JPWO2005056790A1

JPWO2005056790A1 - 核酸の増幅方法

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Publication number: JPWO2005056790A1
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Inventors: 上森　隆司; 隆司上森; 理武田; 山本　純子; 純子山本; 向井　博之; 博之向井; 浅田　起代蔵; 起代蔵浅田; 加藤　郁之進; 郁之進加藤
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Filing date: 2004-12-06
Publication date: 2007-12-06
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Abstract

鋳型核酸中に実質的に同一配列が存在する場合に、その配列に挟まれた領域内にプライマーを設計することにより、ＩＣＡＮ反応においてターゲット領域が上記同一配列を介して同一方向に重合したラダー状産物ができる。さらにキメラオリゴヌクレオチドプライマーと特定の塩基配列を含むラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより、増幅産物を積極的にラダー状にすることでＩＣＡＮ反応の感度、増幅効率および反応速度を向上させることができる。

Description

本発明は、臨床分野において有用な標的核酸の検出方法及び遺伝子工学分野において有用なＤＮＡの合成方法に関し、鋳型となる核酸の増幅方法および該方法で増幅された標的核酸の検出方法に関する。

遺伝子工学分野の研究においてＤＮＡの合成は種々の目的に使用される。このうちオリゴヌクレオチドのような短鎖のＤＮＡの合成を除けば、そのほとんどはＤＮＡポリメラーゼを利用した酵素的方法により実施されている。
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）法は、次の増幅サイクルのための一本鎖標的分子を再生するために、高温から低温の反応を何回も繰り返す必要がある。このように温度によって反応が制約されるため、反応系は不連続な相またはサイクルで行なう必要がある。

従って、上記の方法には広い温度範囲で、かつ、厳密な温度調整を経時的に行なうことのできる高価なサーマルサイクラーを使用することが必要となる。また、該反応は、２種類〜３種類の温度条件で行なうための設定温度にするために要する時間が必要であり、そのロス時間はサイクル数に比例して増大していく。

そこで、上記問題点を解決すべく等温状態で実施可能な核酸増幅法が開発された。
等温で実施可能な方法としては、例えば、鎖置換型増幅（ＳＤＡ；ＳｔｒａｎｄＤｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（例えば、特許文献１参照）、ＲＣＡ（ＲｏｌｌｉｎｇＣｉｒｃｌｅＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（例えば、特許文献２参照）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌＡＭＰｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（例えば、特許文献３参照）、ＩＣＡＮ（ＩｓｏｔｈｅｒｍａｌａｎｄＣｈｉｍｅｒｉｃｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＮｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ）法（例えば、特許文献４参照）、あるいは種々の改良ＳＤＡ法（例えば、特許文献５〜８参照）等が挙げられる。

これらの等温核酸増幅法またはオリゴヌクレオチド合成法の反応においては、プライマーの伸長や、一本鎖伸長生成物（または元の標的配列）へのプライマーのアニーリングや、それに続くプライマーの伸長は、一定温度で保温された反応混合物中で同時に起こる。

上記特許文献１記載のＳＤＡ法は、ＤＮＡポリメラーゼと制限エンドヌクレアーゼを介する二本鎖の置換による、試料中の標的核酸配列（およびその相補鎖）の増幅法である。該方法では、増幅に使用するプライマーは４種類必要であり、その内の２種類は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含むように構築する必要がある。また、該方法では、ＤＮＡ合成のための基質として、修飾されたデオキシリボヌクレオチド３リン酸、例えばα位のリン酸基の酸素原子が硫黄原子（Ｓ）に置換された（α−Ｓ）デオキシリボヌクレオチド３リン酸を大量に用いる必要がある。

上記特許文献２記載のＲＣＡ法は、環状ＤＮＡを鋳型とした核酸増幅方法である。得られる増幅産物は、増幅領域が複数回繰り返された配列を有し、また、増幅産物が新たな鋳型として機能するため、最終的な増幅産物は、ブランチング（ｂｒａｎｃｈｉｎｇ）と呼ばれる分岐構造を有している。さらに、ＲＣＡ法に関連して、増幅効率を向上させるためには、副反応で生成するラダー状増幅産物を抑制することが重要であるという報告がある。（例えば、非特許文献１参照）

上記特許文献３記載のＬＡＭＰ法は、増幅に４種類のプライマーを必要とする。また、得られる増幅産物は、増幅の標的とされた領域が繰り返された、サイズの一定しないラダー状ＤＮＡである。当該ＤＮＡにおいてターゲット領域は、交互に方向が変わった状態で連結されている。

上記特許文献４記載のＩＣＡＮ法は、キメラオリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅方法である。

上記特許文献５記載の改良ＳＤＡ法は、ＲＮＡとＤＮＡから構成され、少なくとも３’末端にＤＮＡが配置された構造を必須要件とするキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＤＮＡ増幅方法である。

上記特許文献６記載の改良ＳＤＡ法は、３’突出末端を生じさせる制限酵素が必要である。

上記特許文献７記載の改良ＳＤＡ法は、少なくとも２組のプライマー対を必要とする。

上記特許文献８記載の改良ＳＤＡ法は、少なくとも２組のプライマーと少なくとも１種類の修飾デオキシリボヌクレオチド３リン酸を必要とする。

以上のように、等温核酸増幅法が開発されているが、これらの方法も、増幅効率、検出感度などの問題があった。そこで、この問題点を解決すべく、改良型等温核酸増幅法が開発された（例えば、特許文献９〜１１参照）。

特許文献９記載の方法は、逆転写プライマーもしくは核酸増幅用プライマーの５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモータもしくはその一部を付加し、さらにその５’末端に少なくとも５塩基を含む任意のオリゴヌクレオチドを付加したプライマー、および該プライマーの上流領域もしくは該プライマーのＲＮＡポリメラーゼプロモータ部位にアニーリングする第３のプライマーを用いた核酸増幅方法である。

特許文献１０記載の方法は、少なくとも２種の相補的プライマーを用いた核酸増幅方法、および少なくとも２種類のプライマー対を用いた核酸増幅方法である。
該方法は、複数のプライマーもしくはプライマー対を用いることにより、増幅産物の生成量を向上させる方法であり、生成量を向上させるためにはより多くのプライマーもしくはプライマー対を用いる必要がある。

特許文献１１記載の方法は、特許文献１２記載の方法において、キメラオリゴヌクレオチドプライマー、および鋳型となる核酸の該プライマーがハイブリダイズする位置の３’側にハイブリダイズする上流オリゴヌクレオチドプライマーとを組合わせて使用する方法である。
該方法において、ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーは鋳型鎖にハイブリダイズする配列のみからなる。

このように、従来の等温核酸増幅法はまだまだ種々の問題をかかえており、効率よく、高感度でできる方法が求められていた。

特公平７−１１４７１８号公報国際公開第９７／１９１９３号パンフレット国際公開第００／２８０８２号パンフレット国際公開第００／５６８７７号パンフレット米国特許番号第５，８２４，５１７号明細書国際公開第９９／０９２１１号パンフレット国際公開第９５／２５１８０号パンフレット国際公開第９９／４９０８１号パンフレット国際公開第９５／０３４２６号パンフレット国際公開第９５／２５１８０号パンフレット特開２００３−５２３８０号公報ＨａｆｎｅｒＧ．Ｊ．他４名、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｖｏｌ．３０（２００１）ｐ８５２−８６７

本発明の主な目的は、試料中の標的核酸の高感度、特異的に増幅する標的核酸の増幅方法、これらの方法のための組成物およびキットを提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究した。その結果、鋳型核酸中に実質的に同一配列が存在する場合に、その配列に挟まれた領域内にプライマーを設計することにより、ＩＣＡＮ反応においてターゲット領域が上記同一配列を介して同一方向に重合したラダー状産物ができることを見出した。さらにキメラオリゴヌクレオチドプライマーと特定の塩基配列を含むラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより、増幅産物を積極的にラダー状にすることでＩＣＡＮ反応の感度、増幅効率および反応速度を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明の第１の発明は、核酸を増幅する方法において、
（Ａ）下記（ａ）又は（ｂ）から選択される反応混合物を調製する工程、
（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも１種類のラダー形成オリゴヌクレオチドプライマー、およびＲＮａｓｅＨ、
（ｂ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、およびＲＮａｓｅＨ、ここで、一方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーはラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーとして作用し、
ここで、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されており、
上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に相補的な第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと、鋳型となる核酸の塩基配列に相同的な第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも２種類を含んでおり、
上記ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型となる核酸の当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領域および／またはその領域より３’側の塩基配列に相補的な配列を有し、鋳型となる核酸と相同的な第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側の塩基配列、鋳型となる核酸の当該第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相同な領域の５’末端よりさらに５’側方向の領域に相当する塩基配列あるいはその両方に相補的な配列を５’側に有し、
および
（Ｂ）鋳型となる核酸へのプライマーの特異的なアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長鎖合成反応及び鎖置換反応、並びにＲＮａｓｅＨによる伸長鎖の切断反応が行える一定の温度条件でラダー状増幅産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートする工程、
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法に関する。

本発明の第１の発明において、鋳型となる核酸はＲＮＡであり、当該核酸をあらかじめデオキシリボヌクレオチド３リン酸、逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及び少なくとも１種類のラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーで処理し、逆転写産物としてもよい。

本発明の第１の発明において、工程（Ａ）における反応混合物は、さらに逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含有してもよい。

本発明の第１の発明において、鋳型となる核酸は、ｍＲＮＡであってもよい。

本発明の第１の発明において、逆転写活性と鎖置換活性とを有する１つのＤＮＡポリメラーゼを用いてもよい。

本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明の方法のための組成物であって、それぞれ少なくとも１種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び／又はラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーを含有する組成物に関する。

本発明の第３の発明は、本発明の第１の発明のためのキットであって、それぞれ少なくとも１種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び／又はラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーを含有するキットに関する。

本発明の第４の発明は、下記工程を包含することを特徴とする標的核酸の検出方法に関する。
（ａ）本発明の第１の方法により、標的核酸を増幅する工程；および、
（ｂ）上記工程により増幅された標的核酸を検出する工程。

本発明の第５の発明は、本発明の第１の発明の方法に用いるプライマーであって、鋳型となる核酸と相同的なプライマーの５’側の塩基配列、鋳型となる核酸の当該第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相同な領域の５’末端よりさらに５’側方向の領域に相当する塩基配列あるいはその両方に相補的な配列を５’側に有することを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマーに関する。

本発明により、従来の等温核酸増幅方法より優れた増幅方法、該方法に用いるためのプライマーを含む組成物およびキットが提供される。

実施例２−（１）−（Ａ）にて使用している第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー、第二オリゴヌクレオチドプライマー、ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの位置関係に関する図である。（ａ）は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー、（ｂ）〜（ｄ）はラダー形成オリゴヌクレオチドプライマー、（ｅ）は第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーを示す。（ｂ）〜（ｄ）において、１の部分は（ｅ）の５’上流の相補鎖の１と相同な配列を有する。各コピー数における増幅曲線を示す図である。図２において、横軸は反応サイクル数を、縦軸は蛍光強度を示す。図２において、ａは１０^５コピー数、ｂは１０^４コピー数、ｃは１０^３コピー数、ｄは１０^２コピー数、ｅは１０^１コピー数、ｆは１０^０コピー数の鋳型を用いた場合の増幅曲線である。

本明細書においてデオキシリボヌクレオチド（本明細書中ではｄＮとも記載する）とは、糖部分がＤ−２−デオキシリボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、例えば、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、チミンを有するものが挙げられる。さらに、７−デアザグアノシン等の修飾塩基を有するものや、あるいは固定化に使用できるような官能基を有するデオキシリボヌクレオチドやデオキシイノシンヌクレオチドのようなデオキシリボヌクレオチドアナログも上記のデオキシリボヌクレオチドに包含される。

本明細書においてリボヌクレオチド（本明細書中ではＮとも記載する）とは、糖部分がＤ−リボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、ウラシルを有するものが挙げられる。さらに、当該リボヌクレオチドには修飾リボヌクレオチドが包含され、例えばα位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子（Ｓ）に置き換えた修飾リボヌクレオチド［（α−Ｓ）リボヌクレオチド、（α−Ｓ）Ｎとも記載する］やこの他の誘導体等も含まれる。

本明細書においてキメラオリゴヌクレオチドプライマーとは、該プライマーの３’末端又は３’末端側にリボヌクレオチドを配置し、本発明の方法において核酸鎖が伸長でき、ＲＮａｓｅＨで切断でき、鎖置換反応を行うことができるオリゴヌクレオチドプライマーのことをいい、該構成を有するものであれば、いずれもが本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーに包含される。
本発明に使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーである。該プライマーには未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドを含有するオリゴリボヌクレオチドプライマーも含まれる。
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列の一部に実質的に相補的な塩基配列を有する。なお、ここで「実質的に相補的な塩基配列」とは、使用される反応条件において鋳型となるＤＮＡにアニーリング可能な塩基配列を意味する。

本明細書において３’側とは、核酸、例えば、プライマーにおいてその中央より３’末端にかけての部分をいう。同様に、５’側とは、核酸においてその中央より５’末端にかけての部分をいう。

本明細書において上流領域とは、使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーと相同的な鋳型鎖において該キメラオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列の５’末端よりさらに５’側方向の領域のことを言う。従って、該鋳型鎖の相補鎖から見ると、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列に相補的な配列の３’末端よりさらに３’側方向の領域に相当する。

また、本明細書においてラダー形成のための塩基配列とは、本発明の方法に用いるキメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側の塩基配列、鋳型となる核酸の当該キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相同な領域の５’末端よりさらに上流領域（すなわち、５’側方向の領域）に相当する塩基配列あるいはその両方に相補的な塩基配列のことを言う。

本明細書においてラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーとは、当該プライマーの５’側に上記ラダー形成のための塩基配列を含むもののことを言う。

本明細書において塩基配列の位置は、本発明の方法に用いるキメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端およびその位置に対する該キメラオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングする鋳型鎖の位置を「０」とし、該キメラオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側へ向けて順次整数で「＋１」、「＋２」、・・・とする。また、該鋳型となる核酸の「０」位置より１塩基上流を「−１」とし、上流へ向けて順次整数で「−２」、「−３」、・・・とする。

本明細書においてＲＮａｓｅＨ（リボヌクレアーゼＨ）とは、鋳型核酸にアニーリングした上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーよりＤＮＡの伸長を行って生成した二本鎖ＤＮＡに作用して、該プライマーのリボヌクレオチド部分を特異的に切断するものであればよい。

本明細書においてＤＮＡポリメラーゼとは、ＤＮＡ鎖を鋳型として新たなＤＮＡ鎖を合成する酵素（ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）およびＲＮＡ鎖を鋳型として該ＲＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖を合成する酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）のことをいい、天然型のＤＮＡポリメラーゼの他、前記活性を有する変異体酵素も包含される。当該酵素としては、例えば鎖置換（Ｓｔｒａｎｄｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有していないＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素活性やＲＮａｓｅＨ活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。

本明細書において「鎖置換活性」とは、鋳型となる核酸配列に従ってＤＮＡ複製を行う際、ＤＮＡ鎖を置き換えながら進行し、鋳型鎖にアニーリングしている相補鎖を遊離させる、即ち鎖置換（ｓｔｒａｎｄｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）することができる活性のことをいう。また、本明細書においては、鎖置換により鋳型となる核酸配列から遊離したＤＮＡ鎖のことを「置換鎖」と称する。

