 ca 62 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) -1^ 111111· •線® 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210>51 <211>62 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>用以放大噬菌體λ DNA之部分的經設計之寡核：y：酸引子 -120- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1259204 A7 B7 i、發明說明（118) <400>51 attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg acgcaatcgg catgttaaac 60 gg 62 <21052 <211>70 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>設計爲51D以放大細胞週期調節蛋白(Cydin)ADNA之部分的經 設計之寡核铝酸引子 <40052 tcgaaatcag ccacagcgcc atttcacaca ggaaacagct atgacatgtt ttgggagaa 60 ttaagtctga 7〇 <210>53 <211>44 <212>DNA <213>人工序列 <220> (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -------訂---------線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <223>設計爲3TD以放大細胞週期調節蛋白(cyclin)ADNA之部分的細 設計之寡核甞酸引子 ％ <400>53 gagttcgtgc cgtacaacta tttcacacag gaaacagcta tgacttacag atttagtgtc tctggtggg <21054 <211>16
60 69 121 - 1259204 A? B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（119) <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>設計爲]VI13RV-2N 16mer的經設計之寡核苷酸引子 <40054 aggaaacagc tatgac <210>55 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>設計爲M13M4-3N 16mer的經設計之寡核菩酸引子 <400>55 agggttttcc cagtcacgac <210>56 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>設計爲M13M4_3N 24mer的經設計之寡核菩酸引子 <40056 cgccagggtt ttcccagtca cgac <210>57 -122- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 16 20 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂-------- 線®#-· 24 1259204 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（12〇) <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>設計爲M13RV-3N 24mer的經設計之寡核甞酸引子 <400>57 tttcacacag gaaacagcta tgac 24 <210>58 <211>17 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>設計爲M13M4的經設計之寡核苷酸引子 <400>58 gttttcccag tcacgac 17 <210>59 <211>27 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體序列的經設計之寡核甞酸 引子 <40059 cagcaactgg gccagcaaag ttgagaa 27 -123- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---------訂·-------- 1259204
五、發明說明（121) <21060 <211>27 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>用以放大編碼部分人類鐵傳、# 引子 蛋白受 體序列的經設計之寡核甞酸 <400>60 gcaaaaacag aaagaaactg ctcagaa <210>61 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220〉 27 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 引子 <223>用以放大編碼部分人類鐵傳遞 I白受體序列的經設計之寡核甞酸 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <400>61 cagcaactgg gccagcaaag ttgaga <210>62 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220> 26 用紙届馬鐵類鐵傳遞蛋白受體序列的經設計之寡核嘗酸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規 線® •124-
