JPWO2003016569A1 - 核酸の増幅方法 - Google Patents
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Abstract
試料中の標的核酸の高感度、特異的に増幅する標的核酸の増幅方法、及びこれらの方法に用いる組成物及びキット。
Description
技術分野
本発明は、臨床分野において有用な標的核酸の検出方法及び遺伝子工学分野において有用なDNAの合成方法に関し、鋳型となる核酸の増幅方法および該方法で増幅された標的核酸の検出方法に関する。
背景技術
遺伝子工学分野の研究においてDNAの合成は種々の目的に使用される。このうちオリゴヌクレオチドのような短鎖のDNAの合成を除けば、そのほとんどはDNAポリメラーゼを利用した酵素的方法により実施されている。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR法)があるが、それは米国特許第4,683,195号、第4,683,202号および第4,800,159号に詳細に記述されている。もう一つの例としては、トレンズ イン バイオテクノロジー(Trends in Biotechnology)第10巻、146〜152頁(1992)に記載の当該方法と逆転写酵素反応を組合わせた逆転写PCR法(RT−PCR法)が挙げられる。上記の方法の開発により、DNAから、若しくはRNAから目的とする領域を増幅することが可能になった。
これらのDNA合成方法は、目的とするDNA領域を増幅させるために例えば、二本鎖鋳型DNAの一本鎖への解離(変性)、一本鎖鋳型DNAへのプライマーのアニーリング、プライマーからの相補鎖合成(伸長)の3つのステップからなる反応により、もしくは、”シャトルPCR”(『PCR法最前線』、「蛋白質核酸 酵素」別冊、第41巻、第5号、425頁〜428頁(1996))と呼ばれる、前述の3ステップ反応のうちプライマーのアニーリングおよび伸長のステップを同一温度で行なう2ステップ反応により実施される。
さらに、別法としては、1989年6月14日に公開された欧州特許出願第320,308号に記述されているリガーゼ連鎖反応(LCR;ligase chain reaction)法、あるいはPCR プロトコールズ(PCR Protocols,Academic Press.Inc.,1990)245〜252頁に記述されている転写増幅システム(TAS;transcription−based amplification system)法が挙げられる。上記4法は、次の増幅サイクルのための一本鎖標的分子を再生するために、高温から低温の反応を何回も繰り返す必要がある。このように温度によって反応が制約されるため、反応系は不連続な相またはサイクルで行なう必要がある。
従って、上記の方法には広い温度範囲で、かつ、厳密な温度調整を経時的に行なうことのできる高価なサーマルサイクラーを使用することが必要となる。また、該反応は、2種類〜3種類の温度条件で行なうため設定温度にするために要する時間が必要であり、そのロス時間はサイクル数に比例して増大していく。
そこで、上記問題点を解決すべく等温状態で実施可能な核酸増幅法が開発された。例えば、特公平7−114718号に記載の鎖置換型増幅(SDA;strand displacement amplification)法、自立複製(3SR;self−sustained sequence replication)法、日本国特許番号第2650159号に記載の核酸配列増幅(NASBA;nucleic acid sequence based amplification)法、TMA(transcription−mediated amplification)法、日本国特許番号第2710159号に記載のQβレプリカーゼ法、さらに米国特許番号第5,824,517号、国際公開第99/09211号パンフレット、国際公開第95/25180号パンフレットあるいは、国際公開第99/49081号パンフレット等に記載の種々の改良SDA法が挙げられる。米国特許番号第5,916,777号には等温状態でのオリゴヌクレオチドの酵素的合成方法が記載されている。これらの等温核酸増幅法またはオリゴヌクレオチド合成法の反応においては、プライマーの伸長や、一本鎖伸長生成物(または元の標的配列)へのプライマーのアニーリングや、それに続くプライマーの伸長は、一定温度で保温された反応混合物中で同時に起こる。
これらの等温核酸増幅法のうち最終的にDNAが増幅される系、例えば、SDA法は、DNAポリメラーゼと制限エンドヌクレアーゼを介する二本鎖の置換による、試料中の標的核酸配列(およびその相補鎖)の増幅法であるが、該方法では、増幅に使用するプライマーは4種類必要であり、その内の2種類は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含むように構築する必要がある。また、該方法では、DNA合成のための基質として、修飾されたデオキシリボヌクレオチド3リン酸、例えばα位のリン酸基の酸素原子が硫黄原子(S)に置換された(α−S)デオキシリボヌクレオチド3リン酸を大量に用いる必要があり、ルーチンワークで反応を行なう遺伝子検査等においては、そのランニングコストが深刻な問題となってくる。さらに該方法では、増幅されたDNA断片中に上記の修飾ヌクレオチド、たとえば(α−S)デオキシリボヌクレオチドが含まれるため、例えば、増幅後のDNA断片を制限酵素長多型(RFLP;restriction enzyme fragment length polymorphism)解析に供しようとする場合に、該断片が制限酵素で切断できないことがある。
また、米国特許番号第5,824,517号記載の改良SDA法は、RNAとDNAから構成され、少なくとも3’末端にDNAが配置された構造を必須要件とするキメラプライマーを使用するDNA増幅方法である。また、国際公開第99/09211号パンフレットに記載の改良SDA法は、3’突出末端を生じさせる制限酵素が必要である。また、国際公開第95/25180号パンフレットに記載の改良SDA法は、少なくとも2組のプライマー対を必要とする。さらに、国際公開第99/49081号パンフレットに記載の改良SDA法は、少なくとも2組のプライマーと少なくとも1種類の修飾デオキシリボヌクレオチド3リン酸を必要とする。一方、米国特許番号第5,916,777号は、オリゴヌクレオチドを合成するために、3’末端にリボヌクレオチドを有するプライマーを使用してDNAを合成し、反応終了後にエンドヌクレアーゼによりプライマー伸長鎖中のプライマーと伸長鎖の間にニックをいれて分離させ、テンプレートを消化し、さらにプライマーを回収して再利用するというものである。該方法では、プライマーを再利用する際には反応系よりプライマーを単離したうえで鋳型を再度アニーリングさせる必要がある。また、国際公開第00/28082号パンフレットに記載のLAMP(Loop−mediated Isothermal Amplification)法は増幅に4種類のプライマーを必要とし、また、増幅産物は増幅の標的とされた領域が繰り返された、サイズの一定しないDNAである。
さらに、キメラオリゴヌクレオチドプライマーを用いた等温核酸増幅方法として、国際公開第00/56877号あるいは国際公開第02/16639号パンフレットに記載のICAN(Isothermal and Chimeric primer−initiated Amplification of Nucleic acids)法がある。しかしながら、従来の等温核酸増幅法はまだまだ種々の問題をかかえており、低ランニングコストで、かつ結果的に得られたDNA断片をさらに遺伝子工学的な処理に使用することが可能な核酸の増幅方法が求められていた。
発明の目的
本発明の主な目的は、試料中の標的核酸の高感度、特異的に増幅する標的核酸の増幅方法、及びこれらの方法に用いる組成物及びキットを提供することにある。
発明の概要
本発明者らは鋭意研究の結果、国際公開第00/56877号あるいは国際公開第02/16639号パンフレットに記載のICAN法において、キメラオリゴヌクレオチドプライマー及び鋳型となる核酸の該プライマーのアニーリングする位置の3’側にアニーリングする上流ブロックオリゴヌクレオチドを組み合わせて使用することにより、標的核酸の増幅効率が向上し、検出感度が改善されることを見いだし、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の第1の発明は、核酸を増幅する方法において、
(a)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも1種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも1種類の上流ブロックオリゴヌクレオチド、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで該キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの3’末端又は3’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり、該上流ブロックオリゴヌクレオチドは、鋳型となる核酸の当該キメラオリゴヌクレオチドプライマーと実質的に相補的な領域の3’側の塩基配列に実質的に相補的であり、かつその3’末端塩基がDNAポリメラーゼによる相補鎖伸長反応が起こらないように修飾されており;および、
(b)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートする工程、
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法に関する。
本発明の第1の発明において、さらに鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相同な配列を有する第2のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有する反応混合物を使用してもよく、さらに鋳型となる核酸の、第2のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列に実質的に相同な配列を有する領域の5’側の塩基配列と実質的に相同的な配列を有し、かつその3’末端の塩基がDNAポリメラーゼによる相補鎖伸長反応が起こらないように修飾されている上流ブロックオリゴヌクレオチドを含有する反応混合物を使用してもよい。
本発明の第2の発明は、本発明の第1の発明の核酸の増幅方法のための組成物であって、それぞれ少なくとも1種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流ブロックオリゴヌクレオチドを含有する組成物に関する。
本発明の第3の発明は、本発明の第1の発明の核酸の増幅方法のためのキットであって、それぞれ少なくとも1種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流ブロックオリゴヌクレオチドを含有するキットに関する。
本発明の第4の発明は、下記工程を包含することを特徴とする標的核酸の検出方法に関する;
(a)本発明の第1の発明の核酸の増幅方法により、標的核酸を増幅する工程;および、
(b)上記工程により増幅された標的核酸を検出する工程;
を包含する。
発明の詳細な説明
本明細書においてデオキシリボヌクレオチド(本明細書中ではdNとも記載する)とは、糖部分がD−2−デオキシリボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、例えば、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、チミンを有するものが挙げられる。さらに、7−デアザグアノシン等の修飾塩基を有するデオキシリボヌクレオチドやデオキシイノシンヌクレオチドのようなデオキシリボヌクレオチドアナログも上記のデオキシリボヌクレオチドに包含される。
本明細書においてリボヌクレオチド(本明細書中ではNとも記載する)とは、糖部分がD−リボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、ウラシルを有するものが挙げられる。さらに、当該リボヌクレオチドには修飾リボヌクレオチドが包含され、例えばα位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えた修飾リボヌクレオチド[(α−S)リボヌクレオチド、(α−S)Nとも記載する]やこの他の誘導体等も含まれる。
本発明に使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、該プライマーの3’末端又は3’末端側にリボヌクレオチドを配置し、本発明の方法において核酸鎖が伸長でき、エンドヌクレアーゼで切断でき、鎖置換反応を行うことができるものであれば、いずれもが本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーに包含される。
本明細書において3’末端側とは、核酸、例えば、プライマーにおいてその中央より3’末端にかけての部分を指す。同様に5’末端側とは、核酸においてその中央より5’末端にかけての部分を指す。
本明細書において上流位置とは、本発明の方法に用いるキメラオリゴヌクレオチドプライマーの5’末端よりもさらに5’側の任意の位置を言う。従って、キメラオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングする鋳型となる核酸鎖から見ると該プライマーよりも3’側の任意の位置である。
本明細書においてエンドヌクレアーゼとは、鋳型核酸にアニーリングした上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーよりDNAの伸長を行って生成した二本鎖DNAに作用して、該プライマーのリボヌクレオチド部分を特異的に切断するものであればよい。
本明細書においてDNAポリメラーゼとは、DNA鎖を鋳型として新たなDNA鎖を合成する酵素のことを言い、天然型のDNAポリメラーゼの他、前記活性を有する変異体酵素も包含される。当該酵素としては、例えば鎖置換(Strand displacement)活性を有するDNAポリメラーゼ、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有していないDNAポリメラーゼ、逆転写酵素活性やエンドヌクレアーゼ活性を併せ持つDNAポリメラーゼが挙げられる。
本明細書において「鎖置換活性」とは、鋳型となる核酸配列に従ってDNA複製を行う際、DNA鎖を置き換えながら進行し、鋳型鎖にアニーリングしている相補鎖を遊離させる、即ち鎖置換(strand displacement)することができる活性のことをいう。また、本明細書においては、鎖置換により鋳型となる核酸配列から遊離したDNA鎖のことを「置換鎖」と称する。
以下、本発明を詳細に説明する。
(1)本発明に使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマー
本発明の方法において使用されるプライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーである。該プライマーには未修飾リボヌクレオチドおよび/または修飾リボヌクレオチドを含有するオリゴリボヌクレオチドプライマーも含まれる。
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列の一部に実質的に相補的な塩基配列を有し、使用される条件において、DNA鎖の伸長に寄与することができ、さらに、その3’末端又は3’末端側にリボヌクレオチドが配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーである。当該プライマーは通常、増幅しようとする領域の上流、すなわち鋳型核酸上の増幅しようとする領域に対応する塩基配列の3’側部分に相補的に設計される。なお、ここで「実質的に相補的な塩基配列」とは、使用される反応条件において鋳型となるDNAにアニーリング可能な塩基配列を意味する。
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは1以上の修飾リボヌクレオチドを含有するものであってもよい。即ち、本明細書においてリボヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端又は3’末端側に配置され、エンドヌクレアーゼにより認識あるいは切断されるものであれば、未修飾リボヌクレオチドおよび/または修飾リボヌクレオチドのいずれであってもよく、そのような未修飾あるいは修飾リボヌクレオチドのいずれもが包含される。すなわち、本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーには、当該プライマーの機能を失わない範囲で未修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチドを使用することができ、さらにこれらを組合せて使用することができる。このような修飾リボヌクレオチドとしては、特に限定するものではないが、たとえば、リン酸基に結合する酸素原子が硫黄原子に置換された(α−S)リボヌクレオチドや、リボースの2位の水酸基がメトキシ基に置換されたリボヌクレオチドが挙げられる。このような修飾リボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、米国特許第5,003,097号記載の硫化反応試薬(グレンリサーチ社製)を用いた方法で調製した(α−S)リボヌクレオチド3リン酸、あるいは2−OMe−RNA−CE ホスホアミダイド試薬(グレンリサーチ社製)を用いて作製することができる。
また、エンドヌクレアーゼによる切断に耐性を付与するような性質の修飾リボヌクレオチドを含有し、本発明の増幅方法に使用できるキメラオリゴヌクレオチドプライマーを設計してもよく、この様なプライマーは、増幅反応工程におけるエンドヌクレアーゼの切断位置を制御し得る点において有用である。
本発明の方法で使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、増幅後のDNA断片を一本鎖もしくは二本鎖のいずれの形態で得たいかによって1種類もしくは2種類を使い分けることができる。すなわち、一本鎖DNAが望まれる場合には1種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを、また、二本鎖が望まれる場合には2種類のプライマーが使用される。
本発明で使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、当該プライマーの3’末端又は3’末端側にリボヌクレオチドが存在し、ICAN法に使用できるものであればその鎖長に特に限定はない。
上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば約6ヌクレオチドから約100ヌクレオチドの範囲、好ましくは、約10ヌクレオチドから約50ヌクレオチドの範囲、さらに好ましくは、約12ヌクレオチドから約40ヌクレオチドの範囲の鎖長のものが使用できる。その塩基配列は使用される反応条件において鋳型核酸にアニーリングするように、実質的に鋳型核酸に相補的な配列であることが好ましい。該プライマーは、後に示す段階で使用されるエンドヌクレアーゼにより認識される配列を3’末端又は3’末端側に含む。
本発明を何ら限定するものではないが、例えば、下記一般式で表す構造をもつオリゴヌクレオチドを本発明のDNA合成方法にプライマーとして使用することができる。
一般式:5’−dNa−Nb−dNc−3’
上記一般式において、dN:デオキシリボヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログ、N:未修飾リボヌクレオチド及び/又は修飾リボヌクレオチド、なお、dNaの部位の一部のdNはNで置換されていてもよく、3’末端のヌクレオチドは当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないような修飾を有していてもよい。
上記一般式において、特に限定はされないが、例えば、aは5以上の整数であればよく、好ましくは6以上の整数、さらに好ましくは8以上の整数である。またbは1以上の整数であればよく、例えば1〜15の範囲、好ましくは1〜10の範囲、さらに好ましくは1〜7の範囲、特に好ましくは1〜5の範囲である。さらにcは0であってもよく、あるいは1以上の整数であり、好ましくは0〜5の範囲、さらに好ましくは0〜3の範囲である。
本発明に用いられるキメラオリゴヌクレオチドプライマーの態様としては、特に限定はされないが、例えば、a=8の場合における、b=1、c=0のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、b=2、c=0のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、b=3〜5、c=0のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、さらにb=2〜3、c=0〜3のキメラオリゴヌクレオチドプライマー等が例示される。すなわち、本発明の方法に使用できるようなキメラオリゴヌクレオチドプライマーとなるようにa、b、cの数値を調整すればよい。
本発明に使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、該プライマーよりDNAポリメラーゼで伸長されたDNA鎖(プライマー伸長鎖)に含まれるリボヌクレオチド含有部位がエンドヌクレアーゼで認識あるいは切断されるような構造を有しており、当該リボヌクレオチドはその3’末端又は3’末端側に配置されている。本発明を特に限定するものではないが、例えば、鋳型核酸にアニーリングした、上記の一般式で表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーよりDNAの伸長を行って生成した二本鎖DNAにRNaseHを作用させた場合には、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーのリボヌクレオチド部分が切断され、上記オリゴヌクレオチドプライマーと伸長により合成されたDNA鎖の間にニックの入った二本鎖DNAが生じる。さらに、該ニックの入った部位からDNAポリメラーゼにより鎖置換反応がおこる。従って、プライマーの3’末端から核酸鎖を伸長させることができ、エンドヌクレアーゼにより切断されることができ、そしてDNAポリメラーゼにより鎖置換反応ができるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは全て本発明の方法に使用することができる。さらに、本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーには、その3’末端がDNAポリメラーゼによる伸長が不可能な形に修飾されており、エンドヌクレアーゼによる切断によって生じた3’末端からDNAの伸長が行われるものが包含される。
また、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーの5’末端側には、RNAポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいてもよい。該RNAポリメラーゼとしては、T7 RNAポリメラーゼあるいはSP6 RNAポリメラーゼが例示される。
さらに本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーはヌクレオチドアナログやその他の物質を含有するものであってもよい。即ち、本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーには、DNAポリメラーゼがその3’末端からポリメラーゼ伸長反応せしめる、プライマーの機能を失わない範囲で1以上のヌクレオチドアナログを含有させることができ、さらに、当該ヌクレオチドアナログは複数の種類のものを組合せて使用することができる。該ヌクレオチドアナログとしては、特に限定はされないが、例えば、デオキシイノシンヌクレオチド、デオキシウラシルヌクレオチドあるいは7−デアザグアニンのような修飾塩基を有するヌクレオチドアナログ、リボースの誘導体を有するヌクレオチドアナログ等を使用することができる。また、本発明に使用されるキメラオリゴヌクレオチドは、上記の機能を保持する範囲内で種々の修飾、例えば標識化合物等の付加がなされたデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログを含有してもよい。