本明細書において「逆転写活性」とは、ＲＮＡ鎖を鋳型として該ＲＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖を合成することができる活性のことをいう。

（１）本発明の標的核酸の増幅方法
本発明の方法は、キメラオリゴヌクレオチドプライマー及びラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ少なくとも１種類使用し、さらにＲＮａｓｅＨおよびＤＮＡポリメラーゼを組み合わせて実施することができる。また、ＲＮａｓｅＨ活性を有するＤＮＡポリメラーゼをＲＮａｓｅＨ活性が発現するような条件で使用することができる。

本発明の方法により、等温条件下において、連続的に核酸が増幅される。ここで、「連続的に」とは、反応温度、反応液組成の変更を伴わずに反応が進行していることを意味する。また、「等温」とは、酵素および核酸鎖が下記各工程において機能する、実質的に一定の温度条件のことを意味する。

本発明の標的核酸の増幅方法の一態様としては、
（ａ）鋳型となる核酸をデオキシリボヌクレオチド３リン酸、逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、及び少なくとも１種類のラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーで処理し、逆転写産物を得る工程、
（ｂ）上記逆転写産物を鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、およびＲＮａｓｅＨを混合して反応混合物を調製する工程、および、
（ｃ）上記ＤＮＡポリメラーゼによる伸長鎖合成反応及び鎖置換反応、並びにＲＮａｓｅＨによる伸長鎖の切断反応が行える一定の温度条件でラダー状増幅産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートする工程、
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法が例示される。
ここで、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されており、
上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に相補的な第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと、鋳型となる核酸の塩基配列に相同的な第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも２種類を含んでおり、
上記ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型となる核酸の当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領域およびその領域より３’側の塩基配列に相補的であり、鋳型となる核酸と相同的な第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側の塩基配列、鋳型となる核酸の当該第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相同な領域の５’末端よりさらに上流領域（すなわち、５’側方向の領域）に相当する塩基配列あるいはその両方に相補的な塩基配列を５’側に有する。

また、本発明の別態様としては、
（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも１種類のラダー形成オリゴヌクレオチドプライマー、およびＲＮａｓｅＨを混合して反応混合物を調製する工程、および、
（ｂ）鋳型となる核酸へのプライマーの特異的なアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長鎖合成反応及び鎖置換反応、並びにＲＮａｓｅＨによる伸長鎖の切断反応が行える一定の温度条件でラダー状増幅産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートする工程、
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法が例示される。
ここで、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されており、
上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に相補的な第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと、鋳型となる核酸の塩基配列に相同的な第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも２種類を含んでおり、
上記ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型となる核酸の当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領域およびその領域より３’側の塩基配列に相補的であり、鋳型となる核酸と相同的な第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側の塩基配列、鋳型となる核酸の当該第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相同な領域の５’末端よりさらに上流領域（すなわち、５’側方向の領域）に相当する塩基配列あるいはその両方に相補的な塩基配列を５’側に有する。

さらに本発明の別態様としては、
（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも１種類のラダー形成オリゴヌクレオチドプライマー、およびＲＮａｓｅＨを混合して反応混合物を調製する工程、および、
（ｂ）鋳型となる核酸へのプライマーの特異的なアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長鎖合成反応及び鎖置換反応、並びにＲＮａｓｅＨによる伸長鎖の切断反応が行える一定の温度条件でラダー状増幅産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートする工程、
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法が例示される。
ここで、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されており、
上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に相補的な第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと、鋳型となる核酸の塩基配列に相同的な第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも２種類を含んでおり、
上記ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型となる核酸の当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領域およびその領域より３’側の塩基配列に相補的であり、鋳型となる核酸と相同的な第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側の塩基配列、鋳型となる核酸の当該第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相同な領域の５’末端よりさらに上流領域（すなわち、５’側方向の領域）に相当する塩基配列あるいはその両方に相補的な塩基配列を５’側に有する。

上記態様において、鋳型となる核酸が１本鎖の場合、第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、当該鎖に相補的な塩基配列を有する。また、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、当該鎖の相補鎖に相補的、即ち当該鎖に相同的な塩基配列を有する。さらにラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーは、当該鎖に相補的な塩基配列及び当該鎖に相同な第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側の塩基配列、当該第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端よりさらに上流領域に相当する塩基配列あるいはその両方に相補的な塩基配列を５’側に有する。また、鋳型となる核酸が２本鎖の場合でも、いずれか一方の鎖において同様にプライマーを設計することができることは言うまでもない。

上記態様のいずれにおいても、ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーをキメラオリゴヌクレオチドプライマーに置き換えても良く、この場合ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの機能を当該キメラオリゴヌクレオチドプライマーが補うことができる。すなわち、ラダー形成に寄与することができるならば、オリゴヌクレオチドプライマー及び／又はキメラオリゴヌクレオチドプライマーのいずれもが好適に使用できる。
特に限定はされないが例えば、ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーとして第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用することができる。この場合、第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型となる核酸と相同的な第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側の塩基配列、当該第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端よりさらに上流領域に相当する塩基配列あるいはその両方に相補的な塩基配列を５’側に有している。

当該方法では、伸長反応の基質となるヌクレオチド３リン酸としてＰＣＲ法等に使われるｄＮＴＰ、すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物が好適に使用できる。また、ｄＵＴＰを基質として用いてもよい。さらに、当該ｄＮＴＰは、使用されるＤＮＡポリメラーゼの基質となる限りにおいては、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸）のアナログ、たとえば７−デアザ−ｄＧＴＰ、ｄＩＴＰ等のヌクレオチド３リン酸を含んでいてもよい。また、ｄＮＴＰあるいはｄＮＴＰアナログの誘導体を使用してもよく、官能基を有する誘導体、例えばアミノ基を有するｄＵＴＰを含んでいてもよい。当該方法では、キメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用するが、当該プライマーは、例えば、ＤＮＡ合成機等を用いて通常の合成方法と同様に調製することができる。

本発明の方法において鋳型となる核酸、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡは、当該核酸を含む可能性のあるあらゆる試料から調製、あるいは単離したものでもよい。さらに、上記試料を直接、本発明の核酸増幅反応に使用してもよい。このような核酸を含む試料には特に限定はないが、例えば、全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織（例えば、癌組織、リンパ節等）、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞培養物、細菌培養物等）のような生体由来試料、ウイロイド、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のような核酸含有試料、ウイルス又は細菌のような微生物が混入もしくは感染している可能性のある試料（食品、生物学的製剤等）、あるいは土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料が挙げられる。また、前記試料等を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物であっても良い。該調製物としては、例えば細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中の核酸、あるいは特定の核酸分子群、例えば、ｍＲＮＡを富化した試料等が本発明に使用できる。さらに上記試料中に含まれる核酸が公知方法で増幅されたＤＮＡあるいはＲＮＡ等の核酸等も好適に使用できる。

これら材料からの核酸含有調製物の調製には特に限定はなく、例えば、界面活性剤による溶解処理、超音波処理、ガラスビーズを用いた振盪攪拌、フレンチプレスの使用等により行うことができる。幾つかの例においては、さらに操作を加えて核酸を精製することが有利である（例えば、内在性ヌクレアーゼが存在するとき）。これらの例において、核酸の精製はフェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動または密度勾配遠心分離等の公知方法により実施される。

ＲＮＡ由来の配列を有する核酸を増幅したい場合には、当該ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡを鋳型として本発明の方法を実施すればよい。本発明の方法に適用することができるＲＮＡには、逆転写反応に使用されるプライマーが作製可能なものであれば特に制限はなく、試料中の全ＲＮＡの他、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等のＲＮＡ分子群、あるいは特定のＲＮＡ分子種が挙げられる。

上記の逆転写反応に使用される酵素としては、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定はなく、例えばトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（Ｍ−ＭＬＶＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用することもできる。また、本発明の目的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素が好適であり、例えばサーマス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ等）、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ等を使用できる。特に限定はないが、例えば、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼが好ましく、Ｂ．ｓｔ由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ）、さらにＢｃａＤＮＡポリメラーゼが好ましい。例えば、ＢｃａＤＮＡポリメラーゼは、逆転写反応にマンガンイオンを必要とせず、また、高温条件下で鋳型ＲＮＡの二次構造形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することができる。上記の逆転写酵素活性を有する酵素も、当該活性を有している範囲において天然体、変異体のいずれもが使用できる。

本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、特に限定するものではないが、好ましくは約６〜約５０塩基、さらに好ましくは約１０〜約４０塩基、特に好ましくは約１２〜約３０塩基のオリゴヌクレオチドが本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーとして使用される。その塩基配列は使用される反応条件において鋳型核酸にアニーリングするように、鋳型核酸に相補的な配列であることが好ましい。該プライマーは、後に示す段階で使用されるＲＮａｓｅＨにより認識される配列を３’末端又は３’末端側に含む。

本発明を何ら限定するものではないが、例えば、下記一般式で表す構造をもつオリゴヌクレオチドを本発明のＤＮＡ合成方法にプライマーとして使用することができる。
一般式：５’−ｄＮａ−Ｎｂ−ｄＮｃ−３’
（上記一般式において、ｄＮ：デオキシリボヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ、Ｎ：未修飾リボヌクレオチド及び／又は修飾リボヌクレオチド、なお上記の各ヌクレオチドはその機能を損なわない範囲でヌクレオチドのアナログや誘導体（修飾ヌクレオチド）を含有していてもよく、ｄＮａ部位の一部のｄＮはＮで置換されていてもよい。）
上記一般式において、特に限定はされないが、例えば、ａは５以上の整数であればよく、好ましくは６以上の整数、さらに好ましくは８以上の整数である。また、ｂは１以上の整数であればよく、例えば１〜１５の範囲、好ましくは１〜１０の範囲、さらに好ましくは１〜７の範囲、特に好ましくは１〜５の範囲である。さらにｃは０であってもよく、あるいは１以上の整数であり、好ましくは０〜５の範囲、さらに好ましくは０〜３の範囲である。

本発明の方法において、ラダー状増幅産物を得るためにラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーを使用しても良く、当該プライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドあるいはヌクレオチドアナログから選択されるものが好適に使用できる。

本発明の方法において使用されるラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型となる核酸と相同的な第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側の塩基配列あるいは当該第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端よりさらに上流領域に相当する塩基配列あるいはその両方に相補的な塩基配列を５’側に付加されたものが好適に使用できる。

本発明において、ＲＮＡを鋳型とする場合には、ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーを逆転写プライマーとして使用しても良く、使用される反応条件において鋳型ＲＮＡにアニールするものであれば特に限定されるものではない。該プライマーは、特定の鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するプライマー（特異的プライマー）の他、オリゴｄＴ（デオキシチミン）プライマーやランダムな配列を有するプライマー（ランダムプライマー）であっても良い。当該ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーにおいて、鋳型となる核酸の塩基配列の一部と相補的な配列の部分の長さは、特異的なアニーリングを行う観点から、好ましくは６ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは９ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは１００ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは３０ヌクレオチド以下である。すなわち、ＲＮＡからの逆転写反応に使用できるものであれば特に限定はない。

当該ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーは、使用される条件において、ラダー状ＤＮＡ鎖の伸長に寄与することができるものであれば得に限定はされない。当該プライマーは、鋳型となる核酸と相同的なキメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側の塩基配列あるいは当該キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端よりさらに上流領域に相当する塩基配列あるいはその両方に相補的な塩基配列を有しているものが好ましく、キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域と相補的な配列は、特に何ら限定するものではないが、好ましくは約３〜約１００ヌクレオチド、さらに好ましくは約４〜約５０ヌクレオチド、特に好ましくは約５〜約２０ヌクレオチドの塩基長である。

また、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域と相補的な配列は、特に何ら限定するものではないが、＋２０〜−１００位置から選択される３塩基以上の配列、好ましくは＋１５〜−８０位置から選択される３塩基以上の配列、さらに好ましくは＋１０〜−６０位置から選択される３塩基以上の配列、特に好ましくは＋５〜−４０位置から選択されるから選択される３塩基以上の配列である。当該塩基配列としては、特に限定はされないが例えば、−１位置、−１１位置、−２１位置から始まる領域が挙げられる。

当該ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーは、その機能を発揮できる限り、アニーリングする位置は特に何ら限定はなく、キメラオリゴヌクレオチドプライマーと全てもしくは１塩基以上重複する位置、隣接する位置、１〜４０塩基離れた位置のいずれでもよい。

また、当該ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーのＧＣ含量は、特に限定はされないが、４０％以上の範囲が好適である。

さらに本発明の方法において使用されるラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーは、ヌクレオチドアナログやその他の物質を含有するものであってもよい。すなわち、本発明のラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーには、ＤＮＡポリメラーゼがその３’末端からポリメラーゼ伸長反応せしめる、プライマーの機能を失わない範囲で１以上のヌクレオチドアナログを含有させることができ、さらに、当該ヌクレオチドアナログは複数の種類のものを組合せて使用することができる。該ヌクレオチドアナログとしては、特に限定はされないが、例えば、デオキシイノシンヌクレオチド、デオキシウラシルヌクレオチドあるいは７−デアザグアニンのような修飾塩基を有するヌクレオチドアナログ、リボースの誘導体を有するヌクレオチドアナログ等を使用することができる。また、本発明に使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、上記の機能を保持する範囲内で種々の修飾、例えば標識化合物等の付加、あるいは、固定化用の官能基の付加がなされたデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログを含有してもよい。
ヌクレオチドアナログのプライマーへの導入は、プライマー自身の高次構造形成の抑制、鋳型とのアニーリング形成の安定化の観点からも有効である。

本発明の方法で用いられるキメラオリゴヌクレオチドプライマーおよびラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーは、任意の核酸配列を持つように、例えばアプライドバイオシステムズ社（ＡＢＩ社、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであっても良い。

さらに本発明の別態様としては、
鋳型となる核酸に本来存在している塩基配列を利用してラダー状増幅産物を得ることができる。この場合ラダー形成は、鋳型となる核酸上にある塩基配列を利用して実施することができる。特に限定はされないが例えば、設定しようとする一方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側あるいはその上流にある塩基配列が、設定しようとするもう一方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側あるいはその上流にある塩基配列と相補的である場合、上記配置でキメラオリゴヌクレオチドプライマーを設定することにより、効率よくラダー状増幅産物を得ることができる。また、ラダー形成を行うことにより、検出感度および検出速度が向上する。

上記鋳型となる核酸上の双方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側あるいはその上流にある、相補的な塩基配列は、そのＧＣ含量、その近接する配列、プライマーとの距離、増幅される長さ、反応条件等によって任意に設定することができ、特に限定するものではないが、例えば３塩基以上、好ましくは６塩基以上の相補的な塩基配列から選択することが好ましい。また当該配列は、特に限定するものではないが、例えば上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端を０位とした場合、＋２０〜−１００の領域、好ましくは＋１５〜−８０の領域、さらに好ましくは＋１０〜−６０の領域、特に好ましくは＋５〜−４０の領域である。
さらに鋳型となる核酸上の双方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側、あるいはその上流にある相補的な配列は、そのＧＣ含量、その近接する配列、プライマーとの距離、増幅される長さ、反応条件等によって任意に設定することができ、特に限定するものではないが、７０％の以上の相補性の範囲が好適である。

本発明の方法で使用されるラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーを何ら限定するものではないが、後述の実施例にて用いているラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの構成を例として説明する。

