WO2005056790A1 - 核酸の増幅方法 - Google Patents

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WO2005056790A1
WO2005056790A1 PCT/JP2004/018137 JP2004018137W WO2005056790A1 WO 2005056790 A1 WO2005056790 A1 WO 2005056790A1 JP 2004018137 W JP2004018137 W JP 2004018137W WO 2005056790 A1 WO2005056790 A1 WO 2005056790A1
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nucleic acid
primer
chimeric oligonucleotide
ladder
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Takashi Uemori
Osamu Takeda
Junko Yamamoto
Hiroyuki Mukai
Kiyozo Asada
Ikunoshin Kato
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Takara Bio Inc.
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    • C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a target nucleic acid useful in the clinical field and a method for synthesizing a DNA useful in the field of genetic engineering, and relates to a method for amplifying a type III nucleic acid and a target nucleic acid amplified by the method.
  • the detection method relates to a method for amplifying a type III nucleic acid and a target nucleic acid amplified by the method.
  • the above method requires the use of an expensive thermal cycler that can perform strict temperature adjustment over a wide temperature range with time.
  • the reaction requires a time required to reach a set temperature for performing two kinds of three kinds of temperature conditions, and the loss time increases in proportion to the number of cycles.
  • primer extension In these reactions of the isothermal nucleic acid amplification method or the oligonucleotide synthesis method, primer extension, primer ringing to a single-stranded extension product (or original target sequence), and Subsequent primer extension occurs simultaneously in the reaction mixture, which is kept at a constant temperature.
  • the ICAN method described in Patent Document 4 is a nucleic acid amplification method using chimeric oligonucleotide primers.
  • the improved SDA method described in Patent Document 6 above requires a restriction enzyme that generates a 3 'protruding end.
  • the improved SDA method described in Patent Document 7 requires at least two primer pairs.
  • the improved SDA method described in Patent Document 8 requires at least two sets of primers and at least one kind of modified deoxyribonucleotide triphosphate.
  • Patent Document 11 The method described in Patent Document 11 is the same as the method described in Patent Document 12, except that the chimera oligonucleotide primer and the type III nucleic acid at the position where the primer hybridizes are used.
  • an upstream oligonucleotide primer that hybridizes to the 3 ′ side is used in combination.
  • the ladder-forming oligonucleotide primer consists only of a sequence that hybridizes to the type I strand.
  • the conventional isothermal nucleic acid amplification method still has various problems, and a method capable of achieving high sensitivity with high efficiency has been demanded.
  • Patent Document 3 International Publication No. 00Z28082 pamphlet
  • Patent Document 4 International Publication No. 00Z56877 pamphlet
  • Patent Document 7 International Publication No.95Z25180 pamphlet
  • Patent Document 8 International Publication No.99Z49081 pamphlet
  • Patent Document 9 International Publication No. 95Z03426 pamphlet
  • Patent Document 10 International Publication No.95Z25180 pamphlet
  • Patent Document 11 JP-A-2003-52380
  • Non-patent literature l Hafner G. J. and 4 others, BioTechniques, vol. 30 (2001) p852 -867
  • a main object of the present invention is to provide a method for amplifying a target nucleic acid in which a target nucleic acid in a sample is amplified with high sensitivity and specificity, and a composition and a kit for these methods.
  • the chimeric oligonucleotide primer comprises at least two types of primers, a first chimeric oligonucleotide primer complementary to the base sequence of the nucleic acid to be type III, and a second chimeric oligonucleotide primer homologous to the base sequence of the nucleic acid to be type III.
  • the nucleic acid to be type II is RNA, and the nucleic acid is previously converted to deoxyribonucleotide triphosphate, a DNA polymerase having reverse transcription activity, and at least one kind of nucleic acid. It may be treated with a ladder-forming oligonucleotide primer to obtain a reverse transcript.
  • the reaction mixture in step (A) may further contain a DNA polymerase having reverse transcription activity.
  • the second invention of the present invention is a composition for the method of the first invention of the present invention, each comprising at least one kind of chimeric oligonucleotide primer and Z or ladder-forming oligonucleotide primer.
  • a composition comprising:
  • the third invention of the present invention is a kit for the first invention of the present invention, wherein each kit contains at least one kind of chimeric oligonucleotide primer and Z or ladder-forming oligonucleotide primer. About.
  • a fourth invention of the present invention relates to a method for detecting a target nucleic acid, comprising the following steps.
  • a fifth invention of the present invention is a primer used in the method of the first invention of the present invention, which has a base sequence on the 5 'side of a primer homologous to a nucleic acid to be type III,
  • the nucleic acid is characterized in that it has a nucleotide sequence on the 5 'side that is complementary to a nucleotide sequence corresponding to a region further 5' from the 5 'end of the region homologous to the second chimeric oligonucleotide primer or both of them.
  • Oligonucleotide primers Oligonucleotide primers.
  • the present invention provides an amplification method superior to the conventional isothermal nucleic acid amplification method, and a composition and a kit containing primers for use in the method.
  • FIG. 1 is a diagram relating to the positional relationship among a first chimeric oligonucleotide primer, a second oligonucleotide primer, and a ladder-forming oligonucleotide primer used in Example 2- (1)
  • A shows the first chimeric oligonucleotide primer
  • (b)-(d) shows the ladder-forming oligonucleotide primer
  • (e) shows the second chimeric oligonucleotide primer.
  • part 1 has a sequence homologous to one of the complementary strand 5 ′ upstream of (e).
  • FIG. 2 is a view showing an amplification curve at each copy number.
  • the horizontal axis is the reaction size.
  • the number of vehicles and the vertical axis indicate the fluorescence intensity.
  • a is 10 5 copy number
  • b is 10 4 copy number
  • c is 10 3 copy number
  • d is 10 2 copy number
  • e is 10 1 copy number
  • f is the 10 ° copy number ⁇ It is an amplification curve when there was.
  • deoxyribonucleotide refers to a nucleotide in which the sugar moiety is composed of D-2-deoxyribose. , Cytosine, guanine and thymine. Furthermore, those having a modified base such as 7-deazaguanosine, or deoxyribonucleotide analogs such as deoxyribonucleotide and deoxyinosine nucleotide having a functional group that can be used for immobilization are also described above. Included in deoxyribonucleotides.
  • a ribonucleotide refers to a nucleotide in which the sugar moiety is composed of D-ribose, and adenine, cytosine, guanine, and peracil are used as bases.
  • the ribonucleotide includes a modified ribonucleotide, for example, a modified ribonucleotide [( ⁇ -S) ribonucleotide in which the oxygen atom of the ⁇ -phosphate group is replaced with a sulfur atom (S), —S) N And other derivatives thereof.
  • chimeric oligonucleotide primer refers to a primer in which a ribonucleotide is located at the 3 'end or 3' end of the primer, the nucleic acid strand can be extended in the method of the present invention, cleavable with RNaseH, and This refers to an oligonucleotide primer capable of performing a substitution reaction, and any one having such a configuration is included in the chimeric oligonucleotide primer of the present invention.
  • the chimeric oligonucleotide primer used in the present invention is a chimeric oligonucleotide primer containing at least deoxyribonucleotides and nucleotide analogs and ribonucleotides.
  • the primers also include oligoribonucleotide primers containing unmodified ribonucleotides and Z or modified ribonucleotides.
  • the chimeric oligonucleotide primer used in the method of the present invention has a base sequence that is substantially complementary to a part of the base sequence of type III nucleic acid.
  • substantially complementary nucleotide sequence means a nucleotide sequence that can anneal to a type II DNA under the reaction conditions used.
  • the term "3 'side” refers to a nucleic acid, for example, a portion of a primer from its center to its 3' end.
  • the 5 'side refers to a portion of a nucleic acid from the center to the 5' end.
  • upstream region refers to a region further 5 'from the 5' end of the base sequence of the chimeric oligonucleotide primer in a ⁇ -shaped chain homologous to the chimeric oligonucleotide primer to be used.
  • upstream region refers to a region further 3 'from the 3' end of the sequence complementary to the base sequence of the chimeric oligonucleotide primer.
  • base sequence for ladder formation refers to the base sequence on the 5 'side of the chimeric oligonucleotide primer used in the method of the present invention, or the chimeric oligonucleotide primer of the nucleic acid to be type III
  • the position of the nucleotide sequence is represented by "0" indicating the 5 'end of the chimeric oligonucleotide primer used in the method of the present invention and the position of the ⁇ -type strand to which the chimeric oligonucleotide primer anneals with respect to the position.
  • the integers are “+1”, “+2”,... Sequentially toward the 3 ′ end of the chimeric oligonucleotide primer.
  • one base upstream from the “0” position of the nucleic acid to be type III is defined as “11”, and the integers are sequentially set as “12”, “13”,.
  • RNaseH ribonuclease H refers to a double-stranded DNA produced by elongating DNA from the chimeric oligonucleotide primer annealed to type III nucleic acid and acting on the ribonucleotide of the primer. What is necessary is to cut the portion specifically.
  • a DNA polymerase is a type in which a new DNA chain is Synthetic enzymes (DNA-dependent DNA polymerases) and enzymes (RNA-dependent DNA polymerases) that synthesize an RNA strand into a ⁇ -type and synthesize a DNA strand complementary to the RNA strand ⁇ Mutant enzymes having the above activities are also included.
  • the enzyme include a DNA polymerase having a strand displacement activity, 5, ⁇ 3, a DNA polymerase having no exonuclease activity, and a DNA polymerase having both a reverse transcriptase activity and an RNaseH activity.
  • strand displacement activity refers to a complementary strand that progresses while replacing a DNA strand and anneals to the ⁇ -type strand when performing DNA replication according to the ⁇ -type nucleic acid sequence. It refers to an activity capable of dissociating, ie, strand displacing.
  • a DNA strand that has released a nucleic acid sequence that has a ⁇ shape due to strand displacement is also referred to as a “substituted strand”.
  • reverse transcription activity refers to an activity capable of synthesizing a DNA strand complementary to the RNA strand using the RNA strand as a zeta.
  • the method of the present invention can be carried out using at least one chimeric oligonucleotide primer and at least one ladder-forming oligonucleotide primer, and further combining RNaseH and DNA polymerase.
  • a DNA polymerase having RNaseH activity can be used under the condition that RNaseH activity is expressed.
  • nucleic acids are continuously amplified under isothermal conditions.
  • continuous means that the reaction is proceeding without changing the reaction temperature and the composition of the reaction solution.
  • isothermal means a substantially constant temperature condition under which the enzyme and the nucleic acid chain function in each of the following steps.
  • nucleic acid to be type ⁇ (a) treating the nucleic acid to be type ⁇ with deoxyribonucleotide triphosphate, a DNA polymerase having reverse transcription activity, and at least one ladder-forming oligonucleotide primer to obtain a reverse transcript;
  • the chimeric oligonucleotide primer contains at least a deoxyribonucleotide and a ribonucleotide whose nucleotide analog power is also selected, and the ribonucleotide is located at the 3 ′ end or 3 ′ end of the primer.
  • Ladder-like amplification products are obtained under a certain temperature condition that allows specific annealing of primers to nucleic acid to be type I, extension strand synthesis reaction and strand displacement reaction by DNA polymerase, and extension strand cleavage reaction by RNaseH. Incubating the reaction mixture for a time sufficient to produce
  • the chimeric oligonucleotide primer is at least deoxyribonucleotide.
  • a ribonucleotide wherein the tide and nucleotide analogs are also selected and the ribonucleotide is located at the 3 ′ end or 3 ′ end of the primer,
  • the chimeric oligonucleotide primer comprises at least two types of primers, a first chimeric oligonucleotide primer complementary to the base sequence of the nucleic acid to be type III, and a second chimeric oligonucleotide primer homologous to the base sequence of the nucleic acid to be type III.
  • the ladder-forming oligonucleotide primer has a region complementary to the first chimeric oligonucleotide primer of the type III nucleic acid and a base sequence 3 ′ to the region, and is homologous to the type III nucleic acid.
  • the base sequence on the 5th side of the second chimeric oligonucleotide primer, the region further upstream from the 5 'end of the region of the type II nucleic acid that is homologous to the second chimeric oligonucleotide primer (ie, the region in the 5' direction) ) Has a base sequence complementary to both at the 5 ′ side.
  • nucleic acid to be type ⁇ deoxyribonucleotide triphosphate, DNA polymerase having strand displacement activity, at least two types of chimeric oligonucleotide primers, at least one type of ladder-forming oligonucleotide primer, and RNaseH Preparing a reaction mixture by performing
  • Ladder-like amplification products are obtained under a certain temperature condition that allows specific annealing of primers to nucleic acid to be type I, extension strand synthesis reaction and strand displacement reaction by DNA polymerase, and extension strand cleavage reaction by RNaseH. Incubating the reaction mixture for a time sufficient to produce
  • the chimeric oligonucleotide primer contains at least a deoxyribonucleotide and a ribonucleotide whose nucleotide analog power is also selected, and the ribonucleotide is located at the 3 ′ end or 3 ′ end of the primer.
  • the chimeric oligonucleotide primer comprises at least two types of primers, a first chimeric oligonucleotide primer complementary to the base sequence of the nucleic acid to be type III, and a second chimeric oligonucleotide primer homologous to the base sequence of the nucleic acid to be type III.
  • the ladder-forming oligonucleotide primer is the first chimera of a nucleic acid to be type III.
  • the first chimeric oligonucleotide primer when the nucleic acid to be type III is single-stranded, has a base sequence complementary to the strand.
  • the second chimeric oligonucleotide primer has a base sequence complementary to the complementary strand of the strand, that is, homologous to the strand.
  • the ladder-forming oligonucleotide primer further comprises a base sequence complementary to the strand, a base sequence on the 5 ′ side of the second chimeric oligonucleotide primer homologous to the strand, and a fifth end of the second chimeric oligonucleotide primer.
  • a primer can be similarly designed on either one of the strands! /.
  • dNTP used in PCR or the like ie, a mixture of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, used as a nucleotide triphosphate serving as a substrate for the extension reaction
  • DUTP may be used as a substrate.
  • the dNTP is used to As long as it is a substrate for limerase, it may contain an analog of dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate), for example, a nucleotide triphosphate such as 7-deza-dGTP or dITP.
  • a derivative having a functional group for example, dUTP having an amino group may be included, even if a derivative of dNTP or a derivative of dNTP analog is used.
  • the ability to use a chimeric oligonucleotide primer The primer can be prepared, for example, using a DNA synthesizer or the like in the same manner as in a usual synthesis method.
  • the nucleic acid that becomes type II may be prepared or isolated from any sample that may contain the nucleic acid. Further, the above sample may be directly used for the nucleic acid amplification reaction of the present invention.
  • the sample containing such a nucleic acid is not particularly limited, but includes, for example, whole blood, serum, buffy coat, urine, feces, cerebrospinal fluid, semen, saliva, tissue (eg, cancer tissue, lymph node, etc.) Biological samples such as cell cultures (eg, mammalian cell cultures, bacterial cultures, etc.), nucleic acid-containing samples such as viroids, viruses, bacteria, molds, yeasts, plants and animals, viruses or bacteria.
  • a cell lysate or a sample obtained by fractionating the same for example, a nucleic acid in the sample, or a specific nucleic acid molecule group, for example, a sample enriched in mRNA can be used in the present invention.
  • nucleic acids such as DNA or RNA obtained by amplifying a nucleic acid contained in the above sample by a known method can also be suitably used.
  • the preparation of a nucleic acid-containing preparation having these material strengths is not particularly limited, and can be performed by, for example, dissolution treatment with a surfactant, ultrasonic treatment, shaking and stirring using glass beads, use of a French press, and the like. .
  • it may be advantageous to further manipulate the nucleic acid to purify it eg, when an endogenous nuclease is present).
  • the nucleic acid is purified by a known method such as phenol extraction, chromatography, ion exchange, gel electrophoresis or density gradient centrifugation.
  • the method of the present invention may be carried out using cDNA synthesized by reverse transcription reaction using the RNA as a type II.
  • the RNA that can be applied to the method of the present invention is not particularly limited as long as a primer used for the reverse transcription reaction can be prepared, and in addition to total RNA in a sample, mRNA, tRNA, rRNA, etc. RNA molecule group or a specific RNA molecular species.
  • a DNA polymerase derived from a bacterium belonging to the genus Thermus (such as Tth DNA polymerase) or a DNA polymerase derived from a bacterium belonging to the thermophilic bacillus genus can be used.
  • B. st-derived DNA polymerase (Bst DNA polymerase), which is preferably a DNA polymerase derived from a thermophilic Bacillus bacterium, and Bca DNA polymerase are more preferable.
  • Bca DNA polymerase does not require manganese ions for the reverse transcription reaction, and can synthesize cDNA while suppressing the secondary structure formation of type II RNA under high temperature conditions.
  • the enzyme having the above reverse transcriptase activity both natural and mutant enzymes can be used within the range having the activity.
  • the chimeric oligonucleotide primer used in the method of the present invention is not particularly limited, but is preferably about 6 to about 50 bases, more preferably about 10 to about 40 bases, and particularly preferably about 12 to about 40 bases. Oligonucleotides of about 30 bases are used as the chimeric oligonucleotide primers of the present invention.
  • the base sequence is preferably a sequence complementary to the ⁇ nucleic acid so that it anneals to the ⁇ nucleic acid under the reaction conditions used.
  • the primer contains a sequence recognized by RNaseH used in a step described later at the 3 ′ terminal or 3 ′ terminal.
  • b may be an integer of 1 or more, for example, in the range of 115, preferably in the range of 110, more preferably in the range of 117, particularly preferably in the range of 115.
  • c may be 0 or an integer of 1 or more, preferably in the range of 0-5, more preferably in the range of 0-3.
  • the ladder-forming oligonucleotide primer is annealed to the type II RNA under the reaction conditions that can be used as the reverse transcription primer. It is not particularly limited as long as it is!
  • the primer may be an oligo dT (deoxythymine) primer or a primer having a random sequence (random primer) in addition to a primer having a base sequence complementary to a specific type I RNA (specific primer).
  • the length of the portion complementary to a portion of the base sequence of the nucleic acid to be type II is preferably at least 6 nucleotides from the viewpoint of performing specific annealing.
  • RNA RNA
  • oligonucleotide synthesis preferably 100 nucleotides or less, more preferably 30 nucleotides or less. That is, reversal from RNA There is no particular limitation as long as it can be used for a copying reaction.
  • the ladder-forming oligonucleotide primer is not particularly limited as long as it can contribute to elongation of the ladder-like DNA chain depending on the conditions used.
  • the primer has a base sequence at the 5 ′ side of the chimeric oligonucleotide primer homologous to the nucleic acid to be type III, a base sequence corresponding to a region further upstream from the 5 ′ end of the chimeric oligonucleotide primer, or both.
  • sequence complementary to the upstream region of the chimeric oligonucleotide primer which preferably has a base sequence complementary to the above, is not particularly limited, but is preferably about 3 to about 100 nucleotides, more preferably Has a base length of about 4 to about 50 nucleotides, particularly preferably about 5 to about 20 nucleotides.
  • the sequence complementary to the upstream region of the chimeric oligonucleotide primer is not particularly limited, but is a sequence of 3 or more bases, and preferably +1580, at which a + 20-1-100 position force is also selected.
  • the base sequence is not particularly limited, but includes, for example, a region where the force at the -1 position, the -11 position, and the -21 position also starts.
  • the ladder-forming oligonucleotide primer used in the method of the present invention may contain a nucleotide analog or another substance. That is, the ladder-forming oligonucleotide primer of the present invention can contain one or more nucleotide analogs as long as the DNA polymerase also causes the 3′-end force of the polymerase extension reaction so that the function of the primer is not lost. Nucleotide analogs can be used in combination of a plurality of types. Examples of the nucleotide analog include, but are not particularly limited to, deoxyinosine nucleotide and deoxyperacyl nuclease.
  • Nucleotide analogs having a modified base such as nucleotide or 7-deazaguanine, nucleotide analogs having a ribose derivative, and the like can be used.
  • the chimeric oligonucleotide primer used in the present invention has various modifications, for example, the addition of a labeling compound or the like, or the addition of a functional group for immobilization within a range that retains the above functions. Oxynucleotides, ribonucleotides, and nucleotide analogs.
  • nucleotide analog into a primer is also effective in suppressing the formation of a higher-order structure of the primer itself and stabilizing the formation of annealing with type III.
  • a ladder-like amplification product can be obtained by using the nucleotide sequence originally present in the nucleic acid to be type III.
  • the ladder formation can be carried out using a base sequence on the nucleic acid to be type III.
  • the nucleotide sequence at the 5 ′ side or upstream of one chimeric oligonucleotide primer to be set The base at the 5 side or upstream of the other chimeric oligonucleotide primer to be set
  • a ladder-like amplification product can be obtained efficiently by setting chimeric oligonucleotide primers in the above arrangement.
  • detection sensitivity and detection speed are improved.
  • the complementary base sequence at the 5 'side or upstream of both chimeric oligonucleotide primers on the nucleic acid of type I above is the GC content, its adjacent sequence, the distance from the primer, the amplification,
  • the length can be arbitrarily set depending on the length, reaction conditions, etc., and is not particularly limited. For example, it is preferable to select from a complementary base sequence of 3 bases or more, preferably 6 bases or more.
  • the sequence is not particularly limited, For example, when the terminal 5 and the end of the chimeric oligonucleotide primer are located at position 0, a region of + 20—100, preferably a region of + 15——80, more preferably a region of + 10——60, particularly preferably +5 to 11 forty areas.
  • the complementary sequence 5 'to or upstream of both chimeric oligonucleotide primers on the nucleic acid of type I is its GC content, its adjacent sequence, the distance to the primer, the length to be amplified. It can be arbitrarily set depending on reaction conditions and the like, and is not particularly limited, but a range of complementarity of 70% or more is preferable.
  • the ladder-forming oligonucleotide primer used in the method of the present invention is not limited in any way! /, But the ladder-forming oligonucleotide primer is used in the examples described below as an example. explain.
  • the 11th to 12th bases of A12-205R are the same as the 5th end of the second chimeric oligonucleotide primer (134FN3 (18); SEQ ID NO: 7 in the sequence listing). It is a nucleotide sequence complementary to the 12 base upstream region (111--12), and the 13th to 30th bases are complementary to the first chimeric oligonucleotide primer (205RN3 (18); SEQ ID NO: 2 in the sequence listing). This is a sequence complementary to the region. In other words, the 13th to 30th bases are sequences homologous to the first chimeric oligonucleotide primer.
  • the 11th to 12th bases of A12-215R are the same as the 5th end of the second chimeric oligonucleotide primer (134FN3 (18); SEQ ID NO: 7 in the sequence listing). It is a nucleotide sequence complementary to the 12-base upstream region (111--12), and the 13th to 30th bases are 5 'of the first chimeric oligonucleotide primer (205RN3 (18); SEQ ID NO: 2 in the sequence listing). It is a sequence complementary to the region complementary to the 8 bases on the side and the 10 bases 3 'side of the region complementary to the first chimeric oligonucleotide primer.
  • the 13th to 30th base is also homologous to the sequence of the 8 bases on the 5 ′ side of the first chimeric oligonucleotide primer at the 10th base upstream of the first chimeric oligonucleotide primer.
  • the 13th to 30th bases are homologous to the sequence from the 18th base upstream to the 1st base upstream of the first chimeric oligonucleotide primer.
  • A12—223R and 205RN3 (18) are adjacent.
  • the 11th to 12th bases of A12 (-10) -215R are 5 'of the nickle oligonucleotide primer (134FN3 (18); SEQ ID NO: 7 in the sequence listing). It is a nucleotide sequence complementary to the region 11 to 22 bases upstream from the end (1111-22), and the 13th to 30th bases are the first chimeric oligonucleotide primer (205RN3 (18); It is a region complementary to the 5'-side 8 bases of No. 2) and a sequence complementary to the 10 bases 3'-side from the region complementary to the first chimeric oligonucleotide primer.
  • the 11th to 12th bases of A12 (6) -215R are 5 'of the second chimeric oligonucleotide primer (134FN3 (18); SEQ ID NO: 7 in the sequence listing).
  • the 13th to 30th bases are a region complementary to the 8 ′ base on the 5 ′ side of the first chimeric oligonucleotide primer (205 RN3 (18); SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) and the first chimeric oligo.
  • the base No. 16 of A6 (1-10) -215R is the 5th base of the second chimeric oligonucleotide primer (134FN3 (18); SEQ ID NO: 7 in the sequence listing).
  • a nucleotide sequence complementary to the 11-11 base upstream region (1-11-1-16) from the end, and the 7th to 24th base is the first chimeric oligonucleotide primer (205RN3 (18); A region complementary to the 8 'base on the 5' side of No. 2) and a sequence complementary to the sequence of 10 bases 3 'from the region complementary to the first chimeric oligonucleotide primer.
  • the 10th to 27th bases are homologous to the sequence of 8 bases on the 5 ′ side of the first chimeric oligonucleotide primer from the 10th base upstream of the first chimeric oligonucleotide primer.
  • the 13th to 29th bases are the first chimeric oligonucleotide primers of a certain nucleic acid (ICAN-AL DH2-R A sequence complementary to a region complementary to 15 bases on the 5 'side of SEQ ID NO: 22) in the sequence listing and to a sequence complementary to two bases 3' side from the region complementary to the first chimeric oligonucleotide primer.