1259204 五、發明說明（ 引子 <400>62 gcaaaaacag aaagaaactg ctcaga 26 <210>63 <211>25 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體序列的經設計之寡核 引子 <400>63 cagcaactgg gccagcaaag ttgag 25 <210>64 <211>25 <212>DNA <213>人工序列 <220> (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 訂---------線
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 引子 <223>用以放大編碼邵分人類鐵傳遞蛋白受體序列的經設計之寡核菩
<4〇〇>64 gcaaaaacag aaagaaactg ctcag <21065 <211>24 <212>DNA 25 酸 125- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） A7 B7 1259204 五、發明說明（123) <213>人工序列 <220> (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) <223>用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白文體序列的經設計之寡核芬酸 引子 <400>65 cagcaactgg gccagcaaag ttga 24 <210>66 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體序列的經設計之寡核答酸 引子 <400>66 gcaaaaacag aaagaaactg ctca 24 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <21067 <211>23 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體序列的經設計之寡核：y：酸 引子 <400>67 cagcaactgg gccagcaaag ttg 23 -126- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 χ 297公釐） ' " 1259204 A7 B7 五、發明說明（124) <210>68 <211>23 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>用以放大編碼部分人類鐵傳遞蛋白受體序列的經設計之寡核甞酸 引子 <400>68 gcaaaaacag aaagaaactg etc 23 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-_1 ϋ 1- 1- ϋ ·ϋ 1_1 一 口 V I n tmmf i^i i·— ϋ I— 11 I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -127- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims (1)

  1. A B c D 六、申請專利範圍厂―，—一——一Ί …瓜太i 「厶‘、u 乂叫 L—a—….—」 1. 一種增幅核酸序列用或大量製造核酸用之方法，其特徵 包含以下步驟·· (a) 將作為模板之核酸、去氧核醣核芬三鱗酸、具有 股置換活性之DNA聚合酶、至少1種類之引子以及會切 斷由此引子所生成之加長鏈的核醣核酸内切酶加以混 合以製備反應混合物之步驟；在此處之該引子係與作 為模板之核酸的鹼基序列實質上互補，其含有去氧核 酶核酸以及核聽核酸，且該核醣核酸為配置於該引子 的3’末端或3,末端侧之嵌合募核甞酸，在此，該核醣 核酸之長度為Imer〜15mer ;以及 (b) 以可進行以下反應之條件下，使反應產物可生成 之充分時間，以2 0〜8 0 °C之等溫條件下孵育反應混合 物之步驟：引子對模板核酸之專一性連結反應、利用 D N A聚合酶進行之加長鏈合成反應及股置換反應、藉 由核醣核酸内切酶進行之加長鏈之切斷反應。 2·如申請專利範圍第1項之方法，其中該含有核醣核酸之 部位係可利用核醣核酸内切酶切斷。 3·如申請專利範圍第1項之方法，其中進一步使用含有具 有與模板核酸之鹼基序列實質上相同之序列的嵌合募核 棼酸引子之反應混合物。 4 · 一種核酸序列增幅用或大量製造核酸用之方法，其特徵 包含以下步驟： (a)藉由將作為模板之核酸以與該核酸之驗基序列實 63263-940726.doc _ 1 _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A8 B8 C8 1259204 申叫專利祀圍 貝地互補之至少1種類之引子及DNA聚合酶進行處理， 而合成與上述模板互補之引子加長鏈之步驟；在此處之 5亥引子為含有去氧核醣核酸以及核醣核酸之嵌合募核芬 酉文引子，該核醣核酸係配置於該引子的3，末端或3，末端 側’在此’該核醣核酸之長度為1 m e r〜1 5 m e r ; (b) 將（a)步驟所得到之雙股核酸引子的加長鏈之含有 核醣核酸之部位，以核醣核酸内切酶切斷之步驟，以及 (c) 由（b)步驟得到之引子的加長鏈所被切下來之雙股 核酸之引子部分的3，末端開始，利用具有股置換活性之 DNA聚合酶，將與模板互補之核酸序列加長，並進行股 置換之步驟； 其中各步驟係可以2 〇〜8 〇 t之等溫條件下進行以下反 應之實施：引子對模板核酸之專一性連結反應、利用 DNA聚合酶進行之加長鏈合成.