ヌクレオチドアナログのプライマーへの導入は、プライマー自身の高次構造形成の抑制、鋳型とのアニーリング形成の安定化の観点からも有効である。さらに、同様の目的でリボヌクレオチドをプライマーに導入しても良い。特に限定するものではないが、非特異的なエンドヌクレアーゼ(RNase)によるプライマーの分解を防ぐ観点からは、例えば、(α―S)リボヌクレオチドのような修飾リボヌクレオチドが好適に使用できる。
これらのキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、任意の核酸配列を持つように、例えばアプライド バイオシステムズ社(ABI社、Applied Biosystems Inc.)のDNAシンセサイザー394型を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。また、別法としてリン酸トリエステル法、H−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであっても良い。
(2)本発明に使用する上流ブロックオリゴヌクレオチド
本発明の方法において使用される上流ブロックオリゴヌクレオチドは、少なくともデオキシリボヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから選択されるものが好適に使用できる。
本発明の方法において使用される上流ブロックオリゴヌクレオチドは、鋳型核酸の塩基配列の一部に実質的に相補的な塩基配列を有し、鋳型となる核酸上の上記(1)のキメラオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング位置のさらに3’側の領域にアニーリングできるものが好適に使用できる。当該オリゴヌクレオチドは通常、増幅しようとする領域の上流、すなわち鋳型核酸上の増幅しようとする領域に対応する塩基配列の3’側部分に相補的に設計される。なお、ここで「実質的に相補的な塩基配列」とは、使用される反応条件において鋳型となるDNAにアニーリング可能な塩基配列を意味する。
上記のように、本発明の上流ブロックオリゴはその3’末端がDNAポリメラーゼによるDNA伸長反応に使用できない形に修飾されている。上記目的を達成可能であればその修飾手段には特に限定はないが、例えば、3’末端にジデオキシヌクレオチド、リボースの3位の水酸基が修飾されたヌクレオチド、DNAポリメラーゼによる伸長が立体障害により妨害されるような修飾を付されたヌクレオチド等を付加することがあげられる。上記上流ブロックオリゴのリボースの3位の水酸基の修飾方法としては、アルキル化やその他の公知の修飾方法を利用することができ、例えばアミノアルキル化することにより、DNA伸長反応を防ぐことができる。
本発明の方法で使用する上流ブロックオリゴヌクレオチドは、増幅後のDNA断片を一本鎖もしくは二本鎖のいずれの形態で得たいかによって1種類もしくは2種類を使い分けることができる。すなわち、一本鎖DNAが望まれる場合には1種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流ブロックオリゴヌクレオチドを、また、二本鎖が望まれる場合にはそれぞれ2種類の上記プライマー及びブロックオリゴヌクレオチドが使用される。
本発明の方法で使用する上流ブロックオリゴヌクレオチドのアニーリングする鋳型となる核酸上の位置は、標的核酸の塩基配列、増幅領域の長さ及び組み合わせるキメラオリゴヌクレオチドプライマーの標的核酸へのアニーリング位置によって最も増幅効率が良くなるような位置であれば特に限定はないが、例えばキメラオリゴヌクレオチドプライマーの5’末端から1塩基以上の範囲にその3’末端が位置するように設定される。
本発明の方法に用いられる上流ブロックオリゴヌクレオチドは、目的の増幅断片の検出感度の向上等の効果が得られるものであれば、いずれの鎖長のものも好適に使用できる。
特に限定されるものではないが、約6ヌクレオチドから約100ヌクレオチドの範囲、好ましくは約10ヌクレオチドから約50ヌクレオチドの範囲、さらに好ましくは約12ヌクレオチドから約40ヌクレオチドの範囲の上流ブロックオリゴヌクレオチドが例示される。その塩基配列は使用される反応条件において鋳型核酸にアニーリングするように、実質的に鋳型核酸に相補的な配列であることが好ましい。
さらに本発明の方法において使用される上流ブロックオリゴヌクレオチドはヌクレオチドアナログやその他の物質を含有するものであってもよい。本発明の上流ブロックオリゴヌクレオチドには、1以上のヌクレオチドアナログを含有させることができ、さらに、当該ヌクレオチドアナログは複数の種類のものを組合せて使用することができる。該ヌクレオチドアナログとしては、特に限定はされないが、例えば、デオキシイノシンヌクレオチド、デオキシウラシルヌクレオチドあるいは7−デアザグアニンのような修飾塩基を有するヌクレオチドアナログ、リボースの誘導体を有するヌクレオチドアナログ等を使用することができる。また、本発明に使用される上流ブロックオリゴヌクレオチドは、種々の修飾、例えば標識化合物等の付加がなされたデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログを含有してもよい。
ヌクレオチドアナログの当該ブロックオリゴヌクレオチドへの導入は、該オリゴヌクレオチド自身の高次構造形成の抑制、鋳型とのアニーリング形成の安定化の観点からも有効である。
これらの上流ブロックオリゴヌクレオチドは、任意の核酸配列を持つように、例えばアプライド バイオシステムズ社(ABI社、Applied Biosystems Inc.)のDNAシンセサイザー394型を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。また、別法としてリン酸トリエステル法、H−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであっても良い。
(3)本発明に使用されるエンドヌクレアーゼ
本発明に使用されるエンドヌクレアーゼとは、鋳型核酸にアニーリングした上記(1)に記載のキメラオリゴヌクレオチドプライマーよりDNAの伸長を行って生成した二本鎖DNAに作用して、鎖置換反応が起こるように伸長鎖を切断しうるものであればよい。即ち、上記の二本鎖DNAのうちのキメラオリゴヌクレオチドプライマー部分にニックを生成しうる酵素である。特に限定されるものではないが、例えば、本発明にはリボヌクレアーゼが使用でき、特にDNAとRNAとから形成された二本鎖核酸のRNA部分に作用するエンドリボヌクレアーゼH(RNaseH)が好適に使用できる。また、該リボヌクレアーゼには、上記作用を有するものであれば、常温性から耐熱性のリボヌクレアーゼのいずれもが好適に本発明に使用できる。例えば、本発明の方法の一態様として、約50℃〜約70℃での反応の場合において、大腸菌(E.coli)由来のRNaseHを使用することができる。また、耐熱性のリボヌクレアーゼも好適に使用できる。該耐熱性リボヌクレアーゼとしては、特に限定はされないが、例えば市販のHybridaseTM Thermostable RNaseH(エピセンターテクノロジーズ社製)の他、好熱性バチルス(Bacillus)属細菌、サーマス(Thermas)属細菌、ピロコッカス(Pyrococcus)属細菌、サーモトガ(Thermotoga)属細菌、アルカエオグロバス(Archaeoglobus)属細菌等由来のRNaseH等も好適に使用できる。さらに、該リボヌクレアーゼは、天然体および変異体のいずれもが好適に使用できる。なお、本願明細書に記載されているRNaseHの酵素単位は、実施例中の参考例に示した酵素単位測定方法に基づいて表示された数値である。
また、上記RNaseHは、本発明の方法に使用できるものであれば特に限定はなく、例えば、種々のウイルス、ファージ、原核、真核生物由来のいずれであってもよい。さらに、細胞性RNaseHあるいはウイルス性RNaseHのいずれであってもよい。例えば、上記細胞性RNaseHとしては大腸菌RNaseHIが、ウイルス性RNaseHとしてはHIV−1由来RNaseHが例示される。本発明の方法においてRNaseHは、I型、II型、III型のいずれもが使用できる。特に限定はされないが、例えば大腸菌由来RNaseHI、ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカエオグロバス属細菌由来RNaseHIIが好適である。
また、本発明の方法に使用するエンドヌクレアーゼ、例えば、RNaseHの切断反応の効率は上記プライマーの3’末端近傍の塩基配列に左右され、所望のDNAの増幅効率に影響することが考えられるので、使用するRNaseHに最適なプライマーをデザインすることは当然のことである。
本明細書において使用されている「ニックを入れる」もしくは「ニッキング」という語は、二本鎖核酸の一方の鎖の内部を切断することを意味する。たとえば、RNaseHはDNAとリボヌクレオチドを含むDNAとのハイブリッド二本鎖核酸に作用し、二本鎖のうちのリボヌクレオチドを含む鎖のリボヌクレオチド部分を選択的に切断することにより、当該ハイブリッド二本鎖核酸にニックを入れる。
(4)本発明に使用されるDNAポリメラーゼ
本発明には、DNAの鎖置換(strand displacement)活性を有するDNAポリメラーゼを使用することができる。また、実質的に5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものが特に好適に使用することができる。
本発明に使用されるDNAポリメラーゼは、上記の鎖置換活性を有するものであれば特に限定はなく、例えば、バチルス カルドテナックス(Bacillus caldotenax、以下、B.caと称す)やバチルス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus、以下B.stと称す)等の好熱性バチルス属細菌由来DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体や、大腸菌(以下、E.coliと称す)由来のDNAポリメラーゼIのラージ フラグメント(クレノウ断片)等が挙げられる。また、本発明に使用できるDNAポリメラーゼは、常温性から耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。
B.caは生育至適温度が約70℃である好熱性細菌であり、この細菌由来のBca DNAポリメラーゼは、DNA依存DNAポリメラーゼ活性、RNA依存DNAポリメラーゼ活性(逆転写活性)、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。上記の酵素は、その本来の起源より精製して取得されたもの、あるいは遺伝子工学的に生産された組み換え蛋白質の何れであっても良い。また、該酵素は、遺伝子工学的あるいはその他の手法によって置換、欠失、付加、挿入等の改変を加えたものであっても良く、このような酵素の例として、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたBca DNAポリメラーゼであるBcaBEST DNAポリメラーゼ(宝酒造社製)等が挙げられる。
なお、DNAポリメラーゼの中には、特定の条件でエンドヌクレアーゼ活性、例えば、RNaseH活性を有するものが知られている。このようなDNAポリメラーゼを本発明の方法に用いることができる。すなわち、該DNAポリメラーゼをRNaseH活性が発現されるような条件下、例えばMn2+の存在下で使用する態様が挙げられる。該態様においては、上記RNaseHを添加することなく本発明の方法を実施することができる。すなわち、Mn2+を含有する緩衝液中で上記のBca DNAポリメラーゼがRNaseH活性を示すことができる。なお、上記の態様はBca DNAポリメラーゼに限定されるものではなく、RNaseH活性を併せ持つことが知られている公知のDNAポリメラーゼ、例えばサーマス サーモフィラス(Thermus thermophilus)由来のTth DNAポリメラーゼも本発明に使用することができる。
(5)本発明の標的核酸の増幅方法
本発明の方法は、上記(1)に示されたキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上記(2)に示された上流ブロックオリゴヌクレオチドをそれぞれ少なくとも1種類使用し、さらに上記(3)に示されたエンドヌクレアーゼおよび上記(4)に示されたDNAポリメラーゼを組合わせて実施することができる。また、上記のようにRNaseH活性を有するDNAポリメラーゼをRNaseH活性が発現するような条件で使用することができる。
当該方法では、伸長反応の基質となるヌクレオチド3リン酸としてPCR法等に使われるdNTP、すなわちdATP、dCTP、dGTP、dTTPの混合物が好適に使用できる。また、dUTPを基質として用いてもよい。さらに、当該dNTPは、使用されるDNAポリメラーゼの基質となる限りにおいては、dNTP(デオキシリボヌクレオチド3リン酸)のアナログ、たとえば7−デアザ−dGTP、dITPの3リン酸等を含んでいてもよい。また、dNTPあるいはdNTPアナログの誘導体を使用してもよく、官能基を有する誘導体、例えばアミノ基を有するdUTPを含んでいてもよい。当該方法では、キメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用するが、当該プライマーは、例えば、DNA合成機等を用いて通常の合成方法と同様に調製することができる。
本発明の方法に用いるキメラオリゴヌクレオチドプライマーと上流ブロックオリゴヌクレオチドの使用量は、標的核酸の塩基配列、目的の増幅断片長及び使用する反応系組成により調整すれば良く、例えば増幅産物量を目安に調整することができる。即ち、本発明の方法において、目的の増幅産物を得られるならば、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーと上記ブロックオリゴヌクレオチドの使用量は限定されない。
本発明において、使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーと上流ブロックオリゴヌクレオチドのモル比は、目的の増幅産物を得られるならば、そのモル比に限定はない。
本発明の方法の一態様として、キメラオリゴヌクレオチドプライマー:上流ブロックオリゴヌクレオチドのモル比は、例えば、1:0.1〜1:10の範囲、好ましくは1:0.2〜1:5の範囲、さらに好ましくは1:0.25〜1:4の範囲である。
本発明の方法においては、使用される酵素の活性が反応中に低下するおそれのある場合には、反応の途中で当該酵素をさらに添加することができる。添加する酵素は、反応開始時に反応液中に含まれる酵素と同じものでもよいし、同じ作用を示す異なる種類の酵素であってもよい。すなわち、反応途中で添加することにより、検出感度の向上あるいは増幅産物量の増大等の効果が得られるならば、添加する酵素の種類及び該酵素の性質には何ら限定はない。
本発明の方法において鋳型となる核酸、すなわちDNAまたはRNAは、当該核酸を含む可能性のあるあらゆる試料から調製、あるいは単離したものでもよい。さらに、上記試料を直接、本発明の核酸増幅反応に使用してもよい。このような核酸を含む試料には特に限定はないが、例えば、全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織(例えば、癌組織、リンパ節等)、細胞培養物(例えば、哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物等)のような生体由来試料、ウイロイド、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のような核酸含有試料、ウイルス又は細菌のような微生物が混入もしくは感染している可能性のある試料(食品、生物学的製剤等)、あるいは土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料が挙げられる。また、前記試料等を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物であっても良い。該調製物としては、例えば細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中の核酸、あるいは特定の核酸分子群、例えば、mRNAを富化した試料等が本発明に使用できる。さらに上記試料中に含まれる核酸が公知方法で増幅されたDNAあるいはRNA等の核酸等も好適に使用できる。
これら材料からの核酸含有調製物の調製には特に限定はなく、例えば、界面活性剤による溶解処理、超音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌、フレンチプレスの使用等により行うことができる。幾つかの例においては、さらに操作を加えて核酸を精製することが有利である(例えば、内在性ヌクレアーゼが存在するとき)。これらの例において、核酸の精製はフェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動または密度勾配遠心分離等の公知方法により実施される。
RNA由来の配列を有する核酸を増幅したい場合には、当該RNAを鋳型とした逆転写反応によって合成されたcDNAを鋳型として本発明の方法を実施すればよい。本発明の方法に適用することができるRNAには、逆転写反応に使用されるプライマーが作製可能なものであれば特に制限はなく、試料中の全RNAの他、mRNA、tRNA、rRNA等のRNA分子群、あるいは特定のRNA分子種が挙げられる。
上記の逆転写反応に使用されるプライマーは、使用される反応条件において鋳型RNAにアニールするものであれば特に限定されるものではない。該プライマーは、特定の鋳型RNAに相補的な塩基配列を有するプライマー(特異的プライマー)の他、オリゴdT(デオキシチミン)プライマーやランダムな配列を有するプライマー(ランダムプライマー)であっても良い。逆転写用プライマーの長さは、特異的なアニーリングを行う観点から、好ましくは6ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは9ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは100ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは30ヌクレオチド以下である。さらに、逆転写用プライマーとして、逆転写後のcDNAを鋳型とした本発明の核酸増幅法を行う際に鎖置換反応のためのプライマーとして使用可能な上記(1)に記載された性質を有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーが好適に使用することができる。すなわち、RNAからの逆転写反応に使用できるものであれば特に限定はない。
上記の逆転写反応に使用される酵素としては、RNAを鋳型としたcDNA合成活性を有するものであれば特に限定はなく、例えばトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素(AMV RTase)、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素(MMLV RTase)、ラウス関連ウイルス2逆転写酵素(RAV−2 RTase)等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つDNAポリメラーゼを使用することもできる。また、本発明の目的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素が好適であり、例えばサーマス属細菌由来DNAポリメラーゼ(Tth DNAポリメラーゼ等)、好熱性バチルス属細菌由来DNAポリメラーゼ等を使用できる。特に限定はないが、例えば、好熱性バチルス属細菌由来DNAポリメラーゼが好ましく、B.st由来DNAポリメラーゼ(Bst DNAポリメラーゼ)、さらにBca DNAポリメラーゼが好ましい。例えば、Bca DNAポリメラーゼは、逆転写反応にマンガンイオンを必要とせず、また、高温条件下で鋳型RNAの二次構造形成を抑制しながらcDNAを合成することができる。上記の逆転写酵素活性を有する酵素も、当該活性を有している範囲において天然体、変異体のいずれもが使用できる。
また、別の態様としては、増幅しようとする塩基配列を含むDNAあるいはRNAをあらかじめ複製した後、本発明の方法の鋳型となる核酸として用いてもよい。該複製の方法としては、特に限定はされないが、増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片を挿入したベクターで適当な宿主を形質転換させた後、得られた形質転換体を培養して、上記増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片を挿入したベクターを抽出して使用する方法が例示される。該ベクターは、宿主内で安定して複製されるものであれば特に限定はなく、例えば、pUC系、pBluescript系、pGEM系、コスミド系、ファージ系のいずれもが好適に使用できる。また、宿主は、使用されるベクターを保持することができるものであれば特に限定はなく、例えば、培養が容易な大腸菌等が例示される。
さらに、上記複製の方法の別の態様としては、増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片を鋳型としてRNAポリメラーゼで該塩基配列を有するRNAを転写した後、該RNAをそのまま、あるいは逆転写反応によりcDNAとして本発明の方法の鋳型に用いてもよい。上記の増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片はRNAポリメラーゼのプロモーター配列を有していれば特に限定はなく、RNAポリメラーゼのプロモーター配列を有するベクターに挿入されたものでもよいし、末端にRNAポリメラーゼのプロモーター配列を有するアダプターあるいはカセットをライゲーションさせたものでもよいし、RNAポリメラーゼのプロモーター配列を有するプライマーと適切な鋳型を用いて酵素的に合成したものであってもよい。すなわち、上記の増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片を、上記のように配置されたRNAポリメラーゼのプロモーター配列を用いて、RNAの形で複製、増幅することができる。上記ベクターは、RNAポリメラーゼのプロモーター配列を有するものであれば特に限定はなく、例えば、pUC系、pBluescript系、pGEM系、コスミド系、ファージ系のいずれもが好適に使用できる。また、該ベクターは、環状のままあるいは直鎖状に処理したもののいずれもが好適に使用できる。さらに、上記の複製、増幅方法に用いられるRNAポリメラーゼは特に限定はなく、例えば、SP6 RNAポリメラーゼ、T7 RNAポリメラーゼあるいはT3 RNAポリメラーゼ等が好適に使用できる。
上記方法により単離したゲノムDNAやPCRフラグメントのような二本鎖DNA、および全RNA若しくはmRNAから逆転写反応で調製されたcDNAのような一本鎖DNAのいずれもが本発明において鋳型DNAとして好適に使用できる。上記二本鎖DNAの場合は、一本鎖DNAに変性する工程(デネーチャー)を施したもの及び変性する工程を施さないもののいずれもが好適に使用できる。
即ち、本発明の方法において、上記デネーチャーの工程は、行っても良いし、行わなくても良い。
本発明の一態様として、RNA由来の配列を有する核酸の増幅を目的とする場合には、RNAを鋳型とした逆転写反応によって得られたRNA−cDNA二本鎖核酸を、RNaseHを含有する本発明の増幅用反応液に加えることにより、RNA鎖を分解して一本鎖cDNAとし増幅反応を開始することができる。さらに、本発明のDNAの合成方法に逆転写酵素活性と鎖置換活性とを有するDNAポリメラーゼを使用することにより、RNAを鋳型とした逆転写反応と、当該反応によって生成したcDNAを鋳型にしたDNA増幅反応とを1種類のDNAポリメラーゼで行なうことができる。
上記のような二本鎖を一本鎖DNAに変性する工程、もしくは、鋳型がRNAの場合、逆転写反応によりcDNA(一本鎖DNA)を調製する工程の後、等温条件下において、連続的に核酸が増幅される。
ここで、「連続的に」とは、反応温度、反応液組成の変更を伴わずに反応が進行していることを意味する。また、本明細書において「等温」とは、酵素および核酸鎖が上記各工程において機能する、実質的に一定の温度条件のことを意味する。