  • ICAN-AL DH2-R A sequence complementary to a region complementary to 15 bases on the 5 'side of SEQ ID NO: 22
  • it is homologous to the sequence from the second base upstream of the first chimeric oligonucleotide primer to the 15 base on the 5 ′ side of the first chimeric oligonucleotide primer.
  • Bases 2-16 of ICAN-ALDH2-R overlap with bases 15-29 of ALDH2-TH1.
  • the 11th and 12th bases of ALDH2-TH2 are the 5 'and 5' ends of the second chimeric oligonucleotide primer (ICAN-ALDH2-F; SEQ ID NO: 21 in the sequence listing). It is a nucleotide sequence complementary to the 11-12 base upstream region (111-112), and the 13-29th base is the first chimeric oligonucleotide primer (ICAN-ALDH2-R; And a sequence complementary to a sequence complementary to the 6 bases on the 5 ′ side of SEQ ID NO: 22) and a 10 bases 3 ′ side from the region complementary to the first chimeric oligonucleotide primer.
  • the 13th to 29th bases are homologous to the sequence from the 10th base upstream of the first chimeric oligonucleotide primer to the 5'-side 6 bases of the first chimeric oligonucleotide primer.
  • Bases 2-7 of ICAN-ALDH2-R overlap with bases 23-28 of ALDH2-TH2.
  • the 11th to 12th bases of R2 (-13) A12-1 are located at the 5 'end of the nickle oligonucleotide primer (F2; SEQ ID NO: 31 in the sequence listing).
  • the base sequence is complementary to the base upstream region (111-112)
  • the 13th to 29th bases are complementary to the first chimeric oligonucleotide primer (R2; SEQ ID NO: 32 in the sequence listing).
  • This sequence is complementary to the base sequence 13 'to 29' 3 'from the base sequence.
  • the 13th to 29th bases are homologous to the sequence of the 13th to 29th bases upstream of the first chimeric oligonucleotide primer.
  • the 11th to 12th bases of R2 (-13) A12-2 are located at the 5 'end of the nickle oligonucleotide primer (F2; SEQ ID NO: 31 in the sequence listing).
  • the base sequence complementary to the 13–24 base upstream region (1 13 24), and the 13th–29th base is a sequence complementary to the first chimeric oligonucleotide primer (R2; SEQ ID NO: 32 in the sequence listing). It is a sequence complementary to the base sequence on the 3 'side of 13-29 bases.
  • the 13th to 29th bases are homologous to the sequence of the 13th to 29th bases upstream of the first chimeric oligonucleotide primer.
  • the ninth base in A9-215R (SEQ ID NO: 48 in the sequence listing) is located 19 bases upstream from the 5 'end of the second chimeric oligonucleotide primer (B134FN3; SEQ ID NO: 12 in the sequence listing).
  • the base sequence complementary to the region (111-1-9), and the 10th to 27th bases are the 5th base 8 bases of the first chimeric oligonucleotide primer (205RN3 (16); SEQ ID NO: 13 in the sequence listing).
  • a region complementary to the first chimeric oligonucleotide primer and a sequence of 10 bases 3 'to the region complementary to the first chimeric oligonucleotide primer are the first chimeric oligonucleotide primer (205RN3 (16); SEQ ID NO: 13 in the sequence listing).
  • the 7th to 24th bases are homologous from the 10th base upstream of the first chimeric oligonucleotide primer to the 8 bases on the 5th and 5th sides of the first chimeric oligonucleotide primer.
  • RNaseH used in the method of the present invention
  • any of RNaseH from room temperature to metathermic can be suitably used in the present invention.
  • RNaseHII derived from Thermococcus litorali s hereinafter referred to as Tli RNaseHII
  • Tli RNaseHII Thermococcus litorali s
  • Afu RNase HII the method described in Example 7 of the same pamphlet
  • Afu RNase HII prepared in the method of the present invention.
  • the DNA polymerase used in the present invention is not particularly limited as long as it has the above-described strand displacement activity.
  • Bacillus caldotenax (hereinafter, referred to as B. ca) or Bacillus stearo A mutant of a DNA polymerase derived from a thermophilic Bacillus bacterium such as Thermophilus (Bacillus stearothermophi lus, hereinafter referred to as B. st), which lacks 5 ′ ⁇ 3 ′ exonuclease activity, or E. coli (hereinafter, E. coli) Large fragment (tarnow fragment) of DNA polymerase I derived therefrom.
  • the DNA polymerase that can be used in the present invention those having normal temperature and heat resistance, and those having a deviation can be suitably used.
  • B. ca is a thermophilic bacterium with an optimal growth temperature of about 70 ° C.
  • Bca DNA polymerase derived from this bacterium has DNA-dependent DNA polymerase activity, RNA-dependent DNA polymerase activity (reverse transcription activity), It is known to have ⁇ 3, exonuclease activity, and 3, ⁇ 5, exonuclease activity.
  • the above-mentioned enzyme may be any of those obtained by purifying from the original source or recombinant proteins produced by genetic engineering.
  • the enzyme may be modified or modified by substitution, deletion, addition, or insertion by genetic engineering or other techniques.
  • BcaBEST DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.), which is a Bca DNA polymerase lacking exonuclease activity, and the like. Further, the enzyme can also be prepared from the microorganism described in Japanese Patent No. 2978001 by the method described in Japanese Patent No. 2978001.
  • DNA polymerases those having endonuclease activity under specific conditions, for example, RNaseH activity, are known.
  • a DNA polymerase can be used in the method of the present invention. That is, there is an embodiment in which the DNA polymerase is used under conditions such that RNaseH activity is expressed, for example, in the presence of Mn 2+ .
  • the method of the present invention can be carried out without adding the above RNaseH. That is, in the buffer containing Mn 2+ , the above-mentioned Bca DNA polymerase is RNaseH Can show activity.
  • the above embodiment is not limited to Bca DNA polymerase, and is known to have both RNaseH activity!
  • other known DNA polymerases such as Tth DNA polymerase derived from Thermus thermophilus. It can be used for the invention.
  • the reaction when a ladder-forming oligonucleotide primer is used, and when the first chimeric oligonucleotide primer also functions as the ladder-forming oligonucleotide primer, complementary
  • the reaction can be stabilized and the desired amplification product can be obtained efficiently by coexistence of a random primer in the reaction, even if there is an error! .
  • the random primer is not particularly limited, but for example, a random primer having a length of 6 to 19 bases can be suitably used.
  • the present invention provides a composition used in the above-described nucleic acid amplification method of the present invention or the nucleic acid detection method of the present invention.
  • the composition include those containing the ladder-forming oligonucleotide primer and Z or chimeric oligonucleotide primer, RNaseH, and DNA polymerase described in (1) above.
  • a buffer component, a magnesium salt, dNTP, or the like may be included as a component for performing the amplification reaction. Further, it may contain a modified deoxyribonucleotide or an analog of deoxynucleotide triphosphate.
  • buffer components and other additives can be used.
  • a composition suitable for the nucleic acid amplification method of the present invention and containing the various components described above may be mentioned.
  • the amplification reaction can be performed only by adding the leotide primer and the Z or ladder-forming oligonucleotide primer.
  • a composition containing a chimeric oligonucleotide primer suitable for amplification of the amplification target is preferable.
  • the present invention provides a kit used for the above-described nucleic acid amplification method of the present invention.
  • the kit comprises, in knocked-out form, instructions for use of a DNA polymerase, RNaseH, a chimeric oligonucleotide primer and a Z or ladder forming oligonucleotide primer in a strand displacement reaction.
  • a kit containing a DNA polymerase having strand displacement activity, RNaseH, and a buffer solution for strand displacement reaction is suitably used in the method of the present invention.
  • a commercially available DNA polymerase having strand displacement activity and Z or RNaseH may be selected and used according to the instruction.
  • RNA may contain a reagent for a reverse transcription reaction in the case where RNA is made into type III.
  • the DNA polymerase the DNA polymerase used in the present invention described in the above (1) can be selected.
  • RNaseH can be selected from the RNaseH described in (1) above.
  • the "instruction” is a printed matter that describes how to use the kit, for example, how to prepare a reagent solution for strand displacement reaction, recommended reaction conditions, and the like. In addition to those included in the label attached to the kit and the package containing the kit. It also includes information disclosed and provided through electronic media such as the Internet.
  • the kit of the present invention may contain a reaction buffer containing Bicine, Tricine, HEPES, a phosphate or a tris-hydrochloride buffer component, and an annealing solution. Further, a DNA polymerase RNaseH having a strand displacement ability may be contained. In addition, it may contain modified deoxyribonucleotides or analogs of deoxynucleotide triphosphates.
  • the kit used for the method for detecting a target nucleic acid may be a kit comprising chimera oligonucleotide primers and ladder-forming oligonucleotide primers suitable for amplifying the target nucleic acid, in addition to the above instructions, reagents for the amplification reaction. It may also contain a reagent for detecting the amplified target nucleic acid, for example, a probe or the like.
  • a target nucleic acid in a sample can be detected.
  • the detection method one embodiment of the detection method
  • the method for detecting a target nucleic acid of the present invention makes it possible to obtain information on specific bases on a gene such as point mutations and single nucleotide substitutions (SNPs).
  • the 3'-terminal portion of the chimeric oligonucleotide primer to be used should be located near a specific base to determine the target base sequence!
  • RNA sample can be detected from the nucleic acid sample with higher sensitivity.
  • RNaseH and DNA polymerase to be used are not particularly limited.
  • a combination of RNaseHII derived from a bacterium belonging to the genus Thermococcus and BcaBEST DNA polymerase is preferable.
  • the number of units that can be suitably used for both RNase H and DNA polymerase is expected to differ depending on the type.
  • the improvement of the detection sensitivity or the increase in the amount of amplification product is used as an index to evaluate the buffer. And the amount of enzyme added may be adjusted.
  • dUTP can be incorporated as a substrate during amplification of a target nucleic acid. Therefore, when dUTP is used as a substrate, the amplification product should be degraded using uracil N-glycosidase (UNG) to prevent false positives due to carryover contamination of the amplification product. Can be.
  • UNG uracil N-glycosidase
  • a nucleic acid having a specific size is detected by a known nucleic acid detection method, for example, electrophoresis.
  • a reaction product detection method a real-time detection using Smart Cycler (manufactured by Takara Bio Inc.), a Rotor gene (manufactured by CORBETT RESEARCH), a detection by hybridization with a probe, and the like can be used. Further, a detection method using a combination of magnetic beads and the like can also be suitably used.
  • the reaction solution may be made cloudy by making pyrrolic acid generated during the step of amplifying the target nucleic acid into an insoluble substance such as a magnesium salt, and the turbidity may be measured.
  • a fluorescent substance such as ethidium bromide is usually used.
  • hybridization with a probe may be used.
  • the probe may be labeled with a radioactive isotope or labeled with a non-radioactive label such as biotin or a fluorescent substance.
  • a coloring reagent of Cyber Green manufactured by Takara Bio Inc.
  • ⁇ It is possible to enhance a detection signal using the label, Further, detection using a fluorescence polarization method, fluorescence energy transfer, or the like can be performed. Furthermore, by constructing an appropriate detection system, it is possible to automatically detect a target nucleic acid or to quantify a target nucleic acid. In addition, a visual detection method using the Noto and Ibriddoku mouth mat methods can also be suitably used.
  • RNA probes labeled with two or more fluorescent substances and chimeric oligonucleotide probes composed of ribonucleotides and deoxyribonucleotides, which are arranged at a distance so as to be in the quenching state are used in the present invention.
  • RNaseH degrades the probe when it anneals to the amplified DNA derived from the target nucleic acid that is complementary to the probe.
  • the distance between the fluorescent substances on the probe is increased to emit fluorescence, and the presence of the target nucleic acid can be known.
  • the target nucleic acid can be detected only by adding the above probe to the reaction solution.
  • the fluorescent substance used for labeling the probe is, for example, ROX (manufactured by Applied Biosystems) or FAM (manufactured by Applied Biosystems), and the quenching substance is, for example, a combination of Eclipse (manufactured by Epoch Biosciences). A combination can be used preferably.
  • the above-mentioned ladder-forming oligonucleotide primer and Z or chimeric oligonucleotide primer can be used, and a polymer having a series of amplified regions is produced.
  • a ladder-like amplification product is connected in the same direction via a sequence complementary to the 5, 5 or the upstream region of the plurality of amplification region coding primer-forming oligonucleotide primers and the second chimeric oligonucleotide primer. It is a thing.
  • the base sequence on the 5 ′ side of one chimeric oligonucleotide primer or on the upstream thereof on the nucleic acid to be type III is the base sequence on the 5 ′ side or upstream of the other chimeric oligonucleotide primer.
  • the target nucleic acid can be detected with high sensitivity by setting a chimeric oligonucleotide primer at the position.
  • the number of units of heat resistance RNaseH in Examples was calculated by the following method. Lmg of poly (rA) and poly (dT) (both manufactured by Amersham Biotech)
  • the absorbance (A260) was measured over time, and the change was determined. That is, the concentration of nucleotides released from the poly (rA) -poly (dT) hybrid by the enzymatic reaction was determined from the difference in absorbance.
  • One unit of RNaseH is the amount of enzyme that increases A260 corresponding to the release of lnmol of ribonucleotide in 20 minutes, and is calculated according to the following formula.
  • RNA transcript used as RT-ICAN type I was synthesized by in vitro transcription.
  • plasmid DNA which is type II of in vitro transcription, was synthesized by requesting an artificial synthetic gene production service (Takara Bio Inc.).
  • the sequence used was 18133th to 18362th (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) of the SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome) coronawinores genome sequence (GenBank Acc. No .: AY278741).
  • SARS severe Acute Respiratory Syndrome coronawinores genome sequence
  • a Hindlll recognition sequence was added to the 5 ′ end of the sequence and a BamHI recognition sequence was added to the 3 ′ end. This fragment was inserted into HindIII and BamHI sites of pBluescriptll SK (+).
  • RNA Dilution Buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), lmM EDTA, lOmM NaCU 30 ⁇ g / ml E. coli 16S + 23S rRNA (Boehringer Inger The concentration was adjusted to 10 ⁇ 10 5 copies / ⁇ 1 with the use of RT-ICAN type II.
  • the ⁇ RNA prepared in Example 1- (1) was calculated from OD260 value was adjusted to 1 mu 1 per 10, 10 1, 10 2, 10 3, 10 4, 10 5 copies.
  • Final concentration 32 mM HEPES—KOH buffer solution (pH 7.8), lOOmM potassium acetate, 1% dimethyl sulfoxide, 0.11% BSA, 4 mM magnesium acetate, 500 M dNTPs each, 205 RN3 (18) primer as the reverse transcription primer (SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing), A12-205R primer (SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing), 215R primer (SEQ ID NO: 4 in the Sequence Listing), 8-12-215!
  • A12-223R primer (SEQ ID NO: 6 in the Sequence Listing) lpmo1, RTase M—MLV (Takara Bio Inc.) 12.5 U, 1 ⁇ l, 10 ⁇ l to which 1 ⁇ l of each copy number of type II RNA was added was prepared.
  • the reaction solution was set in a Thermal Cycler Personal (manufactured by Takara Bio Inc.), kept at 45 ° C for 10 minutes, and then cooled to 4 ° C.
  • After the reverse transcription reaction add a final concentration of 32 mM HEPES-KOH buffer (pH 7.8), 100 mM potassium acetate, 1% dimethyl sulfoxide, 0.11% BSA, 4 mM magnesium acetate, and each MdNTPs
  • the 134FN3 (18) primer SEQ ID NO: 7 in the sequence listing
  • the first chimeric oligonucleotide primer and the 205RN3 (18) primer of the first chimeric oligonucleotide primer 25 pmol each, BcaBEST (Takara Bio Inc.) 11U, International Publication No.
  • the sensitivity of RT-ICAN reverse transcribed with the 205RN3 (18) primer was 10 4 copies, whereas the RT-ICAN at the same position was located in the upstream region (11-1-12) of the second chimeric oligonucleotide primer.
  • 5 Aniru to 12 bases in the case of using a reverse transcription primer A12- 205R that Tsukeka ⁇ terminated, sensitivity becomes 10 2 copies, the sensitivity was improved two orders of magnitude. In addition, speed is also about 2 minutes faster Natsuta detect 10 5 copies.
  • the upstream region of the second chimeric oligonucleotide primer and the position of 12 bases that anneal to Z or a part of the primer (11 11 12 11 11 22 21) 32, + 5-11, + 11-0) was changed and used as a reverse transcription primer to conduct a similar study.
  • Example 11- (1) the type II RNA prepared in Example 11- (1) was calculated from the OD260 value, and was prepared at 10 °, 10 1 , 10 2 , 10 3 , 10 4 , and 10 5 copies per L.
  • B134FN3 (16) primer of the second chimeric oligonucleotide primer (SEQ ID NO: 12 in the sequence listing) and 205RN3 (16) primer of the first chimeric oligonucleotide primer (SEQ ID NO: 13 in the sequence listing) 25 pmol BcaBEST (Takara Bio Inc.) L lU Tli RNaseHII 0.05 U and a reaction solution containing 15 / zl of Cyber Green (manufactured by Takara Bio Inc.) are added. Detected in real time. The reaction products were also confirmed by 3% agarose gel electrophoresis.
  • 15R 15R
  • sensitivity becomes 10 1 copies
  • the sensitivity was improved by one digit.
  • the 105 copies detected speed about 2.5 minutes faster Natsuta.
  • the detection sensitivity and detection speed are improved in the same manner as the above primers did.
  • Example 11- (1) the type II RNA prepared in Example 11- (1) above was calculated from the OD260 value, and 10 per L. , 10 1 , 10 2 , 10 3 , 10 4 , 10 5 copies.
  • the reaction solution was set in a Thermal Cycler Personal (manufactured by Takara Bio Inc.), kept at 45 ° C for 10 minutes, and then cooled to 4 ° C. After the reverse transcription reaction, add a final concentration of 32 mM HEPES-KOH buffer (pH 7.8), 100 mM potassium acetate, 1% dimethyl sulfoxide, 0.11% BSA, 4 mM magnesium acetate, and each MdNTPs to the reaction solution 101 after the completion of the reverse transcription reaction.
  • Ladder-forming oligonucleotide primer A12 (—10) —215R with 12 bases added to the 5 ′ end to anneal to the upstream region (1-111—22) of the second chimeric oligonucleotide primer , sensitivity becomes 10 1 copies, the sensitivity was improved two orders of magnitude. Also, the 10 5 Detection speed about 3 minutes fast Natsuta.
  • the number of bases that anneal to the upstream region of the second chimeric oligonucleotide primer was changed, and the ladder-forming oligonucleotide primer added to the end was changed in sensitivity by adding 6 bases or more.
  • the detection speed was improved. It was confirmed that the effect increased as the number of bases anneal to the upstream region of the second chimeric oligonucleotide primer increased.
  • RNA prepared in Example 1- (1) was calculated from the OD260 value, and prepared at 10 °, 10 1 , 10 2 , 10 3 , 10 4 , and 10 5 copies per L.
  • the reaction solution was set in a Thermal Cycler Personal (manufactured by Takara Bio Inc.), kept at 45 ° C for 10 minutes, and then cooled to 4 ° C.
  • After the reverse transcription reaction add 10 mM final concentration of 32 mM HEPES-KOH buffer (pH 7.8), 100 mM potassium acetate, 1% dimethyl sulfoxide, 0.11% BSA, 4 mM magnesium acetate, 500 M dNTPs
  • the B134FN3 (16) primer of the second chimeric oligonucleotide primer and the 205RN3 (16) primer of the first chimeric oligonucleotide 25 pmol each, BcaBEST (Takara Bio Inc.) lU, Tli RNaseHII 0.05U, Cyber Green
  • the reaction mixture 151 was added thereto, and an ICAN reaction was performed at 55 ° C using a Rotor gene (manufactured by CORBETT RESEARCH), and amplification products were
  • Fig. 2 shows the amplification curve. As shown in FIG. 2, 10 1 to 10 5 copies were detected quantitatively (correlation coefficient 0.992), and up to 10 copies of the reaction were confirmed within 10 cycles.
  • Example 1- (1) was calculated from OD260 values: were prepared L 1 per 100, 10 1, 10 2, 10 3, 10 4, 10 5 copies. Final concentration 32 mM HEPES—KOH buffer (pH 7.8), 100 mM potassium acetate, 1% dimethyl sulfoxide, 0.11% BSA, 4 mM magnesium acetate, 500 ⁇ M dNTPs each, and second chimeric oligonucleotide primer 160FN3 primer (SEQ ID NO: 17 in the sequence listing) and the 241RN3 primer of the first chimeric oligonucleotide primer (SEQ ID NO: 18) or (A12) of the first chimeric oligonucleotide primer (241) 241RN3 primer (SEQ ID NO: 19 in the sequence listing) Reaction solutions containing 25 pmol each, RTase M—MLV (Takara Bio Inc.) 50 U, BcaBEST (Takara Bio Inc.) llU, Tli RNase
  • a ladder-forming oligonucleotide primer having a 12 'base added to the 5' end of the second chimeric oligonucleotide primer at the 5 'end in the upstream region (111-112) was used for reverse transcription and ICAN in the same tube. Simultaneous lstep RT- ICAN was added to the reaction system to examine the sensitivity and detection speed.
  • the type II RNA was added to the mixture, and kept at 45 ° C for 5 minutes and at 55 ° C for 45 minutes using a Rotor gene (CORBETT RESEARCH), and the amplification product was detected in real time.
  • the reaction products were also confirmed by 3% agarose gel electrophoresis.
  • an ICAN-ALDH2-F primer corresponding to the second chimeric oligonucleotide primer SEQ ID NO: 21 in the sequence listing
  • An ICAN-ALDH2-R primer SEQ ID NO: 22 in the sequence listing
  • an ALDH2 wG probe for detecting a normal type SEQ ID NO: 23 in the sequence listing
  • an ALDH2 mA probe for detecting a mutant type SEQ ID NO: 24 in the sequence listing
  • the ALDH2 wG probe for normal type detection uses ROX label (manufactured by Applied Biosystems) at the 5 'end as a fluorescent label, and Ecli pse (manufactured by Epoch Biosciences) as a quenching label at the 3' end.
  • the ALDH2 mA probe is a DNA-RNA-DNA type oligonucleotide probe that has a FAM label (manufactured by Applied Biosystems) at the end and a quenching label Eclipse at the end. is there.
  • the reaction conditions of the ICAN reaction are as follows. That is, final concentration 32 mM HEPE S-KOH buffer, pH 7.8, 100 mM potassium acetate, 5 mM magnesium acetate, 1% dimethyl sulfoxide, 0.04% propylenediamine, 0.11% ⁇ serum albumin, 600 ⁇ m each M dNTPs ⁇ 4U BcaBEST DNA polymerase, 100U Tli RNaseH II, 50pmol each of ICAN-ALDH2-F primer and ICAN-ALDH2-R primer, 5.5pmol ALDH2 wG probe, 6pmol ALDH2 mA probe, ⁇ genomic DNA Based on 100ng, the ladder-forming oligonucleotide primer ALDH2-TH1 or ALDH2-TH2 or ALDH2-TH3 was added at 1pmol, and the final volume was made up to 251 with sterile water.
  • the reaction solution was set on a smart cycler (manufactured by Takara Bay), treated at 70 ° C. for 5 minutes, and then kept at 56 ° C. for 60 minutes. The fluorescence intensity was measured every minute when the temperature was maintained at 56 ° C.
  • PCR was performed using a primer pair of ALDH2-F primer (SEQ ID NO: 28 in the sequence listing) and ALDH2-R primer (SEQ ID NO: 29 in the sequence listing), and The obtained amplification product was purified by Microcon-30 (Millipore), digested with Eco571, electrophoresed on 3% NuSieve3: 1 agarol gel (manufactured by Takara Bio Inc.), and also typed with RF LP. went.
  • PCR was performed using TaKaRa ExTaq (manufactured by Takara Bio Inc.). That is, a final concentration of IX ExTaq buffer solution, 200 dNTPs each, 1.25 U ExTaq, ALD H2-F primer and ALDH2-R primer of each lOpmol, and 5 ⁇ l of human genomic DNA prepared as a type III nucleic acid. The mixture was syruped and the final volume was 50 ⁇ l with sterile water. The reaction solution was set on a Thermal Cycler SP (manufactured by Takara Bio Inc.), and after 94 ° C, 30 seconds, 94 ° C, 30 seconds, 55 ° C, 30 seconds, 72 hours. C, a 30 second cycle was repeated 30 cycles.
  • a Thermal Cycler SP manufactured by Takara Bio Inc.
  • Example 2 (1), the gene encoding the human aldehyde dehydrogenase 2 enzyme selected as the subject to be examined for the effect on the polymorphism detection by the ICAN reaction and real-time detection using the cycling probe method When detecting the sequence, the effect of the base sequence added to the 5 and 5 ends of the ladder-forming oligonucleotide primer added to the reaction system was examined.
  • Example 2- (1) an ICAN-ALDH2-F primer and an ICAN-ALDH2-R primer for detecting a polymorphism of this aldehyde denidogenase 2 gene in the ICAN reaction system.
  • a primer, an ALDH2 wG probe for normal type detection, and an ALDH2 mA probe for mutant type detection were prepared.
  • Genomic DNA to be type I was prepared from a blood sample using EDTA as an anticoagulant, with informed consent, prepared using the QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN). Those that were confirmed to be heterozygotes by typing according to were used.
