TW200532025A - Method of amplifying nucleic acid - Google Patents

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200532025 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 、、本發明係關於—種臨床領域中有狀標的核酸之檢測方 法以及基因工學領域中有用之DNA合成方法，又，本發明 係關於-種作為模板之核酸之增幅方法以及以該方法所增 幅之標的核酸之檢測方法。 【先前技術】 基因工學領域之研究中，使用dna合成而達成各種目 的。其中’若將如寡核㈣之類的短鏈之dna合成排除， 則其大部分係可藉由利用dna聚合酶之酵素方法來實施。 例如’聚合酶連鎖反應（PCR: polymerase ch議

Reactl°n ’聚合酶鏈反應）法為了可再生用於實施下一個增 幅循環之單鏈標的分子，故而必須重複多次自高溫至低溫 的，應：由於可藉由溫度制約反應，因此反應系必須以非 連績相或循環地實施。 故而，上述方法中必須使用價格較高之溫度循環反應 :’，其可使用於較廣溫度範圍並且可依時間實行嚴密的溫 度調整…因該反應中需要充足時間以設定可於兩種〜 二種溫度條件下實施之溫度，固其損失的時間隨循環次數 呈正比地增大。 口此為解決上述問題點，開發有可於等溫狀態下實施 之核酸增幅法。作為可於等溫下實施之方法，例如可列舉 ^ ^ (SDA : strand Displacement Amplification)^ (例如茶照專利文獻υ、RCA_ing a*〜贴⑽贈， 97916.doc 200532025 環形增幅）法（例如參照專利文獻2)、LAMP(L〇〇p,ediated isothermal Amplication，環介導等溫增幅）法（例如參照專 利文獻 3)、ICAN(Is〇thermal and Chlmeric

Amplification of Nucleic acids，等溫嵌合引子引發之核酸 增幅）法（例如參照專利文獻4)或各種改良SDA法（例如參照 專利文獻5〜8)等。 於該等之等溫核酸增幅法或寡核苷酸合成法之反應中， 引子延伸、引子黏接至單鏈延伸生成物(或原#的序列)或其 後之引子延伸等係同時生成於保溫在特定溫度的反應混合 物中。 揭示於上述專利文獻i中之SDA法，其係藉由經由dna聚 合酶與限制性核酸㈣酶之雙鏈取代所實施的試料中標的 核酸序列（以及其互補鏈）之增幅法。該方法中，使用於增幅 之引子必須為四種，豆Φ V ^ ，、T兩種必須構築為可包含限制性核 酸内切酶之識別部位。又’該方法中作為用以合成歷之 基質，必須大量使用經過修#之三鱗酸去氧核糖核苦酸， 例如酸基之氧原子取代為疏原子（s)的㈣）三構酸去 氧核糖核苷酸。 揭示於上述專利文獻2中之RCA法，其係將環狀爾設為 模板之核酸增幅方法。由於糾抱〜曰 去由於所獲得之增幅產物具有複數次 重複增幅區域之序列，了要使增幅產物重新作為模 板發揮功能，故而最終增幅產物具有稱為分支㈣心㈣ 之支化構造。進而’關於RCA法有下述報告：為提高增幅 效率’重要的是抑制副反應中生成之梯子形狀增幅產物（例 97916.doc 200532025 如參照非專利文獻1)。 揭示於上述專利文獻3中之LAMP法，其於增幅中必需四 種引子。又，所獲得之增幅產物係重複成為增幅標的之區 域且尺寸不固定的梯子形狀DNA。該DNA中目標區域係以 改變方向之狀態相互連結。 揭示於上述專利文獻4中之ICAN&，其係使用有嵌合寡 核苷酸引子之核酸增幅方法。 揭示於上述專利文獻5中之改良SDA法，其係使用有嵌合 募核苷酸引子之DNA增幅方法，該嵌合寡核苷酸彳I子包含 RNA與DNA且以至少於3,末端巾配置有DNA之構造為必要 條件。 揭不於上述專利文獻6中之改良SDA法，其必須要可生成 1突出末端之限制酶。 揭示於上述專利文獻7中之改良SDA法，其必須要至少兩 組成對引子。 … 揭示於上述專利文獻8中之改良SDA法，其必須要至少兩 組引子與至少一種修飾性三磷酸去氧核糖核苷酸。 如上所述，雖然開發有等溫核酸增幅法，但該等方法中 亦存有增幅效率、檢測靈敏度等問題。因此，為解決該問 9題:;厂開發"，溫核酸增幅法(例*參照專利：獻 揭示於專利文獻9中之方法，其係使用有下述引子之核酸 增幅方法：逆轉錄引子；或於核酸增幅用引子5，末端中附加 職聚合酶啟動子或其_部分，進而於其5|末端中依需要附 97916.doc 200532025 加至少含有5驗基之寡核普酸的引+ ;以及黏接至該引子上 游區域或該引子RNA聚合酶啟動子部位的第三引子。 補 之 揭示於專利文獻1〇中之方法，其係至少使用有兩種互 的引子之核酸增幅方法，以及至少使用有兩種成對引子 核酸增幅方法。 :方法係藉由使用複數個引子或成對引子之處理從而可 提同牦巾田產物生成里之方法，為提高生成量必須使用更多 的引子或成對引子。 揭示於專利文獻u中之方法，其係於專利文獻12所揭示 之方法中組合使用嵌合寡核苦酸引子以及作為模板之核酸 的該引子所雜合之位置之3,側雜合之上游寡核苦酸引子的 方法。 该方法中’形成梯子形之募核㈣引子僅於模板鍵中包 含雜合之序列。 如此，先則之等溫核酸增幅法仍存有各種問_，故而業 者要求有效率良好且可以高靈敏度實施之方法。 [專利文獻1]日本專利特公平7-114718號公報 [專利文獻2]國際專利公開案第97/19193號出版品 [專利文獻3]國際專利公開案第⑻/2_2號出版品 [專利文獻4]國際專利公開案第⑼/56877號出版品 [專利文獻5]美國專利第5,824,5 17號說明書 [專利文獻6]國際專利公開案第的/⑽川號小冊子 [專利文獻7]ϋ際專利公開案第”^⑽號小冊子 [專利文獻8]_際專利公_第99/濯m小冊子 97916.doc 200532025 [專利文獻9]國際專利公開案第95/03426號小冊子 [專利文獻10]國際專利公開案第95/25 180號小冊子 [專利文獻11]曰本專利特開案2〇〇3-52380號公報 [非專利文獻 l]Hafner G. J·其他四名、Bi〇Techniques， v〇1.30(2001)p852-867 [發明所欲解決之問題] 本叙明之主要目的在於提供一種高靈敏度、特異性增幅

σ式料中私的核酸之標的核酸的增幅方法，用於實施該等方 法之組合物以及套組。 【發明内容】 本案毛明者等為解決上述課題而積極研究。其結果為辱 現下述情形：在模板核酸中存有實質性同一序列之情^ 下藉由在；，於5亥序列之區域内設置引子，於反肩 中Μ不區域可經由上述同一序列生成以同一方向聚合# 梯子形狀產物。進而，發現下述情形從而完成本發明·1 由使用嵌合寡核苷酸引子盥人亡 +