本発明の核酸増幅反応は、例えば、クレノウ断片のような常温性DNAポリメラーゼを使用することにより常温(例えば37℃)でも実施できるが、耐熱性を有する酵素(エンドヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼ)を使用して高温、例えば50℃以上で実施することができる。この場合、プライマーの非特異的なアニーリングが抑制され、DNA増幅の特異性が向上し、また鋳型DNAの二次構造が解消されることによりDNAポリメラーゼの伸長性も向上する。さらに該方法においては、逆転写反応および核酸の増幅を連続して行なう態様も可能であり、上記反応に逆転写酵素を組み合わせて、あるいは逆転写活性を有するDNAポリメラーゼを使用して、RNA由来の配列を有するDNAを増幅することができる。
本発明を特に限定するものではないが、本発明の各態様において、好ましくは、鋳型DNAに該DNAに相補的なキメラオリゴヌクレオチドプライマー、上流ブロックオリゴヌクレオチドがアニーリングする。次に鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼの作用により、当該キメラオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端より鋳型DNAの残りの配列に沿って鋳型DNAに相補的なDNA(プライマー伸長鎖)を伸長させる。その際、キメラオリゴヌクレオチドプライマーの伸長鎖は、鋳型となる核酸の当該キメラオリゴヌクレオチドプライマーと実質的に相補的な領域の3’側の塩基配列に実質的に相補的である上流ブロックオリゴヌクレオチドが鋳型となる核酸にアニーリングすることにより、ブロックされる。このため、本発明の方法の反応初期段階において非直線的な増幅をするキメラオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングするための鋳型が増幅される。この初期増幅反応により本発明の方法は、安定的に増幅効率が向上する。すなわち、標的核酸の検出感度が向上することになる。
本発明の一つの態様においては、エンドヌクレアーゼは上記の二本鎖DNAにニックを入れるニッキング酵素として作用するか、あるいはキメラオリゴヌクレオチドプライマーと鋳型DNAの二本鎖DNA構造を変化させるが、本願発明は理論によって限定はされない。さらに、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼがニックの入った二本鎖DNAのニックの3’末端からDNA鎖を再伸長して新たなプライマー伸長鎖を生成し、同時にニックの3’末端から下流のDNAを遊離させる。こうして先に合成されたプライマー伸長鎖が新たなプライマー伸長鎖に置換される。
本発明の核酸増幅方法は、鋳型核酸に相補的なキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流ブロックオリゴヌクレオチドと、置換鎖に相補的なもう1種のキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流ブロックオリゴヌクレオチドの1組のプライマーと1組のブロックオリゴヌクレオチドを使用して実施することができる。この場合、2本鎖DNAにまずキメラオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングしてそれぞれの相補鎖を合成し、さらにそれぞれの相補鎖に上流ブロックオリゴヌクレオチドがアニーリングして、該上流ブロックオリゴヌクレオチドのアニーリング位置でのそれぞれの相補鎖同士のアニーリングをブロックする考えられる。また、この伸長反応においては、鋳型交換反応も並行して進むと考えられる。この態様を使用すると、各反応産物が他のプライマーのための鋳型として機能できることは明らかである。このように鋳型量が増加することにより、非直線的に増幅産物が増加していく。
二本鎖DNAを鋳型に用いて本発明の核酸増幅方法を実施する場合には、二本鎖のそれぞれにアニーリングするキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流ブロックオリゴヌクレオチドを使用することにより、両方の鎖を増幅反応の鋳型とすることができる。二本鎖DNAを鋳型に反応を開始する場合には、キメラオリゴヌクレオチドプライマー、上流ブロックオリゴヌクレオチド、4種のデオキシリボヌクレオチド3リン酸(dNTP)、DNAポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを反応液に添加する。熱処理により二本鎖DNAを変性し、かつ耐熱性の酵素を使用しない場合には、変性後に酵素を添加することが好ましい。
二本鎖の鋳型DNAと2種のキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流ブロックオリゴヌクレオチドを使用する本発明の核酸増幅方法の態様においては、反応の条件等にもよるが、各プライマーから伸長反応中のそれぞれの鋳型−伸長鎖中間体の間で鋳型の交換が起こり、合成されたプライマー伸長鎖同士がアニーリングした二本鎖核酸を生成することがある。この二本鎖核酸は両端にキメラオリゴヌクレオチドプライマーを有しており、次いでその両端から再び鎖置換による相補鎖伸長反応を開始することができる。この反応の結果、一端にプライマーの配列を有する増幅産物が生成される。さらに、この反応中に鋳型の交換が起こった場合には前記と同様な二本鎖核酸が再度生成される。
本発明により、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを使用し、鋳型交換反応を行う工程を包含する核酸の増幅方法が提供される。当該鋳型交換反応においては、鋳型となる二本鎖核酸と、それぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的な2種のキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流ブロックオリゴヌクレオチドと、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼの存在下に、該鋳型に相補的な2種のプライマー伸長鎖が合成される。該プライマー伸長鎖の合成の途中において、プライマー伸長鎖のそれぞれの鋳型から他方のプライマー伸長鎖への鋳型の交換が起こる。
ここで、鋳型交換反応とは、2本鎖核酸の両側からの鎖置換反応による相補鎖の合成が行われる際に、DNAポリメラーゼがその鋳型を交換し、他方のDNAポリメラーゼが新規に合成してきた相補鎖をそれぞれ鋳型として、以降の相補鎖合成を行うことを言う。言い換えれば、鋳型となる2本鎖核酸をそれぞれのプライマー及び鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼで処理し、該鋳型に相補的な伸長鎖を生成せしめる反応において、該伸長鎖を合成中に、DNAポリメラーゼによってプライマー伸長鎖が当初の鋳型から、他方のプライマー伸長鎖へと能動的にスイッチングせしめる反応を言う。
本発明には、鎖置換反応中に上記の鋳型交換反応を行う能力を有するDNAポリメラーゼが好適に使用でき、例えば、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したBca DNAポリメラーゼの変異体酵素が特に好適に使用される。当該酵素はBcaBEST DNAポリメラーゼ(宝酒造社製)として市販されており、また、該酵素の遺伝子を含有する大腸菌、Escherichia coli HB101/pUI205(FERM BP−3720)より日本特許第2978001号に記載の方法によって調製することもできる。
また、本発明の増幅方法において、キメラオリゴヌクレオチドプライマー伸長鎖のリボヌクレオチド含有部位が切断される際に、当該切断によって生じる5’側の断片(プライマー部分)がリボヌクレオチドを含有しないように切断される場合がある。こうして生じたプライマー部分から伸長されたプライマー伸長鎖はもはやエンドヌクレアーゼにより切断されず、この結果、末端にプライマーの配列を有する増幅産物が生成される。
上記のように、本発明の核酸増幅方法においてはプライマーの配列を含まない増幅産物の他、一端、もしくは両端にプライマーの配列を有する産物が生成しうる。これらの産物も本発明にいう増幅産物に包含される。
キメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用する本発明の核酸増幅方法においては、増幅領域が連なった重合体を生成する場合がある。このような重合体は増幅領域が複数個、いずれも同じ向きに連なったものであり、電気泳動による増幅産物の解析ではラダー状のバンドとして確認される。当該重合体の生成は、増幅される領域、該領域のサイズ、その隣接領域、使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列あるいは反応の条件等により影響を受けることが考えられている。
上記の重合体は、増幅領域を複数個含むものである。当該重合体は、例えば適切なプローブとのハイブリダイゼーションによって多数のプローブとハイブリダイズし、当該重合体が強いシグナルを発生することから、増幅領域を含む核酸の検出を目的とする場合に有用である。また、制限酵素消化等を組み合わせて、重合体より増幅領域、またはその一部をモノマーとして得ることもできる。
本発明に使用されるDNAポリメラーゼは、プライマー部分の3’末端から下流への伸長鎖合成に伴い、先に伸長されたDNA鎖の置換を行う必要がある。そして重要なことは置換鎖を分解する可能性のある5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を示さないことである。このようなDNAポリメラーゼ、例えば大腸菌由来のDNAポリメラーゼIのエキソヌクレアーゼ欠損変異体であるクレノウ断片、BstDNAポリメラーゼ由来の同様の断片(ニューイングランドバイオラブス社製)、B.ca由来のBcaBEST DNAポリメラーゼ(宝酒造社製)が有用である。シークエネース1.0およびシークエネース2.0(米国バイオケミカル社)、ジーン(Gene)第97巻、13〜19頁(1991)記載のT5DNAポリメラーゼおよびφ29 DNAポリメラーゼも使用することができる。通常は5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼであっても、その活性が適当な阻害剤の添加により阻害することが可能な場合は、本発明のDNA合成方法に使用できる。
本発明の核酸の増幅方法は、変温で行ってもよく、又は等温で行ってもよい。ここで変温とは、各工程の反応を妨げない範囲で各工程の反応温度を変化させることを意味する。すなわち、例えば、プライマーのアニーリング、相補鎖の合成反応、相補鎖のニッキング、そして置換反応のそれぞれに適した温度に変化させる場合のことをいう。
次に等温とは、各工程の反応温度を変化させず、各工程が実質的に一定の温度で行われることを意味する。いずれの場合においても、最適の反応条件となるように温度を設定するのは当然である。
本発明の核酸の増幅方法の1つの特徴としては、核酸の合成方法において温度を上げ下げする必要がないことにある。即ち、本発明は等温での核酸の合成方法を提供する。従来の多くの核酸増幅法は、温度を上下することにより合成鎖から標的物を解離する必要があり、例えばサーマルサイクラーのような特別な反応装置を必要とするが、本発明の方法においては一定温度を保持できる装置のみでも実施することができる。このように、本発明の方法は、単一の温度で実施することができる。好ましくは、プライマーの非特異的なアニーリングが低減され、かつ鋳型となる核酸にプライマーが特異的にアニーリングするように反応温度、ストリンジェンシーのレベルを設定して実施される。特に限定するものではないが、上記のように耐熱性の酵素を用いて本発明の方法を高温条件下で行う事ができる。さらに、反応の効率を高く保つ観点から、本発明の方法は使用する酵素の活性が十分に保持される適当な温度で行うことが好ましい。従って、使用する酵素にもよるが、好ましい反応温度は、約20℃〜約80℃であり、さらに好ましくは約30℃〜約75℃であり、特に好ましくは、約50℃〜約70℃である。特に高温条件下で反応を行う場合には、常温で反応を行う場合よりも鎖長の長いプライマーを使用することが好ましい。例えば、本発明の方法において反応温度を55℃から60℃あるいは65℃に設定した場合、該方法に使用するプライマーあるいはブロックオリゴヌクレオチドの長さとしては、特に限定するものではないが、例えば約6ヌクレオチド〜約100ヌクレオチドの範囲、好ましくは約10ヌクレオチド〜約50ヌクレオチドの範囲、さらに好ましくは約12ヌクレオチド〜約40ヌクレオチドの範囲のものが使用できる。このように反応温度を上げることの効果としては、鋳型DNAの二次構造を解消できることが挙げられ、GC含量の高い鋳型核酸を使用した場合にも所望の核酸が増幅される。また、長鎖長の領域を増幅する場合においても同様の効果がある。該効果は、約60bp〜約20kbpの範囲で、さらに約60bp〜約4.3kbpの範囲で、特に約60bp〜約1500bpの範囲で認められる。
また、本発明の方法において、逆転写酵素活性を持つDNAポリメラーゼ、例えば、BcaBEST DNAポリメラーゼを使用した場合、RNAからcDNAを調製する工程(逆転写反応)を含むRNA由来の核酸の増幅を1種類の酵素のみで簡便に実施することができる。また、RNAからcDNAを調製する工程を独立させて行い、その生成物(cDNA)を本発明の方法に鋳型DNAとして使用することもできる。
いずれの場合においても、本発明の方法においては、適当な方法、例えば酵素を失活させたり反応温度を低下させて反応を停止させるか、または基質のうちのいずれか一つが使い尽くされるかのいずれかまで繰り返される。
本発明の核酸の増幅方法は、核酸の増幅を利用した種々の実験操作、例えば核酸の検出、標識、塩基配列の決定に使用することができる。
また、本発明の核酸の増幅方法は、in situ核酸増幅方法、DNAチップのような固相担体上での核酸増幅方法あるいは多種類の領域を同時に増幅するマルチプレックス核酸増幅方法として使用することができる。
また、本発明の上流ブロックオリゴヌクレオチドは、一方のプライマー量を他方の量に対して過剰にして増幅反応を行なう、いわゆるアシンメトリック(非対称)核酸増幅方法においても使用することができる。
本発明の核酸の増幅方法によれば実質的にその相補鎖を含有しない一本鎖のDNAを調製することができ、例えば、DNAチップのような核酸固定化物を作製するための一本鎖DNA、標的核酸検出のための一本鎖DNAプローブ、または長鎖PCR法のためのメガプライマーを容易にしかも短時間に作製することができる。また、本発明の方法を使用することにより、センス配列のみ、あるいはアンチセンス配列のみを選択して増幅させることが可能である。従って、本発明はセンス配列あるいはアンチセンス配列を有する核酸の製造方法としても有用である。
また、本発明の方法は、ビシン、トリシン、ヘペス、リン酸塩あるいはトリス緩衝液中で行うことにより微量の鋳型となる核酸からでも所望の核酸配列領域を増幅することができる。
さらに、本発明の核酸の増幅方法には経時的な温度調節が可能な反応装置を使用する必要がないため、大容量の反応液を使用して増幅反応を実施することができる。したがって、例えば医薬用途等に使用される核酸の工業的大量製造が可能である。
また、本発明の核酸増幅方法は、鋳型となる核酸の塩基配列に忠実に増幅産物を生成することができる。本発明の方法におけるDNA合成の誤りの頻度を得られた増幅産物の塩基配列を解析することによって確認したところ、高い忠実度で核酸を増幅できることが知られているLA−PCR法と本発明の方法のそれぞれで得られた増幅産物中に見出された誤りの頻度は同程度であった。すなわち、本発明の方法はLA−PCR法に匹敵する忠実度を有している。
(6)本発明のキット
本発明は、前述の本発明の核酸の増幅方法に使用されるキットを提供する。1つの実施態様において、該キットは、パッケージされた形態において、鎖置換反応におけるDNAポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、キメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流ブロックオリゴヌクレオチドの使用のための指示書を含むことを特徴とする。さらに、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼならびに鎖置換反応用緩衝液を含むキットは本発明の方法に好適に使用される。あるいは、市販の鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼおよび/またはエンドヌクレアーゼを指示書に従って選択し、使用してもよい。さらに、RNAを鋳型とする場合の逆転写反応用試薬を含んでもよい。DNAポリメラーゼは、上記(4)記載の本発明に使用されるDNAポリメラーゼから選択することができる。また、エンドヌクレアーゼは、上記(3)記載のエンドヌクレアーゼから選択することができる。
上記「指示書」とは、当該キットの使用方法、例えば鎖置換反応用試薬液の調製方法、推奨される反応条件等を記載した印刷物であり、パンフレットまたはリーフレット形式の取り扱い説明書のほか、キットに添付されたラベル、キットが納められたパッケージ等に記載されたものを含む。さらに、インターネットのような電子媒体を通し、開示、提供された情報も含まれる。
さらに、本発明のキットにおいては、ビシン、トリシン、ヘペス、リン酸塩あるいはトリス緩衝成分を含有する反応バッファー、及びアニーリング溶液が含まれていてもよい。また、鎖置換能を有するDNAポリメラーゼやRNaseHが含まれていてもよい。さらに、修飾されたデオキシリボヌクレオチドあるいはデオキシヌクレオチド3リン酸のアナログを含有していてもよい。
さらに、標的核酸の検出方法に使用されるキットは、上記の指示書、増幅反応のための試薬類の他、標的核酸の増幅に適したキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流ブロックオリゴヌクレオチド、増幅された標的核酸を検出するための試薬、例えばプローブ等を含むものであってもよい。
また、本発明のキットは、上記の本発明に使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマー、上流ブロックオリゴヌクレオチド及び/又は本発明のプローブを含有するキットも包含する。
(7)本発明の組成物
本発明は、前述の本発明の核酸の増幅方法、または本発明の核酸の検出方法に使用される組成物を提供する。該組成物としては、例えば、上記(1)に記載のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、上記(2)に記載の上流ブロックオリゴヌクレオチド、上記(3)に記載のエンドヌクレアーゼならびに上記(4)に記載のDNAポリメラーゼを含有するものが挙げられる。さらに、増幅反応を行うための成分として、緩衝成分やマグネシウム塩、dNTP等を含んでいてもよい。さらに、修飾されたデオキシリボヌクレオチドあるいはデオキシヌクレオチド3リン酸のアナログを含有していてもよい。さらに、緩衝成分やその他の添加物を使用することができる。
特に好適な態様としては、本発明の核酸増幅方法に適した組成で上記の各種成分が含有された組成物を挙げることができ、該組成物は適切な鋳型とキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流ブロックオリゴヌクレオチドを添加するのみで増幅反応を実施することができる。さらに、増幅対象があらかじめ明らかである場合には、当該増幅対象の増幅に適したキメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有する組成物が好適である。
(8)本発明の標的核酸の検出方法
本発明の核酸の増幅方法を使用することにより、試料中の標的核酸の検出を行うことができる。当該検出方法は、
(a)上記の本発明の核酸の増幅方法により、標的核酸を増幅する工程;および、
(b)上記工程により増幅された標的核酸を検出する工程;
を包含する。
上記(a)行程において、RNAを鋳型とする場合は、逆転写反応と核酸増幅反応を1段階で行ってもよい。特に限定はされないが、逆転写酵素と鎖置換型DNAポリメラーゼの組み合わせとして例えば、AMV RTase、MMLV RTaseあるいはRAV−2 RTaseとBca DNAポリメラーゼの組み合わせが好適に使用できる。
上記方法は試料中に存在する特定の遺伝子の検出、定量に利用することができる。すなわちDNAまたはRNA等の核酸を含む可能性のあるあらゆる試料から特定の遺伝子を検出、定量することができる。前述の試料としては、特に限定はないが、例えば、全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織(例えば、癌組織、リンパ節等)、細胞培養物(例えば、哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物等)のような生体由来試料、ウイロイド、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のような核酸含有試料、ウイルス又は細菌のような微生物が混入もしくは感染している可能性のある試料(食品、生物学的製剤等)、あるいは土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料から特定の遺伝子を検出、定量することができる。さらに例えば、ウイロイド、ウイルス、カビ、細菌あるいはその他の微生物等由来の特定の遺伝子をターゲットとすることにより、該遺伝子の存在の有無によって上記の微生物の存在を検出、定量等に利用することができる。特に、病原性の微生物の検出方法は衛生、環境分野で有用である。さらに、生物の遺伝子型の判別や遺伝子の発現状態を調べるために本発明の方法を使用することもできる。特に疾病関連遺伝子、例えば細胞の癌化に関連する遺伝子等の検出、発現状態の確認は医療分野において有用である。上記検出法のための鋳型として使用される核酸は、RNAあるいはDNAのいずれもが好適に使用できる。
また、本発明の標的核酸の検出方法は、標的核酸における遺伝子多型のタイピング方法としても使用することができる。
特に限定はされないが、例えば、使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端部分が、標的とされる塩基配列の判別しようとする特定の塩基付近に位置するように、たとえば、該塩基とプライマーの3’末端の塩基とが水素結合を形成するようにプライマーが設計される。このようなキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅反応を実施した場合、プライマーの3’末端部分の塩基配列と鋳型の塩基配列との間にミスマッチが存在する場合には標的核酸からの増幅が起こらず、増幅産物の生成が見られない。当該方法により、点突然変異、一塩基置換(Single nucleotide polymorphysm、SNP)のような遺伝子上の特定の塩基についての情報を得ることが可能である。
同様に本発明の方法は、欠失変異、挿入変異のような遺伝子多型のタイピング方法としても使用できる。
また、本発明の上流ブロックオリゴヌクレオチドは、国際出願番号PCT/JP02/01222明細書に記載の遺伝子多型をタイピングする方法において使用することができる。
遺伝子多型をタイピングする方法の一態様としては、標的核酸における遺伝子多型のタイピング方法であって、
(1)標的核酸を含有する試料とヌクレオチドとを混合する工程:ここで当該ヌクレオチドは、
A)その3’末端が当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
B)標的核酸上の前記特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており、
C)当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在する場合にはヌクレオチドはヌクレアーゼによる切断を受けず、かつ、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しない場合にはヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて新たな3’末端を生じるような配列を含有しており、
(2)前記混合物をヌクレアーゼ、およびDNAポリメラーゼで処理する工程:および
(3)ヌクレアーゼによるヌクレオチドの切断の有無を検出する工程、
を包含することを特徴とする、標的核酸における遺伝子多型のタイピング方法において上記ヌクレオチドと本発明の上流ブロックオリゴヌクレオチドを組合せて使用することができる。
さらに別の態様としては、標的核酸における遺伝子多型のタイピング方法であって、