例えば、Ａ１２−２０５Ｒ（配列表の配列番号３）の１〜１２番目の塩基は第二キメラオリゴヌクレオチドプライマー（１３４ＦＮ３（１８）；配列表の配列番号７）の５’末端より１〜１２塩基上流領域（−１〜−１２）に相補的な塩基配列であり、さらに１３〜３０番目の塩基は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（２０５ＲＮ３（１８）；配列表の配列番号２）と相補的な領域に相補的な配列である。言い換えれば、当該１３〜３０番目の塩基は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相同な配列である。

例えば、Ａ１２−２１５Ｒ（配列表の配列番号５）の１〜１２番目の塩基は第二キメラオリゴヌクレオチドプライマー（１３４ＦＮ３（１８）；配列表の配列番号７）の５’末端より１〜１２塩基上流領域（−１〜−１２）に相補的な塩基配列であり、さらに１３〜３０番目の塩基は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（２０５ＲＮ３（１８）；配列表の配列番号２）の５’側８塩基と相補的な領域および当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領域より３’側１０塩基の配列と相補的な配列である。言い換えれば、当該１３〜３０番目の塩基は、当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流１０塩基目から当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側８塩基の配列と相同である。Ａ１２−２１５Ｒの２３〜３０番目の塩基は２０５ＲＮ３（１８）の１〜８番目の塩基と重複している。

例えば、Ａ１２−２２３Ｒ（配列表の配列番号５）の１〜１２番目の塩基は第二キメラヌクレオチド（１３４ＦＮ３（１８）；配列表の配列番号７）の５’末端より１〜１２塩基上流領域（−１〜−１２）に相補的な塩基配列であり、さらに１３〜３０番目の塩基は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（２０５ＲＮ３（１８）；配列表の配列番号２）と相補的な領域より３’側１８塩基の配列と相補的な配列である。言い換えれば、当該１３〜３０番目の塩基は当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流１８塩基目から上流１塩基目の配列と相同である。Ａ１２−２２３Ｒと２０５ＲＮ３（１８）は隣接している。

例えば、Ａ１２（−１０）−２１５Ｒ（配列表の配列番号８）の１〜１２番目の塩基は第二キメラオリゴヌクレオチドプライマー（１３４ＦＮ３（１８）；配列表の配列番号７）の５’末端より１１〜２２塩基上流領域（−１１〜−２２）に相補的な塩基配列であり、さらに１３〜３０番目の塩基は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（２０５ＲＮ３（１８）；配列表の配列番号２）の５’側８塩基と相補的な領域および当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領域より３’側１０塩基の配列と相補的な配列である。言い換えれば、当該１３〜３０番目の塩基は、当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流１０塩基目から当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側８塩基の配列と相同である。Ａ１２（−１０）−２１５Ｒの２３〜３０番目の塩基は２０５ＲＮ３（１８）の１〜８番目の塩基と重複している。

例えば、Ａ１２（−２０）−２１５Ｒ（配列表の配列番号９）の１〜１２番目の塩基は第二キメラオリゴヌクレオチドプライマー（１３４ＦＮ３（１８）；配列表の配列番号７）の５’末端より２１〜３２塩基上流領域（−２１〜−３２）に相補的な塩基配列であり、さらに１３〜３０番目の塩基は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（２０５ＲＮ３（１８）；配列表の配列番号２）の５’側８塩基と相補的な領域および当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領域より３’側１０塩基の配列と相補的な配列である。言い換えれば、当該１３〜３０番目の塩基は、当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流１０塩基目から当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側８塩基の配列と相同である。Ａ１２（−２０）−２１５Ｒの２３〜３０番目の塩基は２０５ＲＮ３（１８）の１〜８番目の塩基と重複している。

例えば、Ａ１２（６）−２１５Ｒ（配列表の配列番号１０）の１〜１２番目の塩基は第二キメラオリゴヌクレオチドプライマー（１３４ＦＮ３（１８）；配列表の配列番号７）の５’末端側６塩基（＋５〜０）および５’末端より１〜６塩基上流領域（−１〜−６）に相補的な塩基配列であり、さらに１３〜３０番目の塩基は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（２０５ＲＮ３（１８）；配列表の配列番号２）の５’側８塩基と相補的な領域および当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領域より３’側１０塩基の配列と相補的な配列である。言い換えれば、当該１３〜３０番目の塩基は、当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流１０塩基目から当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側８塩基の配列と相同である。Ａ１２（６）−２１５Ｒの２３〜３０番目の塩基は２０５ＲＮ３（１８）の１〜８番目の塩基と重複している。

例えば、Ａ１２（１２）−２１５Ｒ（配列表の配列番号１１）の１〜１２番目の塩基は第二キメラオリゴヌクレオチドプライマー（１３４ＦＮ３（１８）；配列表の配列番号７）の５’末端側１２塩基（＋１１〜０）に相補的な塩基配列であり、さらに１３〜３０番目の塩基は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（２０５ＲＮ３（１８）；配列表の配列番号２）の５’側８塩基と相補的な領域および当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領域より３’側１０塩基の配列と相補的な配列である。言い換えれば、当該１３〜３０番目の塩基は、当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流１０塩基目から当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側８塩基の配列と相同である。Ａ１２（１２）−２１５Ｒの２３〜３０番目の塩基は２０５ＲＮ３（１８）の１〜８番目の塩基と重複している。

例えば、Ａ６（−１０）−２１５Ｒ（配列表の配列番号１４）の１〜６番目の塩基は第二キメラオリゴヌクレオチドプライマー（１３４ＦＮ３（１８）；配列表の配列番号７）の５’末端より１１〜１６塩基上流領域（−１１〜−１６）に相補的な塩基配列であり、さらに７〜２４番目の塩基は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（２０５ＲＮ３（１８）；配列表の配列番号２）の５’側８塩基と相補的な領域および当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領域より３’側１０塩基の配列と相補的な配列である。言い換えれば、当該７〜２４番目の塩基は、当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流１０塩基目から当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側８塩基の配列と相同である。Ａ６（−１０）−２１５Ｒの１７〜２４番目の塩基は２０５ＲＮ３（１８）の１〜８番目の塩基と重複している。

例えば、Ａ９（−１０）−２１５Ｒ（配列表の配列番号１５）の１〜９番目の塩基は第二キメラオリゴヌクレオチドプライマー（１３４ＦＮ３（１８）；配列表の配列番号７）の５’末端より１１〜１９塩基上流領域（−１１〜−１９）に相補的な塩基配列であり、さらに１０〜２７番目の塩基は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（２０５ＲＮ３（１８）；配列表の配列番号２）の５’側８塩基と相補的な領域および当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領域より３’側１０塩基の配列と相補的な配列である。言い換えれば、当該１０〜２７番目の塩基は、当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流１０塩基目から当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側８塩基の配列と相同である。Ａ９（−１０）−２１５Ｒの２０〜２７番目の塩基は２０５ＲＮ３（１８）の１〜８番目の塩基と重複している。

例えば、（Ａ１２）２４１ＲＮ３（配列表の配列番号１９）の１〜７番目の塩基は第二キメラオリゴヌクレオチドプライマー（１６０ＦＮ３；配列表の配列番号１７）の５’末端より１〜７塩基上流領域（−１〜−７）に相補的な塩基配列であり、さらに８〜２１番目の塩基は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（２４１ＲＮ３；配列表の配列番号１８）と相補的な領域に相補的な配列である。言い換えれば、当該８〜２１番目の塩基は、当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相同である。

例えば、ＡＬＤＨ２−ＴＨ１（配列表の配列番号２５）の１〜１２番目の塩基は第二キメラオリゴヌクレオチドプライマー（ＩＣＡＮ−ＡＬＤＨ２−Ｆ；配列表の配列番号２１）の５’末端より１〜１２塩基上流領域（−１〜−１２）に相補的な塩基配列であり、さらに１３〜２９番目の塩基は鋳型とある核酸の第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（ＩＣＡＮ−ＡＬＤＨ２−Ｒ；配列表の配列番号２２）の５’側１５塩基と相補的な領域および当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領域より３’側２塩基の配列と相補的な配列である。言い換えれば、当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流２塩基目から当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側１５塩基の配列と相同である。ＩＣＡＮ−ＡＬＤＨ２−Ｒの２〜１６番目の塩基はＡＬＤＨ２−ＴＨ１の１５〜２９番目の塩基と重複している。

例えば、ＡＬＤＨ２−ＴＨ２（配列表の配列番号２６）の１〜１２番目の塩基は第二キメラオリゴヌクレオチドプライマー（ＩＣＡＮ−ＡＬＤＨ２−Ｆ；配列表の配列番号２１）の５’末端より１〜１２塩基上流領域（−１〜−１２）に相補的な塩基配列であり、さらに１３〜２９番目の塩基は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（ＩＣＡＮ−ＡＬＤＨ２−Ｒ；配列表の配列番号２２）の５’側６塩基と相補的な領域および当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領域より３’側１０塩基の配列と相補的な配列である。言い換えれば、当該１３〜２９番目の塩基は当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流１０塩基目から当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側６塩基の配列と相同である。ＩＣＡＮ−ＡＬＤＨ２−Ｒの２〜７番目の塩基はＡＬＤＨ２−ＴＨ２の２３〜２８番目の塩基と重複している。

例えば、ＡＬＤＨ２−ＴＨ３（配列表の配列番号２７）の１〜１２番目の塩基は第二キメラオリゴヌクレオチドプライマー（ＩＣＡＮ−ＡＬＤＨ２−Ｆ；配列表の配列番号２１）の５’末端より１〜１２塩基上流領域（−１〜−１２）に相補的な塩基配列であり、さらに１３〜２８番目の塩基は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（ＩＣＡＮ−ＡＬＤＨ２−Ｒ；配列表の配列番号２２）と相補的な配列より２〜１７塩基３’側の塩基配列と相補的な配列である。言い換えれば、当該１３〜２８番目の塩基は当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流２〜１７塩基目の配列と相同である。

例えば、Ｒ２（−１３）Ａ１２−１（配列表の配列番号３５）の１〜１２番目の塩基は第二キメラオリゴヌクレオチドプライマー（Ｆ２；配列表の配列番号３１）の５’末端より１〜１２塩基上流領域（−１〜−１２）に相補的な塩基配列であり、さらに１３〜２９番目の塩基は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（Ｒ２；配列表の配列番号３２）と相補的な配列より１３〜２９塩基３’側の塩基配列と相補的な配列である。言い換えれば、当該１３〜２９番目の塩基は当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流１３〜２９塩基目の配列と相同である。

例えば、Ｒ２（−１３）Ａ１２−２（配列表の配列番号３６）の１〜１２番目の塩基は第二キメラオリゴヌクレオチドプライマー（Ｆ２；配列表の配列番号３１）の５’末端より１３〜２４塩基上流領域（−１３〜−２４）に相補的な塩基配列であり、さらに１３〜２９番目の塩基は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（Ｒ２；配列表の配列番号３２）と相補的な配列より１３〜２９塩基３’側の塩基配列と相補的な配列である。言い換えれば、当該１３〜２９番目の塩基は当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流１３〜２９塩基目の配列と相同である。

例えば、Ａ６−２１５Ｒ（配列表の配列番号４７）の１〜６番目の塩基は第二キメラオリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ１３４ＦＮ３；配列表の配列番号１２）の５’末端より１〜６塩基上流領域（−１〜−６）に相補的な塩基配列であり、さらに７〜２４番目の塩基は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（２０５ＲＮ３（１６）；配列表の配列番号１３）の５’側８塩基と相補的な領域および当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領域より３’側１０塩基の配列と相補的である。言い換えれば、当該７〜２４番目の塩基は当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流１０塩基目から当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側８塩基と相同である。２０５ＲＮ３（１６）の１〜８番目の塩基はＡ６−２１５Ｒの１７〜２４番目の塩基と重複している。

例えば、Ａ９−２１５Ｒ（配列表の配列番号４８）の１〜９番目の塩基は第二キメラオリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ１３４ＦＮ３；配列表の配列番号１２）の５’末端より１〜９塩基上流領域（−１〜−９）に相補的な塩基配列であり、さらに１０〜２７番目の塩基は第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー（２０５ＲＮ３（１６）；配列表の配列番号１３）の５’側８塩基と相補的な領域および当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領域より３’側１０塩基の配列と相補的である。言い換えれば、当該７〜２４番目の塩基は当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流１０塩基目から当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側８塩基と相同である。２０５ＲＮ３（１６）の１〜８番目の塩基とＡ６−２１５Ｒの２０〜２７番目の塩基が重複している。

実施例２−（１）−（Ａ）にて使用している第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマー、ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの位置関係を例として図１に示す。

本発明の方法で用いられるＲＮａｓｅＨは、常温性から耐熱性のＲＮａｓｅＨのいずれもが好適に本発明に使用できる。例えば、下記実施例に示すように、国際公開第０２／２２８３１号パンフレット実施例８記載の方法で調製されたＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＲＮａｓｅＨＩＩ（以下、ＴｌｉＲＮａｓｅＨＩＩと称す）や同パンフレット実施例７記載の方法で調製されたＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓｆｕｌｇｉｄｕｓ由来のＲＮａｓｅＩＩ（以下、ＡｆｕＲＮａｓｅＨＩＩと称す）が本発明の方法に使用することができる。該耐熱性ＲＮａｓｅＨとしては、特に限定はされないが、例えば市販のＨｙｂｒｉｄａｓｅ^ＴＭＴｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅＲＮａｓｅＨ（ＥｐｉｃｅｎｔｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）の他、好熱性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、サーマス（Ｔｈｅｒｍａｓ）属細菌、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属細菌、アルカエオグロバス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）属細菌等由来のＲＮａｓｅＨ等も好適に使用できる。さらに、該ＲＮａｓｅＨは、天然体および変異体のいずれもが好適に使用できる。

本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼは、上記の鎖置換活性を有するものであれば特に限定はなく、例えば、バチルスカルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、以下、Ｂ．ｃａと称す）やバチルスステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、以下Ｂ．ｓｔと称す）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体や、大腸菌（以下、Ｅ．ｃｏｌｉと称す）由来のＤＮＡポリメラーゼＩのラージフラグメント（クレノウ断片）等が挙げられる。また、本発明に使用できるＤＮＡポリメラーゼは、常温性から耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。
Ｂ．ｃａは生育至適温度が約７０℃である好熱性細菌であり、この細菌由来のＢｃａＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性（逆転写活性）、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。上記の酵素は、その本来の起源より精製して取得されたもの、あるいは遺伝子工学的に生産された組み換えタンパク質の何れであっても良い。また、該酵素は、遺伝子工学的あるいはその他の手法によって置換、欠失、付加、挿入等の改変を加えたものであっても良く、このような酵素の例として、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたＢｃａＤＮＡポリメラーゼであるＢｃａＢＥＳＴＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）等が挙げられる。また、該酵素は、日本特許第２９７８００１号に記載の方法によって、該公報記載の微生物より調製することもできる。