  • the F2 chimeric oligonucleotide primer of the second chimeric oligonucleotide primer (SEQ ID NO: 31 in the sequence listing) and the R2 chimeric oligonucleotide primer of the first chimeric oligonucleotide primer ( Sequence number 32) in the sequence listing was synthesized using a DNA synthesizer (Applied 'Biosystems).
  • a Mip4gl2 probe SEQ ID NO: 33 in the sequence listing
  • the ladder-forming oligonucleotide primers R2 (-13) (SEQ ID NO: 34 in the sequence listing; 13 29 relative to the first chimeric oligonucleotide primer) and R2 (-13) A12-1 (SEQ ID NO: 35 in the sequence listing; Relative to one chimeric oligonucleotide primer—13——29 parts, 5 and the end added to the upstream region of the second chimeric oligonucleotide primer—12 bases—11—12), R2 (1-13) A12—2 (SEQ ID NO: 36 in the Sequence Listing; 5 of 1329 parts relative to the first chimeric oligonucleotide primer, and 12 bases of the upstream region 13-24 of the second chimeric oligonucleotide primer added to the end) Synthesized.
  • a complementary sequence of 6 bases was inserted into the upstream region from the 5 'end of both ICAN primers on the nucleic acid to be type III, and the effect on the ICAN reaction was observed.
  • the detection target was the human c Ki ras 2 gene (GenBank Acc. No .: L00045).
  • the ladder product was excised from the gel, subcloned into the Hindi site of pUCl18, and the nucleotide sequence was determined.
  • the ladder product was found to be complementary to the target region located in the 5 'end upstream region of both ICAN primers.
  • the target regions were linked in the same direction via the sequence CGCGCG.
  • Form ⁇ was prepared as follows.
  • PCR was performed using the P. gonorrhoeae genome (purchased from Sumisho Pharma International) type I with the PJDBF primer (SEQ ID NO: 43 in the sequence listing) and the PJDBR primer (SEQ ID NO: 44 in the sequence listing).
  • the obtained fragment was blunt-ended and inserted into the Hind I site of plasmid pUC118 (Takarabay).
  • a plasmid having the same orientation as that of M13 primer M4 manufactured by Takara Bayo
  • the PJDBF primer anneals to pUC118 was selected to obtain a plasmid Cp13.
  • a PJDB0FN3 primer SEQ ID NO: 45 in the sequence listing
  • a PJDB0RN3 primer SEQ ID NO: 46 in the sequence listing
  • GTC a sequence complementary to GAC, which is a 3 base upstream sequence adjacent to the 5 'end of the PJDB0RN3 primer, is located in the target region of the PJDB0FN3 primer chain. Exists in position. The effect of these three bases on ICAN was observed.
  • the plasmid DNA prepared above was calculated from the OD260 value, 10 2, 1 0 3, 10 4, 10 5, were prepared in 10 6, 10 7, 10 8 copies.
  • Final concentration 32 mM HEPES—KOH buffer (pH 7.8), 100 mM potassium acetate, 1% dimethyl sulfoxide, 0.11% BSA, 4 mM magnesium acetate, 500 ⁇ M each dNTPs, PJDB0FN3 chimera oligonucleotide primer and PJDB0RN3 chimera oligo Nucleotide primers 30 pmol each, Bca BEST (Takara Bio Inc.) 2.8 U, Afu RNaseHII 2.2 U (Manufactured by Takara Bay) at 60 ° C. for 60 minutes. The amplification products were confirmed by 3% agarose gel electrophoresis.
  • this ladder amplification product was regularly contained in the target region sandwiched by the ICAN primer and the target region sandwiched between the S target region and the 34 base force S region upstream from the 5, end of the PJDBOFN3 chimeric oligonucleotide primer.
  • the polymerization reaction of the target region was promoted by the complementary three bases present in the 5'-terminal upstream regions of both ICAN primers, and high-sensitivity amplification was possible.
  • the position of the probe may be a region sandwiched between both ICAN primers or a complementary region existing in the 5′-end upstream region of the ICAN primer and both ICAN primers. It was shown that selection could be made from regions sandwiched between different sequences.
  • the length of the bases that anneal to the upstream region of the second chimeric oligonucleotide primer to be added to the 5 and 5 ends of the ladder-forming oligonucleotide primers is 6, 9 or 12 bases (111-6, --11).
  • the sensitivity and detection speed of RT-ICAN were examined using the reverse transcription primers described in —9, —1-1-1).
  • the type II RNA prepared in Example 1- (1) above was calculated from the OD260 value, and was calculated to be 10 per ⁇ l. , 10 1 , 10 2 , 10 3 , 10 4 , 10 5 copies.
  • the reaction solution was set in a Thermal Cycler Personal (manufactured by Takara Bio Inc.), kept at 45 ° C for 10 minutes, and then cooled to 4 ° C. After the reverse transcription reaction is completed, the reaction solution 1% dimethyl sulfoxide, 0.11% BSA, 4 mM magnesium acetate, 500 ⁇ ⁇ each dNTPs, B 134FN3 (16) primer as the second chimeric oligonucleotide primer and 205RN3 (16) primer as the first chimeric oligonucleotide primer Add 25pmol, Be aBEST (Takara Bio Inc.) l lU, Tli RNase HII 0.05 U, and reaction mixture 151 containing Cyber Green, and perform the ICAN reaction at 55 ° C with the Rotor gene (CORBETT RESEARCH). Amplification products were detected in real time. The reaction products were also confirmed by 3 o / o agarose gel electrophoresis.
  • the length of the base that anneals to the 5th end of the ladder-forming oligonucleotide primer and upstream of the second chimeric oligonucleotide primer is 12 bases, 18 bases, (111-112, -111). RT-ICAN using reverse transcription primers
  • the type I RNA prepared in Example 1- (1) above was calculated from the OD260 value, Prepared at 10 °, 10 1 , 10 2 , 10 3 , 10 4 , 10 5 copies.
  • the reaction solution was set in a Thermal Cycler Personal (manufactured by Takara Bio Inc.), kept at 45 ° C for 10 minutes, and then cooled to 4 ° C. After the reverse transcription reaction, add a final concentration of 32 mM HEPES-KOH buffer (pH 7.8), 100 mM potassium acetate, 1% dimethyl sulfoxide, 0.11% BSA, 4 mM magnesium acetate, and each MdNTPs
  • a reaction solution containing B134FN3 (18) primer of the first nucleotide oligonucleotide primer and 205RN3 (18) primer of the first chimeric oligonucleotide primer (25 pmol each), BcaBEST (manufactured by Takara Bio Inc.), lU and Tli RNaseHII 0.05 U 151 was added to the mixture, and ICAN reaction was performed at 55 ° C using a Thermal Cycler Personal (manufactured by Takara Bio Inc.), and the amplification products were
  • an amplification method superior to the conventional isothermal nucleic acid amplification method, and a composition and a kit containing primers for use in the method are provided.
  • SEQ ID NO. 2 Designed chimeric oligonucleotide primer designated as 205RN3 (18) for synthesizing cDNA from mRNA, and to amplify a portion of SARS coronavirus genome, "nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides.
  • SEQ ID NO. 4 Designed oligonucleotide primer designated as 215R for synthesizing cDNA from mRNA.
  • SEQ ID NO.5 Designed oligonucleotide primer designated as A12-215R for synthesizing cDNA from mRNA, and to amplify a portion of SARS coronavirus genome.
  • SEQ ID NO.6 Designed oligonucleotide primer designated as A12-223R for synthesizing cDNA from mRNA, and to amplify a portion of SARS coronavirus genome.
  • SEQ ID NO.7 Designed chimeric oligonucleotide primer designated as 134FN3 (18) to amplify a portion of SARS coronavirus genome, ⁇ nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides / ''
  • SEQ ID NO.8 Designed oligonucleotide primer designated as A12 (-10) -215R for synthesizing cDNA from mRNA, and to amplify a portion of SARS coronavirus genome.
  • SEQ ID NO.11 Designed oligonucleotide primer designated as A12 (12) -215R for synthesizing cDNA from mRNA, and to amplify a portion of SARS coronavirus genome.
  • SEQ ID NO. 12 Designed chimeric oligonucleotide primer designated as
  • ⁇ nucleotides 14 to 16 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides. "" 5 end is labeled with biotin.
  • SEQ ID NO. 13 Designed chimeric oligonucleotide primer designated as
  • ⁇ nucleotides 14 to 16 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides.
  • SEQ ID NO.14 Designed oligonucleotide primer designated as A6 (-10) -215R for synthesizing cDNA from mRNA, and to amplify a portion of SARS coronavirus genome.
  • SEQ ID NO.15 Designed oligonucleotide primer designated as A9 (-10) -215R for synthesizing cDNA from mRNA, and to amplify a portion of SARS coronavirus genome.
  • SEQ ID NO.17 Designed chimeric oligonucleotide primer designated as 160FN3 to amplify a portion of SARS coronavirus genome, nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides. "
  • SEQ ID NO. 18 Designed chimeric oligonucleotide primer designated as 241RN3 to amplify a portion of SARS coronavirus genome, ⁇ nucleotides 12 to 14 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides / ''
  • SEQ ID NO.19 Designed chimeric oligonucleotide primer designated as (A12) 241RN3 to amplify a portion of SARS coronavirus genome, ⁇ nucleotides 18 to 21 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides / ''
  • SEQ ID NO.20 Designed chimeric oligonucleotide primer designated as 134FN3 (16) to amplify a portion of SARS coronavirus genome, ⁇ nucleotides 14 to 16 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides / ''
  • SEQ ID NO.21 Designed chimeric oligonucleotide primer designated as ICAN— ALDH2— F to amplify a portion of human aldehyde dehydrogenase 2 gene, ⁇ nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides- other nucleotides are
  • SEQ ID NO.22 Designed chimeric oligonucleotide primer designated as ICAN— ALDH2— R to amplify a portion of human aldehyde dehydrogenase 2 gene, ⁇ nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides- other nucleotides are
  • SEQ ID NO.23 Designed chimeric oligonucleotide probe designated as ALDH2 wG probe for detecting an amplified a portion of native human aldehyde
  • ⁇ nucleotides 11 is ribonucleotide- other nucleotides are deoxyribonucleotides.
  • "b--end is labeled with ROX
  • 3 '-end is labeled with Eclipse
  • SEQ ID NO.24 Designed chimeric oligonucleotide probe designated as ALDH2 mA probe for detecting an amplified a portion of mutant human aldehyde dehydrogenase 2 gene, ⁇ nucleotides 11 is ribonucleotide- other nucleotides are deoxyribonucleotides. "B—end is labeled with FAM, and 3 '-end is labeled with Eclipse,
  • SEQ ID NO.25 Designed oligonucleotide primer designated as ALDH2-TH1 to amplify a portion of human aldehyde dehydrogenase 2 gene.
  • SEQ ID NO.26 Designed oligonucleotide primer designated as ALDH2-TH2 to amplify a portion of human aldehyde dehydrogenase 2 gene.
  • SEQ ID NO.27 Designed oligonucleotide primer designated as ALDH2-TH3 to amplify a portion of human aldehyde dehydrogenase 2 gene.
  • SEQ ID NO.28 Designed oligonucleotide PCR primer designated as ALDH2— F to amplify a portion of human aldehyde dehydrogenase 2 gene.
  • SEQ ID NO.29 Designed oligonucleotide PCR primer designated as ALDH2-R to amplify a portion of human aldehyde dehydrogenase 2 gene.
  • SEQ ID NO.31 Designed chimeric oligonucleotide primer designated as F2 to amplify a portion of Legionella pneumophila mip gene, "nucleotides 15 to 17 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides.”
  • SEQ ID NO.32 Designed chimeric oligonucleotide primer designated as R2 to amplify a portion of Legionella pneumophila mip gene, "nucleotides 15 to 17 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides.”
  • SEQ ID NO.33 Designed chimeric oligonucleotide probe designated as Mip4gl2 probe for detecting an amplified a portion of Legionella pneumophila mip gene, "nucleotides 4 is ribonucleotide- other nucleotides are deoxyribonucleotides," 5 end is labeled with FAM, and 3 end is labeled with Eclipse,
  • SEQ ID NO.34 Designed oligonucleotide primer designated as R2 13) to amplify a portion of Legionella pneumophila mip gene.
  • SEQ ID NO.35 Designed oligonucleotide primer designated as R2 13) A12-1 to amplify a portion of Legionella pneumophila mip gene.
  • SEQ ID NO.36 Designed oligonucleotide primer designated as R2 13) A12-2 to amplify a portion of Legionella pneumophila mip gene.
  • SEQ ID NO. 37 Designed oligonucleotide PCR primer designated as
  • SEQ ID NO. 38 Designed oligonucleotide PCR primer designated as rasTIR to amplify a portion of human c— Ki—ras2 gene.
  • SEQ ID NO.39 Designed oligonucleotide PCR primer designated as rasT14F to amplify a portion of human c— Ki—ras2 gene.
  • SEQ ID NO.41 Designed chimeric oligonucleotide primer designated as c-Ki-ras / 12FN3 to amplify a portion of human c-i-ras2 gene, ⁇ nucleotides 18 to 20 are ribonucleotide- other nucleotides are deoxyribonucleotides. "
  • SEQ ID NO.43 Designed oligonucleotide primer designated as PJDBF to amplify a portion of Neisseria gonorrhoeae cppB gene.
  • SEQ ID NO.44 Designed oligonucleotide primer designated as PJDBR to amplify a portion of Neisseria gonorrhoeae cppB gene.
  • SEQ ID NO. 45 Designed chimeric oligonucleotide primer designated as
  • nucleotides 18 to 20 are ribonucleotide- other nucleotides are deoxyribonucleotides.
  • SEQ ID NO. 46 Designed chimeric oligonucleotide primer designated as
  • nucleotides 15 to 17 are ribonucleotide- other nucleotides are deoxyribonucleotides.
  • SEQ ID NO. 47 Designed oligonucleotide primer designated as A6— 215R to amplify a portion of SARS coronavirus genome.
  • SEQ ID NO.48 Designed oligonucleotide primer designated as A9-- 215R to amplify a portion of SARS coronavirus genome.
  • SEQ ID NO.49 Designed oligonucleotide primer designated as A18-- 205R to amplify a portion of SARS coronavirus genome.

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Abstract

　鋳型核酸中に実質的に同一配列が存在する場合に、その配列に挟まれた領域内にプライマーを設計することにより、ＩＣＡＮ反応においてターゲット領域が上記同一配列を介して同一方向に重合したラダー状産物ができる。さらにキメラオリゴヌクレオチドプライマーと特定の塩基配列を含むラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより、増幅産物を積極的にラダー状にすることでＩＣＡＮ反応の感度、増幅効率および反応速度を向上させることができる。

Description

明 細 書
核酸の増幅方法
技術分野
[0001] 本発明は、臨床分野において有用な標的核酸の検出方法及び遺伝子工学分野に ぉ 、て有用な DNAの合成方法に関し、铸型となる核酸の増幅方法および該方法で 増幅された標的核酸の検出方法に関する。
背景技術
[0002] 遺伝子工学分野の研究において DNAの合成は種々の目的に使用される。このう ちオリゴヌクレオチドのような短鎖の DNAの合成を除けば、そのほとんどは DNAポリ メラーゼを利用した酵素的方法により実施されている。
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR;Polymerase Chain Reaction)法は、次 の増幅サイクルのための一本鎖標的分子を再生するために、高温から低温の反応を 何回も繰り返す必要がある。このように温度によって反応が制約されるため、反応系 は不連続な相またはサイクルで行なう必要がある。
[0003] 従って、上記の方法には広い温度範囲で、かつ、厳密な温度調整を経時的に行な うことのできる高価なサーマルサイクラ一を使用することが必要となる。また、該反応 は、 2種類一 3種類の温度条件で行なうための設定温度にするために要する時間が 必要であり、そのロス時間はサイクノレ数に比例して増大していく。
[0004] そこで、上記問題点を解決すべく等温状態で実施可能な核酸増幅法が開発された 等温で実施可能な方法としては、例えば、鎖置換型増幅（SDA; Strand Displac ement Amplification)法（例えば、特許文献 1参照）、 RCA (Rolling Circle A mplification)法（例えば、特許文献 2参照）、 LAMP (Loop-mediated isotherm al AMPlification)法（例えば、特許文献 3参照）、 ICAN (Isothermal and Chi meric primer— initiated Amplification of Nucleic acias)法 (f列 ば、特 文献 4参照）、あるいは種々の改良 SDA法 (例えば、特許文献 5— 8参照）等が挙げ られる。 [0005] これらの等温核酸増幅法またはオリゴヌクレオチド合成法の反応においては、ブラ イマ一の伸長や、一本鎖伸長生成物（または元の標的配列）へのプライマーのァ- 一リングや、それに続くプライマーの伸長は、一定温度で保温された反応混合物中 で同時に起こる。
[0006] 上記特許文献 1記載の SDA法は、 DNAポリメラーゼと制限エンドヌクレア一ゼを介 する二本鎖の置換による、試料中の標的核酸配列（およびその相補鎖)の増幅法で ある。該方法では、増幅に使用するプライマーは 4種類必要であり、その内の 2種類 は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含むように構築する必要がある。また、該 方法では、 DNA合成のための基質として、修飾されたデォキシリボヌクレオチド 3リン 酸、例えば ex位のリン酸基の酸素原子が硫黄原子 (S)に置換された ( a S)デォキ シリボヌクレオチド 3リン酸を大量に用いる必要がある。
[0007] 上記特許文献 2記載の RCA法は、環状 DNAを铸型とした核酸増幅方法である。
得られる増幅産物は、増幅領域が複数回繰り返された配列を有し、また、増幅産物 が新たな铸型として機能するため、最終的な増幅産物は、ブランチング (branching )と呼ばれる分岐構造を有している。さらに、 RCA法に関連して、増幅効率を向上さ せるためには、副反応で生成するラダー状増幅産物を抑制することが重要であると いう報告がある。（例えば、非特許文献 1参照）
[0008] 上記特許文献 3記載の LAMP法は、増幅に 4種類のプライマーを必要とする。また 、得られる増幅産物は、増幅の標的とされた領域が繰り返された、サイズの一定しな いラダー状 DNAである。当該 DNAにおいてターゲット領域は、交互に方向が変わ つた状態で連結されて 、る。
[0009] 上記特許文献 4記載の ICAN法は、キメラオリゴヌクレオチドプライマーを用いた核 酸増幅方法である。
[0010] 上記特許文献 5記載の改良 SDA法は、 RNAと DNAから構成され、少なくとも 3 '末 端に DNAが配置された構造を必須要件とするキメラオリゴヌクレオチドプライマーを 使用する DNA増幅方法である。