y 于，、3有知'疋鹼基序列之形成梯子 幵> 之养核苷酸引子，將 _ 肝g 1¾產物積極地設為梯子形狀從而 可提高ICAN反應之愈絲痒 里敏度、增幅效率以及反應速度。 即，本發明之第—發明係關於—種核酸之增幅方法，盆 係用於增幅核酸者’其特徵在於：包含 (A)調製選自下述（ U)^(b)之反應混合物的步驟， (a)作為模板之核酸、二綠 斤 ^ ^ 一 去氧核糖核苷酸、具有鏈取 代活性之DNA聚合酶、 一 / v兩種肷合寡核苷酸引子、至少 一種形成梯子形之裳拉 暴核苷酸引子以及RNaSeH， 97916.doc -10- 200532025 (b)作為模板之核酸、三磷酸去氧核糖核苷酸、具有鏈取 代活性之DNA聚合酶、至少兩種嵌合寡核苷酸引子以及 RNaseH，其中，一方嵌合募核苷酸引子係作為形成梯子形 之寡核苷酸引子以發揮作用， 其中，上述嵌合募核苷酸引子含有至少選自去氧核糖核 苷酸以及核苷酸類似物者與核糖核苷酸，該核糖核苷酸配 置於該引子31末端或3,末端側， 上述嵌合寡核苷酸引子至少含有兩種與作為模板之核酸 驗基序歹，J互補之第-喪合寡核彳酸引？，以及與作為模板 之核酸鹼基序列互補之第二嵌合寡核苷酸引子， 上述形成梯子形之寡核苷酸引子，其具有與作為模板之 核酸之該第一嵌合募核苷酸引子互補的區域以及/或者自 該區域與3,侧鹼基序列互補之序列，並且於5，側具有與作為 模板之核酸同源的第二嵌合寡核苷酸引子之5，側鹼基序 列，起始自與作為模板之核酸之該第二嵌合寡核苷酸引子 同源區域5,末端進而相當於5，側方向區域之鹼基序列或與 其兩方互補之序列； 以及 (B)+於特定溫度條件下以生成梯子形狀增幅產物所需之 充足時間來培養反應混合物的步驟，於上述特定溫度條件 下可貫施對於作為模板之核酸的引子特異性黏接，藉由 DNA聚合酶所實行之延伸鏈合成反應及鏈取代反應，以及 藉由RNaseH所實行之延伸鏈切斷反應者。 本發明之第—發明中’作為模板之核酸為RNA，亦可預 97916.doc 200532025 先以二破酸去氧核糖核苦酸、具有逆轉錄活性之㈣a聚合 s号以及至；一種形成梯子形之寡核苷酸引子，處理該核酸 從而設為逆轉錄產物。 本發明之第-發明中，步驟(A)之反應混合物進而亦可含 有具有逆轉錄活性之dna聚合酶。 本發明之第-發明中，作為模板之核酸亦可係mRNA。 本發明之第一發明中，亦可使用一種具有逆轉錄活性與 鏈取代活性之DNA聚合酶。 亡务明之第一發明係關於一種組合物，其特徵在於：用 於實施本發明之第一發明方法’其又含有分別為至少一種 之嵌合寡料酸引子以及/或者形成梯子形之寡核普酸引 尽發明之第三發明係關 ^ ^ ^ 六何1狄牡於:用以 實施本發明之第一發明’又分別含有至少一種嵌合寡核普 酸引子以及/或者形成梯子形之寡核苷酸引子。 本發明之第四發明係關於一種標的核酸之檢測方法，其 特徵在於包含下述步驟： ⑷藉由本發明之第—方法，增幅標的核酸之步驟；以及 (b)檢測藉由上述步驟所增幅之標的核酸的步驟。 本發明之第五發明係關於一種寡核普酸引子，其特徵在 於:使用於本發明之第一發明方法，又於5’側具有與二模 板之核酸同源引子之51侧驗基序列、起始自與作為模板之核 酸之該第二嵌合寡核普酸引子同源區域5,末端且相當於 側方向區域之鹼基序列或與其兩方互補之序列。 979l6.doc 200532025 [發明之效果] 根據本發明，可提供一種優於先前之等溫核酸增幅方法 < 的增幅方法，以及可提供一種含有使用於該方法中之引子 · 的組合物以及套組。 【實施方式】 本說明書中，所謂去氧核糖核普酸（本說明書中亦記载為 dN)係指糖部分由D_2_去氧核糖構成之核芽酸，例如可列舉 驗基部分具有腺以、胞^、鳥嗓呤以及胸腺㈣^ 進而’上述去氧核糖核苷酸中亦包含具有7_去氮鳥嘌呤肖籲 苦等修飾性驗基者，或如具有可使用於固定化之官能基的 去氧核糖核苦酸或如去氧肌普核苦酸之去氧核糖核芽酸類 似物。 本說明書中’所謂核糖核普酸（本說明書中亦記載為N) 係指糖部分由D_核糖構成之核_，可列舉驗基部分具有 腺嗓呤、胞嘧咬、鳥嗓呤以及尿㈣者。$而，該核糖核 普酸中包含修㈣核糖核苦酸’例如亦可包含瞻魏基之 氧原子取代為硫原子⑻之修飾性核糖核芽酸[㈣）核糖核 苷酸，亦記載為（a-S)N]或其他衍生物等。 本說明書中，所謂嵌合寡核苷 甘0夂⑸子係指於該引子3’末 端或3’末端側配置核糖核苷酸、 %丰發明之方法中可延伸核 酸鏈、可以RNaseH切斷且可眚竑么去甘、 辦了貝施鏈取代反應的募核苷酸引 子，只要係具有該等構成者 J」包含於本發明之嵌合寡 核苷酸引子中。 使用於本發明中之嵌合寡核苷 似甘®夂引子，其係含有至少選 979i6.doc 13 200532025 自去氧核糖核苷酸以及核苷酸類似物者與核糖核苷酸的嵌 合寡核苷酸引子。該引子中亦包含寡核苷酸引子，該寡核 苦酸引子含有未修飾性核糖核㈣以及/或者修飾性核糖 核苷酸。 使用於本發明方法中之嵌合募核苷酸引子，其含有實質 性與模板核酸鹼基序列之一部分互補的鹼基序列。再者， 其中所謂「實質互補的鹼基序列」，其係指於所使用之反應 條件下可黏接至作為模板之DNA的鹼基序列。 本說明書中，所謂3’側係指核酸（例如引子）中自其中央至 3’末端的部分。同樣地，所謂5，側係指核酸中自其中央至 末端的部分。 本說明書中，所謂上游區域係指於與所使用之嵌合寡核 苷酸引子同源的模板鏈中，起始自該嵌合募核苷酸引子之 鹼基序列5,末端且相當於5,侧方向之區域。故而，若自該模 板鏈之互補鏈的角度來看，則係起始自與上述嵌合寡核苷 酸引子之鹼基序列互補性序列3,末端且相當於3,側方向之 區域。 匕又，本說明書中所謂用以形成梯子形之驗基序歹,J，其係 指使用於本發明方法中之嵌合募核苷酸引子之5,側鹼基序 列’起始自與作為模板之核酸的該嵌合募核芽酸引子同源 區域5,末端進而相當於上游區域（即5，側方向之區域）的驗基 序列或與其兩方互補之驗基序列。 本說明書中，所謂形成梯子形之寡核苷酸引子，其係指 於該引子5,側含有上述用以形成梯子形之鹼基序列者'。 97916.doc 200532025 本說明書中，鹼基序列位置係將使用於本發明方法中之 嵌合寡核苷酸引子5’末端以及對應於其位置之該嵌合寡核 苷酸引子所黏接之模板鏈位置設為「0」，朝向該嵌合寡核 苷酸引子3’末端侧依次以整數設為「+ 1」、「+2」、…。又， 自作為該模板之核酸「0」位置開始將1鹼基上游設為「-1」， 朝向上游依次以整數設為「-2」、「-3」、…。 本說明書中所謂RNaseH(核糖核苷酸H)，其亦可作用於 雙鏈DNA且特異性切斷該引子之核糖核苷酸部分者，上述 雙鏈DNA係以黏接至模板核酸之上述嵌合寡核苷酸引子實 施DN A延伸而生成。 本說明書中，所謂DNA聚合酶，其係指將DNA鏈作為模 板重新合成DNA鏈之酶（DNA依存性DNA聚合酶）以及以 RNA鏈作為模板從而合成與該RNA鏈互補之DNA鏈的酶 (RNA依存性DNA聚合酶），除天然型DNA聚合酶以外，亦 包含具有上述活性之變異體酶。至於該酶，例如可列舉具 有鏈取代（Strand displacement)活性之DNA聚合酶，未具有 5’— 3’核酸外切酶活性之DNA聚合酶，共同具有逆轉錄酶活 性或RNaseH活性之DNA聚合酶。 本說明書中所謂「鏈取代活性」，其係指根據作為模板之 核酸序列複製DNA時，取代DNA鏈並且實行DNA複製，使 黏接至模板鏈之互補鏈游離，即係可實施鏈取代（strand displacement)之活性。又，本說明書中，將藉由鏈取代從 而自作為模板之核酸序列所游離之DN A鏈稱為「取代鏈」。 本說明書中所謂「逆轉錄活性」，其係指將RNA鏈作為模 97916.doc -15 - 200532025 板從而可合成與該RNA鏈互補之DNA鏈的活性。 (1)本發明之標的核酸之增幅方法 本發明方法中，可分別至少使用一種嵌合寡核苷酸引子 以及形成梯子形之寡核苷酸引子，進而可組合RNaSeH以及 DNA聚合酶加以實施。又，於可表現RNaseH活性之條件 下’使用具有RNaseH活性之DNA聚合酶。 根據本發明方法，於等溫條件下連續性增幅核酸。其中， 所謂「連續性」係指並非隨著反應溫度、反應液組合變更 實行反應之情形。又，所謂「等溫」係指於下述各步驟中， 酶以及核酸鏈可發揮功能之實質性固定之溫度條件。 至於本發明之標的核酸增幅方法之一態樣，可例示為一 種核酸之增幅方法，其特徵在於：包含 (a) 藉由三磷酸去氧核糖核苷酸、具有逆轉錄活性之dna 聚合酶以及至少一種形成梯子形之寡核苷酸引子，處理作 為模板之核酸從而獲得逆轉錄產物之步驟； (b) 將上述逆轉錄產物與具有鏈取代活性之dna聚合 酶、至少兩種嵌合募核苷酸引子以及RNaseH混合從而調製 反應混合物的步驟；以及 (0於特定溫度條件下以生成梯子形狀增幅產物所需之充 足時間且培養反應混合物的步驟，於上述特定溫度條件下 可貝施藉由上述DNA聚合酶所實行之延伸鏈合成反應及鏈 取代反應，以及藉由RNaseH所實行之延伸鏈切斷反應。 其中，上述嵌合寡核苷酸引子含有至少選自去氧核糖核 苦酸及核苷酸類似物者與核糖核苷酸，該核糖核苷酸配置 97916.doc -16- 200532025 於該引子3’末端或3,末端側， 上述嵌合寡核芽酸引子至少含有兩種與作為模板之核酸 驗基序列互補之第一嵌合寘：妨it缺？丨7 禾队口养核苷酸引子，以及與作為模板 之核酸鹼基序列同源之第二嵌合寡核苷酸引子， 上述形成梯子形之S核苷酸引子，其具有與作為模板之 核酸的該第一嵌合募核苷酸引子互補之區域以及自該區域 與3’側鹼基序列互補之序列，並且於5,側具有與作為模板之 核酸同源的第二嵌合募核苷酸引子5，側鹼基序列、起始自與 作為扠板之核酸之該第二嵌合募核苷酸引子同源區域5，末 端進而相當於上游區域（即，5,側方向之區域）的鹼基序列或 與其兩方互補之驗基序列。 又至於本發明之其他恶樣，可例示為一種核酸之增幅 方法’其特徵在於：包含 (a) 混合作為模板之核酸、三磷酸去氧核糖核苷酸、具有 逆轉錄酶活性之DNA聚合酶、具有鏈取代活性之dna聚合 酶、至少兩種嵌合寡核苦酸引子、至少一種形成梯子形之 寡核苷酸引子以及RNaseH，調製反應混合物之步驟；以及 (b) 達成於特定溫度條件下生成梯子形狀增幅產物所需 之充足時間且培養反應混合物的步驟，於上述特定溫度條 件下可實施對於作為模板之核酸的引子特異性黏接，藉由 DNA聚合酶所實行之延伸鏈合成反應及鏈取代反應，以及 藉由RNaseH所實行之延伸鏈切斷反應。 其中，上述嵌合寡核苷酸引子含有至少選自去氧核糖核 普酸及核苷酸類似物者與核糖核苷酸，該核糖核普酸配置 97916.doc -17- 200532025 於该引子3’末端或3,末端側， 上述嵌合募核苷酸引早5 ^、人> 至夕έ有兩種與作為模板之核酸 驗基序列互補之第_嵌人寘 养核苷酸引子，以及與作為模板 之核酸鹼基序列同源之第二嵌合寡核芽酸引子， 上述形成梯子形之寡核㈣引子，其具有與作為模板之 核酸的該第一嵌合寡核苦酸引子互補之區域以及自該區域 與3 ’側鹼基序列互補之庠丨 補之序列，並且於5,側具有與作為模板之 核酸同源的第二嵌合寬# #々 口养核苷酸引子5,側鹼基序列，起始自與 作為模板之核酸之該第二嵌人 甘人口养核苷酸引子同源區域5，末 端進而相當於上游區域以 Ρ 5側方向之區域）的鹼基序列或 與其兩方互補之鹼基序列。 進而至於本發明之其他態樣，可Y列示為一種核酸之增 巾田方法’其特徵在於：包含 ⑷混合作為模板之核酸、三鱗酸去氧核糖核苦酸、具有 鏈取代活性之DNA聚合酶、至少兩種嵌合寡核普酸引子、 至少-種形成梯子形之寡核苦酸引子以及⑽灿，調製反 應混合物之步驟；以及 (b)於特定溫度條件下以生成梯子形狀增幅產物所需之 充足時間培養反應混合物的步驟，於上述特定溫度條件下 可灵施對於作為模板之核酸的引子特異性黏接，藉由DNA 聚合酶所實行之延伸鏈合成反應及鏈取代反應，以及藉由 RNaseH所貫行之延伸鏈切斷反應。 ▲其中，上述嵌合募核苷酸引子含有至少選自去氧核糖核 苷酸以及核苷酸類似物者與核糖核苷酸，該核糖核苷酸配 97916.doc -18- 200532025 置於該引子3'末端或3’末端側， 上述嵌合募核苷酸引子至少含有兩種與作為模板之核酸 · 鹼基序列互補之第一嵌合募核苷酸引子，以及與作為模板 · 之核酸驗基序列同源之弟一敌合募核苷酸引子， 上述形成梯子形之募核苷酸引子，其係與作為模板之核 酸的該第一嵌合寡核苷酸引子互補之區域以及自該區域與 3’側鹼基序列互補之序列，並且於5,側具有與作為模板之核 酸同源的第二嵌合寡核苷酸引子5,側鹼基序列、起始自與作 為模板之核酸之該第二嵌合募核苷酸引子同源區域5，末端 _ 進而相當於上游區域（即，5,側方向之區域）的鹼基序列或與 其兩方互補之鹼基序列。 上述態樣中，作為模板之核酸為單鏈之情形時，第一彼 合养核苷酸引子具有與該鏈互補之鹼基序列。又，第二欲 合寡核苷酸引子具有與該鏈之互補鏈互補之鹼基序列，即 具有與該鏈同源之鹼基序列。進而，形成梯子形之寡核苷 酸引子，其於5,側具有下述鹼基序列··與該鏈互補之鹼基序 列以及與該鏈同源之第二嵌合募核苦酸引子5，側鹼基序籲 列、起始自該第二嵌合募核苷酸引子5,末端進而相當於上游 區域之鹼基序列或與其兩方互補之鹼基序列。又，即使作 為模板之核酸為雙鏈之情形時，當然亦可於任何一方鏈中 同樣地設計引子。 · 上述任何一個態樣中，亦可將形成梯子形之寡核苷酸引 · 子取代U合S核㈣引子，於該情料該嵌合寡核普酸 引子可補充形成梯子形之寡核苷酸引子之功能。即，只要 97916.doc -19- 200532025 有助於梯子形形成，即以使用募核苷酸引子以及/或者嵌合 养核苷酸引子中任一者為較佳。 ， 雖然沒有特別限定，但例如可使用第一嵌合寡核苷酸引 · 子作為形成梯子形之寡核苷酸引子。於該情形時，第一嵌 口养核苷fee引子於5 ’侧具有下述鹼基序列：與作為模板之核 酸同源之第二嵌合募核苷酸引子5，側鹼基序列、起始自該第 二嵌合募核苷酸引子5,末端進而相當於上游區域之鹼基序 列’或與其兩方互補之鹼基序列。 於-亥方法中，以使用作為延伸反應基質之三磷酸核苷酸 鲁 而使用於PCR法等中之dNTp，即dATp、dCTp、dGTp、dTTp 混合物為較佳。又，亦可使用dUTP作為基質。進而，該dNTP 右限疋為所使用之dna聚合酶基質，則亦可含有dNTp(三磷 酸去氧核糖核普酸）類似物，例如7_去氮_dGTP、dITP等三 鱗酸核«。又，亦可使用dNTP3iuNTP類似物之衍生物， 亦可3有具有g I基之衍生物，例如具有胺基之犯。該 方法中’可使用嵌合寡核苦酸引子，該引子係可使用例如 DNA合成機等’以與一般合成方法同源之方式調製。 本毛明方法中，作為模板之核酸（即dna或rna)亦可自 可能含有該核酸之所有試料中調製或分離出來者。進而， 亦可將上述试料直接使用於本發明之核酸增幅反應中。只 要疋含有如此核酸之試料則無特別限定，但例如可列舉如 ‘ 全血、血清、白血球層、尿液、糞便、腦脊骨遗液、精液、· 唾液、組織（例如癌組織、淋巴節等）及細胞培養物（例如嗔 礼動物細胞培養物、細菌培養物等）之類的源自生物體之試 97916.doc -20. 200532025 料’如類病毒、病毒、細 # 擻囷、酵母、植物及動物之 頒的含有核酸之試料，存有合 、e 曰又到如病毋或細菌等|生物 化入或感染可能性的試料（舍0 上 丁十^ 口口生物學性製劑等），或如土 壤、排水等可能含有生物 ^ 、付又，亦可係藉由眾所周 知之方法處理上述試料等所藍 、丁十寻所獲侍的含有核酸之調製物。可 將例如細胞破碎物或將豆分 ，、刀離所獲侍之試料作為該調製 物’可將该试料中之控酿成 T <核馱或特疋核酸分子群（例如mRNA) 經過富化之試料等使用於太恭 丨丁于從用於本發明。進而，亦以使用 ㈣知之方法增幅包含於上述試料中之核酸的dna或rna 等之核酸等為較佳。 只要是來自言亥等材料之含有核酸之調製物的調製方法則 無特別限定，但例如可藉由界面活性劑之溶解處理、超聲 波處理、使用有玻璃珠之振蓋攪#以及使用㈣細胞均質 機等實施。在多個範例中，較為有利的是進一步增加操作 從而純化核酸（例如，存有内在性核酸酶時）。該等範例中， 純化核酸係可藉由酚萃取、色譜法、離子交換、凝膠電泳 或密度梯度離心分離等眾所周知之方法加以實施。 欲要增幅具有源自RNA序列之核酸之情形時，亦可將 cDNA設為模板實施本發明之方法，該cDNA係藉由將上述 RNA設為模板之逆轉錄反應所合成者。對於可適用於本發 明方法之RNA，只要係可製作出使用於逆轉錄反應之引子 者’則無特別限制，但除試料中全部RNA以外，亦可列舉 niRNA、tRNA、rRNA等RNA分子群或特定RNA分子物種。 至於使用於上述逆轉錄反應中之酶，只要是具有將rna 97916.doc -21 - 200532025 設為模板之cDNA合成活㈣，則無特別限$，例如可列舉 源自鳥類骨it芽球症病毒之逆轉錄酶（AMVRTase)、源自莫 洛尼鼠白血病病毒之逆轉錄酶（M规v RTase)、R〇us關聯病 毒2逆轉錄酶（讀-2 RTase)等各種起源之逆轉錄酶。此外， 亦可使用共同具有逆轉錄活性之DNA聚合酶。又，為實現 本發明㈣，以於高溫下具有逆轉錄活性之酶為較佳’例 如可使用源自棲熱菌屬細菌之DNA聚合酶（Tth dna聚合酶 等）、源自嗜熱性桿菌屬細菌之〇]^八聚合酶等。雖無特別限 定，但以例如源自嗜熱性桿菌屬細菌之DNA聚合酶為較 佳，以源自B.st之DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶）為更佳，以 Bca DNA聚合酶為尤佳。例如，Bca 〇：^入聚合酶於逆轉錄 反應中亚不需要錳離子，又，於高溫條件下可抑制模板rna 之二次構造形成並且合成cDNA。亦可使用上述具有逆轉錄 酶活性之酵素中之具有該活性範圍的天然體、變異體中任 一者。 對於使用於本發明方法之嵌合寡核苷酸引子雖無特別限 定’但用來作為本發明之嵌合寡核苷酸引子以約6〜約5〇驗 基為較佳，以約1〇〜約4〇鹼基為尤佳，以約12〜約3〇鹼基之 寡核苷酸為特佳。以其鹼基序列係於所使用之反應條件下 以黏接至模板核酸之方式而與模板核酸互補的序列為較 仏σ亥引子於3末端或3 ’末端側含有藉由下述階段中所使用 之RNaseH識別之序列。 雖然對本發明並無任何限定，但於本發明DNA合成方法 中例如可使用具有以下述一般式表示之構造的寡核芽酸作 97916.doc -22- 200532025 為弓1子。 一般式：5，-dNa-Nb-dNc-3， (上述一般式中，dN :去氧核糖核苷酸以及/或者核苷酸 類似物，N :未修飾性核糖核苷酸以及/或者修飾性核糖核 苷酸，再者上述各核苷酸亦可於不會損害其功能之範圍内 含有核苷酸類似物或衍生物（修飾性核苷酸），dNa部位之一 部分dN亦可以N取代。） 對於上述一般式雖無特別限定，但例如a亦可係5以上之 整數，以6以上之整數為較佳，以8以上之整數為尤佳。又， b亦可係1以上之整數，例如卜。範圍，以卜⑺之範圍為較 仏以1〜7之範圍為尤佳，以1〜5之範圍為特佳。進而，c 亦可係0或1以上之整數，以〇〜5之範圍為較佳，以〇〜3之範 圍為尤佳。 本么明方法中，為獲得梯子形狀增幅產物，亦可使用形 成梯子形之寡核普酸引子’以該引子亦使用至少選自去氧 核糖核苷酸、核糖核苷酸或核苷酸類似物者為較佳。