(1)標的核酸を含有する試料とヌクレオチドとを混合する工程:ここで当該ヌクレオチドは、
A)その3’末端が当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
B)標的核酸上の前記特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており、
C)当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しない場合にはヌクレオチドはヌクレアーゼによる切断を受けず、かつ、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在する場合にはヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて新たな3’末端を生じるような配列を含有しており、
(2)前記混合物をヌクレアーゼ、およびDNAポリメラーゼで処理する工程:および
(3)ヌクレアーゼによるヌクレオチドの切断の有無を検出する工程、
を包含することを特徴とする、標的核酸における遺伝子多型のタイピング方法において、本発明の上流ブロックオリゴヌクレオチドを組合せて使用することができる。
上記「遺伝子多型」は、同一の生物集団内に含まれる個体間における遺伝子の塩基配列の相違のことをいう。「遺伝子多型」を構成する塩基配列の相違は、特定の形式に限定されるものではなく、「塩基置換」、「欠失変異」、「挿入変異」等、種々のタイプのものを包含する。この遺伝情報の違いは、バリエーション(variation)とも呼ばれている。
上記「塩基置換」としては、核酸上の特定の部位において、その一部の塩基が他の塩基に置換されていることを示す。上記「塩基置換」には、「一塩基置換多型(SNP)」も含まれる。
また、「欠失変異」とは、核酸上の特定の部位において、その一部あるいは全部の塩基配列が欠失していることを示す。
さらに、「挿入変異」とは、核酸上の特定の部位において、任意の鎖長の塩基配列が挿入されていることを示す。
上記の態様においては、標的核酸上の上記ヌクレオチドの上流位置に本発明のブロックオリゴヌクレオチドがアニーリングする。その結果、本発明の標的核酸の増幅方法の場合と同様に標的核酸上の遺伝子多型のタイピングにおいて、その検出感度を向上させることができる。
本発明の標的核酸の検出方法は、核酸を含有する試料より直接、標的核酸を増幅することにより実施することができる。この場合、増幅される標的核酸の鎖長には、特に限定はないが、感度よく標的核酸を検出する観点からは、例えば200bp以下、さらに好ましくは150bp以下の領域が有効である。該増幅鎖長となるように本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを設定することにより、高感度に試料中の標的核酸を検出することができる。
さらに、本発明の検出方法では、ビシン、トリシン、ヘペス、リン酸塩あるいはトリス緩衝成分を含有する反応バッファー、及びスペルミジンやプロピレンジアミンを含有するアニーリング溶液の使用により、微量の核酸試料からもさらに高感度に標的核酸を検出することができる。この場合、使用するエンドヌクレアーゼとDNAポリメラーゼは特に限定はされないが、例えばAfu由来のRNaseH及びBcaBEST DNAポリメラーゼの組み合わせが好ましい。特に、上記エンドヌクレアーゼ及びDNAポリメラーゼはともにその種類によって好適に使用できるユニット数が異なる場合が予想されるが、その際には検出感度の向上あるいは増幅産物量の増加を指標にして、該バッファーの組成および酵素の添加量を調整すればよい。
本発明の検出方法においては、標的核酸の増幅の際に、dUTPを基質として取り込ませることができる。したがって、dUTPを基質に用いた場合には、ウラシル N−グリコシダーゼ(uracil N−glycosidase:UNG)を利用して増幅産物を分解し、増幅産物のキャリーオーバーコンタミネーションによる擬陽性を防止することができる。
上記(b)工程には公知の核酸検出方法、例えば電気泳動により特定のサイズの反応産物を検出する方法や、プローブとのハイブリダイゼーションによる検出等を使用することができる。さらに、磁気ビーズ等を組み合わせた検出方法も好適に使用できる。上記電気泳動による検出には、通常、エチジウムブロマイド等の蛍光物質が使用されるが、プローブとのハイブリダイゼーションを組み合わせてもよい。また、プローブは放射性同位元素による標識の他、ビオチンや蛍光物質のような非放射性の標識を施したものが使用できる。この他、上記(a)工程において標識ヌクレオチドを使用することにより、増幅産物に標識ヌクレオチドを取り込ませて検出を容易にすることや該標識を利用した検出用シグナルの増強を行うことができ、さらに蛍光偏光法、蛍光エネルギー転移等を利用した検出を行うことも可能である。さらに、適切な検出系を構築することにより、標的核酸を自動的に検出することや、あるいは標的核酸の定量を行うことが可能である。また、ハイブリッドクロマト法による肉眼検出法も好適に使用できる。
消光状態になるような距離で配置された2種類以上の蛍光物質で標識されたリボヌクレオチド(RNA)プローブあるいはリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドで構成されるキメラオリゴヌクレオチドプローブのいずれもが本発明の検出方法に使用することができる。当該プローブは蛍光を発することはないが、これに相補的な標的核酸由来の増幅DNAにアニーリングした場合、RNaseHは該プローブを分解する。この結果、プローブ上の蛍光物質間の距離が増大して蛍光が発せられるようになり、標的核酸の存在を知ることができる。RNaseHを使用して本発明の核酸の増幅方法が実施された場合には、その反応液中に上記のプローブを添加するだけで標的核酸を検出することができる。当該プローブの標識に使用される蛍光物質としては、例えば、6−FAM(6−carboxyfluorescein)とTAMRA(N,N,N’,N’−tetramethyl−6−carboxyrhodamine)との組み合わせ等が好適に使用できる。
さらに、本発明は前記の標的核酸の検出方法に使用されるプローブを提供する。本発明のプローブは、上記の本発明の核酸の増幅方法により増幅された核酸に通常のハイブリダイゼーションの条件において標的核酸にハイブリダイズし得るものであれば特に限定はないが、増幅産物を特異的に検出する観点からは、例えば厳密な条件として当業者に知られている条件でハイブリダイズするものが好ましい。前記、厳密なハイブリダイゼーション条件は、例えば1989年、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー発行、T.マニアティス(T. Maniatis)ら編集、モレキュラー クローニング:ア ラボラトリー マニュアル第2版(Molecular Cloning : A Laboratory Manual 2nd ed.)に記載されている。具体的な厳密な条件としては、例えば以下の条件を挙げることができる。すなわち、0.5%SDS、5×デンハルツ[Denhardt’s、0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.1%ポリビニルピロリドン、0.1%フィコール400]及び100μg/mlサケ精子DNAを含む6×SSC(1×SSCは0.15M NaCl、0.015M クエン酸ナトリウム、pH7.0)中で、使用するプローブのTm値より約25℃低い温度で4時間〜一晩保温を行う条件を言う。前記プローブは、標的核酸の検出を容易にするために上記のような標識を付されたものを使用することができる。
本発明の方法においては、サーマルサイクラーのような装置を必要としない。また本発明の方法では、キメラオリゴヌクレオチドプライマーと上流ブロックオリゴヌクレオチドを組合せることにより、標的核酸の検出感度を向上させることができる。また、dNTPのような試薬もPCR等で用いられるものを流用できる。そのため、ルーチンワークを行なっている遺伝子検査等の分野で好適に使用できる。さらに、本発明の方法はPCR法よりも短時間により多くの増幅産物を得られることから、簡便、迅速、高感度な遺伝子検出方法として利用することができる。
ゲノムレベルの遺伝子解析においては、大量の塩基配列を解析するために反応系を微量化し、さらに集積度を高める試みがなされている。その手段の一つとして、最先端の超微細加工技術を駆使して、ゲノム解析の基本プロセス、例えば、DNAの細胞からの抽出、DNA増幅反応、電気泳動、ハイブリダイゼーション、目的DNAの検出等のプロセスを数cm角〜指先大のマイクロチップ上に集積化したものが開発されている。該システムはマイクロチップ、あるいはナノチップと呼ばれている。
このようなシステムにおける遺伝子増幅反応として現在はPCR法が考えられているが、該方法は経時的に温度の上昇、下降を繰り返す温度制御のための手段を必要とするため、システムが複雑なものとなる。これに対し、等温条件下で核酸を増幅できる本発明の方法はシステムの単純化が可能であり、上記のような集積化されたシステムでの利用に非常に好適である。さらに、本発明の技術を利用してさらに高い集積度のシステムの構築が可能となる。
実施例
以下に実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
参考例1 アルカエオグロバス フルギダスのRNaseHII遺伝子のクローニング
(1)アルカエオグロバス フルギダス ゲノムDNAの調製
アルカエオグロバス フルギダス(Archaeoglobus fulgidus、ドイッチェザムルンク フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツレンGmbHより購入:DSM4139)8ml相当分の菌体を集め、100μlの25%ショ糖、50mMトリス−HCl(pH8.0)に懸濁し、20μlの0.5M EDTA、10μlの10mg/ml塩化リゾチーム(ナカライテスク社製)水溶液を加えて、20℃で1時間反応させた。反応終了後、この反応液に800μlの150mM NaCl、1mM EDTA、20mMトリス−HCl(pH8.0)、10μlの20mg/mlプロテイナーゼK(宝酒造社製)及び50μlの10%ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、37℃で1時間保温した。反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿、風乾した後に50μlのTEに溶解してゲノムDNA溶液を得た。
(2)RNaseHII遺伝子のクローニング
アルカエオグロバス フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)は全ゲノム配列が公開されており〔ネイチャー(Nature)、第390巻、第364−370頁(1997)〕、RNaseHIIのホモログをコードする遺伝子(AF0621)が1つ存在することが明らかになっている(配列表の配列番号1、http://www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.html)。
そこで、このAF0621遺伝子(配列表の配列番号1)の配列をもとにプライマーAfuNde(配列表の配列番号2)及びAfuBam(配列表の配列番号3)を合成した。
上記(1)で得たアルカエオグロバス フルギダス ゲノムDNA 30ngを鋳型にして、20pmolのAfuNde及び20pmolのAfuBamをプライマーに用い、100μlの容量でPCRを行なった。PCRでのDNAポリメラーゼはパイロベストDNAポリメラーゼ(宝酒造社製)を添付のプロトコールに従って用い、PCRは94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分を1サイクルとし、40サイクル行った。増幅した約0.6kbのDNA断片をNdeI及びBamHI(ともに宝酒造社製)で消化し、得られたDNA断片をプラスミドベクターpTV119Nd(pTV119NのNcoIサイトをNdeIサイトに変換したもの)のNdeI及びBamHI間に組込んだプラスミドpAFU204を作製した。
(3)RNaseHII遺伝子を含むDNA断片の塩基配列の決定
上記(2)で得られたpAFU204の挿入DNA断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、RNaseHIIをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号4に示す。また、該塩基配列から推定されるRNaseHIIのアミノ酸配列を配列表の配列番号5に示す。
なお、プラスミドpAFU204で形質転換された大腸菌JM109は、Escherichia coli JM109/pAFU204と命名、表示され、平成13年2月22日より日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERMP−18221として寄託され、また前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM BP−7691[国際寄託への移管請求日:平成13年8月2日]として寄託されている。
(4)精製RNaseHII標品の調製
上記(2)で得られたpAFU204で大腸菌JM109を形質転換し、得られたpAFU204を含む大腸菌JM109を100μg/mlのアンピシリンを含む2リットルのLB培地に植菌し、37℃で16時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を37.1mlのソニケーションバッファー〔50mMトリス−HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mMフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を12000rpmで10分間の遠心分離を行い、得られた上清を70℃、15分間の熱処理にかけた。その後、再度12000rpmで10分の遠心分離を行い、上清を集め、40.3mlの熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファーA〔50mMトリス−HCl(pH8.0)、1mM EDTA〕で平衡化したRESOURSE Qカラム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)に供し、FPLCシステム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、RNaseHIIはRESOURSE Qカラムを素通りした。
バッファーAで平衡化したRESOURSE Sカラム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)に供し、FPLCシステム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、RNaseHIIはRESOURSE Sカラムを素通りした。
素通りしたRNaseHII画分40.0mlを50mM NaClを含むバッファーB〔50mMトリス−HCl(pH7.0)、1mM EDTA〕2リットルを外液として、2時間の透析を3回行なった。透析後の酵素液40.2mlを50mM NaClを含むバッファーBで平衡化したHiTrap−heparinカラム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)に供し、FPLCシステムを用いて50〜550mM NaCl直線濃度勾配により溶出した。その結果、約240mM NaClのところに溶出されたRNaseHII画分を得た。
このRNaseHII画分7.8mlをセントリコン−10(アミコン社製)を用いた限外ろ過により濃縮し、約600μlの濃縮液を4回に分けて100mM NaCl、0.1mM EDTAを含む50mMトリス−HCl(pH7.0)で平衡化したSuperose6ゲルろ過カラム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、RNaseHIIは、30.0キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、RNaseHIIが1量体として存在する場合に相当する。
こうして溶出されたRNaseHIIをAfuRNaseHII標品とした。 上記で得られたAfu RNaseHII標品を用いて、以下の方法により酵素活性を測定した。
Afu RNaseHII標品1μlに40℃であらかじめインキュベーションした反応液〔20mM ヘペス−水酸化カリウム(pH7.8)、0.01%牛血清アルブミン(宝酒造社製)、1%ジメチルスルホキシド、4mM 酢酸マグネシウム、20μg/mlポリ(dT)(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)、30μg/mlポリ(rA)(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)〕100μlを添加し、40℃で10分間反応さた後、10μl0.5M EDTA(pH8.0)で反応を停止し、260nmの吸収を測定した。その結果、Afu RNaseHII標品にRNaseH活性が認められた。
耐熱性RNaseHのユニット数は、次の方法により算出した。
ポリ(rA)及びポリ(dT)(ともにアマシャム ファルマシア バイオテク製)1mgをそれぞれ1mM EDTAを含む40mM トリス−HCl(pH7.7)1mlに溶解し、ポリ(rA)溶液及びポリ(dT)溶液を調製した。
次に、4mM MgCl2、1mM DTT、0.003%BSA、4%グリセロールを含む40mM トリス−HCl(pH7.7)に、終濃度20μg/mlとなるポリ(rA)溶液、終濃度30μg/mlとなるポリ(dT)溶液を加え、37℃で10分間反応後、4℃に冷却し、ポリ(rA)−ポリ(dT)溶液を調製した。このポリ(rA)−ポリ(dT)溶液100μlに任意に希釈した酵素液1μlを加え、40℃で10分間反応させ、0.5M EDTA 10μlを加えて反応を停止させた後、260nmの吸光度を測定した。対照として、上記反応液に0.5M EDTA 10μlを加えた後、40℃で10分間反応させ、吸光度を測定した。その後、EDTA非存在下で反応させ求めた吸光度から対照の吸光度を引いた値(吸光度差)を求めた。すなわち、酵素反応によってポリ(rA)−ポリ(dT)ハイブリッドから遊離したヌクレオチドの濃度を吸光度差から求めた。RNaseHの1単位は、1nmolのリボヌクレオチドが遊離したのに相当するA260を10分間に増加させる酵素量とし、下記の式に従って算出した。
単位(unit)=〔吸光度差×反応液量(ml)〕/0.0152×(110/100)×希釈率
実施例1
(1)プライマー及びブロックオリゴヌクレオチドの設計
キメラオリゴヌクレオチドプライマーと鋳型となる核酸の該プライマーのアニーリングする位置の3’側の任意の位置にアニーリング可能な上流ブロックオリゴヌクレオチドの組み合わせについて検討した。まず、ジーンバンク登録番号X06707記載のクラミジア トラコーマ (Chlamydia trachomatis)プラスミドの塩基配列に従って、配列表の配列番号6及び7に記載の塩基配列を有するクラミジア トラコマチス由来プラスミドDNA検出用キメラプライマー、CT−BF19−3及びCT−BR23−2をDNA合成機で合成した。さらに、クラミジア トラコマチス由来プラスミドDNA遺伝子の塩基配列を有し、鋳型となる核酸の上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングする位置の3’側の任意の位置にアニーリングできる配列表の配列番号8及び9記載の上流ブロックオリゴヌクレオチド、CR−FBKおよびCR−RBKをそれぞれ合成した。該上流ブロックオリゴヌクレオチドは、3’末端をアミノ化することによりDNAポリメラーゼによる伸長反応が進まないようにブロッキングされている。なお、上流ブロックオリゴヌクレオチドCR−FBKはセンス方向のオリゴヌクレオチドであり、CR−RBKはアンチセンス方向のオリゴヌクレオチドである。
(2)クラミジアポジティブコントロールの調製
配列表の配列番号10に示すクラミジア遺伝子の一部である560bpをPCR増幅後精製し、該増幅断片をpT7 Blue TベクターにDNA Ligation Kit Ver.2(宝酒造社製)を用いて挿入し、E.coli JM109を形質転換し、クラミジアポジティブコントロールプラスミドを調製した。
(3)ICAN反応
上記(2)で調製した102〜106個のポジティブコントロールDNA 1μlあるいは陰性対照の水1μlと、これに各50pmolのキメラオリゴヌクレオチドプライマーおよび各100pmolの上記(1)で合成した上流ブロックオリゴヌクレオチド、各0.5mM dNTP混合液、32mM Hepes−KOH緩衝溶液(pH7.8)、100mM 酢酸カリウム、4.0mM 酢酸マグネシウム、0.01%ウシ血清アルブミン、1.0%ジメチルスルホキシド、4.375UのAfu由来RNaseH、2.64UのBcaBEST DNAポリメラーゼ(宝酒造社製)を含む全液量25μlの反応液をサーマルサイクラーで60℃、1時間保温した。なお、対照として上流ブロックオリゴヌクレオチドを添加しない区分を設定した。反応終了後、該反応液5μlを3.0%アガロースゲル電気泳動により分析した。その結果を図1に示す。図1Aは、上流ブロックオリゴヌクレオチド無添加の反応系であり、レーン1は100bp DNAラダーマーカー、レーン2は陰性対照(水)、レーン3は鋳型102個、レーン4は鋳型103個、レーン5は鋳型104個、レーン6は鋳型105個、レーン7は鋳型106個の場合を示す。また、図1Bは、上流ブロックオリゴヌクレオチドを添加した反応系であり、レーン1は100bp DNAラダーマーカー、レーン2は陰性対照(水)、レーン3は鋳型102個、レーン4は鋳型103個、レーン5は鋳型104個、レーン6は鋳型105個、レーン7は鋳型106個の場合を示す。
図1に示したように上流ブロックオリゴヌクレオチド無添加の区分においては105個の鋳型量まで増幅が認められた。一方、上流ブロックプライマーを添加した区分において103個の鋳型量まで増幅が認められ、添加しない区分と比較して2桁の感度上昇が認められた。以上のことから、キメラオリゴヌクレオチドプライマーと鋳型となる核酸のキメラオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングする位置の3’側の任意の位置にアニーリング可能な上流ブロックオリゴヌクレオチドを組み合わせることにより検出感度が向上することが確認できた。
産業上の利用の可能性
本発明により、キメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流ブロックオリゴヌクレオチドを使用するDNA合成反応により標的核酸の塩基配列中の特異的増幅に適した領域を増幅することを特徴とする標的核酸の増幅方法が提供される。また、該標的核酸の増幅方法で得られた標的核酸の増幅断片を検出する工程を包含することを特徴とする標的核酸の検出方法が提供される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1:本発明の方法により増幅された増幅DNA断片のアガロース電気泳動写真の結果を示す図である。
本発明は、臨床分野において有用な標的核酸の検出方法及び遺伝子工学分野において有用なDNAの合成方法に関し、鋳型となる核酸の増幅方法および該方法で増幅された標的核酸の検出方法に関する。
背景技術
遺伝子工学分野の研究においてDNAの合成は種々の目的に使用される。このうちオリゴヌクレオチドのような短鎖のDNAの合成を除けば、そのほとんどはDNAポリメラーゼを利用した酵素的方法により実施されている。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR法)があるが、それは米国特許第4,683,195号、第4,683,202号および第4,800,159号に詳細に記述されている。もう一つの例としては、トレンズ イン バイオテクノロジー(Trends in Biotechnology)第10巻、146〜152頁(1992)に記載の当該方法と逆転写酵素反応を組合わせた逆転写PCR法(RT−PCR法)が挙げられる。上記の方法の開発により、DNAから、若しくはRNAから目的とする領域を増幅することが可能になった。