[0011] 上記特許文献 6記載の改良 SDA法は、 3 '突出末端を生じさせる制限酵素が必要 である。 [0012] 上記特許文献 7記載の改良 SDA法は、少なくとも 2組のプライマー対を必要とする
[0013] 上記特許文献 8記載の改良 SDA法は、少なくとも 2組のプライマーと少なくとも 1種 類の修飾デォキシリボヌクレオチド 3リン酸を必要とする。
[0014] 以上のように、等温核酸増幅法が開発されているが、これらの方法も、増幅効率、 検出感度などの問題があった。そこで、この問題点を解決すベぐ改良型等温核酸 増幅法が開発された (例えば、特許文献 9一 11参照)。
[0015] 特許文献 9記載の方法は、逆転写プライマーもしくは核酸増幅用プライマーの 5，末 端に RNAポリメラーゼプロモータもしくはその一部を付加し、さらにその 5'末端に少 なくとも 5塩基を含む任意のオリゴヌクレオチドを付加したプライマー、および該プライ マーの上流領域もしくは該プライマーの RNAポリメラーゼプロモータ部位にァニーリ ングする第 3のプライマーを用いた核酸増幅方法である。
[0016] 特許文献 10記載の方法は、少なくとも 2種の相補的プライマーを用いた核酸増幅 方法、および少なくとも 2種類のプライマー対を用いた核酸増幅方法である。
該方法は、複数のプライマーもしくはプライマー対を用いることにより、増幅産物の 生成量を向上させる方法であり、生成量を向上させるためにはより多くのプライマーも しくはプライマー対を用いる必要がある。
[0017] 特許文献 11記載の方法は、特許文献 12記載の方法において、キメラオリゴヌタレ ォチドプライマ一、および铸型となる核酸の該プライマーがハイブリダィズする位置の
3'側にハイブリダィズする上流オリゴヌクレオチドプライマーとを組合わせて使用する 方法である。
該方法にぉ 、て、ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーは铸型鎖にハイブリダィ ズする配列のみからなる。
[0018] このように、従来の等温核酸増幅法はまだまだ種々の問題をかかえており、効率よ ぐ高感度でできる方法が求められていた。
[0019] 特許文献 1 :特公平 7 - 114718号公報
特許文献 2 :国際公開第 97Z19193号パンフレット
特許文献 3：国際公開第 00Z28082号パンフレット 特許文献 4:国際公開第 00Z56877号パンフレット
特許文献 5 :米国特許番号第 5, 824, 517号明細書
特許文献 6 :国際公開第 99Z09211号パンフレット
特許文献 7 :国際公開第 95Z25180号パンフレット
特許文献 8 :国際公開第 99Z49081号パンフレット
特許文献 9：国際公開第 95Z03426号パンフレット
特許文献 10 :国際公開第 95Z25180号パンフレット
特許文献 11：特開 2003— 52380号公報
非特許文献 l :Hafner G. J.他 4名、 BioTechniques, vol. 30 (2001) p852 -867
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0020] 本発明の主な目的は、試料中の標的核酸の高感度、特異的に増幅する標的核酸 の増幅方法、これらの方法のための組成物およびキットを提供することにある。
課題を解決するための手段
[0021] 本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究した。その結果、铸型核酸中に 実質的に同一配列が存在する場合に、その配列に挟まれた領域内にプライマーを 設計することにより、 ICAN反応においてターゲット領域が上記同一配列を介して同 一方向に重合したラダー状産物ができることを見出した。さらにキメラオリゴヌクレオチ ドプライマ一と特定の塩基配列を含むラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーを用い ることにより、増幅産物を積極的にラダー状にすることで ICAN反応の感度、増幅効 率および反応速度を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。
[0022] すなわち、本発明の第 1の発明は、核酸を増幅する方法において、
(A)下記 (a)又は (b)から選択される反応混合物を調製する工程、
(a)铸型となる核酸、デォキシリボヌクレオチド 3リン酸、鎖置換活性を有する DNAポ リメラーゼ、少なくとも 2種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも 1種類の ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマー、および RNaseH、
(b)铸型となる核酸、デォキシリボヌクレオチド 3リン酸、鎖置換活性を有する DNAポ リメラーゼ、少なくとも 2種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、および RNaseH、 ここで、一方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーはラダー形成オリゴヌクレオチドプ ライマーとして作用し、
ここで、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくともデォキシリボヌクレオ チド及びヌクレオチドアナログ力も選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボ ヌクレオチドは該プライマーの 3'末端又は 3'末端側に配置されており、
上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、铸型となる核酸の塩基配列に相補的な 第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと、铸型となる核酸の塩基配列に相同的な第 ニキメラオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも 2種類を含んでおり、
上記ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーは、铸型となる核酸の当該第一キメラ オリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領域および Zまたはその領域より 3'側の塩 基配列に相補的な配列を有し、铸型となる核酸と相同的な第二キメラオリゴヌクレオ チドプライマ一の 5'側の塩基配列、铸型となる核酸の当該第二キメラオリゴヌクレオ チドプライマ一と相同な領域の 5'末端よりさらに 5 '側方向の領域に相当する塩基配 列あるいはその両方に相補的な配列を 5 '側に有し、
および
(B)铸型となる核酸へのプライマーの特異的なアニーリング、 DNAポリメラーゼによ る伸長鎖合成反応及び鎖置換反応、並びに RNaseHによる伸長鎖の切断反応が行 える一定の温度条件でラダー状増幅産物を生成するのに充分な時間、反応混合物 をインキュベートする工程、
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法に関する。
[0023] 本発明の第 1の発明において、铸型となる核酸は RNAであり、当該核酸をあらかじ めデォキシリボヌクレオチド 3リン酸、逆転写活性を有する DNAポリメラーゼ及び少な くとも 1種類のラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーで処理し、逆転写産物としても よい。
[0024] 本発明の第 1の発明において、工程 (A)における反応混合物は、さらに逆転写活 性を有する DNAポリメラーゼを含有してもよ 、。
[0025] 本発明の第 1の発明において、铸型となる核酸は、 mRNAであってもよい。 [0026] 本発明の第 1の発明において、逆転写活性と鎖置換活性とを有する 1つの DNAポ リメラーゼを用いてもよい。
[0027] 本発明の第 2の発明は、本発明の第 1の発明の方法のための組成物であって、そ れぞれ少なくとも 1種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び Z又はラダー形成 オリゴヌクレオチドプライマーを含有する組成物に関する。
[0028] 本発明の第 3の発明は、本発明の第 1の発明のためのキットであって、それぞれ少 なくとも 1種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び Z又はラダー形成オリゴヌク レオチドプライマーを含有するキットに関する。
[0029] 本発明の第 4の発明は、下記工程を包含することを特徴とする標的核酸の検出方 法に関する。
(a)本発明の第 1の方法により、標的核酸を増幅する工程;および、
(b)上記工程により増幅された標的核酸を検出する工程。
[0030] 本発明の第 5の発明は、本発明の第 1の発明の方法に用いるプライマーであって、 铸型となる核酸と相同的なプライマーの 5'側の塩基配列、铸型となる核酸の当該第 ニキメラオリゴヌクレオチドプライマーと相同な領域の 5'末端よりさらに 5'側方向の領 域に相当する塩基配列あるいはその両方に相補的な配列を 5'側に有することを特 徴とするオリゴヌクレオチドプライマーに関する。
発明の効果
[0031] 本発明により、従来の等温核酸増幅方法より優れた増幅方法、該方法に用いるた めのプライマーを含む組成物およびキットが提供される。
図面の簡単な説明
[0032] [図 1]実施例 2— (1) (A)にて使用している第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー、 第二オリゴヌクレオチドプライマー、ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの位置関 係に関する図である。 （a)は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー、（b)—（d)はラ ダー形成オリゴヌクレオチドプライマー、（e)は第二キメラオリゴヌクレオチドプライマ 一を示す。（b)—（d)において、 1の部分は（e)の 5'上流の相補鎖の 1と相同な配列 を有する。
[図 2]各コピー数における増幅曲線を示す図である。図 2において、横軸は反応サイ クル数を、縦軸は蛍光強度を示す。図 2において、 aは 105コピー数、 bは 104コピー 数、 cは 103コピー数、 dは 102コピー数、 eは 101コピー数、 fは 10°コピー数の铸型を 用いた場合の増幅曲線である。
発明を実施するための最良の形態
[0033] 本明細書においてデォキシリボヌクレオチド (本明細書中では dNとも記載する）と は、糖部分が D— 2—デォキシリボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、例えば 、塩基部分にアデニン、シトシン、グァニン、チミンを有するものが挙げられる。さらに 、 7—デァザグアノシン等の修飾塩基を有するものや、あるいは固定ィ匕に使用できるよ うな官能基を有するデォキシリボヌクレオチドゃデォキシイノシンヌクレオチドのような デォキシリボヌクレオチドアナログも上記のデォキシリボヌクレオチドに包含される。
[0034] 本明細書においてリボヌクレオチド (本明細書中では Nとも記載する）とは、糖部分 が D—リボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、塩基部分にアデニン、シトシン 、グァニン、ゥラシルを有するものが挙げられる。さらに、当該リボヌクレオチドには修 飾リボヌクレオチドが包含され、例えば α位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子 (S)に 置き換えた修飾リボヌクレオチド [ ( α— S)リボヌクレオチド、 — S) Nとも記載する] やこの他の誘導体等も含まれる。
[0035] 本明細書においてキメラオリゴヌクレオチドプライマーとは、該プライマーの 3 '末端 又は 3'末端側にリボヌクレオチドを配置し、本発明の方法において核酸鎖が伸長で き、 RNaseHで切断でき、鎖置換反応を行うことができるオリゴヌクレオチドプライマ 一のことをいい、該構成を有するものであれば、いずれもが本発明のキメラオリゴヌク レオチドプライマ一に包含される。
本発明に使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくともデォキシリボ ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログ力 選択されるものとリボヌクレオチドを含有す るキメラオリゴヌクレオチドプライマーである。該プライマーには未修飾リボヌクレオチ ドおよび Zまたは修飾リボヌクレオチドを含有するオリゴリボヌクレオチドプライマーも 含まれる。
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、铸型核酸 の塩基配列の一部に実質的に相補的な塩基配列を有する。なお、ここで「実質的に 相補的な塩基配列」とは、使用される反応条件において铸型となる DNAにァニーリ ング可能な塩基配列を意味する。
[0036] 本明細書において 3'側とは、核酸、例えば、プライマーにおいてその中央より 3'末 端にかけての部分をいう。同様に、 5'側とは、核酸においてその中央より 5'末端にか けての部分をいう。
[0037] 本明細書において上流領域とは、使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーと相 同的な铸型鎖において該キメラオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列の 5'末端よ りさらに 5'側方向の領域のことを言う。従って、該铸型鎖の相補鎖から見ると、上記キ メラオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列に相補的な配列の 3'末端よりさらに 3' 側方向の領域に相当する。
[0038] また、本明細書においてラダー形成のための塩基配列とは、本発明の方法に用い るキメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5'側の塩基配列、铸型となる核酸の当該キメ ラオリゴヌクレオチドプライマーと相同な領域の 5'末端よりさらに上流領域 (すなわち 、 5'側方向の領域）に相当する塩基配列あるいはその両方に相補的な塩基配列のこ とを言う。
[0039] 本明細書においてラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーとは、当該プライマーの 5'側に上記ラダー形成のための塩基配列を含むもののことを言う。
[0040] 本明細書において塩基配列の位置は、本発明の方法に用いるキメラオリゴヌクレオ チドプライマ一の 5'末端およびその位置に対する該キメラオリゴヌクレオチドプライマ 一がアニーリングする铸型鎖の位置を「0」とし、該キメラオリゴヌクレオチドプライマー の 3'末端側へ向けて順次整数で「 + 1」、「 + 2」、 · · ·とする。また、該铸型となる核酸 の「0」位置より 1塩基上流を「一 1」とし、上流へ向けて順次整数で「一 2」、 「一 3」、…と する。
[0041] 本明細書において RNaseH (リボヌクレアーゼ H)とは、铸型核酸にアニーリングし た上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーより DNAの伸長を行って生成した二本鎖 DNAに作用して、該プライマーのリボヌクレオチド部分を特異的に切断するものであ ればよい。
[0042] 本明細書において DNAポリメラーゼとは、 DNA鎖を铸型として新たな DNA鎖を 合成する酵素（DNA依存性 DNAポリメラーゼ)および RNA鎖を铸型として該 RNA 鎖に相補的な DNA鎖を合成する酵素 (RNA依存性 DNAポリメラーゼ)のことを ヽ 、天然型の DNAポリメラーゼの他、前記活性を有する変異体酵素も包含される。当 該酵素としては、例えば鎖置換（Strand displacement)活性を有する DNAポリメ ラーゼ、 5，→3，ェキソヌクレアーゼ活性を有していない DNAポリメラーゼ、逆転写酵 素活性や RNaseH活性を併せ持つ DNAポリメラーゼが挙げられる。
[0043] 本明細書にぉ 、て「鎖置換活性」とは、铸型となる核酸配列に従って DNA複製を 行う際、 DNA鎖を置き換えながら進行し、铸型鎖にアニーリングしている相補鎖を遊 離させる、即ち鎖置換（strand displacement)することができる活性のことをいう。 また、本明細書においては、鎖置換により铸型となる核酸配列力も遊離した DNA鎖 のことを「置換鎖」と称する。
[0044] 本明細書にぉ 、て「逆転写活性」とは、 RNA鎖を铸型として該 RNA鎖に相補的な DNA鎖を合成することができる活性のことを 、う。
[0045] (1)本発明の標的核酸の増幅方法
本発明の方法は、キメラオリゴヌクレオチドプライマー及びラダー形成オリゴヌクレオ チドプライマ一をそれぞれ少なくとも 1種類使用し、さらに RNaseHおよび DN Aポリメ ラーゼを組み合わせて実施することができる。また、 RNaseH活性を有する DNAポリ メラーゼを RNaseH活性が発現するような条件で使用することができる。
[0046] 本発明の方法により、等温条件下において、連続的に核酸が増幅される。ここで、「 連続的に」とは、反応温度、反応液組成の変更を伴わずに反応が進行していることを 意味する。また、「等温」とは、酵素および核酸鎖が下記各工程において機能する、 実質的に一定の温度条件のことを意味する。
[0047] 本発明の標的核酸の増幅方法の一態様としては、
(a)铸型となる核酸をデォキシリボヌクレオチド 3リン酸、逆転写活性を有する DNAポ リメラーゼ、及び少なくとも 1種類のラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーで処理し 、逆転写産物を得る工程、
(b)上記逆転写産物を鎖置換活性を有する DNAポリメラーゼ、少なくとも 2種類のキ メラオリゴヌクレオチドプライマー、および RNaseHを混合して反応混合物を調製する 工程、および、
(c)上記 DNAポリメラーゼによる伸長鎖合成反応及び鎖置換反応、並びに RNase Hによる伸長鎖の切断反応が行える一定の温度条件でラダー状増幅産物を生成す るのに充分な時間、反応混合物をインキュベートする工程、
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法が例示される。
ここで、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくともデォキシリボヌクレオ チド及びヌクレオチドアナログ力も選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボ ヌクレオチドは該プライマーの 3'末端又は 3'末端側に配置されており、
上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、铸型となる核酸の塩基配列に相補的な 第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと、铸型となる核酸の塩基配列に相同的な第 ニキメラオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも 2種類を含んでおり、
上記ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーは、铸型となる核酸の当該第一キメラ オリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領域およびその領域より 3 '側の塩基配列に 相補的であり、铸型となる核酸と相同的な第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5 ，側の塩基配列、铸型となる核酸の当該第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相 同な領域の 5'末端よりさらに上流領域 (すなわち、 5'側方向の領域）に相当する塩 基配列ある 、はその両方に相補的な塩基配列を 5 '側に有する。
また、本発明の別態様としては、
(a)铸型となる核酸、デォキシリボヌクレオチド 3リン酸、逆転写酵素活性を有する DN Aポリメラーゼ、鎖置換活性を有する DNAポリメラーゼ、少なくとも 2種類のキメラオリ ゴヌクレオチドプライマー、少なくとも 1種類のラダー形成オリゴヌクレオチドプライマ 一、および RNaseHを混合して反応混合物を調製する工程、および、
(b)铸型となる核酸へのプライマーの特異的なアニーリング、 DNAポリメラーゼによる 伸長鎖合成反応及び鎖置換反応、並びに RNaseHによる伸長鎖の切断反応が行え る一定の温度条件でラダー状増幅産物を生成するのに充分な時間、反応混合物を インキュベートする工程、
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法が例示される。
ここで、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくともデォキシリボヌクレオ チド及びヌクレオチドアナログ力も選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボ ヌクレオチドは該プライマーの 3'末端又は 3'末端側に配置されており、
上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、铸型となる核酸の塩基配列に相補的な 第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと、铸型となる核酸の塩基配列に相同的な第 ニキメラオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも 2種類を含んでおり、
上記ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーは、铸型となる核酸の当該第一キメラ オリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領域およびその領域より 3 '側の塩基配列に 相補的であり、铸型となる核酸と相同的な第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5 ，側の塩基配列、铸型となる核酸の当該第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相 同な領域の 5'末端よりさらに上流領域 (すなわち、 5'側方向の領域）に相当する塩 基配列ある 、はその両方に相補的な塩基配列を 5 '側に有する。
さらに本発明の別態様としては、
(a)铸型となる核酸、デォキシリボヌクレオチド 3リン酸、鎖置換活性を有する DNAポ リメラーゼ、少なくとも 2種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも 1種類の ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマー、および RNaseHを混合して反応混合物を 調製する工程、および、
(b)铸型となる核酸へのプライマーの特異的なアニーリング、 DNAポリメラーゼによる 伸長鎖合成反応及び鎖置換反応、並びに RNaseHによる伸長鎖の切断反応が行え る一定の温度条件でラダー状増幅産物を生成するのに充分な時間、反応混合物を インキュベートする工程、
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法が例示される。
ここで、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくともデォキシリボヌクレオ チド及びヌクレオチドアナログ力も選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボ ヌクレオチドは該プライマーの 3'末端又は 3'末端側に配置されており、
上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、铸型となる核酸の塩基配列に相補的な 第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと、铸型となる核酸の塩基配列に相同的な第 ニキメラオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも 2種類を含んでおり、
上記ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーは、铸型となる核酸の当該第一キメラ オリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領域およびその領域より 3 '側の塩基配列に 相補的であり、铸型となる核酸と相同的な第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5 ，側の塩基配列、铸型となる核酸の当該第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相 同な領域の 5'末端よりさらに上流領域 (すなわち、 5'側方向の領域）に相当する塩 基配列ある 、はその両方に相補的な塩基配列を 5 '側に有する。
[0050] 上記態様において、铸型となる核酸が 1本鎖の場合、第一キメラオリゴヌクレオチド プライマーは、当該鎖に相補的な塩基配列を有する。また、第二キメラオリゴヌクレオ チドプライマ一は、当該鎖の相補鎖に相補的、即ち当該鎖に相同的な塩基配列を有 する。さらにラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーは、当該鎖に相補的な塩基配列 及び当該鎖に相同な第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5 '側の塩基配列、当 該第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5，末端よりさらに上流領域に相当する塩 基配列あるいはその両方に相補的な塩基配列を 5'側に有する。また、铸型となる核 酸が 2本鎖の場合でも、いずれか一方の鎖において同様にプライマーを設計するこ とができることは言うまでもな!/、。
[0051] 上記態様の 、ずれにぉ 、ても、ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーをキメラォ リゴヌクレオチドプライマーに置き換えても良ぐこの場合ラダー形成オリゴヌクレオチ ドプライマ一の機能を当該キメラオリゴヌクレオチドプライマーが補うことができる。す なわち、ラダー形成に寄与することができるならば、オリゴヌクレオチドプライマー及び Z又はキメラオリゴヌクレオチドプライマーのいずれもが好適に使用できる。
特に限定はされないが例えば、ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーとして第一 キメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用することができる。この場合、第一キメラオリ ゴヌクレオチドプライマーは、铸型となる核酸と相同的な第二キメラオリゴヌクレオチド プライマーの 5，側の塩基配列、当該第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5，末 端よりさらに上流領域に相当する塩基配列あるいはその両方に相補的な塩基配列を 5'側に有している。
[0052] 当該方法では、伸長反応の基質となるヌクレオチド 3リン酸として PCR法等に使わ れる dNTP、すなわち dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTPの混合物が好適に使用できる 。また、 dUTPを基質として用いてもよい。さら〖こ、当該 dNTPは、使用される DNAポ リメラーゼの基質となる限りにおいては、 dNTP (デォキシリボヌクレオチド 3リン酸）の アナログ、たとえば 7-デァザ- dGTP、 dITP等のヌクレオチド 3リン酸を含んでいても よい。また、 dNTPあるいは dNTPアナログの誘導体を使用してもよぐ官能基を有す る誘導体、例えばアミノ基を有する dUTPを含んでいてもよい。当該方法では、キメラ オリゴヌクレオチドプライマーを使用する力 当該プライマーは、例えば、 DNA合成 機等を用いて通常の合成方法と同様に調製することができる。
[0053] 本発明の方法において铸型となる核酸、すなわち DNAまたは RNAは、当該核酸 を含む可能性のあるあらゆる試料力も調製、あるいは単離したものでもよい。さらに、 上記試料を直接、本発明の核酸増幅反応に使用してもよい。このような核酸を含む 試料には特に限定はないが、例えば、全血、血清、バフィ一コート、尿、糞便、脳脊 髄液、精液、唾液、組織 (例えば、癌組織、リンパ節等）、細胞培養物（例えば、哺乳 動物細胞培養物、細菌培養物等)のような生体由来試料、ウイロイド、ウィルス、細菌 、カビ、酵母、植物及び動物のような核酸含有試料、ウィルス又は細菌のような微生 物が混入もしくは感染している可能性のある試料 (食品、生物学的製剤等)、あるい は土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料が挙げられる。また、前記試 料等を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物であっても良い
。該調製物としては、例えば細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中 の核酸、あるいは特定の核酸分子群、例えば、 mRNAを富化した試料等が本発明 に使用できる。さらに上記試料中に含まれる核酸が公知方法で増幅された DNAある いは RNA等の核酸等も好適に使用できる。
[0054] これら材料力 の核酸含有調製物の調製には特に限定はなぐ例えば、界面活性 剤による溶解処理、超音波処理、ガラスビーズを用いた振盪攪拌、フレンチプレスの 使用等により行うことができる。幾つかの例においては、さらに操作を加えて核酸を精 製することが有利である（例えば、内在性ヌクレアーゼが存在するとき)。これらの例に おいて、核酸の精製はフエノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳 動または密度勾配遠心分離等の公知方法により実施される。
[0055] RNA由来の配列を有する核酸を増幅したい場合には、当該 RNAを铸型とした逆 転写反応によって合成された cDNAを铸型として本発明の方法を実施すればよい。 本発明の方法に適用することができる RNAには、逆転写反応に使用されるプライマ 一が作製可能なものであれば特に制限はなぐ試料中の全 RNAの他、 mRNA、 tR NA、 rRNA等の RNA分子群、あるいは特定の RNA分子種が挙げられる。
[0056] 上記の逆転写反応に使用される酵素としては、 RNAを铸型とした cDNA合成活性 を有するものであれば特に限定はなぐ例えばトリ骨髄芽球症ウィルス由来逆転写酵 素（AMV RTase)、モロ-一ネズミ白血病ウイノレス由来逆転写酵素（M— MLV R Tase)、ラウス関連ウィルス 2逆転写酵素（RAV— 2 RTase)等、種々の起源の逆転 写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つ DNAポリメラーゼを使用す ることもできる。また、本発明の目的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素が 好適であり、例えばサーマス属細菌由来 DNAポリメラーゼ (Tth DNAポリメラーゼ 等）、好熱性バチルス属細菌由来 DNAポリメラーゼ等を使用できる。特に限定はな いが、例えば、好熱性バチルス属細菌由来 DNAポリメラーゼが好ましぐ B. st由来 DNAポリメラーゼ（Bst DNAポリメラーゼ）、さらに Bca DNAポリメラーゼが好まし い。例えば、 Bca DNAポリメラーゼは、逆転写反応にマンガンイオンを必要とせず、 また、高温条件下で铸型 RNAの二次構造形成を抑制しながら cDNAを合成するこ とができる。上記の逆転写酵素活性を有する酵素も、当該活性を有している範囲に おいて天然体、変異体のいずれもが使用できる。
[0057] 本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、特に限定 するものではないが、好ましくは約 6—約 50塩基、さらに好ましくは約 10—約 40塩基 、特に好ましくは約 12—約 30塩基のオリゴヌクレオチドが本発明のキメラオリゴヌタレ ォチドプライマ一として使用される。その塩基配列は使用される反応条件において铸 型核酸にアニーリングするように、铸型核酸に相補的な配列であることが好ましい。 該プライマーは、後に示す段階で使用される RNaseHにより認識される配列を 3'末 端又は 3'末端側に含む。
[0058] 本発明を何ら限定するものではないが、例えば、下記一般式で表す構造をもつオリ ゴヌクレオチドを本発明の DNA合成方法にプライマーとして使用することができる。 一般式： 5 ' -dNa-Nb-dNc-3 '
(上記一般式において、 dN:デォキシリボヌクレオチド及び Z又はヌクレオチドアナ口 グ、 N :未修飾リボヌクレオチド及び Z又は修飾リボヌクレオチド、なお上記の各ヌクレ ォチドはその機能を損なわな 、範囲でヌクレオチドのアナログや誘導体 (修飾ヌクレ ォチド）を含有していてもよぐ dNa部位の一部の dNは Nで置換されていてもよい。 ) 上記一般式において、特に限定はされないが、例えば、 aは 5以上の整数であれば よぐ好ましくは 6以上の整数、さらに好ましくは 8以上の整数である。また、 bは 1以上 の整数であればよぐ例えば 1一 15の範囲、好ましくは 1一 10の範囲、さらに好ましく は 1一 7の範囲、特に好ましくは 1一 5の範囲である。さらに cは 0であってもよぐある いは 1以上の整数であり、好ましくは 0— 5の範囲、さらに好ましくは 0— 3の範囲であ る。
[0059] 本発明の方法において、ラダー状増幅産物を得るためにラダー形成オリゴヌクレオ チドプライマ一を使用しても良ぐ当該プライマーは、少なくともデォキシリボヌクレオ チド、リボヌクレオチドあるいはヌクレオチドアナログ力も選択されるものが好適に使用 できる。
[0060] 本発明の方法において使用されるラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーは、铸 型となる核酸と相同的な第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5 '側の塩基配列 あるいは当該第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5，末端よりさらに上流領域に 相当する塩基配列あるいはその両方に相補的な塩基配列を 5'側に付加されたもの が好適に使用できる。