使用於本發明方法之形成梯子形之寡核_酸引子，以使 ㈣⑽具有下述驗基序列者為較佳：與作為模板之核酸同 源之第一肷合募核苷酸引子的5，側鹼基序列，或起始自該第 二嵌合寡核普酸引子5,末端且相當於上游區域之驗基序列 或與其兩方互補之鹼基序列。 亦可使用形成梯子形之 係於所使用之反應條件 定。該引子除具有與特 本發明中，將RNA設為模板時， 养核苷酸引子作為逆轉錄引子，若 下黏接至模板RNA者，則無特別限 97916.doc -23- 200532025 定模板麗互補之驗基序列的引子（特異性引子）以外，亦可 係寡dT(去氧胸普）引子或具有無規序列之弓丨子（益規引 子)。該形成梯子形之募核脊酸引子中，與作為模板之核酸 驗基序列一部分互補之序列部分長度，考慮到實施特異性 黏接之方面’以6個以上之核驻酿 枒甘馱為較佳，以9個以上之核 普酸為更佳；考慮到合成s核㈣方面，以⑽個以下之核 苷酸為較佳，以30個以下之核苷酸為尤佳。即，只要係 使用於來自RNA之逆轉錄反應中者，則無特別限定。” 該形成梯子形之募料酸引子，其於所使用之條件下只 要係有助於梯子形狀DNA鏈之延伸者，則無特別限定。以 該引子具有與作為模板之核酸同源之嵌合寡核苦酸引子5’ 側驗基序列’或起始自該嵌合寡核芽㈣子5,末端且 上游區域之驗基序列或與其兩方互補之鹼基序列者為較 佳；對於與喪合寡核苦酸引子之上游區域互補性序列，雖 然無特別限^，但以約3~約1()()核㈣為較佳，以約4〜⑽ 核苦酸為尤佳，以約5〜約2〇核芽酸之驗基長度為特佳。 又對於與上述嵌合寡核普酸引子之上游區域互補之序 列，雖無特別之限定，但其係選自+2〇〜·_位置之3鹼基 ^上之序列’以選自+ 15〜_8〇位置之3驗基以上之序列為較 佳，以選自+1()〜_6()位置之3驗基以上序列為尤佳，以選自 40位置之3驗基以上序列為特佳。至於該驗基序列雖 然無特別限定，但例如可列舉起始自-!位置、-U位置、-21 位置之區域。 該形成梯子形之寡核普酸引子只要可發揮其功能，則未 97916.doc -24- 200532025 特別限定實施黏接之位，/ ^ 、卜 置亦可係嵌合寡核苷酸引子全部 40驗基之位置 或重複1鹼基以上之位置、 且 W接位置、相隔1 中任一者。 又，對於該形成梯子形之寡核苦酸引子之GC含量雖然無 特別限定，但以4〇%以上範圍為較佳。 、 使用於纟發明方法之形成梯子形之寡核苷酸引 子"亦可係含有;^芽酸類似物或其他物質者。_，本發 月之Φ成梯子形之寡核^:酸引子中，dna聚合酶自其3，末 端實施聚合酶延伸反應，可於不損害引子功能之範圍内含 有個以上核苦酸類似物，進而該核苦酸類似物亦可組合 使用複數種一者。至於該核苦酸類似物，雖無特別限定， 仁例如可使用去氧肌芽核^:酸、去氧尿嘴唆核脊酸或具有 如7去氮鳥&呤核苦之修飾性驗基的核普酸類似物以及具 有核糖衍生物之核苷酸類似物等。又，使用於本發明之嵌 合募核苷酸引子亦在保持上述功能之範圍内含有各種修 飾，例如附加標識化合物等或附加有固定化用官能基之去 氧核糖核苷酸、核糖核苷酸以及核苷酸類似物。 從抑制引子本身之高次構造的形成、使與模板之黏接的 形成穩定化之觀點來看，向核苷酸類似物導入引子係有效 的0 使用於本發明方法之嵌合募核苷酸引子以及形成梯子形 之募核苷酸引子，以具有任何核酸序列之方式使用例如美 國應用生物糸統公司，ABI公司，Applied Biosystems Inc ) 之DNA合成器394型，藉由phosphamidite法合成。又，其他 97916.doc -25- 200532025 :法係：酸二酯法、沁膦酸酯法以及硫代膦酸酯法等，但 亦可係藉由任何一種方法合成者。 ' 於本电明之其他_樣，可利用本來存在於作為 ^之核酸中的驗基序列而獲得梯子形狀增幅產物。於此 月㈣’梯子形可制存在於作為模板之核酸上的驗基序 ㈣成。雖無特別限^ ’但是當例如所欲設^之—方喪合 寡核芽酸引子5’側或存在於其上游之鹼基序列，與所欲設定 之另一方嵌合寡核㈣引子5，側或存在於其上游之驗基序 列互補時’藉由於上述配置中設定嵌合募核苦酸引子，可 有=獲得梯子形狀增幅產物。又，藉由形成梯子形之處理， 可提高檢測靈敏度以及檢測速度。 作為杈板之上述核酸上的雙方嵌合寡核苷酸引子5，側或 存在於其上游之互補性鹼基序列，可藉由其GC含量、接近 八之序列、與引子之距離、所增幅之長度以及反應條件等 隨意設定’雖無特別限定，但例如可選自3驗基以上之互補 丨生鹼基序列’以選自6鹼基以上之互補鹼基序列為較佳。 又，對於该序列雖無特別限定，但例如將上述嵌合募核苷 酉文引子5’末端設為〇位時，則應為+2〇一1〇〇區域，以+15〜_肋 區域為較佳，以+10〜-60區域為尤佳，以+5一4〇區域為特加。 進而，作為模板之核酸上之雙方嵌合寡核苷酸引子5，側 或存在於其上游之互補性鹼基序列，其可藉由其Gc含量、 接近其之序列、與引子之距離、所增幅之長度以及反應條 件等依需要設定，雖無特別限定，但以7〇%以上之互補範 圍為較佳。 97916.doc -26- 200532025 雖然對於使用於本發明方法中之形成梯子形的寡核普酸 引子並無限定，但就使用於下述實施例中之形成梯子形之 寡核苷酸引子構成為例加以說明。 例如’ A12-205R(序列表之序列號3)之第1〜12號驗基，其 係自第二嵌合募核苷酸引子（134FN3(18):序列表之序列號 7)5’末端與1〜12驗基上游區域（-1〜-12)互補的驗基序列，且 苐13〜30號驗基係與第一嵌合募核苦酸引子（2〇5 rn3(1 8): 序列表之序列號2)互補性區域互補的序列。換言之，該第 13〜30號鹼基係與第一嵌合寡核苷酸引子同源。 例如，A12-215R(序列表之序列號5)之第1〜12號鹼基，其 係自第二嵌合寡核苷酸引子（134FN3(18) ··序列表之序列號 7)5末端與1〜12驗基上游區域（-1〜-12)互補的驗基序列，且 第13〜30號鹼基係自與第一嵌合募核苷酸引子 (205RN3(18):序列表之序列號2)5’側8鹼基互補性區域以及 與該第一嵌合寡核苷酸引子互補性區域，與3,側10鹼基序列 互補的序列。換言之，該第Π〜30號鹼基係自該第一嵌合寡 核苦酸引子之上游第1〇鹼基開始，與該第一叙合寡核苷酸 引子5’側8鹼基之序列同源。A12-21 5R之第23〜30號鹼基與 2051〇^3(18)之第1〜8號鹼基重複。 例如’ A12-223R(序列表之序列號5)之第1〜12號鹼基，其 係自第二嵌合募核苷酸引子（134FN3(18):序列，表之序列號 7)5’末端與1〜丨2鹼基上游區域（·1〜-12)互補的鹼基序列，且 第13〜30號鹼基係自與第一嵌合寡核苷酸引子 (205RN3(18) ·•序列表之序列號2)互補性區域，與3’側18鹼 97916.doc •27- 200532025 基序列互補的序列。換言之，該第13〜30號鹼基係自該第一 嵌合寡核苷酸引子之上游第1 8鹼基開始，與上游第1驗基序 列同源。A12-223R與205RN3(18)相互鄰接。 例如，A12(-10)-215R(序列表之序列號8)之第1〜12號驗 基，其係自第二嵌合募核苷酸引子（134FN3(18):序列表之 序列號7)5’末端與11〜22鹼基上游區域（-11〜-22)互補的驗基 序列，且第13〜30號鹼基係自與第一嵌合募核苷酸引子 (205RN3(1 8):序列表之序列號2)5’側8鹼基互補性區域以及 與該第一嵌合募核苷酸引子互補性區域，與3,側10鹼基序列 互補的序列。換言之，該第13〜30號鹼基係自該第一嵌合募 核苦酸引子之上游第1 〇驗基開始，與該第一嵌合寡核苦酸 引子5’側8鹼基之序列同源。A12(-10)-215R之第23〜30號驗 基與205RN3(1 8)之第1〜8號驗基重複。 例如，A12(-20)-215R(序列表之序列號9)之第1〜12號鹼 基，其係自第二嵌合募核苷酸引子（134FN3(18) ··序列表之 序列號7)5’末端與21〜32鹼基上游區域（-21〜-32)互補的鹼基 序列，且第13〜30號鹼基係自與第一嵌合寡核苷酸引子 (205RN3(1 8):序列表之序列號2)5’側8鹼基互補性區域以及 與該第一嵌合募核苷酸引子互補性區域，與3,側1〇鹼基序列 互補的序列。換言之，該第13〜30號鹼基係自該第一嵌合寡 核苷酸引子之上游第1 〇鹼基開始，與該第一嵌合寡核苷酸 引子5’側8鹼基之序列同源。A12(-20)-215R之第23〜30號鹼 基與205RN3(18)之第1〜8號鹼基重複。 例如’ A12(6)-215R(序列表之序列號10)之第丨〜;^號鹼 97916.doc -28- 200532025 基，其係與第二嵌合寡核苷酸引子（134FN3(l8):序列表之 序列號7)5’末端侧6鹼基（+ 5〜〇)以及自5，末端與ι〜6鹼基上 游區域（-1…6)互補的鹼基序列，且第13〜3〇號鹼基係自與第 一嵌合寡核苷酸引子（2〇5RN3(丨8) ··序列表之序列號2)5，側8 鹼基互補性區域以及與該第一嵌合寡核苷酸引子互補性區 域’與3’側10鹼基序列互補的序列。換言之，該第i3〜3〇號 驗基係自該第一嵌合寡核苷酸引子之上游第丨〇鹼基開始， 與该第一喪合寡核苷酸引子5，側8鹼基之序列同源。 八12(6)-21511之第23〜30號鹼基與2051^3(18)之第1〜8號鹼 基重複。 例如’ A12(12)-215R(序列表之序列號11)之第丨〜η號驗 基，其係於第二嵌合寡核苷酸引子（134FN3(18):序列表之 序列號7) 5末側與12驗基（+ 11〜〇)互補的驗基序列，且第 13〜30號鹼基係自與第一嵌合募核苷酸引子（2〇5RN3(18): 序列表之序列號2)5 W則8驗基互補性區域以及與該第一嵌合 寡核苷酸引子互補性區域，與3，側1 〇鹼基序列互補的序列。 換言之，該第13〜30號鹼基係自該第一嵌合寡核苷酸引子之 上游第10鹼基開始，與該第一嵌合寡核苷酸引子5’側8鹼基 之序列同源。A12(12)-215R之第23〜30號鹼基與205RN3(18) 之第1〜8號鹼基重複。 例如，A6(-10)-215R(序列表之序列號14)之第ι〜6號鹼 基，其係自第二嵌合寡核苷酸引子（134FN3(18):序列表之 序列號7)5’末端與11〜16驗基上游區域互補的驗基 序列，且第7〜24號驗基係自與第一喪合寡核苷酸引子 97916.doc -29- 200532025 (205RN3(18):序列表之序列號2)5，側8鹼基互補性區域以及 與該第一後合寡核苷酸引子互補性區域，與3,側1〇鹼基序列 互補的序列。換言之，該第7〜24號鹼基係自該第一嵌合寡 核苦酸引子之上游第10鹼基開始，與該第一嵌合寡核苷酸 引子5’側8鹼基之序列同源。A6(_i〇)-21 5R之第17〜24號鹼基 與205 RN 3 (18)之第1〜8號驗基重複。 例如’ A9(-l〇)-215R(序列表之序列號15)之第1〜9號鹼 基，其係自第二嵌合募核苷酸引子（134FN3(18):序列表之 序列號7)5’末端與Π〜19鹼基上游區域（-11〜-19)互補的鹼基 序列’且弟1 〇〜27號驗基係自與第一般合寡核皆酸引子 (205RN3(18):序列表之序列號2)5W則8鹼基互補性區域以及 與該第一嵌合寡核苷酸引子互補性區域，與3,側1〇鹼基序列 互補的序列。換言之，該第1〇〜27號鹼基係自該第一嵌合寡 核苷酸引子之上游第10鹼基開始，與該第一嵌合募核苷酸 引子5’側8鹼基之序列同源。A9(-l0)-215R之第20〜27號鹼基 與2 0 5 RN 3(18)之第1〜8號驗基重複。 例如，（A12)241RN3(序列表之序列號19)之第1〜7號鹼 基，其係自第二嵌合寡核苷酸引子（160FN3 :序列表之序列 號17)5’末端與1〜7鹼基上游區域（-1〜-7)互補的鹼基序列，且 第8〜21號鹼基係與第一嵌合寡核苷酸引子（241RN3:序列表 之序列號18)互補性區域互補的序列。換言之，該第8〜21號 鹼基係與該第一嵌合寡核苷酸引子同源。 例如，ALDH2-TH1(序列表之序列號25)之第1〜12號驗 基，其係自第二嵌合寡核苷酸引子（ICAN-ALDH2-F ··序列 97916.doc -30- 200532025 表之序列號21)5’末端與1〜12驗基上游區域（_1〜_12)互補的 鹼基序列，且第13〜29號鹼基係自與模板核酸之第一嵌合寡 核苷酸引子（ICAN-ALDH2-R :序列表之序列號22)5,側15鹼 基互補性區域以及與該第一嵌合寡核苷酸引子互補性區 域，與3 W則2驗基序列互補的序列。換言之，自該第一喪合 募核苷酸引子之上游第2鹼基開始，與該第一嵌合寡核苷酸 引子5’側15鹼基之序列同源。icAN-ALDH2-R之第2〜16號鹼 基與ALDH2-TH1之第15〜29號鹼基重複。 例如，ALDH2-TH2(序列表之序列號26)之第丨〜；^號鹼 基’其係自第二嵌合寡核苷酸引子（JCAN-ALDH2-F :序列 表之序列號21)5’末端與1〜12鹼基上游區域（-丨〜-；^)互補的 鹼基序列，且第13〜29號鹼基係自與第一嵌合寡核苷酸引子 (ICAN-ALDH2-R :序列表之序列號22)5，側6鹼基互補性區 域以及與該第一嵌合募核苷酸引子互補性區域，與3，側1〇 鹼基序列互補的序列。換言之，該第13〜29號鹼基係自該第 一嵌合寡核苷酸引子之上游第1〇鹼基開始，與該第一嵌合 养核苷酸引子5’側6鹼基之序列同源。ICAN_ALDH2-R之第 2〜7號驗基與ALDH2-TH2之第23〜28號鹼基重複。 例如’ ALDH2-TH3(序列表之序列號27)之第丨〜12號鹼 基’其係自第二嵌合募核苷酸引子（ICAN_ALDH2-F :序列 表之序列唬21)5’末端與丨〜；^鹼基上游區域（β1〜-12)互補的 I基序列，且第13〜28號鹼基係自與第一嵌合寡核苷酸引子 (ICAN-ALDH2-R:序列表之序列號22)互補性序列，與2〜17 鹼基3’側鹼基序列互補的序列。換言之，該第13〜28號鹼基 97916.doc 200532025 係與該第一嵌合寡核苷酸引子之上游第2〜丨7鹼基之序列同 源。 例如’112(-13)入12-1(序列表之序列號35)之第1〜12號鹼 基’其係自弟一肷合养核普酸引子（F2 :序列表之序列號 3 1)5末端與1〜12驗基上游區域（-1〜-12)互補的驗基序列，且 第13〜29號鹼基係自與第一嵌合募核苷酸引子（R2 ··序列表 之序列號32)互補性序列’與13〜29驗基3f側驗基序列互補的 序列。換言之，該第13〜29號鹼基係與該第一嵌合募核苷酸 引子之上游第13〜29號鹼基之序列同源。 例如’ R2(-13)A12-2(序列表之序列號36)之第1〜12號鹼 基’其係自第二嵌合寡核苷酸引子（F2 :序列表之序列號 3 1)5’末端與13〜24驗基上游區域（_13〜-24)互補的驗基序 列，且第13〜29號驗基係自與第一嵌合募核苷酸引子（R2 : 序列表之序列號32)互補性序列，與13〜29鹼基3,側鹼基序列 互補的序列。換言之，該第13〜29號鹼基係與該第一嵌合寡 核苷酸引子之上游第13〜29號鹼基之序列同源。 例如，A6-215 R(序列表之序列號47)之第1〜6號鹼基，其 係自第二嵌合寡核苷酸引子（B丨34FN3 ··序列表之序列號 12)5’末端與1〜6驗基上游區域（-1〜_6)互補的驗基序列，且第 7〜24號驗基係自與第一喪合募核苷酸引子（2m RN3(i 6):序 列表之序列號13)5’側8鹼基互補性區域以及與該第一嵌合 养核苷酸引子互補性區域，與3 ’側1 〇驗基之序列相互補。換 吕之，該第7〜24號驗基係自該第一嵌合寡核苷酸引子之上 游第10驗基開始，與該第一嵌合寡核苷酸引子5，側8鹼基同 97916.doc -32 - 200532025 源。2 0 5 RN 3(16)之弟1〜8號驗基係與A6-215R之第17〜24號 驗基重複。 例如，A9-215 R(序列表之序列號48)之第1〜9號鹼基，其 係自第二嵌合寡核苷酸引子（B134FN3 :序列表之序列號 12)5’末端與1〜9驗基上游區域（-1〜-9)互補的驗基序列，且第 1〇〜27號驗基係自與第一嵌合募核苷酸引子（2〇5RN3(i6): 序列表之序列號13)5,側8鹼基互補性區域以及與該第一散 合募核苷酸引子互補性區域，與3,側1〇鹼基之序列相互補。 換吕之，該第7〜24號鹼基係自該第一嵌合寡核苷酸引子之 上游第10鹼基開始，與該第一嵌合寡核苷酸引子5，側8鹼基 同源。205RN3(16)之第1〜8號鹼基係與A6_215r之第2〇〜27 號驗基重複。 以實施例2-(1)·(Α)中所使用之第一嵌合募核苷酸引子、 第一嵌合寡核苷酸引子以及形成梯子形之寡核苷酸引子之 位置關係為例，示於圖1中。 對於使用於本發明方法中之RNaseH，從常溫性到耐熱性 之RNaseH均適用於本發明。例如，如下述實施例所示，可 將國際專利公開案第02/22831號小冊子中藉由實施例8揭 示之方法所調製的源自Thermococcus litoralis之 RNaseHII(以下稱為Tli RNaseHn)或同一小冊子中藉由實 施例7揭示之方法所調製的源自Archae〇gl〇bus fulgidus之 RNasell(以下稱為Afu RNaseHII)，使用於本發明方法中。 至於該耐熱性RNaseH，雖無特別限定，但以使用零售之 Hybndase™熱安定RNaseH(Epicentre則仙化⑽⑽—公司 97916.doc -33- 200532025 製造）為較佳，除此之外，亦可使用源自嗜熱性桿菌（Bacillus) 屬細菌、棲熱菌（Thermas)屬細菌、火球菌（Pyrococcus)屬細 菌、棲熱袍菌（Thermotoga)屬細菌以及真菌（Archaeoglobus) 屬細菌等之RNaseH等。進而，該RNaseH以使用天然體以及 變異體中任一者為較佳。 使用於本發明之DNA聚合酶，只要其具有上述鏈取代活 性，貝1J無特別限定，例如可列舉caldotenax桿菌（Bacillus caldotenax，以下稱為B.ca)或嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus，以下稱為B.st)等源自嗜熱性桿菌屬細 菌之DNA聚合酶缺失5’-> 3’核酸外切酶活性之變異體，或源 自大腸g (以下稱為E.coli)之DNA聚合酶I之大片斷（Klenow 片斷）等。又，對於可使用於本發明之DNA聚合酶，從常溫 性到财熱性者為較佳。 B.ca係生育合適溫度為約70°C之嗜熱性細菌，眾所周知 源自該細菌之Bca DNA聚合酶具有依存於DNA之DNA聚合 酶活性、依存於RNA之DNA聚合酶活性（逆轉錄活性）、5’ —3’核酸外切酶活性以及3’— 5’核酸外切酶活性。上述酶亦 可係藉由純化其原本之來源而所獲得者，或藉由基因工學 之方式所生產之重組蛋白質中任何一種。又，該酶亦可係 藉由基因工學方法或其他方法實施取代、缺失、附加、插 入等改變者，至於如此酶之範例，可列舉使5 3 ’核酸外切 酶活性缺損之Bca DNA聚合酶即BcaBEST DNA聚合酶 (TAKARA生物公司製造）等。又，該酶亦可藉由曰本專利第 2978001號中揭示之方法，以該公報揭示之微生物調製。 97916.doc -34- 200532025 再者’眾所周知dna聚合酶於特定條件下具有核酸内切 酶活性，例如具有RNaseH活性者。於本發明方法中可使用 如此之DNA聚合酶。即，可列舉下述態樣··於可表現 活性之條件下（例如於Mn2+存在之條件下）使用該DNA聚合 酶。该悲樣中，無需添加上述RnaseH，即可實施本發明方 法 P於§有Μη之緩衝液中，上述Bca DMA聚合酶可 表現RNaseH活性。再者，上述態樣並非僅限定於dna 聚合酶，亦可將同時具有RNaseH活性之眾所周知的DNA聚 合酶（例如源自嗜熱菌（丁hermus therm〇philus))之丁化dna 聚合酶使用於本發明。 本卷明方法中，使用形成梯子形之寡核苷酸引子時，與 第一嵌合寡核#酸引子兼具該形成梯子形之寡核#酸引子 力月b日守卩及利用存在於作為模板之核酸上的互補性驗基 序列而獲传梯子形狀增幅產物時，均可藉由於該反應中共 存有無規引子，而可使反應穩定且更有效率獲得目的之增 幅產物。雖無特別限定，作 心彳一以於上述無規引子中使用例如6 鹼基〜9鹼基長度之無規引子為較佳。 (2)本發明之組合物 本I月可提供#上述本發明之核酸增幅方法或可使用 於本發明之核酸檢測方法中的組合物。至於該組合物，例 如可列舉含有上述（1)中揭示 朽不之形成梯子形之寡核苷酸引子 及/或嵌合寡核苷酸引子、^ 于 RNaseH以及DNA聚合酶者。進 而’作為用以實施增幅反靡夕士、八 欠應之成分，亦可含有緩衝成分或 鎂鹽、dNTP等。進而，介π人丄 亦可έ有經過修飾之去氧核糖核苷 97916.doc -35- 200532025 酸或三礙酴土 $ ϋ μ 去虱核苷酸類似物。進而，亦可使用緩衝成分 或其他添加物。 至於特別好的態樣，可列舉以適合於本發明之核酸增幅 ^ j的、、且σ而含有之上述各種成分的組合物，該組合物係 可糟由僅添加適當模板與嵌合寡核苷酸引子以及/或者形 成梯子形之寡核苷酸引子，即可實施增幅反應。進而，於 預先可明確增幅對象之情形時，較好的是含有適合於該增 幅對象增幅之嵌合寡核苷酸引子的組合物。 9 (3)本發明之套組 本發明係提供一種可使用於上述本發明之核酸增幅方法 的套、、且於一個貫施態樣中，該套組之特徵在於：就包裝 後之形怨而g ，包含鏈取代反應中之DNA聚合酶、 NaseH瓜口养核苷酸引子以及/或者形成梯子形之寡核苷 酸引子的指示書。進而’以將包含具有鍵取代活性之簡八 水合酶、RNaseH以及鏈取代反應用緩衝液的套組使用於本 毛明方法中為較佳。或者，亦可根據指示書選擇使用具有 鏈取代活性之零售DNA聚合酶以及/或者RNaseH。進而，將 RNAax為杈板時，其亦可含有逆轉錄反應用試劑。dna聚 口酶可遠自於上述（1)揭示之本發明中所使用之dna聚合 酶。又，RNaseH可選自於上述（1)中揭示iRNaseH。 所謂上述之「指示書」，其係指記載有該套組使用方法（例 如鏈取代&應用試劑之調製方法以及所推薦之反應條件等） 的印刷物，除了小冊子或活頁形式之使用者說日月書以外， 亦可包含附於套組中之標簽、容納有套組之包裝等上面所 97916.doc -36- 200532025 記載之内容。進而， 所揭示、提供之資訊 亦可包含經由如網際網路之電子媒體 進而，於本發明套矣且φ ,__ 、七、 中亦可包含反應緩衝劑以及黏接 洛液，上述反應緩衝劑含有N，N雙㈣乙基）冬甘胺酸 ㈣咖）、三㈣基）甲胺基（恤me)、HEpEs、磷酸鹽或心 鹽酸緩衝成分。又’亦可含有具有鏈取代能之舰聚合酶 或RNaseH。進而’亦可含有經過修飾之去氧核糖核苦酸或 三磷酸去氧核苷酸類似物。 進而，使用於標的核酸檢測方法中之套組，其除上述指 示書、用以實施增幅反應之試劑類以外，亦可含有適合於 標的核酸增幅之嵌合募核^:酸引子以及形成梯子形之寡核 普酸引子、用以檢測所增幅之標的核酸的試劑(例如探針) (4)本發明之標的核酸檢測方法 藉由使用本發明之核酸增幅方法，可檢測試料中之標的 核酸。至於該檢測方法之一態樣，可列舉包含下述步驟之 檢測方法： (a) 藉由上述（1)揭示之本發明之核酸增幅方法，增幅標的 核酸之步驟；以及 (b) 檢測藉由上述步驟所增幅之標的核酸之步驟。 於上述（a)步驟中’將RNA設為模板之時，亦可分為1階段 或2階段實施逆轉錄反應與核酸增幅反應。雖無特別限定， 但作為逆轉錄酶與鏈取代型DNA聚合酶之組合，以例如使