これらのDNA合成方法は、目的とするDNA領域を増幅させるために例えば、二本鎖鋳型DNAの一本鎖への解離(変性)、一本鎖鋳型DNAへのプライマーのアニーリング、プライマーからの相補鎖合成(伸長)の3つのステップからなる反応により、もしくは、”シャトルPCR”(『PCR法最前線』、「蛋白質核酸 酵素」別冊、第41巻、第5号、425頁〜428頁(1996))と呼ばれる、前述の3ステップ反応のうちプライマーのアニーリングおよび伸長のステップを同一温度で行なう2ステップ反応により実施される。
さらに、別法としては、1989年6月14日に公開された欧州特許出願第320,308号に記述されているリガーゼ連鎖反応(LCR;ligase chain reaction)法、あるいはPCR プロトコールズ(PCR Protocols,Academic Press.Inc.,1990)245〜252頁に記述されている転写増幅システム(TAS;transcription−based amplification system)法が挙げられる。上記4法は、次の増幅サイクルのための一本鎖標的分子を再生するために、高温から低温の反応を何回も繰り返す必要がある。このように温度によって反応が制約されるため、反応系は不連続な相またはサイクルで行なう必要がある。
従って、上記の方法には広い温度範囲で、かつ、厳密な温度調整を経時的に行なうことのできる高価なサーマルサイクラーを使用することが必要となる。また、該反応は、2種類〜3種類の温度条件で行なうため設定温度にするために要する時間が必要であり、そのロス時間はサイクル数に比例して増大していく。
そこで、上記問題点を解決すべく等温状態で実施可能な核酸増幅法が開発された。例えば、特公平7−114718号に記載の鎖置換型増幅(SDA;strand displacement amplification)法、自立複製(3SR;self−sustained sequence replication)法、日本国特許番号第2650159号に記載の核酸配列増幅(NASBA;nucleic acid sequence based amplification)法、TMA(transcription−mediated amplification)法、日本国特許番号第2710159号に記載のQβレプリカーゼ法、さらに米国特許番号第5,824,517号、国際公開第99/09211号パンフレット、国際公開第95/25180号パンフレットあるいは、国際公開第99/49081号パンフレット等に記載の種々の改良SDA法が挙げられる。米国特許番号第5,916,777号には等温状態でのオリゴヌクレオチドの酵素的合成方法が記載されている。これらの等温核酸増幅法またはオリゴヌクレオチド合成法の反応においては、プライマーの伸長や、一本鎖伸長生成物(または元の標的配列)へのプライマーのアニーリングや、それに続くプライマーの伸長は、一定温度で保温された反応混合物中で同時に起こる。
これらの等温核酸増幅法のうち最終的にDNAが増幅される系、例えば、SDA法は、DNAポリメラーゼと制限エンドヌクレアーゼを介する二本鎖の置換による、試料中の標的核酸配列(およびその相補鎖)の増幅法であるが、該方法では、増幅に使用するプライマーは4種類必要であり、その内の2種類は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含むように構築する必要がある。また、該方法では、DNA合成のための基質として、修飾されたデオキシリボヌクレオチド3リン酸、例えばα位のリン酸基の酸素原子が硫黄原子(S)に置換された(α−S)デオキシリボヌクレオチド3リン酸を大量に用いる必要があり、ルーチンワークで反応を行なう遺伝子検査等においては、そのランニングコストが深刻な問題となってくる。さらに該方法では、増幅されたDNA断片中に上記の修飾ヌクレオチド、たとえば(α−S)デオキシリボヌクレオチドが含まれるため、例えば、増幅後のDNA断片を制限酵素長多型(RFLP;restriction enzyme fragment length polymorphism)解析に供しようとする場合に、該断片が制限酵素で切断できないことがある。
また、米国特許番号第5,824,517号記載の改良SDA法は、RNAとDNAから構成され、少なくとも3’末端にDNAが配置された構造を必須要件とするキメラプライマーを使用するDNA増幅方法である。また、国際公開第99/09211号パンフレットに記載の改良SDA法は、3’突出末端を生じさせる制限酵素が必要である。また、国際公開第95/25180号パンフレットに記載の改良SDA法は、少なくとも2組のプライマー対を必要とする。さらに、国際公開第99/49081号パンフレットに記載の改良SDA法は、少なくとも2組のプライマーと少なくとも1種類の修飾デオキシリボヌクレオチド3リン酸を必要とする。一方、米国特許番号第5,916,777号は、オリゴヌクレオチドを合成するために、3’末端にリボヌクレオチドを有するプライマーを使用してDNAを合成し、反応終了後にエンドヌクレアーゼによりプライマー伸長鎖中のプライマーと伸長鎖の間にニックをいれて分離させ、テンプレートを消化し、さらにプライマーを回収して再利用するというものである。該方法では、プライマーを再利用する際には反応系よりプライマーを単離したうえで鋳型を再度アニーリングさせる必要がある。また、国際公開第00/28082号パンフレットに記載のLAMP(Loop−mediated Isothermal Amplification)法は増幅に4種類のプライマーを必要とし、また、増幅産物は増幅の標的とされた領域が繰り返された、サイズの一定しないDNAである。
さらに、キメラオリゴヌクレオチドプライマーを用いた等温核酸増幅方法として、国際公開第00/56877号あるいは国際公開第02/16639号パンフレットに記載のICAN(Isothermal and Chimeric primer−initiated Amplification of Nucleic acids)法がある。しかしながら、従来の等温核酸増幅法はまだまだ種々の問題をかかえており、低ランニングコストで、かつ結果的に得られたDNA断片をさらに遺伝子工学的な処理に使用することが可能な核酸の増幅方法が求められていた。
発明の目的
本発明の主な目的は、試料中の標的核酸の高感度、特異的に増幅する標的核酸の増幅方法、及びこれらの方法に用いる組成物及びキットを提供することにある。
発明の概要
本発明者らは鋭意研究の結果、国際公開第00/56877号あるいは国際公開第02/16639号パンフレットに記載のICAN法において、キメラオリゴヌクレオチドプライマー及び鋳型となる核酸の該プライマーのアニーリングする位置の3’側にアニーリングする上流ブロックオリゴヌクレオチドを組み合わせて使用することにより、標的核酸の増幅効率が向上し、検出感度が改善されることを見いだし、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の第1の発明は、核酸を増幅する方法において、
(a)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも1種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも1種類の上流ブロックオリゴヌクレオチド、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで該キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの3’末端又は3’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり、該上流ブロックオリゴヌクレオチドは、鋳型となる核酸の当該キメラオリゴヌクレオチドプライマーと実質的に相補的な領域の3’側の塩基配列に実質的に相補的であり、かつその3’末端塩基がDNAポリメラーゼによる相補鎖伸長反応が起こらないように修飾されており;および、
(b)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートする工程、
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法に関する。
本発明の第1の発明において、さらに鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相同な配列を有する第2のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有する反応混合物を使用してもよく、さらに鋳型となる核酸の、第2のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列に実質的に相同な配列を有する領域の5’側の塩基配列と実質的に相同的な配列を有し、かつその3’末端の塩基がDNAポリメラーゼによる相補鎖伸長反応が起こらないように修飾されている上流ブロックオリゴヌクレオチドを含有する反応混合物を使用してもよい。
本発明の第2の発明は、本発明の第1の発明の核酸の増幅方法のための組成物であって、それぞれ少なくとも1種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流ブロックオリゴヌクレオチドを含有する組成物に関する。
本発明の第3の発明は、本発明の第1の発明の核酸の増幅方法のためのキットであって、それぞれ少なくとも1種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流ブロックオリゴヌクレオチドを含有するキットに関する。
本発明の第4の発明は、下記工程を包含することを特徴とする標的核酸の検出方法に関する;
(a)本発明の第1の発明の核酸の増幅方法により、標的核酸を増幅する工程;および、
(b)上記工程により増幅された標的核酸を検出する工程;
を包含する。
発明の詳細な説明
本明細書においてデオキシリボヌクレオチド(本明細書中ではdNとも記載する)とは、糖部分がD−2−デオキシリボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、例えば、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、チミンを有するものが挙げられる。さらに、7−デアザグアノシン等の修飾塩基を有するデオキシリボヌクレオチドやデオキシイノシンヌクレオチドのようなデオキシリボヌクレオチドアナログも上記のデオキシリボヌクレオチドに包含される。
本明細書においてリボヌクレオチド(本明細書中ではNとも記載する)とは、糖部分がD−リボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、ウラシルを有するものが挙げられる。さらに、当該リボヌクレオチドには修飾リボヌクレオチドが包含され、例えばα位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えた修飾リボヌクレオチド[(α−S)リボヌクレオチド、(α−S)Nとも記載する]やこの他の誘導体等も含まれる。
本発明に使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、該プライマーの3’末端又は3’末端側にリボヌクレオチドを配置し、本発明の方法において核酸鎖が伸長でき、エンドヌクレアーゼで切断でき、鎖置換反応を行うことができるものであれば、いずれもが本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーに包含される。
本明細書において3’末端側とは、核酸、例えば、プライマーにおいてその中央より3’末端にかけての部分を指す。同様に5’末端側とは、核酸においてその中央より5’末端にかけての部分を指す。
本明細書において上流位置とは、本発明の方法に用いるキメラオリゴヌクレオチドプライマーの5’末端よりもさらに5’側の任意の位置を言う。従って、キメラオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングする鋳型となる核酸鎖から見ると該プライマーよりも3’側の任意の位置である。
本明細書においてエンドヌクレアーゼとは、鋳型核酸にアニーリングした上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーよりDNAの伸長を行って生成した二本鎖DNAに作用して、該プライマーのリボヌクレオチド部分を特異的に切断するものであればよい。
本明細書においてDNAポリメラーゼとは、DNA鎖を鋳型として新たなDNA鎖を合成する酵素のことを言い、天然型のDNAポリメラーゼの他、前記活性を有する変異体酵素も包含される。当該酵素としては、例えば鎖置換(Strand displacement)活性を有するDNAポリメラーゼ、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有していないDNAポリメラーゼ、逆転写酵素活性やエンドヌクレアーゼ活性を併せ持つDNAポリメラーゼが挙げられる。
本明細書において「鎖置換活性」とは、鋳型となる核酸配列に従ってDNA複製を行う際、DNA鎖を置き換えながら進行し、鋳型鎖にアニーリングしている相補鎖を遊離させる、即ち鎖置換(strand displacement)することができる活性のことをいう。また、本明細書においては、鎖置換により鋳型となる核酸配列から遊離したDNA鎖のことを「置換鎖」と称する。
以下、本発明を詳細に説明する。
(1)本発明に使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマー
本発明の方法において使用されるプライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーである。該プライマーには未修飾リボヌクレオチドおよび/または修飾リボヌクレオチドを含有するオリゴリボヌクレオチドプライマーも含まれる。
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列の一部に実質的に相補的な塩基配列を有し、使用される条件において、DNA鎖の伸長に寄与することができ、さらに、その3’末端又は3’末端側にリボヌクレオチドが配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーである。当該プライマーは通常、増幅しようとする領域の上流、すなわち鋳型核酸上の増幅しようとする領域に対応する塩基配列の3’側部分に相補的に設計される。なお、ここで「実質的に相補的な塩基配列」とは、使用される反応条件において鋳型となるDNAにアニーリング可能な塩基配列を意味する。
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは1以上の修飾リボヌクレオチドを含有するものであってもよい。即ち、本明細書においてリボヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端又は3’末端側に配置され、エンドヌクレアーゼにより認識あるいは切断されるものであれば、未修飾リボヌクレオチドおよび/または修飾リボヌクレオチドのいずれであってもよく、そのような未修飾あるいは修飾リボヌクレオチドのいずれもが包含される。すなわち、本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーには、当該プライマーの機能を失わない範囲で未修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチドを使用することができ、さらにこれらを組合せて使用することができる。このような修飾リボヌクレオチドとしては、特に限定するものではないが、たとえば、リン酸基に結合する酸素原子が硫黄原子に置換された(α−S)リボヌクレオチドや、リボースの2位の水酸基がメトキシ基に置換されたリボヌクレオチドが挙げられる。このような修飾リボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、米国特許第5,003,097号記載の硫化反応試薬(グレンリサーチ社製)を用いた方法で調製した(α−S)リボヌクレオチド3リン酸、あるいは2−OMe−RNA−CE ホスホアミダイド試薬(グレンリサーチ社製)を用いて作製することができる。
また、エンドヌクレアーゼによる切断に耐性を付与するような性質の修飾リボヌクレオチドを含有し、本発明の増幅方法に使用できるキメラオリゴヌクレオチドプライマーを設計してもよく、この様なプライマーは、増幅反応工程におけるエンドヌクレアーゼの切断位置を制御し得る点において有用である。
本発明の方法で使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、増幅後のDNA断片を一本鎖もしくは二本鎖のいずれの形態で得たいかによって1種類もしくは2種類を使い分けることができる。すなわち、一本鎖DNAが望まれる場合には1種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを、また、二本鎖が望まれる場合には2種類のプライマーが使用される。
本発明で使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、当該プライマーの3’末端又は3’末端側にリボヌクレオチドが存在し、ICAN法に使用できるものであればその鎖長に特に限定はない。
上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば約6ヌクレオチドから約100ヌクレオチドの範囲、好ましくは、約10ヌクレオチドから約50ヌクレオチドの範囲、さらに好ましくは、約12ヌクレオチドから約40ヌクレオチドの範囲の鎖長のものが使用できる。その塩基配列は使用される反応条件において鋳型核酸にアニーリングするように、実質的に鋳型核酸に相補的な配列であることが好ましい。該プライマーは、後に示す段階で使用されるエンドヌクレアーゼにより認識される配列を3’末端又は3’末端側に含む。
本発明を何ら限定するものではないが、例えば、下記一般式で表す構造をもつオリゴヌクレオチドを本発明のDNA合成方法にプライマーとして使用することができる。
一般式:5’−dNa−Nb−dNc−3’
上記一般式において、dN:デオキシリボヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログ、N:未修飾リボヌクレオチド及び/又は修飾リボヌクレオチド、なお、dNaの部位の一部のdNはNで置換されていてもよく、3’末端のヌクレオチドは当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないような修飾を有していてもよい。
上記一般式において、特に限定はされないが、例えば、aは5以上の整数であればよく、好ましくは6以上の整数、さらに好ましくは8以上の整数である。またbは1以上の整数であればよく、例えば1〜15の範囲、好ましくは1〜10の範囲、さらに好ましくは1〜7の範囲、特に好ましくは1〜5の範囲である。さらにcは0であってもよく、あるいは1以上の整数であり、好ましくは0〜5の範囲、さらに好ましくは0〜3の範囲である。
本発明に用いられるキメラオリゴヌクレオチドプライマーの態様としては、特に限定はされないが、例えば、a=8の場合における、b=1、c=0のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、b=2、c=0のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、b=3〜5、c=0のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、さらにb=2〜3、c=0〜3のキメラオリゴヌクレオチドプライマー等が例示される。すなわち、本発明の方法に使用できるようなキメラオリゴヌクレオチドプライマーとなるようにa、b、cの数値を調整すればよい。
本発明に使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、該プライマーよりDNAポリメラーゼで伸長されたDNA鎖(プライマー伸長鎖)に含まれるリボヌクレオチド含有部位がエンドヌクレアーゼで認識あるいは切断されるような構造を有しており、当該リボヌクレオチドはその3’末端又は3’末端側に配置されている。本発明を特に限定するものではないが、例えば、鋳型核酸にアニーリングした、上記の一般式で表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーよりDNAの伸長を行って生成した二本鎖DNAにRNaseHを作用させた場合には、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーのリボヌクレオチド部分が切断され、上記オリゴヌクレオチドプライマーと伸長により合成されたDNA鎖の間にニックの入った二本鎖DNAが生じる。さらに、該ニックの入った部位からDNAポリメラーゼにより鎖置換反応がおこる。従って、プライマーの3’末端から核酸鎖を伸長させることができ、エンドヌクレアーゼにより切断されることができ、そしてDNAポリメラーゼにより鎖置換反応ができるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは全て本発明の方法に使用することができる。さらに、本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーには、その3’末端がDNAポリメラーゼによる伸長が不可能な形に修飾されており、エンドヌクレアーゼによる切断によって生じた3’末端からDNAの伸長が行われるものが包含される。
また、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーの5’末端側には、RNAポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいてもよい。該RNAポリメラーゼとしては、T7 RNAポリメラーゼあるいはSP6 RNAポリメラーゼが例示される。
さらに本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーはヌクレオチドアナログやその他の物質を含有するものであってもよい。即ち、本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーには、DNAポリメラーゼがその3’末端からポリメラーゼ伸長反応せしめる、プライマーの機能を失わない範囲で1以上のヌクレオチドアナログを含有させることができ、さらに、当該ヌクレオチドアナログは複数の種類のものを組合せて使用することができる。該ヌクレオチドアナログとしては、特に限定はされないが、例えば、デオキシイノシンヌクレオチド、デオキシウラシルヌクレオチドあるいは7−デアザグアニンのような修飾塩基を有するヌクレオチドアナログ、リボースの誘導体を有するヌクレオチドアナログ等を使用することができる。また、本発明に使用されるキメラオリゴヌクレオチドは、上記の機能を保持する範囲内で種々の修飾、例えば標識化合物等の付加がなされたデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログを含有してもよい。
ヌクレオチドアナログのプライマーへの導入は、プライマー自身の高次構造形成の抑制、鋳型とのアニーリング形成の安定化の観点からも有効である。さらに、同様の目的でリボヌクレオチドをプライマーに導入しても良い。特に限定するものではないが、非特異的なエンドヌクレアーゼ(RNase)によるプライマーの分解を防ぐ観点からは、例えば、(α―S)リボヌクレオチドのような修飾リボヌクレオチドが好適に使用できる。
これらのキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、任意の核酸配列を持つように、例えばアプライド バイオシステムズ社(ABI社、Applied Biosystems Inc.)のDNAシンセサイザー394型を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。また、別法としてリン酸トリエステル法、H−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであっても良い。
(2)本発明に使用する上流ブロックオリゴヌクレオチド
本発明の方法において使用される上流ブロックオリゴヌクレオチドは、少なくともデオキシリボヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから選択されるものが好適に使用できる。