なお、ＤＮＡポリメラーゼの中には、特定の条件でエンドヌクレアーゼ活性、例えば、ＲＮａｓｅＨ活性を有するものが知られている。このようなＤＮＡポリメラーゼを本発明の方法に用いることができる。すなわち、該ＤＮＡポリメラーゼをＲＮａｓｅＨ活性が発現されるような条件下、例えばＭｎ^２＋の存在下で使用する態様が挙げられる。該態様においては、上記ＲＮａｓｅＨを添加することなく本発明の方法を実施することができる。すなわち、Ｍｎ^２＋を含有する緩衝液中で上記のＢｃａＤＮＡポリメラーゼがＲＮａｓｅＨ活性を示すことができる。なお、上記の態様はＢｃａＤＮＡポリメラーゼに限定されるものではなく、ＲＮａｓｅＨ活性を併せ持つことが知られている公知のＤＮＡポリメラーゼ、例えばサーマスサーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＴｔｈＤＮＡポリメラーゼも本発明に使用することができる。

本発明の方法において、ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーを使用する場合ならびに第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーが当該ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの機能を兼ねる場合、さらに鋳型となる核酸上にある相補的な塩基配列を利用してラダー状増幅産物を得る場合のいずれにおいても、当該反応にランダムプライマーを共存させることにより、反応が安定し効率よく目的の増幅産物を得ることができる。上記ランダムプライマーには特に限定はないが、例えば６塩基〜９塩基長のランダムプライマーが好適に使用できる。

（２）本発明の組成物
本発明は、前述の本発明の核酸の増幅方法、または本発明の核酸の検出方法に使用される組成物を提供する。該組成物としては、例えば、上記（１）に記載のラダー形成オリゴヌクレオチドプライマー及び／又はキメラオリゴヌクレオチドプライマー、ＲＮａｓｅＨ、ならびにＤＮＡポリメラーゼを含有するものが挙げられる。さらに、増幅反応を行うための成分として、緩衝成分やマグネシウム塩、ｄＮＴＰ等を含んでいてもよい。さらに、修飾されたデオキシリボヌクレオチドあるいはデオキシヌクレオチド３リン酸のアナログを含有していてもよい。さらに、緩衝成分やその他の添加物を使用することができる。

特に好適な態様としては、本発明の核酸増幅方法に適した組成で上記の各種成分が含有された組成物を挙げることができ、該組成物は適切な鋳型とキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び／又はラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーを添加するのみで増幅反応を実施することができる。さらに、増幅対象があらかじめ明らかである場合には、当該増幅対象の増幅に適したキメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有する組成物が好適である。

（３）本発明のキット
本発明は、前述の本発明の核酸の増幅方法に使用されるキットを提供する。１つの実施態様において、該キットは、パッケージされた形態において、鎖置換反応におけるＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨ、キメラオリゴヌクレオチドプライマー及び／又はラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの使用のための指示書を含むことを特徴とする。さらに、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨならびに鎖置換反応用緩衝液を含むキットは本発明の方法に好適に使用される。あるいは、市販の鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼおよび／またはＲＮａｓｅＨを指示書に従って選択し、使用してもよい。さらに、ＲＮＡを鋳型とする場合の逆転写反応用試薬を含んでもよい。ＤＮＡポリメラーゼは、上記（１）記載の本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼから選択することができる。また、ＲＮａｓｅＨは、上記（１）記載のＲＮａｓｅＨから選択することができる。

上記「指示書」とは、当該キットの使用方法、例えば鎖置換反応用試薬液の調製方法、推奨される反応条件等を記載した印刷物であり、パンフレットまたはリーフレット形式の取り扱い説明書のほか、キットに添付されたラベル、キットが納められたパッケージ等に記載されたものを含む。さらに、インターネットのような電子媒体を通し、開示、提供された情報も含まれる。

さらに、本発明のキットにおいては、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩あるいはｔｒｉｓ−塩酸緩衝成分を含有する反応バッファー、及びアニーリング溶液が含まれていてもよい。また、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼやＲＮａｓｅＨが含まれていてもよい。さらに、修飾されたデオキシリボヌクレオチドあるいはデオキシヌクレオチド３リン酸のアナログを含有していてもよい。

さらに、標的核酸の検出方法に使用されるキットは、上記の指示書、増幅反応のための試薬類の他、標的核酸の増幅に適したキメラオリゴヌクレオチドプライマー及びラダー形成オリゴヌクレオチドプライマー、増幅された標的核酸を検出するための試薬、例えばプローブ等を含むものであってもよい。

（４）本発明の標的核酸の検出方法
本発明の核酸の増幅方法を使用することにより、試料中の標的核酸の検出を行うことができる。当該検出方法の一態様としては、
（ａ）上記（１）記載の本発明の核酸の増幅方法により、標的核酸を増幅する工程；および、
（ｂ）上記工程により増幅された標的核酸を検出する工程；
を包含する検出方法が挙げられる。

上記（ａ）行程において、ＲＮＡを鋳型とする場合は、逆転写反応と核酸増幅反応を１段階もしくは２段階で行ってもよい。特に限定はされないが、逆転写酵素と鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせとして例えば、ＡＭＶＲＴａｓｅ、Ｍ−ＭＬＶＲＴａｓｅあるいはＲＡＶ−２ＲＴａｓｅとＢｃａＢＥＳＴＤＮＡポリメラーゼの組み合わせが好適に使用できる。あるいは、逆転写活性と鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用しても良く、例えばＢｃａＢＥＳＴＤＮＡポリメラーゼが好適に使用できる。

さらに、本発明の標的核酸の検出方法により、点突然変異、一塩基置換（Ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｙｓｍ、ＳＮＰ）のような遺伝子上の特定の塩基についての情報を得ることが可能である。この態様においては、使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端部分が、標的とされる塩基配列の判別しようとする特定の塩基付近に位置するようにすればよい。

さらに、本発明の検出方法では、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩あるいはｔｒｉｓ緩衝成分を含有する反応バッファー、及びスペルミジンやプロピレンジアミンを含有するアニーリング溶液の使用により、微量の核酸試料からもさらに高感度に標的核酸を検出することができる。この場合、使用するＲＮａｓｅＨとＤＮＡポリメラーゼは特に限定はされないが、例えばサーモコッカス属細菌由来のＲＮａｓｅＨＩＩ及びＢｃａＢＥＳＴＤＮＡポリメラーゼの組み合わせが好ましい。特に、上記ＲＮａｓｅＨ及びＤＮＡポリメラーゼはともにその種類によって好適に使用できるユニット数が異なる場合が予想されるが、その際には検出感度の向上あるいは増幅産物量の増加を指標にして、該バッファーの組成および酵素の添加量を調整すればよい。

本発明の検出方法においては、標的核酸の増幅の際に、ｄＵＴＰを基質として取り込ませることができる。したがって、ｄＵＴＰを基質に用いた場合には、ウラシルＮ−グリコシダーゼ（ｕｒａｃｉｌＮ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ：ＵＮＧ）を利用して増幅産物を分解し、増幅産物のキャリーオーバーコンタミネーションによる偽陽性を防止することができる。

上記（ｂ）工程には公知の核酸検出方法、例えば電気泳動により特定のサイズの反応産物を検出する方法や、スマートサイクラー（タカラバイオ社製）、Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ（ＣＯＲＢＥＴＴＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）等を用いたリアルタイム検出、プローブとのハイブリダイゼーションによる検出等を使用することができる。また、磁気ビーズ等を組み合わせた検出方法も好適に使用できる。さらに、標的核酸の増幅工程時に生成するピロリン酸をマグネシウム塩のような不溶性物質とさせて反応液を白濁させ、その濁度を測定しても良い。
上記電気泳動による検出には、通常、エチジウムブロマイド等の蛍光物質が使用されるが、プローブとのハイブリダイゼーションを組み合わせてもよい。また、プローブは放射性同位元素による標識の他、ビオチンや蛍光物質のような非放射性の標識を施したものが使用できる。リアルタイム検出を行う際、サイバーグリーン（タカラバイオ社製）の発色用試薬が好適に使用できる。この他、上記（ａ）工程において標識ヌクレオチドを使用することにより、増幅産物に標識ヌクレオチドを取り込ませて検出を容易にすることや該標識を利用した検出用シグナルの増強を行うことができ、さらに蛍光偏光法、蛍光エネルギー転移等を利用した検出を行うことも可能である。さらに、適切な検出系を構築することにより、標的核酸を自動的に検出することや、あるいは標的核酸の定量を行うことが可能である。また、ハイブリッドクロマト法による肉眼検出法も好適に使用できる。

消光状態になるような距離で配置された２種類以上の蛍光物質で標識されたリボヌクレオチド（ＲＮＡ）プローブあるいはリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドで構成されるキメラオリゴヌクレオチドプローブのいずれもが本発明の検出方法に使用することができる。当該プローブは蛍光を発することはないが、これに相補的な標的核酸由来の増幅ＤＮＡにアニーリングした場合、ＲＮａｓｅＨは該プローブを分解する。この結果、プローブ上の蛍光物質間の距離が増大して蛍光が発せられるようになり、標的核酸の存在を知ることができる。ＲＮａｓｅＨを使用して本発明の核酸の増幅方法が実施された場合には、その反応液中に上記のプローブを添加するだけで標的核酸を検出することができる。当該プローブの標識に使用される蛍光物質としては、例えば、ＲＯＸ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）やＦＡＭ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、クエンチング物質としては、例えば、Ｅｃｌｉｐｓｅ（ＥｐｏｃｈＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）との組み合わせが好適に使用できる。

本発明で用いるプローブは、上記の本発明の核酸の増幅方法により増幅された核酸に通常のハイブリダイゼーションの条件において標的核酸にハイブリダイズし得るものであれば特に限定はないが、増幅産物を特異的に検出する観点からは、例えば厳密な条件として当業者に知られている条件でハイブリダイズするものが好ましい。前記、厳密なハイブリダイゼーション条件は、例えば１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラークローニング：アラボラトリーマニュアル第２版（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ２ｎｄｅｄ．）に記載されている。具体的な厳密な条件としては、例えば以下の条件を挙げることができる。すなわち、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ［Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００］及び１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、使用するプローブのＴｍ値より約２５℃低い温度で４時間〜一晩保温を行う条件を言う。前記プローブは、標的核酸の検出を容易にするために上記のような標識を付されたものを使用することができる。

本発明の標的核酸の検出方法においては、増幅領域が連なったラダー状増幅産物を積極的に生成させる。このようなラダー状増幅産物は増幅領域が複数個、任意の塩基配列を介していずれも同じ向きに重合したものであり、電気泳動による増幅産物の解析ではラダー状のバンドとして確認される。当該ラダー状増幅産物の生成は、増幅される領域、該領域のサイズ、その隣接領域、使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び／又はラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列あるいは反応の条件等により調整することができる。

本発明の検出方法においては、上記ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマー及び／又はキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用することができ、増幅領域が連なった重合体を生成する。このようなラダー状増幅産物は、複数個の増幅領域がラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーと第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側あるいはその上流領域に相補的な配列を介して同じ向きに連なったものである。さらに本発明の方法においては、鋳型となる核酸上の一方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側あるいはその上流にある塩基配列がもう一方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側あるいはその上流にある塩基配列と相補的な場合、当該位置にキメラオリゴヌクレオチドプライマーを設定することにより、標的核酸を感度良く検出することができる。

さらに上記ラダー状増幅産物は、増幅領域を複数個含むものであるので、例えば適切なプローブとのハイブリダイゼーションによって多数のプローブとハイブリダイズすることができる。当該プローブとしては、標的核酸の塩基配列及び／又は上記ラダー状増幅産物中の標的核酸配列間に存在する介在配列にハイブリダイズするもののいずれもが好適に使用できる。その結果、強いシグナルを発生することから、増幅領域を含む核酸の検出を目的とする場合に有用である。また、制限酵素消化等を組み合わせて、ラダー状増幅産物より増幅領域、またはその一部をモノマーとして得ることもできる。

本発明の核酸の増幅方法の等温下における増幅方法においては、サーマルサイクラーのような装置を必要としない。ｄＮＴＰのような試薬もＰＣＲ等で用いられるものを流用できるため、ランニングコストを従来法よりも低くすることができる。そのため、ルーチンワークを行なっている遺伝子検査等の分野で好適に使用できる。さらに、本発明の方法はＰＣＲ法よりも短時間により多くの増幅産物を得られることから、簡便、迅速、高感度な遺伝子検出方法として利用することができる。

以下の実施例により、さらに詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲に何ら限定されるものではない。

参考例１
実施例における耐熱性ＲＮａｓｅＨのｕｎｉｔ数は、以下の方法により算出した。
ポリ（ｒＡ）及びポリ（ｄＴ）（ともにアマシャムバイオテク社製）１ｍｇをそれぞれ１ｍＭＥＤＴＡを含む４０ｍＭｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）１ｍｌに溶解し、ポリ（ｒＡ）溶液及びポリ（ｄＴ）溶液を調製した。
次に、２０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、１％ジメチルスルホキシド、０．０１％ＢＳＡに、終濃度３０μｇ／ｍｌとなるポリ（ｒＡ）溶液、終濃度２０μｇ／ｍｌとなるポリ（ｄＴ）溶液を加え、３７℃で１０分間保持後、室温冷却した後、１／１００容量の４００ｍＭ酢酸マグネシウムを加えてポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）溶液を調製した。
このポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）溶液８００μｌに、任意に希釈した酵素液８μｌを加え、４０℃で２０分間反応させ、吸光度（Ａ２６０）を経時的に測定し、その変化量を求めた。すなわち、酵素反応によって、ポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）ハイブリッドから遊離したヌクレオチドの濃度を吸光度差から求めた。ＲＮａｓｅＨの１単位は、１ｎｍｏｌのリボヌクレオチドが遊離したのに相当するＡ２６０を２０分間に増加させる酵素量とし、下記の式に従って算出した。
単位（ｕｎｉｔ）＝１分あたりの吸光度の変化量×５７．１×希釈率

実施例１
（１）鋳型ＲＮＡの調製
ＲＴ−ＩＣＡＮの鋳型として使用したＲＮＡｔｒａｎｓｃｒｉｐｔは、ｉｎｖｉｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによって合成した。
まず、ｉｎｖｉｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎの鋳型となるプラスミドＤＮＡを人工合成遺伝子作製受託サービス（タカラバイオ社）に依頼して合成した。配列は、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群；ＳｅｖｅｒｅＡｃｕｔｅＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＳｙｎｄｒｏｍｅ）コロナウイルスゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ．Ｎｏ．：ＡＹ２７８７４１）の１８１３３番目〜１８３６２番目（配列表の配列番号１）を用いた。プラスミドに挿入するため、該配列の５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を、３’末端にＢａｍＨＩ認識配列を付加した。この断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩサイトに挿入した。得られたプラスミドをＢａｍＨＩで切断して直鎖ＤＮＡとし、Ｔ７ＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによるｉｎｖｉｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎの鋳型とした。
ｉｎｖｉｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎには、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔＴ７Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いた。キットに添付されている取扱説明書に従って、ｉｎｖｉｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、ＤＮａｓｅＩ処理、ＲＮＡの精製を行い、合成されたＲＮＡの濃度をＯＤ２６０により測定した。このＲＮＡ溶液をＲＮＡＤｉｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＮａＣｌ、３０μｇ／ｍｌＥ．ｃｏｌｉ１６Ｓ＋２３ＳｒＲＮＡ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＩｎｇｅｒｈｅｉｍ社製））にて１０^０〜１０^５コピー／μｌに濃度調整し、ＲＴ−ＩＣＡＮの鋳型として用いた。

（２）２ｓｔｅｐＲＴ−ＩＣＡＮの検討
（Ａ）検討１
逆転写プライマーの５’末端に第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域にアニールする配列を付加することによる効果について検討した。