用 AMV RTase、M-MLV RTase 或 RAV-2 RTase 與 BcaBEST 979l6.doc -3' 200532025 DNA聚合酶之組合為較佳。或者，亦可使用具有逆轉錄活 性與鏈取代活性之DNA聚合酶，以例如使用BcaBESTDNA 聚合酶為較佳。 進而，藉由本發明之標的核酸檢測方法，可獲得關於如 點突變、單驗基取代（Single nucleotide polymorphysm、 SNP，單鹼基多型）之基因上特定鹼基的資訊。該態樣中， 若所使用之嵌合寡核苷酸引子3’末端部分位於欲要判別設 為標的之驗基序列的特定驗基附近即可。 進而，於本發明之檢測方法中，藉由使用含有Bicine、 Tricine、HEPES、磷酸鹽或tris緩衝成分之反應緩衝劑以及 含有亞精胺或丙二胺之黏接溶液，可以微量核酸試料進一 步高靈敏度地檢測出標的核酸。在此情形下，雖無特別限 定所使用之RNaseH與DNA聚合酶，但以例如源自熱球菌屬 細菌之RNaseHII以及BcaBEST DNA聚合酶之組合為較佳。 尤其，雖然可預測到上述RNaseH以及DNA聚合酶之適用單 元數會根據其等之種類而有所不同，但此時亦可以提高檢 測靈敏度或增加增幅產物量作為指標，調整該緩衝劑組合 以及酶添加量。 以本發明之檢測方法增幅標的核酸時，可取導入dUTP作 為基質。故而，將dUTP使用於基質時，可利用尿嘧啶N-糖 苷酶（uracil N-glycosidase : UNG)分解增幅產物，防止由於 增幅產物之殘留物污染所造成之偽陽性。 上述（b)步驟中，可使用眾所周知之核酸檢測方法，例如 藉由電泳檢測特定尺寸反應產物之方法，或使用有Smart 97916.doc -38- 200532025

Cycler(TAKARA 生物公司製造）、Rot〇r gene(c〇RBETT RESEARCH公司製造）等之同步檢測以及藉由探針雜合所 貫施之檢測等。又，亦以使用組合有磁珠等之檢測方法為 較佳。進而，亦可將標的核酸增幅步驟時所生成之焦磷酽 作為如鎂鹽之非溶性物質，使反應液產生白濁從而測定其 濁度。 於藉由上述電泳所實施之檢測中，通常可使用溴化乙錠 等螢光物質，但亦可組合使用探針雜合。又，探針係除了 藉由放射性同位元素所實施之標識以外，亦可使用施以如 生物素或螢光物質之非放射性標識者。實施同步檢測時， 以使用S YBR Green(TAKARA生物公司製造）之發色用試劑 為較佳。此外，藉由於上述（a)步驟中使用標識核苷酸，可 將標識核苷酸取入至增幅產物從而易於檢測，或可增強利 用有該標識之檢測用訊號，進而亦可實施利用有螢光偏光 法、螢光能量轉移等之檢測。進而，藉由適當構築檢測系， 可自動檢測標的核酸或定量標的核酸。又，亦以使用藉由 雜合染色法所實施之肉眼檢測法為較佳。 於本發明之檢測方法中以使用下述者為較佳··藉由以處 於消光狀態之距離配置的兩種以上螢光物質所標識之核糖 核苷酸（RNA)探針，或包含核糖核苷酸以及去氧核糖核苷酸 之嵌合募核苷酸探針中任一者。雖然該探針不會發出螢 光’但黏接至源自與其互補之標的核酸的增幅DNa時， RNaseH將會分解該探針。其結果為，放大探針上之螢光物 質間的距離而發出螢光，從而可知曉標的核酸之存在。使 97916.doc -39- 200532025 用RNaseH貫施本發明之核酸 方法時，僅藉由於其反應 液中4加上述探針，即可檢測 出铽的核酸。作為使用於該 探針標識中之營光物質，以例如使用R〇x(Appiied 心挪刪公司製造）或FAM(AppHed Bi〇s帅⑽公司製造） 為車父佳，至於洋滅物暂 减物貝以例如使用與Eclipse(Epoch B1〇SClences公司製造）之組合為較佳。

使用於本發明之探針，只要其於藉由上述本發明之核酸 增幅方法所增幅之核酸中，於通常雜合條件下可雜合至標 的核酸者，則無特別限定，從特異性檢測增幅產物之觀點 來f ’以例如於嚴格條件下以該項技藝中之業者所知之條 件實施雜合。上述嚴格雜合條件’其例如揭示於以的年、 冷泉港貫驗室發行、T. Maniatis(T Maniat⑷等編輯的分子 選殖實驗室手冊第二版(―r C1〇ning : a Lab〇rat〇ry

Manual 2nd ed.)。至於具體的嚴格條件，例如可列舉下述 條件。即，係指於含有〇.5%SDS、、

〇·ι%胎牛血清白蛋白（BSA)、G1%聚乙烯、〇 ι% 聚嚴糖400]以及1〇〇肫/ml大馬哈魚精子dna的 中，低於所使用之探針！^值約25t：之溫度下保溫4小時〜一 SSC(lxSSC係 0.15 M NaCl、0.015 Μ擰檬酸納、pH值 7.0) 晚之條件。上述探針亦可使用為易於檢測標的核酸而附加 有如上所述之標識者。 於本發明之標的核酸檢測方法中，可積極地生成增幅區 域所聯接之梯子形狀增幅產物。如此之梯子形狀增幅產物 备於複數個增幅區域中經由任何驗基序列均會以同源方向 97916.doc -40- 200532025 聚合者，以電泳分析增幅產物，可確認出梯子形狀帶。該 梯子形狀增幅產物之生成’其係藉由所增幅之區域、該區 域尺寸、其鄰接區域、所使用之嵌合募核苷酸引子以及/或 者形成梯子形之募核苷酸引子之鹼基序列或反應條件等加 以調整。 本發明之檢測方法中，可使用上述形成梯子形之寡核苷 酸引子以及/或者嵌合募核苷酸引子，生成增幅區域所連接 之聚合物。如此之梯子形狀增幅產物，其係經由複數個增 幅區域與形成梯子形之寡核苷酸引子與第二嵌合募核苷酸 引子5’側或其上游區域互補之序列且以同源方向連接者。進 而，於本發明之方法中，作為模板之核酸上之一方嵌合寡 核苷酸引子5,側或存在於其上游之鹼基序列，與另一方嵌合 寡核苷酸引子5,側或存在於其上游之鹼基序列互補時，藉由 於該位置中設定嵌合寡核《引子，可以良好之靈敏度檢 測出標的核酸。 、進而，由於上述梯子形狀增幅產物包含複數個增幅區 或口此例如可藉由與適當探針之雜合從而實施與多數個 板針之雜合。至於該探針，以使用雜合至存在於標的核酸 -土序列以及/或者上述梯子形狀增幅產物中之標的核酸 序歹j間之"於序列者中的任一者為較佳。其結果為，由於 將會產生強烈訊號，故而以欲檢測之含有增幅區域的核酸 作為目的時較為有用。又，亦可組合限制酶消化等，自梯 子形狀增幅產物獲得增幅區域，或將增幅區域-部分作為 單體而獲得。 97916.doc 200532025 本發明之核酸增幅方法之等溫增幅方法中，並不需要設 置如溫度循環反應器之裝置。因如dNTP之試劑亦可轉用於 PCR等之使用中，故而可使運行成本低於先前方法。因此， 以使用於實施常規作業之基因檢查等領域為較佳。進而， 本發明之方法與PCR法相比，可於短時間内獲得更多增幅 產物，故而可作為簡便、迅速、高靈敏度之基因檢測方法 而加以利用。 [實施例] 藉由下述實施例，進一步詳細說明本發明，但本發明並 不僅限於實施例之範圍。 參考例1 實施例中之耐熱性RNaseH之單位數，其係藉由下述方法 算出。 將聚（rA)及聚（dT)(均為Amersham Biotech公司製造）1 mg 分別溶解至含有1 mM EDTA之40 mM tris-HCl(pH值7.7) 1 ml中，調製出聚（rA)溶液及聚（dT)溶液。 其次，於20 mM HEPES-KOH(pH值 7.8)、100 mM醋酸鉀、 1%二甲基亞砜以及0.01%BSA中，以終濃度成為30/xg/ml之 方式添加聚（rA)溶液與以終濃度成為20 gg/ml之方式添加 聚（dT)溶液，於37°C下保持10分鐘後，於室溫下冷卻後， 添加1/100容量之400 mM醋酸鎂從而調製出聚（rA)-聚（dT) 溶液。 於該聚（rA)-聚（dT)溶液800 μΐ中，添加經過依需要稀釋之 酶液8 μΐ，於40 °C中反應20分鐘後依時間測定吸光度 97916.doc -42- 200532025 (A260)，從而求得其變化量。即，藉由酶反應以吸光度差 求得從聚（rA)-聚（dT)雜合體游離出來之核苷酸濃度。將相 % 當於游離有1 nm〇l核糖核苷酸者的A260設為20分鐘内增加 之麵里’根據下述式舁出RNaseH之1單位。 單位（unit)二每一分鐘之吸光度變化量χ57·1χ稀釋率 實施例1

(1)調製模板RNA 作為RT-ICAN模板所使用之rnA轉錄子，係藉由體外轉 錄合成。 _ 首先，委託人工合成基因製作受託服務（TAKARA生物公 司）從而合成作為體外轉錄模板之質體DNA。序列係使用 SARS(重症急性呼吸器症候君羊·· Severe Acute Respiratory Syndrome)冠狀病毒基因組序列（GenBank Acc. No. ·· AY278741)的第18133號〜第18362號（序列表之序列號1)。為 了要插入至質體，故而於該序列5,末端附加有Hindlll識別 序歹，於31末端附加有BamHI識別序列。將該片斷插入至 @ pBluescriptll SK(+ )之 Hindlll、BamHI部位。以 BamHI切斷 所獲得之質體成為直鏈DNA，作為藉由T7 RNA聚合酶所實 施之體外轉錄模板。 於體外轉錄中使用MEGA轉錄子T7套組（Ambion公司 製造）。根據附於套組中之使用說明書，實施體外轉錄、 ·

DNasel處理以及RNA純化，藉由OD260測定所合成之RNA β 濃度。籍由RNA稀釋緩衝液（10 mM Tris-HCl(pH值7.5)、1 mM EDTA、10 mM NaCl、30 pg/ml E.coli 16S + 23S 97916.doc -43 - 200532025 rRNA(Boehringer Ingerheim公司製造），將該RNA溶液濃度 調整為l〇Q〜105複製物/μ卜用作為RT-ICAN模板。

(2)討論2步驟RT-ICAN (A)討論1 就藉由於逆轉錄引子5’末端附加黏接至第二嵌合寡核苷 酸引子之上游區域的序列所達成之效果，加以討論。 藉由使用形成梯子形之寡核苷酸引子作為逆轉錄引子， 從而觀察RT-ICAN靈敏度、檢測速度之變化，上述形成梯 子形之寡核苷酸引子係5’末端附加有黏接至第二嵌合寡核 苷酸引子之上游區域（-1〜-12)之12鹼基者。 根據OD260值計算於上述實施例1-(1)中所調製之模板 RNA，每 1 μΐ調製為 10G、101、102、103、104、105複製物。 調製出10 μΐ下述反應液：於最終濃度為32 mM之 HEPES-KOH緩衝液（pH值7·8)、100 mM醋酸鉀、1%二曱基 亞砜、0.11%BSA、4 mM醋酸鎂各500 μΜ之 dNTPs中，添 加205 RN3(18)引子（序列表之序列號2)、A12-205R引子（序 列表之序列號3)、215R引子（序列表之序列號4)、A12-215R 引子（序列表之序列號5)或A12-223R引子（序列表之序列號 6)各1 pmol作為上述逆轉錄引子、RTase M-MLV(TAKARA 生物公司製造）12.5 U以及1 μΐ各複製物數模板RNA。 將該反應液置於Thermal Cycler Personal(TAKARA 生物 公司製造）中，於45°C中保持10分鐘後冷卻至4°C。逆轉錄 反應結束後，於該反應液10 μΐ中，添加包含於最終濃度為 32 mM 之 HEPES-KOH 緩衝液（pH 值 7.8)、100 mM 醋酸鉀、 97916.doc -44 - 200532025 1%二甲基亞砜、0.11%BSA、4 mM醋酸鎂各500 μΜ之 dNTPs中之第二後合寡核苷酸引子134Ρ>Π(1δ)引子（序歹4表 之序列號7)與第一嵌合寡核苷酸引子205RN3(18)引子各25 pmol、Bca BEST(TAKARA生物公司製造）11 U、以國際專 利公開案第02/22831號公告案中實施例8揭示之方法所調 製之 ΤΠ RNaseHII 0·05 U以及 SYBR Green(TAKARA生物公 司製造）的反應液15 /xl，藉由Rotor gene(CORBETT RESEARCH公司製造）於55°C中實施ICAN反應，從而同步檢 測出增幅產物。又，反應產物亦可藉由3 %瓊脂糖凝膠電泳 加以確認。 其結果為，以205RN3(18)引子實施逆轉錄之RT_ICAN的 靈敏度為104複製物，然而在同源位置使用將黏接至第二嵌 合募核苷酸引子之上游區域〇1〜_ 12)之12鹼基附加至5,末端 的逆轉錄引子A12-205R時’靈敏度成為1〇2複製物，從而將 靈敏度提高2位數。又，1〇5複製物之檢測速度亦加快約兩 分鐘。 同樣地，以215RDNA引子實施逆轉錄之rt_ican，靈敏 度為103複製物，然而當於逆轉錄中在同源位置使用將黏接 至第二嵌合寡核苷酸引子之上游區域（-；1〜-12)之12鹼基附 加至5’末端而形成梯子形之募核苷酸引子Α12_2ΐ5Κ引子 時，靈敏度成為l〇G複製物，從而將靈敏度提高3位數。又， 1 〇複製物之檢測速度亦加快約兩分鐘。 又，當於逆轉錄中使用將黏接至第二嵌合寡核苷酸引子 之上私區域（_1〜_ 12)之12驗基附加至5,末端而形成梯子形之 97916.doc -45- 200532025 寡核苷酸引子A12-223R時，靈敏产亦士、达，] 敬度亦成為101複製物。 綜上所述，可確認下述情形：藉由 稽田於史轉錄中，使用將 黏接至弟一^甘欠合养核苦酸引子之上游| 丄/好&域（-1〜-12)之12驗 基附加至S’末端而形成梯子形之寡核苷酸引子，無論該引子 黏接至模板RNA之哪個位置，均可提高$敏度及檢測速度。 (B)討論2 藉由改變附加至形成梯子形之募核苷酸引子5，末端且黏 接至第二嵌合募核苷酸引子之上游區域以及/或者該引子 一部分之12鹼基位置（-1〜-12、-U〜·22、_21〜_32、+5〜_6、 + 11〜〇)，作為逆轉錄引子來使用，以進行同源之討論。 首先，根據ΟD260值计异上述實施例(1)中所調製之模 板 RNA，每1 μΐ調製為 1〇。、10ι、1〇2、1〇3、1〇4、ι〇5複製 物0 調製出10 μΐ之下述反應液：於最終濃度為32 mM之 HEPES-KOH緩衝液（pH值7.8)、1〇〇 mM醋酸卸、1 %二甲基 亞颯、0.11% BSA、4 mM醋酸鎂各500 μΜ之dNTPs中，添 加形成梯子形之募核普酸引子2 1 5引子、A1 2 - 2 1 5 R引子、 A 12(-10)-2 15R引子（序列表之序列號8)、A12(-20)-215R引 子（序列表之序列號9)、A12(6)-215R(序列表之序列號10)或 A 12(12)-2 15R(序列表之序列號11)各1 pmol作為上述逆轉 錄引子、RTase M-MLV(TAKARA生物公司製造）50 U以及 1 μΐ各複製物數模板RNA。 將該反應液置於 Thermal Cycler Personal(TAKARA 生物 公司製造）中，在45°C中保持10分鐘後冷卻至4°C。逆轉錄 97916.doc -46- 200532025