[0061] 本発明にお 、て、 RNAを铸型とする場合には、ラダー形成オリゴヌクレオチドブラ イマ一を逆転写プライマーとして使用しても良ぐ使用される反応条件において铸型 RNAにァニールするものであれば特に限定されるものではな!/、。該プライマーは、 特定の铸型 RNAに相補的な塩基配列を有するプライマー (特異的プライマー）の他 、オリゴ dT (デォキシチミン)プライマーやランダムな配列を有するプライマー（ランダ ムプライマー）であっても良 ヽ。当該ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーにぉ ヽ て、铸型となる核酸の塩基配列の一部と相補的な配列の部分の長さは、特異的なァ ニーリングを行う観点から、好ましくは 6ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは 9ヌク レオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは 100ヌクレオチ ド以下であり、更に好ましくは 30ヌクレオチド以下である。すなわち、 RNAからの逆転 写反応に使用できるものであれば特に限定はない。
[0062] 当該ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーは、使用される条件にぉ 、て、ラダー 状 DNA鎖の伸長に寄与することができるものであれば得に限定はされない。当該プ ライマーは、铸型となる核酸と相同的なキメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5 '側の 塩基配列ある 、は当該キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5 '末端よりさらに上流領 域に相当する塩基配列あるいはその両方に相補的な塩基配列を有しているものが 好ましぐキメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域と相補的な配列は、特に何ら 限定するものではないが、好ましくは約 3—約 100ヌクレオチド、さらに好ましくは約 4 一約 50ヌクレオチド、特に好ましくは約 5—約 20ヌクレオチドの塩基長である。
[0063] また、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域と相補的な配列は、特に 何ら限定するものではないが、 + 20一— 100位置力も選択される 3塩基以上の配列、 好ましくは + 15 80位置から選択される 3塩基以上の配列、さらに好ましくは + 10 一一 60位置力 選択される 3塩基以上の配列、特に好ましくは + 5 40位置力 選 択されるから選択される 3塩基以上の配列である。当該塩基配列としては、特に限定 はされないが例えば、— 1位置、—11位置、—21位置力も始まる領域が挙げられる。
[0064] 当該ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーは、その機能を発揮できる限り、了二 一リングする位置は特に何ら限定はなぐキメラオリゴヌクレオチドプライマーと全ても しくは 1塩基以上重複する位置、隣接する位置、 1一 40塩基離れた位置のいずれで ちょい。
[0065] また、当該ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの GC含量は、特に限定はされ ないが、 40%以上の範囲が好適である。
[0066] さらに本発明の方法において使用されるラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーは 、ヌクレオチドアナログやその他の物質を含有するものであってもよい。すなわち、本 発明のラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーには、 DNAポリメラーゼがその 3'末 端力もポリメラーゼ伸長反応せしめる、プライマーの機能を失わない範囲で 1以上の ヌクレオチドアナログを含有させることができ、さらに、当該ヌクレオチドアナログは複 数の種類のものを組合せて使用することができる。該ヌクレオチドアナログとしては、 特に限定はされないが、例えば、デォキシイノシンヌクレオチド、デォキシゥラシルヌ クレオチドあるいは 7—デァザグァニンのような修飾塩基を有するヌクレオチドアナログ 、リボースの誘導体を有するヌクレオチドアナログ等を使用することができる。また、本 発明に使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、上記の機能を保持する範囲 内で種々の修飾、例えば標識化合物等の付加、あるいは、固定ィ匕用の官能基の付 加がなされたデォキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログを含有し てもよい。
ヌクレオチドアナログのプライマーへの導入は、プライマー自身の高次構造形成の 抑制、铸型とのアニーリング形成の安定ィ匕の観点力もも有効である。
[0067] 本発明の方法で用いられるキメラオリゴヌクレオチドプライマーおよびラダー形成ォ リゴヌクレオチドプライマーは、任意の核酸配列を持つように、例えばアプライド バイ ォシステムズ社 (ABI社、 Applied Biosystems Inc. )の DNAシンセサイザー 39 4型を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。また、別法としてリン酸トリエステ ル法、 H—ホスホネート法、チォホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成され たものであっても良い。
[0068] さらに本発明の別態様としては、
铸型となる核酸に本来存在している塩基配列を利用してラダー状増幅産物を得る ことができる。この場合ラダー形成は、铸型となる核酸上にある塩基配列を利用して 実施することができる。特に限定はされないが例えば、設定しょうとする一方のキメラ オリゴヌクレオチドプライマーの 5'側あるいはその上流にある塩基配列力 設定しょう とするもう一方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5，側あるいはその上流にある 塩基配列と相補的である場合、上記配置でキメラオリゴヌクレオチドプライマーを設定 することにより、効率よくラダー状増幅産物を得ることができる。また、ラダー形成を行 うことにより、検出感度および検出速度が向上する。
[0069] 上記铸型となる核酸上の双方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5'側あるいは その上流にある、相補的な塩基配列は、その GC含量、その近接する配列、プライマ 一との距離、増幅される長さ、反応条件等によって任意に設定することができ、特に 限定するものではないが、例えば 3塩基以上、好ましくは 6塩基以上の相補的な塩基 配列から選択することが好ましい。また当該配列は、特に限定するものではないが、 例えば上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5，末端を 0位とした場合、 + 20一— 100の領域、好ましくは + 15—— 80の領域、さらに好ましくは + 10—— 60の領域、特 に好ましくは + 5一一 40の領域である。
さらに铸型となる核酸上の双方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5'側、あるい はその上流にある相補的な配列は、その GC含量、その近接する配列、プライマーと の距離、増幅される長さ、反応条件等によって任意に設定することができ、特に限定 するものではな 、が、 70%の以上の相補性の範囲が好適である。
[0070] 本発明の方法で使用されるラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーを何ら限定す るものではな!/、が、後述の実施例にて用いて 、るラダー形成オリゴヌクレオチドプライ マーの構成を例として説明する。
[0071] 例えば、 A12— 205R (配列表の配列番号 3)の 1一 12番目の塩基は第二キメラオリ ゴヌクレオチドプライマー（ 134FN3 (18) ;配列表の配列番号 7)の 5，末端より 1一 12 塩基上流領域 (一 1一— 12)に相補的な塩基配列であり、さらに 13— 30番目の塩基 は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（205RN3 (18)；配列表の配列番号 2)と 相補的な領域に相補的な配列である。言い換えれば、当該 13— 30番目の塩基は第 一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相同な配列である。
[0072] 例えば、 A12— 215R (配列表の配列番号 5)の 1一 12番目の塩基は第二キメラオリ ゴヌクレオチドプライマー（ 134FN3 (18) ;配列表の配列番号 7)の 5，末端より 1一 12 塩基上流領域 (一 1一— 12)に相補的な塩基配列であり、さらに 13— 30番目の塩基 は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（205RN3 (18)；配列表の配列番号 2)の 5 '側 8塩基と相補的な領域および当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相 補的な領域より 3'側 10塩基の配列と相補的な配列である。言い換えれば、当該 13 一 30番目の塩基は、当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流 10塩基目 力も当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5'側 8塩基の配列と相同である。 A12— 215Rの 23— 30番目の塩基は 205RN3 (18)の 1一 8番目の塩基と重複して いる。
[0073] 例えば、 A12— 223R (配列表の配列番号 5)の 1一 12番目の塩基は第二キメラヌク レオチド（ 134FN3 (18) ;配列表の配列番号 7)の 5 '末端より 1一 12塩基上流領域（ — 1一— 12)に相補的な塩基配列であり、さらに 13— 30番目の塩基は第一キメラオリ ゴヌクレオチドプライマー（205RN3 (18)；配列表の配列番号 2)と相補的な領域より 3'側 18塩基の配列と相補的な配列である。言い換えれば、当該 13— 30番目の塩 基は当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流 18塩基目から上流 1塩基目 の配列と相同である。 A12— 223Rと 205RN3 (18)は隣接している。
[0074] 例えば、 A12 (— 10)—215R (配列表の配列番号 8)の 1一 12番目の塩基は第ニキ メラオリゴヌクレオチドプライマー（134FN3 (18)；配列表の配列番号 7)の 5'末端よ り 11一 22塩基上流領域 (一 11一- 22)に相補的な塩基配列であり、さらに 13— 30番 目の塩基は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（205RN3 (18)；配列表の配列 番号 2)の 5'側 8塩基と相補的な領域および当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライ マーと相補的な領域より 3 '側 10塩基の配列と相補的な配列である。言い換えれば、 当該 13— 30番目の塩基は、当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流 10 塩基目から当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5'側 8塩基の配列と相同 である。 A12 (— 10)— 215Rの 23— 30番目の塩基は 205RN3 (18)の 1一 8番目の 塩基と重複している。
[0075] 例えば、 A12 (— 20)—215R (配列表の配列番号 9)の 1一 12番目の塩基は第ニキ メラオリゴヌクレオチドプライマー（134FN3 (18)；配列表の配列番号 7)の 5'末端よ り 21— 32塩基上流領域 (一 21—- 32)に相補的な塩基配列であり、さらに 13— 30番 目の塩基は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（205RN3 (18)；配列表の配列 番号 2)の 5'側 8塩基と相補的な領域および当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライ マーと相補的な領域より 3 '側 10塩基の配列と相補的な配列である。言い換えれば、 当該 13— 30番目の塩基は、当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流 10 塩基目から当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5'側 8塩基の配列と相同 である。 A12 (— 20)— 215Rの 23— 30番目の塩基は 205RN3 (18)の 1一 8番目の 塩基と重複している。
[0076] 例えば、 A12 (6)— 215R (配列表の配列番号 10)の 1一 12番目の塩基は第二キメ ラオリゴヌクレオチドプライマー（134FN3 (18)；配列表の配列番号 7)の 5'末端側 6 塩基（ + 5-0)および 5 '末端より 1一 6塩基上流領域 (一 1一一 6)に相補的な塩基配 列であり、さらに 13— 30番目の塩基は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（205 RN3 (18) ;配列表の配列番号 2)の 5'側 8塩基と相補的な領域および当該第一キメ ラオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領域より 3'側 10塩基の配列と相補的な配 列である。言い換えれば、当該 13— 30番目の塩基は、当該第一キメラオリゴヌクレオ チドプライマ一の上流 10塩基目から当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5 '側 8塩基の配列と相同である。 A12 (6)— 215Rの 23— 30番目の塩基は 205RN3 ( 18)の 1一 8番目の塩基と重複している。
[0077] 例えば、 A12 (12)— 215R (配列表の配列番号 11)の 1一 12番目の塩基は第ニキ メラオリゴヌクレオチドプライマー（134FN3 (18)；配列表の配列番号 7)の 5'末端側 12塩基（ + 11— 0)に相補的な塩基配列であり、さらに 13— 30番目の塩基は第一キ メラオリゴヌクレオチドプライマー（205RN3 (18)；配列表の配列番号 2)の 5，側 8塩 基と相補的な領域および当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領 域より 3'側 10塩基の配列と相補的な配列である。言い換えれば、当該 13— 30番目 の塩基は、当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流 10塩基目から当該第 一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5，側 8塩基の配列と相同である。 A12 ( 12)— 215Rの 23— 30番目の塩基は 205RN3 (18)の 1一 8番目の塩基と重複している。
[0078] 例えば、 A6 (一 10)—215R (配列表の配列番号 14)の 1一 6番目の塩基は第二キメ ラオリゴヌクレオチドプライマー（ 134FN3 (18) ;配列表の配列番号 7)の 5，末端より 11一 16塩基上流領域 (一 11一— 16)に相補的な塩基配列であり、さらに 7— 24番目 の塩基は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（205RN3 (18)；配列表の配列番 号 2)の 5 '側 8塩基と相補的な領域および当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマ 一と相補的な領域より 3'側 10塩基の配列と相補的な配列である。言い換えれば、当 該 7— 24番目の塩基は、当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流 10塩基 目から当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5'側 8塩基の配列と相同である 。 A6 (— 10)— 215Rの 17— 24番目の塩基は 205RN3 (18)の 1一 8番目の塩基と重 複している。
[0079] 例えば、 A9 (— 10)—215R (配列表の配列番号 15)の 1一 9番目の塩基は第二キメ ラオリゴヌクレオチドプライマー（ 134FN3 (18) ;配列表の配列番号 7)の 5，末端より 11一 19塩基上流領域 (一 11一— 19)に相補的な塩基配列であり、さらに 10— 27番 目の塩基は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（205RN3 (18)；配列表の配列 番号 2)の 5'側 8塩基と相補的な領域および当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライ マーと相補的な領域より 3 '側 10塩基の配列と相補的な配列である。言い換えれば、 当該 10— 27番目の塩基は、当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流 10 塩基目から当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5'側 8塩基の配列と相同 である。 A9 (一 10)— 215Rの 20— 27番目の塩基は 205RN3 (18)の 1一 8番目の塩 基と重複している。
[0080] 例えば、（A12) 241RN3 (配列表の配列番号 19)の 1一 7番目の塩基は第二キメラ オリゴヌクレオチドプライマー（160FN3 ;配列表の配列番号 17)の 5，末端より 1一 7 塩基上流領域 (一 1一一 7)に相補的な塩基配列であり、さらに 8— 21番目の塩基は第 一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（241RN3；配列表の配列番号 18)と相補的な 領域に相補的な配列である。言い換えれば、当該 8— 21番目の塩基は、当該第一キ メラオリゴヌクレオチドプライマーと相同である。
[0081] 例えば、 ALDH2-TH1 (配列表の配列番号 25)の 1一 12番目の塩基は第二キメ ラオリゴヌクレオチドプライマー（ICAN— ALDH2— F；配列表の配列番号 21)の 5，末 端より 1一 12塩基上流領域 (一 1一一 12)に相補的な塩基配列であり、さらに 13— 29 番目の塩基は铸型とある核酸の第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー (ICAN— AL DH2— R;配列表の配列番号 22)の 5'側 15塩基と相補的な領域および当該第一キ メラオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領域より 3 '側 2塩基の配列と相補的な配 列である。言い換えれば、当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流 2塩基 目から当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5'側 15塩基の配列と相同であ る。 ICAN— ALDH2— Rの 2— 16番目の塩基は ALDH2— TH1の 15— 29番目の塩 基と重複している。
[0082] 例えば、 ALDH2-TH2 (配列表の配列番号 26)の 1一 12番目の塩基は第二キメ ラオリゴヌクレオチドプライマー（ICAN— ALDH2— F；配列表の配列番号 21)の 5，末 端より 1一 12塩基上流領域 (一 1一一 12)に相補的な塩基配列であり、さらに 13— 29 番目の塩基は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（ICAN— ALDH2— R;配列表 の配列番号 22)の 5 '側 6塩基と相補的な領域および当該第一キメラオリゴヌクレオチ ドプライマ一と相補的な領域より 3'側 10塩基の配列と相補的な配列である。言い換 えれば、当該 13— 29番目の塩基は当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 上流 10塩基目から当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5'側 6塩基の配列 と相同である。 ICAN— ALDH2— Rの 2— 7番目の塩基は ALDH2— TH2の 23— 28 番目の塩基と重複している。
[0083] 例えば、 ALDH2-TH3 (配列表の配列番号 27)の 1一 12番目の塩基は第二キメ ラオリゴヌクレオチドプライマー（ICAN— ALDH2— F；配列表の配列番号 21)の 5，末 端より 1一 12塩基上流領域 (一 1一一 12)に相補的な塩基配列であり、さらに 13— 28 番目の塩基は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（ICAN— ALDH2— R;配列表 の配列番号 22)と相補的な配列より 2— 17塩基 3 '側の塩基配列と相補的な配列で ある。言い換えれば、当該 13— 28番目の塩基は当該第一キメラオリゴヌクレオチドプ ライマーの上流 2— 17塩基目の配列と相同である。
[0084] 例えば、 R2 (— 13)A12—1 (配列表の配列番号 35)の 1一 12番目の塩基は第ニキ メラオリゴヌクレオチドプライマー (F2；配列表の配列番号 31)の 5 '末端より 1一 12塩 基上流領域 (一 1一一 12)に相補的な塩基配列であり、さらに 13— 29番目の塩基は 第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー (R2 ;配列表の配列番号 32)と相補的な配列 より 13— 29塩基 3'側の塩基配列と相補的な配列である。言い換えれば、当該 13— 29番目の塩基は当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流 13— 29塩基目 の配列と相同である。
[0085] 例えば、 R2 (— 13)A12—2 (配列表の配列番号 36)の 1一 12番目の塩基は第ニキ メラオリゴヌクレオチドプライマー (F2 ;配列表の配列番号 31)の 5'末端より 13— 24 塩基上流領域 (一 13 24)に相補的な塩基配列であり、さらに 13— 29番目の塩基 は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー (R2 ;配列表の配列番号 32)と相補的な配 列より 13— 29塩基 3'側の塩基配列と相補的な配列である。言い換えれば、当該 13 一 29番目の塩基は当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流 13— 29塩基 目の配列と相同である。
[0086] 例えば、 A6—215R (配列表の配列番号 47)の 1一 6番目の塩基は第二キメラオリゴ ヌクレオチドプライマー（B134FN3 ;配列表の配列番号 12)の 5 '末端より 1一 6塩基 上流領域 (- 1一- 6)に相補的な塩基配列であり、さらに 7— 24番目の塩基は第一キ メラオリゴヌクレオチドプライマー（205RN3 (16)；配列表の配列番号 13)の 5，側 8塩 基と相補的な領域および当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領 域より 3 '側 10塩基の配列と相補的である。言い換えれば、当該 7— 24番目の塩基 は当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流 10塩基目から当該第一キメラ オリゴヌクレオチドプライマーの 5，側 8塩基と相同である。 205RN3 ( 16)の 1一 8番 目の塩基は A6— 215Rの 17— 24番目の塩基と重複している。
[0087] 例えば、 A9—215R (配列表の配列番号 48)の 1一 9番目の塩基は第二キメラオリゴ ヌクレオチドプライマー（B 134FN3；配列表の配列番号 12)の 5 '末端より 1一 9塩基 上流領域 (一 1一— 9)に相補的な塩基配列であり、さらに 10— 27番目の塩基は第一 キメラオリゴヌクレオチドプライマー（205RN3 (16)；配列表の配列番号 13)の 5，側 8 塩基と相補的な領域および当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な 領域より 3 '側 10塩基の配列と相補的である。言い換えれば、当該 7— 24番目の塩 基は当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流 10塩基目から当該第一キメ ラオリゴヌクレオチドプライマーの 5，側 8塩基と相同である。 205RN3 (16)の 1一 8番 目の塩基と A6— 215Rの 20— 27番目の塩基が重複している。
[0088] 実施例 2— (1) (A)にて使用している第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー、第 ニキメラオリゴヌクレオチドプライマー、ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの位 置関係を例として図 1に示す。
[0089] 本発明の方法で用いられる RNaseHは、常温性から而熱性の RNaseHのいずれも が好適に本発明に使用できる。例えば、下記実施例に示すように、国際公開第 02Z 22831号パンフレット 実施例 8記載の方法で調製された Thermococcus litorali s由来の RNaseHII (以下、 Tli RNaseHIIと称す）や同パンフレット 実施例 7記載 の方法で調製された Archaeoglobus fulgidus由来の RNasell (以下、 Afu RNa seHIIと称す）が本発明の方法に使用することができる。該耐熱性 RNaseHとしては 、特に限定はされないが、例えば市販の Hybridase™ Thermostable RNaseH ( Epicentre Biotechnologies社製）の他、好熱性バチルス (Bacillus)属細菌、サ 一マス（Thermas)属細菌、ピロコッカス（Pyrococcus)属細菌、サーモトガ（Therm otoga)属細菌、アルカェォグロバス（Archaeoglobus)属細菌等由来の RNaseH等 も好適に使用できる。さらに、該 RNaseHは、天然体および変異体のいずれもが好 適に使用できる。
[0090] 本発明に使用される DNAポリメラーゼは、上記の鎖置換活性を有するものであれ ば特に限定はなぐ例えば、バチルス カルドテナックス（Bacillus caldotenax,以 下、 B. caと称す）やバチルス ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophi lus、以下 B. stと称す)等の好熱性バチルス属細菌由来 DNAポリメラーゼの 5 '→3 ' ェキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体や、大腸菌（以下、 E. coliと称す）由来の DNAポリメラーゼ Iのラージ フラグメント (タレノウ断片）等が挙げられる。また、本発 明に使用できる DNAポリメラーゼは、常温性力も耐熱性の 、ずれのものも好適に使 用できる。
B. caは生育至適温度が約 70°Cである好熱性細菌であり、この細菌由来の Bca D NAポリメラーゼは、 DNA依存 DNAポリメラーゼ活性、 RNA依存 DNAポリメラーゼ 活性 (逆転写活性）、 5，→3，ェキソヌクレアーゼ活性、 3，→5，ェキソヌクレアーゼ活 性を持つことが知られている。上記の酵素は、その本来の起源より精製して取得され たもの、あるいは遺伝子工学的に生産された組み換えタンパク質の何れであっても 良い。また、該酵素は、遺伝子工学的あるいはその他の手法によって置換、欠失、付 カロ、挿入等の改変をカ卩えたものであっても良ぐこのような酵素の例として、 5 '→3 'ェ キソヌクレアーゼ活性を欠損させた Bca DNAポリメラーゼである BcaBEST DNA ポリメラーゼ (タカラバイオ社製)等が挙げられる。また、該酵素は、日本特許第 2978 001号に記載の方法によって、該公報記載の微生物より調製することもできる。
[0091] なお、 DNAポリメラーゼの中には、特定の条件でエンドヌクレアーゼ活性、例えば 、 RNaseH活性を有するものが知られている。このような DN Aポリメラーゼを本発明 の方法に用いることができる。すなわち、該 DNAポリメラーゼを RNaseH活性が発現 されるような条件下、例えば Mn2+の存在下で使用する態様が挙げられる。該態様に おいては、上記 RNaseHを添加することなく本発明の方法を実施することができる。 すなわち、 Mn2+を含有する緩衝液中で上記の Bca DNAポリメラーゼが RNaseH 活性を示すことができる。なお、上記の態様は Bca DNAポリメラーゼに限定される ものではなく、 RNaseH活性を併せ持つことが知られて!/、る公知の DNAポリメラーゼ 、例えばサーマス サーモフィラス（Thermus thermophilus)由来の Tth DNAポ リメラーゼも本発明に使用することができる。
[0092] 本発明の方法において、ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーを使用する場合 ならびに第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーが当該ラダー形成オリゴヌクレオチド プライマーの機能を兼ねる場合、さらに铸型となる核酸上にある相補的な塩基配列を 利用してラダー状増幅産物を得る場合の 、ずれにお!、ても、当該反応にランダムプ ライマーを共存させることにより、反応が安定し効率よく目的の増幅産物を得ることが できる。上記ランダムプライマーには特に限定はないが、例えば 6塩基一 9塩基長の ランダムプライマーが好適に使用できる。
[0093] (2)本発明の組成物
本発明は、前述の本発明の核酸の増幅方法、または本発明の核酸の検出方法に 使用される組成物を提供する。該組成物としては、例えば、上記（1)に記載のラダー 形成オリゴヌクレオチドプライマー及び Z又はキメラオリゴヌクレオチドプライマー、 R NaseH、ならびに DNAポリメラーゼを含有するものが挙げられる。さらに、増幅反応 を行うための成分として、緩衝成分やマグネシウム塩、 dNTP等を含んでいてもよい。 さらに、修飾されたデォキシリボヌクレオチドあるいはデォキシヌクレオチド 3リン酸の アナログを含有していてもよい。さらに、緩衝成分やその他の添加物を使用すること ができる。
[0094] 特に好適な態様としては、本発明の核酸増幅方法に適した組成で上記の各種成 分が含有された組成物を挙げることができ、該組成物は適切な铸型とキメラオリゴヌク レオチドプライマ一及び Z又はラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーを添加するの みで増幅反応を実施することができる。さらに、増幅対象があらかじめ明らかである場 合には、当該増幅対象の増幅に適したキメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有する 組成物が好適である。
[0095] (3)本発明のキット
本発明は、前述の本発明の核酸の増幅方法に使用されるキットを提供する。 1つの 実施態様において、該キットは、ノ ッケージされた形態において、鎖置換反応におけ る DNAポリメラーゼ、 RNaseH、キメラオリゴヌクレオチドプライマー及び Z又はラダ 一形成オリゴヌクレオチドプライマーの使用のための指示書を含むことを特徴とする。 さらに、鎖置換活性を有する DNAポリメラーゼ、 RNaseHならびに鎖置換反応用緩 衝液を含むキットは本発明の方法に好適に使用される。あるいは、市販の鎖置換活 性を有する DNAポリメラーゼおよび Zまたは RNaseHを指示書に従って選択し、使 用してもよい。さらに、 RNAを铸型とする場合の逆転写反応用試薬を含んでもよい。 DNAポリメラーゼは、上記（1)記載の本発明に使用される DNAポリメラーゼ力 選 択することができる。また、 RNaseHは、上記（1)記載の RNaseHから選択することが できる。
[0096] 上記「指示書」とは、当該キットの使用方法、例えば鎖置換反応用試薬液の調製方 法、推奨される反応条件等を記載した印刷物であり、パンフレットまたはリーフレット 形式の取り扱い説明書のほか、キットに添付されたラベル、キットが納められたパッケ ージ等に記載されたものを含む。さらに、インターネットのような電子媒体を通し、開 示、提供された情報も含まれる。
[0097] さらに、本発明のキットにおいては、 Bicine、 Tricine、 HEPES、リン酸塩あるいは t ris—塩酸緩衝成分を含有する反応バッファー、及びアニーリング溶液が含まれて!/ヽ てもよい。また、鎖置換能を有する DNAポリメラーゼゃ RNaseHが含まれていてもよ い。さらに、修飾されたデォキシリボヌクレオチドあるいはデォキシヌクレオチド 3リン 酸のアナログを含有して 、てもよ 、。
[0098] さらに、標的核酸の検出方法に使用されるキットは、上記の指示書、増幅反応のた めの試薬類の他、標的核酸の増幅に適したキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマー、増幅された標的核酸を検出するための試 薬、例えばプローブ等を含むものであってもよい。
[0099] (4)本発明の標的核酸の検出方法
本発明の核酸の増幅方法を使用することにより、試料中の標的核酸の検出を行うこ とができる。当該検出方法の一態様としては、
(a)上記（1)記載の本発明の核酸の増幅方法により、標的核酸を増幅する工程;お よび、
(b)上記工程により増幅された標的核酸を検出する工程；
を包含する検出方法が挙げられる。