本発明の方法において使用される上流ブロックオリゴヌクレオチドは、鋳型核酸の塩基配列の一部に実質的に相補的な塩基配列を有し、鋳型となる核酸上の上記(1)のキメラオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング位置のさらに3’側の領域にアニーリングできるものが好適に使用できる。当該オリゴヌクレオチドは通常、増幅しようとする領域の上流、すなわち鋳型核酸上の増幅しようとする領域に対応する塩基配列の3’側部分に相補的に設計される。なお、ここで「実質的に相補的な塩基配列」とは、使用される反応条件において鋳型となるDNAにアニーリング可能な塩基配列を意味する。
上記のように、本発明の上流ブロックオリゴはその3’末端がDNAポリメラーゼによるDNA伸長反応に使用できない形に修飾されている。上記目的を達成可能であればその修飾手段には特に限定はないが、例えば、3’末端にジデオキシヌクレオチド、リボースの3位の水酸基が修飾されたヌクレオチド、DNAポリメラーゼによる伸長が立体障害により妨害されるような修飾を付されたヌクレオチド等を付加することがあげられる。上記上流ブロックオリゴのリボースの3位の水酸基の修飾方法としては、アルキル化やその他の公知の修飾方法を利用することができ、例えばアミノアルキル化することにより、DNA伸長反応を防ぐことができる。
本発明の方法で使用する上流ブロックオリゴヌクレオチドは、増幅後のDNA断片を一本鎖もしくは二本鎖のいずれの形態で得たいかによって1種類もしくは2種類を使い分けることができる。すなわち、一本鎖DNAが望まれる場合には1種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流ブロックオリゴヌクレオチドを、また、二本鎖が望まれる場合にはそれぞれ2種類の上記プライマー及びブロックオリゴヌクレオチドが使用される。
本発明の方法で使用する上流ブロックオリゴヌクレオチドのアニーリングする鋳型となる核酸上の位置は、標的核酸の塩基配列、増幅領域の長さ及び組み合わせるキメラオリゴヌクレオチドプライマーの標的核酸へのアニーリング位置によって最も増幅効率が良くなるような位置であれば特に限定はないが、例えばキメラオリゴヌクレオチドプライマーの5’末端から1塩基以上の範囲にその3’末端が位置するように設定される。
本発明の方法に用いられる上流ブロックオリゴヌクレオチドは、目的の増幅断片の検出感度の向上等の効果が得られるものであれば、いずれの鎖長のものも好適に使用できる。
特に限定されるものではないが、約6ヌクレオチドから約100ヌクレオチドの範囲、好ましくは約10ヌクレオチドから約50ヌクレオチドの範囲、さらに好ましくは約12ヌクレオチドから約40ヌクレオチドの範囲の上流ブロックオリゴヌクレオチドが例示される。その塩基配列は使用される反応条件において鋳型核酸にアニーリングするように、実質的に鋳型核酸に相補的な配列であることが好ましい。
さらに本発明の方法において使用される上流ブロックオリゴヌクレオチドはヌクレオチドアナログやその他の物質を含有するものであってもよい。本発明の上流ブロックオリゴヌクレオチドには、1以上のヌクレオチドアナログを含有させることができ、さらに、当該ヌクレオチドアナログは複数の種類のものを組合せて使用することができる。該ヌクレオチドアナログとしては、特に限定はされないが、例えば、デオキシイノシンヌクレオチド、デオキシウラシルヌクレオチドあるいは7−デアザグアニンのような修飾塩基を有するヌクレオチドアナログ、リボースの誘導体を有するヌクレオチドアナログ等を使用することができる。また、本発明に使用される上流ブロックオリゴヌクレオチドは、種々の修飾、例えば標識化合物等の付加がなされたデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログを含有してもよい。
ヌクレオチドアナログの当該ブロックオリゴヌクレオチドへの導入は、該オリゴヌクレオチド自身の高次構造形成の抑制、鋳型とのアニーリング形成の安定化の観点からも有効である。
これらの上流ブロックオリゴヌクレオチドは、任意の核酸配列を持つように、例えばアプライド バイオシステムズ社(ABI社、Applied Biosystems Inc.)のDNAシンセサイザー394型を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。また、別法としてリン酸トリエステル法、H−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであっても良い。
(3)本発明に使用されるエンドヌクレアーゼ
本発明に使用されるエンドヌクレアーゼとは、鋳型核酸にアニーリングした上記(1)に記載のキメラオリゴヌクレオチドプライマーよりDNAの伸長を行って生成した二本鎖DNAに作用して、鎖置換反応が起こるように伸長鎖を切断しうるものであればよい。即ち、上記の二本鎖DNAのうちのキメラオリゴヌクレオチドプライマー部分にニックを生成しうる酵素である。特に限定されるものではないが、例えば、本発明にはリボヌクレアーゼが使用でき、特にDNAとRNAとから形成された二本鎖核酸のRNA部分に作用するエンドリボヌクレアーゼH(RNaseH)が好適に使用できる。また、該リボヌクレアーゼには、上記作用を有するものであれば、常温性から耐熱性のリボヌクレアーゼのいずれもが好適に本発明に使用できる。例えば、本発明の方法の一態様として、約50℃〜約70℃での反応の場合において、大腸菌(E.coli)由来のRNaseHを使用することができる。また、耐熱性のリボヌクレアーゼも好適に使用できる。該耐熱性リボヌクレアーゼとしては、特に限定はされないが、例えば市販のHybridaseTM Thermostable RNaseH(エピセンターテクノロジーズ社製)の他、好熱性バチルス(Bacillus)属細菌、サーマス(Thermas)属細菌、ピロコッカス(Pyrococcus)属細菌、サーモトガ(Thermotoga)属細菌、アルカエオグロバス(Archaeoglobus)属細菌等由来のRNaseH等も好適に使用できる。さらに、該リボヌクレアーゼは、天然体および変異体のいずれもが好適に使用できる。なお、本願明細書に記載されているRNaseHの酵素単位は、実施例中の参考例に示した酵素単位測定方法に基づいて表示された数値である。
また、上記RNaseHは、本発明の方法に使用できるものであれば特に限定はなく、例えば、種々のウイルス、ファージ、原核、真核生物由来のいずれであってもよい。さらに、細胞性RNaseHあるいはウイルス性RNaseHのいずれであってもよい。例えば、上記細胞性RNaseHとしては大腸菌RNaseHIが、ウイルス性RNaseHとしてはHIV−1由来RNaseHが例示される。本発明の方法においてRNaseHは、I型、II型、III型のいずれもが使用できる。特に限定はされないが、例えば大腸菌由来RNaseHI、ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカエオグロバス属細菌由来RNaseHIIが好適である。
また、本発明の方法に使用するエンドヌクレアーゼ、例えば、RNaseHの切断反応の効率は上記プライマーの3’末端近傍の塩基配列に左右され、所望のDNAの増幅効率に影響することが考えられるので、使用するRNaseHに最適なプライマーをデザインすることは当然のことである。
本明細書において使用されている「ニックを入れる」もしくは「ニッキング」という語は、二本鎖核酸の一方の鎖の内部を切断することを意味する。たとえば、RNaseHはDNAとリボヌクレオチドを含むDNAとのハイブリッド二本鎖核酸に作用し、二本鎖のうちのリボヌクレオチドを含む鎖のリボヌクレオチド部分を選択的に切断することにより、当該ハイブリッド二本鎖核酸にニックを入れる。
(4)本発明に使用されるDNAポリメラーゼ
本発明には、DNAの鎖置換(strand displacement)活性を有するDNAポリメラーゼを使用することができる。また、実質的に5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものが特に好適に使用することができる。
本発明に使用されるDNAポリメラーゼは、上記の鎖置換活性を有するものであれば特に限定はなく、例えば、バチルス カルドテナックス(Bacillus caldotenax、以下、B.caと称す)やバチルス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus、以下B.stと称す)等の好熱性バチルス属細菌由来DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体や、大腸菌(以下、E.coliと称す)由来のDNAポリメラーゼIのラージ フラグメント(クレノウ断片)等が挙げられる。また、本発明に使用できるDNAポリメラーゼは、常温性から耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。
B.caは生育至適温度が約70℃である好熱性細菌であり、この細菌由来のBca DNAポリメラーゼは、DNA依存DNAポリメラーゼ活性、RNA依存DNAポリメラーゼ活性(逆転写活性)、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。上記の酵素は、その本来の起源より精製して取得されたもの、あるいは遺伝子工学的に生産された組み換え蛋白質の何れであっても良い。また、該酵素は、遺伝子工学的あるいはその他の手法によって置換、欠失、付加、挿入等の改変を加えたものであっても良く、このような酵素の例として、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたBca DNAポリメラーゼであるBcaBEST DNAポリメラーゼ(宝酒造社製)等が挙げられる。
なお、DNAポリメラーゼの中には、特定の条件でエンドヌクレアーゼ活性、例えば、RNaseH活性を有するものが知られている。このようなDNAポリメラーゼを本発明の方法に用いることができる。すなわち、該DNAポリメラーゼをRNaseH活性が発現されるような条件下、例えばMn2+の存在下で使用する態様が挙げられる。該態様においては、上記RNaseHを添加することなく本発明の方法を実施することができる。すなわち、Mn2+を含有する緩衝液中で上記のBca DNAポリメラーゼがRNaseH活性を示すことができる。なお、上記の態様はBca DNAポリメラーゼに限定されるものではなく、RNaseH活性を併せ持つことが知られている公知のDNAポリメラーゼ、例えばサーマス サーモフィラス(Thermus thermophilus)由来のTth DNAポリメラーゼも本発明に使用することができる。
(5)本発明の標的核酸の増幅方法
本発明の方法は、上記(1)に示されたキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上記(2)に示された上流ブロックオリゴヌクレオチドをそれぞれ少なくとも1種類使用し、さらに上記(3)に示されたエンドヌクレアーゼおよび上記(4)に示されたDNAポリメラーゼを組合わせて実施することができる。また、上記のようにRNaseH活性を有するDNAポリメラーゼをRNaseH活性が発現するような条件で使用することができる。
当該方法では、伸長反応の基質となるヌクレオチド3リン酸としてPCR法等に使われるdNTP、すなわちdATP、dCTP、dGTP、dTTPの混合物が好適に使用できる。また、dUTPを基質として用いてもよい。さらに、当該dNTPは、使用されるDNAポリメラーゼの基質となる限りにおいては、dNTP(デオキシリボヌクレオチド3リン酸)のアナログ、たとえば7−デアザ−dGTP、dITPの3リン酸等を含んでいてもよい。また、dNTPあるいはdNTPアナログの誘導体を使用してもよく、官能基を有する誘導体、例えばアミノ基を有するdUTPを含んでいてもよい。当該方法では、キメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用するが、当該プライマーは、例えば、DNA合成機等を用いて通常の合成方法と同様に調製することができる。
本発明の方法に用いるキメラオリゴヌクレオチドプライマーと上流ブロックオリゴヌクレオチドの使用量は、標的核酸の塩基配列、目的の増幅断片長及び使用する反応系組成により調整すれば良く、例えば増幅産物量を目安に調整することができる。即ち、本発明の方法において、目的の増幅産物を得られるならば、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーと上記ブロックオリゴヌクレオチドの使用量は限定されない。
本発明において、使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーと上流ブロックオリゴヌクレオチドのモル比は、目的の増幅産物を得られるならば、そのモル比に限定はない。
本発明の方法の一態様として、キメラオリゴヌクレオチドプライマー:上流ブロックオリゴヌクレオチドのモル比は、例えば、1:0.1〜1:10の範囲、好ましくは1:0.2〜1:5の範囲、さらに好ましくは1:0.25〜1:4の範囲である。
本発明の方法においては、使用される酵素の活性が反応中に低下するおそれのある場合には、反応の途中で当該酵素をさらに添加することができる。添加する酵素は、反応開始時に反応液中に含まれる酵素と同じものでもよいし、同じ作用を示す異なる種類の酵素であってもよい。すなわち、反応途中で添加することにより、検出感度の向上あるいは増幅産物量の増大等の効果が得られるならば、添加する酵素の種類及び該酵素の性質には何ら限定はない。
本発明の方法において鋳型となる核酸、すなわちDNAまたはRNAは、当該核酸を含む可能性のあるあらゆる試料から調製、あるいは単離したものでもよい。さらに、上記試料を直接、本発明の核酸増幅反応に使用してもよい。このような核酸を含む試料には特に限定はないが、例えば、全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織(例えば、癌組織、リンパ節等)、細胞培養物(例えば、哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物等)のような生体由来試料、ウイロイド、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のような核酸含有試料、ウイルス又は細菌のような微生物が混入もしくは感染している可能性のある試料(食品、生物学的製剤等)、あるいは土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料が挙げられる。また、前記試料等を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物であっても良い。該調製物としては、例えば細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中の核酸、あるいは特定の核酸分子群、例えば、mRNAを富化した試料等が本発明に使用できる。さらに上記試料中に含まれる核酸が公知方法で増幅されたDNAあるいはRNA等の核酸等も好適に使用できる。
これら材料からの核酸含有調製物の調製には特に限定はなく、例えば、界面活性剤による溶解処理、超音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌、フレンチプレスの使用等により行うことができる。幾つかの例においては、さらに操作を加えて核酸を精製することが有利である(例えば、内在性ヌクレアーゼが存在するとき)。これらの例において、核酸の精製はフェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動または密度勾配遠心分離等の公知方法により実施される。
RNA由来の配列を有する核酸を増幅したい場合には、当該RNAを鋳型とした逆転写反応によって合成されたcDNAを鋳型として本発明の方法を実施すればよい。本発明の方法に適用することができるRNAには、逆転写反応に使用されるプライマーが作製可能なものであれば特に制限はなく、試料中の全RNAの他、mRNA、tRNA、rRNA等のRNA分子群、あるいは特定のRNA分子種が挙げられる。
上記の逆転写反応に使用されるプライマーは、使用される反応条件において鋳型RNAにアニールするものであれば特に限定されるものではない。該プライマーは、特定の鋳型RNAに相補的な塩基配列を有するプライマー(特異的プライマー)の他、オリゴdT(デオキシチミン)プライマーやランダムな配列を有するプライマー(ランダムプライマー)であっても良い。逆転写用プライマーの長さは、特異的なアニーリングを行う観点から、好ましくは6ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは9ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは100ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは30ヌクレオチド以下である。さらに、逆転写用プライマーとして、逆転写後のcDNAを鋳型とした本発明の核酸増幅法を行う際に鎖置換反応のためのプライマーとして使用可能な上記(1)に記載された性質を有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーが好適に使用することができる。すなわち、RNAからの逆転写反応に使用できるものであれば特に限定はない。
上記の逆転写反応に使用される酵素としては、RNAを鋳型としたcDNA合成活性を有するものであれば特に限定はなく、例えばトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素(AMV RTase)、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素(MMLV RTase)、ラウス関連ウイルス2逆転写酵素(RAV−2 RTase)等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つDNAポリメラーゼを使用することもできる。また、本発明の目的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素が好適であり、例えばサーマス属細菌由来DNAポリメラーゼ(Tth DNAポリメラーゼ等)、好熱性バチルス属細菌由来DNAポリメラーゼ等を使用できる。特に限定はないが、例えば、好熱性バチルス属細菌由来DNAポリメラーゼが好ましく、B.st由来DNAポリメラーゼ(Bst DNAポリメラーゼ)、さらにBca DNAポリメラーゼが好ましい。例えば、Bca DNAポリメラーゼは、逆転写反応にマンガンイオンを必要とせず、また、高温条件下で鋳型RNAの二次構造形成を抑制しながらcDNAを合成することができる。上記の逆転写酵素活性を有する酵素も、当該活性を有している範囲において天然体、変異体のいずれもが使用できる。
また、別の態様としては、増幅しようとする塩基配列を含むDNAあるいはRNAをあらかじめ複製した後、本発明の方法の鋳型となる核酸として用いてもよい。該複製の方法としては、特に限定はされないが、増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片を挿入したベクターで適当な宿主を形質転換させた後、得られた形質転換体を培養して、上記増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片を挿入したベクターを抽出して使用する方法が例示される。該ベクターは、宿主内で安定して複製されるものであれば特に限定はなく、例えば、pUC系、pBluescript系、pGEM系、コスミド系、ファージ系のいずれもが好適に使用できる。また、宿主は、使用されるベクターを保持することができるものであれば特に限定はなく、例えば、培養が容易な大腸菌等が例示される。
さらに、上記複製の方法の別の態様としては、増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片を鋳型としてRNAポリメラーゼで該塩基配列を有するRNAを転写した後、該RNAをそのまま、あるいは逆転写反応によりcDNAとして本発明の方法の鋳型に用いてもよい。上記の増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片はRNAポリメラーゼのプロモーター配列を有していれば特に限定はなく、RNAポリメラーゼのプロモーター配列を有するベクターに挿入されたものでもよいし、末端にRNAポリメラーゼのプロモーター配列を有するアダプターあるいはカセットをライゲーションさせたものでもよいし、RNAポリメラーゼのプロモーター配列を有するプライマーと適切な鋳型を用いて酵素的に合成したものであってもよい。すなわち、上記の増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片を、上記のように配置されたRNAポリメラーゼのプロモーター配列を用いて、RNAの形で複製、増幅することができる。上記ベクターは、RNAポリメラーゼのプロモーター配列を有するものであれば特に限定はなく、例えば、pUC系、pBluescript系、pGEM系、コスミド系、ファージ系のいずれもが好適に使用できる。また、該ベクターは、環状のままあるいは直鎖状に処理したもののいずれもが好適に使用できる。さらに、上記の複製、増幅方法に用いられるRNAポリメラーゼは特に限定はなく、例えば、SP6 RNAポリメラーゼ、T7 RNAポリメラーゼあるいはT3 RNAポリメラーゼ等が好適に使用できる。
上記方法により単離したゲノムDNAやPCRフラグメントのような二本鎖DNA、および全RNA若しくはmRNAから逆転写反応で調製されたcDNAのような一本鎖DNAのいずれもが本発明において鋳型DNAとして好適に使用できる。上記二本鎖DNAの場合は、一本鎖DNAに変性する工程(デネーチャー)を施したもの及び変性する工程を施さないもののいずれもが好適に使用できる。
即ち、本発明の方法において、上記デネーチャーの工程は、行っても良いし、行わなくても良い。
本発明の一態様として、RNA由来の配列を有する核酸の増幅を目的とする場合には、RNAを鋳型とした逆転写反応によって得られたRNA−cDNA二本鎖核酸を、RNaseHを含有する本発明の増幅用反応液に加えることにより、RNA鎖を分解して一本鎖cDNAとし増幅反応を開始することができる。さらに、本発明のDNAの合成方法に逆転写酵素活性と鎖置換活性とを有するDNAポリメラーゼを使用することにより、RNAを鋳型とした逆転写反応と、当該反応によって生成したcDNAを鋳型にしたDNA増幅反応とを1種類のDNAポリメラーゼで行なうことができる。
上記のような二本鎖を一本鎖DNAに変性する工程、もしくは、鋳型がRNAの場合、逆転写反応によりcDNA(一本鎖DNA)を調製する工程の後、等温条件下において、連続的に核酸が増幅される。
ここで、「連続的に」とは、反応温度、反応液組成の変更を伴わずに反応が進行していることを意味する。また、本明細書において「等温」とは、酵素および核酸鎖が上記各工程において機能する、実質的に一定の温度条件のことを意味する。
本発明の核酸増幅反応は、例えば、クレノウ断片のような常温性DNAポリメラーゼを使用することにより常温(例えば37℃)でも実施できるが、耐熱性を有する酵素(エンドヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼ)を使用して高温、例えば50℃以上で実施することができる。この場合、プライマーの非特異的なアニーリングが抑制され、DNA増幅の特異性が向上し、また鋳型DNAの二次構造が解消されることによりDNAポリメラーゼの伸長性も向上する。さらに該方法においては、逆転写反応および核酸の増幅を連続して行なう態様も可能であり、上記反応に逆転写酵素を組み合わせて、あるいは逆転写活性を有するDNAポリメラーゼを使用して、RNA由来の配列を有するDNAを増幅することができる。
本発明を特に限定するものではないが、本発明の各態様において、好ましくは、鋳型DNAに該DNAに相補的なキメラオリゴヌクレオチドプライマー、上流ブロックオリゴヌクレオチドがアニーリングする。次に鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼの作用により、当該キメラオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端より鋳型DNAの残りの配列に沿って鋳型DNAに相補的なDNA(プライマー伸長鎖)を伸長させる。その際、キメラオリゴヌクレオチドプライマーの伸長鎖は、鋳型となる核酸の当該キメラオリゴヌクレオチドプライマーと実質的に相補的な領域の3’側の塩基配列に実質的に相補的である上流ブロックオリゴヌクレオチドが鋳型となる核酸にアニーリングすることにより、ブロックされる。このため、本発明の方法の反応初期段階において非直線的な増幅をするキメラオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングするための鋳型が増幅される。この初期増幅反応により本発明の方法は、安定的に増幅効率が向上する。すなわち、標的核酸の検出感度が向上することになる。