反應結束後，於該反應液1 〇 μ丨中，添加於最終濃度為32 mM 之HEPES-KOH緩衝液（pH值7.8)、100 mM醋酸鉀、1%二甲 基亞颯、0.11%BSA、4 mM醋酸鎂各5〇〇 μΜ之dNTPs中包 含有第二嵌合募核苷酸引子之B134FN3(16)引子（序列表之 序列號12)與第一嵌合募核苷酸引子之2〇5Rn3(16)引子（序 列表之序列號13)各25 pmol、BcaBEST(TAKARA生物公司 製造）11 U、Tli RNaseHII 0.05 U以及 SYBR Green(TAKARA 生物公司製造）的反應液15 μΐ，藉由R0t01· gene(CORBETT RESEARCH公司製造）於551：中實施ICAN反應，從而同步檢 _ 測出增幅產物。又，反應產物係亦可藉由3 %瓊脂糖凝膠電 泳加以確認。 其結果為，以上述215R引子實施逆轉錄之rt-ICAN的靈 敏度為102複製物，然而在同源位置使用將黏接至第二嵌合 暴核普酸引子之上游區域（-1〜_ 12)之12鹼基附加至5,末端形 成梯子形之寡核苷酸引子A12-215R時，靈敏度成為ι〇ι複製 物，從而將靈敏度提高1位數。又，1〇5複製物之檢測速度 亦加快約三分鐘。 ® 於使用黏接至第二後合募核苷酸引子之上游區域 (-11〜-22)之12驗基附加至5’末端形成梯子形之寡核苷酸引

子A12(-l〇)_215R時，靈敏度為1〇2複製物，其與使用215R 引子之情形同源，但1 〇5複製物之檢測速度加快約兩分鐘。 ' 又’自1〇2複製物至105複製物之檢測，其與使用215R引子 ， 之情形相比，可發現定量性（相關係數0.997)。 於使用將黏接至第二後合寡核苷酸引子之上游區域 97916.doc -47- 200532025 (-21〜-32)之12鹼基附加至5,末端的形成梯子形寡核苷酸引 子A12(-20)-215R之時，靈敏度成為10ι複製物，從而將靈敏 度提高1位數。又，1〇5複製物之檢測速度亦加快約2·5分鐘。 於使用將黏接至第二嵌合寡核苷酸引子之上游區域以及 該引子一部分之12鹼基附加至5,末端而形成梯子形之寡核 苷酸引子A12(6)-215R，以及將黏接至第二嵌合寡核苷酸引 子一部分之12驗基附加至5,末端而形成梯子形之募核苦酸 引子A12(l 2)-215R之時，亦與上述引子同樣地可提高檢測 靈敏度及檢測速度。 綜上所述，可確認下述情形：無論何者，只要改變黏接 至第一嵌合寡核苷酸引子之上游區域之丨2鹼基序列位置， 附加至5,末端而形成梯子形之寡核苷酸引子，均可提高靈敏 度及檢測速度。 (C)討論3 使用逆轉錄引子來討論rT_ICan靈敏度及檢測速度，該 逆轉錄引子係將附加至形成梯子形之寡核苷酸引子5，末端 且黏接至第二嵌合寡核苷酸引子之上游區域的鹼基長度設 為6鹼基、9驗基、12鹼基（-li〜_i6、_n〜_19、-u〜_22)者。 首先’根據OD260值計算上述實施例le(i)中所調製之模 板 RNA，每1 μ1 調製為 1〇〇、1〇1、1〇2、1〇3、1〇4、1〇5 複製 物。 调製出10 μΐ之下述反應液··於最終濃度為32 mM之 HEPES-KOH緩衝液（pH值7.8)、1〇〇 mM醋酸鉀、1%二甲基 亞石風、0.11%BSA、4 mM醋酸鎂各5〇〇 μΜ之dNTPs中，添 97916.doc 200532025 加形成梯子形之募核苷酸引子之215R引子、A6(-10)-215R 引子（序列表之序列號14)、A9(-10)-215R引子（序列表之序 列號15)或A12(-10)-215R引子各1 pmol作為上述逆轉錄引 子、RTase M-MLV(TAKARA生物公司製造）50 U以及1 μΐ各 複製物數模板RN Α。 將該反應液置於 Thermal Cycler Personal(TAKARA 生物 公司製造）中，於45°C中保持10分鐘後冷卻至4°C。逆轉錄 反應結束後，於該反應液10 μΐ中，添加包含於最終濃度為 32 mM之HEPES-KOH緩衝液（pH值 7.8)、100 mM醋酸鉀、1% 二曱基亞砜、0.11%BSA、4 mM醋酸鎂各500 μΜ之dNTPs 中的第二嵌合寡核苷酸引子之B134FN3(16)引子與第一嵌 合寡核苷酸引子之205RN3(16)引子各25 pmol、Bca BEST(TAKARA生物公司製造）11 U、Tli RNaseHII 0.05 U以 及 SYBR Green的反應液 15 μΐ，藉由 Rotor gene(CORBETT RESEARCH公司製造）於55°C中實施ICAN反應，從而同步檢 測出增幅產物。又，反應產物係亦可藉由3%瓊脂糖凝膠電 泳加以確認。 其結果為，以215R引子實施逆轉錄之RT-ICAN的靈敏度 為1〇3複製物，然而在同源位置使用將黏接至第二嵌合寡核 苷酸引子之上游區域（-11〜-16)之6鹼基附加至5’末端形成梯 子形之募核苷酸引子A6(-10)-215R之情形時，靈敏度成為 1〇2複製物，從而將靈敏度提高1位數。又，1〇5複製物之檢 測速度亦加快約一分鐘。 於使用將黏接至第二嵌合寡核苷酸引子之上游區域 97916.doc -49- 200532025 (-11〜-19)之9鹼基附加至5,末端而形成梯子形之寡核苷酸引 子A9(-10)-215R時，靈敏度成為101複製物，從而將靈敏度 提高2位數。又，1〇5之檢測速度亦加快約2·5分鐘。 於使用將黏接至第二嵌合募核苷酸引子之上游區域 (-11〜-22)之12鹼基附加至5’末端而形成梯子形之寡核苦酸 引子A12(-10)-215R時，靈敏度成為101複製物，從而將靈敏 度提高2位數。又，1 〇5複製物之檢測速度亦加快約三分鐘。 綜上所述，可確認下述情形：改變黏接至第二嵌合募核 苷酸引子之上游區域之鹼基數，藉由對於5,末端經附加而形 成梯子形之寡核苷酸引子進行6驗基以上之附加，可提高靈 敏度及檢測速度。可確認下述情形：黏接至第二嵌合募核 皆酸引子之上游區域的驗基數越多則其效果越大。 (D)討論4 就使用將黏接至第二嵌合寡核苷酸引子之上游區域 (-1〜-12)之12鹼基附加至末端之形成梯子形之寡核苷酸引 子A12-215R的RT-ICAN檢測速度及定量性，加以討論。 首先，根據OD260值計算上述實施例1-(1)中所調製之模 板 RNA，每 1 μΐ調製為 l〇G、101、102、103、1〇4、1〇5複製 物。 調製出10 μ下述反應液：於最終濃度為32 mM之 HEPES-KOH緩衝液（pH值7.8)、100 mM醋酸鉀、1%二甲基 亞砜、0.11%BSA、4 mM醋酸鎂各500 μΜ之dNTPs中，添 加 A12-215R引子 1 pmol、RTase M-MLV(TAKARA生物公司 製造）50 U以及1 μΐ各複製物數模板RNA。 97916.doc -50- 200532025 將該反應液置於Thermal Cycler Personal(TAKARA生物 公司製造）中，於45°C中保持10分鐘後冷卻至4°C。逆轉錄 反應結束後，於該反應液10 μΐ中，於最終濃度為32 mM之 HEPES-KOH緩衝液（pH值7·8)、100 mM醋酸鉀、1%二甲基 亞砜、0.11%BSA、4 mM醋酸鎂各500 /ιΜ之dNTPs中，添 加包含第二喪合寡核苷酸引子之B134FN3(16)引子與第一 嵌合寡核苷酸引子之205RN3(16)引子各25 pmol、Bca BEST(TAKARA生物公司製造）11 U、Tli RNaseHII 0.05 U以 及SYBR Green(TAKARA生物公司製造）的反應液15 μΐ，藉 由 Rotor gene(CORBETT RESEARCH公司製造）於 55°C 中實 施ICAN反應，於每個循環（一分鐘）中同步檢測出增幅產物。 將增幅曲線示於圖2中。如圖2所示，可確認下述情形： 定量性（相關係數0.992)檢測101〜105複製物，十個循環以内 開始反應直至10複製物為止。 進而，以藉由展開染色帶所實施之探針雜合法，亦可確 認有增幅產物。 以藉由展開染色帶所實施之探針雜合法確認增幅產物， 其係使用包含於TaKaRa Bed-Side ICAN blaIMP偵測套組 (TAKARA生物公司製造）中的偵測組，根據其使用說明書中 所記載之檢測方法來實施。但是，這次檢測中，使用包含 FITC標識探針SARS-BNI-B(序列表之序列號16)之探針溶 液作為探針，未使用包含於上述套組中之blaMP探針溶液以 及1C探針溶液。 其結果為，可藉由l〇G〜1〇5複製物/反應之增幅產物，可確 97916.doc -51 - 200532025 認呈色為紅紫色線之特異性增幅。