[0100] 上記 (a)行程にぉ 、て、 RNAを铸型とする場合は、逆転写反応と核酸増幅反応を 1段階もしくは 2段階で行ってもよい。特に限定はされないが、逆転写酵素と鎖置換 型 DNAポリメラーゼの組み合わせとして例えば、 AMV RTase、 M— MLV RTase あるいは RAV— 2 RTaseと BcaBEST DN Aポリメラーゼの組み合わせが好適に 使用できる。あるいは、逆転写活性と鎖置換活性を有する DNAポリメラーゼを使用し ても良ぐ例えば BcaBEST DNAポリメラーゼが好適に使用できる。
[0101] さらに、本発明の標的核酸の検出方法により、点突然変異、一塩基置換 (Single nucleotide polymorphysm、 SNP)のような遺伝子上の特定の塩基についての情 報を得ることが可能である。この態様においては、使用されるキメラオリゴヌクレオチド プライマーの 3'末端部分が、標的とされる塩基配列の判別しょうとする特定の塩基付 近に位置するようにすればよ!、。
[0102] さらに、本発明の検出方法では、 Bicine、 Tricine、 HEPES、リン酸塩あるいは tri s緩衝成分を含有する反応バッファー、及びスペルミジンやプロピレンジァミンを含有 するアニーリング溶液の使用により、微量の核酸試料からもさらに高感度に標的核酸 を検出することができる。この場合、使用する RNaseHと DNAポリメラーゼは特に限 定はされないが、例えばサーモコッカス属細菌由来の RNaseHII及び BcaBEST D NAポリメラーゼの組み合わせが好ましい。特に、上記 RNaseH及び DNAポリメラー ゼはともにその種類によって好適に使用できるユニット数が異なる場合が予想される 力 その際には検出感度の向上あるいは増幅産物量の増加を指標にして、該バッフ ァ一の組成および酵素の添加量を調整すればよい。
[0103] 本発明の検出方法においては、標的核酸の増幅の際に、 dUTPを基質として取り 込ませることができる。したがって、 dUTPを基質に用いた場合には、ゥラシル N—グ リコシダーゼ（uracil N— glycosidase :UNG)を利用して増幅産物を分解し、増幅 産物のキャリーオーバーコンタミネーシヨンによる偽陽性を防止することができる。
[0104] 上記 (b)工程には公知の核酸検出方法、例えば電気泳動により特定のサイズの反 応産物を検出する方法や、スマートサイクラ一（タカラバイオ社製）、 Rotor gene (C ORBETT RESEARCH社製）等を用いたリアルタイム検出、プローブとのハイブリ ダイゼーシヨンによる検出等を使用することができる。また、磁気ビーズ等を組み合わ せた検出方法も好適に使用できる。さらに、標的核酸の増幅工程時に生成するピロリ ン酸をマグネシウム塩のような不溶性物質とさせて反応液を白濁させ、その濁度を測 定しても良い。
上記電気泳動による検出には、通常、ェチジゥムブロマイド等の蛍光物質が使用さ れるが、プローブとのハイブリダィゼーシヨンを組み合わせてもよい。また、プローブは 放射性同位元素による標識の他、ピオチンや蛍光物質のような非放射性の標識を施 したものが使用できる。リアルタイム検出を行う際、サイバーグリーン (タカラバイオ社 製)の発色用試薬が好適に使用できる。この他、上記 (a)工程において標識ヌクレオ チドを使用することにより、増幅産物に標識ヌクレオチドを取り込ませて検出を容易に することゃ該標識を利用した検出用シグナルの増強を行うことができ、さらに蛍光偏 光法、蛍光エネルギー転移等を利用した検出を行うことも可能である。さらに、適切な 検出系を構築することにより、標的核酸を自動的に検出することや、あるいは標的核 酸の定量を行うことが可能である。また、ノ、イブリツドク口マト法による肉眼検出法も好 適に使用できる。
消光状態になるような距離で配置された 2種類以上の蛍光物質で標識されたリボヌ クレオチド (RNA)プローブあるいはリボヌクレオチド及びデォキシリボヌクレオチドで 構成されるキメラオリゴヌクレオチドプローブのいずれもが本発明の検出方法に使用 することができる。当該プローブは蛍光を発することはないが、これに相補的な標的 核酸由来の増幅 DNAにアニーリングした場合、 RNaseHは該プローブを分解する。 この結果、プローブ上の蛍光物質間の距離が増大して蛍光が発せられるようになり、 標的核酸の存在を知ることができる。 RNaseHを使用して本発明の核酸の増幅方法 が実施された場合には、その反応液中に上記のプローブを添加するだけで標的核 酸を検出することができる。当該プローブの標識に使用される蛍光物質としては、例 えば、 ROX (Applied Biosystems社製）や FAM (Applied Biosystems社製）、 クェンチング物質としては、例えば、 Eclipse (Epoch Biosciences社製）との組み 合わせが好適に使用できる。
[0106] 本発明で用いるプローブは、上記の本発明の核酸の増幅方法により増幅された核 酸に通常のハイブリダィゼーシヨンの条件において標的核酸にハイブリダィズし得る ものであれば特に限定はないが、増幅産物を特異的に検出する観点からは、例えば 厳密な条件として当業者に知られている条件でハイブリダィズするものが好ましい。 前記、厳密なハイブリダィゼーシヨン条件は、例えば 1989年、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行、 τ マニアテイス（T. Maniatis)ら編集、モレキュラー クロー-ング：ァ ラボラトリー マニュアル第 2版（Molecular Cloning ： A Lab oratory Manual 2nd ed. )に記載されている。具体的な厳密な条件としては、 例えば以下の条件を挙げることができる。すなわち、 0. 5%SDS、 5 Xデンハルツ [D enhardt，s、 0. 1%ゥシ血清アルブミン（BSA)、 0. 1%ポリビュルピロリドン、 0. 1% フイコール 400]及び 100 μ g/mlサケ精子 DNAを含む 6 X SSC (1 X SSCは 0. 15 M NaCl、0. 015M クェン酸ナトリウム、 pH7. 0)中で、使用するプローブの Tm 値より約 25°C低い温度で 4時間一一晚保温を行う条件を言う。前記プローブは、標 的核酸の検出を容易にするために上記のような標識を付されたものを使用することが できる。
[0107] 本発明の標的核酸の検出方法においては、増幅領域が連なったラダー状増幅産 物を積極的に生成させる。このようなラダー状増幅産物は増幅領域が複数個、任意 の塩基配列を介して 、ずれも同じ向きに重合したものであり、電気泳動による増幅産 物の解析ではラダー状のバンドとして確認される。当該ラダー状増幅産物の生成は、 増幅される領域、該領域のサイズ、その隣接領域、使用されるキメラオリゴヌクレオチ ドプライマ一及び Z又はラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列あるい は反応の条件等により調整することができる。
[0108] 本発明の検出方法においては、上記ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマー及び Z又はキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用することができ、増幅領域が連なつ た重合体を生成する。このようなラダー状増幅産物は、複数個の増幅領域カ^ダー 形成オリゴヌクレオチドプライマーと第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5，側あ るいはその上流領域に相補的な配列を介して同じ向きに連なったものである。さらに 本発明の方法においては、铸型となる核酸上の一方のキメラオリゴヌクレオチドプライ マーの 5'側あるいはその上流にある塩基配列がもう一方のキメラオリゴヌクレオチド プライマーの 5'側あるいはその上流にある塩基配列と相補的な場合、当該位置にキ メラオリゴヌクレオチドプライマーを設定することにより、標的核酸を感度良く検出する ことができる。
[0109] さらに上記ラダー状増幅産物は、増幅領域を複数個含むものであるので、例えば 適切なプローブとのハイブリダィゼーシヨンによって多数のプローブとハイブリダィズ することができる。当該プローブとしては、標的核酸の塩基配列及び Z又は上記ラダ 一状増幅産物中の標的核酸配列間に存在する介在配列にハイブリダィズするもの のいずれもが好適に使用できる。その結果、強いシグナルを発生することから、増幅 領域を含む核酸の検出を目的とする場合に有用である。また、制限酵素消化等を組 み合わせて、ラダー状増幅産物より増幅領域、またはその一部をモノマーとして得る ことちでさる。
[0110] 本発明の核酸の増幅方法の等温下における増幅方法においては、サーマルサイク ラーのような装置を必要としない。 dNTPのような試薬も PCR等で用いられるものを流 用できるため、ランニングコストを従来法よりも低くすることができる。そのため、ルーチ ンワークを行なっている遺伝子検査等の分野で好適に使用できる。さらに、本発明の 方法は PCR法よりも短時間により多くの増幅産物を得られることから、簡便、迅速、高 感度な遺伝子検出方法として利用することができる。
実施例
[0111] 以下の実施例により、さらに詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲 に何ら限定されるものではな 、。
[0112] 参考例 1
実施例における耐熱性 RNaseHの unit数は、以下の方法により算出した。 ポリ（rA)及びポリ（dT) (ともにアマシャム バイオテク社製） lmgをそれぞれ ImM
EDTAを含む 40mM tris— HCl (pH7. 7) lmlに溶解し、ポリ（rA)溶液及びポリ（d
T)溶液を調製した。
次に、 20mM HEPES-KOH (pH7. 8)、 lOOmM 酢酸カリウム、 1%ジメチル スノレホキシド、 0. 01%BSAに、終濃度 30 gZmlとなるポリ（rA)溶液、終濃度 20 /z gZmlとなるポリ（dT)溶液を加え、 37°Cで 10分間保持後、室温冷却した後、 lZ 100容量の 400mM 酢酸マグネシウムをカ卩えてポリ（rA)—ポリ（dT)溶液を調製した このポリ（rA)—ポリ（dT)溶液 800 1に、任意に希釈した酵素液 8 1を加え、 40 °Cで 20分間反応させ、吸光度 (A260)を経時的に測定し、その変化量を求めた。す なわち、酵素反応によって、ポリ（rA)-ポリ（dT)ハイブリッドから遊離したヌクレオチド の濃度を吸光度差から求めた。 RNaseHの 1単位は、 lnmolのリボヌクレオチドが遊 離したのに相当する A260を 20分間に増加させる酵素量とし、下記の式に従って算 出し 7こ。
単位 (unit) = 1分あたりの吸光度の変化量 X 57. 1 X希釈率
実施例 1
(1)铸型 RNAの調製
RT— ICANの铸型として使用した RNA transcriptは、 in vitro transcription によって合成した。
まず、 in vitro transcriptionの铸型となるプラスミド DNAを人工合成遺伝子作 製受託サービス (タカラバイオ社）に依頼して合成した。配列は、 SARS (重症急性呼 吸器症候群； Severe Acute Respiratory Syndrome)コロナウイノレスゲノム配列 (GenBank Acc. No. ： AY278741)の 18133番目一 18362番目（配列表の配 列番号 1)を用いた。プラスミドに挿入するため、該配列の 5'末端に Hindlll認識配 列を、 3 '末端に BamHI認識配列を付カ卩した。この断片を pBluescriptll SK ( + )の HindIII、 BamHIサイトに挿入した。得られたプラスミドを BamHIで切断して直鎖 D NAとし、 T7 RNA polymeraseによる in vitro transcriptionの铸型とした。 in vitro transcriptionには、 MEGAscript T7 Kit (Ambion社製）を用いた 。キットに添付されている取扱説明書に従って、 in vitro transcription, DNasel 処理、 RNAの精製を行い、合成された RNAの濃度を OD260により測定した。この R NA溶液を RNA Dilution Buffer (10mM Tris— HCl (pH7. 5)、 lmM EDT A、 lOmM NaCU 30 μ g/ml E. coli 16S + 23S rRNA (Boehringer Inger heim社製)）にて 10— 105コピー/ μ 1に濃度調整し、 RT— ICANの铸型として用い た。
[0114] (2) 2step RT— ICANの検討
(A)検討 1
逆転写プライマーの 5，末端に第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域 にァニールする配列を付加することによる効果について検討した。
[0115] 第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域 (一 1一一 12)にァニールする 12 塩基を 5，末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーを逆転写プライマ 一として使用することによる RT— ICANの感度、検出速度の変化を見た。
上記実施例 1-(1)で調製した铸型 RNAを OD260値より計算し、 1 μ 1あたり 10、 101、 102、 103、 104、 105コピーに調製した。最終濃度 32mM HEPES— KOH緩 衝液（pH7. 8)、 lOOmM 酢酸カリウム、 1%ジメチルスルホキシド、 0. 11%BSA、 4mM 酢酸マグネシウム、各 500 M dNTPsに、上記逆転写プライマーとして 20 5RN3 (18)プライマー（配列表の配列番号 2)、 A12— 205Rプライマー（配列表の配 列番号 3)、 215Rプライマー（配列表の配列番号 4)、八12—215!^7°ラィマー（配列 表の配列番号 5)あるいは、 A12— 223Rプライマー（配列表の配列番号 6) 各 lpmo 1、 RTase M— MLV (タカラバイオ社製） 12. 5U、 1 μ 1の各コピー数の铸型 RNA を添加した 10 μ 1の反応液を調製した。
[0116] 該反応液はサーマルサイクラ一パーソナル (タカラバイオ社製）にセットし、 45°C、 1 0分間保持後、 4°Cに冷却した。逆転写反応終了後、該反応液 10 1に最終濃度 32 mM HEPES— KOH緩衝液（pH7. 8)、 lOOmM 酢酸カリウム、 1%ジメチルスル ホキシド、 0. 11%BSA、 4mM 酢酸マグネシウム、各 M dNTPsに、第ニキ メラオリゴヌクレオチドプライマーの 134FN3 (18)プライマー（配列表の配列番号 7) と第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 205RN3 (18)プライマー 各 25pmol、 BcaBEST (タカラバイオ社製） 11U、国際公開第 02/22831号パンフレット 実 施例 8に記載の方法で調製した Tli RNaseHII 0. 05U、サイバーグリーン (タカラ バイオ社製）を含む反応液 15 μ 1を添カ卩し、 Rotor gene (CORBETT RESEAR CH社製）により 55°Cで ICAN反応を行い、増幅産物をリアルタイムで検出した。また 、反応産物は 3%ァガロースゲル電気泳動によっても確認した。
[0117] その結果、 205RN3 (18)プライマーで逆転写した RT— ICANの感度が 104コピー であるのに対し、同じ位置で第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域 (一 1 一— 12)にァニールする 12塩基を 5，末端に付カ卩した逆転写プライマー A12— 205R を用いた場合、感度は 102コピーとなり、感度が 2桁向上した。また、 105コピーの検 出速度も約 2分速くなつた。
[0118] 同様に、 215R DNAプライマーで逆転写した RT— ICANの感度が 103コピーであ るのに対し、同じ位置で第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域 (一 1一— 12)にァニールする 12塩基を 5'末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライ マー A12-215Rプライマーを逆転写に用いた場合、感度は 10コピーとなり、感度 力 S3桁向上した。また、 105コピーの検出速度も約 2分速くなつた。
[0119] また、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域 (一 1一一 12)にァニール する 12塩基を 5'末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマー A12— 22 3Rを逆転写に用いた場合の感度も 101コピーであった。
[0120] 以上のことから、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域 (一 1一一 12)に ァニールする 12塩基を 5 '末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーを 逆転写に用いることにより、当該プライマーが铸型 RNAにァニールする位置にかか わらず、感度、検出速度の向上が認められた。
[0121] (B)検討 2
ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの 5，末端に付加する、第二キメラオリゴヌク レオチドプライマ一の上流領域および Zまたは該 primerの一部にァニールする 12 塩基の位置（一 1一一 12 11一一 22 21 32、 + 5一一 6、 + 11— 0)を変え、逆 転写プライマーとして使用することにより、同様の検討を行った。
まず、上記実施例 1一（1)で調製した铸型 RNAを OD260値より計算し、： L 1あたり 10°、 101、 102、 103、 104、 105コピーに調製した。
最終濃度 32mM HEPES— KOH緩衝液（pH7. 8)、 lOOmM 酢酸カリウム、 1 %ジメチルスルホキシド、 0. 11%BSA、 4mM 酢酸マグネシウム、各 500 M dN TPsに、上記逆転写プライマーとしてラダー形成オリゴヌクレオチドプライマー 215 Rプライマー、 A12—215Rプライマー、 A12 (— 10)—215Rプライマー（配列表の配 列番号 8) A12 (— 20)— 215Rプライマー（配列表の配列番号 9) A12 (6)— 215R (配列表の配列番号 10)、あるいは、 A12 (12)— 215R (配列表の配列番号 11) 各 lpmol RTase M— MLV (タカラバイオ社製） 50U 1 μ 1の各コピー数の铸型 RN Aを添加した 10 μ 1の反応液を調製した。
[0122] 該反応液はサーマルサイクラ パーソナル (タカラバイオ社製）にセットし、 45°C 1 0分間保持後、 4°Cに冷却した。逆転写反応終了後、該反応液 10 1に最終濃度 32 mM HEPES— KOH緩衝液（pH7. 8)、 lOOmM 酢酸カリウム、 1%ジメチルスル ホキシド、 0. 11%BSA 4mM 酢酸マグネシウム、各 500 M dNTPsに第二キメ ラオリゴヌクレオチドプライマーの B134FN3 (16)プライマー（配列表の配列番号 12 )と第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 205RN3 (16)プライマー（配列表の配 列番号 13) 各 25pmol BcaBEST (タカラバイオ社製） l lU Tli RNaseHII 0 . 05U、サイバーグリーン (タカラバイオ社製)を含む反応液 15 /z lを添加し、 Rotor gene (CORBETT RESEARCH社製）により 55°Cで ICAN反応を行い、増幅産物 をリアルタイムで検出した。また、反応産物は 3%ァガロースゲル電気泳動によっても 確認した。
[0123] その結果、上記 215Rプライマーで逆転写した RT-ICANの感度が 102コピーであ るのに対し、同じ位置で第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域 (一 1 12)にァニールする 12塩基を 5'末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライ マーの A12-215Rを用いた場合、感度は 101コピーとなり、感度が 1桁向上した。ま た、 105コピーの検出速度も約 3分速くなつた。
[0124] 第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域 (一 11 22)にァニールする 1 2塩基を 5 '末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの A12 (— 10)— 2 15Rを用いた場合の感度は 102コピーで、 215Rプライマーの場合と同じであつたが 10&コピーの検出速度は約 2分速くなつた。また、 10コピーから 10&コピーの検出は 215Rプライマーの場合に比べて定量性 (相関係数 0. 997)がみられた。
[0125] 第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域 (一 21—— 32)にァニールする 1 2塩基を 5 '末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの A12 (— 20)— 2 15Rを用いた場合、感度は 101コピーとなり、感度が 1桁向上した。また、 105コピー の検出速度も約 2. 5分速くなつた。
[0126] 第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域および該 primerの一部にァ- ールする 12塩基を 5 '末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの A1 2 (6)— 215R、および第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの一部にァニールする 12塩基を 5，末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの A12 ( 12)— 2 15Rを用いた場合も、上記プライマーと同様に検出感度、検出速度共に向上した。
[0127] 以上のことから、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域にァニールす る 12塩基の配列の位置を変えて 5 '末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプ ライマーのいずれにおいても、感度、検出速度の向上が認められた。
[0128] (C)検討 3
ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの 5，末端に付加する、第二キメラオリゴヌク レオチドプライマ一の上流領域にァニールする塩基の長さを 6塩基、 9塩基、 12塩基 (一 11一— 16、 -11一— 19、 -11一— 22)とした逆転写プライマーを用いて、 RT— IC ANの感度、検出速度を検討した。
まず、上記実施例 1一（1)で調製した铸型 RNAを OD260値より計算し、： L 1あたり 10。、 101、 102、 103、 104、 105コピーに調製した。
最終濃度 32mM HEPES— KOH緩衝液（pH7. 8)、 lOOmM 酢酸カリウム、 1 %ジメチルスルホキシド、 0. 11%BSA、 4mM 酢酸マグネシウム、各 500 M dN TPsに、上記逆転写プライマーとしてラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの 215 Rプライマー、 A6 (一 10)—215Rプライマー（配列表の配列番号 14)、 A9 (-10) -21 5Rプライマー（配列表の配列番号 15)、あるいは、 A12 (— 10)— 215Rプライマー 各 lpmol、 RTase M— MLV (タカラバイオ社製） 50U、 1 μ 1の各コピー数の铸型 RNAを添カ卩した 10 μ 1の反応液を調製した。
[0129] 該反応液はサーマルサイクラ一パーソナル (タカラバイオ社製）にセットし、 45°C、 1 0分間保持後、 4°Cに冷却した。逆転写反応終了後、該反応液 10 1に最終濃度 32 mM HEPES— KOH緩衝液（pH7. 8)、 lOOmM 酢酸カリウム、 1%ジメチルスル ホキシド、 0. 11%BSA、 4mM 酢酸マグネシウム、各 M dNTPsに、第ニキ メラオリゴヌクレオチドプライマーの B134FN3 (16)プライマーと第一キメラオリゴヌク レオチドプライマ一の 205RN3 (16)プライマー 各 25pmol、 BcaBEST (タカラバイ ォ社製） l lU、Tli RNaseHII 0. 05U、サイバーグリーンを含む反応液 15 1を 添加し、 Rotor gene (CORBETT RESEARCH社製）により 55°Cで ICAN反応 を行い、増幅産物をリアルタイムで検出した。また、反応産物は 3%ァガロースゲル電 気泳動によっても確認した。
[0130] その結果、 215Rプライマーで逆転写した RT-ICANの感度が 103コピーであるの に対し、同じ位置で第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域 (一 11一— 16 )にァニールする 6塩基を 5，末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマー の A6 (-10)— 215Rを用いた場合、感度は 102コピーとなり、感度が 1桁向上した。ま た、 105コピーの検出速度も約 1分速くなつた。
[0131] 第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域 (一 11一— 19)にァニールする 9 塩基を 5'末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの A9 (-10)-215 Rを用いた場合の感度は 101コピーとなり、感度が 2桁向上した。また、 105の検出速 度も約 2. 5分速くなつた。
[0132] 第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域 (一 11一— 22)にァニールする 1 2塩基を 5 '末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの A12 (— 10)— 2 15Rを用いた場合、感度は 101コピーとなり、感度が 2桁向上した。また、 105の検出 速度も約 3分速くなつた。
[0133] 以上のことから、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域にァニールす る塩基の数を変えて 5，末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーにお いて、 6塩基以上の付加で、感度、検出速度の向上が認められた。その効果は第二 キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域にァニールする塩基の数が多いほど 大きいことが確認できた。
[0134] (D)検討 4
第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域 (一 1一一 12)にァニールする 12 塩基を 5 '末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの A12— 215Rを 用いた、 RT— ICANの検出速度、定量性について検討した。 まず、上記実施例 1-(1)で調製した铸型 RNAを OD260値より計算し、： L 1あたり 10°、 101、 102、 103、 104、 105コピーに調製した。
最終濃度 32mM HEPES— KOH緩衝液（pH7. 8)、 lOOmM 酢酸カリウム、 1 %ジメチルスルホキシド、 0. 11%BSA、 4mM酢酸マグネシウム、各 500 μ M dNT Psに、 A12— 215Rプライマー lpmol、 RTase M— MLV (タカラバイオ社製） 50 U、 1 1の各コピー数の铸型 RNAを添カ卩した 10 μ 1の反応液を調製した。
[0135] 該反応液はサーマルサイクラ一パーソナル (タカラバイオ社製）にセットし、 45°C、 1 0分間保持後、 4°Cに冷却した。逆転写反応終了後、該反応液 10 1に最終濃度 32 mM HEPES— KOH緩衝液（pH7. 8)、 lOOmM 酢酸カリウム、 1%ジメチルスル ホキシド、 0. 11%BSA、 4mM 酢酸マグネシウム、 500 M dNTPsに、第二キメ ラオリゴヌクレオチドプライマーの B134FN3 (16)プライマーと第一キメラオリゴヌタレ ォチドプライマ一の 205RN3 (16)プライマー 各 25pmol、 BcaBEST (タカラバイオ 社製） l lU、Tli RNaseHII 0. 05U、サイバーグリーンを含む反応液 15 1を添 加し、 Rotor gene (CORBETT RESEARCH社製）により 55°Cで ICAN反応を 行い、増幅産物を 1サイクル（1分)毎にリアルタイムで検出した。
[0136] 増幅曲線を図 2に示す。図 2に示したように、 101— 105コピーが定量的 (相関係数 0 . 992)に検出され、 10サイクル以内に 10コピーまでの反応の立ち上がりが確認でき た。
[0137] さらに、クロマトストリップへの展開による、プローブハブリダィゼージョン法でも増幅 産物の確認を行った。
[0138] クロマトストリップへの展開による、プローブハブリダィゼージョン法での増幅産物の 確認は、 TaKaRa Bed— Side ICAN blaIMP Detection Kit (タカラバイオ社製 )に含まれる Detection Setを用い、その取扱説明書に記載されている検出方法に 従って行った。ただし、今回の検出では、プローブとして FITC標識プローブ SARS— BNI— B (配列表の配列番号 16)を含む Probe Solutionを使用し、上記キットに含 まれる blaMP Probe Solutionおよび IC Probe Solutionは使用しなかった。
[0139] その結果、 10— 105コピー Z反応の増幅産物により、赤紫色のラインの呈色が認 められ特異的な増幅が確認出来た。 [0140] (3) 1 step RT— ICANの検討
(A)検討 1
第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5，末端に第二キメラオリゴヌクレオチドプ ライマーの上流領域にァニールする配列を付加し、ラダー形成オリゴヌクレオチドプ ライマーとして使用することによる効果にっ 、て検討した。
[0141] 第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域 (一 1一一 7)にァニールする 7塩 基を第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5，末端に付加することによる RT— ICA Nの感度、検出速度について検討した。第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5， 末端に 7塩基付加することで、第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5'末端から 12塩基が第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域 (一 1一一 12)にァニー ルする配列となる。逆転写反応と ICAN反応は同一チューブ内で同時に行った。 まず、上記実施例 1-(1)で調製した铸型 RNAを OD260値より計算し、： L 1あたり 100、 101、 102、 103、 104、 105コピーに調製した。最終濃度 32mM HEPES— KO H緩衝液（pH7. 8)、 lOOmM 酢酸カリウム、 1%ジメチルスルホキシド、 0. 11%B SA、 4mM 酢酸マグネシウム、各 500 μ M dNTPsに、第二キメラオリゴヌクレオチ ドプライマ一の 160FN3プライマー（配列表の配列番号 17)と第一キメラオリゴヌタレ ォチドプライマ一の 241RN3プライマー（配列表の配列番号 18)あるいは第一キメラ オリゴヌクレオチドプライマーの（A12) 241RN3プライマー（配列表の配列番号 19) 各 25pmol、 RTase M— MLV (タカラバイオ社製） 50U、 BcaBEST (タカラバイ ォ社製） l lU、 Tli RNaseHII 0. 05U、サイバーグリーン（タカラバイオ社製）を 含む反応液 24 1に 1 1の各コピー数の铸型 RNAを添カ卩し、 Rotor gene (CORB ETT RESEARCH社製）により 45°Cで 5分、 55°Cで 45分保持し、増幅産物をリア ルタイムで検出した。反応産物は 3%ァガロースゲル電気泳動によっても確認した。
[0142] その結果、第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 241RN3を用いた RT— ICAN の感度が 105コピーであるのに対し、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流 領域 (一 1一— 7)にァニールする 7塩基を 5'末端に付加した (A12) 241RN3プライマ 一を用いた場合、感度は 103コピーとなり、感度が 2桁向上した。また、 105コピーの 検出速度も約 1分速くなつた。 [0143] 以上のことから、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域にァニールす る配列を第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5 '末端に付加したものをラダー形 成オリゴヌクレオチドプライマーとして用いることによる感度、検出速度の向上が認め られた。
[0144] (B)検討 2
lstep RT— ICANの反応に及ぼす、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上 流領域にァニールする配列を 5 '末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライ マーの効果にっ 、て検討した。
[0145] 第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域 (一 1一一 12)にァニールする 12 塩基を 5'末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーを、逆転写反応と I CAN反応を同一チューブ内で同時に行う lstep RT— ICANの反応系に添カ卩して 感度、検出速度を検討した。