本発明の一つの態様においては、エンドヌクレアーゼは上記の二本鎖DNAにニックを入れるニッキング酵素として作用するか、あるいはキメラオリゴヌクレオチドプライマーと鋳型DNAの二本鎖DNA構造を変化させるが、本願発明は理論によって限定はされない。さらに、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼがニックの入った二本鎖DNAのニックの3’末端からDNA鎖を再伸長して新たなプライマー伸長鎖を生成し、同時にニックの3’末端から下流のDNAを遊離させる。こうして先に合成されたプライマー伸長鎖が新たなプライマー伸長鎖に置換される。
本発明の核酸増幅方法は、鋳型核酸に相補的なキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流ブロックオリゴヌクレオチドと、置換鎖に相補的なもう1種のキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流ブロックオリゴヌクレオチドの1組のプライマーと1組のブロックオリゴヌクレオチドを使用して実施することができる。この場合、2本鎖DNAにまずキメラオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングしてそれぞれの相補鎖を合成し、さらにそれぞれの相補鎖に上流ブロックオリゴヌクレオチドがアニーリングして、該上流ブロックオリゴヌクレオチドのアニーリング位置でのそれぞれの相補鎖同士のアニーリングをブロックする考えられる。また、この伸長反応においては、鋳型交換反応も並行して進むと考えられる。この態様を使用すると、各反応産物が他のプライマーのための鋳型として機能できることは明らかである。このように鋳型量が増加することにより、非直線的に増幅産物が増加していく。
二本鎖DNAを鋳型に用いて本発明の核酸増幅方法を実施する場合には、二本鎖のそれぞれにアニーリングするキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流ブロックオリゴヌクレオチドを使用することにより、両方の鎖を増幅反応の鋳型とすることができる。二本鎖DNAを鋳型に反応を開始する場合には、キメラオリゴヌクレオチドプライマー、上流ブロックオリゴヌクレオチド、4種のデオキシリボヌクレオチド3リン酸(dNTP)、DNAポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを反応液に添加する。熱処理により二本鎖DNAを変性し、かつ耐熱性の酵素を使用しない場合には、変性後に酵素を添加することが好ましい。
二本鎖の鋳型DNAと2種のキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流ブロックオリゴヌクレオチドを使用する本発明の核酸増幅方法の態様においては、反応の条件等にもよるが、各プライマーから伸長反応中のそれぞれの鋳型−伸長鎖中間体の間で鋳型の交換が起こり、合成されたプライマー伸長鎖同士がアニーリングした二本鎖核酸を生成することがある。この二本鎖核酸は両端にキメラオリゴヌクレオチドプライマーを有しており、次いでその両端から再び鎖置換による相補鎖伸長反応を開始することができる。この反応の結果、一端にプライマーの配列を有する増幅産物が生成される。さらに、この反応中に鋳型の交換が起こった場合には前記と同様な二本鎖核酸が再度生成される。
本発明により、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを使用し、鋳型交換反応を行う工程を包含する核酸の増幅方法が提供される。当該鋳型交換反応においては、鋳型となる二本鎖核酸と、それぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的な2種のキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流ブロックオリゴヌクレオチドと、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼの存在下に、該鋳型に相補的な2種のプライマー伸長鎖が合成される。該プライマー伸長鎖の合成の途中において、プライマー伸長鎖のそれぞれの鋳型から他方のプライマー伸長鎖への鋳型の交換が起こる。
ここで、鋳型交換反応とは、2本鎖核酸の両側からの鎖置換反応による相補鎖の合成が行われる際に、DNAポリメラーゼがその鋳型を交換し、他方のDNAポリメラーゼが新規に合成してきた相補鎖をそれぞれ鋳型として、以降の相補鎖合成を行うことを言う。言い換えれば、鋳型となる2本鎖核酸をそれぞれのプライマー及び鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼで処理し、該鋳型に相補的な伸長鎖を生成せしめる反応において、該伸長鎖を合成中に、DNAポリメラーゼによってプライマー伸長鎖が当初の鋳型から、他方のプライマー伸長鎖へと能動的にスイッチングせしめる反応を言う。
本発明には、鎖置換反応中に上記の鋳型交換反応を行う能力を有するDNAポリメラーゼが好適に使用でき、例えば、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したBca DNAポリメラーゼの変異体酵素が特に好適に使用される。当該酵素はBcaBEST DNAポリメラーゼ(宝酒造社製)として市販されており、また、該酵素の遺伝子を含有する大腸菌、Escherichia coli HB101/pUI205(FERM BP−3720)より日本特許第2978001号に記載の方法によって調製することもできる。
また、本発明の増幅方法において、キメラオリゴヌクレオチドプライマー伸長鎖のリボヌクレオチド含有部位が切断される際に、当該切断によって生じる5’側の断片(プライマー部分)がリボヌクレオチドを含有しないように切断される場合がある。こうして生じたプライマー部分から伸長されたプライマー伸長鎖はもはやエンドヌクレアーゼにより切断されず、この結果、末端にプライマーの配列を有する増幅産物が生成される。
上記のように、本発明の核酸増幅方法においてはプライマーの配列を含まない増幅産物の他、一端、もしくは両端にプライマーの配列を有する産物が生成しうる。これらの産物も本発明にいう増幅産物に包含される。
キメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用する本発明の核酸増幅方法においては、増幅領域が連なった重合体を生成する場合がある。このような重合体は増幅領域が複数個、いずれも同じ向きに連なったものであり、電気泳動による増幅産物の解析ではラダー状のバンドとして確認される。当該重合体の生成は、増幅される領域、該領域のサイズ、その隣接領域、使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列あるいは反応の条件等により影響を受けることが考えられている。
上記の重合体は、増幅領域を複数個含むものである。当該重合体は、例えば適切なプローブとのハイブリダイゼーションによって多数のプローブとハイブリダイズし、当該重合体が強いシグナルを発生することから、増幅領域を含む核酸の検出を目的とする場合に有用である。また、制限酵素消化等を組み合わせて、重合体より増幅領域、またはその一部をモノマーとして得ることもできる。
本発明に使用されるDNAポリメラーゼは、プライマー部分の3’末端から下流への伸長鎖合成に伴い、先に伸長されたDNA鎖の置換を行う必要がある。そして重要なことは置換鎖を分解する可能性のある5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を示さないことである。このようなDNAポリメラーゼ、例えば大腸菌由来のDNAポリメラーゼIのエキソヌクレアーゼ欠損変異体であるクレノウ断片、BstDNAポリメラーゼ由来の同様の断片(ニューイングランドバイオラブス社製)、B.ca由来のBcaBEST DNAポリメラーゼ(宝酒造社製)が有用である。シークエネース1.0およびシークエネース2.0(米国バイオケミカル社)、ジーン(Gene)第97巻、13〜19頁(1991)記載のT5DNAポリメラーゼおよびφ29 DNAポリメラーゼも使用することができる。通常は5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼであっても、その活性が適当な阻害剤の添加により阻害することが可能な場合は、本発明のDNA合成方法に使用できる。
本発明の核酸の増幅方法は、変温で行ってもよく、又は等温で行ってもよい。ここで変温とは、各工程の反応を妨げない範囲で各工程の反応温度を変化させることを意味する。すなわち、例えば、プライマーのアニーリング、相補鎖の合成反応、相補鎖のニッキング、そして置換反応のそれぞれに適した温度に変化させる場合のことをいう。
次に等温とは、各工程の反応温度を変化させず、各工程が実質的に一定の温度で行われることを意味する。いずれの場合においても、最適の反応条件となるように温度を設定するのは当然である。
本発明の核酸の増幅方法の1つの特徴としては、核酸の合成方法において温度を上げ下げする必要がないことにある。即ち、本発明は等温での核酸の合成方法を提供する。従来の多くの核酸増幅法は、温度を上下することにより合成鎖から標的物を解離する必要があり、例えばサーマルサイクラーのような特別な反応装置を必要とするが、本発明の方法においては一定温度を保持できる装置のみでも実施することができる。このように、本発明の方法は、単一の温度で実施することができる。好ましくは、プライマーの非特異的なアニーリングが低減され、かつ鋳型となる核酸にプライマーが特異的にアニーリングするように反応温度、ストリンジェンシーのレベルを設定して実施される。特に限定するものではないが、上記のように耐熱性の酵素を用いて本発明の方法を高温条件下で行う事ができる。さらに、反応の効率を高く保つ観点から、本発明の方法は使用する酵素の活性が十分に保持される適当な温度で行うことが好ましい。従って、使用する酵素にもよるが、好ましい反応温度は、約20℃〜約80℃であり、さらに好ましくは約30℃〜約75℃であり、特に好ましくは、約50℃〜約70℃である。特に高温条件下で反応を行う場合には、常温で反応を行う場合よりも鎖長の長いプライマーを使用することが好ましい。例えば、本発明の方法において反応温度を55℃から60℃あるいは65℃に設定した場合、該方法に使用するプライマーあるいはブロックオリゴヌクレオチドの長さとしては、特に限定するものではないが、例えば約6ヌクレオチド〜約100ヌクレオチドの範囲、好ましくは約10ヌクレオチド〜約50ヌクレオチドの範囲、さらに好ましくは約12ヌクレオチド〜約40ヌクレオチドの範囲のものが使用できる。このように反応温度を上げることの効果としては、鋳型DNAの二次構造を解消できることが挙げられ、GC含量の高い鋳型核酸を使用した場合にも所望の核酸が増幅される。また、長鎖長の領域を増幅する場合においても同様の効果がある。該効果は、約60bp〜約20kbpの範囲で、さらに約60bp〜約4.3kbpの範囲で、特に約60bp〜約1500bpの範囲で認められる。
また、本発明の方法において、逆転写酵素活性を持つDNAポリメラーゼ、例えば、BcaBEST DNAポリメラーゼを使用した場合、RNAからcDNAを調製する工程(逆転写反応)を含むRNA由来の核酸の増幅を1種類の酵素のみで簡便に実施することができる。また、RNAからcDNAを調製する工程を独立させて行い、その生成物(cDNA)を本発明の方法に鋳型DNAとして使用することもできる。
いずれの場合においても、本発明の方法においては、適当な方法、例えば酵素を失活させたり反応温度を低下させて反応を停止させるか、または基質のうちのいずれか一つが使い尽くされるかのいずれかまで繰り返される。
本発明の核酸の増幅方法は、核酸の増幅を利用した種々の実験操作、例えば核酸の検出、標識、塩基配列の決定に使用することができる。
また、本発明の核酸の増幅方法は、in situ核酸増幅方法、DNAチップのような固相担体上での核酸増幅方法あるいは多種類の領域を同時に増幅するマルチプレックス核酸増幅方法として使用することができる。
また、本発明の上流ブロックオリゴヌクレオチドは、一方のプライマー量を他方の量に対して過剰にして増幅反応を行なう、いわゆるアシンメトリック(非対称)核酸増幅方法においても使用することができる。
本発明の核酸の増幅方法によれば実質的にその相補鎖を含有しない一本鎖のDNAを調製することができ、例えば、DNAチップのような核酸固定化物を作製するための一本鎖DNA、標的核酸検出のための一本鎖DNAプローブ、または長鎖PCR法のためのメガプライマーを容易にしかも短時間に作製することができる。また、本発明の方法を使用することにより、センス配列のみ、あるいはアンチセンス配列のみを選択して増幅させることが可能である。従って、本発明はセンス配列あるいはアンチセンス配列を有する核酸の製造方法としても有用である。
また、本発明の方法は、ビシン、トリシン、ヘペス、リン酸塩あるいはトリス緩衝液中で行うことにより微量の鋳型となる核酸からでも所望の核酸配列領域を増幅することができる。
さらに、本発明の核酸の増幅方法には経時的な温度調節が可能な反応装置を使用する必要がないため、大容量の反応液を使用して増幅反応を実施することができる。したがって、例えば医薬用途等に使用される核酸の工業的大量製造が可能である。
また、本発明の核酸増幅方法は、鋳型となる核酸の塩基配列に忠実に増幅産物を生成することができる。本発明の方法におけるDNA合成の誤りの頻度を得られた増幅産物の塩基配列を解析することによって確認したところ、高い忠実度で核酸を増幅できることが知られているLA−PCR法と本発明の方法のそれぞれで得られた増幅産物中に見出された誤りの頻度は同程度であった。すなわち、本発明の方法はLA−PCR法に匹敵する忠実度を有している。
(6)本発明のキット
本発明は、前述の本発明の核酸の増幅方法に使用されるキットを提供する。1つの実施態様において、該キットは、パッケージされた形態において、鎖置換反応におけるDNAポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、キメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流ブロックオリゴヌクレオチドの使用のための指示書を含むことを特徴とする。さらに、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼならびに鎖置換反応用緩衝液を含むキットは本発明の方法に好適に使用される。あるいは、市販の鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼおよび/またはエンドヌクレアーゼを指示書に従って選択し、使用してもよい。さらに、RNAを鋳型とする場合の逆転写反応用試薬を含んでもよい。DNAポリメラーゼは、上記(4)記載の本発明に使用されるDNAポリメラーゼから選択することができる。また、エンドヌクレアーゼは、上記(3)記載のエンドヌクレアーゼから選択することができる。
上記「指示書」とは、当該キットの使用方法、例えば鎖置換反応用試薬液の調製方法、推奨される反応条件等を記載した印刷物であり、パンフレットまたはリーフレット形式の取り扱い説明書のほか、キットに添付されたラベル、キットが納められたパッケージ等に記載されたものを含む。さらに、インターネットのような電子媒体を通し、開示、提供された情報も含まれる。
さらに、本発明のキットにおいては、ビシン、トリシン、ヘペス、リン酸塩あるいはトリス緩衝成分を含有する反応バッファー、及びアニーリング溶液が含まれていてもよい。また、鎖置換能を有するDNAポリメラーゼやRNaseHが含まれていてもよい。さらに、修飾されたデオキシリボヌクレオチドあるいはデオキシヌクレオチド3リン酸のアナログを含有していてもよい。
さらに、標的核酸の検出方法に使用されるキットは、上記の指示書、増幅反応のための試薬類の他、標的核酸の増幅に適したキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流ブロックオリゴヌクレオチド、増幅された標的核酸を検出するための試薬、例えばプローブ等を含むものであってもよい。
また、本発明のキットは、上記の本発明に使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマー、上流ブロックオリゴヌクレオチド及び/又は本発明のプローブを含有するキットも包含する。
(7)本発明の組成物
本発明は、前述の本発明の核酸の増幅方法、または本発明の核酸の検出方法に使用される組成物を提供する。該組成物としては、例えば、上記(1)に記載のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、上記(2)に記載の上流ブロックオリゴヌクレオチド、上記(3)に記載のエンドヌクレアーゼならびに上記(4)に記載のDNAポリメラーゼを含有するものが挙げられる。さらに、増幅反応を行うための成分として、緩衝成分やマグネシウム塩、dNTP等を含んでいてもよい。さらに、修飾されたデオキシリボヌクレオチドあるいはデオキシヌクレオチド3リン酸のアナログを含有していてもよい。さらに、緩衝成分やその他の添加物を使用することができる。
特に好適な態様としては、本発明の核酸増幅方法に適した組成で上記の各種成分が含有された組成物を挙げることができ、該組成物は適切な鋳型とキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流ブロックオリゴヌクレオチドを添加するのみで増幅反応を実施することができる。さらに、増幅対象があらかじめ明らかである場合には、当該増幅対象の増幅に適したキメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有する組成物が好適である。
(8)本発明の標的核酸の検出方法
本発明の核酸の増幅方法を使用することにより、試料中の標的核酸の検出を行うことができる。当該検出方法は、
(a)上記の本発明の核酸の増幅方法により、標的核酸を増幅する工程;および、
(b)上記工程により増幅された標的核酸を検出する工程;
を包含する。
上記(a)行程において、RNAを鋳型とする場合は、逆転写反応と核酸増幅反応を1段階で行ってもよい。特に限定はされないが、逆転写酵素と鎖置換型DNAポリメラーゼの組み合わせとして例えば、AMV RTase、MMLV RTaseあるいはRAV−2 RTaseとBca DNAポリメラーゼの組み合わせが好適に使用できる。
上記方法は試料中に存在する特定の遺伝子の検出、定量に利用することができる。すなわちDNAまたはRNA等の核酸を含む可能性のあるあらゆる試料から特定の遺伝子を検出、定量することができる。前述の試料としては、特に限定はないが、例えば、全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織(例えば、癌組織、リンパ節等)、細胞培養物(例えば、哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物等)のような生体由来試料、ウイロイド、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のような核酸含有試料、ウイルス又は細菌のような微生物が混入もしくは感染している可能性のある試料(食品、生物学的製剤等)、あるいは土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料から特定の遺伝子を検出、定量することができる。さらに例えば、ウイロイド、ウイルス、カビ、細菌あるいはその他の微生物等由来の特定の遺伝子をターゲットとすることにより、該遺伝子の存在の有無によって上記の微生物の存在を検出、定量等に利用することができる。特に、病原性の微生物の検出方法は衛生、環境分野で有用である。さらに、生物の遺伝子型の判別や遺伝子の発現状態を調べるために本発明の方法を使用することもできる。特に疾病関連遺伝子、例えば細胞の癌化に関連する遺伝子等の検出、発現状態の確認は医療分野において有用である。上記検出法のための鋳型として使用される核酸は、RNAあるいはDNAのいずれもが好適に使用できる。
また、本発明の標的核酸の検出方法は、標的核酸における遺伝子多型のタイピング方法としても使用することができる。
特に限定はされないが、例えば、使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端部分が、標的とされる塩基配列の判別しようとする特定の塩基付近に位置するように、たとえば、該塩基とプライマーの3’末端の塩基とが水素結合を形成するようにプライマーが設計される。このようなキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅反応を実施した場合、プライマーの3’末端部分の塩基配列と鋳型の塩基配列との間にミスマッチが存在する場合には標的核酸からの増幅が起こらず、増幅産物の生成が見られない。当該方法により、点突然変異、一塩基置換(Single nucleotide polymorphysm、SNP)のような遺伝子上の特定の塩基についての情報を得ることが可能である。
同様に本発明の方法は、欠失変異、挿入変異のような遺伝子多型のタイピング方法としても使用できる。
また、本発明の上流ブロックオリゴヌクレオチドは、国際出願番号PCT/JP02/01222明細書に記載の遺伝子多型をタイピングする方法において使用することができる。
遺伝子多型をタイピングする方法の一態様としては、標的核酸における遺伝子多型のタイピング方法であって、
(1)標的核酸を含有する試料とヌクレオチドとを混合する工程:ここで当該ヌクレオチドは、
A)その3’末端が当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
B)標的核酸上の前記特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており、
C)当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在する場合にはヌクレオチドはヌクレアーゼによる切断を受けず、かつ、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しない場合にはヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて新たな3’末端を生じるような配列を含有しており、
(2)前記混合物をヌクレアーゼ、およびDNAポリメラーゼで処理する工程:および
(3)ヌクレアーゼによるヌクレオチドの切断の有無を検出する工程、
を包含することを特徴とする、標的核酸における遺伝子多型のタイピング方法において上記ヌクレオチドと本発明の上流ブロックオリゴヌクレオチドを組合せて使用することができる。
さらに別の態様としては、標的核酸における遺伝子多型のタイピング方法であって、
(1)標的核酸を含有する試料とヌクレオチドとを混合する工程:ここで当該ヌクレオチドは、
A)その3’末端が当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
B)標的核酸上の前記特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており、
C)当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しない場合にはヌクレオチドはヌクレアーゼによる切断を受けず、かつ、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在する場合にはヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて新たな3’末端を生じるような配列を含有しており、
(2)前記混合物をヌクレアーゼ、およびDNAポリメラーゼで処理する工程:および
(3)ヌクレアーゼによるヌクレオチドの切断の有無を検出する工程、
を包含することを特徴とする、標的核酸における遺伝子多型のタイピング方法において、本発明の上流ブロックオリゴヌクレオチドを組合せて使用することができる。
上記「遺伝子多型」は、同一の生物集団内に含まれる個体間における遺伝子の塩基配列の相違のことをいう。「遺伝子多型」を構成する塩基配列の相違は、特定の形式に限定されるものではなく、「塩基置換」、「欠失変異」、「挿入変異」等、種々のタイプのものを包含する。この遺伝情報の違いは、バリエーション(variation)とも呼ばれている。