(3)討論1步驟RT-ICAN (A)討論1 就使用將黏接至第二嵌合寡核苷酸引子之上游區域之序 列附加至第一嵌合寡核苷酸引子5’末端而形成梯子形之寡 核苦酸引子所達成之效果，加以討論。 就藉由將黏接至第二嵌合寡核苷酸引子之上游區域 (-1〜-7)之7鹼基附加至第一嵌合寡核苷酸引子5’末端從而實 施之RT-IC AN靈敏度及檢測速度，加以討論。藉由於第一 嵌合募核苷酸引子5’末端附加7鹼基，從而12鹼基成為自第 一嵌合寡核苷酸引子5’末端開始黏接至第二嵌合寡核苷酸 引子之上游區域（-1〜-12)的序列。於同一試管内同時實施逆 轉錄反應與ICAN反應。 首先，根據OD260值計算上述實施例1-(1)中所調製之模 板 RNA，每 1 μΐ調製為 10°、101、102、103、104、105複製 物。於最終濃度為32 mM之HEPES-KOH緩衝液（pH值7.8)、 100 mM醋酸鉀、1%二甲基亞砜、0.11%BSA、4 mM醋酸鎂 各500 μΜ之dNTPs中，於含有第二嵌合寡核苷酸引子之 160FN3引子（序列表之序列號17)與第一嵌合寡核苷酸引子 之241RN3引子（序列表之序列號18)或第一嵌合寡核苷酸引 子之（A12)241RN3引子（序列表之序列號19)各25 pmol、 RTase M-MLV(TAKARA 生物公司製造）50 U、Bca BEST(TAKARA生物公司製造）11 U、Tli RNaseHII 0.05 U以 及SYBR Green(TAKARA生物公司製造）的反應液24 μΐ中， 97916.doc -52- 200532025 添加1 μ1之各複製物數模板舰，藉由Rotor gene(⑶刪TT RESEARCH公司製造）於价巾保持$分 釭，於55 C中保持45分鐘，從而同步檢測出增幅產物。反 應產物係亦可藉由3 %瓊脂糖凝膠電泳加以確認。 其結果為’使用第一嵌合寡核*酸引子24刪之 RT-讀的靈敏度為1〇5複製物，然而使用將黏接至第二欲 合寡㈣酸引子之上游區域（U)之7驗基附加至5,末端的 (A12)241RN3引？時，靈敏度成為1〇3複製物，從而將靈敏 度提高2位數。又，1〇5複製物之檢測速度亦加快約一分鐘。 綜上所述’可4認下述情形：使用將黏接至第二後合寡 核苷酸引子之上游區域之序列附加至第一嵌合募核苷酸引 子5’末端者作為形成梯子形之寡核苷酸引子，可提高靈敏度 及檢測速度。 (B)討論2 就涉及1步驟RT-ICAN反應且將黏接至第二嵌合寡核苷 酸引子之上游區域的序列附加至5’末端而形成梯子形之募 核苷酸引子所達成之效果，加以討論。 將形成梯子形之寡核苷酸引子添加至於同一試管内之同 時實施逆轉錄反應與ICAN反應的1步驟RT-icAN反應系 中’從而討論靈敏度及檢測速度，上述形成梯子形之募核 苷酸引子係將黏接至第二嵌合寡核苷酸引子之上游區域 (-1〜-12)之12鹼基附加至5，末端者。 首先’根據Ο D 2 6 0值計算上述實施例1 - (1)中所調製之模 板 RNA ’ 每1 μΐ 調製為 1〇0、ίο1、1〇2、1〇3、ι〇4、ι〇5 複窜 97916.doc -53- 200532025 物。於最終濃度為32 mM之HEPES-KOH缓衝液（pH值7·8)、 100 mM醋酸鉀、1%二甲基亞颯、0.11%BSA、4 mM醋酸鎂 各500 μΜ之dNTPs中，添加含有第二嵌合寡核苷酸引子之 134FN3(16)引子（序列表之序列號20)與第一嵌合寡核苷酸 引子之 205RN3(16)引子各 25 pmo卜 RTase M-MLV(TAKARA 生物公司製造）50 U、BcaBEST(TAKARA生物公司製造）11 U、Tli RNaseHII 0.05 U以及 SYBR Green(TAKARA生物公 司製造）的反應液24 μΐ，於進而添加有形成梯子形之寡核苷 酸引子之A12-223R引子2·5 pmol的反應液24 μΐ中，添加 1 μΐ之各複製物數模板RNA，藉由Rotor gene(CORBETT RESEARCH公司製造）於45 X：中保持5分鐘，於55 °C中保持 45分鐘從而同步檢測出增幅產物。又，反應產物係亦可藉 由3 %瓊脂糖凝膠電泳加以確認。 其結果為’未添加形成梯子形之寡核苦酸引子之 A12-223R引子的1步驟RT-ICAN靈敏度為1 〇3複製物，然而 藉由添加A12-223R引子靈敏度成為1〇2複製物，從而將靈敏 度提高1位數。又，1 〇3複製物之檢測速度亦加快約四分鐘。 綜上所述，可確認下述情形··藉由將形成梯子形之寡核 苷酸引子添加至1步驟RT-ICAN反應中，從而可提高靈敏度 及檢測速度。 實施例2 (1)討論於使用有循環探針法之同步檢測系中，針對人類 醛脫氫酶2基因（ALDH2)之多型檢測的效果 就藉由使用有ICAN反應與循環探針法之同步檢測所實 97916.doc -54- 200532025 施的多型檢測效果，加以討論。至於討論對象，選擇有可 編碼人類醛脫氫酶2酶的基因（GenBank Acc. No.: AH002599)。至今為止揭示有下述情形：該基因中，外顯子 12中存有第487號穀胺酸（GAA)取代為賴胺酸（AAA)的單鹼 基多型，且與飲酒相關之個人體質差別有較深關係，癌症 發生之風險有關。 為於ICAN反應系中實施該醛脫氩酶2基因之多型檢測， 藉由DNA合成機（Applied Biosystems公司製造）從而合成相 當於第二嵌合寡核苷酸引子之ICAN-ALDH2-F引子（序列表 之序列號21)、相當於第一嵌合寡核苷酸引子之 ICAN-ALDH2-R引子（序列表之序列號22)。其次，合成正常 型檢測用ALDH2 wG探針（序列表之序列號23)以及變異型 檢測用ALDH2 mA探針（序列表之序列號24)。其中，正常型 檢測用ALDH2 wG探針，其係作為螢光標識附加ROX標識 (Applied Bio systems公司製造）至5’末端且作為淬滅標識附 加Eclipse(Epoch Biosciences公司製造）至3’末端的 DNA-RNA-DNA型之寡核苷酸探針；變異型檢測用ALDH2 mA探針，其係作為螢光標識附加FAM標識（Applied Bio systems公司製造）至5’末端且作為淬滅標識附加Eclipse 至3’末端的DNA-RNA-DNA型之寡核苷酸探針。 進而，將黏接至上述第二嵌合募核苷酸引子之上游區域 (-1〜-12)之12鹼基附加至5，末端，合成設定於 ICAN-ALDH2-R引子附近的形成梯子形之寡核苷酸引子 ALDH2-TH1 (序列表之序列號25 ;對於ICAN-ALDH2-R嵌合 97916.doc -55- 200532025 募核苷酸引子為·1〜+ 15)、ALDH2-TH2(序列表之序列號 26 ;對於ICAN-ALDH2-R嵌合寡核苷酸引子為-9〜+ 6)、 ALDH2-TH3(序列表之序列號27 ;對於ICAN-ALDH2-R嵌合 寡核苷酸引子為-17〜-2)。 以獲得有知情同意書且使用EDTA作為抗凝固劑的血液 樣本，使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN公司）調製出作 為模板之基因組DNA。 ICAN反應之反應條件為如下所述。即，以最終濃度為32 111]^1之《^?£3-1^011緩衝液（？11值7.8)、10〇111“醋酸鉀、5 111]^ 醋酸鎂、1%二甲基亞颯、0.04%丙二胺、0.11%胎牛血清白 蛋白各600 μΜ 之 dNTPs、4 U BcaBEST DNA聚合酶、100 U Tli RNaseHII、各 50 pmol 之 ICAN-ALDH2-F 引子以及 ICAN-ALDH2-R引子、5.5 pmol ALDH2 wG探針、6 pmol ALDH2 mA探針以及100 ng作為模板之基因組DNA為基 本，直接或添加1 pmol形成梯子形之寡核苷酸引子 ALDH2-TH1 或 ALDH2-TH2 或 ALDH2-TH3，藉由滅菌水設 為最終容量25 μΐ。將該反應液置於Smart Cycler(TAKARA 生物公司製造）中，於70°C中處理5分鐘後，於56°C中保持 溫度60分鐘。此外，螢光強度之測定係於保持為56°C時於 每一分鐘貫施測定。 又，將基因組DNA設為模板，使用ALDH2-F引子（序列表 之序列號28)以及ALDH2-R引子（序列表之序列號29)的成對 引子實施PCR，藉由Microcon-30(Millipore公司）純化所獲得 之增幅產物後，以Eco57I消化，藉由3%NuSieve3:lϊ复脂 97916.doc -56- 200532025 糖凝膠（TAKARA生物公司製造）實施電泳，亦藉由RFLP實 施分型。 PCR係使用TaKaRa ExTaq(TAKARA生物公司製造）加以 實施。即，添加最終濃度為lx之ExTaq緩衝液各200 μΜ之 dNTPs、1.25 U ExTaq、各 10 pmol 之 ALDH2-F 引子以及 ALDH2-R引子、作為模板之核酸所調製的人類基因組DNA 5μ，藉由滅菌水設為最終容量50 μΐ。將該反應液置於溫度 循環反應器-S P(TAKARA生物公司製造）中，於94°C中30秒 後，重複30次94°C30秒、55°C30秒、72°C30秒之循環。 丑〇〇5 71係用以識別(3丁0人人0之限制酶，雖然可切斷醛脫 氫酶2之源自正常型之增幅產物，但無法切斷源自變異型之 增幅產物。 就Eco 571中之PCR RFLP而言，使用觀察到之切斷的增幅 產物者與無法切的斷增幅產物者之三條片斷時，亦即’使 用雜交接合體之基因組DNA樣本時，在將ALDH2-TH1、 ALDH2-TH2以及ALDH2-TH3添加至反應系時，其結果如下 述表1以及表2所示，以100作為臨限值界線時，可確認出該 界線與樣本增幅曲線交叉點之Ct值變小，即反應性提高 了。又，對於ALDH2-TH3之情形，雖然無法確認，但添加 有ALDH2-TH1、ALDH2-TH2之情形時，可確認FAM螢光強 度增大，即檢測效率增大。 [表1] 97916.doc -57- 200532025 表ict值之變化 無添加 ALDH2-TH1 ALDH2-TH2 ALDH2-TH3 ROX(野生型） 30.3 〜33.03 21.01 〜23.87 21.06 〜27.37 22.91 〜24.05 FAM(變異型） 36.45〜40.44 22.9-28.0 25.65〜27.98 24.83〜34.71 [表2] 表2螢光強度 無添加 ALDH2-TH1 ALDH2-TH2 ALDH2-TH3 ROX(野生型） 350〜340 330〜350 350〜370 340〜380 FAM(變異型） 150〜245 285〜370 370〜380 145〜250 於Eco 571之RFLP中，使用觀察到之藉由切斷增幅產物所 獲得之兩條片斷時，亦即，使用正常型同源接合體之基因 組DNA樣本時，僅可確認源自ALDH2 wG探針之ROX螢光 訊號；就Eco 5 71之RFLP而言，使用觀察到之無法切斷增幅 產物而獲得之一條片斷時，亦即，使用變異型同源接合體 之基因組DNA樣本之時，僅可確認源自ALDH2 mA探針之 6-FAM螢光訊號。在此情形下，以1〇〇為臨限值界線時，可 確認出該界線與樣本增幅曲線交叉點的Ct值變小了，亦即 反應性提高。 (2)討論ALDH2多型檢測中，附加至被添加於反應系中之 形成梯子形之募核普酸引子51末端的驗基序列之效果 對於實施例2-(1)中藉由使用ICAN反應與循環探針法之 同步檢測所實施的多型檢測效果，檢測可編碼作為討論對 象而選擇之人類醛脫氫酶2酶之基因時，就附加至添加於反 應系中之形成梯子形之募核苦酸引子5 ’末端的驗基序列效 果加以討論。 以與實施例2-(1)同源之方式，準備有用以實施IC AN反應 979i6.doc -58- 200532025 系中該醛脫氫酶2基因之多型檢測的ICAN-ALDH2-F引 子、ICAN-ALDH2-R引子、正常型檢測用ALDH2 wG探針以 及變異型檢測用ALDH2 mA探針。正常型檢測用ALDH2 wG 探針，其係作為螢光標識附加ROX標識至5’末端且作為淬滅 標識附加Eclipse至3’末端的DNA-RNA-DNA型之寡核苷酸 探針；另一方面，變異型檢測用ALDH2 mA探針，其係作 為螢光標識附加FAM標識至5’末端且作為淬滅標識附加 Eclipse至Y末端的DNA-RNA-DNA型之寡核苷酸探針。 進而，將黏接至ICAN-ALDH2-F引子之上游區域（-1〜-12) 之12鹼基附加至5’末端，合成設定於ICAN-ALDH2-R引子附 近的形成梯子形之寡核苷酸引子ALDH2-TH2(對於 ICAN-ALDH2-R嵌合體引子為-9〜+ 6)以及去除附加至該引 子5f末端之12鹼基的ALDH2-TH4(序列號30)。 作為模板之基因組DNA，其係以獲有有知情同意書且使 用EDTA作為抗凝固劑的血液樣本，使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN公司）所調製出之基因組DNA中，可使用藉由 RFLP之分型從而可確認為雜接合體者。 ICAN反應之反應條件為如下所述。即，以最終濃度為32 mM 之 HEPES-KOH 緩衝液 pH 值 7.8、100 mM 醋酸鉀、5 mM 醋酸鎂、1 %二甲基亞砜、0.04%丙二胺、0.11 %胎牛血清白 蛋白各 600 μΜ之 dNTPs、4 U BcaBEST DNA聚合酶、100 U Tli RNaseHII、各 50 pmol 之 ICAN-ALDH2-F 引子以及 ICAN-ALDH2-R引子一對、5.5 pmol ALDH2 wG探針、6 pmol ALDH2 mA探針以及100 ng作為模板之基因組DNA為基 97916.doc -59- 200532025 本，直接或添加1 pmol形成梯子形之寡核苷酸引子 ALDH2-TH2或ALDH2-TH4，藉由滅菌水設為最終容量25 μΐ。將該反應液置於Smart Cycler(TAKARA生物公司製造） 中，於70°C中處理5分鐘後，於56°C中保持溫度60分鐘。再 者，螢光強度之測定係於保持為56°C下於每一分鐘實施測 定。 其結果為，將ALDH2-TH2添加至反應系中之情形時，如 下述表3以及表4所示，將臨限值界線設為1 〇〇，可碟認作為 該界線與樣本增幅曲線交叉點之Ct值變小’即反應性提 高。又，可確認ROX、FAM之螢光強度增大，即檢測效率 增大。另一方面，將ALDH2-TH4添加至反應系中時，無法 確認Ct值之變化，對於螢光強度亦無法確認其變化。即， 將附加至ALDH2-TH2之5’末端且未具有黏接至 ICAN-ALDH2-F引子之上游區域（-1〜-12)之12鹼基的 ALDH2-TH4添加至反應系中時，無法確認可藉由 ALDH2-TH2所確認之反應性提高及檢測效率增大。 [表3] 表3Ct值之變化 無添加 ALDH2-TH2 ALDH2-TH4 ROX(野生型） 28.2 23.9 27.2 FAM(變異型） 34.08 24.7 34.8 [表4] 表4螢光強度 無添加 ALDH2-TH2 ALDH2-TH4 ROX(野生型） 310〜320 410〜420 350〜360 FAM(變異型） 270〜290 465〜475 230〜240 (3)討論添加於反應系中之形成梯子形募核苷酸引子5’末 97916.doc -60- 200532025 端所附力口的驗基序列，在退伍軍人桿菌檢測中之效果 討論添加將黏接於第二欲合寡核普酸引子之上游區域 (-1〜-12或-13〜-24)的12驗基附加至5f末端之形成梯子形的 寡核苷酸引子，於IC AN反應中之檢測速度變化。 就使用ICAN反應與循環探針法之同步檢測的效果加以 討論。至於討論對象，選擇可編碼退伍軍人桿菌 Mip(Legionella pneumophila 、macrophage infectivity potentiator (Mip) ； GenBank Acc. No. ·· AF09521 5)基因的 基因。 為於ICAN反應糸中檢測該退伍軍人桿菌Mip基因，藉由 DNA合成機（Applied.Biosystems公司製造）從而合成第二嵌 合寡核苷酸引子之F2嵌合募核苷酸引子（序列表之序列號 31)以及第一嵌合寡核苷酸引子之尺2嵌合寡核苷酸引子（序 列表之序列號32)。其次，合成有Mip基因檢測用Mip 4 gl2 才木針（序列表之序列號33)。又，Mip基因檢測用Mip 4 gl2 探針，其係於5,末端附加有作為螢光標識之FAM標識且3, 末端附加有作為淬滅標識之Eclipse的 养核苦酸探針。 進而，將黏接至第二嵌合募核苷酸引子之上游區域 (^〜-12或_13〜_24)之12鹼基附加至5，末端，合成設定於第一 _养核苷酉文引子附近之形成梯子形的募核苦酸引子之 R2(-n)(序列表之序列號34;對於第一嵌合寡核苦酸引子為 ==-29)、(序列表之序列號35 ;對於第一嵌 合募核苷酸引子’於-13〜-29部分5,末端中附加有第二嵌合 97916.doc 200532025 募核苷酸引子之上游區域-1〜-12之12鹼基）、 R2(-13)A12-2(序列表之序列號36 ;對於第一嵌合寡核苷酸 引子，於-13〜-29部分5’末端中附加有第二嵌合寡核苷酸引 子之上游區域-13〜-24之12鹼基）。 作為模板之基因組DNA ， 係使用附於 EnviroAmp™(PERKIN ELMER公司製造）之嗜肺性退伍軍 人桿菌對照組DNA(Legionella pneumophila Control DNA) 〇 ICAN反應之反應條件為如下所述。即，以最終濃度為32 mM 之 HEPES-KOH 緩衝液 pH 值 7_8、100 mM 醋酸鉀、5 mM 醋酸鎂、1%二甲基亞颯、0.11 %胎牛血清白蛋白各500 μΜ 之 dNTPs、2 U BcaBEST DNA 聚合酶、100 U Tli RNaseHII、 各25 pmol之F2嵌合寡核苷酸引子以及R2嵌合寡核苷酸引 子、5 pmol Mip 4gl2探針以及作為模板之控制組DNA200 複製物為基本，直接或添加1 pmol之R2(-13)A12_1或 R2(-13)A12-2，以滅菌水使最終容量成為25 μΐ。將該反應 液置於Smart Cycler(TAKARA生物公司製造）中，於7〇°C中 處理5分鐘後，於53 °C中保持溫度90分鐘。再者，螢光強度 之測定係於保持為53°C時於每一分鐘實施測定。 將其結果示於表5中。如表5所示，將形成梯子形之募核 苷酸引子R2(-13)A12-1或R2(-13)A12-2添加至反應系中 時，以100為臨限值界線，可確認該界線與樣本增幅曲線交 叉點之Ct值變小，即反應性提高。 [表5] 表5Ct值之變化 97916.doc -62- 200532025 無添加 R12(-13)A12-1 R12(-13)A12-2 FAM 74.17 〜81.12 44.11 〜54.61 48.03〜55.89 實施例3 (1)於作為模板之核酸方面，存在於雙方ICAN引子上游 區域之互補性序列對於IC AN反應的效果1 作為模板之核酸方面，自雙方ICAN引子之5’末端將6鹼基 互補性序列插入上游區域，可發現涉及ICAN反應之影響。 選擇有人類 c_Ki-ras2基因（GenBank Acc· No. : L00045)作為 檢測對象。 以如下方式調製出雙方ICAN引子之5’末端上游區域中 無明確互補性序列的模板以及具有6鹼基互補性序列的模 板。 將人類基因組（購於Clontech公司）設為模板，使用 c-Ki-ras/12F引子（序列表之序列號37)與rasTIR引子（序列 表之序列號38)或將互補性序列附加至雙方引子5’末端的 rasT14F引子（序列表之序列號39)與rasT4R引子（序列表之 序列號40)，從而實施PCR。將所獲得之片斷平滑化，插入 質體pUC118(TAKARA生物公司製造）之HincII部位。自所獲 得之質體，篩選c-Ki-ras/12F引子或rasT14F引子與黏接至 pUC118之M13引子M4(TAKARA生物公司製造）同源方向 的質體。其結果為，可獲得於雙方ICAN引子之5’末端上游 區域中無明確互補性序列之質體T7與具有6鹼基之互補性 序列CGCGCG的質體T16。 根據OD260值計算上述所調製之質體DNA，每1 μΐ調製為 10〇、101、102、1〇3複製物。於最終濃度為32 mM之 97916.doc -63- 200532025 HEPES-KOH緩衝液（pH值7·8) ' 100 mM醋酸鉀、1%二甲基 亞颯、0.11%BSA、4 mM醋酸鎂各500 μΜ之dNTPs中，於包 含c-Ki-ras/12FN3嵌合寡核苷酸引子（序列表之序列號41)與 c-Ki-ras/12RN3嵌合寡核苷酸引子（序列表之序列號42)各 3 0 pmol、BcaBEST(TAKARA生物公司製造）2.8 U、國際專 利公開案第02/22831號小冊子中藉由實施例7揭示之方法 所調製之Afu RNaseHII 2.2 U的反應液24 μΐ中，添加1 μΐ各 複製物數模板 DNA，於 Thermal Cycler Personal(TAKARΑ 生 物公司製造）於55°C中反應60分鐘。增幅產物係藉由3%瓊脂 糖凝膠電泳加以確認。 其結果為，將於雙方ICAN引子之5’末端上游區域中無明 確互補性序列之質體T7設為模板時，增幅產物僅發現有目 標區域之尺寸帶，較為穩定之靈敏度為1 〇3複製物；然而將 於鄰接至雙方ICAN引子之5’末端之上游區域中具有互補 性序列CGCGCG之質體T16設為模板之情形時，可發現目標 區域之尺寸帶並且於高分子側可發現規則正確之梯子形狀 產物，可穩定地檢測1〇複製物且靈敏度得以提高。又，自 凝膠上切斷梯子形產物、於P U C 11 8之H i n c 11部位次純糸化 從而決定驗基序列時，梯子形產物係目標區域經由存在於 雙方ICAN引子之5’末端上游區域之互補性序列CGCGCG 以同源方向連結者。 綜上所述，可確認下述情形：藉由存在於雙方ICAN引 子之5’末端上游區域之互補性序列，可促進目標區域之聚合 反應，可提高靈敏度。 97916.doc -64- 200532025 (2)於作為模板之核酸方面，存在於雙方IC AN引子上游 區域之互補性序列對於ICAN反應之效果2 於作為模板之核酸方面，可發現自雙方ICAN引子之5’末 端存在於上游區域之3鹼基互補性序列對於IC AN反應之影 響。選擇有奈瑟氏淋球菌隱密質體蛋白質cppB(Neisseria gonorrhoeae cryptic plasmid protein(cppB) ； GenBank Acc. No. : M103 16)基因作為檢測對象。 以如下方式調製出模板。 將淋菌基因組（購於住商Pharma· International)設為模 板，使用PJDBF引子（序列表之序列號43)與PJDBR引子（序 列表之序列號44)從而實施PCR。將所獲得之片斷平滑化， 插入至質體pUC118(TAKARA生物公司製造）之HincII部 位。自所獲得之質體，篩選PJDBF引子與黏接至pUC118之 Ml 3質體M4(TAKARA生物公司製造）同源方向的質體， 從而獲得質體Cpl3。 將上述質體Cp 13設為模板，為增幅後入區域從而設計出 PJDB0FN3引子（序列表之序列號45)與PJDB0RN3引子（序列 表之序列號46)。該情形時，GTC並非存在於PJDB0FN3引 子鏈之目標區域，而存在於起始自PJDB0FN3引子5,末端上 游34鹼基之位置，上述GTC係與GAC互補性序列，該GAC 係鄰接至PJDB0RN3引子5’末端之上游序列3鹼基。可發現 該3鹼基對於ICAN之影響。 根據OD260值計算上述所調製之質體DNA，每1 μΐ調製為 10〇、101、102、1〇3、1〇4、1〇5、106、107、1〇8複製物。於 97916.doc -65 - 200532025 最終濃度為32 111“之11£?£8-尺011緩衝液（？11值7.8)、10〇111?^ 醋酸鉀、1%二甲基亞砜、0.11%BSA、4 mM醋酸鎂各500 μΜ 之dNTPs中，於含有PJDB0FN3嵌合寡核苷酸引子與 PJDB0RN3嵌合寡核苷酸引子各30 pmol 、 BcaBEST(TAKARA生物公司製造）2·8 U以及Afu RNaseHII 2.2 U的反應液24 μΐ中，添加1 μΐ各複製物數模板DNA，於 Thermal Cycler Personal(TAKARA 生物公司製造）中，於 55°C下反應60分鐘。增幅產物係藉由3%瓊脂糖凝膠電泳加 以確認。 其結果為，可發現目標區域之尺寸帶並且於高分子側可 發現規則正確之梯子形狀產物，可以高至102複製物之高靈 敏度檢出。又，自凝膠上切斷梯子形產物，於pUC 11 8之 Hindi部位純系化，從而決定鹼基序列時，梯子形產物係經 由目標區域存在於雙方ICAN引子之5’末端上游區域之互 補性3鹼基GAC與GTC規則正確地以同源方向連結。即，於 該梯子形增幅產物中，包含介於ICAN引子中之目標區域， 並且以夾於目標區域中之形態規則正確地包含起始自 PJDB0FN3嵌合寡核苷酸引子5’末端之上游區域34鹼基。 綜上所述，可確認下述情形：藉由存在於雙方IC AN引子 之5’末端上游區域之互補性序列3鹼基，可促進目標區域之 聚合反應，可增幅高靈敏度。又，用藉由探針所實施之雜 合檢測增幅產物時，顯示出下述情形：探針位置可自介於 IC AN引子間之區域，或介於存在於IC AN引子與雙方IC AN 引子之5’末端上游區域之互補性序列間的區域選定。 97916.doc -66- 200532025 實施例4 使用逆轉錄引子從而討論RT-ICAN靈敏度及檢測速度， 該逆轉錄引子係將附加至形成梯子形之寡核苷酸引子5’末 端且黏接至第二嵌合寡核苷酸引子之上游區域之鹼基長度 設為6驗基、9驗基、12驗基（-1〜-6、-1〜-9、-1〜-12)者。 首先，根據OD260值計算上述實施例1_(1)中所調製之模 板 RNA，每1 μΐ調製為 l〇G、101、1〇2、1〇3、1〇4、1〇5複製 物。 調製出10 μΐ之下述反應液··於最終濃度為32 mM之 HEPES-KOH緩衝液（pH值7_8)、100 mM醋酸鉀、1%二甲基 亞砜、0.11% BSA、4 mM醋酸鎂各500 μΜ之dNTPs中，添 加形成梯子形之寡核苷酸引子之215 R引子、A6-215R引子 (序列表之序列號47)、A9-215R引子（序列表之序列號48)或 A12-215R引子各1 pmol作為上述逆轉錄引子，RTase M_MLV(TAKARA生物公司製造）50 U以及1 μΐ各複製物數 模板RN Α。 將該反應液置於 Thermal Cycler Personal(TAKARA 生物 公司製造）中，於45°C中保持10分鐘後冷卻至41：。逆轉錄 反應結束後，於該反應液10 /xmM酷酸钟、1 %二甲基亞礙、 0.11%BSA、4 mM醋酸鎂各500 μΜ之dNTPs中，添加包含第 二嵌合寡核苷酸引子之B134FN3(16)弓1子與第一嵌合募核 苷酸引子之 205RN3(16)引子各 25 pmo卜 BcaBEST(TAKARA 生物公司製造）11 U、ΤΠ RNaseHII 0.05 U以及 SYBR Green 的反應液 15 μΐ，藉由 Rotor gene(CORBETT RESEARCH公司 97916.doc -67- 200532025 製造）於55t中實施ICAN反應從而同步檢測出增幅產物。 又’反應產物係亦可藉由3 %瓊脂糖凝膠電泳加以確認。 其結果為，於使用將黏接至第二嵌合寡核苷酸引子之上 游區域（-1〜-6)之6鹼基附加至5,末端形成梯子形之募核苷酸 引子A6-215R時，靈敏度為1〇2複製物。藉由附加6鹼基所達 到之檢測速度的加快效果為〇·9分鐘。 於使用有將黏接至第二喪合寡核苷酸引子之上游區域 (-1〜-9)之9驗基附加至5’末端形成梯子形之募核苷酸引子 A9-215R時，靈敏度為102。藉由附加9鹼基所達到之檢測速 度的加快效果為1.6分鐘。 於使用有將黏接至第二嵌合寡核苷酸引子之上游區域 (-1〜_ 12)之12鹼基附加至5’末端形成梯子形之寡核苷酸引子 A12-215R時，靈敏度為ίο1複製物。藉由附加12鹼基所達到 之檢測速度的加快效果為3.7分鐘。 綜上所述，可確認下述情形：附加至形成梯子形之寡核 苷&L引子5末端且黏接至第二叙合募核苦酸引子之上游區 域的序列，其鹼基數越多則其效果越大。 實施例5 就使用有逆轉錄引子之RT-ICAN靈敏度加以討論，該逆 轉錄引子係將附加至形成梯子形之寡核苷酸引子5，末端且 黏接至第二嵌合募核苷酸引子之上游區域之鹼基長度設為 12驗基、18驗基（-1〜-12、-1〜-18)者。 首先，根據OD260值計算上述實施例ι_(1)中所調製之模 板 RNA ’ 母1 μΐ調製為 1〇、ίο1、ι〇2、ι〇3、ι〇4、ι〇5 複製 97916.doc -68- 200532025 物。 調製出10 μΐ下述反應液：於最終濃度為32 mM之 HEPES-KOH緩衝液（pH值7·8)、100 mM醋酸鉀、1%二甲基 亞砜、0.11%BSA、4 mM醋酸鎂各500 μΜ之dNTPs中，添加 形成梯子形之寡核苷酸引子之205 RN3(18)引子、A12-205R 引子或A18-205R引子（序列表之序列號49)各1 pmol作為上 述逆轉錄引子，RTase M-MLV(TAKARA生物公司製造）50 U 以及1 μΐ各複製物數模板RNA。 將該反應液置於 Thermal Cycler Personal(TAKARA 生物 公司製造）中，於45t：中保持10分鐘後冷卻至。逆轉錄 反應結束後，於該反應液10 μ1中，於最終濃度為32 mM之 HEPES-KOH緩衝液（pH值7.8)、100 mM醋酸鉀、1%二曱基 亞颯、0.11%BSA、4 mM醋酸鎂各500 μΜ之dNTPs中，添加 包含第二嵌合募核苷酸引子之B134FN3(18)引子與第一嵌 合募核苷酸引子之205 RN3(18)引子各25 pmol、