まず、上記実施例 1一（1)で調製した铸型 RNAを OD260値より計算し、： L 1あたり 10°、 101、 102、 103、 104、 105コピーに調製した。最終濃度 32mM HEPES— KO H緩衝液（pH7. 8)、 lOOmM 酢酸カリウム、 1%ジメチルスルホキシド、 0. 11%B SA、 4mM 酢酸マグネシウム、各 500 μ M dNTPsに、第二キメラオリゴヌクレオチ ドプライマ一の 134FN3 (16)プライマー（配列表の配列番号 20)と第一キメラオリゴ ヌクレオチドプライマーの 205RN3 (16)プライマー 各 25pmol、 RTase M— MLV (タカラバイオ社製） 50U、 BcaBEST (タカラバイオ社製） l lU、Tli RNaseHII
0. 05U、サイバーグリーン (タカラバイオ社製)を含む反応液 24 1と、さらにラダー 形成オリゴヌクレオチドプライマーの A12—223Rプライマー 2. 5pmolをカ卩えた反 応液 24 1に 1 1の各コピー数の铸型 RNAを添カ卩し、 Rotor gene (CORBETT RESEARCH社製）により 45°Cで 5分、 55°Cで 45分保持し、増幅産物をリアルタイ ムで検出した。また、反応産物は 3%ァガロースゲル電気泳動によっても確認した。
[0146] その結果、ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの A12— 223Rプライマーを添 加しなかった lstep RT— ICANの感度が 103コピーであるのに対し、 A12— 2231^7° ライマーを添加することにより感度は 102コピーとなり、感度が 1桁向上した。また、 10 3コピーの検出速度も約 4分速くなつた。 [0147] 以上のことから、ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーを lstep RT— ICANの反 応に加えることにより、感度、検出速度の向上が認められた。
[0148] 実施例 2
(1)サイクリングプローブ法を用いたリアルタイム検出系でのヒトアルデヒドデハイド口 ゲナーゼ 2遺伝子 (ALDH2)の多型検出における効果の検討
[0149] ICAN反応とサイクリングプローブ法を用いたリアルタイム検出による多型検出に対 する効果について検討した。検討対象としては、ヒトアルデヒドデハイドロゲナーゼ 2 酵素をコードしている遺伝子（GenBank Acc. No. ： AH002599)を選択した。 該遺伝子においてェキソン 12には、 487番目のグルタミン酸（GAA)がリジン（AAA )に置換する一塩基多型が存在し、飲酒に関連した体質の個人差に深く関係し、発 ガンリスクに関与することがこれまでに報告されている。
[0150] ICAN反応系でこのアルデヒドデハイドロゲナーゼ 2遺伝子の多型検出を行うため に、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーに相当する ICAN-ALDH2-Fプライマ 一（配列表の配列番号 21)、第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーに相当する ICA N— ALDH2— Rプライマー（配列表の配列番号 22)を DNA合成機（Applied Bios ystems社製）により合成した。次に、正常型検出用 ALDH2 wGプローブ (配列表 の配列番号 23)及び変異型検出用 ALDH2 mAプローブ (配列表の配列番号 24) を合成した。ここで、正常型検出用 ALDH2 wGプローブは、 5'末端に蛍光標識と して ROX標識 (Applied Biosystems社製）、 3，末端にクェンチング標識として Ecli pse (Epoch Biosciences社製）を、変異型検出用 ALDH2 mAプローブは、 5，末 端に蛍光標識として FAM標識 (Applied Biosystems社製）、 3，末端にクェンチン グ標識として Eclipseを付カ卩した DNA— RNA— DNAタイプのオリゴヌクレオチドプロ ーブである。
[0151] さらに、上記第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域 (一 1一一 12)にァ- ールする 12塩基を 5'末端に付カ卩し、 ICAN— ALDH2— Rプライマー付近に設定し たラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの ALDH2— TH1 (配列表の配列番号 25 ； ICAN— ALDH2— Rキメラオリゴヌクレオチドプライマーに対して一 1一" h 15)、 ALD H2-TH2 (配列表の配列番号 26； ICAN— ALDH2— Rキメラオリゴヌクレオチドプラ イマ一に対してー9一" h6)、 ALDH2-TH3 (配列表の配列番号 27 ;ICAN— ALDH 2-Rキメラオリゴヌクレオチドプライマーに対して- 17—— 2)を合成した。
[0152] 铸型となるゲノム DNAは、インフォームドコンセントの得られた、抗凝固剤として ED TAを用いた血液サンプルより、 QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN社）を用い て調製した。
[0153] ICAN反応の反応条件は以下の通りである。すなわち、最終濃度 32mM HEPE S— KOH緩衝液、 pH7. 8、 lOOmM 酢酸カリウム、 5mM 酢酸マグネシウム、 1% ジメチルスルホキシド、 0. 04% プロピレンジァミン、 0. 11% ゥシ血清アルブミン 、各 600 μ M dNTPsゝ 4U BcaBEST DNAポリメラーゼ、 100U Tli RNaseH II、各 50pmolの ICAN— ALDH2—Fプライマーおよび ICAN— ALDH2— Rプライマ 一、 5. 5pmol ALDH2 wGプローブ、 6pmol ALDH2 mAプローブ、铸型とな るゲノム DNA lOOngを基本とし、このまま、もしくはラダー形成オリゴヌクレオチドプ ライマーの ALDH2— TH1あるいは ALDH2— TH2あるいは ALDH2— TH3を lpm ol加え、滅菌水にて最終容量 25 1にした。該反応液をスマートサイクラ一（タカラバ ィォ社製）にセットし、 70°C、 5分処理したあと、 56°C、 60分温度を保持した。なお、 蛍光強度の測定は、 56°Cで保持しているときに、 1分ごとに測定した。
[0154] また、ゲノム DNAを铸型とし、 ALDH2— Fプライマー（配列表の配列番号 28)およ び ALDH2— Rプライマー（配列表の配列番号 29)のプライマー対を用いて PCRを行 V、、得られた増幅産物を Microcon— 30 (ミリポア社)で精製した後、 Eco 571で消化 し、 3% NuSieve3： 1ァガロールゲル（タカラバイオ社製）にて電気泳動を行 、、 RF LPによるタイピングも行った。
[0155] PCRは、 TaKaRa ExTaq (タカラバイオ社製）を用いて行った。すなわち、最終濃 度 I X ExTaq緩衝液、各 200 dNTPs、 1. 25U ExTaq、各 lOpmolの ALD H2— Fプライマーおよび ALDH2— Rプライマー、铸型となる核酸として調製したヒトゲ ノム DNA 5 μ 1を添カ卩し、滅菌水にて最終容量 50 μ 1〖こした。該反応液をサーマル サイクラ一 SP (タカラバイオ社製）にセットし、 94°C、 30秒のあと、 94°C、 30秒、 55°C 、 30秒、 72。C、 30秒のサイクルを 30サイクル繰り返した。
[0156] Eco 571は、 CTGAAGを認識する制限酵素であり、アルデハイドデハイドロゲナ ーゼ 2の正常型由来の増幅産物を切断するが、変異型由来の増幅産物は切断しな い。
[0157] その結果、 Eco 571での PCR RFLPにおいて、増幅産物が切断されたものと切 断されなかったものの三本のフラグメントが観察された、すなわちヘテロ接合体と考え られるゲノム DNAサンプルを用いた場合、 ALDH2— TH1、 ALDH2— TH2、 ALD H2— TH3を反応系に加えた場合、以下の表 1および 2に示されるように、スレッシュ ホールドラインを 100とし、このラインとサンプルの増幅曲線が交差するポイントである Ct値が小さくなる、すなわち反応性の上昇が認められた。また、 ALDH2— TH3の場 合では確認されなかったが、 ALDH2— TH1、 ALDH2— TH2をカ卩えた場合は FAM の蛍光強度が増大する、すなわち検出効率が増大したことが確認された。
[0158] [表 1]
表 1 C t値の変化
Figure imgf000043_0001
[0159] [表 2]
表 2 蛍光強度
Figure imgf000043_0002
[0160] Eco 571での RFLPにおいて増幅産物が切断されたことによる二本のフラグメント が観察された、すなわち正常型のホモ接合体と考えられるゲノム DNAサンプルを用 いた場合は ALDH2 wGプローブ由来の ROX蛍光シグナルのみが認められ、 Eco 571での RFLPにお 、て、増幅産物が切断されずに一本のフラグメントが観察され た、すなわち、変異型のホモ接合体と考えられるゲノム DNAサンプルを用いた場合 には ALDH2 mAプローブ由来の 6— FAM蛍光シグナルのみが認められた。これら の場合、スレッシュホールドラインを 100とし、このラインとサンプルの増幅曲線が交 差するポイントである Ct値が小さくなる、すなわち、反応性の上昇が認められた。
[0161] (2) ALDH2多型検出における反応系に添加するラダー形成オリゴヌクレオチドブラ イマ一の 5'末端に付加した塩基配列の効果の検討
[0162] 実施例 2—（ 1 )での IC AN反応とサイクリングプローブ法を用いたリアルタイム検出 による多型検出に対する効果において、検討対象として選択したヒトアルデヒドデノヽ イドロゲナーゼ 2酵素をコードしている遺伝子の検出の際、反応系に添加するラダー 形成オリゴヌクレオチドプライマーの 5，末端に付加した塩基配列の効果について検
B寸した。
[0163] 実施例 2—（1)と同様に、 ICAN反応系でこのアルデヒドデノヽイドロゲナーゼ 2遺伝 子の多型検出を行うための IC AN— ALDH 2— Fプライマー、 IC AN— ALDH 2— Rプ ライマー、正常型検出用 ALDH2 wGプローブ及び変異型検出用 ALDH2 mAプ ローブを用意した。正常型検出用 ALDH2 wGプローブは、 5'末端に蛍光標識とし て ROX標識、 3'末端にクェンチング標識として Eclipseを、一方、変異型検出用 AL DH2 mAプローブは、 5，末端に蛍光標識として F AM標識、 3，末端にクェンチング 標識として Eclipseを付カ卩した DNA— RNA— DNAタイプのオリゴヌクレオチドプロ一 ブである。
[0164] さらに、 ICAN— ALDH2— Fプライマーの上流領域 (一 1一— 12)にァニールする 12 塩基を 5'末端に付加し、 ICAN— ALDH2— Rプライマー付近に設定したラダー形成 オリゴヌクレオチドプライマーの ALDH2— TH2 (ICAN— ALDH2— Rキメラプライマ 一に対して 9一 + 6)と、この当該プライマーの 5，末端に付加してある 12塩基を除 ヽ た ALDH2— TH4 (配列番号 30)を合成した。
[0165] 铸型となるゲノム DNAは、インフォームドコンセントの得られた、抗凝固剤として ED TAを用いた血液サンプルより、 QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN社）を用い て調製したもののうちで、 RFLPによるタイピングによりへテロ接合体と確認されたもの を使用した。
[0166] ICAN反応の反応条件は以下の通りである。すなわち、最終濃度 32mM HEPE S— KOHバッファー、 pH7. 8、 lOOmM 酢酸カリウム、 5mM 酢酸マグネシウム、 1 % ジメチルスルホキシド、 0. 04% プロピレンジァミン、 0. 11% ゥシ血清アルブミ ン、各 600 μ M dNTPsゝ 4U BcaBEST DNAポリメラーゼ、 100U Tli RNase ΗΠ、各 50pmolの 1じ八?^ー八1^0112—？プラィマーぉょび1じ八?^ー八1^0112—1^プラィ マー対、 5. 5pmol ALDH2 wGプローブ、 6pmol ALDH2 mAプローブ、铸型 となるゲノム DNA lOOngを基本とし、このまま、もしくはラダー形成オリゴヌクレオチ ドプライマ一の ALDH2— TH2あるいは ALDH2— TH4を lpmolカ卩え、滅菌水にて 最終容量 25 μ 1にした。該反応液をスマートサイクラ一（タカラバイオ社製）にセットし 、 70°C、 5分処理したあと、 56°C、 60分温度を保持した。なお、蛍光強度の測定は、 56°Cで保持しているときに、 1分ごとに測定した。
[0167] その結果、 ALDH2— TH2を反応系に加えた場合、以下の表 3および 4に示される ように、スレッシュホールドラインを 100とし、このラインとサンプルの増幅曲線が交差 するポイントである Ct値が小さくなる、すなわち反応性の上昇が認められた。また、 R OX、 FAMの蛍光強度が増大する、すなわち検出効率が増大したことが確認された 。一方、 ALDH2— TH4を反応系にカ卩えた場合は、 Ct値に変化は認められず、蛍光 強度にも変化は認められなかった。すなわち、 ALDH2— TH2の 5'に付カ卩してある、 ICAN— ALDH2— Fプライマーの上流領域 (一 1一— 12)にァニールする 12塩基のな Vヽ ALDH2— TH4を反応系に加えた場合には、 ALDH2— TH2で確認される反応性 の上昇、検出効率の増大は確認されな力つた。
[0168] [表 3]
表 3 C t値の変化
Figure imgf000045_0001
[0169] [表 4]
表 4 蛍光強度
Figure imgf000045_0002
[0170] (3)レジオネラ検出における反応系に添加するラダー形成オリゴヌクレオチドプライマ 一の 5'末端に付加した塩基配列の効果の検討
[0171] 第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域 (一 1一— 12あるいは— 13—— 24
)にァニールする 12塩基を 5 '末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマ 一を添加し、 ICAN反応における検出速度の変化を検討した。
[0172] ICAN反応とサイクリングプローブ法を用いたリアルタイム検出に対する効果につい て検討した。検討対象としては、レジオネラ Mip (Legionella pneumophila, mac rophage infectivity potentiator (Mip)； GenBank Acc. No. ： AF095215 )遺伝子をコードして!/ヽる遺伝子を選択した。
ICAN反応系でこのレジオネラ Mip遺伝子の検出を行うために、第二キメラオリゴヌ クレオチドプライマ一の F2キメラオリゴヌクレオチドプライマー（配列表の配列番号 31 )および第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの R2キメラオリゴヌクレオチドプライマ 一 (配列表の配列番号 32)を DNA合成機 (アプライド 'バイオシステム社製）により合 成した。次に、 Mip遺伝子検出用 Mip4gl2プローブ (配列表の配列番号 33)を合 成した。また、 Mip遺伝子検出用 Mip4gl2プローブは、 5'末端に蛍光標識として FAM標識、 3'末端にクェンチング標識として Eclipseを付カ卩した DNA— RNA— DN Aタイプのオリゴヌクレオチドプローブである。
[0173] さらに、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域 (一 1一— 12あるいは 1 3一— 24)にァニールする 12塩基を 5，末端に付加し、第一キメラオリゴヌクレオチドプ ライマー付近に設定したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの R2 (— 13) (配列 表の配列番号 34 ;第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーに対して 13 29)、 R2 (一 13) A12— 1 (配列表の配列番号 35；第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーに対 して— 13—— 29部分の 5，末端に第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域 -1一— 12の 12塩基を付加した）、 R2 (一 13) A12— 2 (配列表の配列番号 36；第一キ メラオリゴヌクレオチドプライマーに対して 13 29部分の 5，末端に第二キメラオリ ゴヌクレオチドプライマーの上流領域 13—— 24の 12塩基を付加した)を合成した。
[0174] 铸型となるゲノム DNAは、 EnviroAmpTM (PERKIN ELMER社製）に添付の Le gionella pneumophila Control DNA 使用し 7こ。
[0175] ICAN反応の反応条件は以下の通りである。すなわち、最終濃度 32mM HEPE S— KOHバッファー、 pH7. 8、 lOOmM 酢酸カリウム、 5mM 酢酸マグネシウム、 1 % ジメチルスルホキシド、 0. 11% ゥシ血清アルブミン、各 500 M dNTPs、 2U BcaBEST DNAポリメラーゼ、 100U Tli RNaseHII、各 25pmolの F2キメラォ リゴヌクレオチドプライマーおよび R2キメラオリゴヌクレオチドプライ 5pmol Mi p 4g 12プローブ、铸型となる Control DNA 200コピーを基本とし、このまま、もし くは R2 (— 13)A12— 1あるいは R2 (— 13)A12— 2を lpmolカ卩え、滅菌水にて最終容 量 25 μ 1にした。該反応液をスマートサイクラ （タカラバイオ社製）にセットし、 70°C 5分処理したあと、 53°C 90分温度を保持した。なお、蛍光強度の測定は、 53°Cで 保持しているときに、 1分ごとに測定した。
[0176] その結果を表 5に示す。表 5に示したように、ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマ 一の R2 (-13) A12— 1ある!/、は R2 (— 13) A12— 2を反応系に加えた場合、スレツシ ュホールドラインを 100とし、このラインとサンプルの増幅曲線が交差するポイントであ る Ct値が小さくなる、すなわち反応性の上昇が認められた。
[0177] [表 5]
表 5 C t値の変化
Figure imgf000047_0001
[0178] 実施例 3
(1)铸型となる核酸上で、双方の ICAN primerの上流領域に存在する相補的配列 の ICANの反応に及ぼす効果 1
[0179] 铸型となる核酸上で、双方の ICAN primerの 5'末端より上流領域に 6塩基の相 補的な配列を挿入し、 ICAN反応に及ぼす影響を見た。検出対象は、ヒト c Ki ras 2遺伝子（GenBank Acc. No. ： L00045)を選択した。
[0180] 双方の ICAN primerの 5'末端上流領域に明確な相補的な配列がない铸型と 6 塩基の相補的な配列を有する铸型は以下のように調製した。
Human genome (クロンテック社より購入）を铸型に c Ki rasZl2Fプライマー（ 配列表の配列番号 37)と rasTIRプライ （配列表の配列番号 38)あるいは双方 のプライマーの 5'末端に相補的な配列を付カ卩した rasT14Fプライ （配列表の配 列番号 39)と rasT4Rプライ （配列表の配列番号 40)を用いて、 PCRを行った。 得られた断片を平滑化し、プラスミド pUCl 18 (タカラバイオ社製)の Hindiサイトに 挿入した。得られたプラスミドより、 c Ki rasZl2Fプライ あるいは rasT14Fプ ライマーが PUC118にァニールする M13 primer M4 (タカラバィォ社製）と同方 向であるプラスミドを選別した。その結果、双方の ICAN primerの 5 '末端上流領域 に明確な相補的な配列がないプラスミド T7と 6塩基の相補的な配列 CGCGCGを有 するプラスミド T16を得た。
[0181] 上記調製したプラスミド DNAを OD260値より計算し、 1 μ 1あたり 10°、 101、 102、 1 03コピーに調製した。最終濃度 32mM HEPES— KOH緩衝液 (pH7. 8)、 100m M 酢酸カリウム、 1%ジメチルスルホキシド、 0. 11%BSA、 4mM 酢酸マグネシゥ ム、各 500 μ M dNTPsに、 c Ki ras/12FN3キメラオリゴヌクレオチドプライマー (配列表の配列番号 41)と c Ki rasZl2RN3キメラオリゴヌクレオチドプライマー（ 配列表の配列番号 42) 各 30pmol、 BcaBEST (タカラバイオ社製） 2. 8U、国際 公開第 02/22831号パンフレット 実施例 7に記載の方法で調製した Afu RNase HII 2. 2U、を含む反応液 24 μ 1に、 1 μ 1の各コピー数の铸型 DNAを添カ卩し、サー マルサイクラ一パーソナル (タカラバイオ社製)で、 55°Cで 60分反応した。増幅産物 は 3%ァガロースゲル電気泳動により確認した。
[0182] その結果、双方の ICAN primerの 5'末端上流領域に明確な相補的な配列がな V、プラスミド T7を铸型とした場合、増幅産物はターゲット領域のサイズのバンドしか見 られず、安定した感度が 103コピーであるのに対し、双方の ICAN primerの 5 '末端 に隣接する上流領域に相補的な配列 CGCGCGを有するプラスミド T16を铸型にし た場合、ターゲット領域のサイズのバンドとともに高分子側に規則正しいラダー状の 産物が見られ、 10コピーが安定して検出され、感度が向上した。また、ラダー産物を ゲルより切り出し、 pUCl 18の Hindiサイトにサブクローニングして、塩基配列を決 定したところ、ラダー産物はターゲット領域が双方の ICAN primerの 5'末端上流領 域に存在する相補的な配列 CGCGCGを介して、ターゲット領域が同方向に連結し たものであった。
以上のことから、双方の ICAN primerの 5'末端上流領域に存在する相補的な配 列により、ターゲット領域の重合反応が促進され、感度の向上が認められた。
[0183] (2)铸型となる核酸上で、双方の ICAN primerの上流領域に存在する相補的配列 の ICANの反応に及ぼす効果 2 [0184] 铸型となる核酸上で、双方の ICAN primerの 5'末端より上流領域にある 3塩基の 相補的な配列の ICAN反応に及ぼす影響を見た。検出対象は、淋菌 cppB (NeiSSe ria gonorrhoeae cryptic plasmid protein (cppB) ； GenBank Acc. No. ： M 10316)遺伝子を選択した。
[0185] 铸型は以下のように調製した。
淋菌ゲノム (住商ファーマインターナショナルより購入)を铸型に PJDBFプライマー（ 配列表の配列番号 43)と PJDBRプライマー（配列表の配列番号 44)を用いて、 PCR を行った。得られた断片を平滑化し、プラスミド pUC118 (タカラバィォ社製)の Hind Iサイトに挿入した。得られたプラスミドより、 PJDBFプライマーが pUC118にァニー ルする M13 primer M4 (タカラバィォ社製）と同方向であるプラスミドを選別しプラ スミド Cp 13を得た。
上記プラスミド Cp 13を铸型に、インサート領域を増幅するために、 PJDB0FN3ブラ イマ一（配列表の配列番号 45)と PJDB0RN3プライマー（配列表の配列番号 46)を 設計した。この場合、 PJDB0RN3プライマーの 5'末端に隣接した上流の配列 3塩基 である GACに相補的な配列である GTCは PJDB0FN3プライマー鎖のターゲット領 域にはなぐ PJDB0FN3プライマーの 5'末端より上流 34塩基の位置に存在する。こ の 3塩基の ICANに及ぼす影響を見た。
[0186] 上記調製したプラスミド DNAを OD260値より計算し、 1 μ 1あたり 10°、
Figure imgf000049_0001
102、 1 03、 104、 105、 106、 107、 108コピーに調製した。最終濃度 32mM HEPES— KOH 緩衝液（PH7. 8)、 lOOmM 酢酸カリウム、 1%ジメチルスルホキシド、 0. 11%BSA 、 4mM 酢酸マグネシウム、各 500 μ M dNTPsに、 PJDB0FN3キメラオリゴヌタレ ォチドプライマ一と PJDB0RN3キメラオリゴヌクレオチドプライマー 各 30pmol、 Bca BEST (タカラバイオ社製） 2. 8U、 Afu RNaseHII 2. 2Uを含む反応液 24 1に 、 1 1の各コピー数の铸型 DNAを添カ卩し、サーマルサイクラ一パーソナル（タカラバ ィォ社製)で、 55°Cで 60分反応した。増幅産物は 3%ァガロースゲル電気泳動により 確認した。
[0187] その結果、ターゲット領域のサイズのバンドとともに高分子側に規則正しいラダー状 の産物が見られ、 102コピーまで高感度に検出された。また、ラダー産物をゲルより切 り出し、 pUCl 18の Hindiサイトにサブクローニングして、塩基配列を決定したところ 、ラダー産物はターゲット領域が双方の ICAN primerの 5'末端上流領域に存在す る相補的な 3塩基 GACと GTCを介して、ターゲット領域が同方向に規則正しく連結 したものであった。すなわち、このラダー増幅産物には ICANプライマーに挟まれた ターゲット領域とともに、 PJDBOFN3キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5，末端より 上流領域 34塩基力 Sターゲット領域に挟まれた形で規則正しく含まれていた。
[0188] 以上のことから、双方の ICAN primerの 5'末端上流領域に存在する相補的な配 列 3塩基で、ターゲット領域の重合反応が促進され、高感度増幅出来ることが確認さ れた。また、増幅産物の検出をプローブによるハイプリで行う場合、プローブの位置 は双方の ICAN primerにはさまれた領域、あるいは、 ICAN primerと双方の ICA N primerの 5'末端上流領域に存在する相補的な配列にはさまれた領域から選定 できることが示された。
[0189] 実施例 4
ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの 5，末端に付加する、第二キメラオリゴヌク レオチドプライマ一の上流領域にァニールする塩基の長さを 6塩基、 9塩基、 12塩基 (一 1一— 6、— 1一— 9、— 1一— 12)とした逆転写プライマーを用いて、 RT— ICANの感 度、検出速度を検討した。
[0190] まず、上記実施例 1— (1)で調製した铸型 RNAを OD260値より計算し、 1 μ 1あたり 10。、 101、 102、 103、 104、 105コピーに調製した。
最終濃度 32mM HEPES— KOH緩衝液（pH7. 8)、 lOOmM 酢酸カリウム、 1 %ジメチルスルホキシド、 0. 11%BSA、 4mM 酢酸マグネシウム、各 500 M dN TPsに、上記逆転写プライマーとしてラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの 215 Rプライマー、 A6— 215Rプライマー（配列表の配列番号 47)、 A9— 215Rプライマー (配列表の配列番号 48)、あるいは、 A12— 215Rプライマー 各 lpmol、 RTase M -MLV (タカラバイオ社製） 50U、 1 μ 1の各コピー数の铸型 RNAを添カ卩した 10 μ 1 の反応液を調製した。
[0191] 該反応液はサーマルサイクラ一パーソナル (タカラバイオ社製）にセットし、 45°C、 1 0分間保持後、 4°Cに冷却した。逆転写反応終了後、該反応液 10 mM 酢酸力リウ ム、 1%ジメチルスルホキシド、 0. 11%BSA、 4mM 酢酸マグネシウム、各 500 μ Μ dNTPsに、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの B 134FN3 ( 16)プライマーと 第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 205RN3 (16)プライマー 各 25pmol、 Be aBEST (タカラバイオ社製） l lU、 Tli RNaseHII 0. 05U、サイバーグリーンを 含む反応液 15 1を添加し、 Rotor gene (CORBETT RESEARCH社製）により 55°Cで ICAN反応を行い、増幅産物をリアルタイムで検出した。また、反応産物は 3 o/oァガロースゲル電気泳動によっても確認した。
[0192] その結果、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域 (一 1一一 6)にァニー ルする 6塩基を 5'末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの A6— 21 5Rを用いた場合、感度は 102コピーであった。 6塩基付加することによる検出速度を 速める効果は 0. 9分であった。
第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域 (一 1一一 9)にァニールする 9塩 基を 5'末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの A9—215Rを用い た場合、感度は 102コピーであった。 9塩基付加することによる検出速度を速める効 果は 1. 6分であった。
第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域 (一 1一一 12)にァニールする 12 塩基を 5 '末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの A12— 215Rを 用いた場合、感度は 101コピーであった。 12塩基付加することによる検出速度を速め る効果は 3. 7分であった。
[0193] 以上のことから、ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの 5'末端に付加されてい る第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域にァニールする配列の効果は 、その塩基数が多いほど大きいことが確認された。
[0194] 実施例 5
ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの 5，末端に付加する、第二キメラオリゴヌク レオチドプライマ一の上流領域にァニールする塩基の長さを 12塩基、 18塩基、（一 1 一一 12、 -1一一 18)とした逆転写プライマーを用いた RT— ICANの感度について検
B寸した。
[0195] まず、上記実施例 1— (1)で調製した铸型 RNAを OD260値より計算し、 1 μ 1あたり 10°、 101、 102、 103、 104、 105コピーに調製した。
最終濃度 32mM HEPES— KOH緩衝液（pH7. 8)、 lOOmM 酢酸カリウム、 1 %ジメチルスルホキシド、 0. 11%BSA、 4mM 酢酸マグネシウム、各 500 M dN TPsに、上記逆転写プライマーとしてラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの 205 RN3 (18)プライマー、 A12—205Rプライマー、あるいは、 A18—205Rプライマー（ 配列表の配列番号 49)各 lpmol、RTase M—MLV (タカラバイオ社製） 50U、 1 μ 1の各コピー数の铸型 RNAを添加した 10 μ 1の反応液を調製した。
[0196] 該反応液はサーマルサイクラ一パーソナル (タカラバイオ社製）にセットし、 45°C、 1 0分間保持後、 4°Cに冷却した。逆転写反応終了後、該反応液 10 1に最終濃度 32 mM HEPES— KOH緩衝液（pH7. 8)、 lOOmM 酢酸カリウム、 1%ジメチルスル ホキシド、 0. 11%BSA、 4mM 酢酸マグネシウム、各 M dNTPsに、第ニキ メラオリゴヌクレオチドプライマーの B134FN3 (18)プライマーと第一キメラオリゴヌク レオチドプライマ一の 205RN3 (18)プライマー 各 25pmol、 BcaBEST (タカラバイ ォ社製） l lU、Tli RNaseHII 0. 05Uを含む反応液 15 1を添カ卩し、サーマル サイクラ一パーソナル (タカラバイオ社製）により 55°Cで ICAN反応を行い、増幅産物 を 3%ァガロースゲル電気泳動によっても確認した。
[0197] その結果、 205RN3プライマーで逆転写した RT— ICANの感度が 102コピーである のに対し、同じ位置で第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域 (一 1一— 12 )にァニールする 12塩基を 5 '末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマ 一の A12— 205Rを用いた場合、および、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 上流領域 (一 1一— 18)にァニールする 18塩基を 5，末端に付加したラダー形成オリゴ ヌクレオチドプライマーの A18— 205Rを用いた場合感度は 101コピーとなり、いずれ の場合においても感度が 1桁向上した。また、 A12— 205R、あるいは、 A18-205R を用いた場合の増幅はプライマー上流域のァニールする配列を介して連結した規則 正 、ラダー状の増幅産物であることが確認された。
[0198] 以上のことから、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域にァニールす る塩基の数を変えても、その領域を介したラダー増幅が起こり、感度の向上が認めら れた。 産業上の利用可能性
[0199] 本発明により、従来の等温核酸増幅方法より優れた増幅方法、該方法に用いるた めのプライマーを含む組成物およびキットが提供された。
配列表フリーテキスト
[0200] SEQ ID NO. 1: A portion of ¾AR¾ coronavirus genomic RNA reverse transcripted to DNA. "nucleotide 1 to 5 is Hindlll restriction site- nucleotide 238 to 242 is BamHI restriction site."