第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域（−１〜−１２）にアニールする１２塩基を５’末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーを逆転写プライマーとして使用することによるＲＴ−ＩＣＡＮの感度、検出速度の変化を見た。
上記実施例１−（１）で調製した鋳型ＲＮＡをＯＤ２６０値より計算し、１μｌあたり１０^０、１０^１、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５コピーに調製した。最終濃度３２ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、１％ジメチルスルホキシド、０．１１％ＢＳＡ、４ｍＭ酢酸マグネシウム、各５００μＭｄＮＴＰｓに、上記逆転写プライマーとして２０５ＲＮ３（１８）プライマー（配列表の配列番号２）、Ａ１２−２０５Ｒプライマー（配列表の配列番号３）、２１５Ｒプライマー（配列表の配列番号４）、Ａ１２−２１５Ｒプライマー（配列表の配列番号５）あるいは、Ａ１２−２２３Ｒプライマー（配列表の配列番号６）各１ｐｍｏｌ、ＲＴａｓｅＭ−ＭＬＶ（タカラバイオ社製）１２．５Ｕ、１μｌの各コピー数の鋳型ＲＮＡを添加した１０μｌの反応液を調製した。

該反応液はサーマルサイクラーパーソナル（タカラバイオ社製）にセットし、４５℃、１０分間保持後、４℃に冷却した。逆転写反応終了後、該反応液１０μｌに最終濃度３２ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、１％ジメチルスルホキシド、０．１１％ＢＳＡ、４ｍＭ酢酸マグネシウム、各５００μＭｄＮＴＰｓに、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの１３４ＦＮ３（１８）プライマー（配列表の配列番号７）と第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの２０５ＲＮ３（１８）プライマー各２５ｐｍｏｌ、ＢｃａＢＥＳＴ（タカラバイオ社製）１１Ｕ、国際公開第０２／２２８３１号パンフレット実施例８に記載の方法で調製したＴｌｉＲＮａｓｅＨＩＩ０．０５Ｕ、サイバーグリーン（タカラバイオ社製）を含む反応液１５μｌを添加し、Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ（ＣＯＲＢＥＴＴＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）により５５℃でＩＣＡＮ反応を行い、増幅産物をリアルタイムで検出した。また、反応産物は３％アガロースゲル電気泳動によっても確認した。

その結果、２０５ＲＮ３（１８）プライマーで逆転写したＲＴ−ＩＣＡＮの感度が１０^４コピーであるのに対し、同じ位置で第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域（−１〜−１２）にアニールする１２塩基を５’末端に付加した逆転写プライマーＡ１２−２０５Ｒを用いた場合、感度は１０^２コピーとなり、感度が２桁向上した。また、１０^５コピーの検出速度も約２分速くなった。

同様に、２１５ＲＤＮＡプライマーで逆転写したＲＴ−ＩＣＡＮの感度か１０^３コピーであるのに対し、同じ位置で第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域（−１〜−１２）にアニールする１２塩基を５’末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーＡ１２−２１５Ｒプライマーを逆転写に用いた場合、感度は１０^０コピーとなり、感度が３桁向上した。また、１０^５コピーの検出速度も約２分速くなった。

また、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域（−１〜−１２）にアニールする１２塩基を５’末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーＡ１２−２２３Ｒを逆転写に用いた場合の感度も１０^１コピーであった。

以上のことから、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域（−１〜−１２）にアニールする１２塩基を５’末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーを逆転写に用いることにより、当該プライマーが鋳型ＲＮＡにアニールする位置にかかわらず、感度、検出速度の向上が認められた。

（Ｂ）検討２
ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端に付加する、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域および／または該ｐｒｉｍｅｒの一部にアニールする１２塩基の位置（−１〜−１２、−１１〜−２２、−２１〜−３２、＋５〜−６、＋１１〜０）を変え、逆転写プライマーとして使用することにより、同様の検討を行った。
まず、上記実施例１−（１）で調製した鋳型ＲＮＡをＯＤ２６０値より計算し、１μｌあたり１０^０、１０^１、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５コピーに調製した。
最終濃度３２ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、１％ジメチルスルホキシド、０．１１％ＢＳＡ、４ｍＭ酢酸マグネシウム、各５００μＭｄＮＴＰｓに、上記逆転写プライマーとしてラダー形成オリゴヌクレオチドプライマー２１５Ｒプライマー、Ａ１２−２１５Ｒプライマー、Ａ１２（−１０）−２１５Ｒプライマー（配列表の配列番号８）、Ａ１２（−２０）−２１５Ｒプライマー（配列表の配列番号９）、Ａ１２（６）−２１５Ｒ（配列表の配列番号１０）、あるいは、Ａ１２（１２）−２１５Ｒ（配列表の配列番号１１）各１ｐｍｏｌ、ＲＴａｓｅＭ−ＭＬＶ（タカラバイオ社製）５０Ｕ、１μｌの各コピー数の鋳型ＲＮＡを添加した１０μｌの反応液を調製した。

該反応液はサーマルサイクラーパーソナル（タカラバイオ社製）にセットし、４５℃、１０分間保持後、４℃に冷却した。逆転写反応終了後、該反応液１０μｌに最終濃度３２ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、１％ジメチルスルホキシド、０．１１％ＢＳＡ、４ｍＭ酢酸マグネシウム、各５００μＭｄＮＴＰｓに第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーのＢ１３４ＦＮ３（１６）プライマー（配列表の配列番号１２）と第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの２０５ＲＮ３（１６）プライマー（配列表の配列番号１３）各２５ｐｍｏｌ、ＢｃａＢＥＳＴ（タカラバイオ社製）１１Ｕ、ＴｌｉＲＮａｓｅＨＩＩ０．０５Ｕ、サイバーグリーン（タカラバイオ社製）を含む反応液１５μｌを添加し、Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ（ＣＯＲＢＥＴＴＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）により５５℃でＩＣＡＮ反応を行い、増幅産物をリアルタイムで検出した。また、反応産物は３％アガロースゲル電気泳動によっても確認した。

その結果、上記２１５Ｒプライマーで逆転写したＲＴ−ＩＣＡＮの感度か１０^２コピーであるのに対し、同じ位置で第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域（−１〜−１２）にアニールする１２塩基を５’末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーのＡ１２−２１５Ｒを用いた場合、感度は１０^１コピーとなり、感度が１桁向上した。また、１０^５コピーの検出速度も約３分速くなった。

第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域（−１１〜−２２）にアニールする１２塩基を５’末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーのＡ１２（−１０）−２１５Ｒを用いた場合の感度は１０^２コピーで、２１５Ｒプライマーの場合と同じであったが、１０^５コピーの検出速度は約２分速くなった。また、１０^２コピーから１０^５コピーの検出は、２１５Ｒプライマーの場合に比べて定量性（相関係数０．９９７）がみられた。

第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域（−２１〜−３２）にアニールする１２塩基を５’末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーのＡ１２（−２０）−２１５Ｒを用いた場合、感度は１０^１コピーとなり、感度が１桁向上した。また、１０^５コピーの検出速度も約２．５分速くなった。

第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域および該ｐｒｉｍｅｒの一部にアニールする１２塩基を５’末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーのＡ１２（６）−２１５Ｒ、および第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの一部にアニールする１２塩基を５’末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーのＡ１２（１２）−２１５Ｒを用いた場合も、上記プライマーと同様に検出感度、検出速度共に向上した。

以上のことから、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域にアニールする１２塩基の配列の位置を変えて５’末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーのいずれにおいても、感度、検出速度の向上が認められた。

（Ｃ）検討３
ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端に付加する、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域にアニールする塩基の長さを６塩基、９塩基、１２塩基（−１１〜−１６、−１１〜−１９、−１１〜−２２）とした逆転写プライマーを用いて、ＲＴ−ＩＣＡＮの感度、検出速度を検討した。
まず、上記実施例１−（１）で調製した鋳型ＲＮＡをＯＤ２６０値より計算し、１μｌあたり１０^０、１０^１、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５コピーに調製した。
最終濃度３２ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、１％ジメチルスルホキシド、０．１１％ＢＳＡ、４ｍＭ酢酸マグネシウム、各５００μＭｄＮＴＰｓに、上記逆転写プライマーとしてラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの２１５Ｒプライマー、Ａ６（−１０）−２１５Ｒプライマー（配列表の配列番号１４）、Ａ９（−１０）−２１５Ｒプライマー（配列表の配列番号１５）、あるいは、Ａ１２（−１０）−２１５Ｒプライマー各１ｐｍｏｌ、ＲＴａｓｅＭ−ＭＬＶ（タカラバイオ社製）５０Ｕ、１μｌの各コピー数の鋳型ＲＮＡを添加した１０μｌの反応液を調製した。

該反応液はサーマルサイクラーパーソナル（タカラバイオ社製）にセットし、４５℃、１０分間保持後、４℃に冷却した。逆転写反応終了後、該反応液１０μｌに最終濃度３２ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、１％ジメチルスルホキシド、０．１１％ＢＳＡ、４ｍＭ酢酸マグネシウム、各５００μＭｄＮＴＰｓに、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーのＢ１３４ＦＮ３（１６）プライマーと第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの２０５ＲＮ３（１６）プライマー各２５ｐｍｏｌ、ＢｃａＢＥＳＴ（タカラバイオ社製）１１Ｕ、ＴｌｉＲＮａｓｅＨＩＩ０．０５Ｕ、サイバーグリーンを含む反応液１５μｌを添加し、Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ（ＣＯＲＢＥＴＴＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）により５５℃でＩＣＡＮ反応を行い、増幅産物をリアルタイムで検出した。また、反応産物は３％アガロースゲル電気泳動によっても確認した。

その結果、２１５Ｒプライマーで逆転写したＲＴ−ＩＣＡＮの感度か１０^３コピーであるのに対し、同じ位置で第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域（−１１〜−１６）にアニールする６塩基を５’末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーのＡ６（−１０）−２１５Ｒを用いた場合、感度は１０^２コピーとなり、感度が１桁向上した。また、１０^５コピーの検出速度も約１分速くなった。

第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域（−１１〜−１９）にアニールする９塩基を５’末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーのＡ９（−１０）−２１５Ｒを用いた場合の感度は１０^１コピーとなり、感度が２桁向上した。また、１０^５の検出速度も約２．５分速くなった。

第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域（−１１〜−２２）にアニールする１２塩基を５’末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーのＡ１２（−１０）−２１５Ｒを用いた場合、感度は１０^１コピーとなり、感度が２桁向上した。また、１０^５の検出速度も約３分速くなった。

以上のことから、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域にアニールする塩基の数を変えて５’末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーにおいて、６塩基以上の付加で、感度、検出速度の向上が認められた。その効果は第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域にアニールする塩基の数が多いほど大きいことが確認できた。

（Ｄ）検討４
第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域（−１〜−１２）にアニールする１２塩基を５’末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーのＡ１２−２１５Ｒを用いた、ＲＴ−ＩＣＡＮの検出速度、定量性について検討した。
まず、上記実施例１−（１）で調製した鋳型ＲＮＡをＯＤ２６０値より計算し、１μｌあたり１０^０、１０^１、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５コピーに調製した。
最終濃度３２ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、１％ジメチルスルホキシド、０．１１％ＢＳＡ、４ｍＭ酢酸マグネシウム、各５００μＭｄＮＴＰｓに、Ａ１２−２１５Ｒプライマー１ｐｍｏｌ、ＲＴａｓｅＭ−ＭＬＶ（タカラバイオ社製）５０Ｕ、１μｌの各コピー数の鋳型ＲＮＡを添加した１０μｌの反応液を調製した。

該反応液はサーマルサイクラーパーソナル（タカラバイオ社製）にセットし、４５℃、１０分間保持後、４℃に冷却した。逆転写反応終了後、該反応液１０μｌに最終濃度３２ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、１％ジメチルスルホキシド、０．１１％ＢＳＡ、４ｍＭ酢酸マグネシウム、５００μＭｄＮＴＰｓに、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーのＢ１３４ＦＮ３（１６）プライマーと第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの２０５ＲＮ３（１６）プライマー各２５ｐｍｏｌ、ＢｃａＢＥＳＴ（タカラバイオ社製）１１Ｕ、ＴｌｉＲＮａｓｅＨＩＩ０．０５Ｕ、サイバーグリーンを含む反応液１５μｌを添加し、Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ（ＣＯＲＢＥＴＴＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）により５５℃でＩＣＡＮ反応を行い、増幅産物を１サイクル（１分）毎にリアルタイムで検出した。

増幅曲線を図２に示す。図２に示したように、１０^１〜１０^５コピーが定量的（相関係数０．９９２）に検出され、１０サイクル以内に１０コピーまでの反応の立ち上がりが確認できた。

さらに、クロマトストリップへの展開による、プローブハブリダイゼージョン法でも増幅産物の確認を行った。

クロマトストリップへの展開による、プローブハブリダイゼージョン法での増幅産物の確認は、ＴａＫａＲａＢｅｄ−ＳｉｄｅＩＣＡＮｂｌａ^ｌＭＰＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（タカラバイオ社製）に含まれるＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｅｔを用い、その取扱説明書に記載されている検出方法に従って行った。ただし、今回の検出では、プローブとしてＦＩＴＣ標識プローブＳＡＲＳ−ＢＮＩ−Ｂ（配列表の配列番号１６）を含むＰｒｏｂｅＳｏｌｕｔｉｏｎを使用し、上記キットに含まれるｂｌａＭＰＰｒｏｂｅＳｏｌｕｔｉｏｎおよびＩＣＰｒｏｂｅＳｏｌｕｔｉｏｎは使用しなかった。

その結果、１０^０〜１０^５コピー／反応の増幅産物により、赤紫色のラインの呈色が認められ特異的な増幅が確認出来た。

（３）１ｓｔｅｐＲＴ−ＩＣＡＮの検討
（Ａ）検討１
第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端に第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域にアニールする配列を付加し、ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーとして使用することによる効果について検討した。

第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域（−１〜−７）にアニールする７塩基を第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端に付加することによるＲＴ−ＩＣＡＮの感度、検出速度について検討した。第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端に７塩基付加することで、第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端から１２塩基が第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域（−１〜−１２）にアニールする配列となる。逆転写反応とＩＣＡＮ反応は同一チューブ内で同時に行った。
まず、上記実施例１−（１）で調製した鋳型ＲＮＡをＯＤ２６０値より計算し、１μｌあたり１００、１０^１、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５コピーに調製した。最終濃度３２ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、１％ジメチルスルホキシド、０．１１％ＢＳＡ、４ｍＭ酢酸マグネシウム、各５００μＭｄＮＴＰｓに、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの１６０ＦＮ３プライマー（配列表の配列番号１７）と第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの２４１ＲＮ３プライマー（配列表の配列番号１８）あるいは第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの（Ａ１２）２４１ＲＮ３プライマー（配列表の配列番号１９）各２５ｐｍｏｌ、ＲＴａｓｅＭ−ＭＬＶ（タカラバイオ社製）５０Ｕ、ＢｃａＢＥＳＴ（タカラバイオ社製）１１Ｕ、ＴｌｉＲＮａｓｅＨＩＩ０．０５Ｕ、サイバーグリーン（タカラバイオ社製）を含む反応液２４μｌに１μｌの各コピー数の鋳型ＲＮＡを添加し、Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ（ＣＯＲＢＥＴＴＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）により４５℃で５分、５５℃で４５分保持し、増幅産物をリアルタイムで検出した。反応産物は３％アガロースゲル電気泳動によっても確認した。