上記「塩基置換」としては、核酸上の特定の部位において、その一部の塩基が他の塩基に置換されていることを示す。上記「塩基置換」には、「一塩基置換多型(SNP)」も含まれる。
また、「欠失変異」とは、核酸上の特定の部位において、その一部あるいは全部の塩基配列が欠失していることを示す。
さらに、「挿入変異」とは、核酸上の特定の部位において、任意の鎖長の塩基配列が挿入されていることを示す。
上記の態様においては、標的核酸上の上記ヌクレオチドの上流位置に本発明のブロックオリゴヌクレオチドがアニーリングする。その結果、本発明の標的核酸の増幅方法の場合と同様に標的核酸上の遺伝子多型のタイピングにおいて、その検出感度を向上させることができる。
本発明の標的核酸の検出方法は、核酸を含有する試料より直接、標的核酸を増幅することにより実施することができる。この場合、増幅される標的核酸の鎖長には、特に限定はないが、感度よく標的核酸を検出する観点からは、例えば200bp以下、さらに好ましくは150bp以下の領域が有効である。該増幅鎖長となるように本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを設定することにより、高感度に試料中の標的核酸を検出することができる。
さらに、本発明の検出方法では、ビシン、トリシン、ヘペス、リン酸塩あるいはトリス緩衝成分を含有する反応バッファー、及びスペルミジンやプロピレンジアミンを含有するアニーリング溶液の使用により、微量の核酸試料からもさらに高感度に標的核酸を検出することができる。この場合、使用するエンドヌクレアーゼとDNAポリメラーゼは特に限定はされないが、例えばAfu由来のRNaseH及びBcaBEST DNAポリメラーゼの組み合わせが好ましい。特に、上記エンドヌクレアーゼ及びDNAポリメラーゼはともにその種類によって好適に使用できるユニット数が異なる場合が予想されるが、その際には検出感度の向上あるいは増幅産物量の増加を指標にして、該バッファーの組成および酵素の添加量を調整すればよい。
本発明の検出方法においては、標的核酸の増幅の際に、dUTPを基質として取り込ませることができる。したがって、dUTPを基質に用いた場合には、ウラシル N−グリコシダーゼ(uracil N−glycosidase:UNG)を利用して増幅産物を分解し、増幅産物のキャリーオーバーコンタミネーションによる擬陽性を防止することができる。
上記(b)工程には公知の核酸検出方法、例えば電気泳動により特定のサイズの反応産物を検出する方法や、プローブとのハイブリダイゼーションによる検出等を使用することができる。さらに、磁気ビーズ等を組み合わせた検出方法も好適に使用できる。上記電気泳動による検出には、通常、エチジウムブロマイド等の蛍光物質が使用されるが、プローブとのハイブリダイゼーションを組み合わせてもよい。また、プローブは放射性同位元素による標識の他、ビオチンや蛍光物質のような非放射性の標識を施したものが使用できる。この他、上記(a)工程において標識ヌクレオチドを使用することにより、増幅産物に標識ヌクレオチドを取り込ませて検出を容易にすることや該標識を利用した検出用シグナルの増強を行うことができ、さらに蛍光偏光法、蛍光エネルギー転移等を利用した検出を行うことも可能である。さらに、適切な検出系を構築することにより、標的核酸を自動的に検出することや、あるいは標的核酸の定量を行うことが可能である。また、ハイブリッドクロマト法による肉眼検出法も好適に使用できる。
消光状態になるような距離で配置された2種類以上の蛍光物質で標識されたリボヌクレオチド(RNA)プローブあるいはリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドで構成されるキメラオリゴヌクレオチドプローブのいずれもが本発明の検出方法に使用することができる。当該プローブは蛍光を発することはないが、これに相補的な標的核酸由来の増幅DNAにアニーリングした場合、RNaseHは該プローブを分解する。この結果、プローブ上の蛍光物質間の距離が増大して蛍光が発せられるようになり、標的核酸の存在を知ることができる。RNaseHを使用して本発明の核酸の増幅方法が実施された場合には、その反応液中に上記のプローブを添加するだけで標的核酸を検出することができる。当該プローブの標識に使用される蛍光物質としては、例えば、6−FAM(6−carboxyfluorescein)とTAMRA(N,N,N’,N’−tetramethyl−6−carboxyrhodamine)との組み合わせ等が好適に使用できる。
さらに、本発明は前記の標的核酸の検出方法に使用されるプローブを提供する。本発明のプローブは、上記の本発明の核酸の増幅方法により増幅された核酸に通常のハイブリダイゼーションの条件において標的核酸にハイブリダイズし得るものであれば特に限定はないが、増幅産物を特異的に検出する観点からは、例えば厳密な条件として当業者に知られている条件でハイブリダイズするものが好ましい。前記、厳密なハイブリダイゼーション条件は、例えば1989年、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー発行、T.マニアティス(T. Maniatis)ら編集、モレキュラー クローニング:ア ラボラトリー マニュアル第2版(Molecular Cloning : A Laboratory Manual 2nd ed.)に記載されている。具体的な厳密な条件としては、例えば以下の条件を挙げることができる。すなわち、0.5%SDS、5×デンハルツ[Denhardt’s、0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.1%ポリビニルピロリドン、0.1%フィコール400]及び100μg/mlサケ精子DNAを含む6×SSC(1×SSCは0.15M NaCl、0.015M クエン酸ナトリウム、pH7.0)中で、使用するプローブのTm値より約25℃低い温度で4時間〜一晩保温を行う条件を言う。前記プローブは、標的核酸の検出を容易にするために上記のような標識を付されたものを使用することができる。
本発明の方法においては、サーマルサイクラーのような装置を必要としない。また本発明の方法では、キメラオリゴヌクレオチドプライマーと上流ブロックオリゴヌクレオチドを組合せることにより、標的核酸の検出感度を向上させることができる。また、dNTPのような試薬もPCR等で用いられるものを流用できる。そのため、ルーチンワークを行なっている遺伝子検査等の分野で好適に使用できる。さらに、本発明の方法はPCR法よりも短時間により多くの増幅産物を得られることから、簡便、迅速、高感度な遺伝子検出方法として利用することができる。
ゲノムレベルの遺伝子解析においては、大量の塩基配列を解析するために反応系を微量化し、さらに集積度を高める試みがなされている。その手段の一つとして、最先端の超微細加工技術を駆使して、ゲノム解析の基本プロセス、例えば、DNAの細胞からの抽出、DNA増幅反応、電気泳動、ハイブリダイゼーション、目的DNAの検出等のプロセスを数cm角〜指先大のマイクロチップ上に集積化したものが開発されている。該システムはマイクロチップ、あるいはナノチップと呼ばれている。
このようなシステムにおける遺伝子増幅反応として現在はPCR法が考えられているが、該方法は経時的に温度の上昇、下降を繰り返す温度制御のための手段を必要とするため、システムが複雑なものとなる。これに対し、等温条件下で核酸を増幅できる本発明の方法はシステムの単純化が可能であり、上記のような集積化されたシステムでの利用に非常に好適である。さらに、本発明の技術を利用してさらに高い集積度のシステムの構築が可能となる。
実施例
以下に実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
参考例1 アルカエオグロバス フルギダスのRNaseHII遺伝子のクローニング
(1)アルカエオグロバス フルギダス ゲノムDNAの調製
アルカエオグロバス フルギダス(Archaeoglobus fulgidus、ドイッチェザムルンク フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツレンGmbHより購入:DSM4139)8ml相当分の菌体を集め、100μlの25%ショ糖、50mMトリス−HCl(pH8.0)に懸濁し、20μlの0.5M EDTA、10μlの10mg/ml塩化リゾチーム(ナカライテスク社製)水溶液を加えて、20℃で1時間反応させた。反応終了後、この反応液に800μlの150mM NaCl、1mM EDTA、20mMトリス−HCl(pH8.0)、10μlの20mg/mlプロテイナーゼK(宝酒造社製)及び50μlの10%ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、37℃で1時間保温した。反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿、風乾した後に50μlのTEに溶解してゲノムDNA溶液を得た。
(2)RNaseHII遺伝子のクローニング
アルカエオグロバス フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)は全ゲノム配列が公開されており〔ネイチャー(Nature)、第390巻、第364−370頁(1997)〕、RNaseHIIのホモログをコードする遺伝子(AF0621)が1つ存在することが明らかになっている(配列表の配列番号1、http://www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.html)。
そこで、このAF0621遺伝子(配列表の配列番号1)の配列をもとにプライマーAfuNde(配列表の配列番号2)及びAfuBam(配列表の配列番号3)を合成した。
上記(1)で得たアルカエオグロバス フルギダス ゲノムDNA 30ngを鋳型にして、20pmolのAfuNde及び20pmolのAfuBamをプライマーに用い、100μlの容量でPCRを行なった。PCRでのDNAポリメラーゼはパイロベストDNAポリメラーゼ(宝酒造社製)を添付のプロトコールに従って用い、PCRは94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分を1サイクルとし、40サイクル行った。増幅した約0.6kbのDNA断片をNdeI及びBamHI(ともに宝酒造社製)で消化し、得られたDNA断片をプラスミドベクターpTV119Nd(pTV119NのNcoIサイトをNdeIサイトに変換したもの)のNdeI及びBamHI間に組込んだプラスミドpAFU204を作製した。
(3)RNaseHII遺伝子を含むDNA断片の塩基配列の決定
上記(2)で得られたpAFU204の挿入DNA断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、RNaseHIIをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号4に示す。また、該塩基配列から推定されるRNaseHIIのアミノ酸配列を配列表の配列番号5に示す。
なお、プラスミドpAFU204で形質転換された大腸菌JM109は、Escherichia coli JM109/pAFU204と命名、表示され、平成13年2月22日より日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERMP−18221として寄託され、また前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM BP−7691[国際寄託への移管請求日:平成13年8月2日]として寄託されている。
(4)精製RNaseHII標品の調製
上記(2)で得られたpAFU204で大腸菌JM109を形質転換し、得られたpAFU204を含む大腸菌JM109を100μg/mlのアンピシリンを含む2リットルのLB培地に植菌し、37℃で16時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を37.1mlのソニケーションバッファー〔50mMトリス−HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mMフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を12000rpmで10分間の遠心分離を行い、得られた上清を70℃、15分間の熱処理にかけた。その後、再度12000rpmで10分の遠心分離を行い、上清を集め、40.3mlの熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファーA〔50mMトリス−HCl(pH8.0)、1mM EDTA〕で平衡化したRESOURSE Qカラム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)に供し、FPLCシステム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、RNaseHIIはRESOURSE Qカラムを素通りした。
バッファーAで平衡化したRESOURSE Sカラム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)に供し、FPLCシステム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、RNaseHIIはRESOURSE Sカラムを素通りした。
素通りしたRNaseHII画分40.0mlを50mM NaClを含むバッファーB〔50mMトリス−HCl(pH7.0)、1mM EDTA〕2リットルを外液として、2時間の透析を3回行なった。透析後の酵素液40.2mlを50mM NaClを含むバッファーBで平衡化したHiTrap−heparinカラム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)に供し、FPLCシステムを用いて50〜550mM NaCl直線濃度勾配により溶出した。その結果、約240mM NaClのところに溶出されたRNaseHII画分を得た。
このRNaseHII画分7.8mlをセントリコン−10(アミコン社製)を用いた限外ろ過により濃縮し、約600μlの濃縮液を4回に分けて100mM NaCl、0.1mM EDTAを含む50mMトリス−HCl(pH7.0)で平衡化したSuperose6ゲルろ過カラム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、RNaseHIIは、30.0キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、RNaseHIIが1量体として存在する場合に相当する。
こうして溶出されたRNaseHIIをAfuRNaseHII標品とした。 上記で得られたAfu RNaseHII標品を用いて、以下の方法により酵素活性を測定した。
Afu RNaseHII標品1μlに40℃であらかじめインキュベーションした反応液〔20mM ヘペス−水酸化カリウム(pH7.8)、0.01%牛血清アルブミン(宝酒造社製)、1%ジメチルスルホキシド、4mM 酢酸マグネシウム、20μg/mlポリ(dT)(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)、30μg/mlポリ(rA)(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)〕100μlを添加し、40℃で10分間反応さた後、10μl0.5M EDTA(pH8.0)で反応を停止し、260nmの吸収を測定した。その結果、Afu RNaseHII標品にRNaseH活性が認められた。
耐熱性RNaseHのユニット数は、次の方法により算出した。
ポリ(rA)及びポリ(dT)(ともにアマシャム ファルマシア バイオテク製)1mgをそれぞれ1mM EDTAを含む40mM トリス−HCl(pH7.7)1mlに溶解し、ポリ(rA)溶液及びポリ(dT)溶液を調製した。
次に、4mM MgCl2、1mM DTT、0.003%BSA、4%グリセロールを含む40mM トリス−HCl(pH7.7)に、終濃度20μg/mlとなるポリ(rA)溶液、終濃度30μg/mlとなるポリ(dT)溶液を加え、37℃で10分間反応後、4℃に冷却し、ポリ(rA)−ポリ(dT)溶液を調製した。このポリ(rA)−ポリ(dT)溶液100μlに任意に希釈した酵素液1μlを加え、40℃で10分間反応させ、0.5M EDTA 10μlを加えて反応を停止させた後、260nmの吸光度を測定した。対照として、上記反応液に0.5M EDTA 10μlを加えた後、40℃で10分間反応させ、吸光度を測定した。その後、EDTA非存在下で反応させ求めた吸光度から対照の吸光度を引いた値(吸光度差)を求めた。すなわち、酵素反応によってポリ(rA)−ポリ(dT)ハイブリッドから遊離したヌクレオチドの濃度を吸光度差から求めた。RNaseHの1単位は、1nmolのリボヌクレオチドが遊離したのに相当するA260を10分間に増加させる酵素量とし、下記の式に従って算出した。
単位(unit)=〔吸光度差×反応液量(ml)〕/0.0152×(110/100)×希釈率
実施例1
(1)プライマー及びブロックオリゴヌクレオチドの設計
キメラオリゴヌクレオチドプライマーと鋳型となる核酸の該プライマーのアニーリングする位置の3’側の任意の位置にアニーリング可能な上流ブロックオリゴヌクレオチドの組み合わせについて検討した。まず、ジーンバンク登録番号X06707記載のクラミジア トラコーマ (Chlamydia trachomatis)プラスミドの塩基配列に従って、配列表の配列番号6及び7に記載の塩基配列を有するクラミジア トラコマチス由来プラスミドDNA検出用キメラプライマー、CT−BF19−3及びCT−BR23−2をDNA合成機で合成した。さらに、クラミジア トラコマチス由来プラスミドDNA遺伝子の塩基配列を有し、鋳型となる核酸の上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングする位置の3’側の任意の位置にアニーリングできる配列表の配列番号8及び9記載の上流ブロックオリゴヌクレオチド、CR−FBKおよびCR−RBKをそれぞれ合成した。該上流ブロックオリゴヌクレオチドは、3’末端をアミノ化することによりDNAポリメラーゼによる伸長反応が進まないようにブロッキングされている。なお、上流ブロックオリゴヌクレオチドCR−FBKはセンス方向のオリゴヌクレオチドであり、CR−RBKはアンチセンス方向のオリゴヌクレオチドである。
(2)クラミジアポジティブコントロールの調製
配列表の配列番号10に示すクラミジア遺伝子の一部である560bpをPCR増幅後精製し、該増幅断片をpT7 Blue TベクターにDNA Ligation Kit Ver.2(宝酒造社製)を用いて挿入し、E.coli JM109を形質転換し、クラミジアポジティブコントロールプラスミドを調製した。
(3)ICAN反応
上記(2)で調製した102〜106個のポジティブコントロールDNA 1μlあるいは陰性対照の水1μlと、これに各50pmolのキメラオリゴヌクレオチドプライマーおよび各100pmolの上記(1)で合成した上流ブロックオリゴヌクレオチド、各0.5mM dNTP混合液、32mM Hepes−KOH緩衝溶液(pH7.8)、100mM 酢酸カリウム、4.0mM 酢酸マグネシウム、0.01%ウシ血清アルブミン、1.0%ジメチルスルホキシド、4.375UのAfu由来RNaseH、2.64UのBcaBEST DNAポリメラーゼ(宝酒造社製)を含む全液量25μlの反応液をサーマルサイクラーで60℃、1時間保温した。なお、対照として上流ブロックオリゴヌクレオチドを添加しない区分を設定した。反応終了後、該反応液5μlを3.0%アガロースゲル電気泳動により分析した。その結果を図1に示す。図1Aは、上流ブロックオリゴヌクレオチド無添加の反応系であり、レーン1は100bp DNAラダーマーカー、レーン2は陰性対照(水)、レーン3は鋳型102個、レーン4は鋳型103個、レーン5は鋳型104個、レーン6は鋳型105個、レーン7は鋳型106個の場合を示す。また、図1Bは、上流ブロックオリゴヌクレオチドを添加した反応系であり、レーン1は100bp DNAラダーマーカー、レーン2は陰性対照(水)、レーン3は鋳型102個、レーン4は鋳型103個、レーン5は鋳型104個、レーン6は鋳型105個、レーン7は鋳型106個の場合を示す。
図1に示したように上流ブロックオリゴヌクレオチド無添加の区分においては105個の鋳型量まで増幅が認められた。一方、上流ブロックプライマーを添加した区分において103個の鋳型量まで増幅が認められ、添加しない区分と比較して2桁の感度上昇が認められた。以上のことから、キメラオリゴヌクレオチドプライマーと鋳型となる核酸のキメラオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングする位置の3’側の任意の位置にアニーリング可能な上流ブロックオリゴヌクレオチドを組み合わせることにより検出感度が向上することが確認できた。
産業上の利用の可能性
本発明により、キメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流ブロックオリゴヌクレオチドを使用するDNA合成反応により標的核酸の塩基配列中の特異的増幅に適した領域を増幅することを特徴とする標的核酸の増幅方法が提供される。また、該標的核酸の増幅方法で得られた標的核酸の増幅断片を検出する工程を包含することを特徴とする標的核酸の検出方法が提供される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1:本発明の方法により増幅された増幅DNA断片のアガロース電気泳動写真の結果を示す図である。
Claims (6)
- 核酸を増幅する方法において、
(a)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも1種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも1種類の上流ブロックオリゴヌクレオチド、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで該キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの3’末端又は3’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり、該上流ブロックオリゴヌクレオチドは、鋳型となる核酸の当該キメラオリゴヌクレオチドプライマーと実質的に相補的な領域の3’側の塩基配列に実質的に相補的であり、かつその3’末端塩基がDNAポリメラーゼによる相補鎖伸長反応が起こらないように修飾されており;および、
(b)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートする工程、
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法。 - さらに鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相同な配列を有する第2のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有する反応混合物を使用することを特徴とする請求項1記載の核酸の増幅方法。
- さらに鋳型となる核酸の、第2のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列に実質的に相同な配列を有する領域の5’側の塩基配列と実質的に相同的な配列を有し、かつその3’末端の塩基がDNAポリメラーゼによる相補鎖伸長反応が起こらないように修飾されている上流ブロックオリゴヌクレオチドを含有する反応混合物を使用することを特徴とする請求項2記載の核酸の増幅方法。
- 請求項1記載の核酸の増幅方法のための組成物であって、それぞれ少なくとも1種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流ブロックオリゴヌクレオチドを含有する組成物。
- 請求項1記載の核酸の増幅方法のためのキットであって、それぞれ少なくとも1種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流ブロックオリゴヌクレオチドを含有するキット。
- 下記工程を包含することを特徴とする標的核酸の検出方法;
(a)請求項1記載の核酸の増幅方法により、標的核酸を増幅する工程;および、
(b)上記工程により増幅された標的核酸を検出する工程;
を包含する。
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