BcaBEST(TAKARA生物公司製造）11 U以及 Tli RNaseHII 0.05 U 的反應液 15 μΐ ，藉由 Thermal Cycler Personal(TAKARA生物公司製造）於55 °C中實施ICAN反 應，亦可藉由3%瓊脂糖凝膠電泳確認出增幅產物。 其結果為，以205 RN3引子實施逆轉錄之RT-ICAN靈敏度 為102複製物，然而於在同源位置上使用將黏接至第二嵌合 寡核苷酸引子之上游區域（-1〜-12)之12鹼基附加至5’末端形 成梯子形之募核苷酸引子A12-205R時，以及使用有將黏接 至第二嵌合募核苷酸引子之上游區域（_1〜-18)之18鹼基附 97916.doc -69- 200532025 加至5’末端形成梯子形之寡核苷酸引子A18-205R時，靈敏 度成為101複製物，因此於任何情形時靈敏度均可提高1位 數。又，可確認下述情形··於使用A12-205R或A18-205R之 增幅係經由黏接至引子上游區域之序列連結規則正確之梯 子形狀增幅產物。 綜上所述，可確認下述情形：即使改變黏接至第二嵌合 寡核苷酸引子之上游區域的鹼基數，亦會引起經由該區域 之梯子形增幅，且可提高靈敏度。 [產業上之可利用性] 根據本發明，可提供一種優於先前等溫核酸增幅方法的 增幅方法，包含使用於該方法之引子的組合物以及套組。 [序列表說明] SEQ ID NO. 1: 一部分SARS冠狀病毒基因組RNA逆轉錄 為DNA。f’核苷酸l至5為mndIII限制部位-核苷酸23 8至242 為BamHI限制部位。π SEQ ID NO· 2:經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為 205RN3(18)，用於自mRNA合成cDNA，且用於增幅一部分 SARS冠狀病毒基因組。”核苷酸16至18為核糖核苷酸-其它 核苷酸為去氧核糖核苷酸。π SEQ ID NO. 3:經設計之寡核苷酸引子，命名為 A12-205R，用於自 mRNA 合成 cDNA。 SEQ ID NO. 4:經設計之募核苷酸引子，命名為215R， 用於自mRNA合成cDNA。 SEQ ID NO. 5: 經設計之寡核苷酸引子，命名為 97916.doc -70- 200532025 A12-215R，用於自mRNA合成cDNA，且用於增幅一部分 SARS冠狀病毒基因組。 SEQ ID NO. 6:經設計之寡核苷酸引子，命名為 A12-223R，用於自mRNA合成cDNA，且用於增幅一部分 SARS冠狀病毒基因組。 SEQ ID NO· 7:經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為 134FN3(18)，用於增幅一部分SARS冠狀病毒基因組。’’核 苷酸16至1 8為核糖核苷酸-其它核苷酸為去氧核糖核苷酸’’。 SEQ ID NO. 8: 經設計之寡核苷酸引子，命名為 A12(-10)_215R，用於自mRNA合成cDNA，且用於增幅一部 分SARS冠狀病毒基因組。 SEQ ID NO. 9:經設計之寡核苷酸引子，命名為 A12(-20)-2 15R，用於自mRNA合成cDNA，且用於增幅一部 分SARS冠狀病毒基因組。 SEQ ID NO. 10:經設計之寡核苷酸引子，命名為 A12(6)-2 1 5R，用於自mRNA合成cDNA，且用於增幅一部分 SARS冠狀病毒基因組。 SEQ ID NO. 11··經設計之募核苷酸引子，命名為 A12(12)-215R，用於自mRNA合成cDNA，且用於增幅一部 分SARS冠狀病毒基因組。 SEQ ID NO. 12:經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為 B134FN3(16)，用於增幅一部分SARS冠狀病毒基因組。”核 苷酸14至16為核糖核苷酸-其它核苷酸為去氧核糖核苷酸”。 n5f末端用生物素標記’’。 97916.doc -71 - 200532025 SEQ ID NO· 13:經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為 205RN3(16)，用於增幅一部分SARS冠狀病毒基因組。”核 苷酸14至16為核糖核苷酸-其它核苷酸為去氧核糖核苷酸’’。 SEQ ID NO. 14:經設計之寡核苷酸引子，命名為 A6(-10)-215R，用於自mRNA合成cDNA，且用於增幅一部 分SARS冠狀病毒基因組。 SEQ ID NO. 15:經設計之寡核苷酸引子，命名為 A9(-10)-215R，用於自mRNA合成cDNA，且用於增幅一部 分SARS冠狀病毒基因組。 SEQ ID NO. 16:經設計之寡核苷酸探針，命名為 SARS-BNI-B，用於檢測經增幅之一部分SARS冠狀病毒基 因組。”5’末端用FITC標記π。 SEQ ID NO. 17:經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為 160FN3，用於增幅一部分SARS冠狀病毒基因組。’’核苷酸 1 6至1 8為核糖核苷酸-其它核苷酸為去氧核糖核苷酸’’。 SEQ ID NO. 18:經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為 241RN3，用於增幅一部分SARS冠狀病毒基因組。，’核苷酸 1 2至14為核糖核苷酸-其它核苷酸為去氧核糖核苷酸”。 SEQ ID NO. 19:經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為 (A12)241RN3，用於增幅一部分SARS冠狀病毒基因組。”核 苷酸18至21為核糖核苷酸-其它核苷酸為去氧核糖核苷酸”。 SEQ ID NO. 20:經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為 134FN3(16)，用於增幅一部分SARS冠狀病毒基因組。’’核 苷酸14至16為核糖核苷酸-其它核苷酸為去氧核糖核苷酸’’。 97916.doc -72- 200532025 SEQ ID NO. 21:經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為 ICAN-ALDH2-F，用於增幅一部分人類醛脫氫酶2基因。 ’’核苷酸18至20為核糖核苷酸-其它核苷酸為去氧核糖核苷 酸’，。 SEQ ID N0. 22··經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為 ICAN-ALDH2-R，用於增幅一部分人類醛脫氫酶2基因。 π核苷酸18至20為核糖核苷酸-其它核苷酸為去氧核糖核苷 酸丨’。 SEQ ID NO. 23··經設計之嵌合寡核苷酸探針，命名為 ALDH2 wG探針，用於檢測經增幅之一部分天然型人類醛 脫氳酶2基因。”核苷酸11為核糖核苷酸-其它核苷酸為去 氧核糖核苷酸’’。”5’末端用ROX標記，且3’末端用Eclipse標 記，丨。 SEQ ID NO. 24··經設計之嵌合寡核苷酸探針，命名為 ALDH2 mA探針，用於檢測經增幅之一部分變異型人類醛 脫氫酶2基因。”核苷酸11為核糖核苷酸-其它核苷酸為去氧 核糖核苷酸’’。”5’末端用FAM標記，且3’末端用Eclipse標記”。 SEQ ID NO· 25··經設計之寡核苷酸引子，命名為 ALDH2-TH1，用於增幅一部分人類醛脫氫酶2基因。 SEQ ID NO_ 26:經設計之寡核苷酸引子，命名為 ALDH2-TH2，用於增幅一部分人類醛脫氫酶2基因。 SEQ ID NO. 27:經設計之寡核苷酸引子，命名為 ALDH2-TH3，用於增幅一部分人類醛脫氫酶2基因。 SEQ ID NO. 28:經設計之募核苷酸PCR引子，命名為 97916.doc 73 - 200532025 ALDH2-F，用於增幅一部分人類醛脫氫酶2基因。 SEQ ID NO. 29:經設計之寡核苷酸PCR引子，命名為 ALDH2-R，用於增幅一部分人類醛脫氫酶2基因。 SEQ ID NO. 30:經設計之寡核苷酸引子，命名為 ALDH2-TH4，用於增幅一部分人類醛脫氫酶2基因。 SEQ ID NO. 31:經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為 F2，用於增幅一部分嗜肺性退伍軍人桿菌mip基因。’’核苷 酸1 5至1 7為核糖核苷酸-其它核苷酸為去氧核糖核苷酸’’。 SEQ ID NO· 32··經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為 R2，用於增幅一部分嗜肺性退伍軍人桿菌mip基因。’’核苷 酸1 5至1 7為核糖核苷酸-其它核苷酸為去氧核糖核苷酸π。 SEQ ID NO. 33:經設計之嵌合募核苷酸探針，命名為 Mip4gl2探針，用於檢測經增幅之一部分嗜肺性退伍軍人桿 菌mip基因。”核苷酸4為核糖核苷酸-其它核苷酸為去氧核 糖核苷酸。π5’末端用FAM標記，且3’末端用Eclipse標記π。 SEQ ID NO. 34:經設計之寡核苷酸引子，命名為 R2(-13)，用於增幅一部分嗜肺性退伍軍人桿菌mip基因。 SEQ ID NO. 35:經設計之寡核苷酸引子，命名為 R2(-13)A12-1，用於增幅一部分嗜肺性退伍軍人桿菌mip基 因。 SEQ ID NO· 36:經設計之寡核苷酸引子，命名為 R2(-13)A12-2，用於增幅一部分嗜肺性退伍軍人桿菌mip基 因。 SEQ ID NO. 37:經設計之寡核苷酸PCR引子，命名為 97916.doc -74- 200532025 c-Ki-ras/12F，用於增幅，部分人類c_Ki-ras2基因。 SEQ ID NO. 38:經設計之寡核苷酸PCR引子，命名為 rasTIR，用於增幅一部分人類c-Ki-ras2基因。 SEQ ID NO. 39:經設計之寡核苷酸引子，命名為 rasT14F，用於增幅一部分人類c-Ki-ras2基因。 SEQ ID NO. 40:經設計之寡核苷酸PCR引子，命名為 rasT4R，用於增幅一部分人類C-Ki_ras2基因。 SEQ ID NO. 41:經設計之欲合寡核苷酸引子，命名為 c-Ki-ras/12FN3，用於增幅一部分人類c-Ki-ras2基因。”核 苷酸18至20為核糖核苷酸-其它核苷酸為去氧核糖核苷酸π。 SEQ ID NO. 42:經設計之嵌合募核苷酸引子，命名為 c-Ki-ras/12RN3，用於增幅一部分人類c_Ki-ras2基因。”核 苷酸18至20為核糖核苷酸-其它核苷酸為去氧核糖核苷酸”。 SEQ ID NO. 43:經設計之寡核苷酸引子，命名為PJDBF， 用於增幅一部分Neisseria gonorrhoeae cppB基因。 SEQ ID NO. 44:經設計之寡核苷酸引子，命名為PJDBR， 用於增幅一部分Neisseria gonorrhoeae cppB基因。 SEQ ID NO. 45:經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為 PJDB0FN3，用於增幅一部分Neisseria gonorrhoeae cppB基 因。π核苷酸18至20為核糖核苷酸-其它核苷酸為去氧核糖 核苦酸”。 SEQ ID NO. 46:經設計之嵌合募核苷酸引子，命名為 PJDB0RN3，用於增幅一部分 Neisseria gonorrhoeae cppB基 因。’’核苷酸15至17為核糖核苷酸-其它核苷酸為去氧核糖 97916.doc -75- 200532025 核苷酸”。 SEQ ID NO· 47·•經設計之寡核苷酸引子，命名為 A6-215R，用於增幅一部分SARS冠狀病毒基因組。 SEQ ID NO· 48:經設計之寡核苷酸引子，命名為 A9-215R，用於增幅一部分SARS冠狀病毒基因組。 SEQ ID NO· 49:經設計之募核苷酸引子，命名為 A18-205R，用於增幅一部分SARS冠狀病毒基因組。 【圖式簡單說明】 圖1係關於實施例2-(1)-(Α)中所使用之第一嵌合寡核苦 酸引子、第二寡核苷酸引子、形成梯子形之寡核苷酸引子 之位置關係圖。（a)表示第一嵌合募核苷酸引子，（b)〜(幻表 示形成梯子形之寡核苷酸引子，（e)表示第二嵌合募核普酸 引子。（b)〜（d)中，一部分具有與⑷之5,上游互補鏈1同源之 序列。 圖2係表示各複製物數之增幅曲線圖。圖2中，橫轴表示 反應循環數，縱軸表示螢光強度。圖2中，a係使用有ι〇5複 製物數模板時之增幅曲線，b係使用有1 〇4複製物數模板時 之增幅曲線，c係使用有103複製物數模板時之增幅曲線，d 係使用有102複製物數模板時之增幅曲線，e係使用有ι〇ι複 製物數模板時之增幅曲線，f係使用有1 〇G複製物數模板時之 增幅曲線。 97916.doc -76- 200532025 序列表 <110> TAKARA BIO INC. <120〉核酸之增幅方法 <130〉 <140〉 093138482 <141〉 2004-12-10 <150〉 JP 2003-412326 <151〉 2003-12-10 <160> 49 <170〉專利第3.1版 <210〉 1 <211〉 242 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> —部分SARS冠狀病毒基因組RNA逆轉錄為DNA。“核苷酸1至5 為H i nd Μ I限制部位-核苷酸238至242為BamH丨限制部位”。 <400> 1 aagctttctc tatgatgggt ttcaaaatga attaccaagt caatggttac cctaatatgt 60 ttatcacccg cgaagaagct attcgtcacg ttcgtgcgtg gattggcttt gatgtagagg 120 gctgtcatgc aactagagat gctgtgggta ctaacctacc tctccagcta ggattttcta 180 caggtgttaa cttagtagct gtaccgactg gttatgttga cactgaaaat aacacaggat 240 cc 242 97916.doc 200532025 <210> 2 <211〉 18 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為205RN3(18),用於自mRNA 合成cDNA,且用於增幅一部分SARS冠狀病毒基因組。“核苷 酸16至18為核糠核苷酸-其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”。 <400> 2 agttgcatga cagcccuc <210> 3 <211〉 30 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉經設計之寡核苷酸引子，命名為A12-205R,用於自mRNA合成 cDNA〇 <400〉 3 aaacatatta ggagttgcat gacagccctc 30 <210〉 4 <211〉 18 <212> DNA <2U>人工序列 <220> <223〉經設計之寡核苷酸引子，命名為215R,用於自mRNA合成cDNA。 97916.doc -2- 200532025 <400〉 4 cagcatctct agttgcat <210〉 5 <211〉 30 <212〉 DMA <213〉人工序列 <220〉 〈223>經設計之寡核苷酸引子，命名為幻2—215R，用於自巾瞧合成 cDNA，且用於增幅一部分SARS冠狀病毒基因組。 <400〉 5 aaacatatta ggcagcatct ctagttgcat 30 <210〉 6 <211〉 30 <212〉 DNA <213>人工序列 <220> <223>經設計之寡核苷酸引子，命名為A12-223R，用於自mRNA合成 cDNA，且用於增幅一部分SARS冠狀病毒基因組。 <400> 6 aaacatatta ggagtaccca cagcatctct 30 <210> 7 <211〉 18 97916.doc 200532025 <212> DNA <2】3>人工序列 <220〉 <223>經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為134FN3(18)，用於增幅— 部分SARS冠狀病毒基因組。“核苷酸16至18為核糖核苷酸-其 它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”。 <400〉 7 atcacccgcg aagaagcu 18 <210> 8 <211〉 30 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223>經設計之寡核苷酸引子，命名為A12(-10)-215R，用於自mRNA 合成cDNA，且用於增幅一部分SARS冠狀病毒基因組。 <400> 8 gggtaaccat tgcagcatct ctagttgcat 30 <210〉 9 <211> 30 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223>經設計之寡核苷酸引子，命名為A12(-20)-215R，用於自mRNA 合成cDNA，且用於增幅一部分SARS冠狀病毒基因組。 97916.doc -4- 200532025 <400〉 9 tgacttggta atcagcatct ctagttgcat 30 <210〉 10 <211> 30 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉經設計之寡核苷酸引子，命名為A12⑹-215R，用於自mRNA合 成cDNA，且用於增幅一部分SARS冠狀病毒基因組。 <400〉 10 ggtgataaac atcagcatct ctagttgcat 30 <210> 11 <211> 30 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223〉經設計之寡核苷酸引子，命名為A12(12)-215R，用於自mRNA 合成cDNA，且用於增幅一部分SARS冠狀病毒基因組。 <400〉 11 ttcgcgggtg atcagcatct ctagttgcat 31

<210> 12 <211〉 16 <212〉 DNA 97916.doc 200532025 <213>人工序列 <220〉 <力3>經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為B134FN3(16)，用於増幅 —部分SARS冠狀病毒基因組。“核苷酸14至16為核糖核苷酸 -其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”。“5’末端用生物素標記”。 <400〉 12 atcacccgcg aagaag 16 <210> 13 <211> 16 <212> DNA 〈213>人工序列 <220〉 <223>經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為205RN3(16)，用於增幅 一部分SARS冠狀病毒基因組。“核苷酸14至16為核糖核苷 酸-其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”。 <400> 13 agttgcatga cagccc 16 <210> 14 <211〉 24 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223>經設計之寡核苷酸引子，命名為A6(-10)-215R，用於自mRNA合 成cDNA，且用於增幅一部分SARS冠狀病毒基因組。 97916.doc 200532025 <400> 14 gggtaacagc atctctagtt gcat 24 <210> <211> <212〉 <213〉 15 27

DNA 人工序列 <220> <223〉經設計之寡核苷酸引子，命名為A9(-10)-215R，用於自mRNA 合成cDNA，且用於增幅一部分SARS冠狀病毒基因組。 <400〉 15 gggtaaccac agcatctcta gttgcat 27 <210〉 16 <211〉 20 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> 幅 <223〉經設計之寡核苷酸探針，命名為SARS-BNI-B，用於檢測經增 之一部分SARS冠狀病毒基因組。“5’末端用FITC標記”。 <400> 16 aagccaatcc acgcacgaac 20

<210> 17 <211〉 18 <212> DNA 97916.doc 200532025 <213〉人工序列 <220> 〈223>經設計之嵌合募杨苷酸引子，命名為160FN3,用於增幅一咅分 SARS冠狀病毒基因組。“核苷酸16至18為核糖核苷酸-其它 核苷酸為脫氧核糖核苷酸”。 <400〉 17 cgttcgtgcg tggatugg <210〉 18 <211〉 14 〈212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223〉經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為241RN3,用於增幅一部分 SARS冠狀病毒基因組。“核苷酸12至U為核糖核苷酸—其它核 苷酸為脫氧核糖核苷酸”。 <400> 18 tagctggaga ggua

<210〉 19 <211〉 21 <212〉 DNA <213>人工序列 <220> <223>經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為（A12)241RN3,用於增幅— 部分SARS冠狀病毒基因組。“核苷酸18至21為核糖核苷酸一其 它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”。 97916.doc 200532025 <400〉 19 tgacgaatag ctggagaggu a 21 <210〉 20 <211〉 16 <212> DNA <2!3>人工序列 <220> <223>經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為134FN3(16)，用於增幅一 部分SARS冠狀病毒基因組。“核苷酸14至16為核糖核苷酸-其 它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”。 <400> 20 atcacccgcg aagaag 16 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223>經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為ICAN-ALDH2-F，用於增幅 —部分人類醛脫氫酶2基因。“核苷酸18至20為核糖核苷酸-其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”。 <400〉 21 agttgggcga gtacgggcug 20 97916.doc 200532025 <210> 22 <211〉 20 <212〉 DNA <213>人工序列 <220> <223>經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為ICAN-ALDH2-R，用於增幅 —部分人類醛脫氫酶2基因。“核苷酸18至20為核糖核苷酸-其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”。 <400> 22

cagaccotca agccccaaca <210〉 23 <211〉 14 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223>經設計之嵌合寡核苷酸探針，命名為ALDH2WG探針，用於檢測 經增幅之一部分天然型人類醛脫氫酶2基因。“核苷酸11為核 糖核苷酸-其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”。“5’末端用FOX標 言己，且3’末端用Eel ipse標記”。 鲁 <400> 23 ggcatacact gaag 14

<210〉 24 <211〉 14 <212〉 DNA <213>人工序列 97916.doc -10- <220〉 200532025 <223>經設計之嵌合寡核苷酸探針，命名為ALDH2mA探針，用於檢測 經增幅之一部分變異型人類醛脫氫酶2基因。“核苷酸11為核糖 核苷酸-其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”。“5’末端用FAM標記， 且3’末端用Eel ipse標記”。 <400〉 24 ggcatacact aaag 14

<210〉 25 <211> 29 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>經設計之寡核苷酸引子，命名為ALDH2-TH1,用於增幅一部分 乂類醛脫氫酶2基因。 <400> 25 cccggccact ccgcagacoc tcaagccco 29

<210〉 26 <211〉 28 <212〉 DNA <213>人工序列 <220> <223>經設計之寡核苷酸引子，命名為ALDH2-TH2,用於增幅一部分人 類醛脫氫酶2基因。 <400〉 26 cccggccact ccagccacca gcagaccc 28 97916.doc -11 - 200532025

<210> 27 <211〉 28 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 〈223>經設計之寡核苷酸引子，命名為ALDH2-TH3,用於增幅一部分 人類醛脫氫酶2基因。 <400> 27 cccggccact ccaggctccg agccacca 28

<210〉 28 <211〉 21 <212〉 DNA <213>人工序列 <220> <223>經設計之寡核苷酸PCR引子，命名為ALDH2-F，用於增幅一部分 人類醛脫氫酶2基因。 <400〉 28 cagggtcaac tgctatgatg t 21

<210> 29 <211> 21 <212> DNA 〈213>人工序列 <220〉 <223〉經設計之寡核苷酸PCR引子，命名為ALDH2-R，用於增幅一部分 人類醛脫氫酶2基因。 97916.doc 12- 200532025 <400〉 29 agcccccaac agaccccaat c 21 <210> 30 <211〉 16 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 〈223>經設計之寡核苷酸引子，命名為ALDH2-TH4,用於增幅一部分人 類醛脫氫酶2基因。

<400〉 30 agccacoagc agaccc 16 <210> 31 <211> 17 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉

<223>經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為F2,用於增幅一部分嗜肺性 退伍軍人桿菌mi p基因。“核苷酸15至17為核糖核苷酸-其它核 苷酸為脫氧核糖核苷酸”。 <400> 31 atggggcttg caatguc <210> 32 <211> 17 <212〉 DNA <213〉人工序列 97916.doc -13- <220〉 <220〉200532025 <223>經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為R2,用於增幅一部分嗜肺 性退伍軍人桿菌mi p基因。“核苷酸15至17為核糖核苷酸-其 它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”。 <400〉 32 agtagctaat gatgugg 17 <210〉 33 <211> 12 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>經設計之嵌合寡核苷酸探針，命名為MiP4gl2探針，用於檢測經 增幅之一部分嗜肺性退伍軍人桿菌mi p基因。“核苷酸4為核糖核 苷酸-其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”。“5’末端用FAM標記，且 3’末端用Eel ipse標記”。 <400〉 33 aatggctgca ac 12

<210〉 34 <211〉 17 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223>經設計之寡核苷酸引子，命名為R2(_13)，用於增幅一部分嗜肺性 退伍軍人桿菌mi p基因。 97916.doc -14- 200532025 <400〉 34 ccaatgctat aagacaa 17 <210> 35 <211〉 29 <212〉 DNA <213>人工序列 <220> <223>經設計之寡核苷酸引子，命名為R2(-13)A12-1,用於增幅一部 分嗜肺性退伍軍人桿菌mi p基因。 <400〉 35 aacagctgca gtccaatgct ataagacaa 29

<210〉 36 <211〉 29 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223>經設計之寡核苷酸引子，命名為R2(-13)A12-2,用於增幅一部 分嗜肺性退伍軍人桿菌mi p基因。 <400〉 36 caccaatttc atccaatgct ataagacaa 29

<210> 37 <211〉 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> 97916.doc -15 - 200532025 <223〉經設計之寡核苷酸PCR引子，命名為c-Ki-ras/12F，用於增幅 —部分人類c-Ki-ras2基因。 <400> 37 gactgaatat aaacttgtgg 20 <210〉 38 <211〉 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223>經設計之寡核苷酸PCR引子，命名為rasTIR，用於增幅一部分人 類 c-Ki-ras2 基因。 <400〉 38 aaactattgt tggatcatat teg 23

<210〉 39 <211〉 25 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>經設計之寡核苷酸PCR引子，命名為rasT14F，用於增幅一部分人 類 c-Ki-ras2 基因。 <400> 39 gcgcggactg aatataaact tgtgg 25 97916.doc 16- 200532025 <213〉人工序列 <220〉 <223>經設計之寡核苷酸PCR引子，命名為rasT4R，用於增幅一部分 人類c-Ki-ras2基因。 <400> 40 aaacgcgcgc tattgttgga tcatattcg 29 <210〉 41 <211〉 20 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223>經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為C-Ki-raS/12FN3,用於增幅 —部分人類c-Ki-ras2基因。“核苷酸18至20為核糖核苷酸-其 它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”。 <400> 41 gactgaatat aaacttgugg 20 <210〉 42 <211〉 20 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223>經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為C-Ki-ras/12RN3,用於増幅一 部分人類c-Ki-ras2基因。“核苷酸18至20為核糖核苷酸-其它核苷 酸為脫氧核糖核苷酸”。 97916.doc 17- 200532025 <400〉 42 ctattgttgg atcatatucg 20

<210> 43 <211> 20 <212> DNA <213〉人工序列 〈220> <223〉經設計之寡核苷酸引子，命名為PJDBF，用於增幅一部分Neisseria gonorrhoeae cppB 基因。

<400〉 43 ctttgcttca atgcctcgtt 20 <210> 44 <211> 17 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223>經設計之寡核苷酸引子，命名為PJDBR，用於增幅一部分Neisseria gonorrhoeae cppB 基因。

<400〉 44 catcacgcac cgaagcc <210> 45 <211〉 20 <212> DNA <213>人工序列 97916.doc 18- <220〉 200532025 〈223>經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為PJDB0FM3,用於增幅一部 分 Neisseria gonorrhoeae cppB 基因。“核苷酸 18 至 20 為核 糖核苷酸-其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”。 <400> 45 ctttgcttca atgcctcguu 20 <210〉 46 <211〉 17 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223>經設計之嵌合寡核苷酸引子，命名為PJDB0RN3,用於增幅一部 分 Neisseria gonorrhoeae cppB 基因。“核苷酸 15 至 17 為核 糖核苷酸-其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”。 <400> 46 catcacgcac cgaagcc 口 <210> 47 <211〉 24 <212> DNA <213〉人工 <220〉

<223>經設計之寡核苷酸引子，命名為A6—215R，用於增幅一部分SARS 冠狀病毒基因組。 <400〉 47 aaacatcagc atctctagtt gcat u 97916.doc -19- 200532025 <210> 48 <211〉 27 <212> DNA 〈213〉人工 <220> <223>經設計之寡核苷酸引子，命名為A9-215R，用於增幅一部分SARS 冠狀病毒基因組。 <400> 48 aaacatattc agcatctcta gttgcat 27 <210〉 49 <211〉 36 <212〉 DNA <213〉人工 <220>

<223>經設計之寡核苷酸引子，命名為A18-205R,用於增幅一部分SARS 冠狀病毒基因組。 <400〉 49 aaacatatta gggtaaccag ttgcatgaca gcccto 36 97916.doc 20-

Claims (1)

1. 200532025 十、申請專利範圍： 1 · 一種核酸之增幅方法’其係用於增幅核酸者，其特徵在 於包含： (A)調製選自下述（a)或（b)之反應混合物的步驟 (a) 作為模板之核酸、三鱗酸去氧核糖核苷酸、具 有鏈取代活性之DNA聚合酶 '至少兩種嵌合寡核苷酸引 子、至少一種形成梯子形之募核苷酸引子以&RNaseH， (b) 作為模板之核酸、三磷酸去氧核糖核苷酸、具 有鏈取代活性之DNA聚合酶、至少兩種嵌合寡核苷酸引 子以及RNaseH，其中，-方嵌合募核㈣引子係作為形 成梯子形之寡核苷酸引子以發揮作用， 其中’上述嵌合募核苦酸引子含有至少選自去氧核糖 核普酸以及核苦酸類似物者與核糖核芽酸，該核糖核皆 酸配置於該引子3 ’末端或3，末端側， 上述喪合寡核苦酸引子至少含有兩種與作為模板之核 酸鹼基序列互補之第—嵌合寡核普酸引子，以及與作為 模板之核酸鹼基序列同源之第二嵌合募核苷酸引子， 上述形成梯子形之募核芽酸引子，其具有與作為模板 之核酸之該第一嵌合寡核苦酸引子互補性區域以及 與自該區域之3,側驗基序列互補之序列，並且於5 與作為模板之核酸同源㈣二嵌合寡㈣㈣子之: 驗基序列，相當於起始自與作為模板之核酸之 山 合养核普酸引子同源區域5，末端且更在5•側^ 鹼基序列或與其兩方互補之序列； 或之 97916.doc 200532025 以及 (B)於特定溫度條件下以生成梯子形狀增幅產物所需之 充足％間來培養反應混合物的步驟，於上述特定溫度條 件下可對作為模板之核酸的引子實施特異性黏接，利用 DNA聚合酶所實行之延伸鏈合成反應及鏈取代反應，以 及利用RNaseH所實行之延伸鏈切斷反應。 2·如請求項1之方法，其中作為模板之核酸係RNA，其係預 先以一磷酸去氧核糖核苷酸、具有逆轉錄活性之DNA聚 口酶以及至少一種形成梯子形之寡核苷酸引子處理該核 酸’而形成逆轉錄產物。 3. 如請求項1之方法，其中步驟（A)中之反應混合物更含有具 有逆轉錄活性之DNA聚合酶。 4. 士月长員2或3之方法，其中作為模板之核酸係mRNA。 5. 士月长員2或3之方法，其中具有逆轉錄活性與鏈取代活 性之一種DNA聚合酶，係作為具有逆轉錄活性之DNA聚 合_以及具有鏈取代活性之DNA聚合酶以發揮作用。 6. —種組合物，其特徵在於··其係使用於如請求項1之核酸 =增幅方法中的組成物，且分別含有至少一種嵌合募核 苷酉文引子以及/或者形成梯子形之寡核苷酸引子。 7· —種套組，其特徵在於：其係使用於如請求項丨之核酸之 曰巾田方法中的套組，且含有分別為至少一種之嵌合募核 苷酸引子以及/或者形成梯子形之寡核苷酸引子。 8· —種標的核酸之檢測方法，其特徵在於包含下述步驟·· (幻藉由如請求項丨之核酸之增幅方法，增幅標的核酸之 97916.doc 200532025 步驟；以及 (b)檢測藉由上述步驟所增幅之標的核酸之步驟。 9· 一種寡核苷酸引子，其特徵在於：其係使用於如請求項工 之核酸之增幅方法中之引子’且於5,側具有與作為模板之 核酸同源引子之5’側鹼基序列，相當於起始自與作為模板 之核酸之該第二嵌合募核苷酸引子同源區域5 ’末端且更 在5,側方向區域之鹼基序列或與其兩方互補之序列。 97916.doc