その結果、第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの２４１ＲＮ３を用いたＲＴ−ＩＣＡＮの感度が１０^５コピーであるのに対し、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域（−１〜−７）にアニールする７塩基を５’末端に付加した（Ａ１２）２４１ＲＮ３プライマーを用いた場合、感度は１０^３コピーとなり、感度が２桁向上した。また、１０５コピーの検出速度も約１分速くなった。

以上のことから、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域にアニールする配列を第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端に付加したものをラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーとして用いることによる感度、検出速度の向上が認められた。

（Ｂ）検討２
１ｓｔｅｐＲＴ−ＩＣＡＮの反応に及ぼす、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域にアニールする配列を５’末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの効果について検討した。

第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域（−１〜−１２）にアニールする１２塩基を５’末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーを、逆転写反応とＩＣＡＮ反応を同一チューブ内で同時に行う１ｓｔｅｐＲＴ−ＩＣＡＮの反応系に添加して感度、検出速度を検討した。
まず、上記実施例１−（１）で調製した鋳型ＲＮＡをＯＤ２６０値より計算し、１μｌあたり１０^０、１０^１、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５コピーに調製した。最終濃度３２ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、１％ジメチルスルホキシド、０．１１％ＢＳＡ、４ｍＭ酢酸マグネシウム、各５００μＭｄＮＴＰｓに、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの１３４ＦＮ３（１６）プライマー（配列表の配列番号２０）と第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの２０５ＲＮ３（１６）プライマー各２５ｐｍｏｌ、ＲＴａｓｅＭ−ＭＬＶ（タカラバイオ社製）５０Ｕ、ＢｃａＢＥＳＴ（タカラバイオ社製）１１Ｕ、ＴｌｉＲＮａｓｅＨＩＩ０．０５Ｕ、サイバーグリーン（タカラバイオ社製）を含む反応液２４μｌと、さらにラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーのＡ１２−２２３Ｒプライマー２．５ｐｍｏｌを加えた反応液２４μｌに１μｌの各コピー数の鋳型ＲＮＡを添加し、Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ（ＣＯＲＢＥＴＴＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）により４５℃で５分、５５℃で４５分保持し、増幅産物をリアルタイムで検出した。また、反応産物は３％アガロースゲル電気泳動によっても確認した。

その結果、ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーのＡ１２−２２３Ｒプライマーを添加しなかった１ｓｔｅｐＲＴ−ＩＣＡＮの感度が１０^３コピーであるのに対し、Ａ１２−２２３Ｒプライマーを添加することにより感度は１０^２コピーとなり、感度が１桁向上した。また、１０^３コピーの検出速度も約４分速くなった。

以上のことから、ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーを１ｓｔｅｐＲＴ−ＩＣＡＮの反応に加えることにより、感度、検出速度の向上が認められた。

実施例２
（１）サイクリングプローブ法を用いたリアルタイム検出系でのヒトアルデヒドデハイドロゲナーゼ２遺伝子（ＡＬＤＨ２）の多型検出における効果の検討

ＩＣＡＮ反応とサイクリングプローブ法を用いたリアルタイム検出による多型検出に対する効果について検討した。検討対象としては、ヒトアルデヒドデハイドロゲナーゼ２酵素をコードしている遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ．Ｎｏ．：ＡＨ００２５９９）を選択した。該遺伝子においてエキソン１２には、４８７番目のグルタミン酸（ＧＡＡ）がリジン（ＡＡＡ）に置換する一塩基多型が存在し、飲酒に関連した体質の個人差に深く関係し、発ガンリスクに関与することがこれまでに報告されている。

ＩＣＡＮ反応系でこのアルデヒドデハイドロゲナーゼ２遺伝子の多型検出を行うために、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーに相当するＩＣＡＮ−ＡＬＤＨ２−Ｆプライマー（配列表の配列番号２１）、第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーに相当するＩＣＡＮ−ＡＬＤＨ２−Ｒプライマー（配列表の配列番号２２）をＤＮＡ合成機（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により合成した。次に、正常型検出用ＡＬＤＨ２ｗＧプローブ（配列表の配列番号２３）及び変異型検出用ＡＬＤＨ２ｍＡプローブ（配列表の配列番号２４）を合成した。ここで、正常型検出用ＡＬＤＨ２ｗＧプローブは、５’末端に蛍光標識としてＲＯＸ標識（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、３’末端にクエンチング標識としてＥｃｌｉｐｓｅ（ＥｐｏｃｈＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を、変異型検出用ＡＬＤＨ２ｍＡプローブは、５’末端に蛍光標識としてＦＡＭ標識（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、３’末端にクエンチング標識としてＥｃｌｉｐｓｅを付加したＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡタイプのオリゴヌクレオチドプローブである。

さらに、上記第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域（−１〜−１２）にアニールする１２塩基を５’末端に付加し、ＩＣＡＮ−ＡＬＤＨ２−Ｒプライマー付近に設定したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーのＡＬＤＨ２−ＴＨ１（配列表の配列番号２５；ＩＣＡＮ−ＡＬＤＨ２−Ｒキメラオリゴヌクレオチドプライマーに対して−１〜＋１５）、ＡＬＤＨ２−ＴＨ２（配列表の配列番号２６；ＩＣＡＮ−ＡＬＤＨ２−Ｒキメラオリゴヌクレオチドプライマーに対して−９〜＋６）、ＡＬＤＨ２−ＴＨ３（配列表の配列番号２７；ＩＣＡＮ−ＡＬＤＨ２−Ｒキメラオリゴヌクレオチドプライマーに対して−１７〜−２）を合成した。

鋳型となるゲノムＤＮＡは、インフォームドコンセントの得られた、抗凝固剤としてＥＤＴＡを用いた血液サンプルより、ＱＩＡａｍｐＤＮＡＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて調製した。

ＩＣＡＮ反応の反応条件は以下の通りである。すなわち、最終濃度３２ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液、ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、５ｍＭ酢酸マグネシウム、１％ジメチルスルホキシド、０．０４％プロピレンジアミン、０．１１％ウシ血清アルブミン、各６００μＭｄＮＴＰｓ、４ＵＢｃａＢＥＳＴＤＮＡポリメラーゼ、１００ＵＴｌｉＲＮａｓｅＨＩＩ、各５０ｐｍｏｌのＩＣＡＮ−ＡＬＤＨ２−ＦプライマーおよびＩＣＡＮ−ＡＬＤＨ２−Ｒプライマー、５．５ｐｍｏｌＡＬＤＨ２ｗＧプローブ、６ｐｍｏｌＡＬＤＨ２ｍＡプローブ、鋳型となるゲノムＤＮＡ１００ｎｇを基本とし、このまま、もしくはラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーのＡＬＤＨ２−ＴＨ１あるいはＡＬＤＨ２−ＴＨ２あるいはＡＬＤＨ２−ＴＨ３を１ｐｍｏｌ加え、滅菌水にて最終容量２５μｌにした。該反応液をスマートサイクラー（タカラバイオ社製）にセットし、７０℃、５分処理したあと、５６℃、６０分温度を保持した。なお、蛍光強度の測定は、５６℃で保持しているときに、１分ごとに測定した。

また、ゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＡＬＤＨ２−Ｆプライマー（配列表の配列番号２８）およびＡＬＤＨ２−Ｒプライマー（配列表の配列番号２９）のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物をＭｉｃｒｏｃｏｎ−３０（ミリポア社）で精製した後、Ｅｃｏ５７Ｉで消化し、３％ＮｕＳｉｅｖｅ３：１アガロールゲル（タカラバイオ社製）にて電気泳動を行い、ＲＦＬＰによるタイピングも行った。

ＰＣＲは、ＴａＫａＲａＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を用いて行った。すなわち、最終濃度１×ＥｘＴａｑ緩衝液、各２００μＭｄＮＴＰｓ、１．２５ＵＥｘＴａｑ、各１０ｐｍｏｌのＡＬＤＨ２−ＦプライマーおよびＡＬＤＨ２−Ｒプライマー、鋳型となる核酸として調製したヒトゲノムＤＮＡ５μｌを添加し、滅菌水にて最終容量５０μｌにした。該反応液をサーマルサイクラーＳＰ（タカラバイオ社製）にセットし、９４℃、３０秒のあと、９４℃、３０秒、５５℃、３０秒、７２℃、３０秒のサイクルを３０サイクル繰り返した。

Ｅｃｏ５７Ｉは、ＣＴＧＡＡＧを認識する制限酵素であり、アルデハイドデハイドロゲナーゼ２の正常型由来の増幅産物を切断するが、変異型由来の増幅産物は切断しない。

その結果、Ｅｃｏ５７ＩでのＰＣＲＲＦＬＰにおいて、増幅産物が切断されたものと切断されなかったものの三本のフラグメントが観察された、すなわちヘテロ接合体と考えられるゲノムＤＮＡサンプルを用いた場合、ＡＬＤＨ２−ＴＨ１、ＡＬＤＨ２−ＴＨ２、ＡＬＤＨ２−ＴＨ３を反応系に加えた場合、以下の表１および２に示されるように、スレッシュホールドラインを１００とし、このラインとサンプルの増幅曲線が交差するポイントであるＣｔ値が小さくなる、すなわち反応性の上昇が認められた。また、ＡＬＤＨ２−ＴＨ３の場合では確認されなかったが、ＡＬＤＨ２−ＴＨ１、ＡＬＤＨ２−ＴＨ２を加えた場合はＦＡＭの蛍光強度が増大する、すなわち検出効率が増大したことが確認された。

Ｅｃｏ５７ＩでのＲＦＬＰにおいて増幅産物が切断されたことによる二本のフラグメントが観察された、すなわち正常型のホモ接合体と考えられるゲノムＤＮＡサンプルを用いた場合はＡＬＤＨ２ｗＧプローブ由来のＲＯＸ蛍光シグナルのみが認められ、Ｅｃｏ５７ＩでのＲＦＬＰにおいて、増幅産物が切断されずに一本のフラグメントが観察された、すなわち、変異型のホモ接合体と考えられるゲノムＤＮＡサンプルを用いた場合にはＡＬＤＨ２ｍＡプローブ由来の６−ＦＡＭ蛍光シグナルのみが認められた。これらの場合、スレッシュホールドラインを１００とし、このラインとサンプルの増幅曲線が交差するポイントであるＣｔ値が小さくなる、すなわち、反応性の上昇が認められた。

（２）ＡＬＤＨ２多型検出における反応系に添加するラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端に付加した塩基配列の効果の検討

実施例２−（１）でのＩＣＡＮ反応とサイクリングプローブ法を用いたリアルタイム検出による多型検出に対する効果において、検討対象として選択したヒトアルデヒドデハイドロゲナーゼ２酵素をコードしている遺伝子の検出の際、反応系に添加するラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端に付加した塩基配列の効果について検討した。

実施例２−（１）と同様に、ＩＣＡＮ反応系でこのアルデヒドデハイドロゲナーゼ２遺伝子の多型検出を行うためのＩＣＡＮ−ＡＬＤＨ２−Ｆプライマー、ＩＣＡＮ−ＡＬＤＨ２−Ｒプライマー、正常型検出用ＡＬＤＨ２ｗＧプローブ及び変異型検出用ＡＬＤＨ２ｍＡプローブを用意した。正常型検出用ＡＬＤＨ２ｗＧプローブは、５’末端に蛍光標識としてＲＯＸ標識、３’末端にクエンチング標識としてＥｃｌｉｐｓｅを、一方、変異型検出用ＡＬＤＨ２ｍＡプローブは、５’末端に蛍光標識としてＦＡＭ標識、３’末端にクエンチング標識としてＥｃｌｉｐｓｅを付加したＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡタイプのオリゴヌクレオチドプローブである。

さらに、ＩＣＡＮ−ＡＬＤＨ２−Ｆプライマーの上流領域（−１〜−１２）にアニールする１２塩基を５’末端に付加し、ＩＣＡＮ−ＡＬＤＨ２−Ｒプライマー付近に設定したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーのＡＬＤＨ２−ＴＨ２（ＩＣＡＮ−ＡＬＤＨ２−Ｒキメラプライマーに対して−９〜＋６）と、この当該プライマーの５’末端に付加してある１２塩基を除いたＡＬＤＨ２−ＴＨ４（配列番号３０）を合成した。

鋳型となるゲノムＤＮＡは、インフォームドコンセントの得られた、抗凝固剤としてＥＤＴＡを用いた血液サンプルより、ＱＩＡａｍｐＤＮＡＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて調製したもののうちで、ＲＦＬＰによるタイピングによりヘテロ接合体と確認されたものを使用した。

ＩＣＡＮ反応の反応条件は以下の通りである。すなわち、最終濃度３２ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨバッファー、ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、５ｍＭ酢酸マグネシウム、１％ジメチルスルホキシド、０．０４％プロピレンジアミン、０．１１％ウシ血清アルブミン、各６００μＭｄＮＴＰｓ、４ＵＢｃａＢＥＳＴＤＮＡポリメラーゼ、１００ＵＴｌｉＲＮａｓｅＨＩＩ、各５０ｐｍｏｌのＩＣＡＮ−ＡＬＤＨ２−ＦプライマーおよびＩＣＡＮ−ＡＬＤＨ２−Ｒプライマー対、５．５ｐｍｏｌＡＬＤＨ２ｗＧプローブ、６ｐｍｏｌＡＬＤＨ２ｍＡプローブ、鋳型となるゲノムＤＮＡ１００ｎｇを基本とし、このまま、もしくはラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーのＡＬＤＨ２−ＴＨ２あるいはＡＬＤＨ２−ＴＨ４を１ｐｍｏｌ加え、滅菌水にて最終容量２５μｌにした。該反応液をスマートサイクラー（タカラバイオ社製）にセットし、７０℃、５分処理したあと、５６℃、６０分温度を保持した。なお、蛍光強度の測定は、５６℃で保持しているときに、１分ごとに測定した。

その結果、ＡＬＤＨ２−ＴＨ２を反応系に加えた場合、以下の表３および４に示されるように、スレッシュホールドラインを１００とし、このラインとサンプルの増幅曲線が交差するポイントであるＣｔ値が小さくなる、すなわち反応性の上昇が認められた。また、ＲＯＸ、ＦＡＭの蛍光強度が増大する、すなわち検出効率が増大したことが確認された。一方、ＡＬＤＨ２−ＴＨ４を反応系に加えた場合は、Ｃｔ値に変化は認められず、蛍光強度にも変化は認められなかった。すなわち、ＡＬＤＨ２−ＴＨ２の５’に付加してある、ＩＣＡＮ−ＡＬＤＨ２−Ｆプライマーの上流領域（−１〜−１２）にアニールする１２塩基のないＡＬＤＨ２−ＴＨ４を反応系に加えた場合には、ＡＬＤＨ２−ＴＨ２で確認される反応性の上昇、検出効率の増大は確認されなかった。

（３）レジオネラ検出における反応系に添加するラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端に付加した塩基配列の効果の検討

第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域（−１〜−１２あるいは−１３〜−２４）にアニールする１２塩基を５’末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーを添加し、ＩＣＡＮ反応における検出速度の変化を検討した。