SEQ ID NO. 2: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as 205RN3(18) for synthesizing cDNA from mRNA, and to amplify a portion of SARS coronavirus genome, "nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides .
SEQ ID NO. 3: Designed oligonucleotide primer designated as A12-205R for synthesizing cDNA from mRNA.
SEQ ID NO. 4: Designed oligonucleotide primer designated as 215R for synthesizing cDNA from mRNA.
SEQ ID NO. 5: Designed oligonucleotide primer designated as A12-215R for synthesizing cDNA from mRNA, and to amplify a portion of SARS coronavirus genome.
SEQ ID NO. 6: Designed oligonucleotide primer designated as A12-223R for synthesizing cDNA from mRNA, and to amplify a portion of SARS coronavirus genome.
SEQ ID NO. 7: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as 134FN3(18) to amplify a portion of SARS coronavirus genome, ^nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides/''
SEQ ID NO. 8: Designed oligonucleotide primer designated as A12(- 10)- 215R for synthesizing cDNA from mRNA, and to amplify a portion of SARS coronavirus genome.
SEQ ID NO. 9: Designed oligonucleotide primer designated as A12(— 20)— 215R for synthesizing cDNA from mRNA, and to amplify a portion of SARS coronavirus genome.
SEQ ID NO. 10: Designed oligonucleotide primer designated as A12(6)- 215R for synthesizing cDNA from mRNA, and to amplify a portion of SARS coronavirus genome.
SEQ ID NO. 11: Designed oligonucleotide primer designated as A12(12)-215R for synthesizing cDNA from mRNA, and to amplify a portion of SARS coronavirus genome.
SEQ ID NO. 12: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as
B134FN3(16) to amplify a portion of SARS coronavirus genome, ^nucleotides 14 to 16 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides." "5 end is labeled with biotin.
SEQ ID NO. 13: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as
205RN3(16) to amplify a portion of SARS coronavirus genome, ^nucleotides 14 to 16 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides."
SEQ ID NO. 14: Designed oligonucleotide primer designated as A6(- 10)- 215R for synthesizing cDNA from mRNA, and to amplify a portion of SARS coronavirus genome.
SEQ ID NO. 15: Designed oligonucleotide primer designated as A9(- 10)- 215R for synthesizing cDNA from mRNA, and to amplify a portion of SARS coronavirus genome.
SEQ ID NO. 16: Designed oligonucleotide probe designated as SARS - BM—B for detecting an amplified a portion of SARS coronavirus genome. 5 ena is labeled with FITC
SEQ ID NO. 17: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as 160FN3 to amplify a portion of SARS coronavirus genome, nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides."
SEQ ID NO. 18: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as 241RN3 to amplify a portion of SARS coronavirus genome, ^nucleotides 12 to 14 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides/''
SEQ ID NO. 19: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as (A12)241RN3 to amplify a portion of SARS coronavirus genome, ^nucleotides 18 to 21 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides/''
SEQ ID NO. 20: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as 134FN3(16) to amplify a portion of SARS coronavirus genome, ^nucleotides 14 to 16 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides/''
SEQ ID NO. 21: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as ICAN— ALDH2— F to amplify a portion of human aldehyde dehydrogenase 2 gene, "nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides- other nucleotides are
deoxyribonucleotides .〃
SEQ ID NO. 22: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as ICAN— ALDH2— R to amplify a portion of human aldehyde dehydrogenase 2 gene, "nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides- other nucleotides are
deoxyribonucleotides .〃
SEQ ID NO. 23: Designed chimeric oligonucleotide probe designated as ALDH2 wG probe for detecting an amplified a portion of native human aldehyde
dehydrogenase 2 gene, ^nucleotides 11 is ribonucleotide- other nucleotides are deoxyribonucleotides." b—end is labeled with ROX, and 3 '-end is labeled with Eclipse,
SEQ ID NO. 24: Designed chimeric oligonucleotide probe designated as ALDH2 mA probe for detecting an amplified a portion of mutant human aldehyde dehydrogenase 2 gene, ^nucleotides 11 is ribonucleotide- other nucleotides are deoxyribonucleotides." b—end is labeled with FAM, and 3 '-end is labeled with Eclipse,
SEQ ID NO. 25: Designed oligonucleotide primer designated as ALDH2-TH1 to amplify a portion of human aldehyde dehydrogenase 2 gene. SEQ ID NO. 26: Designed oligonucleotide primer designated as ALDH2-TH2 to amplify a portion of human aldehyde dehydrogenase 2 gene.
SEQ ID NO. 27: Designed oligonucleotide primer designated as ALDH2-TH3 to amplify a portion of human aldehyde dehydrogenase 2 gene.
SEQ ID NO. 28: Designed oligonucleotide PCR primer designated as ALDH2— F to amplify a portion of human aldehyde dehydrogenase 2 gene.
SEQ ID NO. 29: Designed oligonucleotide PCR primer designated as ALDH2-R to amplify a portion of human aldehyde dehydrogenase 2 gene.
SEQ ID NO. 30: Designed oligonucleotide primer designated as ALDH2-TH4 to amplify a portion of human aldehyde dehydrogenase 2 gene.
SEQ ID NO. 31: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as F2 to amplify a portion of Legionella pneumophila mip gene, "nucleotides 15 to 17 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides."
SEQ ID NO. 32: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as R2 to amplify a portion of Legionella pneumophila mip gene, "nucleotides 15 to 17 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides."
SEQ ID NO. 33: Designed chimeric oligonucleotide probe designated as Mip4gl2 probe for detecting an amplified a portion of Legionella pneumophila mip gene, "nucleotides 4 is ribonucleotide- other nucleotides are deoxyribonucleotides, "5し end is labeled with FAM, and 3し end is labeled with Eclipse,
SEQ ID NO. 34: Designed oligonucleotide primer designated as R2 13) to amplify a portion of Legionella pneumophila mip gene.
SEQ ID NO. 35: Designed oligonucleotide primer designated as R2 13)A12- 1 to amplify a portion of Legionella pneumophila mip gene.
SEQ ID NO. 36: Designed oligonucleotide primer designated as R2 13)A12- 2 to amplify a portion of Legionella pneumophila mip gene.
SEQ ID NO. 37: Designed oligonucleotide PCR primer designated as
c-Ki-ras/12F to amplify a portion of human c— i—ras2 gene. SEQ ID NO. 38: Designed oligonucleotide PCR primer designated as rasTIR to amplify a portion of human c— Ki— ras2 gene.
SEQ ID NO. 39: Designed oligonucleotide PCR primer designated as rasT14F to amplify a portion of human c— Ki— ras2 gene.
SEQ ID NO. 40: Designed oligonucleotide PCR primer designated as rasT4R to amplify a portion of human c— Ki— ras2 gene.
SEQ ID NO. 41: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as c-Ki-ras/12FN3 to amplify a portion of human c- i-ras2 gene, ^nucleotides 18 to 20 are ribonucleotide- other nucleotides are deoxyribonucleotides."
SEQ ID NO. 42: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as c-Ki-ras/12RN3 to amplify a portion of human human c-Ki-ras2 gene, ^nucleotides 18 to 20 are ribonucleotide- other nucleotides are deoxyribonucleotides."
SEQ ID NO. 43: Designed oligonucleotide primer designated as PJDBF to amplify a portion of Neisseria gonorrhoeae cppB gene.
SEQ ID NO. 44: Designed oligonucleotide primer designated as PJDBR to amplify a portion of Neisseria gonorrhoeae cppB gene.
SEQ ID NO. 45: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as
PJDB0FN3 to amplify a portion of Neisseria gonorrhoeae cppB gene, "nucleotides 18 to 20 are ribonucleotide- other nucleotides are deoxyribonucleotides."
SEQ ID NO. 46: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as
PJDB0RN3 to amplify a portion of Neisseria gonorrhoeae cppB gene, "nucleotides 15 to 17 are ribonucleotide- other nucleotides are deoxyribonucleotides."
SEQ ID NO. 47: Designed oligonucleotide primer designated as A6— 215R to amplify a portion of SARS coronavirus genome.
SEQ ID NO. 48: Designed oligonucleotide primer designated as A9— 215R to amplify a portion of SARS coronavirus genome.
SEQ ID NO. 49: Designed oligonucleotide primer designated as A18— 205R to amplify a portion of SARS coronavirus genome.
Figure imgf000058_0001

Claims

請求の範囲
[1] 核酸を増幅する方法において、
(A)下記 (a)又は (b)から選択される反応混合物を調製する工程、
(a)铸型となる核酸、デォキシリボヌクレオチド 3リン酸、鎖置換活性を有する DNAポ リメラーゼ、少なくとも 2種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも 1種類の ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマー、および RNaseH、
(b)铸型となる核酸、デォキシリボヌクレオチド 3リン酸、鎖置換活性を有する DNAポ リメラーゼ、少なくとも 2種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、および RNaseH、 ここで、一方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーはラダー形成オリゴヌクレオチドプ ライマーとして作用し、
ここで、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくともデォキシリボヌクレオ チド及びヌクレオチドアナログ力も選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボ ヌクレオチドは該プライマーの 3'末端又は 3'末端側に配置されており、
上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、铸型となる核酸の塩基配列に相補的な 第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと、铸型となる核酸の塩基配列に相同的な第 ニキメラオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも 2種類を含んでおり、
上記ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーは、铸型となる核酸の当該第一キメラ オリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領域および Zまたはその領域より 3'側の塩 基配列に相補的な配列を有し、铸型となる核酸と相同的な第二キメラオリゴヌクレオ チドプライマ一の 5'側の塩基配列、铸型となる核酸の当該第二キメラオリゴヌクレオ チドプライマ一と相同な領域の 5'末端よりさらに 5 '側方向の領域に相当する塩基配 列あるいはその両方に相補的な配列を 5 '側に有し、
および
(B)铸型となる核酸へのプライマーの特異的なアニーリング、 DNAポリメラーゼによ る伸長鎖合成反応及び鎖置換反応、並びに RNaseHによる伸長鎖の切断反応が行 える一定の温度条件でラダー状増幅産物を生成するのに充分な時間、反応混合物 をインキュベートする工程、
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法。
[2] 铸型となる核酸が RNAであり、当該核酸をあら力じめデォキシリボヌクレオチド 3リ ン酸、逆転写活性を有する DNAポリメラーゼ及び少なくとも 1種類のラダー形成オリ ゴヌクレオチドプライマーで処理し、逆転写産物とする、請求項 1記載の方法。
[3] 工程 (A)における反応混合物がさらに逆転写活性を有する DNAポリメラーゼを含 有する、請求項 1記載の方法。
[4] 铸型となる核酸が mRNAであることを特徴する、請求項 2又は 3記載の方法。
[5] 逆転写活性と鎖置換活性とを有する 1つの DNAポリメラーゼが、逆転写活性を有 する DNAポリメラーゼおよび鎖置換活性を有する DNAポリメラーゼとして作用するこ とを特徴とする、請求項 2又は 3記載の方法。
[6] 請求項 1記載の核酸の増幅方法のための組成物であって、それぞれ少なくとも 1種 類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び Z又はラダー形成オリゴヌクレオチドブラ イマ一を含有する組成物。
[7] 請求項 1記載の核酸の増幅方法のためのキットであって、それぞれ少なくとも 1種類 のキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び Z又はラダー形成オリゴヌクレオチドプライ マーを含有するキット。
[8] 下記工程を包含することを特徴とする標的核酸の検出方法；
(a)請求項 1記載の核酸の増幅方法により、標的核酸を増幅する工程;および、
(b)上記工程により増幅された標的核酸を検出する工程。
[9] 請求項 1記載の核酸の増幅方法に用いるプライマーであって、铸型となる核酸と相 同的なプライマーの 5'側の塩基配列、铸型となる核酸の当該第二キメラオリゴヌタレ ォチドプライマ一と相同な領域の 5'末端よりさらに 5'側方向の領域に相当する塩基 配列あるいはその両方に相補的な配列を 5'側に有することを特徴とするオリゴヌタレ ォチドプライマ一。
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Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006125267A1 (en) * 2005-05-26 2006-11-30 Human Genetic Signatures Pty Ltd Isothermal strand displacement amplification using primers containing a non-regular base
JP2009504173A (ja) * 2005-08-19 2009-02-05 エニグマ ディアグノスティックス リミテッド 分析方法及びキット
JP2010158215A (ja) * 2009-01-09 2010-07-22 Fujifilm Corp 核酸配列の複製方法
US7799525B2 (en) 2003-06-17 2010-09-21 Human Genetic Signatures Pty Ltd. Methods for genome amplification
US7803580B2 (en) 2004-09-10 2010-09-28 Human Genetic Signatures Pty. Ltd. Amplification blocker comprising intercalating nucleic acids (INA) containing intercalating pseudonucleotides (IPN)
US7833942B2 (en) 2004-12-03 2010-11-16 Human Genetic Signatures Pty. Ltd. Methods for simplifying microbial nucleic acids by chemical modification of cytosines
US7846693B2 (en) 2003-09-04 2010-12-07 Human Genetic Signatures Pty. Ltd. Nucleic acid detection assay
US8143006B2 (en) 2007-08-03 2012-03-27 Igor Kutyavin Accelerated cascade amplification (ACA) of nucleic acids comprising strand and sequence specific DNA nicking
US8168777B2 (en) 2004-04-29 2012-05-01 Human Genetic Signatures Pty. Ltd. Bisulphite reagent treatment of nucleic acid
US8343738B2 (en) 2005-09-14 2013-01-01 Human Genetic Signatures Pty. Ltd. Assay for screening for potential cervical cancer
US8685675B2 (en) 2007-11-27 2014-04-01 Human Genetic Signatures Pty. Ltd. Enzymes for amplification and copying bisulphite modified nucleic acids
WO2015087945A1 (ja) * 2013-12-11 2015-06-18 学校法人埼玉医科大学 Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ５ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法、及びｃ型肝炎ウイルスのｎｓ５ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出用キット
JP2015221036A (ja) * 2008-04-30 2015-12-10 インテグレイテツド・デイー・エヌ・エイ・テクノロジーズ・インコーポレイテツド 修飾されたｒｎａ単量体を用いるｒｎアーゼｈを基礎とするアッセイ
US9732375B2 (en) 2011-09-07 2017-08-15 Human Genetic Signatures Pty. Ltd. Molecular detection assay using direct treatment with a bisulphite reagent
JP2019170398A (ja) * 2019-07-16 2019-10-10 株式会社東芝 核酸検出方法及びアッセイキット

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8420323B2 (en) * 2007-11-14 2013-04-16 Fujifilm Corporation Nucleic acid amplification method
CN104531837A (zh) * 2008-12-22 2015-04-22 赛卢拉有限公司 检测等位基因、基因组和转录物组的方法和基因型分析谱
JP6346242B2 (ja) * 2016-11-04 2018-06-20 株式会社東芝 核酸検出方法及びアッセイキット

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995003426A2 (fr) 1993-07-26 1995-02-02 Bio Merieux Procede d'amplification d'acides nucleiques par transcription utilisant le deplacement, reactifs et necessaire pour la mise en ×uvre de ce procede
WO1995025180A1 (en) 1994-03-16 1995-09-21 Gen-Probe Incorporated Isothermal strand displacement nucleic acid amplification
JPH07114718B2 (ja) 1991-01-31 1995-12-13 ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー 鎖置換型増幅法
WO1997019193A2 (en) 1995-11-21 1997-05-29 Yale University Unimolecular segment amplification and detection
US5824517A (en) 1995-07-24 1998-10-20 Bio Merieux Method for amplifying nucleic acid sequences by strand displacement using DNA/RNA chimeric primers
WO1999009211A1 (en) 1997-08-13 1999-02-25 Tepnel Medical Limited Amplification of nucleic acids
WO1999049081A2 (en) 1998-03-25 1999-09-30 Tepnel Medical Limited Amplification of nucleic acids
WO2000028082A1 (fr) 1998-11-09 2000-05-18 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Procede de synthese d'acide nucleique
WO2000056877A1 (fr) 1999-03-19 2000-09-28 Takara Shuzo Co., Ltd. Procede d'amplification d'une sequence d'acide nucleique
WO2002016639A1 (fr) * 2000-08-23 2002-02-28 Takara Bio Inc. Procede d'amplification d'acide nucleique
JP2003052380A (ja) 2001-08-20 2003-02-25 Takara Bio Inc 核酸の増幅方法
JP2005052002A (ja) * 2001-07-06 2005-03-03 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd 非環状核酸断片の増幅方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5916777A (en) * 1995-06-07 1999-06-29 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of oligonucleotides using 3'-ribonucleotide primers

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07114718B2 (ja) 1991-01-31 1995-12-13 ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー 鎖置換型増幅法
WO1995003426A2 (fr) 1993-07-26 1995-02-02 Bio Merieux Procede d'amplification d'acides nucleiques par transcription utilisant le deplacement, reactifs et necessaire pour la mise en ×uvre de ce procede
WO1995025180A1 (en) 1994-03-16 1995-09-21 Gen-Probe Incorporated Isothermal strand displacement nucleic acid amplification
US5824517A (en) 1995-07-24 1998-10-20 Bio Merieux Method for amplifying nucleic acid sequences by strand displacement using DNA/RNA chimeric primers
WO1997019193A2 (en) 1995-11-21 1997-05-29 Yale University Unimolecular segment amplification and detection
WO1999009211A1 (en) 1997-08-13 1999-02-25 Tepnel Medical Limited Amplification of nucleic acids
WO1999049081A2 (en) 1998-03-25 1999-09-30 Tepnel Medical Limited Amplification of nucleic acids
WO2000028082A1 (fr) 1998-11-09 2000-05-18 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Procede de synthese d'acide nucleique
WO2000056877A1 (fr) 1999-03-19 2000-09-28 Takara Shuzo Co., Ltd. Procede d'amplification d'une sequence d'acide nucleique
WO2002016639A1 (fr) * 2000-08-23 2002-02-28 Takara Bio Inc. Procede d'amplification d'acide nucleique
JP2005052002A (ja) * 2001-07-06 2005-03-03 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd 非環状核酸断片の増幅方法
JP2003052380A (ja) 2001-08-20 2003-02-25 Takara Bio Inc 核酸の増幅方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY
HAFNER, G.J. ET AL., BIOTECHNIQUES, vol. 30, 2001, pages 852 - 867

Cited By (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7799525B2 (en) 2003-06-17 2010-09-21 Human Genetic Signatures Pty Ltd. Methods for genome amplification
US7846693B2 (en) 2003-09-04 2010-12-07 Human Genetic Signatures Pty. Ltd. Nucleic acid detection assay
US8168777B2 (en) 2004-04-29 2012-05-01 Human Genetic Signatures Pty. Ltd. Bisulphite reagent treatment of nucleic acid
US7803580B2 (en) 2004-09-10 2010-09-28 Human Genetic Signatures Pty. Ltd. Amplification blocker comprising intercalating nucleic acids (INA) containing intercalating pseudonucleotides (IPN)
US8598088B2 (en) 2004-12-03 2013-12-03 Human Genetic Signatures Pty. Ltd. Methods for simplifying microbial nucleic acids by chemical modification of cytosines
US7833942B2 (en) 2004-12-03 2010-11-16 Human Genetic Signatures Pty. Ltd. Methods for simplifying microbial nucleic acids by chemical modification of cytosines
WO2006125267A1 (en) * 2005-05-26 2006-11-30 Human Genetic Signatures Pty Ltd Isothermal strand displacement amplification using primers containing a non-regular base
JP2008541705A (ja) * 2005-05-26 2008-11-27 ヒューマン ジェネティック シグネチャーズ ピーティーワイ リミテッド 非標準塩基を含むプライマーを使用する等温鎖置換増幅
US8431347B2 (en) 2005-05-26 2013-04-30 Human Genetic Signatures Pty Ltd Isothermal strand displacement amplification using primers containing a non-regular base
JP2009504173A (ja) * 2005-08-19 2009-02-05 エニグマ ディアグノスティックス リミテッド 分析方法及びキット
US8343738B2 (en) 2005-09-14 2013-01-01 Human Genetic Signatures Pty. Ltd. Assay for screening for potential cervical cancer
US8143006B2 (en) 2007-08-03 2012-03-27 Igor Kutyavin Accelerated cascade amplification (ACA) of nucleic acids comprising strand and sequence specific DNA nicking
US8685675B2 (en) 2007-11-27 2014-04-01 Human Genetic Signatures Pty. Ltd. Enzymes for amplification and copying bisulphite modified nucleic acids
JP2015221036A (ja) * 2008-04-30 2015-12-10 インテグレイテツド・デイー・エヌ・エイ・テクノロジーズ・インコーポレイテツド 修飾されたｒｎａ単量体を用いるｒｎアーゼｈを基礎とするアッセイ
JP2018110590A (ja) * 2008-04-30 2018-07-19 インテグレイテツド・デイー・エヌ・エイ・テクノロジーズ・インコーポレイテツド 修飾されたｒｎａ単量体を用いるｒｎアーゼｈを基礎とするアッセイ
JP2010158215A (ja) * 2009-01-09 2010-07-22 Fujifilm Corp 核酸配列の複製方法
US9732375B2 (en) 2011-09-07 2017-08-15 Human Genetic Signatures Pty. Ltd. Molecular detection assay using direct treatment with a bisulphite reagent
WO2015087945A1 (ja) * 2013-12-11 2015-06-18 学校法人埼玉医科大学 Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ５ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法、及びｃ型肝炎ウイルスのｎｓ５ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出用キット
JPWO2015087945A1 (ja) * 2013-12-11 2017-03-16 学校法人 埼玉医科大学 Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ５ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法、及びｃ型肝炎ウイルスのｎｓ５ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出用キット
US10370730B2 (en) 2013-12-11 2019-08-06 Saitama Medical University Detection method for mutation in 93rd amino acid of hepatitis C virus NS5A protein, and detection kit for mutation in 93rd amino acid of hepatitis C virus NS54 protein
JP2019170398A (ja) * 2019-07-16 2019-10-10 株式会社東芝 核酸検出方法及びアッセイキット

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