反應及股置換反應、藉 由核醣核酸内切酶進行之加長鏈之切斷反應。 5 ·如申請專利範圍第4項之方法，其中⑻步驟與⑷步驟 係連續地反復進行。 6 ·如申請專利範圍第4項之方法，其係於步驟（b)中再度 利用含有再生之引子加長鏈的雙股核酸，且其進一步包 含以下工程： (d)以（c)步驟所得到之游離之取代鏈作為模板，利 用與⑷步驟所使用之引子相異之至少1種引子，以及 DNA聚合酶共同處理，以合成與取代鏈互補之引子加長 63263-940726.doc . 2 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 8 8 8 8 A B c D 1259204 々、申請專利範圍 鏈之步驟；在此所謂與（a)步驟所使用之引子相異之引 子係與取代鏈之鹼基序列實質上互補且含有去氧核醣核 酸以及核醣核酸之嵌合寡核甞酸引子，該核醣核酸係配 置於該引子的V末端或V末端側，在此，該核醣核酸之 長度為lmer〜15mer ; (e) 將（d)步驟所得到之雙股核酸引子的加長鏈之含有 核醣核酸之部位，以核醣核酸内切酶切斷之步驟；以及 (f) 由（e)步驟得到之引子的加長鏈所被切下來之雙股 核酸之引子部分的3 ’末端開始，利用具有股置換活性之 DNA聚合酶，將該與模板互補之核酸序列加長，並進行 股置換之步驟；且該包含再生之引子的加長鏈之雙股核 酸係再度利用於（e)步驟之步驟。 7. 如申請專利範圍第1或4項之方法，其中使用具有股置 換活性之1種的DNA聚合酶進行。 8. 如申請專利範圍第1或4項之方法，其中該核醣核酸係 因藉由核醣核酸内切酶之切斷而配置。 9. 如申請專利範圍第1或4項之方法，其中該DNA聚合酶 係指由獲得自大腸菌之DNA聚合酶I的Klenow片段、獲 得自史泰洛嗜熱桿菌（Bacillus stearothermophilus)之 5 * 3 1核酸外切酶缺失Bst DNA聚合酶以及獲得自卡多 提那克斯桿菌（Bacillus caldotenax)之5 * 3 ’核酸外切酶 缺失Bca DNA聚合酶所構成之群組中所選擇之DNA聚合 酶0 63263-940726.doc - 3 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）
    ABCD 1259204 申請專利範圍 10·如申請專利範圍第1或4項之方法，其中該核醣核酸内 切酶係RNaseH。 U·如申請專利範圍第1或4項之方法，其中該嵌合募核甞 酸引子係含有連續2個殘基以上之核醣核酸。 12·如申請專利範圍第1或4項之方法，其中該嵌合募核嘗 酸引子係含有1個以上之修飾核醣核酸。 13·如申請專利範圍第12項之方法，其中該嵌合寡核茹酸引 子係3有以硫原子取代結合於核醣核酸的α位置構原 子之氧原子之（a - S )核醣核酸。 14. 如申請專利範圍第i或4項之方法，其中該模板核酸係 單股或雙股DNA 〇 15. 如申請專利範圍第14項之方法，其中係於將作為模板之 雙股DNA變成單股DNA之步驟後進行。 16. 如申請專利範圍第14項之方法.，纟中該模板核酸係由 RNA利用逆轉錄反應所得到之eDNA 〇 Π.如申請專利範圍第16項之方法，丨中係於藉由以囊作 為模板之逆轉錄反應合成eDNA之步驟後進行。 18.如申請專利範圍第17項之方法，其中逆轉錄反應用引子 係由寡dT引子、隨意（random)引子或者專一性引子所構 成之群組所選擇者。 •如申請專利範圍第17項之方法’其中逆轉錄反應用引子 係嵌合募核菩酸引子。 20.如申請專利範圍第17項之方法，其中係使用具有逆轉 63263-940726.doc -4 8 8 8 8 ABCD 1259204 六、申請專利範圍 錄酵素活性之DNA聚合酶作為逆轉錄酵素。 21·如申請專利範圍第1 7項之方法，其中逆轉錄反應以及 與模板互補之加長鍵之合成係藉由具有逆轉錄酵素活性 以及股置換活性之1種的DNA聚合酶進行。 22. 如申請專利範圍第21項之方法，其中所使用之該DNA聚 合酶係獲得自史泰洛嗜熱桿菌（Bacillus stearothermophilus) 之尸-> 3 ’核酸外切酶缺失Bst DNA聚合酶或者獲得自卡 多提那克斯桿菌（Bacillus caldotenax)之V 3 *核酸外切酶 缺失BcaDNA聚合酶。 23. 如申請專利範圍第1 7項之方法，其中作為逆轉錄反應 之模板的RNA係於核酸增幅反應中所增幅之RNA。 24. 如申請專利範圍第23項之方法，其中係於藉由以RNA作 為模板之核酸增幅反應增幅之RNA片段合成步驟之後實 施。 25. 如申請專利範圍第23項之方法，其中核酸增幅反應係由 轉錄增幅系統（TAS; transcription-based amplification system) 法、自主序列複製（3SR; self-sustained sequence replication) 法、NASBA(nucleic acid sequence-based amplification)法、 TMA( transcription-mediated amplification)法或者 Q /3 複製 酶法中任一者所選擇者。 26·如申請專利範圍第14項之方法，其中模板核酸係利用核 酸增幅反應所獲得之DNA。 27.如申請專利範圍第26項之方法，其中係於藉由以DNA作 63263-940726.doc - 5 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1259204 έ88 C8 D8 六、申請專利範圍 為模板之核酸增幅反應的增幅DNA片段合成步驟之後實 施。 28. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該核酸增幅反應係 由聚合酶鏈顧反應（PCR; polymerase chain reaction)法、 結合酶鏈鎖反應（LCR; ligase chain reaction)法、 SDA(strand displacement amplification)法之任一者戶斤選擇 者。 29. 如申請專利範圍第2 6項之方法，其中核酸增幅反應係 使用隨意（random)引子或簡併（degenerate)引子所進行 者。 30. 如申請專利範圍第29項之方法，其中隨意引子或簡併引 子係至少在其3 ’末端或者3 ’末端側具有隨意序列或簡併 序列之引子。 31· —種用於申請專利範圍第1或4項之增幅核酸序列用或 大量製造核酸用之方法的嵌合寡核茹酸引子，其係含有 1個以上之修飾核醣核酸。 32. 如申請專利範圍第31項之嵌合募核茹酸引子，其中係含 有以硫原子取代結合於核醣核茹三磷酸的α位置磷原子 之氧原子之（α - S )核醣核酸作為修飾核醣核酸。 33. —種用於檢測試劑中標的核酸之方法，其係包含： (a) 利用申請專利範圍第1或4項之增幅核酸序列用或大 量製造核酸用之方法，將標的核酸增幅之步驟；以及 (b) 檢測（a)步驟所增幅之標的核酸之步驟。 -6 - 63263-940726.doc 本紙張尺度適财_ $_(CNS) A4^(21G〉〈 297公嫠) 1259204 - C8 D8 六、申請專利範圍 34. 如申請專利範圍第33項中之方法，其係以可成為消光狀 態之距離下所配置之2種類以上之螢光物質，檢測利用 所標誌之核醣核酸（RNA)探針所增幅之標的核酸。 35. —種用於申請專利範圍第1、4或33項之方法之套組，其 特徵係在包裝型態中，含有： (a) 具有股置換活性之DNA聚合酶； (b) 核醣核酸内切酶；以及 (c) 股置換反應用緩衝液。 36·如申請專利範圍第3 5項之套組，其係含有指示有關股 置換反應中DNA聚合酶以及核酸内切酶之使用之說明 書。 37. 如申請專利範圍第35項之套組，其中含有由獲得自大腸 菌之DNA聚合酶I的Klenow片段、獲得自史泰洛嗜熱桿 菌（Bacillus stearothermophilus)之 5 · ~> 3 f 核酸外切酶缺失 Bst DNA聚合酶以及獲得自卡多提那克斯桿菌（Bacillus caldotenax)之5 ’ 4 3 1核酸外切酶缺失Bca DNA聚合酶所構 成之群組中所選擇之DNA聚合酶作為DNA聚合酶。 38. —種用於申請專利範圍第35項之套組，其中含有RNaseH 作為核醣核酸内切酶。 39. —種用於申請專利範圍第1、4或33項之方法之組合物， 其包含： (a) 具有股置換活性之DNA聚合酶； (b) 核醣核酸内切酶；以及 63263-940726.doc - 7 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A BCD 1259204 六、申請專利範圍 (C)股置換反應用緩衝液。 40. 如申請專利範圍第3 9項之組合物，其中含有由獲得自大 腸囷之DNA聚合酶I的Klenow片段、獲得自史泰洛嗜熱 才干囷（8&〇111115 51631：〇1；1161*1110卩1111115)之5’—>3’核酸外切 酶缺失B s t D N A聚合酶以及獲得自卡多提那克斯桿菌 (Bacillus caldotenax)之 5，— 3,核酸外切酶缺失Bca DNA聚合酶所構成之群組中所選擇之dnA聚合酶作為 D N A聚合酶。 41. 如申請專利範圍第39項之組合物，其中含有RNaseH作為 核酶核酸内切酶。 42. —種將核酸於特定之區域上排列之核酸固定化物質之製 備方法，其係包含： (a) 利用申請專利範圍第1或4項之增幅核酸序列用或大 量製造核酸用之方法，將應該固定化之核酸增幅之步 驟；以及 (b) 將（a)步驟所增幅之核酸，於載體上之特定區域上 排列並固定化之步驟。 43·如申請專利範圍第42項之將核酸於特定之區域上排列之 核酸固定化物質之製備方法’其中將實質上不含其互補 鏈之單股核酸加以增幅，並於特定之區域上將其排列並 固定化。 44.種將藉由申凊專利範圍第4 2項之方法所製作之核酸 於特定之區域上排列之核酸固定化物質，其特徵係將單 63263-940726.doc _ Q _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇 χ 297公釐) 1259204
    股核酸於特定之區域上排列並固定化者。 如申請專利範圍第44項之將核酸於特定之區域上排列之 ㈣固定化物質’其中實質上不含其互補鏈之單股核酸係於特定之區域上排列並固定化。 一種用以檢測試劑中之標的核酸檢測方法，其包含··(a) 由β式劑製備可能包含標的核酸之核酸試劑之步驟； (b) 將該核酸試劑與申請專利範圍第42項之方法所製得 之核酸固定化物質相接觸之步驟；(c) 檢測與核酸固定化物質中之核酸雜合之該核酸試劑 中之標的核酸之步驟。 47· —種用以決定核酸之鹼基序列之方法，其特徵包含將申 "月專利範圍苐1或4項之方法之核酸序列加以增幅之步驟。 48·種用以檢測標的核酸之變異之方法，其特徵包含將申 "月專利範圍第1或4項之方法之核酸序列加以增幅之步 驟。 45. 46. 63263-940726.doc -9 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)
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