ＩＣＡＮ反応とサイクリングプローブ法を用いたリアルタイム検出に対する効果について検討した。検討対象としては、レジオネラＭｉｐ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒ（Ｍｉｐ）；ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ．Ｎｏ．：ＡＦ０９５２１５）遺伝子をコードしている遺伝子を選択した。
ＩＣＡＮ反応系でこのレジオネラＭｉｐ遺伝子の検出を行うために、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーのＦ２キメラオリゴヌクレオチドプライマー（配列表の配列番号３１）および第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーのＲ２キメラオリゴヌクレオチドプライマー（配列表の配列番号３２）をＤＮＡ合成機（アプライド・バイオシステム社製）により合成した。次に、Ｍｉｐ遺伝子検出用Ｍｉｐ４ｇ１２プローブ（配列表の配列番号３３）を合成した。また、Ｍｉｐ遺伝子検出用Ｍｉｐ４ｇ１２プローブは、５’末端に蛍光標識としてＦＡＭ標識、３’末端にクエンチング標識としてＥｃｌｉｐｓｅを付加したＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡタイプのオリゴヌクレオチドプローブである。

さらに、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域（−１〜−１２あるいは−１３〜−２４）にアニールする１２塩基を５’末端に付加し、第一キメラオリゴヌクレオチドプライマー付近に設定したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーのＲ２（−１３）（配列表の配列番号３４；第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーに対して−１３〜−２９）、Ｒ２（−１３）Ａ１２−１（配列表の配列番号３５；第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーに対して−１３〜−２９部分の５’末端に第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域−１〜−１２の１２塩基を付加した）、Ｒ２（−１３）Ａ１２−２（配列表の配列番号３６；第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーに対して−１３〜−２９部分の５’末端に第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域−１３〜−２４の１２塩基を付加した）を合成した。

鋳型となるゲノムＤＮＡは、ＥｎｖｉｒｏＡｍｐ^ＴＭ（ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲ社製）に添付のＬｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａＣｏｎｔｒｏｌＤＮＡを使用した。

ＩＣＡＮ反応の反応条件は以下の通りである。すなわち、最終濃度３２ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨバッファー、ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、５ｍＭ酢酸マグネシウム、１％ジメチルスルホキシド、０．１１％ウシ血清アルブミン、各５００μＭｄＮＴＰｓ、２ＵＢｃａＢＥＳＴＤＮＡポリメラーゼ、１００ＵＴｌｉＲＮａｓｅＨＩＩ、各２５ｐｍｏｌのＦ２キメラオリゴヌクレオチドプライマーおよびＲ２キメラオリゴヌクレオチドプライマー、５ｐｍｏｌＭｉｐ４ｇ１２プローブ、鋳型となるＣｏｎｔｒｏｌＤＮＡ２００コピーを基本とし、このまま、もしくはＲ２（−１３）Ａ１２−１あるいはＲ２（−１３）Ａ１２−２を１ｐｍｏｌ加え、滅菌水にて最終容量２５μｌにした。該反応液をスマートサイクラー（タカラバイオ社製）にセットし、７０℃、５分処理したあと、５３℃、９０分温度を保持した。なお、蛍光強度の測定は、５３℃で保持しているときに、１分ごとに測定した。

その結果を表５に示す。表５に示したように、ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーのＲ２（−１３）Ａ１２−１あるいはＲ２（−１３）Ａ１２−２を反応系に加えた場合、スレッシュホールドラインを１００とし、このラインとサンプルの増幅曲線が交差するポイントであるＣｔ値が小さくなる、すなわち反応性の上昇が認められた。

実施例３
（１）鋳型となる核酸上で、双方のＩＣＡＮｐｒｉｍｅｒの上流領域に存在する相補的配列のＩＣＡＮの反応に及ぼす効果１

鋳型となる核酸上で、双方のＩＣＡＮｐｒｉｍｅｒの５’末端より上流領域に６塩基の相補的な配列を挿入し、ＩＣＡＮ反応に及ぼす影響を見た。検出対象は、ヒトｃ−Ｋｉ−ｒａｓ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ．Ｎｏ．：Ｌ０００４５）を選択した。

双方のＩＣＡＮｐｒｉｍｅｒの５’末端上流領域に明確な相補的な配列がない鋳型と６塩基の相補的な配列を有する鋳型は以下のように調製した。
Ｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅ（クロンテック社より購入）を鋳型にｃ−Ｋｉ−ｒａｓ／１２Ｆプライマー（配列表の配列番号３７）とｒａｓＴ１Ｒプライマー（配列表の配列番号３８）あるいは双方のプライマーの５’末端に相補的な配列を付加したｒａｓＴ１４Ｆプライマー（配列表の配列番号３９）とｒａｓＴ４Ｒプライマー（配列表の配列番号４０）を用いて、ＰＣＲを行った。得られた断片を平滑化し、プラスミドｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）のＨｉｎｃＩＩサイトに挿入した。得られたプラスミドより、ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ／１２ＦプライマーあるいはｒａｓＴ１４ＦプライマーがｐＵＣ１１８にアニールするＭ１３ｐｒｉｍｅｒＭ４（タカラバイオ社製）と同方向であるプラスミドを選別した。その結果、双方のＩＣＡＮｐｒｉｍｅｒの５’末端上流領域に明確な相補的な配列がないプラスミドＴ７と６塩基の相補的な配列ＣＧＣＧＣＧを有するプラスミドＴ１６を得た。

上記調製したプラスミドＤＮＡをＯＤ２６０値より計算し、１μｌあたり１０^０、１０^１、１０^２、１０^３コピーに調製した。最終濃度３２ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、１％ジメチルスルホキシド、０．１１％ＢＳＡ、４ｍＭ酢酸マグネシウム、各５００μＭｄＮＴＰｓに、ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ／１２ＦＮ３キメラオリゴヌクレオチドプライマー（配列表の配列番号４１）とｃ−Ｋｉ−ｒａｓ／１２ＲＮ３キメラオリゴヌクレオチドプライマー（配列表の配列番号４２）各３０ｐｍｏｌ、ＢｃａＢＥＳＴ（タカラバイオ社製）２．８Ｕ、国際公開第０２／２２８３１号パンフレット実施例７に記載の方法で調製したＡｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ２．２Ｕ、を含む反応液２４μｌに、１μｌの各コピー数の鋳型ＤＮＡを添加し、サーマルサイクラーパーソナル（タカラバイオ社製）で、５５℃で６０分反応した。増幅産物は３％アガロースゲル電気泳動により確認した。

その結果、双方のＩＣＡＮｐｒｉｍｅｒの５’末端上流領域に明確な相補的な配列がないプラスミドＴ７を鋳型とした場合、増幅産物はターゲット領域のサイズのバンドしか見られず、安定した感度が１０^３コピーであるのに対し、双方のＩＣＡＮｐｒｉｍｅｒの５’末端に隣接する上流領域に相補的な配列ＣＧＣＧＣＧを有するプラスミドＴ１６を鋳型にした場合、ターゲット領域のサイズのバンドとともに高分子側に規則正しいラダー状の産物が見られ、１０コピーが安定して検出され、感度が向上した。また、ラダー産物をゲルより切り出し、ｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩサイトにサブクローニングして、塩基配列を決定したところ、ラダー産物はターゲット領域が双方のＩＣＡＮｐｒｉｍｅｒの５’末端上流領域に存在する相補的な配列ＣＧＣＧＣＧを介して、ターゲット領域が同方向に連結したものであった。
以上のことから、双方のＩＣＡＮｐｒｉｍｅｒの５’末端上流領域に存在する相補的な配列により、ターゲット領域の重合反応が促進され、感度の向上が認められた。

（２）鋳型となる核酸上で、双方のＩＣＡＮｐｒｉｍｅｒの上流領域に存在する相補的配列のＩＣＡＮの反応に及ぼす効果２

鋳型となる核酸上で、双方のＩＣＡＮｐｒｉｍｅｒの５’末端より上流領域にある３塩基の相補的な配列のＩＣＡＮ反応に及ぼす影響を見た。検出対象は、淋菌ｃｐｐＢ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅｃｒｙｐｔｉｃｐｌａｓｍｉｄｐｒｏｔｅｉｎ（ｃｐｐＢ）；ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ．Ｎｏ．：Ｍ１０３１６）遺伝子を選択した。

鋳型は以下のように調製した。
淋菌ゲノム（住商ファーマインターナショナルより購入）を鋳型にＰＪＤＢＦプライマー（配列表の配列番号４３）とＰＪＤＢＲプライマー（配列表の配列番号４４）を用いて、ＰＣＲを行った。得られた断片を平滑化し、プラスミドｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）のＨｉｎｃＩＩサイトに挿入した。得られたプラスミドより、ＰＪＤＢＦプライマーがｐＵＣ１１８にアニールするＭ１３ｐｒｉｍｅｒＭ４（タカラバイオ社製）と同方向であるプラスミドを選別しプラスミドＣｐ１３を得た。
上記プラスミドＣｐ１３を鋳型に、インサート領域を増幅するために、ＰＪＤＢ０ＦＮ３プライマー（配列表の配列番号４５）とＰＪＤＢ０ＲＮ３プライマー（配列表の配列番号４６）を設計した。この場合、ＰＪＤＢ０ＲＮ３プライマーの５’末端に隣接した上流の配列３塩基であるＧＡＣに相補的な配列であるＧＴＣはＰＪＤＢ０ＦＮ３プライマー鎖のターゲット領域にはなく、ＰＪＤＢ０ＦＮ３プライマーの５’末端より上流３４塩基の位置に存在する。この３塩基のＩＣＡＮに及ぼす影響を見た。

上記調製したプラスミドＤＮＡをＯＤ２６０値より計算し、１μｌあたり１０^０、１０^１、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８コピーに調製した。最終濃度３２ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、１％ジメチルスルホキシド、０．１１％ＢＳＡ、４ｍＭ酢酸マグネシウム、各５００μＭｄＮＴＰｓに、ＰＪＤＢ０ＦＮ３キメラオリゴヌクレオチドプライマーとＰＪＤＢ０ＲＮ３キメラオリゴヌクレオチドプライマー各３０ｐｍｏｌ、ＢｃａＢＥＳＴ（タカラバイオ社製）２．８Ｕ、ＡｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ２．２Ｕを含む反応液２４μｌに、１μｌの各コピー数の鋳型ＤＮＡを添加し、サーマルサイクラーパーソナル（タカラバイオ社製）で、５５℃で６０分反応した。増幅産物は３％アガロースゲル電気泳動により確認した。

その結果、ターゲット領域のサイズのバンドとともに高分子側に規則正しいラダー状の産物が見られ、１０^２コピーまで高感度に検出された。また、ラダー産物をゲルより切り出し、ｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩサイトにサブクローニングして、塩基配列を決定したところ、ラダー産物はターゲット領域が双方のＩＣＡＮｐｒｉｍｅｒの５’末端上流領域に存在する相補的な３塩基ＧＡＣとＧＴＣを介して、ターゲット領域が同方向に規則正しく連結したものであった。すなわち、このラダー増幅産物にはＩＣＡＮプライマーに挟まれたターゲット領域とともに、ＰＪＤＢ０ＦＮ３キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端より上流領域３４塩基がターゲット領域に挟まれた形で規則正しく含まれていた。

以上のことから、双方のＩＣＡＮｐｒｉｍｅｒの５’末端上流領域に存在する相補的な配列３塩基で、ターゲット領域の重合反応が促進され、高感度増幅出来ることが確認された。また、増幅産物の検出をプローブによるハイブリで行う場合、プローブの位置は双方のＩＣＡＮｐｒｉｍｅｒにはさまれた領域、あるいは、ＩＣＡＮｐｒｉｍｅｒと双方のＩＣＡＮｐｒｉｍｅｒの５’末端上流領域に存在する相補的な配列にはさまれた領域から選定できることが示された。

実施例４
ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端に付加する、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域にアニールする塩基の長さを６塩基、９塩基、１２塩基（−１〜−６、−１〜−９、−１〜−１２）とした逆転写プライマーを用いて、ＲＴ−ＩＣＡＮの感度、検出速度を検討した。

まず、上記実施例１−（１）で調製した鋳型ＲＮＡをＯＤ２６０値より計算し、１μｌあたり１０^０、１０^１、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５コピーに調製した。
最終濃度３２ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、１％ジメチルスルホキシド、０．１１％ＢＳＡ、４ｍＭ酢酸マグネシウム、各５００μＭｄＮＴＰｓに、上記逆転写プライマーとしてラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの２１５Ｒプライマー、Ａ６−２１５Ｒプライマー（配列表の配列番号４７）、Ａ９−２１５Ｒプライマー（配列表の配列番号４８）、あるいは、Ａ１２−２１５Ｒプライマー各１ｐｍｏｌ、ＲＴａｓｅＭ−ＭＬＶ（タカラバイオ社製）５０Ｕ、１μｌの各コピー数の鋳型ＲＮＡを添加した１０μｌの反応液を調製した。

該反応液はサーマルサイクラーパーソナル（タカラバイオ社製）にセットし、４５℃、１０分間保持後、４℃に冷却した。逆転写反応終了後、該反応液１０μｍＭ酢酸カリウム、１％ジメチルスルホキシド、０．１１％ＢＳＡ、４ｍＭ酢酸マグネシウム、各５００μＭｄＮＴＰｓに、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーのＢ１３４ＦＮ３（１６）プライマーと第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの２０５ＲＮ３（１６）プライマー各２５ｐｍｏｌ、ＢｃａＢＥＳＴ（タカラバイオ社製）１１Ｕ、ＴｌｉＲＮａｓｅＨＩＩ０．０５Ｕ、サイバーグリーンを含む反応液１５μｌを添加し、Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ（ＣＯＲＢＥＴＴＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）により５５℃でＩＣＡＮ反応を行い、増幅産物をリアルタイムで検出した。また、反応産物は３％アガロースゲル電気泳動によっても確認した。

その結果、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域（−１〜−６）にアニールする６塩基を５’末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーのＡ６−２１５Ｒを用いた場合、感度は１０^２コピーであった。６塩基付加することによる検出速度を速める効果は０．９分であった。
第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域（−１〜−９）にアニールする９塩基を５’末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーのＡ９−２１５Ｒを用いた場合、感度は１０^２コピーであった。９塩基付加することによる検出速度を速める効果は１．６分であった。
第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域（−１〜−１２）にアニールする１２塩基を５’末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーのＡ１２−２１５Ｒを用いた場合、感度は１０^１コピーであった。１２塩基付加することによる検出速度を速める効果は３．７分であった。

以上のことから、ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端に付加されている第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域にアニールする配列の効果は、その塩基数が多いほど大きいことが確認された。

実施例５
ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端に付加する、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域にアニールする塩基の長さを１２塩基、１８塩基、（−１〜−１２、−１〜−１８）とした逆転写プライマーを用いたＲＴ−ＩＣＡＮの感度について検討した。

まず、上記実施例１−（１）で調製した鋳型ＲＮＡをＯＤ２６０値より計算し、１μｌあたり１０^０、１０^１、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５コピーに調製した。
最終濃度３２ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、１％ジメチルスルホキシド、０．１１％ＢＳＡ、４ｍＭ酢酸マグネシウム、各５００μＭｄＮＴＰｓに、上記逆転写プライマーとしてラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの２０５ＲＮ３（１８）プライマー、Ａ１２−２０５Ｒプライマー、あるいは、Ａ１８−２０５Ｒプライマー（配列表の配列番号４９）各１ｐｍｏｌ、ＲＴａｓｅＭ−ＭＬＶ（タカラバイオ社製）５０Ｕ、１μｌの各コピー数の鋳型ＲＮＡを添加した１０μｌの反応液を調製した。

該反応液はサーマルサイクラーパーソナル（タカラバイオ社製）にセットし、４５℃、１０分間保持後、４℃に冷却した。逆転写反応終了後、該反応液１０μｌに最終濃度３２ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、１％ジメチルスルホキシド、０．１１％ＢＳＡ、４ｍＭ酢酸マグネシウム、各５００μＭｄＮＴＰｓに、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーのＢ１３４ＦＮ３（１８）プライマーと第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーの２０５ＲＮ３（１８）プライマー各２５ｐｍｏｌ、ＢｃａＢＥＳＴ（タカラバイオ社製）１１Ｕ、ＴｌｉＲＮａｓｅＨＩＩ０．０５Ｕを含む反応液１５μｌを添加し、サーマルサイクラーパーソナル（タカラバイオ社製）により５５℃でＩＣＡＮ反応を行い、増幅産物を３％アガロースゲル電気泳動によっても確認した。

その結果、２０５ＲＮ３プライマーで逆転写したＲＴ−ＩＣＡＮの感度か１０^２コピーであるのに対し、同じ位置で第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域（−１〜−１２）にアニールする１２塩基を５’末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーのＡ１２−２０５Ｒを用いた場合、および、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域（−１〜−１８）にアニールする１８塩基を５’末端に付加したラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーのＡ１８−２０５Ｒを用いた場合感度は１０^１コピーとなり、いずれの場合においても感度が１桁向上した。また、Ａ１２−２０５Ｒ、あるいは、Ａ１８−２０５Ｒを用いた場合の増幅はプライマー上流域のアニールする配列を介して連結した規則正しいラダー状の増幅産物であることが確認された。

以上のことから、第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの上流領域にアニールする塩基の数を変えても、その領域を介したラダー増幅が起こり、感度の向上が認められた。

本発明により、従来の等温核酸増幅方法より優れた増幅方法、該方法に用いるためのプライマーを含む組成物およびキットが提供された。

ＳＥＱＩＤＮＯ．１：ＡｐｏｒｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｉｃＲＮＡｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｅｄｔｏＤＮＡ．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ１ｔｏ５ｉｓＨｉｎｄＩＩＩｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓｉｔｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ２３８ｔｏ２４２ｉｓＢａｍＨＩｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓｉｔｅ．″
ＳＥＱＩＤＮＯ．２：Ｄｅｓｉｇｎｅｄｃｈｉｍｅｒｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓ２０５ＲＮ３（１８）ｆｏｒｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇｃＤＮＡｆｒｏｍｍＲＮＡ，ａｎｄｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅ．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１６ｔｏ１８ａｒｅｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｒｅｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．″
ＳＥＱＩＤＮＯ．３：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＡ１２−２０５ＲｆｏｒｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇｃＤＮＡｆｒｏｍｍＲＮＡ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．４：Ｄｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓ２１５ＲｆｏｒｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇｃＤＮＡｆｒｏｍｍＲＮＡ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．５：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＡ１２−２１５ＲｆｏｒｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇｃＤＮＡｆｒｏｍｍＲＮＡ，ａｎｄｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．６：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＡ１２−２２３ＲｆｏｒｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇｃＤＮＡｆｒｏｍｍＲＮＡ，ａｎｄｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．７：Ｄｅｓｉｇｎｅｄｃｈｉｍｅｒｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓ１３４ＦＮ３（１８）ｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅ．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１６ｔｏ１８ａｒｅｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｒｅｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．″
ＳＥＱＩＤＮＯ．８：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＡ１２（−１０）−２１５ＲｆｏｒｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇｃＤＮＡｆｒｏｍｍＲＮＡ，ａｎｄｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．９：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＡ１２（−２０）−２１５ＲｆｏｒｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇｃＤＮＡｆｒｏｍｍＲＮＡ，ａｎｄｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．１０：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＡ１２（６）−２１５ＲｆｏｒｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇｃＤＮＡｆｒｏｍｍＲＮＡ，ａｎｄｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．１１：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＡ１２（１２）−２１５ＲｆｏｒｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇｃＤＮＡｆｒｏｍｍＲＮＡ，ａｎｄｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．１２：ＤｅｓｉｇｎｅｄｃｈｉｍｅｒｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＢ１３４ＦＮ３（１６）ｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅ．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１４ｔｏ１６ａｒｅｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｒｅｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．″″５’−ｅｎｄｉｓｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈｂｉｏｔｉｎ．″
ＳＥＱＩＤＮＯ．１３：Ｄｅｓｉｇｎｅｄｃｈｉｍｅｒｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓ２０５ＲＮ３（１６）ｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅ．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１４ｔｏ１６ａｒｅｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｒｅｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．″
ＳＥＱＩＤＮＯ．１４：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＡ６（−１０）−２１５ＲｆｏｒｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇｃＤＮＡｆｒｏｍｍＲＮＡ，ａｎｄｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．１５：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＡ９（−１０）−２１５ＲｆｏｒｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇｃＤＮＡｆｒｏｍｍＲＮＡ，ａｎｄｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．１６：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｏｂｅｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＳＡＲＳ−ＢＮＩ−ＢｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇａｎａｍｐｌｉｆｉｅｄａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅ．″５’−ｅｎｄｉｓｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈＦＩＴＣ．″
ＳＥＱＩＤＮＯ．１７：Ｄｅｓｉｇｎｅｄｃｈｉｍｅｒｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓ１６０ＦＮ３ｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅ．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１６ｔｏ１８ａｒｅｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｒｅｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．″
ＳＥＱＩＤＮＯ．１８：Ｄｅｓｉｇｎｅｄｃｈｉｍｅｒｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓ２４１ＲＮ３ｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅ．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１２ｔｏ１４ａｒｅｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｒｅｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．″
ＳＥＱＩＤＮＯ．１９：Ｄｅｓｉｇｎｅｄｃｈｉｍｅｒｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓ（Ａ１２）２４１ＲＮ３ｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅ．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１８ｔｏ２１ａｒｅｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｒｅｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．″
ＳＥＱＩＤＮＯ．２０：Ｄｅｓｉｇｎｅｄｃｈｉｍｅｒｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓ１３４ＦＮ３（１６）ｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅ．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１４ｔｏ１６ａｒｅｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｒｅｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．″
ＳＥＱＩＤＮＯ．２１：ＤｅｓｉｇｎｅｄｃｈｉｍｅｒｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＩＣＡＮ−ＡＬＤＨ２−Ｆｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ２ｇｅｎｅ．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１８ｔｏ２０ａｒｅｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｒｅｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．″
ＳＥＱＩＤＮＯ．２２：ＤｅｓｉｇｎｅｄｃｈｉｍｅｒｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＩＣＡＮ−ＡＬＤＨ２−Ｒｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ２ｇｅｎｅ．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１８ｔｏ２０ａｒｅｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｒｅｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．″
ＳＥＱＩＤＮＯ．２３：ＤｅｓｉｇｎｅｄｃｈｉｍｅｒｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｏｂｅｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＡＬＤＨ２ｗＧｐｒｏｂｅｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇａｎａｍｐｌｉｆｉｅｄａｐｏｒｔｉｏｎｏｆｎａｔｉｖｅｈｕｍａｎａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ２ｇｅｎｅ．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１１ｉｓｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｒｅｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．″″５’−ｅｎｄｉｓｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈＲＯＸ，ａｎｄ３’−ｅｎｄｉｓｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈＥｃｌｉｐｓｅ．″
ＳＥＱＩＤＮＯ．２４：ＤｅｓｉｇｎｅｄｃｈｉｍｅｒｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｏｂｅｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＡＬＤＨ２ｍＡｐｒｏｂｅｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇａｎａｍｐｌｉｆｉｅｄａｐｏｒｔｉｏｎｏｆｍｕｔａｎｔｈｕｍａｎａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ２ｇｅｎｅ．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１１ｉｓｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｒｅｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．″″５’−ｅｎｄｉｓｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈＦＡＭ，ａｎｄ３’−ｅｎｄｉｓｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈＥｃｌｉｐｓｅ．″
ＳＥＱＩＤＮＯ．２５：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＡＬＤＨ２−ＴＨ１ｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ２ｇｅｎｅ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．２６：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＡＬＤＨ２−ＴＨ２ｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ２ｇｅｎｅ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．２７：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＡＬＤＨ２−ＴＨ３ｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ２ｇｅｎｅ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．２８：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰＣＲｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＡＬＤＨ２−Ｆｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ２ｇｅｎｅ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．２９：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰＣＲｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＡＬＤＨ２−Ｒｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ２ｇｅｎｅ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．３０：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＡＬＤＨ２−ＴＨ４ｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ２ｇｅｎｅ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．３１：ＤｅｓｉｇｎｅｄｃｈｉｍｅｒｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＦ２ｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＬｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａｍｉｐｇｅｎｅ．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１５ｔｏ１７ａｒｅｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｒｅｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．″
ＳＥＱＩＤＮＯ．３２：ＤｅｓｉｇｎｅｄｃｈｉｍｅｒｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＲ２ｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＬｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａｍｉｐｇｅｎｅ．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１５ｔｏ１７ａｒｅｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｒｅｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．″
ＳＥＱＩＤＮＯ．３３：ＤｅｓｉｇｎｅｄｃｈｉｍｅｒｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｏｂｅｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＭｉｐ４ｇ１２ｐｒｏｂｅｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇａｎａｍｐｌｉｆｉｅｄａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＬｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａｍｉｐｇｅｎｅ．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ４ｉｓｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｒｅｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．″″５’−ｅｎｄｉｓｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈＦＡＭ，ａｎｄ３’−ｅｎｄｉｓｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈＥｃｌｉｐｓｅ．″
ＳＥＱＩＤＮＯ．３４：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＲ２（−１３）ｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＬｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａｍｉｐｇｅｎｅ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．３５：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＲ２（−１３）Ａ１２−１ｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＬｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａｍｉｐｇｅｎｅ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．３６：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＲ２（−１３）Ａ１２−２ｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＬｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａｍｉｐｇｅｎｅ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．３７：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰＣＲｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓｃ−Ｋｉ−ｒａｓ／１２Ｆｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｃ−Ｋｉ−ｒａｓ２ｇｅｎｅ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．３８：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰＣＲｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓｒａｓＴ１Ｒｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｃ−Ｋｉ−ｒａｓ２ｇｅｎｅ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．３９：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰＣＲｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓｒａｓＴ１４Ｆｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｃ−Ｋｉ−ｒａｓ２ｇｅｎｅ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．４０：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰＣＲｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓｒａｓＴ４Ｒｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｃ−Ｋｉ−ｒａｓ２ｇｅｎｅ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．４１：Ｄｅｓｉｇｎｅｄｃｈｉｍｅｒｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓｃ−Ｋｉ−ｒａｓ／１２ＦＮ３ｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｃ−Ｋｉ−ｒａｓ２ｇｅｎｅ．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１８ｔｏ２０ａｒｅｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｒｅｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．″
ＳＥＱＩＤＮＯ．４２：Ｄｅｓｉｇｎｅｄｃｈｉｍｅｒｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓｃ−Ｋｉ−ｒａｓ／１２ＲＮ３ｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｈｕｍａｎｃ−Ｋｉ−ｒａｓ２ｇｅｎｅ．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１８ｔｏ２０ａｒｅｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｒｅｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．″
ＳＥＱＩＤＮＯ．４３：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＰＪＤＢＦｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＮｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅｃｐｐＢｇｅｎｅ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．４４：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＰＪＤＢＲｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＮｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅｃｐｐＢｇｅｎｅ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．４５：ＤｅｓｉｇｎｅｄｃｈｉｍｅｒｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＰＪＤＢ０ＦＮ３ｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＮｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅｃｐｐＢｇｅｎｅ．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１８ｔｏ２０ａｒｅｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｒｅｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．″
ＳＥＱＩＤＮＯ．４６：ＤｅｓｉｇｎｅｄｃｈｉｍｅｒｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＰＪＤＢ０ＲＮ３ｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＮｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅｃｐｐＢｇｅｎｅ．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１５ｔｏ１７ａｒｅｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｒｅｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．″
ＳＥＱＩＤＮＯ．４７：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＡ６−２１５ＲｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．４８：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＡ９−２１５ＲｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅ．
ＳＥＱＩＤＮＯ．４９：ＤｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＡ１８−２０５ＲｔｏａｍｐｌｉｆｙａｐｏｒｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅ．

Claims

核酸を増幅する方法において、
（Ａ）下記（ａ）又は（ｂ）から選択される反応混合物を調製する工程、
（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも１種類のラダー形成オリゴヌクレオチドプライマー、およびＲＮａｓｅＨ、
（ｂ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、およびＲＮａｓｅＨ、ここで、一方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーはラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーとして作用し、
ここで、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されており、
上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に相補的な第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと、鋳型となる核酸の塩基配列に相同的な第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも２種類を含んでおり、
上記ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型となる核酸の当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領域および／またはその領域より３’側の塩基配列に相補的な配列を有し、鋳型となる核酸と相同的な第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側の塩基配列、鋳型となる核酸の当該第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相同な領域の５’末端よりさらに５’側方向の領域に相当する塩基配列あるいはその両方に相補的な配列を５’側に有し、
および
（Ｂ）鋳型となる核酸へのプライマーの特異的なアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長鎖合成反応及び鎖置換反応、並びにＲＮａｓｅＨによる伸長鎖の切断反応が行える一定の温度条件でラダー状増幅産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートする工程、
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法。
鋳型となる核酸がＲＮＡであり、当該核酸をあらかじめデオキシリボヌクレオチド３リン酸、逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及び少なくとも１種類のラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーで処理し、逆転写産物とする、請求項１記載の方法。
工程（Ａ）における反応混合物がさらに逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含有する、請求項１記載の方法。
鋳型となる核酸がｍＲＮＡであることを特徴する、請求項２又は３記載の方法。
逆転写活性と鎖置換活性とを有する１つのＤＮＡポリメラーゼが、逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼおよび鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼとして作用することを特徴とする、請求項２又は３記載の方法。
請求項１記載の核酸の増幅方法のための組成物であって、それぞれ少なくとも１種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び／又はラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーを含有する組成物。
請求項１記載の核酸の増幅方法のためのキットであって、それぞれ少なくとも１種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び／又はラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーを含有するキット。
下記工程を包含することを特徴とする標的核酸の検出方法；
（ａ）請求項１記載の核酸の増幅方法により、標的核酸を増幅する工程；および、
（ｂ）上記工程により増幅された標的核酸を検出する工程。
請求項１記載の核酸の増幅方法に用いるプライマーであって、鋳型となる核酸と相同的なプライマーの５’側の塩基配列、鋳型となる核酸の当該第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相同な領域の５’末端よりさらに５’側方向の領域に相当する塩基配列あるいはその両方に相補的な配列を５’側に有することを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマー。