KR100735131B1 - 핵산 증폭 방법 - Google Patents

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    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA

Abstract

3'-말단 또는 3'-말단측에 제공되는 리보뉴클레오티드를 갖는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머, 엔도뉴클레아제 및 쇄 이동 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 샘플중 표적 핵산을 고감도 및 특이적으로 증폭시키는 방법, 즉 핵산의 등온 및 키메라성 프라이머-개시 증폭법(ICAN); 상기 방법을 사용하여 수득된 증폭 단편을 검출하는 방법; 상기 증폭 방법을 사용하여 표적 핵산을 제조하는 과정; 및 본 방법에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.

Description

핵산 증폭 방법{Method of amplifying nucleic acid}
본 발명은 임상의학 분야에서 유용한 핵산을 검출하는 방법 및 유전공학 분야에서 유용한 DNA를 합성하는 방법에 관한 것이다. 주형으로서 핵산을 증폭시키는 방법 및 언급된 방법에 의해 증폭된 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다.
DNA 합성은 유전 공학분야의 연구에서 다양한 목적으로 사용된다. 올리고뉴클레오티드와 같은 단쇄 DNA의 합성을 제외한 대부분의 DNA 합성은 DNA 폴리머라제를 사용하는 효소적 방법에 의해 수행된다. 상기 방법의 예는 미국 특허 제 4,683,195 호, 제 4,683,202호, 및 4,800,159호에 상세히 기재된 중합효소 연쇄반응(PCR)이다. 또다른 예는 (Trends in Biotechnology, 10:146-152(1992))에 기재된, PCR 방법 및 역전사 효소 반응의 배합인 역전사-PCR 방법이다. 상기-언급된 방법의 개발에 의해 DNA 또는 RNA로부터 관심의 대상이 되는 영역을 증폭시킬 수 있었다.
상기 언급된 DNA 합성 방법은 예를 들면, 3단계로 구성된 반응에 의해 수행된다. 3단계는 더블-스트랜드 DNA를 싱글-스트랜드로 해리(변성)시키는 단계, 싱글-스트랜드에 프라이머를 어닐링하는 단계 및 프라이머로부터 상보적 스트랜드(complementary strand)를 합성(신장)시켜 관심의 대상이 되는 영역을 증 폭시키는 단계이다. 또한, "셔틀 PCR(shuttle PCR)"로 명시되는, 3단계중 2단계, 즉 동일한 온도에서 프라이머를 어닐링하는 단계 및 신장 단계를 수행하는 반응을 사용하여 그것을 수행한다("PCR hosaizensen"(Recent advances in PCR methology: Basic methodology and it's application), Tanpakushitsu Kakusan Kouso, Bessatsu, (Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Supplement), 41(5):425-428(1996)).
또한, 1989년 6월 14일에 공개된 유럽 특허 제 320,308 호에 기재된 리가아제 연쇄반응(ligase chain reation(LCR)) 방법 또는 문헌(PCR Protocols, Academic Press Inc., 1990, pp.245-252)에 기재된 전사-기초 증폭 시스템(transcription-based amplication system(TAS))을 사용할 수 있다. 상기 언급된 4개의 방법은 다음 증폭 사이클을 위한 싱글-스트랜드 표적 분자를 재생시키기 위해 고온 및 저온에서 반응을 여러 차례 반복시키는 것을 필요로 한다. 상기 기재된 바와 같이 반응은 온도에 의해 제한되기 때문에 반응 시스템은 불연속 상 또는 사이클을 사용하여 수행되어야 한다.
따라서, 상기 방법들은 시간동안 광범위한 범위의 온도를 엄격히 조정할 수 있는 고가의 열 싸이클러(thermal cycler)의 사용을 필요로 한다. 또한, 반응은 두개 또는 3개의 예정된 것으로 온도를 조정하기 위한 시간을 필요로 한다. 사이클 수에 비례하여 낭비되는 시간은 증가한다.
상기 문제점을 해결하기 위해 등온에서 수행될 수 있는 핵산 증폭 방법이 개발되었다. 그의 예는 JP-B 7-114718호에 기재된 스트랜드 치환 증폭(SDA) 방법, 자 립복제(self-sustained sequence replicaiotn(3SR)) 방법, 일본 특허 제 2650159 호에 기재된 핵산서열 기초 증폭(NASBA) 방법, 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification(TMA)) 방법, 일본 특허 제 2710159호에 기재된 Qβ레플리카아제(replicase) 방법 및 미국 특허 제 5,824,517 호, WO 99/09211, WO 95/25180 및 WO 99/49081에 기재된 다양한 개량 SDA 방법을 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 등온 효소적 합성 방법은 미국 특허 제 5,916,777호에 기재되어 있다. 등온 핵산 증폭 또는 올리고뉴클레오티드의 합성 방법의 반응에서 프라이머로부터의 신장 및/또는 프라이머로부터의 신장전에 수행되는 프라이머의 싱글-스트랜드 신장 산물(원 표적 서열)에의 어닐링은 등온에서 인큐베이션된 반응 혼합물중에서 동시에 수행된다.
등온 핵산 증폭 방법중에서, SDA 방법이 DNA를 최종적으로 증폭시키는 시스템의 한 예이다. SDA 방법은 DNA 폴리머라제 및 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 더블 스트랜드를 치환하여 샘플중에서 핵산 서열(및 그의 상보적 스트랜드)를 증폭시키는 방법이다. 상기 방법은 증폭용 4개의 프라이머를 필요로 하고, 이중 2개는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위를 포함하도록 작제되어야 한다. 이 방법은 DNA를 대량으로 합성하기 위해 기질로서 변형된 데옥시리보클레오티드 트리포스페이트의 사용을 필요로 한다. 변형된 데옥시리보클레오티드 트리포스페이트의 예는 α-위치의 인산 그룹의 산소 원자가 황 원자(S)로 치환된 (α-S) 데옥시리보클레오티드 트리포스페이트이다. 예를 들면, 유전자 시험을 위해 상기 반응을 항상(routinely) 수행하는 경우, 변형된 데옥시리보클레오티드 트리포스페이트의 사용과 관련된 러닝코스트(running cost) 문제는 심각하다. 또한, 예를 들면, 제한 효소 단편 장다형(restriction enzyme fragment length polymorphism(RELP)) 분석시, 본 발명에서 (α-S) 데옥시리보클레오티드와 같은 변형된 뉴클레오티드를 증폭된 DNA 단편에 삽입시킴으로써 제한 효소를 사용하여 증폭된 DNA 단편을 절단하는 것을 생략할 수 있다.
미국 특허 제 5,824,517 호에 기재된 바와 같은 개량 SDA 방법은 RNA 및 DNA로 구성되고 필수 요소로서 DNA가 적어도 3'-말단에 위치한 구조를 갖는 키메라성 프라이머를 사용하는 DNA 증폭 방법이다. WO 99/09211에 기재된 바와 같은 개량 SDA 방법은 5'-팽창형의(Protruding) 단(end)을 제조하는 제한 효소의 사용을 필요로 한다. WO 95/25180에 기재된 개량된 SDA 방법은 적어도 두쌍의 프라이머의 사용을 필요로 한다. WO 99/49081에 기재된 개량된 SDA 방법은 적어도 2쌍의 프라이머 및 적어도 하나의 변형된 데옥시리보클레오티드 트리포스페이트의 사용을 필요로 한다. 한편, 미국 특허 제 5,916,777호에 기재된 올리고뉴클레오티드 합성 방법은 3'-말단에 리보뉴클레오티드를 갖는 프라이머를 사용하여 DNA를 합성하고, 프라이머를 사용하여 반응을 종결시키고, 프라이머-신장된 스트랜드중의 프라이머 및 신장된 스트랜드 사이에 엔도뉴클레아제로 닉(nick)를 삽입하여 그들을 분리하고, 주형을 분해하고 그것을 재사용하기 위해 프라이머를 회수하는 것을 포함한다. 본 발명에서 반응 시스템으로부터 프라이머를 분리한 후 그것을 주형에 다시 어닐링하여 프라이머를 재사용하는 것이 필요하다. 또한, WO 00/28028에 기재되어 있는 루프-매개 등온 증폭법(Loop-mediated Isothermal Amplificatin(LAMP))는 증폭을 위해 4 개의 프라이머를 필요로 하고 상기 방법을 사용하여 증폭된 산물은 증폭을 위한 표적 부위가 반복된 다양한 크기를 갖는 DNA 이다.
상기 기재된 바와 같이, 통상의 등온 핵산 증폭 방법은 여전히 다양한 문제를 갖고 있다. 따라서, 적은 운영비로 핵산을 증폭시키는 방법에 의해 추가로 유전공학적으로 DNA 단편을 수득하는 것이 요구되고 있다.
발명의 목적
본 발명의 목적은 키메라 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 DNA 합성법에 의해 고감도로 샘플중 핵산을 특별하게 증폭시키는 핵산을 증폭시키는 방법, 상기 방법에 의해 수득한 증폭된 단편을 검출하는 방법, 상기 증폭법 및 이 방법을 위해 사용된 키메라 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 핵산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
발명의 요약
집중적으로 연구한 결과, 본 발명자는 유전자 증폭 반응용의 우수한 시스템을 구축하였다. 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 리보뉴클레오티드를 갖는 키메라 올리고뉴클레오티드 프라이머, 엔도뉴클레아제 및 DNA 폴리머라제의 존재에 관심의 대상이 되는 DNA 부위를 증폭시는 방법을 개발하여 구축하였다. 따라서, 본 발명은 완성되었다. 본 방법은 키메라 올리고뉴클레오티드 프라이머가 사용되는 핵산을 증폭시키는 방법이고 본 명세서에서 ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiate Amplification of Nucleic acids) 법으로 언급된다.
본 발명의 제 1면은
(a) 주형으로서 핵산, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 적어도 하나의 프라이머 및 RNase H를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고(여기에서 프라이머는 주형으로서 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 적어도 하나 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이다);
(b) 충분한 시간동안 반응 혼합물을 인큐베이션시켜 반응 산물을 생성시키는 것을 포함하는 핵산을 증폭시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 2 면은
(a) 주형으로서 핵산을 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 적어도 하나의 프라이머 및 DNA 폴리머라제로 처리하여 주형에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고 더블-스트랜드 핵산을 합성하고(여기에서 프라이머는 주형으로서 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 적어도 하나 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이다);
(b) RNase H의 존재하에 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 전 단계에서 수득된 주형으로서 더블-스트랜드 핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 신장시키고;
(c) 주형으로서 단계 (b)에서 수득한 더블-스트랜드 핵산을 단계(b)에서 다 시 사용하는 것을 포함하는 핵산을 증폭시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 3 면은
(a) 주형으로서 핵산을 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 적어도 하나의 프라이머 및 DNA 폴리머라제로 처리하여 주형에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고(여기에서 프라이머는 주형으로서 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 적어도 하나 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이다);
(b) RNase H의 존재하에 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 전 단계에서 수득된 주형으로서 더블-스트랜드 핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 신장시켜 스트랜드 치환시키고 치환된 스트랜드 및 더블-스트랜드 핵산을 합성하고;
(c) 단계 (b)에서 수득한 더블-스트랜드 핵산을 단계(b)에서 다시 사용하고;
(d) 주형으로서 단계 (b)에서 수득한 치환된 스트랜드를 단계 (b)에서 사용된 것과 상이한 적어도 하나의 프라이머 및 DNA 폴리머라제로 처리하여 치환된 스트랜드에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고(여기에서 프라이머는 치환된 스트랜드의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 적어도 하나 포함하는 단계 (a)에서 사용된 것과 상이한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이다);
(e) RNase H의 존재하에 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 전 단계에서 수득된 주형으로서 더블-스트랜드 핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 신장시켜 스트랜드 치환시키고 치환된 스트랜드 및 더블-스트랜드 핵산을 합성하고;
(f) 주형으로서 단계 (e)에서 수득한 더블-스트랜드 핵산을 단계 (e)에서 다시 사용하는 것을 포함하는 핵산을 증폭시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 1 및 제 2 면에서, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 DNA 폴리머라제로 사용할 수 있다.
본 발명의 제 4 면은
(a) 주형으로서 더블-스트랜드 핵산을 더블-스트랜드 핵산의 각 스트랜드의 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 상보적인 두개의 프라이머 및 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제로 처리하여 주형에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고(여기에서 각 프라이머는 주형으로서 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 적어도 하나 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이다);
(b) 단계 (a)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산을 리보뉴클레오티드를 포함하는 위치에서 엔도뉴클레아제로 절단하고;
(c) 단계 (b)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 각 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리 머라제를 사용하여 주형에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 신장시켜 스트랜드 치환시키고 주형 및 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산을 수득하는 것을 포함하는 것을 핵산 증폭 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 5면은
(a) 주형으로서 더블-스트랜드 핵산을 더블-스트랜드 핵산의 각 스트랜드의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 두개의 프라이머 및 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제로 처리하여 주형에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고 서로 어닐링하는 합성된 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산을 수득하고, 여기에서 각 프라이머는 리보뉴클레오티드, 및 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 리보뉴클레오티드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
(b) 단계 (a)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산의 리보뉴클레오티드를 포함하는 사이트를 엔도뉴클레아제로 절단하고;
(c) 단계 (b)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 각 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 주형에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 신장시켜 스트랜드 치환시키고 서로 어닐링된 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산을 수득하는 것을 포함하는 것을 핵산 증폭 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 6면은
(a) 주형으로서 더블-스트랜드 핵산을 더블-스트랜드 핵산의 각 스트랜드의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 두개의 프라이머 및 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제로 처리하여 주형에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고 서로 어닐링하는 합성된 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산을 수득하고, 여기에서 각 프라이머는 리보뉴클레오티드, 및 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 리보뉴클레오티드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
(b) 단계 (a)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산의 리보뉴클레오티드를 포함하는 사이트를 엔도뉴클레아제로 절단하고;
(c) 단계 (b)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 각 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 주형에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 신장시켜 스트랜드 치환시키고 주형 및 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산 및 단계 (a)의 두개의 프라이머가 어닐링된 서로 어닐링된 주형으로 구성된 더블-스트랜드 핵산을 수득하고;
(d) 단계 (c)에서 수득한 두개의 프라이머가 어닐링된 더블-스트랜드 핵산의 각 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 주형에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 신장시켜 스트랜드 치환시키고 서로 어닐링된 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산 및 단계 (a) 의 두개의 프라이머가 어닐링된 서로 어닐링된 주형으로 구성된 더블-스트랜드 핵산을 수득하고;
(e) 단계 (d)에서 수득한 두개의 프라이머가 어닐링된 더블-스트랜드 핵산을 단계 (d)에서 다시 사용하는 것을 포함하는 핵산을 증폭시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 7 면은
(a) 주형으로서 더블-스트랜드 핵산을 더블-스트랜드 핵산의 각 스트랜드의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 두개의 프라이머 및 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제로 처리하여 주형에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고 서로 어닐링하는 합성된 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산을 수득하고, 여기에서 각 프라이머는 리보뉴클레오티드, 및 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 리보뉴클레오티드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
(b) 단계 (a)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산의 리보뉴클레오티드를 포함하는 사이트를 엔도뉴클레아제로 절단하고;
(c) 단계 (b)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 각 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 주형에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 신장시켜 스트랜드 치환시키고 서로 어닐링된 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산 및 단계 (a)의 두개의 프라이머가 어닐링된 서로 어닐링된 주형으로 구성된 더블-스트랜드 핵산을 수득하고;
(d) 단계 (c)에서 수득한 두개의 프라이머가 어닐링된 더블-스트랜드 핵산의 각 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 주형에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 신장시켜 스트랜드 치환시키고 주형 및 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산을 수득하고;
(e) 단계 (d)에서 수득한 주형 및 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산의 리보뉴클레오티드를 포함하는 사이트를 엔도뉴클레아제로 절단하고;
(f) 단계 (e)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 각 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 주형에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 신장시켜 치환된 스트랜드를 합성하는 것을 포함하는 핵산을 증폭시키는 방법에 관한 것이다.
제 4면 내지 제 7면에서, RNase H와 같은 엔도리보뉴클레아제가 엔도뉴클레아제로서 사용될 수 있다.
RNase H가 사용되는 제 1면 내지 제 7면에서, 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli)로부터의 RNase H, 써모토가(Thermotoga) 속 박테리움으로부터의 RNase H, 써무스(Thermus) 속 박테리움으로부터의 RNase H, 피로코쿠스 (Pyrococcus) 속 박테리움으로부터의 RNase H, 아키오글루부스 (Archaeoglobus) 속 박테리움으로부터의 RNase H 및 바실러스(Bacillus) 속 박테리움으로부터의 RNase H가 사용될 수 있다.
제 1면 내지 제 7면에서, 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열내 증폭시키고자 하는 부위의 적절한 길이의 예는 200bp 이하이다.
본 발명의 제 1면 내지 제 7면에 대하여 하기 일반식으로 나타낸 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머가 사용될 수 있다:
일반식: 5'-dNa-Nb-dNc-3'
(a: 11이상의 정수; b: 1이상의 정수; c: 0 또는 1이상의 정수; dN: 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체; N: 변형되지 않은 리보뉴클레오티드 및/또는 변형된 리보뉴클레오티드, 여기에서, dNa중 일부의 dNs는 Ns로 대체될 수 있고, 3'-말단의 뉴클레오티드는 DNA 폴리머라제의 작용에 의한 3'-말단으로부터의 신장이 발생하지 않도록 변형될 수 있다).
상기 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 c가 0인 프라이머 및 뉴클레오티드 유사체가 데옥시리보이노신 뉴클레오티드 또는 데옥시리보우라실 뉴클레오티드이고 변형된 리보뉴클레오티드가 (α-S) 리보뉴클레오티드인 프라이머가 예시된다. 또한, 상기 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머가 사용되는 경우 프라이머에 적절한 DNA 신장 반응 온도에서 DNA 신장 반응을 수행한다.
제 1면 내지 제 7면의 증폭 반응은 핵산이 프라이머에 어닐링하는 것을 촉진시키는 물질을 포함하는 어닐링 용액중에서 주형으로서 핵산을 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 어닐링시키는 것을 포함할 수 있다. 예로서, 어닐링 용액은 스퍼미딘 및/또는 프로필렌디아 민를 포함할 수 있다. 주형으로서 핵산 및 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 어닐링 용액을 90℃ 이상에서 인큐베이션시킨 후 증폭 반응을 수행하는 온도 이하로 용액을 냉각시켜 어닐링을 수행할 수 있다.
제 1면 내지 제 7면의 증폭 반응은 Bicine 및 HEPES로 구성된 그룹으로부터 선택되는 완충 성분을 포함하는 완충액중에서 수행할 수 있다.
제 1면 내지 제 7면에서, 예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 DNA 폴리머라제 I의 클레나우(Klenow) 단편, 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bst DNA 폴리머라제 및 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bca DNA 폴리머라제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 DNA 폴리머라제가 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제로서 사용될 수 있다.
제 1면 내지 제 7면의 구체예로서, 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bca DNA 폴리머라제가 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제로서 사용되고 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 RNase H, 피로코쿠스(Pyrococcus) 속 박테리움으로부터의 RNase H 또는 아키오글루부스(Archaeoglobus) 속 박테리움으로부터의 RNase H가 엔도뉴클레아제로서 사용된다. RNase H가 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 RNase H I형, 또는 피로코쿠스(Pyrococcus) 또는 아키오글루부스(Archaeoglobus) 속 박테리움으로부터의 RNase H II형으로 예시 된다.
제 1면 내지 제 7면에서 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제가 사용될 수 있다. 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bca DNA 폴리머라제가 DNA 폴리머라제로서 사용될 수 있고 Bca DNA 폴리머라제가 Bca DNA 폴리머라제의 엔도뉴클레아제 활성이 발현될 수 있도록 하는 물질의 존재하에 증폭 반응을 수행할 수 있다. Bca DNA 폴리머라제의 엔도뉴클레아제 활성이 발현될 수 있도록 하는 물질은 망간 이온으로 예시된다.
제 1면 내지 제 7면의 표적 핵산 증폭 방법은 DNA 폴리머라제의 역전사 활성을 저해하는 물질의 존재하에 수행할 수 있다. DNA 폴리머라제의 역전사 활성을 저해하는 물질이 포스포노포름산에 의해 예시된다.
본 발명의 제 1면 내지 제 7면은 주형으로서 싱글-스트랜드 DNA 또는 더블-스트랜드 DNA를 사용하여 수행할 수 있다. 주형 핵산이 더블 스트랜드인 경우, 증폭 반응은 이를 싱글-스트랜드 DNAs로 전환시킨 후 수행할 수 있다.
주형으로서 핵산은 주형으로서 RNA를 사용하여 역전사 반응에 의해 수득된 cDNA일 수 있다. 일면으로, 증폭 반응을 주형으로서 RNA를 사용하여 역전사 반응에 의해 cDNA를 합성한 후 수행할 수 있다. 역전사 효소 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 역전사 효소로 사용할 수 있다. 예로서 역전사 반응 및 주형에 상보적인 신장된 스트랜드 합성을 역전사 효소 활성 및 스트랜드 치환 활성 둘 모두를 갖는 하나의 DNA 폴리머라제를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 DNA 폴리머라제가 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결 핍된 Bst DNA 폴리머라제 또는 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bca DNA 폴리머라제에 의해 예시된다.
제 1면 내지 제 7면에 있어서, 핵산 증폭 반응은 등온 조건하에 수행될 수 있다. 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 유사체, 예로서, 데옥시우리딘 트리포스페이트 또는 그의 유도체의 존재하에 수행할 수 있다.
본 발명의 제 8면은
(a) 주형으로서 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 적어도 하나의 프라이머, 여기에서, 프라이머는 리보뉴클레오티드, 및 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 리보뉴클레오티드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
(b) 엔도뉴클레아제; 및
(c) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 포함하는 핵산을 증폭시키기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제 9면은
(a) 주형으로서 더블-스트랜드 핵산의 각 스트랜드의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 적어도 두개의 프라이머, 여기에서, 각 프라이머는 리보뉴클레오티드, 및 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 리보뉴클레오티드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
(b) 엔도뉴클레아제; 및
(c) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 포함하는 핵산을 증폭시키기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제 10면은 주형으로서 핵산, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 적어도 하나의 프라이머(여기에서, 프라이머는 주형으로서 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 리보뉴클레오티드, 및 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 리보뉴클레오티드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치한다) 및 엔도뉴클레아제를 혼합하여 수득된 핵산을 증폭시키기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제 11면은 주형으로서 핵산, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 적어도 두개의 프라이머(여기에서, 각 프라이머는 주형으로서 더블-스트랜드 핵산의 각 스트랜드의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 리보뉴클레오티드, 및 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 리보뉴클레오티드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치한다) 및 엔도뉴클레아제를 혼합하여 수득된 핵산을 증폭시키기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제 8면 내지 제 11면의 조성물에 포함되는 프라이머는 하기 일반식으로 나타낸 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머로 예시된다:
일반식: 5'-dNa-Nb-dNc-3'
(a: 11이상의 정수; b: 1이상의 정수; c: 0 또는 1이상의 정수; dN: 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체; N: 변형되지 않은 리보뉴클레오티드 및/또는 변형된 리보뉴클레오티드, 여기에서, dNa중 일부의 dNs는 Ns로 대체될 수 있고, 3'-말단의 뉴클레오티드는 DNA 폴리머라제의 작용에 의한 3'-말단으로부터의 신장이 발생하지 않도록 변형될 수 있다).
상기 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 c가 0인 프라이머 및 뉴클레오티드 유사체가 데옥시리보이노신 뉴클레오티드 또는 데옥시리보우라실 뉴클레오티드이고 변형된 리보뉴클레오티드가 (α-S) 리보뉴클레오티드인 프라이머로 예시된다.
제 8면 내지 제 11면의 조성물은 핵산 증폭 반응에 적절한 완충 성분을 포함할 수 있다. 예로서, Bicine 및 HEPES로 구성된 그룹으로부터 선택되는 완충 성분을 포함할 수 있다.
제 8면 내지 제 11면은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 DNA 폴리머라제 I의 클레나우(Klenow) 단편, 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bst DNA 폴리머라제 및 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bca DNA 폴리머라제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 DNA 폴리머라제를 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제로서 포함하는 조성물에 의해 예시된다.
일면에서, 제 8면 내지 제 11면의 조성물은 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제로서 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bca DNA 폴리머라제 및 엔도뉴클레아제로서 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 RNase H, 피로코쿠스(Pyrococcus) 속 박테리움으로부터의 RNase H, 또는 아키오글루부스(Archaeoglobus) 속 박테리움를 포함한다.
제 8면 내지 제 11면의 조성물은 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 포함할 수 있다. DNA 폴리머라제로서 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bca DNA 폴리머라제가 사용될 수 있고 Bca DNA 폴리머라제가 Bca DNA 폴리머라제의 엔도뉴클레아제 활성이 발현될 수 있도록 하는 물질의 존재하에서 사용될 수 있다. Bca DNA 폴리머라제의 엔도뉴클레아제 활성이 발현될 수 있도록 하는 물질은 망간 이온으로 예시된다.
제 8면 내지 제 11면의 조성물은 DNA 폴리머라제의 역전사 활성을 저해하는 물질을 포함하는 물질을 포함할 수 있다. DNA 폴리머라제의 역전사 활성을 저해하는 물질을 포함하는 물질은 포스포노포름산으로 예시된다. 또한, 조성물은 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 유사체, 예로서 데옥시우리딘 트리포스페이트 또는 그의 유도체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제 12면은
(a) RNase H; 및
(b) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 포함하는 제 1면 내지 제 3면의 핵산을 증폭시키는 방법을 위해 사용되는 핵산을 증폭시키기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제 13면은
(a) 엔도뉴클레아제; 및
(b) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 포함하는 제 4면 내지 제 7면의 핵산을 증폭시키는 방법을 위해 사용되는 핵산을 증폭시키기 위한 조성물.
RNase H와 같은 엔도리보뉴클레아제가 제 13면의 조성물을 위해 엔도뉴클레아제로서 사용될 수 있다.
RNase H를 포함하는 제 12면 또는 제 13면의 조성물을 위한 RNase H로서 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 RNase H, 써모토가(Thermotoga) 속 박테리움으로부터의 RNase H, 써무스(Thermus) 속 박테리움으로부터의 RNase H, 피로코쿠스(Pyrococcus) 속 박테리움으로부터의 RNase H, 아키오글루부스(Archaeoglobus) 속 박테리움으로부터의 RNase H 및 바실러스(Bacillus) 속 박테리움으로부터의 RNase H로 구성된 그룹으로부터 선택되는 RNase H를 포함할 수 있다.
제 12면 또는 제 13면의 조성물은 추가로 핵산 증폭 반응에 적절한 완충 성분을 포함할 수 있다. 예로서 Bicine 및 HEPES로 구성된 그룹으로부터 선택되는 완충 성분을 포함할 수 있다.
제 12면 또는 제 13면은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 DNA 폴리머라제 I의 클레나우(Klenow) 단편, 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bst DNA 폴리머라제 및 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bca DNA 폴리머라제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 DNA 폴리머라제를 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제로서 포함하는 조성물에 의해 예시된다. RNase H와 같은 엔도리보뉴클레아제를 엔도뉴클레아제로서 사용할 수 있다. RNase H가 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 RNase H, 써모토가(Thermotoga) 속 박테리움으로부터의 RNase H, 써무스(Thermus) 속 박테리움으로부터의 RNase H, 피로코쿠스(Pyrococcus) 속 박테리움으로부터의 RNase H, 아키오글루부스(Archaeoglobus) 속 박테리움으로부터의 RNase H에 의해 예시된다.
일면에서, 제 12면 또는 제 13면의 조성물은 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제로서 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bca DNA 폴리머라제 및 엔도뉴클레아제로서 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 RNase H, 피로코쿠스(Pyrococcus) 속 박테리움으로부터의 RNase H, 또는 아키오글루부스(Archaeoglobus) 속 박테리움으로부터의 RNase H를 포함할 수 있다. RNase H가 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 RNase H I형, 또는 피로코쿠스(Pyrococcus) 또는 아키오글루부스(Archaeoglobus) 속 박테리움으로부터의 RNase H II형으로 예시된다.
제 12면 또는 제 13면의 조성물은 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 포함할 수 있다. DNA 폴리머라제로서 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bca DNA 폴리머라제가 사용될 수 있고 이는 Bca DNA 폴리머라제가 Bca DNA 폴리머라제의 엔도뉴클레아제 활성이 발현될 수 있도록 하는 물질의 존재하에 사용될 수 있다. Bca DNA 폴리머라제의 엔도뉴클레아제 활성이 발현될 수 있도록 하는 물질은 망간 이온에 의해 예시된다.
제 12면 또는 제 13면의 조성물은 DNA 폴리머라제의 역전사 활성을 저해하는 물질을 포함하는 물질을 포함할 수 있다. DNA 폴리머라제의 역전사 활성을 저해하는 물질을 포함하는 물질은 포스포노포름산에 의해 예시된다. 또한, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 유사체, 예로서 데옥시우리딘 트리포스페이트 또는 그의 유도체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제 14면은
(a) RNase H; 및
(b) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 포함하고, 제 1면 내지 제 3면의 핵산을 증폭시키기 위한 방법에서 사용되는 핵산을 증폭시키기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명의 제 15면은
(a) 엔도뉴클레아제; 및
(b) 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 포함하고, 제 4면 내지 제 7면의 핵산을 증폭시키기 위한 방법에서 사용되는 핵산을 증폭시키기 위한 키트에 관한 것이다.
RNase H와 같은 엔도리보뉴클레아제를 제 15면의 키트를 위항 엔도뉴클레아 제로서 사용할 수 있다.
RNase H를 포함하는 제 14면 또는 제 15면의 키트는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 RNase H, 써모토가(Thermotoga) 속 박테리움으로부터의 RNase H, 써무스(Thermus) 속 박테리움으로부터의 RNase H, 피로코쿠스(Pyrococcus) 속 박테리움으로부터의 RNase H, 아키오글루부스(Archaeoglobus) 속 박테리움으로부터의 RNase H 및 바실러스(Bacillus) 속 박테리움으로부터의 RNase H로 구성된 그룹으로부터 선택되는 RNase H를 포함하는 키트에 의해 예시된다.
제 14면 또는 제 15면의 키트는 핵산 증폭 반응에 적절한 완충 성분을 포함할 수 있다. 예로서, 조성물은 Bicine 및 HEPES로 구성된 그룹으로부터 선택되는 완충 성분을 포함할 수 있다. 키트는 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 프라이머에 주형으로서의 핵산이 어닐링하는 것을 촉진시키는 물질을 포함하는 어닐링 용액을 포함할 수 있다. 예로서, 어닐링 용액은 스퍼미딘 및/또는 프로필렌디아민를 포함할 수 있다.
본 발명의 제 14면 또는 제 15면의 키트에 포함되는 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 DNA 폴리머라제 I의 클레나우(Klenow) 단편, 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bst DNA 폴리머라제 및 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bca DNA 폴리머라제로 예시된다.
일면에서, 제 14면 또는 제 15면의 키트는 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bca DNA 폴리머라제 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 피로코쿠스(Pyrococcus) 속 박테리움 또는 아키오글루부스(Archaeoglobus) 속 박테리움으로부터의 RNase H를 포함한다. RNase H가 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 RNase H I형, 또는 피로코쿠스(Pyrococcus) 또는 아키오글루부스(Archaeoglobus) 속 박테리움으로부터의 RNase H II형으로 예시된다.
제 14면 또는 제 15면의 키트는 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 포함할 수 있다. DNA 폴리머라제로서 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bca DNA 폴리머라제가 사용될 수 있고 이는 Bca DNA 폴리머라제가 Bca DNA 폴리머라제의 엔도뉴클레아제 활성이 발현될 수 있도록 하는 물질의 존재하에 사용될 수 있다. Bca DNA 폴리머라제의 엔도뉴클레아제 활성이 발현될 수 있도록 하는 물질은 망간 이온에 의해 예시된다.
제 14면 또는 제 15면의 키트는 DNA 폴리머라제의 역전사 활성을 저해하는 물질을 포함하는 물질을 포함할 수 있다. DNA 폴리머라제의 역전사 활성을 저해하는 물질을 포함하는 물질은 포스포노포름산에 의해 예시된다. 또한, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 유사체, 예로서 데옥시우리딘 트리포스페이트 또는 그의 유도체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제 16면은 패키지 형태(packaged form)이고 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 및 RNase H의 사용을 지시하는 안내서를 포함하는, 제 1면 내 지 제 3면의 핵산 증폭 방법을 위해 사용되는 핵산 증폭용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 제 17면은 패키지 형태이고 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 및 엔도뉴클레아제의 사용을 지시하는 안내서를 포함하는, 제 4면 내지 제 7면의 핵산 증폭 방법을 위해 사용되는 핵산 증폭용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 18면은 포장재 및 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 및/또는 RNase H를 포함하는 포장재에 동봉된 핵산을 증폭시키기 위한 시약으로 구성되고, 핵산을 증폭시키기 위한 시약을 등온 조건하에서의 핵산 증폭을 위해 사용할 수 있다는 설명이 포장재에 부착된 라벨 또는 포장재에 첨부된 안내서에 표시된 핵산 증폭을 위한 시약 제품에 관한 것이다.
본 발명의 제 19면은 포장재 및 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 및/또는 엔도뉴클레아제를 포함하는 포장재에 동봉된 핵산을 증폭시키기 위한 시약으로 구성되고, 핵산을 증폭시키기 위한 시약을 등온 조건하에서의 핵산 증폭을 위해 사용할 수 있다는 설명이 포장재에 부착된 라벨 또는 포장재에 첨부된 안내서에 표시된 핵산 증폭을 위한 시약 제품에 관한 것이다.
본 발명의 제 20면은
(a) 본 발명의 제 1면 내지 제 7면의 핵산 증폭 방법에 의해 핵산을 증폭시키고;
(b) 단계 (a)에서 증폭된 표적 핵산을 검출하는 것을 포함하는, 샘플중 표적 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 20면의 검출 방법은 검출용 프로브를 사용하여 증폭된 핵산을 검출하는 것을 포함할 수 있다. 프로브는 검출용 프로브가 표지화 물질로 표지된 프로브일 수 있다. 예로서, 프로브가 소광 상태에 이르게 하는 거리에 위치하는 두개 이상의 형광 물질로 표지된 RNA 프로브가 사용될 수 있다.
본 발명의 제 21면은 제 20면에 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 관한 것이다. 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 하기 일반식으로 나타낸 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머로 예시된다:
일반식: 5'-dNa-Nb-dNc-3'
(a: 11이상의 정수; b: 1이상의 정수; c: 0 또는 1이상의 정수; dN: 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체; N: 변형되지 않은 리보뉴클레오티드 및/또는 변형된 리보뉴클레오티드, 여기에서, dNa중 일부의 dNs는 Ns로 대체될 수 있고, 3'-말단의 뉴클레오티드는 DNA 폴리머라제의 작용에 의한 3'-말단으로부터의 신장이 발생하지 않도록 변형될 수 있다).
상기 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 c가 0인 프라이머 및 뉴클레오티드 유사체가 데옥시리보이노신 뉴클레오티드 또는 데옥시리보우라실 뉴클레오티드이고 변형된 리보뉴클레오티드가 (α-S) 리보뉴클레오티드인 프라이머로 예시된다.
본 발명의 제 21면의 프라이머는 병원성 미생물 또는 질환-관련 유전자 검출을 위한 프라이머로 예시된다. 병원성 미생물, 예로서, 장혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 클로스트리듐 보톨리늄(Clostridium botulinum ), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 마이코박테리움 튜버큐로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia tracomatis),인간 유두종 바이러스(human papilloma virus), C형 간염 바이러스 또는 비로이드를 검출하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머가 본 발명에 포함된다.
본 발명의 제 22면은 서열번호 31-34, 47, 48, 51-53, 64-72, 84, 85, 113, 114, 130 및 131로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 장출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)를 검출하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 관한 것이다.
본 발명의 제 23면은 서열번호 59, 60, 119, 120, 122 및 123로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 비로이드를 검출하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 관한 것이다.
본 발명의 제 24면은 서열번호 116 또는 117로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 클로스트리듐 보톨리늄(Clostridium botulinum)를 검출하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 관한 것이다.
본 발명의 제 25면은 서열번호 96 또는 97로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 인간 유두종 바이러스을 검출하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 관한 것이다.
본 발명의 제 26면은 서열번호 101, 102, 138, 139, 200 및 201로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 C형 간염 바이러스를 검출하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 관한 것이다.
본 발명의 제 27면은 서열번호 136 또는 137로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)을 검출하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 관한 것이다.
본 발명의 제 28면은 서열번호 155, 156, 159-162, 194 및 195로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis)를 검출하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 관한 것이다.
본 발명의 제 29면은 서열번호 157 또는 158로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 클라미디아 (Chlamydia)를 검출하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 관한 것이다.
본 발명의 제 30면은 본 발명의 제 21면 내지 제 29면의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는, 제 1면 내지 제 15면의 핵산을 증폭하는 방법에서 사용되는 핵산 증폭용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 제 31면은 본 발명의 제 21면 내지 제 29면의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는, 본 발명의 제 20면의 표적 핵산을 검출하는 방법에서 사용되는 핵산 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 제 32면은 제 20면의 방법에서 사용되는 프로브에 관한 것이다.
본 발명의 제 33면은 제 1면 내지 제 7면의 방법에 의해 증폭된 핵산에 하이브리드화되는 프로브에 관한 것이다.
본 발명의 제 34면은 제 21면 내지 제 29면의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭된 부위에 하이브리드화되는 프로브에 관한 것이다.
제 32면 내지 제 34면의 프로브는 표지 물질로 표지된 프로브일 수 있고, 예로서, 소광 상태에 이르게 하는 거리에 위치하는 두개 이상의 형광 물질로 표지된 RNA 프로브 일 수 있다.
본 발명의 제 35면은 제 32면 내지 제 34면의 프로브를 포함하고 제 20면의 방법에서 표적 핵산을 검출하기 위하여 사용되는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 제 36면은 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 주형 스위치 반응을 시키는 것을 포함하는, 핵산 증폭 방법에 관한 것이다.
제 36면에서 사용되는 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 DNA 폴리머라제 I의 클레나우(Klenow) 단편, 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bst DNA 폴리머라제 및 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bca DNA 폴리머라제에 의해 예시된다.
본 발명의 제 37면은
(a) 제 1면 내지 제 7면의 핵산 증폭 방법에 의해 고정화하고자 하는 핵산을 증폭시키고;
(b) 단계 (a)에서 증폭된 핵산을 미리 정해진 영역에 배열하고 고정화시키는 것을 포함하는, 핵산이 미리 정해진 영역에 배열된, 고정화된 핵산을 갖는 물질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 38면은 제 37면의 방법에 의해 제조되는 핵산이 미리 정해진 영역에 배열된, 고정화된 핵산을 갖는 물질에 관한 것이다.
본 발명의 제 39면은
(a) 제 1면 내지 제 7면의 핵산 증폭 방법에 의해 핵산을 증폭시키고;
(b) 단계 (a)에서 증폭된 핵산을 모으는하는 것을 포함하는, 핵산을 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 40면은
(a) 증폭시키고자 하는 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA를 복제하여 주형으로서 핵산을 제조하고;
(b) 제 1면 내지 제 7면의 핵산 증폭 방법에 의해 단계 (a)에서 수득한 주형으로서 핵산을 증폭시키는 것을 포함하는 핵산 증폭 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 41면은 제 1면 내지 제 7면, 제 39면 또는 제 40면의 방법에 따라 핵산을 증폭시키는 것을 포함하는 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 방법에 관한 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 4은 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 8는 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 9은 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 10은 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다. A: ICAN, B: PCR.
도 11는 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 12은 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 13은 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 14는 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 15은 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 16은 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 17는 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 18은 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 19은 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 20는 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 21은 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 22은 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 23는 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 24은 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 25은 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 26는 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 27은 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 28은 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 29는 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 30는 본 발명의 방법 및 PCR에 따라 증폭된 증폭 산물의 양을 비교한 그래프이다.
도 31은 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 32는 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 33은 본 발명의 핵산을 증폭시키는 방법의 일면을 나타낸다.
도 34은 본 발명의 핵산을 증폭시키는 방법의 일면을 나타낸다.
도 35은 본 발명의 핵산을 증폭시키는 방법의 일면을 나타낸다.
도 36은 본 발명의 핵산을 증폭시키는 방법의 일면을 나타낸다.
도 37은 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 38은 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 39은 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바, 데옥시리보뉴클레오티드(또한 dN으로서 언급됨)는 당 부위가 D-2-데옥시리보오스로 구성된 뉴클레오티드를 언급한다. 예를 들면, 데옥시리보뉴클레오티드는 염기 부위로서 아데닌, 사이토신, 구아닌 또는 티민을 갖는 것들을 포함한다. 추가로, 데옥시리보뉴클레오티드는 또한 7-데아자구아노신과 같이 변형된 염기를 갖는 데옥시리보뉴클레오티드 및 데옥시이노신 뉴클레오티드와 같은 데옥시리보뉴클레오티드 유사체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 리보뉴클레오티드(또한 N으로서 언급됨)는 당 부위가 D-리보오스로 구성된 뉴클레오티드를 언급한다. 예를 들면, 데옥시리보뉴클레오티드는 염기 부위로서 아데닌, 사이토신, 구아닌 또는 우라실 갖는 것들을 포함한다. 또한 리보뉴클레오티드는 α-위치의 인산 그룹의 산소 원자가 황원자로 치환된(또한 ( α-S)로서 언급됨) 변형된 리보뉴클레오티드와 같은 변형된 리보뉴클 레오티드 또는 다른 유도체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 프라이머를 언급한다. 프라이머는 리보뉴클레오티드 유사체 및/또는 변형된 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 리보뉴클레오티드를 갖고, 본 발명의 방법에서 핵산 스트랜드를 신장시키기 위하여 사용할 수 있고, 엔도뉴클레아제로 절단될 수 있고, 스트랜드 치환 반응을 위해 사용될 수 있는 어느 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 3'-말단측은 예를 들면, 프라이머와 같이 핵산의 중심으로부터 3'-말단까지의 부위를 언급한다. 또한, 5'-말단측은 핵산의 중심으로부터 5'-말단까지의 부위를 언급한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 엔도뉴클레아제는 주형으로서 핵산에 어닐링된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 DNA를 신장시켜 제조된 더블-스트랜드 DNA에 작용하고, 특히 리보뉴클레오티드를 포함하는 프라이머의 부위에서 그것을 절단하는 어느 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바, DNA 폴리머라제는 주형으로서 DNA 스트랜드를 사용하여 새롭게 DNA 스트랜드를 합성하는 효소를 언급한다. DNA 폴리머라제는 자연발생적 DNA 폴리머라제 및 상기 언급한 활성을 갖는 변이체 효소를 포함한다. 예 를 들면, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 DNA 폴리머라제 및 역전사효소 활성을 갖거나 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바, "스트랜드 치환 활성"은 스트랜드를 치환할 수 있는 활성, 즉, DNA 스트랜드를 치환하여 주형 스트랜드에 어닐링된 상보적인 스트랜드를 분리시키면서 주형으로 뉴클레오티드 서열에 기초하여 DNA를 복제할 수 있는 활성을 언급한다. 또한, 본 명세서에서 스트랜드 치환으로부터 수득한 주형으로서 뉴클레오티드 서열로부터 분리된 DNA 스트랜드를 "치환된 스트랜드"로서 언급한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명할 것이다.
(1) 본 발명에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머
본 발명의 방법에서 사용되는 프라이머는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이다. 그러한 프라이머는 또한 변형되지 않는 리보뉴클레오티드 및/또는 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머이다.
본 발명의 방법에서 사용되는 키메라성 프라이머는 주형으로서 핵산의 일부의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 키메라성 올리고뉴크레오티드 프라이머이다. 사용되는 조건하에서 DNA 스트랜드를 신장시킬 수 있다. 또한, 리보뉴클레오티드는 키메라성 올리고뉴크레오티드 프라이머의 3'- 말단 또는 3'-말단측에 위치한다. 프라이머는 일반적으로 증폭되는 영역의 상류, 즉, 주형으로서 핵산중에 증폭되는 부위에 대응하는 뉴클레오티드 서열의 3' 부위에 상보적으로 작제된다. 본 명세서에서 사용되는 바, "실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열"은 사용되는 반응 조건하에서 주형으로서 DNA에 어닐링할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
그러한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 공지된 방법, 예를 들면, Labo Manual PCR(Takara Shuzo, pp.13-16, 1996)를 참고하여 디자인할 수 있다. OLIGOTM 프라이머 어날리시스 소프트웨어(Takara Shuzo)와 같은 프라이머 작제용의 시판되는 소프트웨어를 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 하나 이상의 변형된 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, 리보뉴클레오티드는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치할 수 있고 엔도뉴클레아제에 의해 인식되거나 절단되는 변형되지 않은 리보뉴클레오티드 또는 변형된 리보뉴클레오티드중 어느 하나일 수 있다. 리보뉴클레오티드는 상기 언급된 변형되지 않은 리보뉴클레오티드 및 변형된 리보뉴클레오티드 둘 모두를 포함할 수 있다. 변형되지 않은 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드 또는 그의 혼합물이 프라이머의 기능을 없애지 않는 한 본 발명의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 위해 사용할 수 있다. 변형된 리보뉴클레오티 드의 예로는 제한되는 것은 아니지만, 인산 그룹에 결합된 산소원자가 황 원자로 치환된 (α-S) 리보뉴클레오티드, 및 리보오스의 2번-위치에 하이드록시 그룹이 메톡시 그룹으로 치환된 리보뉴클레오티드를 포함한다. 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하는 그러한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 예를 들면, 황화 반응제(Glen Research), 또는 2-OMe-RNA-CE 포스포르아미다이트제(Glen Research)를 사용하는 방법에 의해 제조된 (α-S) 리보뉴클레오티드를 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 증폭 방법에서 사용될 수 있는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 엔도뉴클레아제를 사용하는 절단에 대하여 내성을 갖도록 하기 위해 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하도록 디자인될 수 있다. 그러한 프라이머는 증폭 반응 단계동안 그것이 엔도뉴클레아제로 절단 부위를 조정할 수 있게 하는데 유용한다.
하나 이상의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머가 증폭 후 원하는 형태의 DNA 단편(싱글-스트랜드 또는 더블-스트랜드)에 따라 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 특히, 싱글-스트랜드 DNA가 필요한 경우, 하나의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하고, 더블-스트랜드 DNA가 필요한 경구, 두개의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한다.
본 발명의 방법에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 길이는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 바람직하게 약 12 뉴클레오티드 내지 약 100 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게 약 15뉴클레오티드 내지 약 40뉴클레오티드이다. 키메라성 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 사용되는 반응 조건하에서 주 형으로서 핵산에 어닐링할 수 있도록 실질적으로 주형으로서 핵산과 상보적인 것이 바람직할 수 있다. 프라이머는 하기에 기재된 단계에서 사용되는 엔도뉴클레아제에 의해 3'-말단 또는 3'-말단측에서 인식되는 서열을 포함한다.
예를 들면, 하기 일반식으로 표시되는 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드를 본 발명의 DNA 합성 방법에서 프라이머로서 사용할 있지만, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 것은 아니다:
일반식 : 5'-dNa-Nb-dNc3'
(a: 11이상의 정수이고; b: 0 또는 1이상의 정수이며 c: 0 또는 1이상의 정수이고(단, b 및 c는 동시에 0이 아니다); dN: 데옥시리보뉴클레오티드이며; N: 변형되지 않은 리보뉴클레오티드 및/또는 변형된 리보뉴클레오티드이다(여기에서, dNa중 dNs는 Ns에 의해 치환될 수 있고, 3'-말단의 뉴클레오티드는 DNA 폴리머라제의 작용에 의한 3'-말단으로부터의 신장을 발생하지 않도록 변형될 수 있다).
예를 들면, a가 11이상인 정수이고; b가 1이며; c가 0-5인 일반식으로 표시되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 본 발명에서 바람직하게 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 리보뉴클레오티드의 길이는 바람직하게 1-mer 내지 15-mer, 더욱 바람직하게 1-mer 내지 10-mer, 가장 바람직하게 1-mer 내지 5-mer이다. 일반식에서 c의 수는 특정하게 제한되는 것은 아니지만, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 어느 수가 선택될 수 있다. 일반적으로, 5이하가 바람직하다. c에 대하여 4보 다 3, 3보다 2, 2보다 1을 선택한 반응에서 더욱 우수한 결과를 수득하였다. 특히, c가 0인 경우 가장 효과적인 반응을 수행할 수 있었다.
본 발명에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 엔도뉴클레아제가 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 리보뉴클레오티드를 포함하는 위치에서 DNA 폴리머라제(프라이머-신장된 스트랜드)를 사용하여 프라이머로부터 신장된 DNA 스트랜드를 인식하거나 절단하는 구조를 갖는다. 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만 예를 들면, 주형으로서 핵산에 어닐링된 일반식에 의해 표시된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 DNA 신장에 의해 제조된 더블-스트랜드 DNA에 RAas H를 작용시키는 경우, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 리보뉴클레오티드 부위에서 절단된다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 신장에 의해 합성된 DNA 스트랜드 사이에 닉(nick)이 삽입된 더블-스트랜드가 제조된다. 이어서, 닉 부위로부터 DNA 폴리머라제로 스트랜드 치환 반응을 수행한다. 따라서, 프라이머의 3'-말단으로부터 핵산 스트랜드를 신장시키기 위해 사용될 수 있고, 엔도뉴클레아제로 절단될 수 있고, 그것과 함께 DNA 폴리머라제로 스트랜드 치환시킬 수 있는 어느 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다. 추가로, 본 발명의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 3'-말단이 DNA 폴리머라제에 작용에 의한 신장이 발생하지 않고 DNA 신장은 엔도뉴클레아제에 의한 절단시 생성된 3'-말단으로부터 발생하는 것을 포함한다.
추가로, RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열은 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'-말단측상에 포함될 수 있다. 그러한 RNA 폴리머라제은 T7 RNA 폴 리머라제 및 SP6 RNA 폴리머라제에 의해 예시된다.
또한, 본 발명의 방법에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 물질을 포함할 수 있다. 즉, 하나 이상의 뉴클레오티드(들)은 DNA 폴리머라제의 작용에 의해 3'-말단으로부터의 중합 신장 반응시키는 프라이머의 작용이 제거되지 않는 한 본 발명의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 포함될 수 있다. 여러 형태의 뉴클레오티드 유사체가 배합되어 사용될 수 있다. 제한하는 것은 아니지만, 뉴클레오티드 유사체의 예로 데옥시이노신 뉴클레오티드, 데옥시우라실 뉴클레오티드, 7-데아자구아닌과 같이 변형된 염기를 갖는 뉴클레오티드 유사체, 리보스 유사체를 갖는 뉴클레오티드 유사체 등을 포함한다. 또한 본 발명에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 데옥시뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 또는 상기 기술된 작용을 갖는 한 표지된 화합물을 추가하는 것과 같은 다양한 변형을 갖는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 유사체를 프라이머내로 삽입하는 것이 프라이머 자체의 고차 구조 형성을 억제하고 주형과의 어닐링 형성을 안정화시키는데 유효하다. 리보클레오타이드를 동일한 방법으로 프라이머내로 삽입할 수 있다. 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, (α-S) 리보클레오타이드와 같이 변형된 리보뉴클레오타이드를 바람직하게 사용하여 비-특이 엔도뉴클레아제(RNase)에 의한 프라이머의 분해를 방지할 수 있다.
예를 들면, 포스포르아미다이트 방법에 따라 어플라이드 바이오시스템사(Appliced Biosystems Inc. (ABI))의 394형 DNA 합성기를 사용하여 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머가 어느 뉴클레오티드 서열을 갖도록 합성할 수 있다. 또한, 포스페이트 트리에스테르 방법, H-포스포네이트 방법 및 티오포스포네이트 방법을 사용하여 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성할 수 있다.
(2) 본 발명에서 사용되는 엔도뉴클레아제
상기 (1)에 기재된 바와 같은 주형으로서 핵산에 어닐링되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 DNA 신장에 의해 제조된 더블-스트랜드 DNA상에 작용하고 스트랜드를 치환시키기 위해 신장된 스트랜드를 절단하는 어느 엔도뉴클레아제를 본 발명에서 사용할 수 있다. 즉, 엔도뉴클레아제는 더블-스트랜드 DNA의 키메라성 올리보뉴클레오티드 부위에 닉을 제조하는 효소이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 엔도뉴클레아제의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 리보뉴클레아제들이다. 이들중에서, DNA 및 RNA로 구성된 더블-스트랜드 핵산의 RNA 부분에 작용하는 엔도리보뉴클레아제 H(RNase H)를 바람직하게 사용할 수 있다. 중온성 및 열-내성의 것을 포함하고, 상기 언급된 활성을 갖는 어느 리보뉴클레아제를 본 발명에서 바람직하게 사용할 수 있다. 예를 들면, 하기 실시예에 기재된 바와 같이 본 발명의 방법에서 E.Coli로부터의 RNase H를 약 50℃ 내지 약 70℃에 반응을 위해 사용할 수 있다. 열-내성 리보뉴클레아제를 본 발명의 방법에서 바람직하게 사용할 수 있다. 바람직하게 사용될 수 있는 열-내성 리보뉴클레아제는 제한하는 것은 아니지만, 상업 상 사용가능한 열-내성의 리보뉴클레아제, HybridaseTM Thermostable RNase H(Epicenter Technologies) 및 바실러스(Bacillus) 속의 고온성 세균, 써무스(thermus) 속 세균, 피로코쿠스(Pyrococcus)속 세균, 써모토가(Thermotoga) 속 세균, 아키오글로부스(archaeoglobus) 속 세균 등으로부터의 RNase H를 포함한다. 추가로 자연발생된 리보뉴클레아제 및 변이체가 바람직하게 사용될 수 있다. 본 명세서에서 언급하는 RNase H의 효소 유니트는 참조 실시예에 기재된 바와 같이 효소 유니트를 측정 방법에 따라 나타낸 값이다.
RNase H는 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 한 특정의 것으로 제한되지 않는다. 예를 들면, RNase H는 다양한 바이러스, 파지, 원핵생물 또는 진핵생물로부터 유래될 수 있다. 세포성 RNase H 또는 바이러스성 RNase H일 수 있다. 세포성 RNase H는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) RNase HI에 의해 바이러스성 RNase H는 HIV-1에 의해 예시된다. I형, II형 또는 III형 RNase H는 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들면 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 RNase HI, 또는 피로코쿠스(Pyrococcus)속 세균 또는 아키오글로부스(archaeoglobus) 속 세균으로부터의 RNase H가 제한되지 않고 바람직하다.
본 발명의 방법에서 사용되는 RNase H와 같은 엔도뉴클레아제를 사용하는 절단 반응의 효율은 프라이머의 3'-말단 주위의 뉴클레오티드 서열에 따라 달라질 수 있고 원하는 DNA의 증폭 효율에 영향을 줄 수 있다. 그러므노, 사용되는 Rase H 를 위해 최적의 프라이머를 작제하는 것이 적절하다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "닉의 삽입" 또는 "닉킹(nicking)"은 더블-스트랜드 핵산의 두개의 스트랜드중 하나를 내부적으로 절단하는 것을 의미한다. 예를 들면, RNase H는 DNA 및 리보뉴클레오티드-포함 DNA로 구성된 하이브리드 더블-스트랜드 핵산에 작용하여 두개의 스트랜드중에서 리보뉴클레오티드 부분에서 리보뉴클레오티드-포함 스트랜드를 선택적으로 절단한다.
(3) 본 발명에서 사용되는 DNA 폴리머라제
본 발명에서 DNA상에 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제가 사용될 수 있다. 특히, 실질적으로 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 DNA 폴리머라제가 바람직하게 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바, "스트랜드 치환 활성"은 스트랜드를 치환시킬 수 있는, 즉, DNA 스트랜드를 치환하여 주형 스트랜드에 어닐링된 상보적인 스트랜드를 분리시키면서 주형으로서 뉴클레오티드 서열에 기초하여 DNA 복제를 수행할 수 있는 활성을 언급한다. 또한, 본 멩세서에서 스트랜드 치환 결과 주형으로서 뉴클레오티드 서열로부터 분리된 DNA 스트랜드를 "치환된 스트랜드"로서 언급한다.
본 발명에서 스트랜드 치환 활성을 갖는 어느 DNA 폴리머라제를 사용할 수 있다. 그의 예는 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)(이하, B. ca로서 언급함) 및 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus)(이하, B. st로서 언급함)와 같은 바실러스 속의 고온성 세균으로부터 유래된, 그들의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 DNA 폴리머라제, 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 DNA 폴리머라제 I의 거대 단편(클레나우 단편)의 변이체를 포함한다. 중온성 및 열-내성 DNA 폴리머라제 둘 모두를 본 발명에서 바람직하게 사용할 수 있다.
B. ca는 약 70℃의 최적 성장 온도를 갖는 고온성 세균이다. 이 세균으로부터의 Bca DNA 폴리머라제가 DNA-의존 DNA 폴리머라제 활성, RNA-의존 DNA 폴리머라제 활성(역전사 활성), 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는다고 공지되어 있다. 효소는 그의 기원으로부터의 정제된 효소 또는 유전 공학 기술에 의해 생산된 재배합 단백질일 수 있다. 효소를 유전 공학 기술 또는 다른 방법을 사용하여 치환, 결실, 첨가 또는 삽입에 의해 변형시킬 수 있다. 변형된 효소의 예는 그의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 Bca DNA 폴리머라제인 Bca BEST DNA 폴리머라제(Takara Shuzo)를 포함한다.
일부 DNA 폴리머라제는 특정 조건하에서 RNase H 활성과 같은 엔도뉴클레아제 활서을 갖는 것으로 공지되어 있다. 그러한 DNA 폴리머라제를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 일면으로, Mn+2의 존재하에서와 같이 RNase H의 활성을 발현시킬 수 있는 조건하에서 DNA 폴리머라제가 사용될 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의 방법은 RNase H를 가하지 않고 수행될 수 있다. 본 발명자는 최초로 Mn+2을 포함하는 완충액에서 Bca DNA 폴리머라제가 RNase 활성을 보였고, 본 발명의 핵산을 증폭시키는 방법은 Bca DNA 폴리머라제외의 다른 효소는 포함하지 않는 반응 혼합물중에서 수행될 수 있다는 것을 입증하였다. 상기 언급한 면은 Bca DNA 폴리머라제의 사 용을 제한하지 않는다. 써무스 써모필러스(Thermus stearothermophilus)로부터의 Tth DNA 폴리머라제와 같이 RNase H 활성을 갖는 것으로 공지된 DNA 폴리머라제를 본 발명에서 사용할 수 있다.
(4) 본 발명에서 사용되는 반응 완충액의 조성
본 발명에서 완충 성분, 마그네슘염 및 dNTPs를 포함하는 반응 완충액을 사용할 수 있다. 자연적으로는 염의 형태 및 농도는 사용되는 금속 요구량 또는 효소 등에 따라 최적화된다. 바람직하게 사용될 수 있는 완충 성분의 예는, 제한하는 것은 아니지만, 트리신(Tricine), 트리스-하이드로클로라이드 및 인산염(예; 인산나트륨 및 인산칼륨)을 포함한다. 이들중에서, 완충 성분으로서 트리신 또는 인산염을 포함하는 완충액이 본 발명에서 바람직하다. 본 바렴을 제한하는 것은 아니지만, 예를 들면 반응 온도가 고온인 경우 온도 변화에 의해 pH가 거의 변하지 않는 Bicine 완충액이 바람직하게 사용된다. 사용되는 RNase H의 형태에 따라 HEPES 완충액이 바람직할 수 있다. 따라서, 최적의 완충액은 반응 온도, 사용되는 엔도뉴클레아제 또는 DNA 폴리머라제 등에 따라 선택될 수 있다. 완충 성분의 최종 농도는 5-100mM, 바람직하게 20-50mM 범위이다. pH는 6.0-9.5, 바람직하게 7.0-9.2 범위이다. 예를 들면, pH 7.5-9.2에 22-46mM 트리신을 함유하는 완충액 또는 pH 7.0-8.0에 25-50mM 인산칼륨을 함유하는 완충액이 바람직하다. 바람직하게 사용될 수 있는 마그네슘염의 예는, 제한하는 것은 아니지만, 염화마그네슘, 마그네슘 아세테이트 또는 황산마그네슘을 포함한다. 마그네슘염의 최종 농도는 1-20mM, 바람직하게 2-10mM 범위이다. 혼합물중 DNA 신장 반응용 기질로서 dNTPs(dATP, dCTP, dCTP 및 dTTP의 혼합물)의 최종 농도는 0.1-3.0mM, 바람직하게 0.2-1.2mM 범위이다. 50㎕ 반응 용량중에 사용되는 프라이머의 양은 1-1000pmol, 바람직하게 10-150pmol이다. 또한, 예를 들면, 반응 혼합물은 증폭 반응을 안정화시키기 위해 첨가제를 포함할 수 있다. 최종 농도 0.1% 이하의 송 혈청 알부민(BSA), 최종 농도 10% 이하의 디메틸설폭사이드, 최종 농도 4mM 이하의 푸트레신 디하이드로클로라이드, 또는 최종 농도 0.01% 이하의 프로필렌디아민을 첨가할 수 있다. 또한, NMP(1-메틸-2-피롤리디논), 글리세롤, 폴리(에틸렌 글리콜), 디메틸설폭사이드 및/또는 포름아미드를 포함할 수 있다. 그러한 유기 용매를 첨가하여 올리고뉴클레오티드 프라이머의 비특이적인 어닐링이 감소될 것으로 예상된다.
본 발명의 방법은 DNA 폴리머라제의 역전사 활성을 저해하는 물질 예로서 포스포노포름산(PFA)를 가하여 수행될 수 있다. 역전사 활성을 저해하는 물질을 가하는 경우 핵산외 비특이적 산물의 증폭이 감소된다.
또다른 일면으로 증폭 반응에 앞서 주형으로서 핵산을 본 발명에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 어닐링하는 것이 본 발명의 검출, 증폭 또는 생산 방법에서 올리고뉴클레오티드 프라이머의 비특이적 어닐링을 감소시키는데 유효하다. 폴리아민(예: 스퍼민 또는 스퍼미딘) 또는 프로필렌디아민과 같이 어닐링을 증진시키는 물질을 포함하는 어닐링 용액을 사용하여 어닐링을 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하게, 폴리아민을 포함하는 어닐링 용액 또한 염을 포함한다. 예를 들면, 제한하지 않고 어닐링 용액은 염화나트륨, 염화칼륨, 아세트산칼륨, 아세트산나트륨 등 및 폴리아민을 포함할 수 있다.
어닐링은 통상 프라이머 및 주형으로서 핵산을 포함하는 어닐링 용액을 더블-스트랜드 핵산이 변성되는 온도(예; 약 90℃ 이상)에서 인큐베이션시킨 후 본 발명의 방법에서 사용되는 온도 이하로 용액을 냉각시켜 수행된다.
어닐링 후, DNA 폴리머라제, RNase H 및 dNTPs와 같은 다른 필수 성분을 혼합물에 추가로 가하여 본 발명의 핵산 증폭 반응을 개시한다.
50㎕의 반응 용량중 엔도뉴클레아제의 예로서 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 RNae H 양은 바람직하게 3-200U, 더욱 바람직하게 15-60U 범위이다. 유사하게 50㎕의 반응 용량중 엔도뉴클레아제의 예로서 피로코쿠스(Pyrococcus)속 세균 또는 아키오글로부스(archaeoglobus) 속 세균으로부터의 RNae H 양은 바람직하게 3-200U, 더욱 바람직하게 4-40U 범위이다. 50㎕ 반응 용량중에 엔도뉴클레아제의 샘플로서 Bca BEST DNA 폴리머라제의 양은 바람직하게 0.5-100U, 더욱 바람직하게 1-22U 범위이다.
엔도뉴클레아제 및 DNA 폴리머라제를 본 발명의 방법에서 배합하여 사용하는 경우 예를 들면 제한하지 않고 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 피로코쿠스(Pyrococcus)속 세균 또는 아키오글로부스(archaeoglobus) 속 세균 및 Bca BEST 로부터의 RNae H의 배합물이 바람직하게 사용된다. 엔도뉴클레아제 및 DNA 폴리머라제의 바람직한 유니트수는 효소의 형태에 따라 달라질 수 있다고 예상된다. 그러한 경우, 사용되는 완충액의 조성 및 첨가되는 효소의 양은 인덱스로서 증폭 산물의 양 또는 검출 감수성의 증가를 사용하여 조정될 수 있다. 어느 경우에도, 사용되는 효소의 형에 따라 반응 완충액의 조성 등을 최적화하는 것이 적절하다.
(5) 본 발명의 핵산을 증폭시키는 방법
본 발명의 방법은 상기 (1)에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 프라이머를 상기 (2)에 기재된 바와 같은 엔도뉴클레아제 및 상기 (3)에 기재된 바와 같은 DNA 폴리머라제와 배합하여 사용함으로써 수행될 수 있다. 또한 RNase H 활성을 갖는 DNA 폴리머라제는 상기 기재된 바와 같이 RNase H 활성을 발현시킬 수 있는 조건하에서 사용될 수 있다.
PCR 방법에 사용되는 dNTPs 등(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP)등을 방법중에서 신장 반응에서 기질로서 뉴클레오티드 트리포스페이트로서 바람직하게 사용할 수 있다. dNTPs는 그것이 사용되는 DNA 폴리머라제에 대한 기질로서 작용하는 한 7-데자(deaza)-dGTP와 같은 dNTP 유사체를 포함할 수 있다. dNTP 또는 dNTP 유사체의 유도체를 사용할 수 있다. 아미노 그룹을 갖는 dUTP와 같은 작용 그룹을 갖는 유사체를 포함할 수 있다. 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 본 발명에서 사용할 수 있다. 상기 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 표준 올리고뉴클레오티드 프라이머를 배합하여 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다.
사용되는 효소의 활성이 반응과정에서 감소하는 경우 본 발명의 방법에서 반응하는 동안 추가로 효소를 가할 수 있다. 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 예를 들면 RNase H이 사용되는 반응시 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터 RNase H를 추가로 가할 수 있다. 첨가된 효소는 반응 시작시 반응 혼합물에 포함된 것과 동일할 수 있거나 동일한 활성을 보이는 상이한 효소일 수 있다. 따라서, 첨가되는 효소의 타입 또는 성질은 반응시 첨가가 검출 감수성의 증가 또는 증폭 산 물 양의 증가와 같은 효과를 제공하는 한 특정의 것으로 제한하지 않는다.
본 발명의 방법에서 주형으로서 사용되는 핵산(DNA 또는 RNA)은 핵산을 포함할 수 있는 어느 샘플로부터 분리하거나 제조할 수 있다. 또한, 샘플은 본 발명에 따른 핵산 증폭 반응에서 직접 사용할 수 있다. 핵산을 포함할 수 있는 샘플의 예는, 제한하는 것은 아니지만, 전체 혈액, 혈청, 백혈구층(buffy coat), 소변, 대변, 뇌척수액, 정액, 침, 조직(예: 종양 조직 또는 림프절) 및 세포 배양액(예: 포유류 세포 배양액 또는 박테리움성 세포 배양액)과 같이 유기체로부터의 샘플, 비로이드(viroid), 바이러스, 박테리움, 진균, 효모, 식물 및 동물과 같이 핵산을 포함하는 샘플, 바이러스 또는 박테리움와 같은 미생물로 오염되거나 감염감염된 것으로 예측되는 샘플(예; 식품 또는 생물학적 제제), 및 토양 및 폐수와 같이 유기체를 포함할 수 있는 샘플을 포함한다. 상기 샘플은 공지된 방법에 따라 상기 기재된 바와 같은 샘플을 공정화하여 수득된 핵산을 함유하는 샘플(preparation)일 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 샘플의 예는 세포 파괴 산물 또는 상기 산물을 분별하여 수득한 샘플, 샘플중에 핵산, 또는 mRNAs가 풍부한 샘플과 같은 특이적인 핵산 분자들을 포함한다. 또한, 샘플중에 포함된 핵산을 공지된 방법에 따라 증폭시켜 수득한 DNA 또는 RNA와 같은 핵산을 바람직하게 사용할 수 있다.
핵산을 포함하는 샘플을 제한하지 않고, 예를 들면, 세제를 사용하는 세포 용해, 초음파 처리, 글래스 비드 또는 프렌치 프레스(French press)를 사용하는 진탕/교반을 사용하여 상기 언급된 물질로부터 제조할 수 있다. 일부 경우에는, 추가로 샘플을 공정하여 핵산을 정제하는 것이 유리하다(예: 엔도뉴클레아제가 존재하 는 경우). 그러한 경우에, 핵산은 공지된 방법, 예를 들면, 페놀 추출, 크로마토그래피, 이온 교환, 겔 전기 영동 또는 밀도-구배 농축에 의해 정제된다.
RNA로부터 유래된 서열을 갖는 핵산을 증폭시켜야 하는 경우, 주형으로서 RNA를 사용하는 역전사반응에 의해 합성된 cDNA를 주형으로서 사용하여 본 발명의 발명을 수행할 수 있다. 샘플중에 총 RNA, tRNA 및 rRNA와 같은 RNA 분자 및 특이 RNA 종을 포함하여, 역전사 반응용 프라이머를 제조할 수 있는 어느 RNA도 본 발명의 방법에 적용될 수 있다.
사용된 반응 조건하에서 주형으로서 RNA에 어닐링하는 어느 프라이머가 역전사 반응에서 사용될 수 있다. 프라이머는 주형으로서 특이 RNA에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머(특이적 프라이머), 올리고-dT 프라이머(데옥시티민)프라이머 및 무작위 프라이머를 갖는 프라이머(무작위 프라이머) 일 수 있다. 특이적인 어닐링과 관련하여, 역전사용 프라이머의 길이는 바람직하게 6 뉴클레오티드 이상, 더욱 바람직하게 9 뉴클레오티드 이상이다. 올리고뉴클레오티드 합성과 관련하여, 길이는 바람직하게 100 뉴클레오티드 이하, 더욱 바람직하게 30 뉴클레오티드 이하이다. 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머가 역전사용 프라이머로서 사용될 수 있다. 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 또한 본 발명의 주형으로서 역전사후 수득된 cDNA를 사용하여 핵산을 증폭시키는 방법에서 스트랜드 치환 반응용 프라이머로서 사용될 수 있다. 그러한 프라이머는 상기 (1)에 기재된 특성을 갖고 RNA로부터 역전사 반응에 사용될 수 있는 어느 것일 수 있다.
주형으로서 RNA를 사용하여 cDNA를 합성하는 활성을 갖는 어느 효소가 역전 사 반응에서 사용될 수 있다. 그의 예는 다양한 원으로부터 기원한 역전사효소, 예를 들면, 조류 골수아세포증바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase(AMV RTase)), 마우스 백혈병 바이러스-유래된 역전사 효소( murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase(MMLV RTase) 및 라우스=관련 바이러스 2 역전자 효소(Rous-associated virus 2 reverse transcriptase(RAV-2 RTase)를 포함한다. 또한, 역전사효소 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용할 수 있다. 써모스속 박테리움으로부터의 DNA 폴리머라제(예: Tth DNA 폴리머라제) 및 바실러스(Bacillus)속의 고온성 박테리움으로부터의 DNA 폴리머라제와 같이 고온에서 역전사 활성을 갖는 어느 효소가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, B. st로부터의 DNA 폴리머라제(Bst DNA 폴리머라제) 및 B. ca로부터의 DNA 폴리머라제(Bca DNA 폴리머라제)와 같은 바실러스(Bacillus)속의 고온성 박테리움으로부터의 DNA 폴리머라제가 바람직할 수 있지만, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 예를 들면, Bca DNA 폴리머라제는 역전사 반응을 위해 마그네슘 이온을 필요로 하지 않는다. 또한, 그것은 고온 조건하에서 주형으로서 RNA의 2차 구조 형성을 억제시키면서 cDNA를 합성할 수 있다. 역전사 효소활성을 갖는 천연의 것 및 상기 효소의 변이체는 그들이 상기 활성을 갖는 한 사용될 수 있다.
또다른 일면에서 앞서 증폭시키고자 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA을 복제한 후 본 발명의 방법에서 복제된 산물을 주형으로서의 핵산으로서 사용할 수 있다. 복제 방법의 예로서 제한하는 것은 아니지만, 증폭시키고자 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 단편이 삽입된 벡터를 사용하여 적절한 숙주 세포를 형질전환시키고, 생성된 형질전환주를 배양하고, 증폭시키고자 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 단편이 삽입된 벡터를 그로부터 추출하고 사용하는 것을 포함하는 방법을 포함한다. 벡터는 숙주내에서 안정하게 복제되는 한 어느 것을 사용할 수 있다. 예로서, pUC 시리즈, pBluescript 시리즈, pGEM 시리즈, 코스미드형 벡터 및 파지형 벡터가 바람직하게 사용된다. 숙주는 사용되는 벡터를 유지할 수 있는 한 어느 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, 용이하게 배양되는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)를 들 수 있다.
복제 방법의 다른 일면으로 증폭시키고자 하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNA를 RNA 폴리머라제 및 주형으로서 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 단편을 사용하여 전사시킨 후 직접 또는 역전사 반응에 의해 cDNA로 전환시킨 후 RNA를 본 발명의 방법을 위한 주형으로서 사용할 수 있다. 증폭시키고자 하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 단편은 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열을 갖는 한 특정의 것으로 제한하지 않는다. RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열을 갖는 벡터내로 삽입되고, 그의 말단에 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열을 갖는 아댑터 또는 카세트로 결찰되거나 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열을 갖는 프라이머 및 적절한 주형을 사용하여 효소적으로 합성될 수 있다. 따라서 증폭시키고자 하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 단편은 상기 기재된 바와 같이 위치하는 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열을 사용하여 RNA 형태로 복제되거나 증폭될 수 있다. RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열을 갖는 한 모든 벡터가 사용될 수 있다. 예를 들 면, pUC 시리즈, pBluescript 시리즈, pGEM 시리즈, 코스미드형 벡터 및 파지형 벡터가 바람직하게 사용된다. 환상 형태로 또는 선형화된 후 바람직하게 사용될 수 있다. RNA 폴리머라제는 복제 또는 증폭법을 위해 사용될 수 있다. 예로서 SP6 RNA 폴리머라제, T7 RNA 폴리머라제, T3 RNA 폴리머라제 등을 바람직하게 사용할 수 있다.
분리된 게놈 DNA 또는 PCR 단편과 같은 더블-스트랜드 DNA 및 총 RNA 또는 mRNA로부터의 역전사 반응에 의해 제조된 cDNA와 같은 싱글-스트랜드 DNA 둘 모두를 본 발명에서 주형 DNA로서 바람직하게 사용할 수 있다. 더블-스트랜드 DNA는 그것을 싱글-스트랜드 DNA로 변성시킨 후 사용하는 것이 바람직하다.
PCR 증폭 산물과 같은 선형의 더블-스트랜드 DNA를 주형으로서 사용하는 경우, 본 발명의 증폭 방법에서 변성 단계는 삭제될 수 있다. 본 발명의 프라이머에 대한 어닐링 부위에 DNA의 말단으로로부터 내부로 약 50개의 염기를 위치시켜 삭제를 수행할 수 있다. 본 발명의 DNA 합성 방법에서 하나의 DNA 폴리머라제를 사용하여 RNA으로부터의 서열을 갖는 핵산을 증폭시키는 경우, 주형으로서 RNA을 사용하여 역전사 반응에 의해 수득한 RNA-cDNA 더블 스트랜드 핵산을 RNase H을 포함하는 본 발명의 증폭 반응 혼합물에 가하여 RNA 스트랜드를 분해하고 싱글-스트랜드 cDNA로 핵산을 전환시켜 증폭 반응을 개시할 수 있다. 또한, 주형으로서 RNA를 사용하는 역전사반응 및 역전사 반응에 의해 제조된 cDAN를 주형으로서 사용하는 DNA 증폭 반응을 수행할 수 있다. 그러한 DNA 폴리머라제는 역전사 효소 활성 및 스트랜드 치환 활성을 갖는다.
단편중에 전체 표적 서열 또는 적어도 충분한 부분의 표적 서열이 존재하기 때문에 적절한 길이의 주형은 프라이머 서열이 충분하게 결합할 수 있게 제공하는 것이다.
제한하지 않고, 주형으로서 DNA가 더블-스트랜드 DNA인 경우, DNA를 싱글-스트랜드 DNA로 변성시켜 본 발명의 방법에서 프라이머가 주형으로서 DNA 스트랜드에 결합할 수 있도록 한다. 더블-스트랜드 DNA가 변성되는 온도(예: 약 95℃)에서 그것을 인큐베이션시키는 것이 변성을 위해 바람직할 수 있다. 다른 방법은 증가된 pH를 사용하는 것을 포함한다. 이러한 경우, pH를 감소시켜 올리고뉴클레오티드 프라이머가 표적에 결합할 수 있도록 하여야 한다. 더블-스트랜드 DNA를 싱글-스트랜드 DNAs로 변성시키거나, RNA를 주형으로서 사용하는 경우, 역전사 반응에 의해 cDNA(싱글-스트랜드 DNA)를 제조한 후, 순차적으로 등온 조건하에서 핵산을 증폭시킨다.
"순차적으로"는 반응 온도 또는 반응 혼합물의 조성을 변화시키지 않고 반응을 수행하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바, "등온"은 실직적으로 그 온도하에서 각 단계에서 효소 및 핵산 스트랜드가 작용하는 상온(constant temperature) 조건을 의미한다.
본 발명의 핵산 증폭 반응은 클레나우 단편과 같은 중온성 DNA 폴리어라아제를 사용하여 표준 온도(예: 37℃)에서 수행할 수 있다. 또한, 그것은 열-내성 효소(엔도뉴클레아제 또는 DNA 폴리어라아제)를 사용하여 고온 온도(예: 50℃ 이상, 또는 60℃ 이상)에서 수행할 수 있다. 이러한 경우, 프라이머의 비특이적 어닐 링은 억제되어 DNA 증폭의 특이성은 증가한다. 또한, 주형으로서 DNA의 2차 구조 형성의 문제점을 해결함으로써, DNA 폴리머라제의 신장 능력을 증가시킨다. 본 발명에서 역전사 반응 및 핵산 증폭을 순차적으로 수행할 수 있다. 이러한 경우, 역전사 효소를 상기 언급된 반응과 사용하거나 역전사 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 RNA로부터 유래된 서열을 갖는 DNA를 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 상기 언급된 각각의 일면에서, 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 주형으로서 싱글-스트랜드 DNA에 상보적인 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 DNA에 어닐링시킨다. 이어서, DNA 폴리머라제의 작용에 의해 프라이머의 3'-말단으로부터 주형으로서 DNA의 잔존 서열을 따라 주형으로서 DNA에 상보적인 DNA(프라이머-신장된 스트랜드)를 신장시켜 더블-스트랜드 DNA를 합성한다. 엔도뉴클레아제는 더블-스트랜드 DNA에 작용하고 다시 프라이머-신장된 스트랜드의 프라이머 부위로부터의 DNA 재신장을 시작한다. 본 발명의 일면으로, 엔도뉴클레아제는 더블-스트랜드 DNA에 닉을 삽입시키는 닉 효소로서 작용하거나 본 발명으로 이론으로서 제한하는 것은 아니지만, 엔도뉴클레아제는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 주형으로서 DNA로 구성된 더블-스트랜드 DNA의 구조를 변경시킬 수 있다. 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제는 닉의 3'-말단의 하류에서 DNA를 분리시키면서 더블-스트랜드 DNA중에 삽입된 닉의 3'-말단으로부터 DNA 스트랜드를 재-신장시켜 신규의 프라이머-신장된 스트랜드를 제조한다. 따라서, 신규의 프라이머-신장된 스트랜드가 앞서 합성된 프라이머-신장된 스트랜드를 대신한다.
두개의 프라이머, 즉, 주형으로서 핵산에 상보적인 키메라성 올리고뉴클레오 티드 프라이머 및 치환된 스트랜드에 상보적인 또다른 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머을 사용하여 본 발명의 핵산을 증폭시키는 방법은 수행할 수 있다. 이러한 경우, 하나의 프라이머는 주형으로서 DNA 스트랜드에 결합하여 스트랜드 치환 반응시키는 반면, 또다른 프라이머는 스트랜드 치환 반응 결과 분리된 치환된 스트랜드에 결합하여 또다른 스트랜드 치환 반응을 개시한다. 이 면이 사용되는 경우, 하나의 프라이머를 갖는 반응산물이 또다른 프라이머에 대한 주형으로서 작용할 수 있다는 것은 자명하다. 따라서, 비-선형 방법에서 주형의 양이 증가함에 따라 증폭산물의 양이 증가한다.
주형으로서 더블-스트랜드 DNA를 사용하여 본 발명의 핵산의 증폭 방법을 수행하는 경우, 두개의 스트랜드는 각각 두개의 스트랜드에 어닐링하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머을 사용하여 증폭 반응에서 주형으로서 작용할 수 있다. 반응을 더블-스트랜드 DNA의 변성후에 개시하는 경우, 더블-스트랜드 DNA의 변성 전후로 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머, 4개의 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTPs), DNA 폴리머라제 및 엔도뉴클레아제를 반응 혼합물에 첨가한다. 더블-스트랜드 DNA를 변성시키기 위해 열처리를 사용하고 열-내성 효소를 사용하지 않는 경우, 변성 후 효소를 첨가하는 것이 바람직하다.
주형으로서 더블-스트랜드 DNA 및 두개의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 본 발명의 핵산 증폭 방법에서 반응 조건 등에 따라 신장 반응동안 주형-신장된 스트랜드 중간체중 프라이머로부터 주형의 변환(switching)이 발생하여 서로 어닐링되는 합성 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵 산을 생성할 수 있다. 더블-스트랜드 핵산은 양쪽 끝에 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 갖는다. 이어서 스트랜드 치환을 포함하는 상보적 스트랜드를 신장하는 반을 양쪽 끝으로부터 다시 시작할 수 있다. 반응 결과, 한쪽 끝에서 프라이머 서열을 갖는 증폭 산물을 생산된다. 추가로, 반응시 주형의 변환이 발생하는 경우 상기 기술된 것과 유사한 더블-스트랜드 핵산을 다시 생산된다.
본 발명은 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 주형 스위치 반응시키는 것을 포함하는 핵산을 증폭시키는 방법을 제공한다. 주형으로서 더블-스트랜드 핵산, 각 스트랜드의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 두개의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제의 존재하의 주형 스위치 반응에서 주형에 상보적인 두개의 프라이머-신장된 스트랜드가 합성된다.프라이머-신장된 스트랜드 합성시 주형으로부터 다른 프라이머-신장된 스트랜드로의 각 프라이머-신장된 스트랜드의 주형 변환이 일어난다.
본 명세서에서 사용되는 바, 주형 스위치 반응은 상보적 스트랜드가 스트랜드 치환 반응에 의해 더블-스트랜드 핵산의 양측으로부터 합성되는 경우, DNA 폴리머라제가 주형을 변환하고 이후 또다른 DNA 폴리머라제에 의해 새로 합성된 다른 상보적 스트랜드를 주형으로서 사용하여 상보적 스트랜드를 합성하는 것 반응을 언급한다. 즉 주형 스위치 반응 주형으로서 더블-스트랜드 핵산을 프라이머 및 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제로 처리하여 주형에 상보적인 신장된 스트랜드를 생성하는 반응을 언급하고, 여기에서 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하는 DNA 폴리머라제는 신장된 스트랜드의 합성시 원 주형으로부터 다른 프라이머-신장 된 스트랜드로 주형을 활발하게 변환한다. 주형 스위치 반응시키는 DNA 폴리머라제의 능력은 예로서 하기 실시예 32에 기술되는 방법에 따라 측정할 수 있지만, 이는 본 발명의 제한하는 것은 아니다.
스트랜드 치환 반응시 주형 스위치 반응시킬 수 있는 DNA 폴리머라제가 본 발명에서 바람직하게 사용될 수 있다. 예로서, 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 Bca DNA 폴리머라제의 다양한 효소가 특히 바람직하게 사용된다. 그러한 효소는 상업적으로 BcaBEST DNA 폴리머라제(Takara Shuzo)로서 이용할 수 있다. 일본 특허 2978001에 기술된 방법에 따른 효소에 대한 유전자를 포함하는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) HB101/pU1205 (FERM BP-3720)으로부터 제조될 수 있다. 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) HB101/pU1205 (FERM BP-3720)는 1991년 5월 10일(기탁일)에 International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central(6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan)에 기탁되었다.
본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 본 발명의 핵산을 증폭시키는 방법의 반응 모드는 예로서 하기와 같이 고려된다.
본 발명의 핵산을 증폭시키는 방법에서, 주형으로서 더블-스트랜드 핵산을 RNase H 존재하에 각 스트랜드의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 두개의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제로 처리하여 주형에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성한다. 서로 어닐링하는 합성된 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산 및 주형 스위치 반응 결과 두개의 프라이머가 어닐링하는, 서로 어닐링하는 주형으로 구성된 더블-스트랜드 핵산를 수득할 수 있다. 후자의 더블-스트랜드 핵산을 주형으로서 재사용한다. 서로 어닐링하는 합성된 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산은 리보뉴클레오티드를 포함하는 부위에서 RNase H로 분해된다. 주형에 상보적인 핵산은 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 더블-스트랜드 핵산의 각 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 스트랜드 치환시킨다. 서로 어닐링하는 합성된 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산 및 주형 스위치 반응 결과 두개의 프라이머가 어닐링하는, 서로 어닐링하는 주형으로 구성된 더블-스트랜드 핵산를 수득할 수 있다.
주형 스위치 반응이 일어나지 않는 경우, 각 주형 및 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 두가지 형태의 더블-스트랜드 핵산을 수득할 수 있다.
두가지 형태의 더블-스트랜드 핵산은 리보뉴클레오티드를 포함하는 부위에서 RNase H로 분해된다. 주형에 상보적인 핵산은 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 더블-스트랜드 핵산의 각 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 스트랜드 치환시킨다. 서로 어닐링하는 합성된 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산 및 주형 스위치 반응 결과 두개의 프라이머가 어닐링하는, 서로 어닐링하는 주형으로 구성된 더블-스트랜드 핵산를 수득할 수 있다.
본 발명의 핵산을 증폭시키는 방법에서, 주형으로서 더블-스트랜드 핵산을 RNase H의 존재하에 각 스트랜드의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 두개의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리 머라제로 처리하고, 주형에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성한다. 주형 스위치 반응이 일어나지 않는 경우, 각 주형 및 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 두가지 형태의 더블-스트랜드 핵산을 수득할 수 있다.
본 발명의 증폭 방법에서, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머-신장된 스트랜드는 리보뉴클레오티드를 포함하는 부위에서 분해되어 분해로부터 생성된 5' 단편 (프라이머 부위)는 리보뉴클레오티드를 포함하지 않을 수 있다. 그렇게 생성된 프라이머 부위로부터 신장된 프라이머-신장된 스트랜드는 엔도뉴클레아제에 의해 더이상 분해되지 않는다. 결과 끝에 프라이머 서열을 갖는 증폭 산물이 생성된다.
상기 기재된 바와 같이, 양쪽 끝에 프라이머 서열을 갖지 않는 증폭 산물 및 프라이머 서열(들)을 갖는 산물이 본 발명의 핵산 증폭 방법에서 생산될 수 있다. 이들 산물이 본 명세서에서 증폭 산물로 포함된다.
본 발명의 핵산 증폭 방법의 예를 도 33 내지 36에 도시한다. 다시 말해 도 33 내지 36은 본 발명의 핵산 증폭 방법에서 예시적인 핵산 증폭을 설명한다.
도 33 내지 36은 DNA 주형으로서 더블-스트랜드 핵산인 DNA, 주형으로서 DNA의 뉴클레오티드 서열 정보에 기초하여 합성된 한쌍의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 (도에서, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 3개의 리보뉴클레오티드를 3'-말단에 갖고; 도에서 오픈 서클은 리보뉴클레오티드를 나타낸다), 스트랜드 치환 활성을 갖는 스트랜드 치환형 DNA 시탄아제 (DNA 폴리머라제), DNA-RNA 하이브리드 위치에서 분해하는 리보뉴클레아제인 RNase H, 신장된 스트랜드로 삽입시키고자 하는 기질인 dNTPs의 존재하에의 예시적인 핵산 증폭 방법을 설명한다.
도 33에 나타낸 바와 같이, 주형으로서 DNA의 뉴클레오티드 서열 정보에 기초하여 합성된 한쌍의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 주형으로서 DNA의 특정 부위에 어닐링하다. DNA 스트랜드는 단계 1에 나타낸 스트랜드 치환 반응의 결과로서 각 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 3'-말단으로부터 신장된다.
이후, 도 34에 나타낸 바, 단계 2에 나타낸 바와 같이 주형 스위치 반응 결과 상류 및 하류로부터 신장된 일부의 프라이머-신장된 스트랜드는 원 주형으로부터 유리된다. 프라이머-신장된 스트랜드는 그이 3' 부위에서 서로 어닐링한다. 상보적 스트랜드는 서로 어닐링하는 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 DNA를 형성하면서 어닐링된 신장된 스트랜드로부터 신장된다. 또한, 상기 언급된 한싸의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머가 어닐링하는 서로 어닐링하는 치환된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 DNA가 생성된다. 이를 도 34에서 출발 물질로서 사용한다.
도 35의 단계 3에 나타낸 바, 서로 어닐링하는 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 도 34의 더블-스트랜드 DNA의 키메라성 올리고뉴클레오티드로부터 유도된 RNA를 포함하는 단 하나의 스트랜드만이 더블-스트랜드 DNA의 DNA/RNA 하이브리드 사이트에서 RNase H의 작용에 의해 분해되고, 더블-스트랜드 DNA에 닉을 삽입한다.
이어서, 스트랜드 치환 반응이 더블-스트랜드 DNA의 닉으로부터 일어나고 DNA는 도 35의 단계 4와 같이 신장된다. 이어서 도 34의 단계 2와 같은 주형 스위 치 반응은 얼마간 또는 그 비율로 일어나고, 증폭 산물, 즉 서로 어닐링하는 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드를 생성한다.
또한, 상기 언급한 쌍의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 어닐링하는 서로 어닐링하는 치환된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 DNA가 생성된다.
이후 도 36에 나타낸 바와 같이 DNA 스트랜드는 스트랜드 치환 반응의 결과로서 각 키메라성 올리로뉴클레오티드 프라이머의 3'-말단으로부터 도 35의 쌍의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 어닐링하는 서로 어닐링하는 치환된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 DNA로 신장된다. 단계 2 및 단계 5의 것과 유사한 주형 스위치 반응이 얼마간 일어나고 이로써 서로 어닐링하는 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드가 생성된다. 이 더블-스트랜드 DNA를 도 35의 단계 3으로 다시 되돌린다. 반응을 단계 3에서 다시 시작한다. 쌍의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 어닐링하는 서로 어닐링하는 치환된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 DNA를 생성하고 도 36에서 출발물질로서 사용한다. 결과 이들 더블-스트랜드 핵산이 반복적으로 생성되는 연쇄 반응으로 한쌍의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의해 결합된 영역을 증폭시키고 생성하다.
키메라성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 본 발명의 핵산 증폭 방법에서 증폭시키고자 하는 영역이 서로 연결된 폴리머가 생성될 수 있다. 폴리머는 증폭시키고자 하는 다수의 영역이 동일한 방향으로 반복된 구조를 갖는다. 폴리머는 증폭 산물의 전기영동 분석시 래더 밴드(laddered band)로서 관찰된다. 폴리머 생성은 증폭시키고자 하는 영역, 영역의 크기, 측면 영역, 사용되는 키메라성 올리고뉴클 레오티드 프라이머의 뉴클레오티드 서열, 반응 조건 등에 의해 영향을 받는 것으로 판단된다.
상기 기재된 바와 같이 폴리머는 증폭시키고자 하는 다수의 영역을 포함한다. 예로서, 폴리머는 적절한 프로브를 사용하여 하이브리화시키는 경우 다수의 프로브와 하이브리드하고 강한 시그날을 발생시키기 때문에 증폭시키고자 하는 영역을 포함하는 핵산을 검출하고자 하는 경우 유용하다. 증폭시키고자 하는 영역 또는 그의 일부는 제한 효소 등에 의한 분해에 의해 모노머로서 또는 그의 배합물로서 폴리머로부터 수득될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 DNA 폴리머라제는 앞서 신장된 DNA 스트랜드를 치환하면서 닉킹된 부위로부터 하뷰 방향으로 신장되는 스트랜드를 합성하여야 한다. DNA 폴리머라제는 치환된 스트랜드을 분해할 수 있는 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 나타내지 않는 것이 중요하다. 예를 들면, E. coli로부터의 DNA 폴리머라제 I의 에고뉴클레아제-결핍 변이체인 클레나우 단편, Bst DNA 폴리머라제로부터 유래된 유사한 단편(New England Biolabs), 및 B. ca로부터의 Bca BEST DNA 폴리머라제(Takara Shuzo)를 그러한 DNA 폴리머라제로서 사용한다. 시쿼나아제(Sequenase) 1.0 및 시쿼나아제 2.0(United States Biochemical), 및 (Gene, 97:13-19(1991))에 기재된 T5 DNA 폴리머라제 및 φ29 DNA 폴리머라제를 또한 사용할 수 있다. 적절한 억제제를 첨가하여 활성을 억제시키는 경우, 일반적으로 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 폴리머라제를 DNA 합성 방법에서 사용할 수 있다.
본 발명의 핵산 증폭 방법은 다양한 온도 또는 등온에서 수행될 수 있다. 다 양한 온도는 각 단계에서의 변화가 반응을 방해하지 않도록 각 단계를 위해 반응 온도를 변화시키는 것을 의미한다. 특히, 다양한 온도는 예를 들면, 프라이머의 어닐링, 상보적 스트랜드의 합성 반응, 상보적 스트랜드의 닉킹(nicking) 및 치환 반응의 각각에 적절한 온도의 변화를 언급한다.
한편, 등온은 각 단계에 대한 반응 온도는 불변하고 각 단계를 실질적으로 상온(constant temperature)에서 수행하는 것을 의미한다. 둘 모두의 경우에서 반응 조건을 최적화하기 위해 온도를 선택하는 것이 적절하다.
본 발명의 핵산 증폭 방법의 하나의 특성은 상기 방법은 핵산 합성동안 온도를 상하로 조정할 필요가 없다는 것이다. 따라서, 본 발명은 등온으로 뉴클레오티드 서열을 합성하는 방법을 제공하는 것이다. 다수의 통상적인 핵산 증폭 방법은 합성된 스트랜드로부터 표적을 해리시키기 위하여 온도를 상하로 조절하는 것을 필요로 한다. 이들 방법은 이 목적을 위해 열 싸이클러(thermal cycler)와 같은 특별한 반응 장치를 필요로 한다. 그러나, 본 발명의 방법은 단지 온도를 일정하게 유지시킬 수 있는 장치만을 사용하여 수행된다. 상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 단일 온도에서 수행될 수 있다. 바람직하게, 프라이머의 비-특이적인 어닐링을 감소시키고 프라이머가 특이적으로 주형으로서 뉴클레오티드 서열에 어닐링할 수 있도록 반응 온도 및 엄격한(stringency) 수준을 선택하여 수행한다. 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 본 발명의 방법은 상기 기재된 열-내성 효소를 사용하여 고온 조건하에서 수행될 수 있다. 또한, 사용되는 효소의 활성을 충분히 유지하기 위한 적절한 온도에서 본 발명의 방법을 수행하여 반응 효율을 고수준으로 유지시 키는 겻이 바람직할 수 있다. 따라서, 반응 온도는 사용되는 효소에 따라 달라질 수 있지만, 바람직하게, 20℃ 내지 약 80℃, 더욱 바람직하게 약 30 ℃ 내지 약 75℃, 가장 바람직하게 약 50℃ 내지 약 70℃이다. 특히 고온 조건하에서 반응을 수행하는 경우, 표준 온도에서의 반응을 위한 것보다 더욱 긴 프라이머를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 반응 온도에 적절한 프라이머의 서열 및 길이는 예를 들면, 그의 Tm 값을 참고로하여 결정될 수 있다. 또한, OLIGOTM 프라이머 어날리시스 소프트웨어(Takara Shuzo)와 같이 프라이머를 다자인하기 위한 상업적으로 시용가능항 소프트웨어를 사용할 수 있다. 예를 들면, 55℃ 내지 60℃ 또는 65℃의 반응 온도를 사용하는 경우, 본 발명의 방법에서 사용되는 프라이머의 길이는 에를 들면, 제한하지 않고, 12-1000 뉴클레오티드, 바람직하게 14-50 뉴틀레오티드, 더욱 바람직하게 15-40 뉴클레오티드이다. 반응 온도를 승온시킴으로써 얻은 효과의 예는 주형으로서 DNA의 2차 구조 형성의 문제를 해결한 것이다. 높은 GC 함량을 갖는 핵산을 주형으로서 사용하여도, 반응 온도를 승온시킴으로써 원하는 핵산을 증폭시킬 수 있다. 또한, 그것은 유사하게 장쇄의 영역을 증폭시키는데 효과적이다. 그러한 효과는 약 60bp 내지 약 20 kbp 사이, 특히 약 110bp 내지 약 4.3 kbp 사이, 더욱 바람직하게 약 130bp 내지 약 1500 bp 사이 범위에서 관찰된다.
증폭 효능은 주형으로서 핵산의 GC 함량에 따라 반응 온도를 조절하여 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 낮은 GC 함량을 갖는 핵산을 주형으로서 사용하는 경우 온도는 증폭시키고자 하는 쇄의 길이 및 프라이머의 Tm 값에 따라 달라질 수 있지 만 본 발명의 증폭 반응은 50 내지 55℃에서 수행될 수 있다.
RNA로부터 cDNA를 제조하는 단계 (역전사 반응)를 통상적으로 수행하는 것을 포함하여, 본 발명의 방법에서 역전사 효소 활성을 갖는 DNA 폴리머라제(예: Bca BEST DNA 폴리머라제)를 사용하여 RNA로부터 핵산을 증폭시킨다. 또한, RNA로부터 핵산을 증폭시키는 단계를 독립적으로 수행하여 수득한 산물, 즉, cDNA를 본 발명의 방법에서 주형으로서 DNA로서 사용할 수 있다.
각 경우에서, 적절한 방법, 예를 들면, 효소를 불활성시키거나 반응 온도를 낮추어 그것이 종결될 때까지, 또는 반응에서 기질중 하나가 부족할 때까지 본 발명의 방법에서 반응을 반복한다.
본 발명의 핵산 증폭 방법은 핵산의 검출, 표지 및 서열화를 포함하는 핵산 증폭을 사용하는 다양한 실험 방법을 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산 증폭 방법은 DNA 칩과 같은 고체 기질상의 핵산을 증폭시키는 방법인 인시츄(in situ)에서의 핵산 증폭 방법, 또는 다수의 영역을 동시에 증폭시키는 멀티플렉스 핵산 증폭 방법을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 핵산 증폭 방법의 하나의 특징은 싱글-스트랜드 DNA를 제조하는 그의 능력이다. 이 목적을 위해 하나 또는 두개의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용할 수 있다. 예를 들면, 두개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 경우, 본 발명의 방법은, 또다른 것에 대하여 상대적으로 과량의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 수행되는 증폭 방법인 비대칭 PCR 방법을 위해 사용되는 것와 같은 프라이머 비를 적용시켜 수행할 수 있다. 결과적으로, 하나의 스트 랜드로부터 치환된 산물의 양은 또다른 것으로부터의 것에 대하여 상대적으로 과량이다. 제한하는 것은 아니지만 프라이머 비는 바람직하게 1: 10 내지 1: 500 범위, 더욱 바람직하게 1:10 내지 1: 100의 범위이다. 결과 하나의 스트랜드로부터의 치환 산물의 양은 또다른 것으로부터의 것과 비교하여 과량이다.
본 발명의 핵산 증폭 방법에 따라, 그의 상보적인 스트랜드가 실질적으로 결핍된 싱글-스트랜드 DNA를 제조할 수 있다. 예를 들면, DNA 칩과 같이 고정하고자 하는 핵산을 갖는 물질을 제조하기 위한 싱글-스트랜드 DNA, 핵산을 검출하기 위한 싱글-스트랜드 DNA 프로브, 또는 장쇄 PCR 방법용 메가-프라이머(mega-primer)를 단시간에 용이하게 제조할 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 단지 센스 서열(sense sequence) 또는 안티센스 서열(anti sense sequence)을 선택적으로 증폭시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 센스 서열 또는 안티센트 서열을 갖는 핵산을 제조하는 방법으로서 유용하다.
관심의 대상이 되느 핵산 영역은 Bicine, Tricine, HEPES, 포스페이트 또는 트리스의 완충액중 본 발명의 방법을 수행하여 주형으로서 미량의 핵산으로부터도 증폭될 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산 증폭 방법은 시간동안 온도를 조정할 수 있는 반응 장치의 사용을 필요로 하지 않는다. 그러므로, 증폭 반응은 대량의 반응 혼합물중에서 수행될 수 있다. 따라서, 핵산(예: 의료용)을 대량으로 산업적으로 생산할 수 있다.
본 발명의 핵산 증폭 방법에서 사용된 프라이머의 사용 효율은 PCR 방법과 같은 통상의 방법에서 것보다 5- 내지 10배 높은 약 100%이다.
본 발명의 핵산 증폭 방법은 주형 핵산의 뉴클레오티드 서열에 고도로 동일한 증폭 산물을 생산할 수 있다. 본 발명의 방법에서 DNA 합성의 오차 빈도수를 생성된 증폭 산물의 뉴클레오티드 서열을 분석하여 확인했을 때, 본 발명의 방법에 의해 수득횐 증폭 산물에서 발견된 오차 빈도수는 고도로 동일하게 증폭시킬 수 있는 것으로 공지된 LA-PCR에 의한 것과 동일하였다. 다시 말해, 본 발명의 방법은 LA-PCR의 것과 동일한 고도의 동일성을 갖는다.
(6) 본 발명의 핵산 검출 방법 및 상기 방법을 위한 키트
본 발명의 핵산 증폭 방법을 사용하여 샘플중 핵산을 검출할 수 있다. 검출은 하기 방법을 포함한다:
(a) 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 핵산 증폭 방법에 의해 표적 핵산을 증폭시키고;
(b) 상기 단계에서 증폭된 핵산을 검출한다.
상기 단계 (a)에서, 주형으로서 RNA를 사용하는 경우 1단계에서 역전사 반응 및 핵산 증폭 반응이 수행될 수 있다. 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, 예로서, AMV RTase, MMLV RTase 또는 RAV-2 RTase 및 BcDNA 폴리머라제의 배합물을 리버스 트랜스크립타제 및 스트랜드 치환형 DNA 폴리머라제의 배합물로서 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명을 사용하여 샘플중에 특이적 유전자를 검출하거나 측량화할 수 있다. 즉, 특이적 유전자는 검출하거나 측량화된 형태이다. 즉, DNA 또는 RNA와 같은 핵산을 포함할 것으로 예측되는 모든 샘플로부터 특이적 유전자를 검출하거나 측량할 수 있다. 특이적 유전자가 검출하거나 측량화될 수 있는 샘플의 예는, 제한하는 것은 아니지만, 전체 혈액, 혈청, 백혈구층, 소변, 대변, 뇌척수액, 정액, 침, 조직(예: 종양 조직 또는 림프절) 및 세포 배양액(예: 포유류 세포 배양액 또는 박테리움성 세포 배양액)과 같은 유기체로부터의 샘플, 비로이드, 바이러스, 박테리움, 균류, 효모, 식물 및 동물과 같은 핵산을 포함하는 샘플, 바이러스 또는 박테리움와 같은 미생물로 오염되거나 감염된 샘플(예; 식품 또는 생물학적 제제), 및 토양 및 폐수와 같은 유기체를 포함할 수 있는 샘플을 포함한다. 예를 들면, 샘플중의 비로이드, 바이러스, 박테리움, 균류 또는 다른 미생물은 표적으로서 비로이드, 바이러스, 박테리움, 진균 또는 다른 미생물로부터 유래된 특이적 유전자의 존재 또는 함량에 기초하여 검출 또는 측량화될 수 있다. 특히 병원성 미생물을 검출하는 방법이 위생 및 환경 분야에서 유용하다. 또한, 본 발명의 방법을 사용하여 유기체의 유전자형을 식별하거나 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있다. 특히, 질병-관련 유전자, 예로서 세포의 암 유발과 관련된 유전자의 발현 상태를 검출하거나 확인하는 것이 의약 분야에서 유용하다. RNA 및 DNA 둘 모두를 검출 방법에서 주형으로서의 핵산으로 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명의 표적 핵산 검출 방법은 서열 표적 핵산의 뉴클레오티드의 사이를 식별하기 위하여 사용될 수 있다. 이 일면에서, 사용하고자 하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 3'-말단 부위가 식별하고자 하는 표적 뉴클레오티드 서열 의 특정 염기에 가깝게 위치하도록 작제한다. 예를 들면, 수소 결합이 프라이머의 3'-말단 부위 및 염기사이에 형성되도록 작제한다. 프라이머의 3'-말단 부위의 뉴클레오티드 서열 및 주형의 뉴클레오티드 서열 주형사이에 불일치가 존재하는 경우, 표적 핵산으로부터 증폭은 발생하지 않고 상기 언급한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭 산물은 생성되지 않는다. 점돌연변이(point mutation) 또는 단일염기변이 (SNP)와 같은 유전자의 특정 염기와 관련된 정보를 상기 방법을 사용하여 수득할 수 있다.
본 발명의 표적 핵산 검출 방법은 핵산을 포함하는 샘플로부터 직적 표적 핵산을 증폭시켜 수행할 수 있다. 이러한 경우, 증폭시키고자 하는 표적 핵산의 쇄 길이는 특정의 것으로 제한하지 않는다. 예를 들면, 200이하, 바람직하게 150 bp이하의 영역이 표적 핵산의 감수성 검출에 효과적이다. 샘플중 표적 핵산는 본 발명의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 작제하여 고감수성으로 검출하여 상기 기재된 바와 같이 증폭시키고자 하는 쇄를 얻을 수 있다.
또한, 표적 핵산은 완충 성분으로서 Bicine, Tricine, HEPES, 포스페이트 또는 트리스를 포함하는 반응 완충액 및 상기 (4)에 예시된 스퍼미딘 또는 프로필렌디아민을 포함하는 어닐링 용액을 사용하여 본 발명의 검출 방법에서 미량의 핵산 샘플로부터도 더욱 감수성으로 검출될 수 있다. 이 경우, 사용하는 엔도뉴클레아제 및 DNA 폴리머라제를 특정의 것으로 제한하지 않는다. 예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 피로코쿠스(Pyrococcus)속 세균 또는 아키오글로부스(archaeoglobus) 속 세균 및 Bca BEST 로부터의 RNae H의 배합물이 바람직하게 사용된다. 엔도뉴클레아제 및 DNA 폴리머라제의 바람직한 유니트수는 효소의 형태에 따라 달라질 수 있다고 예상된다. 그러한 경우, 완충액의 조성 및 첨가되는 효소의 양은 인덱스로서 증폭 산물의 양 또는 검출 감수성의 증가를 사용하여 조정될 수 있다.
본 발명의 검출 방법에서 표적 핵산의 증폭시 dUTP가 기질로서 삽입될 수 있다. 따라서, dUTP가 기질로서 사용되는 경우, 우라실 N-글리소키다아제 (UNG)를 사용하여 증폭 산물을 분해시켜 증폭 산물의 캐리-오버(glycosidase) 오염을 방지할 수 있다.
핵산 검출을 위한 공지된 방법을 단계 (b)를 위해 사용할 수 있다. 그러한 방법의 예는 전기영동에 의해 특정 크기를 갖는 반응산물의 검출, 및 프로브와 하이브리다이제이션시키는 검출을 포함한다. 에티디윰 브로마이드와 같은 형광 물질을 사용하여 전기 영동에 의한 검출에서 사용한다. 프로브를 사용하는 하이브리다이제이션을 전기영동에 의한 검출과 배합시킬 수 있다. 프로브는 방사성 동위 원소로 표지할 수 있거나 바이오틴과 같은 비-방사성 동위 원소 물질 또는 형광 물질로 표지할 수 있다. 또한, 단계 (a)에서 표지된 뉴클레오티드를 사용하여 증폭 산물의 검출을 촉진시킬 수 있다. 또한, 형광 편광법, 형광 에너지 전이 등을 검출을 위해 사용할 수 있다. 적절한 검출 시스템을 구측하여 핵산을 자동적으로 검출하거나 측량화할 수 있다. 또한 하이브리드 크로마토그래피에 의해 나안(naked eye)으로 검출하는 것이 바람직하게 사용될 수 있다.
소광 상태가 되는 거리에 위치한 두개 이상의 형광 물질로 표지된 리보뉴클 레오티드(RNA) 프로브를 본 발명의 검출 방법에 사용할 수 있다. 프로브는 형광을 발산하지 않는다. 그것이 프로브에 상보적인 핵산으로부터 증폭된 DNA에 어닐링되는 경우, RNase H가 프로브를 분해한다. 이어서, 프로브상에 형광 물질사이에 거리를 증가시켜, 형광을 발산시킨다, 발산은 핵산의 존재를 나타낸다. RNase H를 본 발명의 핵산 증폭 방법에서 사용하는 경우, 단지 프로브를 반응 혼합물에 첨가하여 핵산을 검출할 수 있다. 예를 들면, 형광 물질, 6-카복시플루오레슨(6-FAM) 및 N,N,N',N'-테트메틸-6-카복시로다민(TAMRA)의 혼합물을 프로브 표지용으로 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명은 추가로 상기 언급한 표적 핵산을 검출하는 방법에서 사용되는 프로브를 제공한다. 본 발명의 프로브는 정상 하이브리드화 조건하에서 본 발명의 핵산 증폭 방법에 의해 증폭된 표적 핵산에 하이브리드될 수 있는 한 특정의 것으로 제한하지 않는다. 증폭 산물의 특정 검출과 관련하여 조건 예를 들면, 본 분야의 기술자에거 엄격한(stringent) 조건으로 공지되어 있는 조건하에 혼성화하는 프로브가 바람직할 수 있다. 엄격한 하이브리드 조건은 예를 들면 [T. Maniatis et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory]에 기술되어 있다. 특히 엄격한 조건은 하기와 같이 예시된다: 사용되는 프로브의 Tm보다 낮은 약 25℃의 온도에서 4시간 내지 밤새도록 0.5% SDS, 5 x Denhardt's(0.1% 소혈청 알부민(BSA), 0.1% 폴리비닐피롤리돈, 0.1% Ficoll 400) 및 100μg/㎖ 살몬 정자 DNA를 포함하는 6 x SSC(1 x SSC : 0.15M NaCl, 0.015M 소듐 시트레이트, pH 7.0)중에서 인큐베이션. 상기 기재된 바와 같은 라벨을 갖는 프로브를 표적 핵산의 검출을 촉진하는 프로브로서 사용할 수 있다.
본 발명의 등온 조건하에서 핵산 증폭 방법은 열 싸이클러와 같은 장치의 사용을 필요로 하지 않는다. 본 발명의 증폭 방법에서 사용되는 프라이머의 수는 통상의 방법에서 사용되는 것보다 적은 하나 또는 둘이다. PCR용 dNTPs 등과 같은 시약을 본 발명의 방법에 사용하기 때문에, 통상의 방법과 비교하여 러닝 코스트(running cost)를 감소시킬 수 있다. 그러므로, 본 발명의 방법은 검출을 항상 수행하는 유전자 시험을 포함하는 분야에서 바람직하게 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 PCR 방법보다 더욱 단시간에 증폭 산물을 대량으로 제공한다. 그러므로, 본 발명의 방법은 편리하고 신속하고 민감한 유전자 검출 방법으로서 사용될 수 있다.
게놈 수준으로 유전자 분석에서 다량의 뉴클레오티드 서열을 분석하기 위하여 반응 시스템을 축소화하고 통합(integraion) 정도를 증가시키기 위해 시도되고 있다. 게놈 분석을 위한 기본 공정(예: 세포로부터 DNA 추출, DNA 증폭 반응, 전기영동, 하이브리드화, 관심의 대상이 되는 DNA 검출 등)을 핑거팁(fingertip) 크기로 여러 사각 센티메터의 마이르코칩상에 통합시키는 최근 초미새 공정 기술을 사용하여 상기 목적을 위해 시스템이 개발되고 있다. 그러한 시스템을 마이크로 칩 또는 나노칩으로 명명한다.
유전자 증폭 반응으로서 시스템에 PCR의 적용이 현재 고려되고 있다. 그러 나, PCRs은 시간에 따라 온도를 반복적으로 상하 조정하는 수단을 필료로하기 때문에 시스템은 복잡할 것이다. 반대로 본 시스템은 등온 조건하에서 핵산을 증폭시킬 수 있는 본 발명의 방법을 사용하여 단순화될 수 있기 때문에 상기 기술된 바와 같이 통합 시스템을 위해 본 방법을 매우 적절하게 이용한다.
(7) 본 발명의 키트
본 발명은 상기 기재된 본 발명의 핵산을 증폭 또는 검출하기 위한 키트를 제공한다. 일례에서, 키트는 패키지 형태(packaged form)이고 스트랜드 치환 반응과 관련하여 DNA 폴리머라아제 및 엔도뉴클레아제의 사용과 관련된 안내서를 포함한다. 또한, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제, 엔도뉴클레아제, 및 스트랜드 치환 반응용 완충액을 포함하는 키트가 본 발명의 방법에서 바람직하게 사용된다. 또한, 상업적으로 사용가능한 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제 및/또는 엔도뉴클레아제을 안내서에 따라 선택하고 사용할 수 있있다. 또한, RNA를 주형으로서 사용하는 경우, 키트는 사용되는 역전사 반응용 시약을 포함할 수 있다. DNA 폴리머라아제는 상기 (3)에 기재된 바와 같이 본 발명에서 사용되는 DNA 폴리머라아제들로부터 선택될 수 있다. 엔도뉴클레아제는 상기 (2)에 기재된 바와 같은 엔도뉴클레아제들로부터 선택할 수 있다. 상기 (4)에 기재된 바와 같은 반응 완충액 조성을 갖는 것을 바람직하게 스트랜드 치환 반응용 완충액으로서 사용할 수 있다.
"안내서"는 키트 사용법, 예를 들면, 스트랜드 치환 반응용 시약 용액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단 지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명의 키트는 추가로 상기 (4)에 예시된 어닐링 용액 및 완충 성분으로서 Bicine, Tricine, HEPES, phosphate 또는 tris를 포함하는 반응 완충액을 포함할 수 있다. 추가로, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 및 RNase H를 포함할 수 있다. 또한 키트느 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 유사체를 포함할 수 있다.
표적 핵산을 검출하는 방법에서 사용되는 키트는 상기 기술된 바와 같은 안내서 및 증폭 반응용 시약외에 표적 핵산을 증폭시키기 위한 적절한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 증폭된 표적 핵산을 검출하는 시약 예로서 프로브를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 본 발명에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및/또는 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 프로브를 포함한느 키트를 포함한다.
(8) 본 발명의 조성물
본 발명은 상기 기술된 본 발명의 핵산을 증폭시키는 방법 또는 본 발명의 핵산을 검출하는 방법에서 사용되는 조성물을 제공한다. 예를 들면, 조성물은 상기 (2)에 기술된 엔도뉴클레아제 및 (3)에 기술된 DNA 폴리머라제를 포함할 수 있다. 조성물은 증폭 반응을 수행하기 위한 성분으로서 또한 완충 성분, 마그네슘 염, dNTPs 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 상기 (4)에 기술된 것은 완충 성분 및 다른 첨가체로서 사용될 수 있다.
특히 바람직한 일면으로 조성물은 본 발명의 핵산 증폭 방법을 위해 상기 나열된 다양한 성분을 적절한 양으로 포함할 수 있다. 증폭 반응은 단지 적절한 주형 및 키메라성 올리고뉴클레오티드(들)를 조성물에 가하여 수행될 수 있다. 증폭시키고자 하는 목적물이 앞서 공지된 경우 조성물은 바람직하게 목적물을 증폭시키기에 적절한 키메라성 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
(9) 본 발명의 미리 정해진 영역에 배열되고 고정화된 핵산을 갖는 물질 및 그를 제조하는 방법.
DNA 칩(또는 DNA 마이크로어레이 또는 DNA 어레이로서 언급함)은 그것에 다양한 유전자 단편 또는 DNAs가 슬라이드 글라스와 같은 고체 기질상의 미리 정해진 영역 또는 미리 정해진 위치에 배열되고 고정화된, 고정화된 핵산을 갖는 물질이다. DNA 칩은 DNA 칩상에 미리 정해진 영역에 배열되고 고정화된 DNA에 상보적인 서열을 갖는 핵산의 핵산 샘플중의 존재 여부를 조사하기 위해 사용된다. 하이브리다이제이션시키기 위해 DNA 칩을 샘플, 바람직하게 표지된 핵산 샘플로부터 제조된 핵산 샘플과 접촉시킨다. 하나의 방법에서 DNA 칩을 사용하여 샘플중의 핵산을 검출하거나 핵산의 수를 측량할 수 있기 때문에, 그것은 유전자 발현 분석, 또는 돌연 변이 또는 다형(polymorphism)의 분석을 매우 효과적으로 촉진시키는 유용한 방 법이다. 더블-스트랜드 핵산이 미리 정해진 영역에 배열되고 고정화된 DNA 칩은 적절히 변성시킨 후에 하이브리다이제이션을 위해 사용한다. 검출되는 핵산에 상보적인 싱글-스트랜드 DNA가 미리 정해진 영역에 배열되고 고정화된 DNA 칩이 핵산 검출용으로 특히 바람직할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 원하는 DNA를 본 발명의 방법에 의해 싱글-스트랜드 형태로 증폭시킬 수 있다. 증폭 산물을 정제시키는 어느 방법도 사용될 수 있지만, 이소프로판올 침전을 사용하는 정제법이 바람직할 수 있다. 그렇게 수득한 DNA, 바람직하게 실질적으로 그의 상보적 스트랜드가 없는 싱글-스트랜드 DNA를 바람직하게 DNA 칩상에 고정하고자 하는 DNA 단편으로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법을 DNA 칩을 생산하기 위해 미리 정해진 영역에 배열되고 고정하고자 DNA를 제조하는 방법으로서 바람직하게 사용한다. 어느 불용성 기질도 그렇게 수득한 DNA를 그것위에 미리 정해진 영역에 배열하고 고정화하는 기질로서 사용할 수 있지만, 글래스 또는플라스틱으로부터 제조된 프레이트-형태의 기질, 및 니트로셀룰로오스 또는 나일론으로부터 제조된 막-형태의 기질을 바람직하게 사용한다. 고정화시키는 공지된 방법을 사용하여 핵산을 고정화시킬 수 있다. DNA는 그대로 기질상의 고정화될 수 있다. 또한, DNA는 적절한 링커(linker)를 통해 고정화될 수 있거나 다수의 DNA 분자를 결찰(ligating)시켜 고정화될 수 있다. 또한, 변형된 데옥시리보뉴클레오티드는 본 발명의 생산 방법에 의해 증폭된 핵산 내로 삽입될 수 있기 때문에 고정화된 핵산을 갖는 물질은 변형 그룹을 사용하여 생산될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 증폭된 DNA가 미리 정해진 영역에 배열되고 고정화 된, 고정화된 핵산을 갖는 물질(예: DNA 칩)상에서 핵산과 하이브리다이제이션되는 핵산을 검출 또는 측량할 수 있다. 그러한 검출 또는 측량은 핵산을 함유할 것으로 예상되는 샘플로부터 제조된 핵산 샘플과 물질을 접촉시켜 하이브리다이제이션시켜 수행될 수 있다. 이들 중에서, 본 발명의 방법에 의해 증폭된 싱글-스트랜드 DNA가 미리 정해진 영역에 배열되고 고정화된 DNA 칩은 통상의 물질과 비교하여 더욱 편리하고 높고감도 및 더욱 높은 생산력으로 핵산을 검출할 수 있게 한다.
(10) 본 발명의 핵산을 대량으로 생산하는 방법
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 일면은 등온 조건하에서 수행될 수 있는 핵산 증폭 방법을 제공한다. 증폭되는 핵산을 위해 주형으로서 핵산 및 반응을 위해 필요한 다양한 성분을 혼합하고 등온 조건하에서 혼합물을 반응시키는 방법에 의해 바람직한 핵산을 생산할 수 있다. PCR 방법은 시간동안 반응 혼합물의 온도를 변화시켜야 하기 때문에, 온도를 조정할 수 있는 반응 용량(일반적으로, 200㎕ 이하)의 것으로 제한한다. 그러므로, 용량을 증가시키는 것은 어렵다. 한편, 본 발명의 방법에는 그러한 제한은 없다. 반응 혼합물의 용량을 증가시켜 다량의 핵산을 생산할 수 있다. 본 발명의 방법에서 용량은 예를 들면 바람직하게 200㎕이상, 더욱 바람직하게 300㎕ 이상 가장 바람직하게 500㎕ 이상이고 이는 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 발명의 방법에서 다수의 상보적 스트랜드 분자를 하나의 주형 분자로부터 합성한다. 또한, 주형들로서 이들 상보적 스트랜드 분자들을 사용하여 핵산을 합성할 수 있다. 따라서, 적절하게 주형 및 프라이머를 선택하여 원하는 핵산을 효율적으로 다량 생산할 수 있다. 또한, PCR 방법과는 달리, 본 발 명의 방법은 특정 장치 또는 복잡한 온도 변화를 요구하지 않는다는 사실이 장치 및 에너지 비용과 관련하여 그것을 이롭게 한다. 그러므로, 상기 방법은 핵산을 다량 생산하는 산업상 우수한 방법이다.
관심의 대상이 되는 핵산은 (4)에 예시된 것과 같은 반응 완충액 및 어닐링 용액을 사용하여 본 발명의 검출 방법에서 미량의 핵산으로부터도 증폭되거나 생산될 수 있다. 이 경우, 사용하는 엔도뉴클레아제 및 DNA 폴리머라제를 특정의 것으로 제한하지 않는다. 예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 Bca BEST 로부터의 RNae H의 배합물이 바람직하게 사용된다. 엔도뉴클레아제 및 DNA 폴리머라제의 바람직한 유니트수는 효소의 형태에 따라 달라질 수 있다고 예상된다. 그러한 경우, 완충액의 조성 및 첨가되는 효소의 양은 인덱스로서 증폭 산물의 양 또는 검출 감수성의 증가를 사용하여 조정될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 DNA 칩상에 고정하고자 하는 것과 같은, 다양한 DNA 단편을 다량 공급하는 방법으로서 유용하다. 특히, 일례에서 DNA 단편을 단순 반응 단계에서 다량 수득할 수 있다. 또다른 일례에서, 제한된 수의 프라이머드을 사용하여 다양한 DNA 단편을 수득할 수 있다. PCR 방법과 같으 공지된 핵산 증폭 방법에 의해 앞서 본 발명의 방법에서 주형으로서 작용하는 핵산을 증폭시키는 단게를 이후의 일례에서 인용할 수 있다. 예를 들면, 태그 서열을 갖는 무작위 프라이머를 사용하여 핵산을 증폭시키는 방법(Nucleic Acids Reseach, 24(19):3778-3783(1996)) 또는 축퇴 프라이머를 사용하는 축퇴-올리고뉴클레오티드-프라임드 PCR(DOP-PCR, Genomics, 13:718-725(1992))에 기초하여, 주형으로서 모든 종류의 핵산을 제한된 수의 프라이머를 사용하여 증폭시킬 수 있다. 주형으로서 상기 언급된 단계에서 제조된 모든 핵산에 대한 일부의 프라이머중 하나를 사용하여 본 발명의 핵산 증폭 방법을 수행할 수 있다. 이것은 그것을 무작위 또는 축퇴 프라이머에 첨가된 태그 서열에 일치시키기 위해 본 발명의 증폭 방법에서 사용되는 프라이머를 디자인하여 수행될 수 있다. 따라서, 주형으로서 핵산을 제조하는 적절한 단계 및 본 발명의 방법을 결합시킴으로써 통상의 방법과 비교하여 더욱 저렴한 비용으로 다양한 DNA 단편을 다량 공급할 수 있다.
핵산을 포함하는 약제학적 조성물은 세포중에서 유용한 폴리펩티드를 발현시키는 더블-스트랜드 DNA 또는 관심의 대상이 되는 유전자의 발현을 억제하는 싱글-스트랜드 안티센스 DNA를 포함할 수 있다. 적절한 방법, 예를 들면, 리보솜과 같은 유전자 전달용 전달체를 사용하여 그러한 핵산을 유기체내로 투여한다. 의료용 싱글-스트랜드 또는 더블-스트랜드 핵산을 다량 생산하기 위해 본 발명의 핵산 제조 방법이 바람직할 수 있다. 또한, 예를 들면, 생체내에서 핵산의 축퇴를 억제시키는, dNTP 유사체를 포함하는 핵산을 본 발명의 방법에 의해 용이하게 생산할 수 있다.
본 발명에서 증폭된 DNA 단편은 표준의 뉴클레오티드로 구성되기 때문에, DNA중에 제한효소 부위를 사용하여 증폭된 DNA는 적절한 벡터내로 서브클로닝될 수 있다. 또한, 예를 들면, DNA는 별 문제없이 RFLP용 제한 효소로 처리될 수 있다. 그러므로, DNA는 유전자 시험 분야에서 광범위하게 사용될 수 있다. 또한, RNA 폴리머라제를 위한 프로모터 서열을 증폭된 단편내로 혼입시킬 수 있다. 예를 들면, 증폭된 단편을 주형으로서 사용하여 프로브로서 사용할 수 있는 RNA를 합성할 수 있다. 물론, 표준 dNTP를 대신하여 형광-표지된 dNTP를 사용하여 본 발명의 뉴클레오티드 증폭 방법을 수행하여 형광-표지된 DNA 프로브를 생산할 수 있다.
본 발명의 방법에서 최종적으로 증폭된 단편이 양단에 증폭용 프라이머에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖지 않기 때문에, 증폭 산물의 캐리-오버(carry-over)에 기인하는 오염을 줄일 수 있다. 그러므로, 본 발명의 방법은 동일한 영역을 계속하여 증폭시키는 유전자 시험 등에서 유용하다.
본 발명의 핵산 증폭 방법의 특징을 하기에 나열한다.
1. 소량의 주형으로부터 다량의 핵산을 증폭시킬 수 있다. 두개의 프라이머를 사용하는 경우 증폭 산물은 2차 함수적으로 증가한다.
2. 등온으로 수행될 수 있다. 이러한 경우, 열 싸이클러와 같은 장치의 사용을 필요로 않는다. 그러므로, 반응 용량을 용이하게 증가시킬 수 있다.
3. 일반적으로, 하나 또는 두개의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 주개의 효소(DNA 폴리머라제 및 엔도뉴클레아제)를 사용하여 증폭 반응을 수행한다.
4. 다수의 DNA 스트랜드가 한 분자의 프라이머로부터 합성될 수 있기 때문에, 프라이머의 양이 증폭 산물의 양을 제한하지 않는다. 또한, 프라이머 사용 효율은 PCR 방법의 것과 비교하여 더욱 높은 약 100%이다.
5. 목적에 따라 싱글-스트랜드 또는 더블-스트랜드를 선택적으로 증폭시킬 수 있다.
6. 그것은 증폭 반응을 위해 (α-S) dNTP와 같은 dNTP 유사체를 필요로 하지 않기 때문에, 시약의 비용은 저렴하다. 또한, dNTP 유사체 없이 천연 형태의 핵산을 수득할 수 있다.
7, 본 발명의 방법을 또다른 핵산 복제 방법과 결합하여 저렴한 비용으로 증폭된 DNA 단편을 다량 공급할 수 있다.
8. 본 발명은 핵산의 증폭, 자동화된 검출, 마이크로칩 또는 나노칩상에서의 소량 검출 및 고도로 통합된 검출에 적절하다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 상업상 핵산을 생산하는 것이 적절하다.
본 발명을 실시예에 따라 더욱 구체적으로 설명하며, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
참고예 1: 호열성 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터 RNase H 제조
바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax) YT-G (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen로부터 구입; DSM406)를 0.2% Trytone(Difco laboratories) 및 1.5% 효모 추출액(Difco laboratories)을 포함하는 100㎖의 배지에 접종하고, 진탕시키면서 140분동안 60℃에서 배양하고 예비-배양액으로서 사용하였다. 30㎖의 예비-배양액을 동일한 조성물을 갖는 3L의 배지에 접종하고 2.5L/분에서 에어레이션시키면서 5시간동안 60℃의 온도에서 250rpm으로 교반하면서 배양하였다.
세포를 원심분리에 의해 회수하고 15분동안 5000 x g 에서 배양하였다. 402g(습윤상태의 중량)의 세포를 10 mM 머캅토에탄올, 0.1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 1mM EDTA 및 20μM PAPMSF를 포함하는 1000㎖의 50mM tris-HCl 완충액(pH 7.5)에 현탁시키고 MINI-Lab(APV GAULIN/RANNIE)를 사용하여 파열시켰다. 세포 브리스를 원심분리에 의해 제거하고 상층액을 수득하였다.
폴리에틸렌 이민 용액을 0.1%의 최종 농도로 생성된 상층액에 가하였다. 교반한 후, 혼합물을 1시간동안 방치시켰다. 이어서 상층액을 원심분리에 의해 회수하였다. 황산암모늄을 50% 포화도로 상층액에 가하였다. 원심분리에 의해 수득한 침전물을 10 mM 머캅토에탄올, 0.1 mM EDTA, 50 mM NaCl 및 10% 글리세롤를 포함하는 20mM tris-HCl 완충액(pH 7.5)에 용해시켰다. 용액을 동일한 완충액에 대하여 투석시켰다. 투석된 샘플을 동일한 완충액으로 평형화된 280-ml DE52 칼럼 (Whatman)상에 로딩하고 비-흡착성 분획을 회수하였다.
칼럼을 추가로 평형화에 사용된 420㎖의 완충액으로 세척하고 세척 분획을 회수하였다. DE52 칼럼 크로마토그래피로부터의 비-흡착성 분획 및 세척 분획을 혼합하고 10 mM 머캅토에탄올, 0.1 mM EDTA, 50 mM NaCl 및 10% 글리세롤를 포함하는 20mM tris-HCl 완충액(pH 7.5)으로 평형화된 20 mM tris-HCl 완충액(pH 7.5)으로 평형화된 240-ml P-11 칼럼 크로마토그래피(Whatman)상에 로딩하였다. 이어서 0 내지 0.5M NaCl을 포함하는 평형 완충액을 사용하여 용출시켰다.
생성된 활성 분획을 투석 튜브에 놓앗다. 튜브를 4℃에서 탈수-농축을 위해 고체 폴리에틸렌 글리콜 20000상에 놓았다. 이어서 효소 농축물을 5 mM 머캅토에탄 올, 0.5 mM EDTA, 30 mM NaCl 및 50% 글리세롤를 포함하는 25mM tris-HCl 완충액(pH 7.5)으로 평형화된 300 mM Superdex G-2000 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)상에 로딩하였다. 평형에 사용된 완충액을 사용하여 용리시켜 활성 분획을 수득하였다. 활성 분획을 10 mM 머캅토에탄올, 0.1 mM EDTA, 50 mM NaCl 및 10% 글리세롤를 포함하는 20mM tris-HCl 완충액(pH 7.5)으로 평형화된 15-ml 헤파린-세파로스 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)상에 로딩하였다. 이어서 0 내지 0.5M NaCl을 포함하는 평형 완충액을 사용하여 용출시켰다.
생성된 활성 분획을 10 mM 머캅토에탄올, 0.1 mM EDTA, 50 mM NaCl 및 10% 글리세롤를 포함하는 20mM tris-HCl 완충액(pH 7.5)으로 평형화된 5-ml Hitrap-SP칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)상에 로딩하였다. 이어서 0 내지 0.5M NaCl을 포함하는 평형 완충액을 사용하여 용출시켰다. 생성된 활성 분획을 5 mM 머캅토에탄올, 0.5 mM EDTA, 30 mM NaCl 및 50% 글리세롤를 포함하는 25mM tris-HCl 완충액(pH 7.5)으로 평형화된 5-300-ml Superdex G-200 칼럼 (Amersham Pharmacia Biotech)상에 다시 로딩하였다. 생성된 활성 분획을 RNase H 샘플(효소 용액)으로 사용하였다.
열-내성 RNase H 활성을 하기와 같이 측정하였다:
1 mg의 poly(rA) 또는 poly(dT) (Amersham Pharmacia Biotech로부터 모두 입수)를 1 mM EDTA를 포함하는 1 ml의 40 mM tris-HCl (pH 7.7)에 용해시켜 poly(rA) 용액 및 poly(dT) 용액을 제조하였다.
poly(rA) 용액(20μg/㎖의 최종 농도) 및 poly(dT)(30μg/㎖의 최종 농도) 을 이어서 4mM MgCl2, 1mM DTT, 0.003% BSA 및 4% 글리세롤를 포함하는 40mM tris-HCl 완충액(pH 7.7)에 가하였다. 혼합물을 10분동안 37℃에서 반응시킨 후 4℃으로 냉각시켜 켜 poly(rA) 용액-poly(dT) 용액을 제조하였다.
1 ㎕의 효소 용액을 100 ㎕의 poly(rA) 용액-poly(dT) 용액에 가하였다. 혼합물을 40℃에서 10분동안 반응시켰다. 10 ㎕의 0.5M EDTA를 가하여 반응을 종결시켰다. 260nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로서 10 ㎕의 0.5M EDTA를 가하고 생성된 혼합물을 10분동안 40℃에서 반응시킨 후 흡광도를 측정하였다. EDTA가 존재하지 않은 반응에서의 흡광도로부터 대조군의 흡광도를 감하여 값(흡광도 차)을 수득하였다. 따라서, 효소 반응에 의한 poly(rA) -poly 하이브리드으로부터 유리된 뉴클레오티드의 농도를 흡광도 차에 기초하여 측정하였다. 1 유니트의 RNase H는 하기 식에서 계산되는 10분후 1nmol의 리보뉴클레오티드의 유리에 상응하여 A260를 증가시키는 효소의 양으로 정의된다. 희석된 효소 용액을 사용하는 경우 하기 식을 상요하여 얻은 값은 희석율에 기초하여 보정되었다:
유니트 = [흡광도 차 x 반응 용량(㎖)] / 0.0152
참고 실시예 2: 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax) RNase HII 유전자의 클로닝
(1) 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터 게놈 DNA 제조
바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax) YT-G (DSM406)를 60㎖의 LB 배지(1% Trytone, 0.5% 효모 추출액 및 0.5% NaCl, pH 7.2)에 접종하고, 20시간동 안 배양하였다. 배양후 배양액을 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포를 2㎖의 25% 수크로오스 및 50mM tris-HCl(pH 8.0)에 현탁시켰다. 물중 0.2㎖의 10mg/㎖의 리소자임 클로라이드(Nacalai Tesque)를 가하였다. 혼합물을 1시간동안 20℃에서 반응시켰다. 반응 후, 150mM NaCl, 1mM EDTA 및 20mM tris-HCl(pH 8.0), 0.1㎖의 20mg/㎖ 프로테이나제 K(Takara Shuzo) 및 1㎖을 10% 소듐 라우릴 설페이트 수용액을 포함하는 12㎖의 혼합물을 반응 혼합물에 가하였다. 혼합물을 1시간동안 37℃에서 인큐베이션시켰다.
2.1㎖의 5M NaCl 및 2㎖의 CTAB-NaCl 용액[10% 세틸트리메틸 암모늄 브로마이드(Nacalai Tesque) 및 0.7M NaCl]을 혼합물에 가하여 생성된 혼합물을 완전하게 혼합하고 10분동안 65℃에서 인큐베이션시켰다. 동량의 클로로포름/이소아밀 알콜의 혼합물(24:1, v/v)를 가하였다. 생성된 혼합물을 10분동안 서서히 혼합하고 10000 x g에서 10분동안 65℃에서 인큐베이션시켰다. 원심분리후, 동량의 100mM tris-HCl(pH 8.0)으로 포화된 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜의 혼합물(25:24:1, v/v)을 생성된 상층액에 가하였다. 0.6 용량의 2-프로판올을 생성된 상층액에 가하였다. 생성된 섬유성 친전물을 글래스 바를 사용하여 감고, 물중 70% 에탄올로 세척하고 공기-건조시킨 후 0.5㎖의 TE 완충액에 용해시켜 게놈 DNA 용액을 수득하였다.
(2)RNase HII 유전자의 중간 부위 클로닝
서열번호 1 및 2로 나타낸 올리고뉴클레오티드 BsuII-3 및 BsuII-6를 다양한 유기체(Biochemistry, 38:605-608 (1999))로부터 RNase HIIs의 아미노산 서열중 보 존되는 부위인 Motif I 및 Motif III에 기초하여 합성하였다.
주형으로서 참고 실시예 (2)-1에서 제조된 것과 같은 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax) 게놈 DNA 용액 1 ㎕, 및 프라이머로서 100pmol의 BsuII-3 및 100pmol의 BsuII-6 을 사용하여 PCR을 100 ㎕으로 수행하였다. TaKaRa Taq 폴리머라제(Takara Shuzo)를 첨부된 프로토콜에 따른 PCR용 DNA 폴리머라제로서 사용하였다. PCR을 하기와 같이 수행하였다: 30초동안 94℃, 30초동안 45℃, 1분동안 72℃에서 50싸이클. 반응 후, 반응 혼합물을 페놀로 처리하여 에탄올 침전시켜 DNA를 정제하였다. 생성된 DNA를 T4 DNA 폴리머라제(Takara Shuzo)를 사용하여 말단을 둔화(blunt-ended)시키고 아가로스 겔 전기영동시켜 겔로부터 약 0.4kb의 증폭된 DNA 단편을 회수하였다. 약 0.4kb의 DNA 단편을 사용하여 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109로 형질전환시켰다. 생성된 형질전환체를 배양하여 0.4kb의 DNA이 삽입되는 플라스미드 21-12를 수득하였다.
(3) RNase HII 유전자의 상류 부위 클로닝
참고 실시예 2-(2)에서 수득한 플라스미드 21-12내 0.4kb의 삽입된 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 서열번호 3 및 4로 나타낸 올리고뉴클레오티드 RNII-S1 및 RNII-S2를 결정된 뉴클레오티드 서열에 기초하여 합성하였다.
참고 실시예 2-(1)에서 제조된 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax) 게놈 DNA 를 BamHI(Takara Shuzo)로 분해하고 T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 Sau3AI 카세트(Takara Shuzo)로 결찰시켰다. 시험관내 클로닝 키트(Takara Shuzo)내 TaKaRa LA PCR에 첨부된 프로토콜에 따라 주형으로서 결찰 혼합물, 1차 PCR용 프라이머로서 RNII-S2 및 2차 PCR용 프라이머로서 RNII-S1을 사용하여 공정을 수행하였다. 2차 PCR후 페놀 추출에 의해 DNA를 용액으로부터 정제한 후 에탄올 침전시켰다. DNA를 T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 말단을 둔화시키고 아가로스 겔 전기영동시켜 겔로부터 약 1.5kb의 증폭된 DNA 단편을 회수하였다. 약 1.5kb의 DNA 단편을 사용하여 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109로 형질전환시켰다.
생성된 형질전환체를 배양하여 약 1.5kb의 DNA이 삽입된 플라스미드 B25N16을 수득하였다.
(4) 전장 RNase HII 유전자의 클로닝
참고 실시예 2-(3)에서 확인된 플라스미드 21-12내 0.4kb의 삽입 단편의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 서열번호 5 및 6으로 나타낸 올리고뉴클레오티드 RNII-S5 및 RNII-S6을 합성하였다.
주형으로서 참고 실시예 2-(2)에서 제조된 플라스미드 21-12, 및 프라이머로서 RNII-S5 및 RNII-S6를 사용하여 PCR을 수행하였다. TaKaRa EX Taq 폴리머라제(Takara Shuzo)를 첨부된 프로토콜에 따른 PCR용 DNA 폴리머라제로서 사용하였다. PCR을 하기와 같이 수행하였다: 30초동안 94℃, 30초동안 55℃, 30초도안 72℃에서 25싸이클. 반응 후, 반응 혼합물을 아가로스 겔 전기영동시켰다. 약 0.3kb의 증폭된 DNA 단편을 겔로부터 회수하였다. 약 0.3kb의 DNA 단편을 DIG-프라임(Roche Diagnostics)를 사용하여 다이곡시제닌(digoxigenin)으로 표지하였다.
HindIII (Takara Shuzo), Sac I (Takara Shuzo), 또는 HindIII 및 SacI을 사용한 참고 실시예 2-(1)에서 제조된 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax) 게 놈 DNA의 분해물에 대하여 프로브로서 다이곡시제닌-표지된 DNA를 사용하여 서던 하이브리드화하였다. 하이브리드화 및 검출은 첨부된 프로토콜에 따라 DIG Luminescent Detection Kit (Roche Diagnostics)을 사용하여 수행하였다. 결과 약 4.5 kb, 약 5.8 kb 및 약 1.3 kb의 DNA 단편이 각각 HindIII, SacI, 및 HindIII 및 SacI을 사용한 분해물에 대하여 프로브와 하이브리드하였다.
이 결과에 기초하여, 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax) 게놈 DNA를 HindIII로 분해하고 아가로스 겔 전기영동시켜 겔로부터 약 4.5 kb DNA를 회수하였다. 생성된 DNA 단편을 SacI로 분해하고 아가로스 겔 전기영동시켜 겔로부터 약 1.3 kb DNA를 회수하였다. 생성된 DNAs를 T4 DNA 리가제를 사용하여 HindIII 및 SacI으로 분해된 pUC19 (Takara Shuzo)와 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) HB101을 형질전환시켰다.
생성된 형질전환체를 Hybond-NTM (Amersham Pharmacia Biotech)상에 리플리카-플레이팅(replica-plated)시켰다. 이어서 통상의 방법에 따라 디곡시제닌-표진된 프로브를 사용하여 콜로니 하이브리드화를 수행하였다. 그렇게 수득된 양성 클론으로부터 플라스미드 pRHB1을 제조하였다.
pRHB1내로 삽입된 DNA의 뉴클레오티드 서열을 확인하였다. 뉴클레오티드 서열로부터 유도된 아미노선 서열을 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilis)로부터의 아미노선 서열과 비교하여 개시 코돈으로부터 약 40bp 부위가 pRHB1 DNA에서 결손(missing)되어있음을 제안하였다. 이어서 전장의 RNase H 유전자를 하기와 같이 작제하였다.
참고 실시예 2-(3)에서 제조된 B25N16를 HindIII로 분해하고 아가로스 겔 전기영동시켜 겔로부터 약 160bp의 DNA 단편을 회수하였다. 약 160bp의 DNA 단편을 T4 DNA 리가제를 사용하여 HindIII 분해된 pRHB1와 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) HB101을 형질전환시켰다. 생성된 형질전환체로부터 플라스미드를 제조하였다.
이어서, 서열번호 7로 나타낸 올리고뉴클레오티드 RNII-Nde를 개시코돈 주위의 가정의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 합성하였다. PCRs를 주형으로서 형질전환체로부터 제조된 플라스미드, 및 프라이머로서 RNII-Nde 및 RNII-S6를 사용하여 수행하였다. 약 0.7kb의 DNA 단편이 증폭되는 플라스미드를 선별하고 pRHB11로서 작제하였다.
그렇게 수득된 플라스미드 pRHB11내로 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열울 확인하였다. 결과를 분석하여 RNase HII를 코딩할 것으로 가정된 오픈 리딩 프레임을 밝혀냈다. 이 뉴클레오티드 서열을 서열번호 8에 나타낸다. 뉴클레오티드 서열로부터 유도된 RNase HII의 아미노산 서열은 서열번호 9에 나타낸다.
플라스미드 pRHB11로 형질전화된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) HB101를 작제하고 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109/pRHB11로 지정하고 2000년 9월 6일(원 기탁일)에 수탁번호 FERM BP-7655로 International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central(6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566)에 기탁하였다.
(5) 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax) HII 유전자의 발현
pRHB11 또는 pRHB1로 형질전환 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) HB101를 100μg/㎖의 앰피실린을 포함하는 5㎖의 LB 배지내로 접종하고 37℃에서 밤새도록 진탕시키면서 배양하였다. 배양후, 원심분리에 의해 회수한 세포를 0.5㎖의 TE 완충액에 현탁시키고 초음파처리하였다. 원심분리에 의해 수득한 상층액을 사용하여 세포 원(crude) 추출물로서 사용하였다.
10mM tris-HCl(pH 8.0), 1mM 디티오트레이티올(Nacalai Tesque), 0.003% 소 혈청 알부민(분획 V, Sigma), 4% 글리세롤, 20μg/㎖ poly(dT)(Amersham Pharmacia Biotech) 및 30μg/㎖ poly(rA)(Amersham Pharmacia Biotech)를 함께 혼합하였다.혼합물을 10분동안 37℃에서 인큐베이션시키고 RNase H 활성 측정을 위한 기질 용액으로서 사용하였다.
1 ㎕의 1M MnCl2의 100 ㎕의 기질 용액에 가하였다. 혼합물을 40℃에서 인큐베이션시켰다. 10 ㎕의 세포 원추출물의 10배 희석액을 혼합물에 가하여 반응을 개시시켰다. 30분동안 40℃에서 반응시킨 후, 10 ㎕의 0.5M EDTA를 가하여 반응을 종결시켰다. 260nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과, pRHB11를 포함(harboring)하는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) HB101로부터 제조된 세포 원추출액을 사용한 반응으로부터의 260nm에서의 흡광도가 pRHB1을 포함하는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) HB101로부터 제조된 세포 원추출액을 사용한 반응으로부터의 260nm에서의 흡광도보다 고도로 높았다. 따라서, pRHB11이 RNase H를 포함하 고 pRHB1을 포함하는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)가 RNase H 활성을 발현시킨다는 것이 입증되었다.
(6) 정제된 RNase HII 샘플의 제조
참고 실시예 2-(4)에서 수득된 pRHB11로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) HB101를 100μg/㎖의 앰피실린을 포함하는 1L의 LB 배지내로 접종하고 37℃에서 16시간동안 진탕시키면서 배양하였다. 배양후, 원심분리에 의해 회수한 세포를 52.3의 초음파 처리 완충액[50mM tris-HCl(pH 8.0), 2mM 2-머캅토에탄올, 10% 글리세롤, 2mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드]에 현탁시키고 초음파처리하였다. 10분동안 12000rpm에서 초음파 처리된 현탁액을 원심분리하여 수득한 상층액을 15분동안 60℃에서 가열하였다. 10분동안 다시 12000rpm에서 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 따라서, 50.0㎖의 가열된 상층액을 수득하였다.
용액을 완충액 C[50mM tris-HCl(pH 8.0), 2mM 2-머캅토에탄올, 10% 글리세롤]으로 평형화된 RESOURSE Q 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용하고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 결과, RNase H는 RESOURSE Q 칼럼을 통해 이동(flow)하였다. 51㎖의 이동(flow-through) RNase H 분획을 완충액 C으로 평형화된 RESOURSE Q 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 0 내지 500mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 240mM NaCl로 용출된 RNase II를 포함하는 분획을 수득하였다. 30㎖의 RNase H 분획을 50mM NaCl을 포함하는 완충액 C으로 평형화된 PD-10 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 2부분으로 적용시켰다. 7.0㎖의 생성된 용출액을 50mM NaCl을 포함하는 완충액 C으로 평형화된 HiTrap-heparin 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 50 내지 550mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 310mM NaCl로 용출된 RNase II를 포함하는 분획을 수득하였다. 4.4㎖의 RNase H 분획을 한외여과에 의해 Centricon-10(Amicon)을 사용하여 농축시켰다. 280 ㎕의 농축액을 100mM NaCl 및 0.1mM EDTA를 포함하는 50mM Tris-HCl(pH 8.0)로 평형화된 Superdex 20 겔 여과 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 동일한 완충액으로 용출시켰다. 결과 RNase H가 분자량 35킬로달톤에 상응하는 위치에서 용출되었다. 이 분자량은 모노머 형태의 RNase H의 것과 일치한다. 따라서 용리된 RNase HII를 Bca RNase 샘플로서 사용하였다.
수득한 Bca RNase 샘플의 효소 활성을 하기와 같이 측정하였다.
40℃에서 인큐베이션된 100 ㎕의 반응 혼합물[20mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 0.001% 소 혈청 알부민(Takara Shuzo), 1% 디메틸 설폭시드, 10mM 염화마그네슘, 20μg/㎖ poly(dT)(Amersham Pharmacia Biotech) 및 30μg/㎖ poly(rA)(Amersham Pharmacia Biotech)을 Bca RNase HII 샘플에 가하였다. 혼합물을 10분동안 40℃에서 반응시켰다. 이어서 0.5M EDTA(pH 8.0)을 가하여 반응을 종결시켰다. 260nm에서 흡광도를 측정하였다.
결과, RNase H 활성을 Bca RNase HII 샘플에 대하여 관찰하였다.
참고 실시예 3: 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax) RNase HIII 유전자 클로닝
(1) RNase HIII 유전자 단편 클로닝
바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilis)[Biochemistry, 38: 605-608(1999)] 및 다른 유기체로부터의 RNase HIIIs의 아미노산 서열사이의 상동성에 기초하여 확인된 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilis)[Biochemistry, 38: 605-608(1999)] 및 다른 유기체사이에 잘 보존되는 부위의 아미노선 서열에 기초하여 RNase HIII를 코딩하는 유전자를 스크리닝하기 위하여 서열번호 10 내지 13에 나타낸 프라이머 BsuIII-1, BsuIII-3, BsuIII-6 및 BsuIII-8를 합성하였다.
주형으로서 참고 실시예 (2)-1에서 제조된 것과 같은 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax) 게놈 DNA 200ng, 및 프라이머로서 100pmol의 BsuII-1 및 100pmol의 BsuII-8을 사용하여 1차 PCR을 50 ㎕의 용량으로 수행하였다. 이어서 주형으로서 1 ㎕의 반응 혼합물, 및 프라이머로서 100pmol의 BsuII-3 및 100pmol의 BsuII-6을 사용하여 2차 PCR을 100 ㎕의 용량으로 수행하였다. TaKaRa Taq 폴리머라제(Takara Shuzo)를 첨부된 프로토콜에 따라 2회의 PCR을 위한 DNA 폴리머라제로서 사용하였다. PCR을 하기와 같이 수행하였다: 30초동안 94℃, 30초동안 45℃, 1분동안 72℃에서 25싸이클(1차 PCR) 또는 30싸이클(2차 PCR).
약 450bp의 증폭된 DNA 단편을 T4 DNA 폴리머라제(Takara Shuzo)를 사용하여 말단을 둔화(blunt-ended)시키고 아가로스 겔 전기영동시켜 약 450bp의 증폭된 DNA 단편을 회수하였다. 약 450bp의 DNA 단편을 T4 DNA 리가아제(Takara Shuzo)를 사용하여 Sma I(Takara Shuzo)로 분해된 pUC119(Takara Shuzo)와 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109로 형질전환시켰다. 생성된 형질전환체를 배양하여 약 450bp의 DNA 단편이 삽입된 플라스미드 pBCA3204를 수득하였다.
(2) 서던 하이브리드화 방법을 사용한 RNase H 유전자의 클로닝
참고 실시예 (3)-1에서 수득한 pBCA3204에 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 확인하였다. 서열번호 14 및 15로 나타낸 프라이머 RNIII-S3 및 BcaRNIII-3을 확인된 뉴클레오티드 서열에 기초하여 확인하였다. 주형으로서 pBCA3204 및 프라이머로서 100 ㎕의 RNIII-S3 및 BcaRNIII-3을 사용하여 PCR을 100 ㎕의 용량으로 수행하였다. PCR을 하기와 같이 수행하였다: 0초동안 98℃, 0초동안 55℃, 20초동안 72℃에서 30싸이클. 반응 후, 반응 혼합물을 페놀-클로로포름 추출, 에탄올 침전 및 아가로스 겔 전기영동시켜 겔로부터 약 0.4kb의 DNA 단편을 회수하였다. 약 0.4kb의 DNA 단편을 DIG DNA Labeling Kit(Boegringer Mannheim)을 사용하여 라벨링하여 프로브를 제조하였다.
20μg의 참고 실시예 2-(1)에서 제조된 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax) 게놈 DNA를 BamHI, EcoRI, HindIII, PstI 또는 XbaI(Takara Shuzo)로 완전하게 분해하였다. 각 분해물의 반을 아가로스 겔 전기영동시켰다. DNA를 아가로스 겔로부터 0.4N 수산화나트륨을 사용하여 나일론 막으로 이동시켰다. 30㎖의 하이브리드화 완충액[43.4g/L 염화나트륨, 17.6g/L 시트르산나트륨, 1% 차단체(Boegringer Mannheim), 0.1% N-라우로일 사코신, 0.02% 소듐 라우릴 설페이트(SDS)]을 포함하는 봉입된 백에서 4시간동안 60℃에서 예비-인큐베이션시킨 후 프로브를 포함하는 5㎖의 하이브리드화 완충액을 포함하는 봉입된 백에서 16시간동 안 60℃에서 인큐베이션시켰다.
막을 0.1% SDS를 포함하는 50㎖의 2 x SSC(17.5g/L NaCl, 8.8g/L 시트르산나트륨)중에서 실온에서 2회,
0.1% SDS를 포함하는 50㎖의 2 x SSC(4.3g/L NaCl, 1.9g/L 시트르산나트륨)중에서 45℃에서 2회 세척하였다. 이어서, 프로브에 상보적인 서열을 갖는 약 8kb의 EcoRI 단편, 약 4.5kb의 PstI 단편, 약 1kb의 HindIII 단편을 DIG 핵산 검출 키트(Boegringer Mannheim)를 사용하여 검출하였따.
PstI로 완전하게 분해된 남은 반의 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax) 게놈 DNA를 아가로스 겔 전기영동시켰다. 약 4.5kb의 PstI 단편을 겔로부터 회수하였다. 이어서 DNA 단편을 PstI로 분해되고, 알칼리성 포스포타제(Takara Shuzo)로 탈인산화된 플라스미드 벡터 pTV119N으로 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) HB109를 형질전환시켰다.
주형으로서 콜로니중 하나, 및 프라이머로서 RNIII-3 및 BcaRNIII-3을 사용하여 50 ㎕의 용량으로 PCR을 수행하여 RNase H 유전자를 포함하는 것으로 가정된 콜로니를 선별하였다. TaKaRa-Z Taq(Takara Shuzo)를 첨부된 프로토콜에 따라 PCR를 위해 DNA 폴리머라제로서 사용하였다. PCR을 하기와 같이 수행하였다: 0초동안 98℃, 0초동안 55℃, 20초동안 72℃에서 30싸이클. 결과 관심의 대상이 되는 유전자가 콜로니 88번에 포함되어 있다는 것을 발견하였다.
주형으로서 콜로니 88번, 및 프라이머쌍 RN-N(Takara Shuzo) 및 BcaRNIII-3 또는 프라이머쌍 M4(Takara Shuzo) 및 RNIII-S3으로부터 제조된 플라스미드를 사용하여 PCR를 수행하여 전장 RNase HIII 유전자가 플라스미드에 포함되어 있는지 여부를 조사하였다. 결과, 전장 RNase HIII 유전자가 플라스미드에 포함되어 있음을 발견하고, 이를 pBCA3P88로 명명하였다.
(3) RNase HIII 유전자를 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열 확인
참고 실시예 3-(2)에서 수득된 플라스미드 pBCA3P88내로 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 디데옥시 방법에 따라 확인하였다.
확인된 뉴클레오티드 서열을 분석하여 RNase HIII의 N-말단 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 존재를 밝혀냈다. 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열 및 뉴클레오티드 서열로부터 유도된 RNase HIII의 아미노산 서열을 각각 서열번호 16 및17에 나타낸다.
(4) RNase HIII를 발현시키기 위한 플라스미드의 작제
주형으로서 참고 실시예 3-(2)에 기술된 플라스미드 pBCA3P88, RNase HIII 및 M13 프라이머(Takara Shuzo)에 대한 상기 언급된 오픈 리딩 프레임 주위의 서열과 관련하여 명명된 서열번호 18의 BcaRNIIINde를 사용하여 100 ㎕의 용량으로 PCR을 수행하였다. Pyrobest DNA 폴리머라제(Takara Shuzo)를 첨부된 프로토콜에 따라 PCR를 위해 DNA 폴리머라제로서 사용하였다. PCR을 하기와 같이 수행하였다: 30초동안 94℃, 30초동안 55℃, 3분동안 72℃에서 30싸이클. 약 4kb의 증폭된 DNA 단편을 NdeI(Takara Shuzo)로 분해하고 아가로스 겔 전기영동시켜 겔로부터 약 1.4kb의 DNA 단편을 회수하였다. NdeI로 분해되고 알칼리성 포스포타제(Takara Shuzo)로 탈 인산화된 pTV119Nd(pTV119N중 NcoI 사이트가 NdeI 사이트로 전환된 플라스미드)로 약 1.4kb의 DNA 단편을 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109를 형질전환시켰다.
이어서, 주형으로서 콜로니중 하나, 및 프라이머로서 RN-N(Takara Shuzo) 및 BcaRNIII-3을 사용하여 PCR을 수행하고 NdeI 단편중 RNase HIII 유전자가 벡터 pTV119Nd중 lac 프로모터로부터 하류에 연결된 플라스미드를 스크리닝하였다. 이어서 RNase HIII 유전자를 포함하는 것으로 가정된 콜로니를 선별하였다. TaKaRa-Z Taq(Takara Shuzo)를 첨부된 프로토콜에 따라 PCR를 위해 DNA 폴리머라제로서 사용하였다. PCR을 하기와 같이 수행하였다: 0초동안 98℃, 0초동안 55℃, 20초동안 72℃에서 30싸이클. 결과 콜로니 2번이 NdeI 단편중 RNase HIII 유전자가 벡터 pTV119Nd중 lac 프로모터로부터 하류에 연결된 플라스미드를 포함한다는 것을 발견하였다. 이 플라스미드를 pBCA3Nd2라 명명하였다.
디데옥시 방법에 의해 플라스미드내로 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 확인하므로써 개시코돈 GTG가 ATG로 변환되었다는 것을 제외하고 PCR에 의한 돌연변이는 없음을 밝혀냈다.
플라스미드 pBCA3Nd2로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109를 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109/pBCA3Nd2로 명명하고 기탁번호 FERM BP-7653하에 2000년 9월 5일(원 기탁일) International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central(6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305- 8566)에 기탁하였다.
(5) 정제된 RNase HIII 샘플의 제조
참고 실시예 3-(4)에서 수득된 pBCA3Nd2로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109를 100μg/㎖의 앰피실린을 포함하는 2L의 LB 배지내로 접종하고 37℃에서 16시간동안 진탕시키면서 배양하였다. 배양후, 원심분리에 의해 회수한 세포를 39.6㎖의 초음파 처리 완충액[50mM tris-HCl(pH 8.0), 2mM 1mM EDTA, 2mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드]에 현탁시키고 초음파처리하였다. 10분동안 12000rpm에서 초음파 처리된 현탁액을 원심분리하여 수득한 상층액을 15분동안 60℃에서 가열하였다. 10분동안 다시 12000rpm에서 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 따라서, 39.8㎖의 가열된 상층액을 수득하였다.
가열된 상층액을 완충액 A[50mM tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA]으로 평형화된 RESOURSE Q 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용하고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 결과, RNase HIII는 RESOURSE Q 칼럼을 통해 이동하였다.
45㎖의 이동 RNase HIII 분획을 2L의 완충액 B[50mM tris-HCl(pH 7.0), 1mM EDTA]에 대하여 2시간동안 투석하였다. 동일한 조건하에 2회 더 투석을 반복하였다. 55.8㎖의 투석된 효소 용액을 완충액 B로 평형화된 RESOURSE Q 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 0 내지 500mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 105mM NaCl로 용출된 RNase II를 포함하는 분획을 수득하였다.
1M NaCl를 포함하는 완충액 B를 7.0㎖의 분획에 가하여 NaCl의 농도를 150mM으로 만들었다. 혼합물을 150mM NaCl을 포함하는 완충액 B로 평형화된 HiTrap-heparin 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시켰다. 결과, RNase HIII는 RESOURSE Q 칼럼을 통해 이동하였다.
7.8㎖의 이동 RNase HIII 분획을 한외여과에 의해 Centricon-10(Amicon)을 사용하여 농축시켰다. 190 ㎕의 농축액을 100mM NaCl 및 0.1mM EDTA를 포함하는 50mM Tris-HCl(pH 7.0)로 평형화된 Superdex 20 겔 여과 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 동일한 완충액으로 용출시켰다. 결과 RNase HIII가 분자량 33킬로달톤에 상응하는 위치에서 용출되었다. 이 분자량은 모노머 형태의 RNase H의 것과 일치한다.
수득한 Bca RNase HIII 샘플로서 사용하였다.
그렇게 수득한 Bca RNase HIII 샘플의 효소 활성을 하기와 같이 측정하였다.
40℃에서 인큐베이션된 100 ㎕의 반응 혼합물[20mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 0.001% 소 혈청 알부민(Takara Shuzo), 1% 디메틸 설폭시드, 10mM 염화마그네슘, 20μg/㎖ poly(dT)(Amersham Pharmacia Biotech) 및 30μg/㎖ poly(rA)(Amersham Pharmacia Biotech)을 Bca RNase HIII 샘플에 가하였다. 혼합물을 10분동안 40℃에서 반응시켰다. 이어서 0.5M EDTA(pH 8.0)을 가하여 반응을 종결시켰다. 260nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과 Bca RNase HIII 샘플에 대하여 RNase H 활성을 관찰하였다.
참고 실시예 4: 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) RNase HII 유 전자 클로닝
(1) 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터 게놈 DNA 제조
1% 트립톤(Difco Laboratories), 0.5% 효모 추출물(Difco Laboratories), 1% 가용성 전분 (Nacalai Tesque), 3.5% Jamarine S Solid (Jamarine Laboratory), 0.5% Jamarine S Liquid (Jamarine Laboratory), 0.003% MgSO4, 0.001% NaCl, 0.0001% FeSO4·7H20, 0.0001% CoSO4, 0.0001% CaCl2·7H2 0, 0.0001% ZnSO4, 0.1ppm CuSO4·5H20, 0.1ppm KAI(SO4)2, 0.1ppm H3BO4 , 0.1ppm Na2MoO4·2H20, 및 0.25mM NiCl2·6H20를 포함하는 2L 배지을 2L 배지용 병에 놓고, 20분동안 120℃에서 멸균하고 질소 가스로 버블링하여 산소를 제거한 후 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)(Deutsche Sammlung von Migrooranismen; DSM3638)을 배지내 접종하고 진탕하지 않고 16시간동안 95℃에서 배양하였다. 배양 후 세포를 원심분리에 의해 회수하였다.
생성된 세포를 4㎖의 25% 수크로오스, 및 50mM tris-HCl(pH 8.0)에 현탁시켰다. 물중 0.4㎖의 10mg/㎖의 리소자임 클로라이드(Nacalai Tesque)를 가하였다. 혼합물을 1시간동안 20℃에서 반응시켰다. 반응 후, 150mM NaCl, 1mM EDTA 및 20mM tris-HCl(pH 8.0), 0.2㎖의 20mg/㎖ 프로테이나제 K(Takara Shuzo) 및 2㎖을 10% 소듐 라우릴 설페이트 수용액을 포함하는 24㎖의 혼합물을 반응 혼합물에 가하였다. 혼합물을 1시간동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 반응 후 혼합물을 페놀-클로로포름 추출후 에탄올 침전시켜 1mg의 게놈 DNA를 제조하였다.
(2) RNase HII 유전자 클로닝
피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshi)의 전장 게놈 서열이 공개되었다[DNA Research, 5:55-76 (1998)]. 게놈중 RNase HII(PH1650)의 동족체를 코딩하는 하나의 유전자의 존재가 공지되었다(서열번호:19, the home page of National Institute of Technology 및 Evaluation: http://www.nite.go.jp/).
PH1650 유전자 및 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)의 일부 공개된 게놈 서열 (the home page of University of Utah, Utah Genome Center: http://www.genome.utah.edu/sequence.html)의 상동성을 조사하였다. 결과 고도의 상동성 서열을 발견하였다. 프라이머 1650Nde (서열번호:20) 및 1650Bam (서열번호:21)을 상동 서열에 기초하여 합성하였다.
주형으로서 200ng의 참고 실시예 4-(1)에서 제조된 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) 게놈 DNA, 및 프라이머로서 20pmol의 1650Nde 및 20pmol 1650Bam을 사용하여 100 ㎕의 용량으로 PCR을 수행하였다. Takara EX Taq(Takara Shuzo)를 첨부된 프로토콜에 따라 PCR를 위해 DNA 폴리머라제로서 사용하였다. PCR을 하기와 같이 수행하였다: 30초동안 94℃, 30초동안 55℃, 1분동안 72℃에서 30싸이클. 약 0.7kb의 증폭된 DNA 단편을 NdeI 및 BamHI(Takara Shuzo)로 분해하였다. 생성된 DNA 단편을 플라스미드 벡터 pET3a(Novagen)중 NdeI 및 BamHI 사이트 사이에 삽입하여 플라스미드 pPFU220을 제조하였다.
(3) RNase HII 유전자를 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열의 확인
참고 실시예 4-(2)에서 수득한 pPFU220 내로 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오티 드 서열을 디데옥시 방법에 의해 확인하였다.
확인된 뉴클레오티드 서열을 분석하여 RNase HII를 코딩하는 것으로 가정된 오픈 리딩 프레임의 존재를 밝혀냈다. 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 22에 나타낸다. 뉴클레오티드 서열로부터 유도된 RNase H의 아미노산 서열을 서열번호 23에 나타낸다.
플라스미드 pPFU220로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109을 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109/pPFU220로 명명하고 2000년 월 5일(원기탁일)에 기탁번호 BP-7654하에 International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central(6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan)에 기탁하였다.
(4) 정제된 RNase HII 샘플의 제조
에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) HMS174(DE3) (Novagen)을 참고 실시예 4-(2)에서 수득한 pPFU220으로 형질전환시켰다. pPFU220을 포함하는 생성된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) HMS174(DE3)을 100μg/㎖의 앰피실린을 포함하는 2L의 LB 배지내로 접종하고 37℃에서 16시간동안 진탕시키면서 배양하였다. 배양후, 원심분리에 의해 회수한 세포를 66.0㎖의 초음파 처리 완충액[50mM tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 2mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드]에 현탁시키고 초음파처리하였다. 10분동안 12000rpm에서 초음파 처리된 현탁액을 원심분리하여 수득한 상층액을 15분동안 60℃에서 가열하였다. 10분동안 다시 12000rpm에서 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 따라서, 61.5㎖의 가열된 상층액을 수득하였다.
가열된 상층액을 완충액 A[50mM tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA]으로 평형화된 RESOURSE Q 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용하고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 결과, RNase H는 RESOURSE Q 칼럼을 통해 이동하였다.
60.0㎖의 이동(flow-through) RNase H 분획을 완충액 A으로 평형화된 RESOURSE Q 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 0 내지 500mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 150mM NaCl로 용출된 RNase II를 포함하는 분획을 수득하였다. 2.0㎖의 RNase H 분획을 100mM NaCl 및 0.1mM EDTA을 포함하는 50mM tris-HCl(pH 8.0)으로 평형화된 Superdex 200 겔 여과 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 동일한 완충액으로 용출시켰다. 결과 RNase HII가 분자량 17킬로달톤에 상응하는 위치에서 용출되었다. 이 분자량은 모노머 형태의 RNase HII의 것과 일치한다.
용리된 RNase HII를 Pfu RNase HII 샘플로서 사용하였다.
수득한 Pfu RNase HII 샘플의 효소 활성을 참고 실시예 3-(5)에 기술된 방법과 같이 측정하였다. 결과, Pfu RNase HII 샘플에 대하여 RNase H 활성을 관찰하였다.
참고 실시예 5: 써모토가 마리티마 (Thermotoga maritima) RNase HII 유전자 클로닝
(1) 써모토가 마리티마 (Thermotoga maritima)로부터 게놈 DNA 제조
1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% 가용성 전분, 3.5% Jamarine S Solid , 0.5% Jamarine S Liquid, 0.003% MgSO4, 0.001% NaCl, 0.0001% FeSO4·7H20, 0.0001% CoSO4, 0.0001% CaCl2·7H20, 0.0001% ZnSO4, 0.1ppm CuSO4·5H20, 0.1ppm KAI(SO4)2, 0.1ppm H3BO4, 0.1ppm Na2MoO4 ·2H20, 및 0.25mM NiCl2·6H20를 포함하는 2L 배지을 2L 배지용 병에 놓고, 20분동안 120℃에서 멸균하고 질소 가스로 버블링하여 산소를 제거한 후 써모토가 마리티마 (Thermotoga maritima)(Deutsche Sammlung von Migrooranismen; DSM3109)을 배지내 접종하고 진탕하지 않고 16시간동안 85℃에서 배양하였다.
300㎖의 배양액으로부터 원심분리에 의해 회수된 세포를 3㎖의 TE 완충액[10mM tris-HCl(pH 7.5), 1mM EDTA]에 현탁시켰다. 150 ㎕의 10% 소듐 라우릴 설페이트 수용액(Nacalai Tesque) 및 15 ㎕의 20mg/㎖ 프로테이나제 K(Takara Shuzo)을 가하였다. 혼합물을 1시간동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 반응 후 0.5㎖의 5M NaCl을 혼합물에 가하였다. 완전하게 혼합시킨 후, 0.4㎖의 CTAB-NaCl 용액[10% 세틸트리메틸암모늄 브롬마이드(Nacalai Tesque), 0.7M NaCl]을 혼합물에 가하였다. 완전하게 혼합시킨 후, 혼합물을 65℃에서 10분동안 인큐베이션시켰다. 1.5㎖의 클로로포름/이소아밀 알콜의 혼합물(24:1, v/v)를 가하였다. 혼합물을 10분동안 서서히 혼합시키고 5분동안 20000 x g에서 원심분리하였다. 원심분리한 후, 동량의 100mM tris-HCl(pH 8.0)으로 포화된 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜의 혼합물(25:24:1, v/v)을 생성된 상층액에 가하였다. 혼합물을 10분동안 서서히 혼합시 키고 5분동안 20000 x g에서 원심분리하였다. 원심분리후 0.6 용량의 2-프로판올을 생성된 상층액에 가하였다. 10000 x g에서 5분간 원심분리하여 수득된 침전물을 물중 70% 에탄올로 세척하고 공기-건조시킨 후 200㎖의 TE 완충액에 용해시켜 게놈 DNA 용액을 수득하였다.
(2) RNase HII 유전자 클로닝
써모토가 마리티마 (Thermotoga maritima)의 게놈 DNA의 뉴클레오티드 서열에서 RNase HII 유전자로서 확인된 부위의 뉴클레오티드 서열(http://www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.html)에 기초하여 서열번호 24 내지 27로 나타낸 올리고뉴클레오티드 915-F1, 915-F2, 915-R1, 915-R2을 합성하여 주형으로서 써모토가 마리티마 (Thermotoga maritima) 게놈 DNA를 사용하여 PCR을 수행하여 RNase H 유전자를 포함하는 증폭된 DNA 단편을 수득하였다.
주형으로서 참고 실시예 5-(1)에서 제조된 써모토가 마리티마 (Thermotoga maritima) 게놈 DNA, 및 프라이머 쌍으로서 915-F1 및 915-R1, 915-F1 및 915-R2, 915-F2 및 915-R1 및 915-F2 및 915-R2를 사용하여 PCR을 수행하였다. Takara EX Taq(Takara Shuzo)를 첨부된 프로토콜에 따라 PCR를 위해 DNA 폴리머라제로서 사용하였다. PCR을 하기와 같이 수행하였다: 0.5분동안 95℃, 0.5분동안 55℃, 1.5분동안 72℃에서 25싸이클. 반응 후, 각 PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동시켜 추출하고 약 0.7kb의 증폭된 DNA 단편을 정제하였다. 프라이머 쌍 915-F1 및 915-R1, 또는 915-F1 및 915-R2를 사용하여 증폭된 DNA를 HindIII 및 XbaI(Takara Shuzo)로 분해하고 T4 DNA 리가아제를 사용하여 HindIII 및 XbaI로 분해된 pUC19로 결찰시켰 다. 결찰 혼합물을 사용하여 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109을 형질전환시켰다. 생성된 형질전환체를 배양하여 약 0.7kb DNA가 삽입된 플라스미드 DNA를 제조하였다. 결과, 915-F1 및 915-R1을 사용하여 증폭된 DNA를 갖는 플라스미드 1번 및 2번 및 915-F1 및 915-R2을 사용하여 증폭된 DNA를 갖는 플라스미드 3번 및 4번을 수득하였다.
또한, 프라이머쌍 915-F2 및 915-R1 또는 915-F2 및 915-R2를 사용하여 증폭된 DNA를 NcoI(Takara Shuzo) 및 XbaI로 이중으로 분해하고 T4 DNA 리가아제를 사용하여 NcoI(Takara Shuzo) 및 XbaI로 이중으로 분해된 pTV119N(Takara Shuzo)로 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109을 형질전환시켰다.
생성된 형질전환체를 배양하여 약 0.7kb DNA가 삽입된 플라스미드 DNA를 제조하였다. 결과, 915-F2 및 915-R1을 사용하여 증폭된 DNA를 갖는 플라스미드 5번 및 6번 및 915-F2 및 915-R2을 사용하여 증폭된 DNA를 갖는 플라스미드 7번 및 8번을 수득하였다.
플라스미드 7번으로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109를 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109/pTM-RNH로 명명하고, 2000년 월 5일(원기탁일)에 기탁번호 BP-7652하에 International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central(6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan)에 기탁하였다.
(3) 써모토가 마리티마 (Thermotoga maritima) RNase HII 유전자 발현
플라스미드 1번 내지 7번 또는 pUC19중 하나로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109을 100μg/㎖의 앰피실린을 포함하는 5㎖의 LB 배지[10g/L 트립톤, 5g/L 효모 추출액, 5g/L NaCl, pH 7.2]내로 접종하고 37℃에서 진탕시키면서 배양하였다. 660nm에서 흡광도가 0.5에 도달하였을 때, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드를 가하여 최종 농도를 1mM으로 하고 세포를 밤새도록 배양하였다. 배양후, 원심분리에 의해 회수한 세포를 1㎖의 TE 완충액에 현탁시키고 초음파처리하였다. 초음파 처리된 현탁액을 10분동안 80℃에서 가열하였다. 원심분리에 의해 수득한 상층액을 세포 원추출물로서 사용하였다. 참고 실시예 2-(5)에 기술된 방법과 같이 세포 원추출물ㅇ르 사용하여 흡광도를 측정하였다. 결과, 반응을 MnCl2의 존재하에 수행하는 경우 플라스미드 3, 5, 6, 또는 7번을 포함하는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109로부터 제조된 세포 원추출액을 사용하는 각 반응으로부터 얻은 260nm에서의 흡광도는 pUS19를 포함하는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109로부터 제조된 세포 원추출액을 사용하는 각 반응으로부터 얻은 것보다 매우 현저하게 높았다. 따라서, 플라스미드 3, 5, 6, 또는 7번은 RNase H를 포함하고 이들 플라스미드를 포함하는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)가 RNase H 활성을 나타낸다는 것을 입증하였다.
에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 RNase 활성을 나타내는 것을 입증된 플라스미드가 삽입된 DNA 단편의 부분 뉴클레오티드 서열을 확인하였다. 확인 된 뉴클레오티드 서열을 분석하여 RNase HII를 코딩하는 것으로 가정된 오픈 리딩 프레임을 밝혀냈다. 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 143에 나타낸다. 뉴클레오티드 서열로부터 유도된 RNase HII의 아미노산 서열을 서열번호 144에 나타낸다. 이어서 PCR시 생성될 수 있는 한개의 염기 치환하여 코딩되는 아미노산 잔기를 변화시키는 것을 플라스미드 7번에 삽입된 DNA 단편의 부분 뉴클레오티드 서열의 부위에서 관찰하였다.
(4) 정제된 RNase HII 샘플 제조
참고 실시예 5-(2)에서 수득한 pTM-RNH로 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109을 형질전환시켰다. pTM-RNH을 포함하는 생성된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109을 100μg/㎖의 앰피실린을 포함하는 1L의 LB 배지내로 접종하고 37℃에서 16시간동안 진탕시키면서 배양하였다. 배양후, 원심분리에 의해 회수한 세포를 31.0㎖의 초음파 처리 완충액[50mM tris-HCl(pH 8.0), 2mM 2-머캅토에탄올, 10% 글리세롤, 2mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드]에 현탁시키고 초음파처리하였다. 10분동안 12000rpm에서 초음파 처리된 현탁액을 원심분리하여 수득한 상층액을 15분동안 70℃에서 가열하였다. 10분동안 다시 12000rpm에서 다시 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 따라서, 32.0㎖의 가열된 상층액을 수득하였다.
가열된 상층액을 완충액 C[50mM tris-HCl(pH 8.0), 2mM 2-머캅토에탄올, 10% 글리세롤]으로 평형화된 RESOURSE Q 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용하고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 결 과, RNase H는 RESOURSE Q 칼럼을 통해 이동하였다. 32.5㎖의 이동(flow-through) RNase H 분획을 완충액 C로 평형화된 RESOURSE Q 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 0 내지 500mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 240mM NaCl로 용출된 RNase II를 포함하는 분획을 수득하였다. 2.0㎖의 RNase H 분획을 50mM NaCl을 포함하는 완충액 C PD-10 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시켰다. 3.5㎖의 생성된 용출액을 50 mM NaCl을 완충액 C로 평형화된 Hitrap-heparin 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 FPLC 시스템을 사용하여 50 내지 550mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 결과 약 295mM NaCl로 용출된 RNase II를 포함하는 분획을 수득하였다. 용출된 RNase HII를 Tma RNase HII 샘플로 사용하였다.
RNase HII를 Tma RNase HII 샘플의 효소 활성을 참고 실시예 2-(6)에 기술된 바와 같이 측정하였다. 결과 RNase H 활성이 RNase HII를 Tma RNase HII 샘플에 대하여 관찰되었다.
참고 실시예 6: 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii) RNase HII 유전자 클로닝
(1) 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii)로부터 게놈 DNA 제조
1% 트립톤(Difco Laboratories), 0.5% 효모 추출물(Difco Laboratories), 1% 가용성 전분 (Nacalai Tesque), 3.5% Jamarine S Solid (Jamarine Laboratory), 0.5% Jamarine S Liquid (Jamarine Laboratory), 0.003% MgSO4, 0.001% NaCl, 0.0001% FeSO4·7H20, 0.0001% CoSO4, 0.0001% CaCl2·7H2 0, 0.0001% ZnSO4, 0.1ppm CuSO4·5H20, 0.1ppm KAI(SO4)2, 0.1ppm H3BO4 , 0.1ppm Na2MoO4·2H20, 및 0.25mM NiCl2·6H20를 포함하는 2L 배지을 2L 배지용 병에 놓고, 20분동안 120℃에서 멸균하고 질소 가스로 버블링하여 산소를 제거한 후 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii) OT3(Institute of Physical and Chemical Research(RIKEN); JCM9974)을 배지내 접종하고 진탕하지 않고 16시간동안 95℃에서 배양하였다. 배양 후 세포를 원심분리에 의해 회수하였다.
세포를 4㎖의 25% 수크로오스, 50mM tris-HCl(pH 8.0)에 현탁시켰다. 물중 0.4㎖의 10mg/㎖ 리조자임 클로라이드(Nacalai Tesque)를 가하였다. 혼합물을 20℃에서 1시간동안 반응시켰다. 반응 후, 150mM NaCl, 1mM EDTA 및 20mM tris-HCl(pH 8.0), 0.2㎖의 20mg/㎖의 프로테나제 K(Takara Shuzo) 및 2㎖의 10% 소듐 라우릴 설페이트 수용액을 포함하는 24㎖의 혼합물을 반응 혼합물에 가하였다. 혼합물을 1시간동안 37℃에서 인큐베이션시켰다.
반응 후, 혼합물을 페놀-추출 후 에탄올 침전시켜 약 1mg의 게놈 DNA를 제조하였다.
(2) RNase HII 유전자 클로닝
피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii)의 전장 게놈 서열이 공개되어 있다[DNA Research, 5:55-76 (1998)]. RNase HII (PH1650) 동족체를 코딩하는 하나의 유전자의 존재가 공지되어 있다(서열번호:145, the home page of National Institute of Technology 및 Evaluation: http://www.nite.go.jp/).
프라이머 PhoNde (서열번호:146) 및 PhoBam (서열번호:147)를 PH1650 유전자 (서열번호:145) 서열에 기초하여 합성하였다.
주형으로서 참고 실시예 6-(1)에서 제조된 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii) 게놈 DNA 100ng, 및 프라이머로서 각각 20pmol의 PhoNde 및 PhoBam을 사용하여 100 ㎕의 용량으로 수행하였다. Takara EX Taq(Takara Shuzo)를 첨부된 프로토콜에 따라 PCR를 위해 DNA 폴리머라제로서 사용하였다. PCR을 하기와 같이 수행하였다: 30초동안 94℃, 30초동안 55℃, 1분동안 72℃에서 40싸이클. 약 0.7kb의 증폭된 DNA 단편을 NdeI 및 BamHI(Takara Shuzo)로 분해하였다. 이어서 플라스미드 pPHO238을 플라스미드 벡터 pET3a(Novagen)중 NdeI 및 BamHI사이의 생성된 DNA 단편에 삽입하여 작제하였다.
(3) RNase HII 유전자를 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열의 확인
참고 실시예 6-(2)에서 수득한 pPHO238 내로 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 디데옥시 방법에 의해 확인하였다.
확인된 뉴클레오티드 서열을 분석하여 RNase HII를 코딩하는 것으로 가정된 오픈 리딩 프레임의 존재를 밝혀냈다. 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 148에 나타낸다. 뉴클레오티드 서열로부터 유도된 RNase HII의 아미노산 서열을 서열번호 149에 나타낸다.
플라스미드 pPHO238로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109을 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109/pPHO238로 명명하고 2000년 월 5일(원기탁일)에 기탁번호 BP-7692하에 International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central(6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan)에 기탁하였다.
(4) 정제된 RNase HII 샘플 제조
참고 실시예 6-(2)에서 수득한 pPHO238로 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) HMS174(DE3)(Novagen)을 형질전환시켰다. pPHO238을 포함하는 생성된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) HMS174(DE3)을 100μg/㎖의 앰피실린을 포함하는 1L의 LB 배지내로 접종하고 37℃에서 16시간동안 진탕시키면서 배양하였다. 배양후, 원심분리에 의해 회수한 세포를 34.3㎖의 초음파 처리 완충액[50mM tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 2mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드]에 현탁시키고 초음파처리하였다. 10분동안 12000rpm에서 초음파 처리된 현탁액을 원심분리하여 수득한 상층액을 15분동안 70℃에서 가열하였다. 10분동안 다시 12000rpm에서 다시 원심분리하여 수득한 상층액을 15분동안 80℃에서 가열하였다. 이어서 다시 10분동안 12000rpm에서 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 따라서, 33.5㎖의 가열된 상층액을 수득하였다.
가열된 상층액을 완충액 A[50mM tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA]으로 평형화된 RESOURSE Q 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용하고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 결과, RNase H는 RESOURSE Q 칼럼을 통해 이동하였다.
35.0㎖의 이동(flow-through) RNase H 분획을 2L의 완충액 B[50mM tris-HCl(pH 7.0), 1mM EDTA]을 2시간동안 투석하였다. 투석을 2회 더 반복하였다. 34.5㎖의 투석 효소 용액을 완충액 B로 으로 평형화된 RESOURSE Q 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 0 내지 500mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 155mM NaCl로 용출된 RNase II를 포함하는 분획을 수득하였다.
완충액 B를 4.0㎖의 분획에 가하여 최종 농도를 50mM으로 하였다. 혼합물을 50mM NaCl을 포함하는 완충액 B로 평형화된 HiTrap-heparin 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 50 내지 550mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 160mM NaCl로 용출된 RNase II를 포함하는 분획을 수득하였다.
6.9㎖의 RNase HIII 분획을 한외여과에 의해 Centricon-10(Amicon)을 사용하여 농축시켰다. 250 ㎕의 농축액으로 각각 분리된 2분량을 100mM NaCl 및 0.1mM EDTA를 포함하는 50mM Tris-HCl(pH 7.0)로 평형화된 Superose 6 겔 여과 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 동일한 완충액으로 용출시켰다. 결과 RNase HIII가 분자량 24.5 킬로달톤에 상응하는 위치에서 용출되었다. 이 분자량은 모노머 형태의 RNase H의 것과 일치한다.
수득한 Pho RNase HIII 샘플로서 사용하였다.
그렇게 수득한 Pho RNase HIII 샘플의 효소 활성을 참고 실시예 3-(5)에 기술된 바와 같이 측정하였다. 결과 Pho RNase HIII 샘플에 대하여 RNase H 활성을 관찰하였따.
참고 실시예 7: 아키오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)로부터 RNase HII 유전자 클로닝
8㎖의 배양액으로부터 회수된 아키오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen로부터 구입; DSM4139)를 100 ㎕의 25% 수크로스, 50mM tris-HCl(pH 8.0)에 현탁시켰다. 물중 20㎖의 0.5M EDTA 및 10㎖의 10mg/㎖ 리조자임 클로라이드(Nacalai Tesque)를 가하였다. 혼합물을 20℃에서 1시간동안 반응시켰다. 반응 후, 150mM NaCl, 1mM EDTA 및 20mM tris-HCl(pH 8.0), 10 ㎕의 20mg/㎖의 프로테나제 K(Takara Shuzo) 및 50 ㎕의 10% 소듐 라우릴 설페이트 수용액을 포함하는 800 ㎕의 혼합물을 반응 혼합물에 가하였다. 혼합물을 1시간동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 반응 후, 혼합물을 페놀-추출 후 에탄올 침전시키고 공기 건조시킨 후 50 ㎕의 TE에 용해시켜 게놈 DNA 용액를 제조하였다.
(2) RNase HII 유전자 클로닝
아키오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)의 전장 게놈 서열이 공개되어 있다[Nature, 390: 364-370(1997)]. RNase HII (AF0621) 동족체를 코딩하는 하나의 유전자의 존재가 공지되어 있다(서열번호:150, (http://www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.html).
프라이머 AfuNde(서열번호: 151) 및 AfuBam(서열번호 152)를 Af0621 유전자(서열번호 150)에 기초하여 합성하였다.
주형으로서 참고 실시예 7-(1)에서 제조된 아키오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus) 게놈 DNA 30ng, 및 프라이머로서 각각 20pmol의 AfuNde 및 AfuBam을 사용하여 100 ㎕의 용량으로 수행하였다. Pyrobest DNA 폴리머라제(Takara Shuzo)를 첨부된 프로토콜에 따라 PCR를 위해 DNA 폴리머라제로서 사용하였다. PCR을 하기와 같이 수행하였다: 30초동안 94℃, 30초동안 55℃, 1분동안 72℃에서 40싸이클. 약 0.6kb의 증폭된 DNA 단편을 NdeI 및 BamHI(Takara Shuzo)로 분해하였다. 이어서 플라스미드 pAFU204를 플라스미드 벡터 pTV119Nd중 NdeI 및 BamHI사이의 생성된 DNA 단편에 삽입하여 작제하였다(pTV119중 NcoI가 NdeI 사이트로 전환된 플라스미드).
(3) RNase HII 유전자를 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열의 확인
참고 실시예 7-(2)에서 수득한 pAFU204 내로 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 디데옥시 방법에 의해 확인하였다.
확인된 뉴클레오티드 서열을 분석하여 RNase HII를 코딩하는 것으로 가정된 오픈 리딩 프레임의 존재를 밝혀냈다. 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 153에 나타낸다. 뉴클레오티드 서열로부터 유도된 RNase HII의 아미노산 서열을 서열번호 154에 나타낸다.
플라스미드 pAFU204로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109을 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109/pAFU204로 명명하고 2001년 2월 22일(원기탁일)에 기탁번호 BP-7692하에 International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central(6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan)에 기탁하였다.
(4) 정제된 RNase HII 샘플 제조
참고 실시예 7-(2)에서 수득한 pAFU204로 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)를 형질전환시켰다. pAFU204을 포함하는 생성된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109를 100μg/㎖의 앰피실린을 포함하는 2L의 LB 배지내로 접종하고 37℃에서 16시간동안 진탕시키면서 배양하였다. 배양후, 원심분리에 의해 회수한 세포를 37.1㎖의 초음파 처리 완충액[50mM tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 2mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드]에 현탁시키고 초음파처리하였다. 10분동안 12000rpm에서 초음파 처리된 현탁액을 원심분리하여 수득한 상층액을 15분동안 70℃에서 가열하였다. 10분동안 다시 12000rpm에서 다시 원심분리하여 수득한 상층액을 15분동안 80℃에서 가열하였다.
가열된 상층액을 완충액 A[50mM tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA]으로 평형화된 RESOURSE Q 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용하고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 결과, RNase H는 RESOURSE Q 칼럼을 통해 이동하였다.
35.0㎖의 이동(flow-through) RNnase HII 분획을 완충액 A으로 평형화된 RESOURSE S 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용하고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 결과, RNase H는 RESOURSE S 칼럼을 통해 이동하였다.
40.0㎖의 이동 RNnase HII 분획을 50mM NaCl을 포함하는 2L의 완충액 B[50mM tris-HCl(pH 7.0), 1mM EDTA]을 2시간동안 투석하였다. 투석을 2회 더 반복하였다. 40.2㎖의 투석 효소 용액을 50mM NaCl를 포함하는 완충액 B로 평형화된 HiTrap\-heparin 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 0 내지 500mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 240mM NaCl로 용출된 RNase II를 포함하는 분획을 수득하였다.
7.8㎖의 RNase HIII 분획을 한외여과에 의해 Centricon-10(Amicon)을 사용하여 농축시켰다. 600 ㎕의 농축액으로 각각 분리된 4분량을 100mM NaCl 및 0.1mM EDTA를 포함하는 50mM Tris-HCl(pH 7.0)로 평형화된 Superose 6 겔 여과 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 동일한 완충액으로 용출시켰다. 결과 RNase HIII가 분자량 30.0 킬로달톤에 상응하는 위치에서 용출되었다. 이 분자량은 모노머 형태의 RNase HII의 것과 일치한다.
상기 기술된 바와 같이 용출된 RNase HII를 Afu RNase HII 샘플로서 사용하였다.
수득한 Afu RNase HII 샘플의 효소 활성을 참고 실시예 3-(5)에 기술된 바와 같이 측정하였다. 결과 Afu RNase HII 샘플에 대한 RNase H 활성을 관찰하였다.
참고 실시예 8
본 발명에서 사용되는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 RNase H의 유니트 값을 하기 방법에 따라 측정하였다.
(1) 사용하는 시약 용액의 제조
역가측정용 반응 혼합물 : 최종농도가 각각 40mM 트리스-염산(pH 7.7, 37℃), 4mM 염화마그네슘, 1mM DTT, 0.003% BSA, 4% 글리세롤 및 24μM 폴리(dT)가 되도록 멸균수로 제조하였다.
폴리(8-3H)아데닐산 용액 : 370kBq의 폴리(8-3H)아데닐산 용액을 200㎕의 멸균수에 희석하였다.
폴리아데닐산 용액 : 폴리아데닐산을 초순수의 멸균수(sterile ultraqure water)를 사용하여 3mM의 농도로 희석시켰다.
효소 희석액 : 최종농도가 각각 25mM 트리스-염산(pH 7.5, 37℃), 5mM 2-머캅토에탄올, 0.5mM EDTA(pH 7.5, 37℃), 30mM 염화나트륨 및 50% 글리세롤이 되도록 멸균수로 제조하였다.
열변성 송아지 흉선 DNA의 제조 : 송아지 흉선 DNA 200㎎을 TE 완충액 100㎖에 현탁하여 팽윤시켰다. 이 용액을 UV 260㎚에서 측정된 흡광도에 기초하여 1㎎/㎖의 농도가 되도록 멸균 초순수로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 100℃에서 10분간 가열한 후, 얼음조에서 급냉하였다.
(2) 활성 측정 방법
상기 (1)에서 제조한 역가측정용 반응 혼합물 985㎕에 폴리(8-3H)아데닐산 용액 7㎕를 가하였다. 상기 혼합물을 37℃에서 10분간 인큐베이션시켰다. 최종농도가 24μM이 되도록 8㎕의 폴리아데닐산을 가하였다. 추가로 37℃에서 5분간 인큐베이션시켰다. 이렇게 하여 폴리(8-3H)rA-폴리dT 반응 혼합물 1000㎕를 제조하였다. 이어서, 이 반응액 200㎕를 30℃에서 5분간 인큐베이션시켰다. 적절하게 희석된 일 련의 효소액 1㎕를 가하였다. 시간동안 이들 반응액을 50㎕씩 샘플링하여, 다음 측정에 사용하였다. 효소첨가로부터 샘플링까지의 시간을 Y분으로 하였다. 또, 총 CPM용 반응 혼합물 50㎕ 또는 블랭크용 반응 혼합물 50㎕를 효소액 대신에 효소 희석액을 1㎕ 가하여 제조하였다. 이 샘플링 용액에 10mM 피롤린산 나트륨 100㎕, 열변성 송아지 흉선 DNA 용액 50㎕ 및 10% 트리클로로 아세트산 300㎕(총 CPM 측정의 경우는, 초순수 300㎕)을 가하였다. 혼합물을 0℃에서 5분간 인큐베이션시킨 후, 10000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리후, 수득된 상등액 250㎕를 바이얼에 넣었다. 아쿠아졸-2(NEN Life Science Products) 10㎖를 가하였다. 액체 신틸레이션 카운터(Scintillation counter)로 CPM을 측정하였다.
(3) 유니트 계산
각 효소의 유니트 값을 이하의 계산식으로 산출하였다.
유니스/㎖ = {(측정된CPM-블랭크CPM) x 1.2* x 20 x 1000 x 희석율}200(㎕)/(총 CPM x Y(분) x 50(㎕) x 9**)
1.2* : 50㎕당 총 CPM중에 함유된 폴리(8-3H)rA-폴리dT의 양(nmol)
9** : 보정계수
실시예 1
본 발명의 방법은 장출혈성 E.coli O-157을 검출하기 위하여 사용되었다.
실시예에서 사용되는 프라미어의 서열을 서열 목록의 서열번호 31 내지 34에 나타낸다. 프라이머 각각 서열번호 31 또는 32의 서열을 갖는 프라이머의 결합물을 O-157의 베로독소 (VT) 1을 코딩하는 서열을 검출하기 위하여 작제하고, 프라이머 각각 서열번호 33 또는 34의 서열을 갖는 프라이머의 결합물을 O-157의 베로독소 (VT) 2를 코딩하는 서열을 검출하기 위하여 작제하였다. 장출혈성 E.coli O-157(ATCC 수탁번호 43895)을 배양하고, 세포를 회수하고, 적절한 세포 밀도로 멸균수에서 세포를 현탁시키고 10분동안 98℃에서 처리하여 제조된 온수 추출액을 주형으로서 사용하였다. 반응 혼합물의 조성은 하기와 같았다.
27mM 인산 완충액(pH 7.3), 0.01% 소 혈청 알부민(BSA), 5% 디메틸설폭시드(DMSO), 1mM 각 dNTPs, 8mM 아세트산마그네슘, 60pmol의 각각의 프라이머, 104-106개의 세포에 상응하는 주형으로서 DNA(온수-추출액) 및 48 ㎕의 반응 용량으로 멸균 증류수. 반응 혼합물을 1분동안 98℃에서 열-변성시킨 후 55℃으로 냉각시켰다. 5.5U BcaBEST DNA 폴리머라제 및 60U E.coli RNase H를 가하였다. 반응 혼합물을 60분동안 55℃에서 인큐베이션시켰다. 이후, 혼합물을 2분동안 90℃에서 가열하여 효소를 불활성화시켰다. 3 ㎕의 각 반응 혼합물을 4% NuSieve 3:1 아가로스(Takara Shuzo) 겔상에서 전기영동시켰다. 결과, 베로독소 1 및 2가 프라이머쌍중 하나 및 104개 세포에 상응하는 주형으로서 DNA를 사용하여 검출될 수 있고, 본 발명의 방법이 독성 박테리움를 검출하기 위한 방법으로 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 2
(1) 본 발명의 방법에서 사용되는 완충액 유형의 효능을 조사하였다. 서열번호 39 및 40에 나타낸 서열을 갖는 λDNA를 증폭시키는 프라이머를 실시예에서 사용하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 120pmol의 각 프라이머, 0.01% 프로필렌디아민 수용액 및 주형으로서 10ng 또는 1ng DNA를 포함하는 10 ㎕의 혼합물을 2분동안 98℃에서 열-변성시키고, 얼음상에서 냉각시켜 프라이머가 주형 DNA에 어닐링되도록 하였다. 서열번호 41 및 42에 나타낸 프라이머 및 주형으로서 λDNA(Takara Shuzo)를 사용하여 PCR에 의하고, Suprec02((Takara Shuzo)를 사용하여 정제된 증폭 산물(1005bp)을 주형으로서 사용하였다.
어닐링 후, 0.625mM 각 dNTPs, 5.0mM 아세트산마그네슘, 0.0125% 소 혈청 알부민(BSA), 1.25% 디메틸설폭시드(DMSO), 11U BcaBEST DNA 폴리머라제 및 30U E.coli RNase H를 포함하는 40 ㎕의 3가지 유형의 반응용 완충액(42.5mM Tricine-수산화칼륨(pH 8.5), 42.5mM Bicine-수산화칼륨(pH 8.5) 및 42.5mM HEPES-수산화칼륨(pH 8.5))중 하나를 혼합물에 가하여 최종 용량을 50 ㎕으로 하였다. 반응 혼합물을 1시간동안 60℃에서 인큐베이션시켰다. 반응후, 3 ㎕의 각 반응 혼합물을 확인하기 위하여 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 이후, 관심의 대상이 되는 증폭 단편을 주형의 양으로 둘다에 대하여 관찰하였다. 특히 더 많은 증폭 산물을 Bicine-수산화칼륨(pH 8.5)을 포함하는 반응 시스템에서 수득하였다.
(2) HEPES-수산화칼륨 완충액의 사용에 대한 반응 개선을 조사하였다. 멀티-클로닝 사이트내로 삽입된 약 150bp의 DNA 단편을 갖는 pUC19 플라스미드를 주형으로서 사용하였다. 주형을 하기와 같이 제조하였다.
서열번호 134 및 135로 나타낸 서열을 갖는 pUC19 상류(upper) 150 PCR 프라이머 및 pUC19 하류(lower) PCR 프라이머 및 주형으로서 100pg의 pUC19 플라스미드 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였따. 생성된 증폭 단편을 Microcon-100을 사용하여 정제하고, DNA 블런팅 키트(Takara Shuzo)를 사용하여 말단을 둔화시키고 플라스미드 pUC19의 HindII 사이트내로 서브클로닝하였다. 삽입된 증폭 단편을 갖는 플라스미드를 사용하여 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109를 형질전환시켰다. 형질전환체를 배양하였다. 삽입된 DNA를 갖는 플라스미드를 QIAGEN 플라스미드 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 세포로부터 정제하고 주형으로서 사용하였다.
상기 기재된 바와 같이 제조된 pUC19-150 플라스미드 DNA, 및 서열번호 35 및 36에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 MCS-F 및 MCS-R를 사용하여 PCR-증폭된 DNA 단편을 주형으로서 사용하였다. 서열번호37 및 38로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 MF2N3(24) 및 MR1N3(24)를 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머로서 사용하였다. 이들 프라이머 결합물을 사용하여 수득된 증폭 단편의 크기는 약 350 bp이었다.
HEPES-수산화칼륨 완충 시스템을 조사하고자 하는 완충액으로서 사용하였다. 인산칼륨 완충 시스템 및 Tricine 완충 시스템을 대조군으로서 사용하였다. 반응 혼합물의 조성은 하기와 같다.
반응 혼합물 A: 10 ㎕의 반응 용량으로 10ng의 PCR-증폭된 단편, 50 pmol의 각각의 프라이머 MF2N3(24) 및 MR1N3(24), 0.01% 프로필렌디아민 수용액 및 10 M 아세트산마그네슘 및 멸균증류수.
반응 혼합물 B: 하기의 3가지 유형을 제조하였다.
수산화칼륨 완충 시스템 : 최종 농도로 35mM 수산화칼륨 완충(pH 7.5), 1.25% DMSO, 1.25% BSA, 5mM 아세트산마그네슘, 0.625mM 각 dNTPs, 60U BcaBEST DNA 폴리머라제 및 5.5U E.coli RNase H를 포함하는 40 ㎕의 반응 혼합물을 제조하였다.
Tricine 완충 시스템 : 최종 농도로 42.5mM Tricine 완충액(pH 7.5), 12.5mM 염화칼륨, 12.5mM 황산암모늄, 1.25% DMSO, 1.25% BSA, 5mM 아세트산마그네슘, 0.625mM 각 dNTPs, 30U BcaBEST DNA 폴리머라제 및 5.5U E.coli RNase H를 포함하는 40 ㎕의 반응 혼합물을 제조하였다.
HEPES-수산화칼륨 완충 시스템 : 최종 농도로 25mM HEPES-수산화칼륨 완충액(pH 7.8), 125mM 아세트산칼륨, 12.5mM 황산암모늄, 1.25% DMSO, 1.25% BSA, 5mM 아세트산마그네슘, 0.625mM 각 dNTPs, 30U BcaBEST DNA 폴리머라제 및 5.5U E.coli RNase H를 포함하는 40 ㎕의 반응 혼합물을 제조하였다.
반응 혼합물 A를 2분동안 98℃에서 열-변성시키고, 60℃ 또는 65℃으로 냉각시킨 후 얼음상에서 방치시켰다. 반응 혼합물 B중 하나를 얼음상에서 반응 혼합물 A에 가하여 50 ㎕으로 반응 용량을 만들었다. 반응 혼합물을 1시간동안 60℃ 또는 65℃으로 인큐베이션시켰다. 반응 후, 4℃으로 냉각시키고 1/10 용량의 0.5M EDTA를 각 혼합물에 가하여 반응을 종결시켰다. 3 ㎕의 각 혼합물을 3% NuSieve 3:1 아가로스(Takara Shuzo) 겔상에서 전기영동시켰다. 결과, 관심의 대상이 되는 증폭된 단편은 사용된 반응 온도와 상관없이 3개의 완충 시스템을 관찰하였다. 특히 다량 의 증폭 산물 및 높은 반응성을 본 실시예에서 HEPES-수산화칼륨에 대하여 관찰하였다.
실시예 3
(1) 프라이머를 주형에 어닐링하기 위한 본 발명의 방법에서 사용되는 조건을 조사하였다. WO 97/32010에 기술된 플라보박테리움 속(Flavobacterium) SA-0082 (수탁번호 FERM P-14872하에 1995넌 3월 29일 기탁 International Patent organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, 및 수탁번호 FERM BP-5402하에 International Patent 또는ganism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science 및 Technology, AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan에 기탁 (국제 기탁 기관으로의 이관일: 1996년 2월 15일)의 부분 뉴클레오티드 서열에 기초한 서열번호 43 및 44에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머를 사용하였다. 주형으로서 플라보박테리움 속(Flavobacterium) SA-0082로부터의 게놈 DNA 및 서열번호 45 및 46에 나타낸 프라이머의 결합물을 사용한 PCR에 의해 수득된 증폭 산물(573 bp)을 Suprec02 (Takara Shuzo)을 사용하여 정제한 후 본 실시예에서 주형으로서의 DNA로 사용하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 2 ㎕의 두개의 어닐링 용액중 하나(500mM 염화칼륨 및 8μM 스퍼미딘, 또는 0.05% 프로필렌디아민)을 120pmol의 각 프라이머에 가하였다. 10ng 또는 1ng의 PCR-증폭 단편을 추가로 포함하는 최종 용량 10 ㎕의 각 혼합물을 2분동안 98℃에서 열-변성시켰다. 변성후, 혼합물을 신속하게 얼음상에서 냉각시켜 프라이머를 주형에 어닐링시켰다.
어닐링 후, 0.625mM 각 dNTPs, 5.0mM 아세트산마그네슘, 0.0125% 소 혈청 알부민(BSA), 1.25% 디메틸설폭시드(DMSO), 11U BcaBEST DNA 폴리머라제 및 30U E.coli RNase H를 포함하는 40 ㎕의 3가지 유형의 반응용 완충액(42.5mM Tricine-수산화칼륨(pH 8.5), 42.5mM Bicine-수산화칼륨(pH 8.5) 및 42.5mM HEPES-수산화칼륨(pH 8.5))중 하나를 혼합물에 가하여 최종 용량을 50 ㎕으로 하였다. 반응 혼합물을 1시간동안 52℃에서 인큐베이션시켰다. 반응후, 3 ㎕의 각 반응 혼합물을 확인하기 위하여 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 1에 나타낸다. 도 1은 어닐링 용액 및 완충액의 각 결합물을 사용한 반응물의 전기영동의 결과를 나타낸다. 레인 1: 분자량 마커(100bp 레더, Takara Shuzo); 레인 2: 프로필렌디아민/Tricine(주형: 10ng); 레인 3: 프로필렌디아민/HEPES(주형: 10ng); 레인 4: 프로필렌디아민/HEPES(주형: 1ng); 레인 5: 프로필렌디아민/Bicine(주형: 10ng); 레인 6: 프로필렌디아민/Bicine (주형: 1 ng); 레인 7: 500 mM 염화칼륨 및 8μM 스퍼미딘/Bicine(주형: 10ng); 레인 8: 500 mM 염화칼륨 및 8μM 스퍼미딘/Bicine(주형: 1ng); 레인 9: 분자량 마커(100bp 레더); 레인 10: 프로필렌디아민/Tricine(주형: 1ng); 레인 11: 500 mM 염화칼륨 및 8μM 스퍼미딘/Tricine(주형: 1ng); 레인 12: 프로필렌디아민/HEPES(주형: 1ng); 레인 13: 500 mM 염화칼륨 및 8μM 스퍼미딘/HEPES(주형: 1ng); 레인 14: 프로필렌디아민/Bicine (주형: 1 ng); 레인 15: 500 mM 염화칼륨 및 8μM 스퍼미딘/Bicine(주형: 1ng).
도 1에 나타낸 바와 같이 주형으로서 DNA의 양에 상관없이 주형 DNA에 프라 이머를 어닐링하깅 위하여 500 mM 염화칼륨 + 8μM 스퍼미딘을 포함하는 어닐링 용액을 사용하는 경우 더 많은 관심의 대상이 되는 증폭 산물을 수득하였다. 특히 500 mM 염화칼륨 + 8μM 스퍼미딘을 포함하는 어닐링 용액 및 Bicine-염화칼륨 완충액의 배합물을 본 실시예에서 우수한 결과를 산출한다.
(2) λDNA로부터의 PCR-증폭 단편을 주형으로서 사용하는 경우 어닐링 용액의 효능을 조사하였다. 실시예 2(1)에 기술된 키메라성 올리코뉴클레오티드 프라이머를 본 실시예에서 사용하였다. 실시예 2(1)에서 제조된 바와 같은 PCR-증폭 단편 또는 λDNA을 주형 DNA로 사용하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 2 ㎕의 3가지 형태의 어닐링 용액중 하나(500mM 염화칼륨 및 8μM 스퍼미딘, 또는 멸균수)을 120pmol의 각 프라이머에 가하였다. 10ng 또는 1ng의 PCR-증폭 단편을 추가로 포함하는 10 ㎕의 각 혼합물을 제조하였다. 혼합물을 2분동안 98℃에서 열-변성시키고, 신속하게 얼음상에서 냉각시켜 프라이머를 주형에 어닐링시켰다.
어닐링 후, 0.625mM 각 dNTPs, 5.0mM 아세트산마그네슘, 0.0125% 소 혈청 알부민(BSA), 1.25% 디메틸설폭시드(DMSO), 11U BcaBEST DNA 폴리머라제 및 30U E.coli RNase H를 포함하는 40 ㎕의 3가지 유형의 반응용 완충액(42.5mM Tricine-수산화칼륨(pH 8.5), 42.5mM Bicine-수산화칼륨(pH 8.5) 및 42.5mM HEPES-수산화칼륨(pH 8.5))중 하나를 혼합물에 가하여 최종 용량을 50 ㎕으로 하였다. 반응 혼합물을 1시간동안 52℃에서 인큐베이션시켰다. 반응후, 3 ㎕의 각 반응 혼합물을 확인하기 위하여 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 2에 나타낸다. 도 2는 주형의 양, 반응 완충액 및 어닐링 용액의 조합을 조합한 결과를 나타내는 전기영동 결과를 설명한다. 레인 1: 분자량 마커(100bp 레더); 레인 2: 10ng 주형, Tricine/500mM 염화칼륨 및 스퍼미딘 배합물; 레인 3: 1ng 주형, Tricine/500mM 염화칼륨 및 스퍼미딘 배합물; 레인4: 10ng 주형, Bicine/500mM 염화칼륨 및 스퍼미딘 배합물; 레인 5: 1ng 주형, Bicine/500mM 염화칼륨 및 스퍼미딘 배합물; 레인6: 10ng 주형, HEPS/500mM 염화칼륨 및 스퍼미딘 배합물; 레인7: 1ng 주형, HEPS/500mM 염화칼륨 및 스퍼미딘 배합물; 레인 8: 분자량 마커(100bp 레더); 레인 9: 10 ng의 주형, Tricine/프로필렌디아민 배합물; 레인 10: 1 ng의 주형, Tricine/프로필렌디아민 배합물; 레인 11: 10 ng의 주형, Bicine/프로필렌디아민 배합물; 레인 12: 1 ng의 주형, Bicine/프로필렌디아민 배합물; 레인 13: 10 ng의 주형, HEPES/프로필렌디아민 배합물; 레인 14: 10 ng의 주형, HEPES/프로필렌디아민 배합물; 레인 15: 분자량 마커(100bp 레더); 레인 16: 10 ng의 주형, Tricine/물 배합물; 레인 17: 1 ng의 주형, Tricine/물 배합물; 레인 18: 10 ng의 주형, Bicine/물 배합물; 레인 19: 1 ng의 주형, Bicine/물 배합물; 레인 20: 10 ng의 주형, HEPES/물 배합물; 레인 21: 10 ng의 주형, HEPES/물 배합물.
도 2에 나타낸 바와 같이 관십의 대상이 되는 증폭 단편을 주형 DNA의 양과 상관없이 3개의 완충액의 각 배합물에 대하여 관찰하였다. 특히 500mM 염화칼륨 및 8μM 스퍼미드를 포함하는 어닐링 용액 및 Bicin 완충액의 배합물을 사용하여 더 많은 증폭된 단편을 수득하였다.
실시예 4
본 발명의 방법에서 역전사 효소(RNase)의 저해제의 존재에 대한 효능을 조 사하였다. 포스포노포름산(PFA)를 RTase의 저해제로서 사용하였다. 서열번호 47 및 48에 나타낸 프라이머를 본 실시예에서 사용하였다. 주형으로서 장출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 유래된 게놈 DNA 및 서열번호 49 및 50에 나타낸 프라이머를 사용하여 PCR, 이어서 Suprec02 (Takara Shuzo)에 의해 정제시켜 수득한 에 의해 수득한 증폭 산물(576bp)를 주형 DNA로 사용하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 1ng의 PCR-증폭 단편을 120pmol의 각 프라이머 및 500mM 염화칼륨 및 8μM 스퍼키딘을 포함하는 2 ㎕의 어닐링 용액에 가하여 제조된 10 ㎕의 각 혼합물을 2분동안 98℃에서 열-변성시키고, 신속하게 얼음상에서 냉각시켜 프라이머를 주형에 어닐링시켰다.
어닐링 후, 0.625mM 각 dNTPs, 42.5mM Tricine-수산화칼륨 완충액(pH 8.5), 5.0mM 마그네슘아세테이트, 0.0125% 소 혈청 알부민(BSA), 1.25% 디메틸설폭시드(DMSO), 11U BcaBEST DNA 폴리머라제 및 30U E.coli RNase H 및 500μg/㎖ 또는 50μg/㎖의 농도로 PFA를 포함하는 40 ㎕의 혼합물을 어닐링 혼합물에 가하여 최종 용량을 50 ㎕으로 하였다. 반응 혼합물을 1시간동안 55℃에서 인큐베이션시켰다. PFA를 가하지 않는 시스템을 대조군으로 사용하였다. 반응후, 9 ㎕의 각 반응 혼합물을 확인하기 위하여 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3은 역전사 효소 활성의 저해제 효능을 설명하는 전기영동 결과를 나타낸다. 레인 1: 분자량 마커(100bp 레더); 레인 2: PFA 첨가하지 않음; 레인 3: 500μg/㎖ 의 PFA 첨가; 레인4: 50μg/㎖의 PFA 첨가.
도 3에 나타낸 바와 강, PFA를 첨가하였을 때 비특정 증폭은 억제되었고 관 심의 대상이 되는 단편이 관찰되었다. 특히 PFA를 첨가하지 않은 시스템에서 관찰된 비특정 증폭 산물은 관찰되지 않았고 관심의 대상이 되는 증폭 단편은 PFA를 50μg/㎖의 농도로 첨가한 시스템에서 명확하게 증폭되었음을 확인하였다.
실시예 5
본 발명의 방법에서 증폭시키고자 하는 단편의 길이 및 검출 감수성의 관계를 조사하였다.
(1) 서열번호 51 내지 52에 나타낸 장출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157 베로독소를 증폭시키기 위한 프라이머를 합성하였다. 실시예 4에서 사용된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하였다. 각각의 프라이머 결합물을 사용하는 증폭시키고자 하는 단편의 길이는 하기와 같아았다. 247 bp (서열번호51 및 48); 168 bp (서열번호52 및 53); 206 bp (서열번호52 및 48); 135 bp (서열번호47 및 53); 및 173 bp (서열번호47 및 48).실시예 4에서 제조된 정제된 PCR-증폭 576bp 단편을 본 실시예에서 주형으로서 사용하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 60pmol의 각 프라이머, 2 ㎕의 0.05% 폴리에틸렌아민 수용액 및 10fg 내지 10ng의 PCT-증폭 단편을 포함하는 10 ㎕의 각 혼합물을 2분동안 98℃에서 열-변성시킨 후, Thermal Cycler Persnoal(Takara Shuzo)내에서 55℃으로 냉각시켜 프라이머를 주형에 어닐링시켰다.
어닐링 후, 0.625mM 각 dNTPs, 42.5mM Tricine-수산화칼륨 완충액(pH 8.5), 5.0mM 마그네슘아세테이트, 0.0125% 소 혈청 알부민(BSA), 1.25% 디메틸설폭시드(DMSO), 5.5U BcaBEST DNA 폴리머라제 및 30U E.coli RNase H 및 멸 균수를 포함하는 40 ㎕의 혼합물을 가하여 최종 용량을 50 ㎕으로 하였다. 반응 혼합물을 1시간동안 55℃에서 인큐베이션시켰다. 반응 후 5 ㎕의 각 반응 혼합물을 확인하기 위하여 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 대조군으로서 10fg 내지 10ng의 PCR-증폭 단편의 검출을 서열번호 54 및 55로 나타낸 프라이머를 사용하여 수행하였다. 135-bp의 단편을 이들 프라이머의 결합물을 사용하여 증폭시킨다. 60pmol의 각 프라이머, 5 ㎕의 10 x Ex Taq 완충액(Takara Shuzo), 1.25U TaKaRa Ex Taq DNA 폴리머라제(Takara Shuzo) 및 0.2mM의 각 dNTPs를 포함하하는 50 ㎕의 PCR 용액을 제조하였다. PCR을 하기와 같이 수행하였다: 30초동안 94℃, 30초동안 55℃, 30초동안 72℃에서 25 또는 30싸이클(2분. 38초/싸이클). 반응후, 1 ㎕(ICAN) 또는 5 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 4 및 표 1에 나타낸다.
표 1
증폭 크기(bp) 검출 한도
ICAN(총 시간: 70분) 247 168 206 135 173 100pg 100fg 100pg 10fg 100fg
PCR(25싸이클: 총시간:약 66분) 135 100fg
PCR(30싸이클: 총시간:약 80분) 135 19fg

도 4는 ICAN(1/50의 반응 혼합물을 로딩) 및 PCR(1/10의 반응 혼합물을 로딩)에 의해 수득한 쇄 길이 135bp를 증폭시키기 위한 검출 한도를 나타내는 전기영동의 결과를 보여준다. 레인 1: 분자량 마커(100bp 레더); 레인 2: 1ng의 주형을 사용한 ICAN; 레인 3: 100fg의 주형을 사용한 ICAN; 레인 4: 10fg의 주형을 사용한 ICAN; 레인 5: 1ng의 주형을 사용한 PCR(25싸이클); 레인 6: 100fg의 주형을 사용한 PCR(25싸이클); 레인 7: 10fg의 주형을 사용한 PCR(25싸이클); 레인 8: 1pg의 주형을 사용한 PCR(30싸이클); 레인 9: 100fg의 주형을 사용한 PCR(30싸이클); 레인 10: 10fg의 주형을 사용한 PCR(30싸이클).
표 1에 나타낸 바와 같이, PCR의 것과 동일한 검출 감수성을 ICAN에서 수득하였음을 확인하였다. 또한, PCR에 대한 총 반응 시간은 약 80분이고, 본 발명의 방법을 사용하여 동일한 검출 감수성을 얻기 위하여 필요한 반응 시간은 70분이고, 이는 반응 시간은 본 발명의 방법을 사용하여 단축될 수 있음을 확인시켜주었다.
(2) 서열번호 39,40 및 56에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 λDNA를 증폭 시키기 위한 프라이머를 합성하였다. 각 프라이머 결합물을 사용하여 증폭시키고자 하는 단편의 길이는 하기와 같다: 151 bp (서열번호39 및 40) 및 125 bp (서열번호56 및 40. 실시예 2(1)에서 제조된 주형 DNA를 본 실시예에서 사용하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 2 ㎕의 어닐링 용액(500mM 염화칼륨 및 8μM 스퍼미딘), 1fg 내지 1ng의 주형을 120pmol의 각 프라이머에 가하고 멸균수로 10 ㎕까지 채웠다. 혼합물을 2분동안 98℃에서 열-변성시킨 후, 얼음상에서 신속하게 냉각시켜 프라이머를 주형에 어닐링시켰다.
어닐링 후, 0.625mM 각 dNTPs, 42.5mM Tricine-수산화칼륨 완충액(pH 8.5), 5.0mM 마그네슘아세테이트, 0.0125% 소 혈청 알부민(BSA), 1.25% 디메틸설폭시드(DMSO), 11U BcaBEST DNA 폴리머라제 및 30U E.coli RNase H 및 멸균수를 포함하는 40 ㎕의 혼합물을 가하여 최종 용량을 50 ㎕으로 하였다. 반응 혼합물을 1시간동안 60℃에서 인큐베이션시켰다. 반응 후 3 ㎕의 각 반응 혼합물을 확인하기 위하여 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 표 2에 나타낸다.
표 2
증폭 크기(bp) 검출 한도
125 151 10fg 100fg
표 2에 나타낸 바와 같이 λDNA를 주형으로서 사용하는 경우 10fg와 같은 낮은 검출 감수성을 최적 부위를 조사하여 얻었다.
(3) 증폭 단편(길이: 340 bp)을 플라스미드 T7Blue T-벡터 (Takara Shuzo)로 삽입하여 플라스미드를 제조하였다. 서열번호 57 및 58을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 갖는 크리산써뭄(chrysanthemum) 비로이드 유전자을 증폭시키기 위한 합성 프라이머 및 주형으로서 비로이드로 감염된 크리산써뭄(chrysanthemum)로부터의 RNA를 사용하여 단편을 JP-A 9-140383 에 기재된 바와 같이 제조하였다. 플라스미드를 사용하여 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109 항체 반응 능력이 있는 세포(Takara Shuzo)를 형질전환시켰다. 형질전환체를 16시간동안 37℃에서 5㎖의 LB에서 배양하였다. 플라스미드를 매뉴얼에 따라 QIAGEN 플라스미드 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 회수한 세포로부터 정제하였다. 1 ㎕의 멸균수중 0fg, 1fg, 10fg, 100fg, 1pg, 10pg, 100pg, 또는 1ng의 플라스미드를 Beckman UC-600(Beckman)을 사용하여 측정된 바와 같은 플라스미드의 농도에 기초하여 제조하였다. 1 ㎕의 제조된 플라스미드 용액중 하나를 50 ㎕의 각 ICAN 반응 시스템을 위한 주형으로서 사용하였다. 서열번호 59 및 60프라이머 CSVD-F2 및 CSVD-R6을 본 실시예에서 사용하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 50pmol의 각 프라이머, 1 ㎕의 제조된 플라스미드 용액 및 최종 농도 0.01%의 프로필렌디아민을 포함하는 10 ㎕의 혼합물을 제조하였다. 혼합물을 2분동안 98℃에서 열-변성시킨 후, Thermal Cycler Personal(Takara Shuzo)에서 1분간 상기 온도에서 인큐베이션시키고 얼음상에 방치하였다.
어닐링 후, 최종 농도로 20mM HEPES-염화칼륨(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 1% DMSO, 0.01% BSA, 4mM 아세트산마그네슘, 500μM의 각 dNTPs, 5.5U BcaBEST DNA 폴리머라제 및 30U E.coli RNase H를 혼합물에 가하여 최종 용량을 50 ㎕으로 하였 다. 반응 혼합물을 60℃으로 세팅된 Thermal Cycler Personal(Takara Shuzo)에 놓고 60분동안 반응시켰다. 반응 후 3 ㎕의 각 반응 혼합물을 3% NuSieve 3:1 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과 관심의 대상이 되는 증폭 산물(약 90bp, 약 70bp 및 약 50bp)를 10fg의 농도로 주형을 사용하여 관찰되었다.
실시예 6
본 발명의 방법에서 사용되는 프라이머를 조사하였다.
(1) 프라이머의 Tm 값 및 반응 온도를 조사하였다. 서열번호43 및 61-63에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 플라보박테리움(Flavobacterium) 종. SA-0082을 증폭시키기 위한 프라이머를 합성하였다. 이 프라이머를 작제하여 약 20%의 GC 함량을 갖는 160bp 이하의 부위을 증폭시켰다. 각 프라이머 결합물을 사용하여 증폭시키고자 하는 단편의 길이는 하기와 같았다: 126 bp (서열번호43 및 62); 158 bp (서열번호43 및 63); 91 bp (서열번호61 및 62); 및 123 bp (서열번호61 및 63). 실시예3(1)에서 제조된 PCR-증폭 산물을 본 실시예에서 주형 DNA로서 사용하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 20pmol의 각 프라이머, 2 ㎕의 3가지 유형중 어닐링 용액(500mM 염화칼륨 및 8μM 스퍼미딘, 0.05% 포르필렌디아민, 또는 물) 하나, 1fg 내지 10ng의 주형을 포함하는 10 ㎕의 혼합물을 제조하였다. 혼합물을 2분동안 98℃에서 열-변성시킨 후, 얼음상에서 신속하게 냉각시켜 프라이머를 주형에 어닐링시켰다.
어닐링 후, 0.625mM 각 dNTPs, 5.0mM 아세트산마그네슘, 0.0125% 소 혈청 알부민(BSA), 1.25% 디메틸설폭시드(DMSO), 11U BcaBEST DNA 폴리머라제 및 30U E.coli RNase H를 포함하는 40 ㎕의 3가지 유형의 반응용 완충액(17mM Tricine-수산화칼륨(pH 8.5), 17mM Bicine-수산화칼륨(pH 8.5) 및 17mM HEPES-수산화칼륨(pH 8.5))중 하나를 혼합물에 가하여 최종 용량을 50 ㎕으로 하였다. 반응 혼합물을 1시간동안 52, 55 또는 60℃에서 인큐베이션시켰다. 반응후, 3 ㎕의 각 반응 혼합물을 확인하기 위하여 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과, 관심의 대상이 되는 증폭 단편을 52℃의 반응 온도를 사용하여 관찰하였다. 특히, 500mM 염화칼륨 및 8μM 스퍼미딘 및 Tricine 또는 Bicine 완충액을 포함하는 어닐링 용액의 결합물을 사용하여 더 많은 양의 관심의 대상이 되는 증폭 단편을 수득하였다. 프라이머쌍, 증폭 단편의 길이 및 52℃의 반응 온도에 대한 검출 감수성을 도 5 및 표 3에 나타낸다.
표 3
증폭 크기(bp) 검출 한도
126 158 91 123 100fg 1pg 1fg 100fg
도 5는 AT-풍부한 부위를 증폭시킬 때 주형 DNA의 양과 증폭된 단편의 길이 사이의 관계를 나타내는 전기영동 결과를 보여준다. 레인 1: 분자량 마커(100 bp 레더); 레인 2: 1pg의 주형을 사용하여 길이 91 bp의 단편 증폭; 레인 3: 100 fg의 주형을 사용하여 길이 91 bp의 단편 증폭; 레인 4: 10 fg의 주형을 사용하여 길이 91 bp의 단편 증폭; 레인 5: 1 fg의 주형을 사용하여 길이 91 bp의 단편 증폭; 레인 6: 1 pg의 주형을 사용하여 길이 123bp의 단편 증폭; 레인 7: 100 fg의 주형을 사용하여 길이 123bp의 단편 증폭; 레인 8: 10 fg의 주형을 사용하여 길이 123bp의 단편 증폭; 레인 9: 1 pg의 주형을 사용하여 길이 126bp의 단편 증폭; 레인 10: 100 fg의 주형을 사용하여 길이 126bp의 단편 증폭; 레인 11: 10 fg의 주형을 사용하여 길이 126bp의 단편 증폭; 레인 12: 1 pg의 주형을 사용하여 길이 158bp의 단편 증폭; 레인 13: 100 fg의 주형을 사용하여 길이 158bp의 단편 증폭; 및 레인 14: 10 fg의 주형을 사용하여 길이 158bp의 단편 증폭.
도 5 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법을 At-풍부한 주형 및 At-풍부 프라이머 세트를 사용하여 수행하는 경우 프라이머의 Tm값에 따라 우수한 결과가 더욱 낮은 온도에서 얻을 수 있다는 것인 입증되었다.
(2) 프라이머의 고차 구조(higher-order)가 본 발명의 방법에 영향을 줄 수 있다. 이어서, 프라이머의 고차 구조 형성을 피하고 프라이머를 목적 주형에 용이하게 어닐링시키기 위한 프라이머의 변혀을 조사하였다. 서열번호47, 48 및 64-69에 나타낸 프라이머를 사용하였다. 특히 서열번호 47에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머, 3'-말단으로부터 4, 5, 또는 6번째 염기에서 이노신 데옥시뉴클레오티드를 갖는 서열번호64 내지 66의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 120I4, 121I5 및 122I6, 서열번호 104에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머, 및 서열번호67 내지 69에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖고 3'-말단으로부터 4,5,또는 6번째에서 이노신 데옥시뉴클레오티드을 갖는 프라이머 123I4, 124I5 및 125I6를 사용하였다. 주형으로서 DNA를 실시예 4(1)에서 제조된 것을 본 실시예에서 사용하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다: 간단하게, 50pmol의 각 프라이머, 2 ㎕의 0.05%의 프로필렌디아민 수용액, 1ng 내지 10ng의 주형 DNA 및 멸균 증류수를 포함 하는 10 ㎕의 혼합물을 2분동안 98℃에서 열-변성시킨 후, Thermal cycler(GeneAmp PCR System 9600, Applied Biosystems)을 사용하여 1분동안 온도에서 인큐베이션시켰다.
어닐링 후, 0.625mM 각 dNTPs, 42.5mM Tricine-수산화칼륨 완충액(pH 8.5), 5.0mM 아세트산마그네슘, 0.0125% 소 혈청 알부민(BSA), 1.25% 디메틸설폭시드(DMSO), 5.5U BcaBEST DNA 폴리머라제 및 30U E.coli RNase H 또는 5U의 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus) (Tth) (Toyobo, 이하 Tth RNase H로 언급함)로부터의 열-내성 RNase H를 혼합물에 가하여 멸균수로 최종 용량을 50 ㎕으로 하였다. 반응 혼합물을 1시간동안 55℃에서 인큐베이션시켰다. 반응후, 5 ㎕의 각 반응 혼합물을 확인하기 위하여 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 6에 나타낸다.
도 6은 E.coli RNase H 및 Tth RNase H를 사용하였을 때 이노신 데옥시뉴클레오티드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 효능을 보여주는 전기영동의 결과를 설명한다. 레인 2 내지 9는 E.coli RNase H를 사용하여 수득한 결과를 나타낸다. 레인 10 내지 17은 Tth RNase H를 사용한 결과를 보여준다. 레인 1: 분자량 마커(100 bp 레더); 레인 2: 서열번호47 및 48로 나타낸 프라이머 쌍, 1ng의 주형; 레인 3: 프라이머 120I4 및 123I4의 쌍, 1ng의 주형; 레인 4: 프라이머 121I5 및 124I5의 쌍, 1ng의 주형; 레인 5: 프라이머 122I6 및 125I6의 쌍, 1ng의 주형; 레인 6: 서열번호47 및 48로 나타낸 프라이머의 쌍, 10ng의 주형; 레인 7: 프라이머 120I4 및 123I4의 쌍, 10ng의 주형; 레인 8: 프라이머 121I5 및 124I5 의 쌍, 10ng의 주형; 레인 9: 프라이머 122I6 및 125I6의 쌍, 1ng의 주형; 레인 10: 서열번호47 및 48로 나타낸 프라이머의 쌍, 1ng의 주형; 레인 11: 프라이머 120I4 및 123I4의 쌍, 1ng의 주형; 레인 12: 프라이머 121I5 및 124I5의 쌍, 1ng의 주형; 레인 13: 프라이머 122I6 및 125I6의 쌍, 1ng의 주형; 레인 14: 서열번호47 및 48로 나타낸 프라이머의 쌍, 10ng의 주형; 레인 15: 프라이머 120I4 및 123I4의 쌍, 10ng의 주형; 레인 16: 프라이머 121I5 및 124I5의 쌍, 10ng의 주형; 및 레인 17: 프라이머 122I6 및 125I6의 쌍, 10ng의 주형.
도 6에 나타낸 바와 같이, 프라이머의 3'-말단으로부터 4 또는 5번째 염기에 삽입된 이노신을 갖는 프라이머를 사용하는 경우 주형의 양에 상관없이 E.coli RNase H 또는 Tth RNase H를 사용하였을 때 관심의 대상이 되는 증폭 산물이 관찰되었다. 이 결과는 ICAN의 반응성은 적절한 위치에 이노신을 삽입함으로써 개선된다는 것을 입증한다.
(3) 상기 (2)에서와 동일한 목적으로 프라이머를 연구하였다. 3'-말단에 3개의 염기가 α-S(또는 알파-티오) 리보뉴클레오티드인, 즉 RNA 부위에 5'-포스포티오에이트 결합을 갖는 서열번호 84 및 85로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머 1S 및 4S를 합성하였다. 또한, 3'-말단으로부터 3개의 염기 및 데옥시리보뉴클레오티드 부위의 서열중 한 부위의 리보뉴클레오티드, 즉 프라이머의 3'-말단으로부터 11 내지 13번째 리보뉴클레오티드를 갖는 서열번호 70 및 71로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머 1N3N3 및 4N3N3을 합성하였다. 실시예 4에서 제조된 주형 DNA를 사용하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 50pmol의 각 프라이머, 2 ㎕의 0.05%의 프로필렌디아민 수용액, 10ng의 주형 DNA 및 멸균 증류수를 포함하는 10 ㎕의 혼합물을 2분동안 98℃에서 Thermal cycler를 사용하여 가열한 후 냉각시키기 위하여 얼음상에 방치하였다.
어닐링 후, 0.625mM 각 dNTPs, 42.5mM Tricine-수산화칼륨 완충액(pH 8.5), 5.0mM 아세트산마그네슘, 0.0125% 소 혈청 알부민(BSA), 1.25% 디메틸설폭시드(DMSO), 5.5U BcaBEST DNA 폴리머라제 및 30U E.coli RNase H 또는 5U의 Tth RNase H를 혼합물에 가하여 멸균수로 최종 용량을 50 ㎕으로 하였다. 반응 혼합물을 Thermal cycler에서 1시간동안 55℃에서 인큐베이션시켰다.
반응후, 5 ㎕의 각 반응 혼합물을 확인하기 위하여 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과 증폭 산물을 사용된 RNase H의 유형과 상관없이 프라이머 1S 및 4S 또는 1N3N3 및 4N3N3의 결합물을 사용하여 예상 위치에서 증폭 산물을 명확하게 관찰하였다. 이 결과는 5'-포스포티오테이트로 프라이머의 3'-말단에서 프라이머를 변형하는 것이 본 발명의 방법에 효과적이다는 것을 입증하였다. 또한, 프라이머의 3'-말단외에 적절한 내부 위치에서 리보뉴클레오티드를 사용한 치환이 본 발명의 방법의 반응성을 개선시키는데 효과적임이 확인되었다.
실시예 7
본 발명의 방법에서 특정 망간 이온의 존재하에 E.coli RNase H 활성을 갖는 DNA 폴리머라제의 사용을 조사하였다. 120pmol의 각 실시예 2(1)에서 사용된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머, 2 ㎕의 500mM 염화칼륨 및 8μM 스퍼미딘을 포 함하는 어닐링 용액, 실시예 2(1)에서 사용된 1ng의 주형 DNA 및 멸균 증류수를 포함하는 10 ㎕의 혼합물을 2분동안 98℃에서 열-변성시킨 후 얼음상에 신속하게 냉각시켜 프라이머를 주형에 어닐링시켰다. 어닐링 후, 0.625mM 각 dNTPs, 42.5mM Tricine-수산화칼륨 완충액(pH 8.5), 5.0mM 아세트산마그네슘, 0.0125% 소 혈청 알부민(BSA), 1.0% DMSO 및 11U BcaBEST DNA 폴리머라제, 및 최종 농도 0.5, 2.5, 5.0 또는 10mM의 염화마그네슘(Nacalai Tesque)를 포함하는 40 ㎕의 혼합물에 멸균수로 최종 용량을 50 ㎕으로 하였다. 반응 혼합물을 1시간동안 60℃에서 인큐베이션시켰다. 또한, 염화마그네슘을 첨가하지 않은 혼합물, 및 30U의 E.coli RNase H를 가하고 염화마그네슘을 첨가하지 않은 혼합물을 대조군으로서 제조하였다. 반응후, 3 ㎕의 각 반응 혼합물을 확인하기 위하여 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 7에 나타낸다.
도 7은 BcaBEST DNA 폴리머라제의 RNase H 활성을 사용한 ICAN의 결과를 보여주는 전기영동 결과를 보여준다. 레인 1: 분자량 마커(100 bp 레더); 레인 2: 염화마그네슘 첨가하지 않음/E. coli RNase H 첨가; 레인 3: 염화마그네슘 첨가하지 않음/E. coli RNase H 첨가하지 않음; 레인 4: 0.5 mM 염화마그네슘 첨가/E. coli RNase H 첨가하지 않음; 레인 5: 2.5 mM 염화마그네슘 첨가/E. coli RNase H 첨가하지 않음; 레인 6: 5.0 mM 염화마그네슘 첨가/E. coli RNase H 첨가하지 않음; 및 레인 7: 10.0 mM 염화마그네슘 첨가/E. coli RNase H 첨가하지 않음.
도 7에 나타낸 바와 같이 E. coli RNase H의 부재하에 2.5mM 농도의 염화마그네슘을 가한 반응 시스템에서 관심의 대상이 되는 증폭 산물을 관찰하였다.
실시예 8
본 발명의 방법을 실제 생물학적 샘플을 사용하여 연구하였다.
(1) 주형으로서 장출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157(ATCC 수탁번호 43895) 배양액으로부터 제조된 온수-추출액을 사용하여 검출을 수행하였다. 장출혈성 E. Coli. O-157(ATCC 수탁번호 43895)을 18시간동안 42℃에서 노보바이오신을 포함하는 mEC 배지에서 배양한 후, 10분동안 95℃에서 가열하였다. 0, 1, 10, 102, 103, 104 또는 105개의 세포에 상응하는 O-157 온수 추출액은 추출액을 멸균수로 희석하여 제조되었다. 실시예 5(1)에서와 동일한 조건하에서 이들 O-157 온수 추출액중 하나를 사용하여 베로독소 2(VT2) 유전자를 증폭시켰다. 대조군으로서 실시예 5(1)에서와 동일한 조건하에 동일한 주형을 사용하여 PCR을 수행하였다. 반응 후, 1 ㎕(ICAN) 또는 5 ㎕(PCR)의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 표 4 및 도 8에 나타낸다.
표 4
증폭 크기(bp) 검출한도(세포수)
ICAN(총 시간: 70분) 135 173 102 103
PCR(25싸이클; 총 시간: 약 66분) 135 103
PCR(30싸이클; 총 시간: 약 80분) 135 102

도 8은 ICAN 또는 PCR을 사용한 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O- 157의 검출을 나타낸 전기영동 결과를 나타낸다. 증폭된 쇄 길이는 135 bp였다. 레인 1: 분자량 마커(100 bp 레더); 레인 2: 104개 세포에 대한 ICAN; 레인 3: 103 개 세포에 대한 ICAN; 레인 4: 102개 세포에 대한 ICAN; 레인 5: 104개 세포에 대한 25싸이클의 PCR; 레인 6: 103개 세포에 대한 25싸이클의 PCR; 레인 7: 102개 세포에 대한 25싸이클의 PCR; 레인 8: 104개 세포에 대한 30싸이클의 PCR; 레인 9: 103개 세포에 대한 30싸이클의 PCR; 및 레인 10: 102개 세포에 대한 30싸이클의 PCR.
표 4 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 검출 방법의 검출 감수성은 PCR의 것과 동일하였고, 본 발명의 방법의 검출을 위해 필요한 시간은 PCR을 위해 필요한 것과 비교하여 짧다는 것을 확인하였다.
(2) λDNA을 실시예 2 및 4에서 사용한 서열번호 40 및 56으로 나타낸 프라이머르 사용하여 검출하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 120pmol의 각 프라이머, 2 ㎕의 500mM 염화칼륨 및 8μM 스퍼미딘을 포함하는 어닐링 용액, 10fg 내지 1ng의 λDNA(Takara Shuzo) 및 멸균수를 포함하는 10 ㎕의 혼합물을 제조하였다. 혼합물을 2분동안 98℃에서 열-변성시킨 후, 얼음상에서 신속하게 냉각시켜 프라이머를 주형에 어닐링시켰다.
어닐링 후, 0.625mM 각 dNTPs, 42.5mM Ticine-수산화칼륨(pH 8.5), 5.0mM 아세트산마그네슘, 0.0125% 소 혈청 알부민(BSA), 1.25% 디메틸설폭시드(DMSO), 11U BcaBEST DNA 폴리머라제 및 30U E.coli RNase H를 포함하는 40 ㎕의 혼합물을 혼합 물에 가하여 멸균수로 최종 용량을 50 ㎕으로 하였다. 반응 혼합물을 1시간동안 60℃에서 인큐베이션시켰다. 반응후, 3 ㎕의 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 표 5에 나타낸다.
표 5
증폭 크기(bp) 검출 한도
125 1pg

도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법이 λ DNA 검출에 효과적임을 확인하였다.
(3) 실시예 6(1)에서 사용된 서열번호 61 및 62에 나타낸 프라이머 및 주형으로서 플라보박테리움(Flavobacterium) 종. SA-0082으로부터의 게놈 DNA를 사용하여 검출을 수행하였다. 주형으로서 게놈 DNA을 WO97/32010에 기술된 바와 같이 배양된 플라보박테리움(Flavobacterium) 속의 박테리움으로부터 통상의 방법에 따라 제조하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 120pmol의 각 프라이머, 2 ㎕의 500mM 염화칼륨 및 8μM 스퍼미딘을 포함하는 어닐링 용액, 10fg 내지 1ng의 게놈 DNA 및 멸균수를 포함하는 10 ㎕의 혼합물을 제조하였다. 혼합물을 2분동안 98℃에서 열-변성시킨 후, 얼음상에서 신속하게 냉각시켜 프라이머를 주형에 어닐링시켰다.
어닐링 후, 0.625mM 각 dNTPs, 42.5mM Ticine-수산화칼륨(pH 8.5), 5.0mM 아세트산마그네슘, 0.0125% 소 혈청 알부민(BSA), 1.25% 디메틸설폭시드(DMSO), 11U BcaBEST DNA 폴리머라제 및 30U E.coli RNase H를 포함하는 40 ㎕의 혼합물을 혼합 물에 가하여 멸균수로 최종 용량을 50 ㎕으로 하였다. 반응 혼합물을 1시간동안 52℃에서 인큐베이션시켰다. 반응후, 3 ㎕의 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 표 6 및 도 9에 나타낸다.
표 6
증폭 크기(bp) 검출 한도
91 100fg

도 9는 플라보박테리움(Flavobacterium) 속의 박테리움의 검출을 보여주는 전기영동 결과를 보여준다. 레인 1: 분자량 마커(100 bp 레더); 레인 2: 1ng의 주형; 레인 3: 10pg의 주형; 레인 4: 1pg의 주형; 레인 5: 100fg의 주형; 및 레인 6: 10fg의 주형.
표 6 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법은 박테리움 검출에 효과적임을 확인하였다.
실시예 9
본 발명의 증폭 방법 및 하이드리드화 방법을 조합된 표적 핵산 검출 방법을 연구하였다. 장출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157을 주형으로서 선택하였다. 주형 DNA를 실시예 8(1)과 같이 제조하였다. 약 40%의 GC 함량을 갖는 약 100bp의 부위을 증폭시키고자 하는 단편으로서 선택하였다. 서열번호51 및 72로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 VT2-IF20 및 VT2-IV20-2를 프라이머로서 사용하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 50pmol의 프라이머 VT2-IF20 및 VT2-IV20-2, 최종 농도 0.01%의 프로필렌디아민을 포함하는 어닐링 용 액, 0 내지 104개의 세포에 상응하는 온수-추출액 및 멸균수를 포함하는 10 ㎕의 혼합물을 제조하였다. 혼합물을 2분동안 98℃에서 열-변성시킨 후, Thermal Cycler Personal(Takara Shuzo)에서 1분동안 상기 온도에서 인큐베이션시키고 어닐링을 위해 얼음상에 방치하였다.
어닐링 후, 최종 농도 20mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 0.01% 소 혈청 알부민(BSA), 1% 디메틸설폭시드(DMSO), 500μM 각 dNTPs, 5.5U BcaBEST DNA 폴리머라제 및 30U E.coli RNase H를 혼합물에 가하여 멸균수로 최종 용량을 50 ㎕으로 하였다. 반응 혼합물을 55℃으로 세팅된 Thermal Cycler Personal상에 방치하고 60분동안 상기 온도에서 인큐베이션시켰다. 대조군으로서 Thermal Cycler Personal을 사용하여 매뉴얼에 따라 O-157 Typing Set(Takara Shuzo)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR을 하기와 같이 수행하였다: 1분동안 94℃, 1분동안 55℃, 1분동안 72℃에서 35싸이클. 상기 반응은 1 싸이클당 약 4분 및 약 145분의 총 시간을 필요로 하였다. 증폭 산물의 예상된 크기는 404bp였다. 반응후, 3 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% NuSieve 3:1 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 28A에 나타낸다. 도 28A는 ICAN 또는 PCR을 사용한 장출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157 베로독소 II 유전자의 검출에 대한 전기영동 결과를 보여준다. 레인 M1: 분자량 마커(50-2000 bp); 레인 M2: 분자량 마커(100 bp 레더); 레인 N: 음성 대조군; 레인 1: 1개의 세포에 상응하는 주형; 레인 2: 10개의 세포에 상응하는 주형; 레인 3: 102개의 세포에 상응하는 주형; 레 인 4: 103개의 세포에 상응하는 주형; 및 레인 5: 104개의 세포에 상응하는 주형. 또한, 1개의 세포 또는 10개의 세포에 대하여 ICAN PCR에 의해 수득한 증폭 수준 결과를 비교한 결과를 표 7에 나타낸다.
표 7
E.Coli O-157 세포
0 1 10
ICAN - + +++
PCR - + +++
: 증폭되지 않음; + 내지 +++는 3단게의 증폭 정도를 나타낸다.
도 28A 및 표 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 검출 방법 및 PCR에 따라 1개의 세포에 상응하는 온수-추출액을 사용하여 반응 시스템에서 관심의 대상이 되는 증폭 산물을 관찰하였다. 프로브로서 5'-말단에 바이오틴으로 표지된 서열번호 73으로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 VT2를 사용하여 ICAN에 따라 수득된 증폭 산물에 대하여 도트 블랏 하이브리드화를 수행하였다. 하이브리드화를 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 1 ㎕의 반응 혼합물을 5분동안 98℃에서 변성시키고 얼음상에서 신속하게 냉각시키고 Hybond-NTM(Amersham Pahrmacia Biotech)상에 점적하였다. UV에 노출시킨 후, 막을 하이브리드화 백에 놓았다. 0.5M 디소듐 하이드로게노포스페이트(pH 7.2), 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산 및 7% 소듐 라우릴 설페이트를 포함하는 10㎖의 하이브리드화 용액을 가하였다. 예비-하이브리드화를 30분동안 42℃에서 수행하였다. 100ng/ ㎕의 농도로 VT2 프로브 용액 10 ㎕을 열-변성시키고 예비-하이브리드화 반응 시스템에 가하였다. 60분동안 42℃에서 하이브리드화한 후 막을 66.6mM 염화나트륨, 66.6mM 시트르산나트륨 및 0.1% 소듐 라우릴 설페이트을 포함하는 용액중에 실온에서 5분동안 2회 세척하고, 2 ㎕의 5mg/㎖의 호스래디쉬 퍼옥시다제 스트렙토아비딘 컨쥬게이트(PIERCE)가 첨가된 6㎖의 세척 완충액(0.3M 염화나트륨, 17.3mM 디소듐 하이드로게노포스페이트 디하이드레이트, 2.5mM EDTA, 0.1% 소듐 라우릴 설페이트)중에서 42℃에서 12분동안 인큐베이션시킨 후, 실온에서 세척 완충액중 2회 세척하였다. 이어서 막을 실온에서 10㎖의 0.1M 시트레이트 완충액(pH 5.0)을 세척한 후 약 10분동안 암실에서 에탄올중 2mg/㎖의 테트라메틸벤지딘(TMB, Nacalai Tesque) 용액 250 ㎕, 5 ㎕의 3% 하이드로겐 퍼옥시드, 5㎖의 0.1M 시트레이트 완충액의 혼합물중에서 반응시켰다. 발색 후, 탈염수로 반응을 종결시켰다. 결과를 도 28B에 나타낸다. 도 28B은 ICAN에 의해 장출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 II의 유전자를 검출하기 위한 도트 블랏 하이브리드화 결과를 보여준다. 결과는 상기 언급한 전기영동에서 관찰된 것과 일치하였다. 따라서, 본 발명의 방법의 검출 감수성은 PCR의 것과 일치하였다. 본 발명의 ICAN을 사용하여 증폭 반응을 위해 요구되는 시간은 PCR을 위해 요구되는 것과 비교하여 1/2 이하였다. 따라서, 본 발명의 ICAN이 병원체 등을 검출하기 위해 유효하다는 것이 입증되었다.
실시예 10
(1) 주형으로서 배양 세포로부터의 RNA를 사용하여 역전사 반응 및 본 발명의 방법의 조합을 조사하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 1.5 x 105 세포/㎖의 농도로 10% 우태아 혈청(Gibco)를 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's 배지 (Bio Whittaker, 12-604F)중에 RAW264.7 세포 (ATCC TIB 71)를 현탁시켰다. 5㎖의 현탁액을 6-웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 가하고 5% CO2 존재하에 밤새도록 37℃에서 인큐베이션시켰다. 물중 5μg/㎖의 리로폴리사카라이드(LPS, Sigma) 용액 50 ㎕ 및 물중 1000U/ ㎕의 인터페론-γ(INF-γ, Genzyme Techne) 용액 50 ㎕을 웰에 가하였다. 플레이트를 추가의 4시간동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 키트에 첨부된 안내서에 따라 RNeasy Mini Kit(Qiagen)을 사용하여 세포로부터 RNA를 제조하였다. 음성 대조군으로서, LPS 또는 INF-γ을 가하지 않은 그룹을 사용하였다.
3μg의 제조된 RNA, 10mM 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 8.3), 50mM KCl, 5mM MgCl2, 1mM 각 dNTPs, 150pmol의 무작위 6mers 프라이머, 60U의 리보뉴클레아제 저해제(Takakra Shuzo) 및 15U의 역전사효소 XL(AMV)(Takakra Shuzo, 2620A)을 포함하는 60 ㎕의 혼합물을 30℃에서 10분, 42℃에서 1시간, 이어서 99℃에서 5분동안 인큐베이션하여 thermal cycler(GeneAmp PCR System 9600, Applied Biosystems)을 사용하여 효소를 불활성화시켜 cDNA를 제조하였다.
서열번호 74 및 75로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머를 마우스 유도 NO 신타아제(iNOS)(GeneBank 수탁번호 NM-010927)의 mRNA의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 합성하였다. 대조군으로서 서열번호 76 및 77로 나타낸 PCR용 프라이머 또한 합성하였다.
간단하게, 50pmol의 각 프라이머, 0.05%의 농도의 프로필렌디아민 수용액 2 ㎕, 1 ㎕의 주형 DNA(50ng의 RNA에 상응) 및 멸균수를 포함하는 10 ㎕의 혼합물을 제조하였다. 혼합물을 2분동안 98℃에서 열-변성시킨 후, 55℃으로 냉각시키고 상기 온도에서 1분동안 Thermal Cycler에서 인큐베이션시켜 프라이머가 주형에 어닐링하도록 하였다.
어닐링 후, 0.625mM 각 dNTPs, 42.5mM Ticine-수산화칼륨(pH 8.5), 5.0mM 아세트산마그네슘, 0.0125% 소 혈청 알부민(BSA), 1.25% 디메틸설폭시드(DMSO), 11U BcaBEST DNA 폴리머라제 및 15U E.coli RNase H를 포함하는 40 ㎕의 혼합물을 혼합물에 가하여 멸균수로 최종 용량을 50 ㎕으로 하였다. 반응 혼합물을 1시간동안 55℃에서 Thermal Cycler에서 인큐베이션시켰다. 반응 샘플을 분석시까지 -20℃에서 냉동시켜 저장하였다. 대조군으로서 PCR을 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 50pmol의 각 프라이머, 1 ㎕의 cDNA(50ng의 RNA에 상응), 5 ㎕의 10 x Ex Taq 완충액(Takara Shuzo), 1.25U의 TaKaRa Ex Taq DNA 폴리머라제(Takara Shuzo) 및 0.2mM 각 dNTPs를 포함하는 50 ㎕의 반응 혼합물을 Thermal Cycler에서 반응시켰다. 프로그램은 하기와 같았다: 2분동안 94℃에서 1싸이클; 30초동안 94℃, 30초동안 55℃ 및 30초동안 72℃에서 30싸이클; 및 5분동안 72℃에서 1싸이클. 반응 샘플을 분석시까지 -20℃에서 냉동시켜 저장하였다. 반응 후, 5 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 10에 나타낸다.
도 10은 RT-ICAN(A) 및 RT-PCR (B)의 비교를 나타낸 전기영동 결과를 설명한다. 레인 1: 분자량 마커(100 bp 레더); 레인 2: 음성 대조군; 및 레인 3: LPS 및 IFN-γ으로 처리된 그룹.
도 10에 나타낸 바와 같이, LPS 및 IFN-γ으로 처리된 세포로부터 제조된 cDNA를 주형으로서 사용하였을 때만 본 발명의 방법 및 PCR 모두에서 증폭 산물이 관찰되었다. 따라서, 본 발명의 방법이 PCR의 것과 비교하여 반응을 위해 필요한 시간이 더욱 짧기 때문에 본 발명의 방법이 역전사 후 DNA 증폭 방법으로서 더욱 효과적이다는 것을 확인하였다.
실시예 11
최적 온도가 37℃인 E. coli RNase H는 본 발명의 증폭 반응시 불활성화될 수 있다. 이어서 증폭 반응시 반응 혼합물에 E. coli RNase H를 첨가하였을 때의 효능을 조사하였다. 콜리플라워모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터 및 EPSPS 유전자가 삽입된 재조합 소이빈으로부터 추출된 게놈 DNA로부터 서열번호 78 및 79로 나타낸 프라이머 GMO-PCR-F 및 GMO-PCR-R을 사용하여 PCR에 의해 수득된 증폭된 단편(1071bp)을 주형 DNA로서 사용하였다. 또한, 서열번호80 내지 83로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 GMO-S1, S2, A1 및 A2를 사용하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다: 간단하게, 50pmol의 각 프라이머, 0.01%의 농도의 프로필렌디아민, 1pg 내지 10ng의 주형 DNA 및 멸균수를 포함하는 10 ㎕의 혼합물을 제조하였다. 혼합물을 2분동안 98℃에서 열-변성시킨 후, 어닐링을 위해 55℃으로 냉각시켰다.
어닐링 후, 최종 농도로 500μM 각 dNTPs, 34mM Ticine-수산화칼륨(pH 8.7), 4.0mM 아세트산마그네슘, 0.01% 소 혈청 알부민(BSA), 5.5U BcaBEST DNA 폴리머라 제 및 30U E.coli RNase H를 혼합물에 가하여 멸균수로 최종 용량을 50 ㎕으로 하였다. 반응 혼합물을 25분동안 55℃에서 Thermal Cycler에서 인큐베이션시켰다. 반응 개시 25분 후 30U의 E.coli RNase H를 추가로 가하였다. 혼합물을 30분동안 55℃에서 인큐베이션시켰다. 대조군으로서 혼합물을 55분동안 55℃에서 인큐베이션시켜 반응을 수행시켰다. 반응 후, 3 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과, 증폭 효능은 프라이머의 결합물, S1/A1. S1/A2, S2/A1, 및 S2/A2에 대한 주형 DNA의 농도와 상관없이 반응시 E.coli RNase H의 첨가에 의해 개선된다는 것을 확인하였다.
실시예 12
본 발명의 방법에서 주형으로서 사용하는 핵산의 증폭 또는 복제 방법 및 본 발명의 방법의 조합을 조사하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 주형으로서 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 복제된 실시예 5(3)에서 제조된 바와 같은 크리산써뭄 비로이드(chrysanthemum viroid) 유전자를 포함하는 플라스미드 및 T7 RNA 폴리머라제 (Takara Shuzo)를 사용하여 시험관내 전사를 수행하여 RNA로부터 복제된 단편을 수득하였다. 서열번호 57 및 58에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 및 cDNA 합성 키트(Takara Shuzo)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 주형으로서 cDNA 단편 또는 복제된 플라스미드를 사용하여 실시예 5(3)에 기술된 바와 같이 증폭 반응을 수행하였다. 결과 플라스미드 형태로 복제된 핵산 및 RNA 폴리머라제를 사용하여 RNA로부터 복제된 cDNA의 형태의 핵산을 본 발명의 방법을 위한 주형으로서 사용할 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 13
(1) 프라이머 합성
서열목록 86 및 87로 나타낸 올리고뉴클레오티드 프라이머 NS1 및 NS2를 마우스 유도 NO 신타아제(iNOS)에 대한 mRNA의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 합성하였다.
(2) 주형으로서 PCR 산물을 사용하는 ICAN에 따른 DNA 단편의 증폭
50pmol의 각 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머, 2 ㎕의 0.05%의 프로필렌디아민 수용액 및 10fg 내지 10pg의 주형 DNA를 포함하는 10 ㎕의 혼합물을 Thermal cycler(GeneAmp PCR System 9600, Applied Biosystems)을 사용하여 2분동안 98℃, 2분동안 60℃에서 가열하여 프라이머가 주형에 어닐링되도록 하였다. 서열번호 132 및 133으로 나타낸 프라이머 NS-PCR1 및 NS-PCR2를 사용하여 증폭된 후 Super02(Takara Shuzo)를 사용하여 정제된 iNOS cDNA(741bp)를 주형으로서 사용하였다. 0.625mM 각 dNTPs, 40mM HEPES-수산화칼륨 완충액(pH 7.8), 125mM 아세트산칼륨, 5.0mM 아세트산마그네슘, 0.0125% 소 혈청 알부민(BSA), 1.25% 디메틸설폭시드(DMSO), 0.0156μg Pfu RNase H 및 0.66U BcaBEST DNA 폴리머라제를 포함하는 40 ㎕의 혼합물을 가열 용액에 가하였다. 혼합물을 thermal cycler에서 1시간동안 60℃에서 인큐베이션시켰다. 반응후, 5 ㎕의 각 반응 혼합물을 확인하기 위하여 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 11에 나타낸다. 도 11은 Pfu RNase H를 사용한 ICAN의 결과를 나타낸다. 레인 1: 분자량 마커(100bp); 레인 2: 10fg의 주형; 레인 3: 100fg의 주형; 레인 4: 1pg의 주형; 및 레인 5: 10pg의 주형.
도 11에 나타낸 바와 같이, 관심의 대상이 되는 증폭 산물은 100fg의 주형을 사용하여 관찰되었다.
실시예 14
(1) RNA 제조
1) 1.5 x 105 세포/㎖의 농도로 10% 우태아 혈청(Gibco)를 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's 배지 (Bio Whittaker, 12-604F)중에 RAW264.7 세포 (ATCC TIB 71)를 현탁시켰다. 5㎖의 현탁액을 6-웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 가하고 5% CO2 존재하에 밤새도록 37℃에서 인큐베이션시켰다. 물중 5μg/㎖의 리로폴리사카라이드(LPS, Sigma) 용액 50 ㎕ 및 물중 1000U/ ㎕의 인터페론-γ(INF-γ, Genzyme Techne) 용액 50 ㎕을 웰에 가하였다. 플레이트를 추가의 4시간동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 키트에 첨부된 안내서에 따라 RNeasy Mini Kit(Qiagen, 74104)을 사용하여 세포로부터 RNA를 제조하였다. 음성 대조군으로서, LPS 또는 INF-γ을 가하지 않은 그룹을 사용하였다.
3μg의 제조된 RNA, 10mM 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 8.3), 50mM KCl, 5mM MgCl2, 1mM 각 dNTPs, 150pmol의 무작위 6mers 프라이머, 60U의 리보뉴클레아제 저해제(Takakra Shuzo) 및 15U의 역전사효소 XL(AMV)(Takakra Shuzo, 2620A)을 포함하는 60 ㎕의 혼합물을 30℃에서 10분, 42℃에서 1시간, 이어서 99℃에서 5분동안 인큐베이션하여 thermal cycler(GeneAmp PCR System 9600, Applied Biosystems)을 사용하여 효소를 불활성화시켜 cDNA를 제조하였다.
서열번호 92 및 93으로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 NS5 및 NS6을 마우스 유도 NO 신타아제(iNOS)의 mRNA의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 합성하였다. 대조군으로서 서열번호 88 및 89로 나타낸 PCR용 프라이머 NS3 및 NS4 또한 합성하였다.
50pmol의 각 프라이머 NS5 및 NS6, 주형으로서 1 ㎕의 상기 기술된 바와 같이 합성된 cDNA 용액(50ng의 RNA에 상응) 또는 물을 사용한 그의 10-, 100-, 1000-, 또는 1000- 배 희석액, 0.5mM 각 dNPTs, 32mM ,HEPES-수산화칼륨 완충액(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 4.0mM 아세트산마그네슘, 0.01% 소 혈청 알부민(BSA), 1% 디메틸설폭시드(DMSO), 0.0156μg Pfu RNase H 및 0.66U BcaBEST DNA 폴리머라제를 포함하는 50 ㎕의 혼합물을 Thermal Cycler에서 1시간동안 60℃에서 인큐베이션시켰다. 반응 샘플을 분석시까지 -20℃에서 냉동시켜 저장하였다.
한편, 대조군으로서 PCR을 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 50pmol의 각 프라이머 NS3 및 NS4, 주형으로서 1 ㎕의 상기 기술된 바와 같이 합성된 cDNA 용액(50ng의 RNA에 상응) 또는 물을 사용한 그의 10-, 100-, 1000-, 또는 1000- 배 희석액, 5 ㎕의 10 x Ex Taq 완충액(Takara Shuzo), 1.25U의 TaKaRa Ex Taq DNA 폴리머라제(Takara Shuzo) 및 0.2mM 각 dNTPs를 포함하는 50 ㎕의 반응 혼합물을 Thermal Cycler을 사용하여 반응시켰다. 프로그램은 하기와 같았다: 2분동안 94℃에서 1싸이클; 30초동안 94℃, 30초동안 55℃ 및 30초동안 72℃에서 35싸이클; 및 5분동안 72℃에서 1싸이클. 반응 샘플을 분석시까지 -20℃에서 냉동시켜 저장하였다.
반응 후, 5 ㎕의 각 반응 혼합물(ICNA 또는 PCR)을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 12에 나타낸다. 도 12는 Pfu RNase H 또는 PCR을 사용하여 ICAN에 따라 iNOS를 검출한 결과를 보여준다. 레인 1: 100 bp DNA 레더 마커를 위한 레인; 레인 2: 음성 대조군 cDNA의 10000배 희석액; 레인 3: 음성 대조군 cDNA의 1000배 희석액; 레인 4: 음성 대조군 cDNA의 100배 희석액; 레인 5: 음성 대조군 cDNA의 10배 희석액; 레인 6: 음성 대조군 cDNA의 원 용액; 레인 7: LPS 및 IFN-γ이 첨가된 음성 대조군 cDNA의 10000배 희석액; 레인 8: LPS 및 IFN-γ이 첨가된 음성 대조군 cDNA의 1000배 희석액; 레인 9: LPS 및 IFN-γ이 첨가된 음성 대조군 cDNA의 100배 희석액; 레인 10: LPS 및 IFN-γ이 첨가된 음성 대조군 cDNA의 10배 희석액; 레인 11: LPS 및 IFN-γ이 첨가된 음성 대조군 cDNA의 원 용액.
도 12에 나타낸 바와 같이, LPS 및 IFN-γ으로 처리된 세포로부터 제조된 cDNA를 주형으로서 사용하는 경우 ICAN 및 PCR에 대하여 증폭 산물이 관찰되었다. ICAN에 대하여 cDNA의 1000배 희석액을 사용하여 증폭 산물의 증가를 관찰하였다. PCR에 대하여, cDNA의 100배 희석액을 사용하여 증폭 산물의 증가를 관찰하였다.
실시예 15
(1) 서열번호90 및 91으로 나타낸 올리고뉴클레오티드 프라이머 4 및 5를 λDNA의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 합성하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 4는 75%의 GC 함량을 갖는 센스 프라이머이다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 4는 80%의 GC 함량을 갖는 센스 프라이머이다.
120pmol의 각 프라이머 4 및 5, 2 ㎕의 0.05% 프로필렌디아민 용액 및 10ng 의 주형을 포함하는 10 ㎕의 반응 시스템을 2분동안 98℃에서 열-변성시킨 후, 어닐링을 위해 신속하게 얼음상에서 냉각시켜 프라이머가 주형에 어닐링되도록 하였다. 실시예 2에 기술된 바와 같이 Super02를 사용하여 정제된 PCR 산물(1005bp)을 주형으로서 사용하였다.
(2) 어닐링 후, 0.625mM 각 dNTPs, 40mM Bicine-수산화칼륨 완충액(pH 8.3), 5.0mM 아세트산마그네슘, 0.0125% 소 혈청 알부민(BSA), 1.25% DMSO, 0.5 ㎕의 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) RNase H(0.58μg/㎖) 및 2.2U BcaBEST DNA 폴리머라제를 포함하는 40 ㎕의 혼합물을 가하여 1시간동안 60, 65, 또는 70℃에서 수행하였다. ICNA후 3 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 13에 나타낸다. 도 13은 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) RNase H를 사용한 ICAN 결과를 나타낸다. 레인 1: 분자량 마커(100bp); 레인 2: 10fg의 주형; 레인 3: 100fg의 주형; 레인 4: 1pg의 주형; 및 레인 5: 10pg의 주형.
도 13에 나타낸 바와 같이, 관심의 대상이 되는 증폭 산물을 각 반응 온도에서 관찰하였다.
실시예 16
(1) 주형으로서 PCR 산물을 사용하여 ICAN에 따른 DNA 단편(알칼리-변성된)의 증폭을 조사하였다. 1fg 내지 10pg의 주형 및 1 ㎕의 0.4N NaOH를 포함하는 1 ㎕의 용액을 함께 혼합하였다. 혼합물을 5분동안 37℃에서 인큐베이션하여 주형을 변성시켰다. 상기 실시예 13에서 기술된 바와 같이 Super02(Takara Shuzo)를 사용 하여 정제된 PCR-증폭 iNOS cDNA(741bp)를 주형으로서 사용하였다. 변성된 각 주형을 1 ㎕의 0.4N HCl로 중화시켰다. 50pmol의 각 프라이머 NS1 및 NS2, 0.5mM dNTPs, 32mM HEPES-수산화칼륨 완충액(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 4.0mM 아세트산마그네슘, 0.01% BSA, 1.0% DMSO, 0.0156μg Pfu RNase H 및 0.66U BcaBEST DNA 폴리머라제를 포함하는 47 ㎕의 혼합물을 가하였다. 혼합물을 thermal cycler에서 1시간동안 60℃에서 인큐베이션시켰다. 5 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동에 의해 분석하였다. 결과를 도 14에 나타낸다. 도 14는 알카리-변성된 주형을 사용한 ICAN의 결과를 보여준다. 레인 1: 분자량 마커(100bp); 레인 2: 10fg의 주형; 레인 3: 100fg의 주형; 레인 4: 1pg의 주형 및 레인 5: 10pg의 주형.
도 14에 나타낸 바와 같이 1pg의 주형을 사용하여 증폭 산물이 명백하게 증가되었다.
실시예 17
(1) 주형을 변성시키기 않고 ICAN에 따라 DNA 단편을 증폭시키는 것을 조사하였다. 서열번호 92 및 93에 나타낸 프라이머 NS5 및 NS6을 프라이머로서 사용하였다. DNA 주형을 실시예 13에서 제조된 것을 사용하였다. 10 fg 내지 100pg의 주형 또는 음성 대조군으로서 물, 50pmol의 각 프라이머 NS5 및 NS6, 0.5mM dNTPs, 32mM HEPES-수산화칼륨 완충액(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 4.0mM 아세트산마그네슘, 0.01% BSA, 1.0% DMSO, 0.0156μg Pfu RNase H 및 1U BcaBEST DNA 폴리머라제(Takara Shuzo)를 포함하는 50 ㎕의 혼합물을 thermal cycler에서 1시간동안 60 ℃에서 인큐베이션시켰다. 반응 후, 5 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동에 의해 분석하였다. 결과를 도 15에 나타낸다. 도 15는 주형을 변성시키지 않은 본 발명의 증폭 방법에 대한 전기영동 결과를 보여준다. 레인 1: 100bp DNA 래더 마커; 레인 2: 음성 대조군(물); 레인 3: 10fg의 주형; 레인 4: 100fg의 주형; 레인 5: 1pg의 주형, 레인 6: 10pg의 주형; 레인 7: 100pg의 주형.
도 15에 나타낸 바와 같이 1pg의 주형을 사용하여 관심의 대상이 되는 증폭 산물을 관찰하였음을 확인하였다.
실시예 18
(1) 서열번호94 및 95에 나타낸 프라이머 pDON-AI-1 및 pDON-AI-2를 벡터 플라스미드 pDON-AI DNA (Takara Shuzo)중 패키지 부위의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 합성하였다.
(2) 주형을 변성하지 않은 ICAN에 따른 DNA 단편의 증폭
10 fg 내지 1ng의 pDON-AI DNA 또는 음성 대조군으로서 물, 50pmol의 각 프라이머, 0.5mM dNTPs, 32mM HEPES-수산화칼륨 완충액(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 4.0mM 아세트산마그네슘, 0.01% BSA, 1.0% DMSO, 참고 실시예 4에서 제조된 0.0156μg Pfu RNase H 및 1U BcaBEST DNA 폴리머라제를 포함하는 50 ㎕의 혼합물을 thermal cycler에서 1시간동안 60℃에서 인큐베이션시켰다. 5 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동에 의해 분석하였다. 결과를 도 16에 나타낸다. 도 16은 변성시키지 않고 주형으로서 환상 더블-스트랜드 DNA를 사용하여 본 발명에 대한 전기영동 결과를 보여준다. 레인 1: 100bp DNA 래더 마커; 레인 2: 음 성 대조군(물); 레인 3: 10fg의 주형; 레인 4: 100fg의 주형; 레인 5: 1pg의 주형, 레인 6: 10pg의 주형; 레인 7: 100pg의 주형: 레인 8: 1ng의 주형.
도 16에 나타낸 바와 같이, 10fg의 주형을 사용하여 관심의 대상이 되는 증폭 산물을 관찰하였음을 확인하였다.
실시예 19
본 발명의 방법을 사용하는 인간 유두종(human papilloma) 바이러스 16 유전자의 검출을 조사하였다. D인간 유두종 바이러스 16로 감염된 세포, CaSki cells (Dainippon Pharmaceutical; 세포내 500개의 인간 유두종 바이러스 16 카피를 포함)로부터 DNA를 주형으로서 사용하였다. 서열번호96 및 97로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 HPV16 S3 및 HPV16 A2를 HPV16 검출을 위한 프라이머로서 사용하였다. 프라이머쌍을 사용하여 수득산 증폭 사물의 예상 크기는 약 120bp였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다: 1pg, 3pg, 30pg, 100ph, 300pg, 1ng, 3gn, 또는 10ng의 주형 DNA, 50pmol의 각 프라이머 HPV16 S3 및 HPV16 A2 최종 농도 0.01%의 프로필렌디아민을 포함하는 10 ㎕의 혼합물을 제조하였다. Thermal Cycler Personal에서 98℃에서 2분 및 55℃에서 1분동안 인큐베이션시킨 후, 얼음상에 방치하였다. 최종 농도 20mM HEPES-수산화칼륨 완충액(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 4.0mM 아세트산마그네슘, 0.01% BSA, 1.0% DMSO, 500μM 각 dNTPs, 30U E. Coli RNase H 및 5.5U BcaBEST DNA 폴리머라제를 포함하는 50 ㎕의 혼합물을 55℃으로 세팅된 Thermal Cycler에 놓고 60분동안 반응시켰다. Thermal Cycler Personal중 매뉴얼에 따라 인간 유두종 바이러스 프라이머 HPVp16(전향, 역향)를 사용하여 PCR 을 수행하였다. 예상된 증폭 산물의 크기는 140bp였다.
반응 후, 3 ㎕의 각 반응 혼합물을 4% NuSieve 3:1 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 17A에 나타낸다. 도 17A는 ICAN 및 PCR을 사용하여 HPC16 유전자를 검출한 결과를 보여준다. 레인 M1: 분자량 마커(100 bp 레더); 레인 M2: 분자량 마커(50-2000 bp); 레인 1: 주형 없음; 레인 2: 1pg의 주형; 레인 3: 3pg의 주형; 레인 4: 30pg의 주형; 레인 5: 100pg의 주형; 레인 6: 300pg의 주형; 레인 7: 1ng의 주형; 레인 8: 3의 주형; 및 레인 9: 10ng의 주형.
도 17A에 나타낸 바와 같이, 관심의 대상이 되는 증폭 산물을 각각 ICAN에 대하여 3pg의 주형 DNA 및 PCR에 대하여 1pg의 주형 DNA를 사용하여 관찰하였음을 확인하였다.
또한, 서열번호 98로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 HPV16 프로브를 사용하여 반응 산물에 대한 도트 블랏 하이브리드화를 수행하였다. 하이브리드화를 실시예 9와 같이 수행하였다. 결과를 도 17B에 나타낸다. 도 17B는 PCR 및 ICAN에 따른 HPV16 유전자의 도트 블랏 하이브리드화 검출 결과를 보여준다. 레인 1: 주형 없음; 레인 2: 1pg의 주형; 레인 3: 3pg의 주형; 레인 4: 30pg의 주형; 레인 5: 100pg의 주형; 레인 6: 300pg의 주형; 레인 7: 1ng의 주형; 레인 8: 3의 주형; 및 레인 9: 10ng의 주형.
도 17B에 나타낸 바와 같이, PCR 및 ICAN의 검출 감수성은 거의 동일하였다. 따라서, 이들 방법은 바이러스 등의 검출에 효과적임을 확인하였다.
실시예 20
임상검체 DNA 샘플로부터 인간 유두종 바이러스 16 유전자의 검출을 조사하였다. 사전동의서와 함께 얻은 6개의 임상검체로부터 통상의 방법에 따라 제조된 DNA를 주형으로서 사용하였다. 임상검체로부터 제조된 샘플중 감염성 HPVs의 형태를 PCR에 의해서 입증하였다. 실시예 19에서 기술된 프라이머 HPV16 S3 및 HPV16 A2를 검출용 프라이머로서 사용하였다. 주형으로서 사용하고자 하는 임상검체로부터 DNA 샘플의 농도를 TE 완충액으로 100ng/ ㎕으로 조정하였다. 반응 혼합물의 조성 및 반응 조건은 주형의 양을 제외하고 실시예 19에 기술된 바와 같았다. 또한 음성 대조군으로서 주형 DNA를 첨가하지 않은 반응 혼합물 및 양성 대조군으로서 HPV16으로 감염된 CaSki 세포 500pg를 포함하는 반응 혼합물을 사용하여 유사한 반응을 수행하였다. 반응 후, 3 ㎕의 각 반응 혼합물을 4% NuSieve 3:1 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 18A에 나타낸다. 도 18A은 임상검체로부터 HPV16 유전자의 검출 결과를 나타낸다. 레인 1 내지 6: 임상검체; 레인 7: 음성 대조군; 및 레인 8: 양성 대조군.
도 18A에 나타낸 바와 같이 약 120bp의 증폭 산물은 통상의 PCR에 의해 HPV16으로 감염된 것으로 입증된 샘플에 대하여 ICAN에 따라 관찰되었다. 다른 형태의 HPV16로 감염된 샘플 또는 비-감염 샘플에서는 증폭이 관찰되지 않았다.
또한, 실시예 9에서와 같이 증폭 산물에 대하여 도트 블랏 하이브리드화를 수행하였다. 결과를 도 18B 및 표 8에 나타낸다. 도 18B는 임상검체로부터의 HPV16 유전자의 도트 블랏 하이브리드화 검출 결과를 나타낸다. 레인 1 내지 6: 임상검체; 레인 7: 음성 대조군; 및 레인 8: 양성 대조군.
도 18에 나타낸 바와 같이, 전기영동에 의해 수득한 것과 일치하는 결과를 얻었고, PCR의 것과 유사한 결과를 전기영동 및 도트 블랏 하이브리드화를 사용하여 수득할 수 있다는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라 실제 임상검체로부터 HPV16이 검출될 수 있고 본 발명이 바이러스 등의 검출에 유효하다는 것을 확인하였다.
표 8
샘플 PCR 형태 HPV16 검출 프라이머를 사용한 ICAN 증폭
3번 4번 6번 7번 8번 9번 주형 없음 양성 대조군 비-감염 비-감염 유형 18 유형 16 유형 67 유형 16 * * - - - + - + _ +
- : 증폭 없음 + : 증폭 관찰됨
실시예 21
임상검체로부터 HCV의 검출을 조사하였다. 검체 샘플을 시약에 첨부된 안내서에 따라 TRIzol 시약(Life Technologies)를 사용하여 사전동의서와 함께 얻은 HCV를 갖는 환자로부터의 300 ㎕의 각각의 5개의 혈청 검체로부터 제조하고 6 ㎕의 주사가능한 물(Otsuka Pharmaceutical)에 최종적으로 용해시켜 RAN 샘플을 수득하였다. 건강한 개인으로부터의 300 ㎕의 혈청으로부터 유사하게 추출된 RNA를 음성 대조군으로서 사용하였다. 우선, 1 x RNA PCR 완충액, 5mM MgCl2, 1mM 각 dNTPs,1U의 AMV 역전사효소 XL, 서열번호 99 및 100에 나타낸 10pmol의 각 프라이머 HCV-F 및 HCV-R, 및 2 ㎕의 RNA 샘플중 하나를 포함하는 4 ㎕의 반응 혼합물을 RNA PCR 키트(AMW) 버젼 2.1(Takara Shuzo)를 사용하여 제조하였다. 혼합물을 10분동안 30℃에서 가온하고 30분동안 50℃에서 반응시켰다. 역전사후, ICAN을 수행하였다. 서열번호 101 및 102로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 HCV-F2 및 HCV-R1을 ICAN에 사용하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다.
50pmol의 각 프라이머, 3 ㎕의 역전사 반응 혼합물 중 하나 및 최종 농도 0.01%의 프로필렌디아민을 포함하는 10 ㎕의 혼합물을 제조하였다. 3 ㎕의 멸균수를 블랭크로 사용하였다. 혼합물을 98℃에서 2분동안 인큐베이션시키고 신속하게 60℃으로 냉각시키고 1분동안 Thermal Cycler Personal에서 상기 온도에서 인큐베이션시키고 얼음상에서 저장하였다.
반응 후, 최종 농도 20mM HEPES-수산화칼륨 완충액(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 4.0mM 아세트산마그네슘, 0.01% BSA, 1.0% DMSO, 500μM 각 dNTPs, 30U E. Coli RNase H 및 5.5U BcaBEST DNA 폴리머라제를 혼합물에 가하여 멸균수로 최종 용량을 50 ㎕으로 하였다. 반응 혼합물을 55℃으로 세팅된 Thermal Cycler에 놓고 60분동안 반응시켰다. 반응 후, 3 ㎕의 각 반응 혼합물을 3% NuSieve 3:1 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 19A에 나타낸다. 도 19A는 임상검체로부터 HCV 검출 결과를 보여준다. 레인 B: 주형으로서 멸균수; 레인 1: 건강한 개인으로부터의 샘플; 레인 2 내지 6: HCV를 갖는 환자로부터의 샘플: 및 레인 M: 분자량
도 19A에 나타낸 바와 같이 HCV 게놈의 뉴클레오티드 서열로부터 예상되는 약 170bp의 증폭 산물을 HCV를 갖는 환자로부터의 RNA 샘플에 대해서만 관찰하였고, 건강한 개인으로부터의 혈청 및 블랭크에 대해서는 증폭 산물이 관찰되지 않았 따. 또한 ICAN-증폭 산물에 대한 도트 블랏 하이브리드화를 5'-말단에서 바이오틴화된 서열번호 103으로 나타낸 HCV에 대한 프로브를 사용하여 실시예 9에 기술된 바와 같이 수행하였다. 결과를 도 19B에 나타낸다. 도 19B에서 샘플에 대한 레인은 전기영동에 대하여 나타낸 것과 같다.
도 19에 나타낸 바와 같이 전기영동으로부터의 결과는 도트 블랏 하이브리드화의 결과와 일치한다는 것을 확인하였다. 본 결과로 본 발명의 방법이 실제 임상검체로부터의 HCV 검출에 사용될 수 있고 바이러스 등의 검출에 효과적임을 확인하였다.
실시예 22
아데노바이러스 검출 방법을 조사하였다.
서열번호 104 내지 106으로 나타낸, E1A (종양 유전자), E1A-1 (센스), E1A-2 (안티센스) 및 E1A-3 (안티센스)를 증폭시키기 위한 프라이머를 아데노바이러스 (GenBank 기탁번호 JO1917)의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 작제하였다. 아데노바이러스 (ATCC 기탁번호 VR-5)를 사용하였다. 주형을 하기와 같이 제조하였다. 8.73 x 1010 PFU/㎖의 농도로 아데노바이러스를 포함하는 100 ㎕의 용액을 최종 농도 0.1%의 SDS 및 최종 농도 0.2mg/㎖의 프로테나제 K의 존재하에 1시간동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. DNA를 실리카겔에 흡착에 의해 정제하였다. 멸균수로 정제된 DNA를 희석하여 제조된 103, 104, 105, 또는 106 PFU에 상응하는 아데노바이러스 DNAs를 사용하였다. 간단하게, 60pmol의 각 프라이머 E1A-1 및 E1A-2(증폭 길이: 112bp) 또는 E1A-1 및 E1A-3(증폭 길이: 91bp), 2 ㎕의 0.05% 프로필렌디아민 및 주형을 포함하는 10 ㎕의 반응 시스템을 2분동안 94℃에서 열변성시키고 얼음상에서 급속 냉각시켜 프라이머가 주형에 어닐링되도록 하였다.
반응 후, 0.625mM 각 dNTPs, 42.5mM Tricine-수산화칼륨 완충액(pH 8.5), 5.0mM 아세트산칼륨, 0.0125% BSA, 1.25% DMSO, 30U E. Coli RNase H 및 5.5U BcaBEST DNA 폴리머라제를 혼합물에 가하여 최종 용량을 50 ㎕으로 하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 1시간동안 인큐베이션시켰다. 대조군으로서, PCR에 의한 검출을 상기와 동일한 온도 및 서열번호 107, 108 및 142로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 E1A (종양 유전자), E1A-1P (센스), E1A-2P (안티센스) 및 E1A-3P(안티센스)를 증폭시키기 위한 프라이머를 사용하여 수행하였다. PCR을 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 60pmol의 각 프라이머 E1A-1 및 E1A-2P(증폭 길이: 112bp) 또는 E1A-1 및 E1A-3P(증폭 길이: 91bp), 5 ㎕의 10 x Ex Taq 완충액(Takara Shuzo), 1.25U TaKaRa Ex DNA 폴리머라제(Takara Shuzo) 및 0.2mM dNTPs를 포함하는 50 ㎕의 PCR 용액을 제조하였다. PCR을 위한 조건은 하기와 같았다: 94℃에서 30초동안, 55℃에서 30초동안 및 72℃에서 30초.
반응 후, ICAN 및 PCR을 위한 3 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 20 및 표 9에 나타낸다. 도 20은 아데노바이러스 입자로부터의 바이러스 E1A 유전자의 검출 결과를 보여준다. 레인 1 내지 10은 프라이머 E1A-1 및 E1A-2 결합물을 사용해 얻은 결과를 보여준다. 레인 11 내지 20 은 프라이머 E1A-1 및 E1A-3 결합물을 사용해 얻은 결과를 보여준다. 레인 1: 분자 량 마커(100 bp 레더); 레인 2: 106 PFU에 상응하는 DNA를 사용한 ICAN; 레인 3: 105 PFU에 상응하는 DNA를 사용한 ICAN; 레인 4: 104 PFU에 상응하는 DNA를 사용한 ICAN; 레인 5: 103 PFU에 상응하는 DNA를 사용한 ICAN; 레인 6: 분자량 마커(100 bp 레더); 레인 7: 106 PFU에 상응하는 DNA를 사용한 PCR; 레인 8: 105 PFU에 상응하는 DNA를 사용한 PCR; 레인 9: 104 PFU에 상응하는 DNA를 사용한 PCR; 및 레인 10: 103 PFU에 상응하는 DNA를 사용한 PCR. 또한, 레인 11: 분자량 마커(100 bp 레더); 레인 12: 106 PFU에 상응하는 DNA를 사용한 ICAN; 레인 13: 105 PFU에 상응하는 DNA를 사용한 ICAN; 레인 14: 104 PFU에 상응하는 DNA를 사용한 ICAN; 레인 15: 103 PFU에 상응하는 DNA를 사용한 ICAN; 레인 16: 분자량 마커(100 bp 레더); 레인 17: 106 PFU에 상응하는 DNA를 사용한 PCR; 레인 18: 105 PFU에 상응하는 DNA를 사용한 PCR; 레인 19: 104 PFU에 상응하는 DNA를 사용한 PCR; 및 레인 20: 103 PFU에 상응하는 DNA를 사용한 PCR.
표 9
증폭 크기 (bp) 검출 한도
ICAN PCR
112 104 104
91 104 104

도 20 및 표 9에 나타낸 바와 같이, ICAN에 의한 아데노바이러스 E1A 유전자의 검출 감수성이 PCR에 의한 것과 일치한다는 것을 확인하였다.
실시예 23
레트로바이러스 벡터로 감염된 세포로부터 통합 바이러스 유전자의 검출을 조사하였다. 레트로바이러스 및 게놈 DNA로 감염된 세포를 하기와 같이 제조하였다. 간단하게, 인산칼슘 방법에 따라 벡터 플라스미드 pDON-AI (Takara Shuzo)를 패키징 세포 GPE+86내로 삽입하였다. 동종숙주역 벡터를 삽입 세포의 배양 상층액으로부터 제조하였다. NIH/3T3 tpvhfmf 동종숙주역 벡터로 감염시키고 감염된 세포를 14일동안 G418을 포함하는 배지중에서 배양하여 바이러스 벡터로 감염된 세포를 제조하였다. 통상의 방법에 따라 27μg의 게놈 DNA를 레트로바이러스로 감염된 4 x 104의 제조된 세포로부터 수득하였다. 실시예 18(1)에 기술된 프라이머 pDON-AI-1 및 pDON-AI-2를 프라이머로서 사용하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 60pmol의 각 프라이머, 2 ㎕의 0.25%의 프로필렌디아민 수용액 및 0.1ng 내지 1000ng 주형으로서 게놈 DNA를 포함하는 10 ㎕의 반응 시스템을 thermal cycler(Takara Shuzo) 2분동안 98℃ 이후 60℃에서 가열하여 프라이머가 주형에 어닐링되도록 하였다.
반응후, 0.625mM 각 dNTPs, 40mM HEPES-수산화칼륨 완충액(pH 7.8), 125mM 아세트산칼륨, 5.0mM 아세트산마그네슘, 0.0125% 소 혈청 알부민(BSA), 1.25% 디메틸설폭시드(DMSO), 30U E.Coli RNase H 및 0.55U BcaBEST DNA 폴리머라제를 포함하 는 40 ㎕의 혼합물을 가하여 최종 용량 50 ㎕으로 하였다. 반응 혼합물을 thermal cycler에서 1시간동안 60℃에서 인큐베이션시켰다. 반응후, 5 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 추가로, ICAN 및 PCR에 의해 DNA를 검출하는 감수성을 비교하기 위하여 서열번호 111 및 112로 나타낸 프라이머 pDON-AI-3 및 pDON-AI-4를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR을 하기와 같이 수행하였다. 0.1ng 내지 100ng의 주형, 60pmol의 각 프라이머, 1.25U의 TaKaRa Ex Taq DNA 폴리머라제(Takara Shuzo) 및 0.2mM 각 dNTPs를 포함하는 50 ㎕의 반응 혼합물을 Thermal Cycler을 사용하여 하기와 같이 반응시켰다: 30초동안 94℃에서 30초동안 55℃ 및 30초동안 72℃에서 35싸이클. 반응 후, 5 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 도 21에 결과를 나타낸다. 도 21은 ICAN 및 PCR에 따라 레트로바이러스 벡터로 감염되 세포로부터의 통합 바이러스 유전자 검출 결과를 나타낸다. 레인 1: 분자량 마커(100bp); 레인 2: 1000ng의 주형; 레인 3: 100ng의 주형; 레인 4: 10ng의 주형; 레인 5: 1ng의 주형; 및 레인 6: 0.1ng의 주형.
도 21에 나타낸 바와 같이, 관심의 대상이 되는 증폭 산물은 1ng의 주형 DNAf를 사용한 ICAN 및 1ng의 주형 DNA를 사용항 35싸이클의 PCR에 대하여 관찰되었다.
실시예 24
본 발명의 증폭 방법 및 하이드리드화 방법을 조합된 표적 핵산 검출 방법을 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157 베록독소 I의 검출을 위해 연구하였 다. 장출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157의 베록독소 I의 유전자를 표적으로서 선택하였다. 주형 DNA를 실시예 8(1)과 같이 제조하였다. 약 40%의 GC 함량을 갖는 약 80bp의 부위을 증폭켰다. 서열번호 113 및 114로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 VT1-IF4 및 VT1-IR1을 프라이머로서 사용하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 60pmol의 프라이머 VT1-IF4 및 VT1-IR1, 최종 농도 0.01%의 프로필렌디아민, 0 내지 105개의 세포에 상응하는 온수-추출액 및 멸균수를 포함하는 5 ㎕의 혼합물을 제조하였다. 혼합물을 2분동안 98℃에서 열-변성시킨 후, Thermal Cycler Personal(Takara Shuzo)에서 1분동안 상기 온도에서 인큐베이션시키고 어닐링을 위해 얼음상에 방치하였다.
어닐링 후, 최종 농도 20mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 0.01% 소 혈청 알부민(BSA), 1% 디메틸설폭시드(DMSO), 500μM 각 dNTPs, 2.75U BcaBEST DNA 폴리머라제 및 15U E.coli RNase H를 혼합물에 가하여 멸균수로 최종 용량을 25 ㎕으로 하였다. 반응 혼합물을 55℃으로 세팅된 Thermal Cycler Personal상에 방치하고 60분동안 상기 온도에서 인큐베이션시켰다. 대조군으로서 Thermal Cycler Personal을 사용하여 매뉴얼에 따라 O-157 Typing Set(Takara Shuzo)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR을 하기와 같이 수행하였다: 1분동안 94℃, 1분동안 55℃, 1분동안 72℃에서 35싸이클. 상기 반응을 위해 필요한 총 시간은 약 145분이었다. 증폭 산물의 예상된 크기는 349bp였다. 반응후, 3 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% NuSieve 3:1 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. ICAN에 대한 결 과를 도 22에 나타낸다. 도 22는 O-157 베로독소 I 유전자의 검출에 대한 결과를 보여준다. 레인 M1: 분자량 마커(50-2000 bp); 레인 N: 주형으로서 멸균수; 레인 1: 1개의 세포에 상응하는 주형; 레인 2: 10개의 세포에 상응하는 주형; 레인 3: 102개의 세포에 상응하는 주형; 레인 4: 103개의 세포에 상응하는 주형. 또한, ICAN 및 PCR에 의한 검출 결과를 표 10에 나타낸다.
표 10
에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157 세포
0 1 10
ICAN - + +++
PCR - + +++

: 증폭되지 않음; + 내지 +++는 3단게의 증폭 정도를 나타낸다.
표 10에 나타낸 바와 같이, ICAN 및 PCR 모두를 사용한 1개의 세포에 상응하는 온수-추출액을 사용하여 반응 시스템에서 관심의 대상이 되는 증폭 산물을 관찰하였다. 또한, 프로브로서 5'-말단에 바이오틴으로 표지된 서열번호 115로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 VT1을 사용하여 증폭 산물에 대하여 도트 블랏 하이브리드화를 수행하였다. 하이브리드화를 실시예 19와 같이 수행하였다. 결과는 전기영동에 의한 결과와 일치하였다. 따라서, ICAN의 검출 감수성은 PCR의 것과 일치한다는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 ICAN을 사용하여 증폭 반응을 위해 요구되는 시간은 PCR을 위해 요구되는 것과 비교하여 1/2 이하였다. 따라서, 본 발명의 ICAN이 병원성 박테리움 등을 검출하기 위해 유효하다는 것이 입증되었다.
실시예 25
보톨리늄(botulinum) 독소 A형에 대한 유전자를 검출하는 방법을 조사하였다. 식중독 케이스, type A-190로부터의 균주 클로스트리듐 보톨리늄(Clostridium botulinum )로부터의 DNA를 주형으로서 사용하였다. 이 균주는 Department of Hygiene, Kagawa Nutrition University에 보관되어 있다. 검출용 프라이머로서 서열번호 116 및 117에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 BotA S2 및 BotA A2를 합성하였다. 상기 프라이머를 사용하여 수득한 증폭 산물의 크기는 약 150bp였다. 1 ㎕의 멸균수중 주형으로서 사용되는 A형 독소-생산 클로스트리듐 보톨리늄(Clostridium botulinum )으로부터 100fg, 1pg, 10pg 또는 100pg의 DNA를 포함하는 용액을 제조하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다.
50pmol의 프라이머, 최종 농도 0.01%의 프로필렌디아민, 주형으로서 1 ㎕의 DNA 용액중 하나를 포함하는 10 ㎕의 혼합물을 제조하였다. 혼합물을 실시예 19에 기술된 반응 혼합물의 조성 및 반응 조건을 사용하여 ICAN하였다. 대조군으로서 보톨리늄(botulinum) 독소 A형에 대한 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트, BAS-1 및 BAS-2 (Takara Shuzo)를 사용하여 Thermal Cycler Personal에서 매뉴얼에 따라 PCR을 수행하였다. 증폭 산물의 예상 크기는 284bp였다.
반응 후, 3 ㎕의 각 반응 혼합물을 4.0% NuSieve 3:1 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 23A에 나타낸다. 도 23A는 ICAN 및 PCR에 따른 보톨리늄(botulinum) 독소 A형에 대한 유전자 검출 결과를 나타낸다. 레인 M1: 분자량 마커(100bp); 레인 M2: 분자량 마커(50-2000 bp 마커); 레인 1: 주형 없음; 레인 2: 100fg의 주형; 레인 3: 10pg의 주형; 및 레인 4: 100pg의 주형.
도 23A에 나타낸 바와 같이, 관심의 대상이 되는 증폭 산물은 100fg의 주형 DNA를 ICAN에 따라 사용한 반응에서 관찰되었다. 한편, 관심의 대상이 되는 증폭 산물은 100fg의 주형 DNA를 PCR에 따라 사용한 반응에서는 관찰되지 않았다. 또한, 반응 산물에 대한 도트 블랏 하이브리드화를 서열번호 118에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 BotA 프로브를 사용하여 수행하였다. 도트 블랏 하이브리드화를 실시예 9에 기술한 바와 같이 수행하였다. 결과를 도 23B에 나타낸다. 도 23B에 나타낸 바와 같이, 시그날은 각각 ICAN에 대하여 100fg의 주형을 사용하고 PCR에 대하여 10pg의 주형을 사용하여 관찰되었다. 이 결과는 전기영동의 결과와 일치하였다.
실시예 26
크리산써뭄(chrysanthemum) 비로이드의 검출을 조사하였다. JP-A 9-140383의 실시예 1에 기술된 바와 같은 국화 왜화증(Chrysanthemum Stunt Viroid)(CSVd)로 감염된 크리산써뭄(chrysanthemum)으로부터 저분자 RNA을 추출하는 방법에 따라 수득한 저분자 RNA의 10배 연속 희석액을 제조하였다. 역전사 반응을 RNA PCR 키트 (AMW) 버젼 2.1 (Takara Shuzo)를 사용하여 수행하였다. 특히, 1 x RNA PCR 완충액, 5mM MgCl2, 1mM 각 dNTPs, 20U의 RNase 저해제, 5U의 AMV 역전사효소 XL, 50pmol 무작위 9mers, 1 ㎕의 RNA의 연속 희석액중 하나를 포함하는 역전사 반응 혼합물 20 ㎕을 제조하였다. 혼합물을 30℃에서 10분에서 가온시키고 55℃에서 30분동안 가열하고 5분동안 99℃에서 가열하여 역전사 효소를 불활성화시켰다. 냉각 후 ICAN을 수행하였다. 1 ㎕의 역전사 반응 혼합물을 ICAN을 위한 50 ㎕의 반응 혼합물에 대하여 주형으로서 사용하였다. 서열번호 119 및 120을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머CSVD-F4 및 CSVD-R3을 본 실시예에서 프라이머로서 사용하였다. 반응 온도가 60℃이고 Thermal Cycler MP를 사용한 것을 제외하고 실시예 19에 기술된 바와 같이 반응을 수행하였다. 반응 후, 3 ㎕의 각 반응 혼합물을 3% Nucieve 3:1 아가로스겔사에서 전기영동시켰다.
한편, 주형으로서 1 ㎕의 동일한 역전사 반응 혼합물을 사용하여 50 ㎕의 반응 시스템에서 PCR 증폭을 수행하였다. 서열번호 109 및 110으로 나타낸 프라이머 F 94 및 R264를 프라이머로서 사용하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다. 반응 혼합물을 프로토콜에 따라 Takara PCR Amplification kit를 사용하여 제조하였다. 10pmol 각 프라이머 및 1 ㎕의 역전사 반응 혼합물을 가하여 최종 용량을 50 ㎕으로 하였다. 증폭 반응은 Thermal Cycler MP를 사용하여 반응을 하기와 같이 수행하였다: 30초동안 94℃, 30초동안 55℃ 및 30초동안 72℃에서 30싸이클. 반응 후 5℃의 각 반응 혼합물을 5 ㎕의 각 반응 혼합물을 3% Nucieve 3:1 아가로스겔사에서 전기영동시켰다. 결과를 표 11에 나타낸다.
표 11
주형으로서 RNA의 희석비율 x 102 x 103
RT-ICAN RT-PCR ++ + + -

- : 증폭되지 않음. +: 증폭 ++: 우수한 증폭
표 11에 나타낸 바와 같이 ICAN에 따라 103배 희석된 RNA 샘플을 주형으로 사용한 반응에서 증폭 산물이 관찰되었다. 한편, PCR에 따라 102배 희석된 RNA 샘플을 주형으로 사용한 반응에서 증폭 산물이 관찰되었다.
또한, ICAN-증폭 산물 및 PCR-증폭 산물이 도트 블랏 하이브리드화에 의해 관심의 대상이 되는 산물로 확인되었다. 도트 블랏 하이브리드화를 5'-말단에 바이로팅으로 표지된 서열번호 121로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 CSVd 프로브를 사용하여 수행하였다. 실시예 9에서와 같이 하이브리드화를 수행하였다. 결과는 전기영동과 일치하였다. 시그날은 각각 ICAN에 대하여 103배 희석된 RNA 샘플 및 PCR에 대하여 102배 희석된 RNA 샘플에서 관찰되었고, 이는 PCR보다 ICAN이 더욱 감수성임을 입증한다.
실시예 27
Pfu RNase H를 사용하여 크리산써뭄 드와핑 비로이드(chrysanthemum dwarfing viroid) (CSVd)로 감염된 크리산써뭄(chrysanthemum)으로부터 비로이드 유전자를 검출하는 것을 조사하였다. 3 ㎕의 실시예 26에서 제조된 RNA의 10배 연속 희석액중 하나, 10mM tris-하이드로클로라이드 완충액(pH 8.3), 50mM 염화칼륨, 5mM 염화마그네슘, 1mM 150pmol 무작위 6mers, 60U의 RNase 저해제(Takara Shuzo) 및 15U의 역전사효소 XL(AMV)(Takara Shuzo)를 포함하는 60 ㎕의 혼합물을 thermal cycler(GeneAmp PCR System 9600, Applied Biosystems)를 사용하여 30℃에서 10분, 42℃에서 1시간동안 인큐베이션시키고 99℃에서 5분동안 가열하여 효소를 불활성시켜 cDNA를 제조하였다. 서열번호 122 내지 125로 나타낸 프라이머 Vd1, Vd2, Vd3, 및 Vd4를 비로이드에 대한 mRNA의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 합성하였다.
50pmol의 각 프라이머 Vd1 및 Vd2, 상기 기술된 바와 같은 1삐의 cDNA, 주형으로서 물로의 10-, 100-, 1000- 또는 10000-배 희석액 또는 음성 대조군을 위해 물, 0.5mM 각 dNTPs, 32mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 4.0mM 아세트산마그네슘, 0.01% 소 혈청 알부민(BSA), 1% 디메틸설폭시드(DMSO), 0.156μg의 Pfu RNase H 및 1U BcaBEST DNA 폴리머라제를 포함하는 50 ㎕의 혼합물을 Thermal Cycler에서 1시간동안 57℃에서 인큐베이션시켰다. 반응 샘플을 분석시까지 -20℃에서 냉동시켜 저장하였다.
PCR을 대조군으로서 수행하였다. 간단하게, 50pmol의 각 프라이머 Vd3 및 Vd4, 상기 기술된 바와 같은 1 ㎕의 cDNA 용액, 주형으로서 물로의 10-, 100-, 1000- 또는 10000-배 희석액 또는 음성 대조군을 위해 물, 5 ㎕의 10 x Ex Taq 완충액, 1.25U Takara Ex Taq 폴리머라제 및 0.2mM 각 dNTPs를 포함하는 50 ㎕의 반응 시스템을 Thermal Cycler에서 하기와 같이 반응시켰다. 30초 94℃, 30초 55℃ 및 30초 72℃에서 35싸이클; 및 5분동안 72℃에서 1싸이클.반응 샘플을 분석시까지 -20℃에서 냉동시켜 저장하였다.
5 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 24에 나타낸다. 도 24는 Pfu RNase H 를 사용항 ICAN 및 PCR에 따른 비로이드 검출 결과를 나타낸다. 레인 M: 100 bp DNA 레더 마커; 레인 2: 음성 대조군; 레인 3: cDNA의 10000배 희석액; 레인 4: cDNA의 1000배 희석액; 레인 5: cDNA의 100배 희석액; 레인 6: cDNA의 10배 희석액; 및 레인 7: cDNA 원액.
도 24에 나타낸 바와 같이, 관심의 대상이 되는 증폭 산물을 ICAN 및 PCR에 대하여 cDNA의 100배 희석액에서 관찰하였다.
K-ras 유전자 검출을 연구하였다.
(1) 게놈 DNA 검출
인간 c-Ki-ras의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 서열번호126 및 127로 나타낸 프라이머 c-Ki-ras-1 및 c-Ki-ras-2를 작제하였다.
60pmol의 각 프라이머, 2 ㎕의 0.25% 프로필렌디아민 수용액 및 주형으로서 1ng 내지 100ng 인간 게놈 DNA(Clontech)를 포함하는 10 ㎕의 혼합물을 제조하였다. 혼합물을 Thermal Cycler Personal에서 2분동안 98℃ 이어서 53℃에서 열-변성시켜 프라이머를 주형에 어닐링시켰다.
어닐링 후, 0.625mM 각 dNTPs, 40mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 125mM 아세트산칼륨, 5.0mM 아세트산마그네슘, 0.0125% 소 혈청 알부민(BSA), 1.25% 디메틸설폭시드(DMSO), 5.5U BcaBEST DNA 폴리머라제 및 30U E.coli RNase H를 포함하는 40 ㎕의 혼합물을 가하여 최종 용량을 50 ㎕으로 하였다. 반응 혼합물을 1시간동안 53℃에서 인큐베이션시켰다. 반응후, 5 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다.
한편, 대조군으로서 PCR을 수행하였다. 서열번호 128 및 129로 나타낸 프라이머 c-Ki-ras-3 및 c-Ki-ras-4를 프라이머로서 사용하였다. 60pmol의 각 프라이 머, 0.1ng 내지 100ng의 주형, 5 ㎕의 10 x Ex Taq 완충액, 1.25U의 Takara Ex Taq DNA 폴리머라제 및 0.2mM 각 dNTPs를 포함하는 50 ㎕의 반응 혼합물을 제조하였다. 혼합물을 Thermal Cycler을 사용하여 하기와 같이 반응시켰다: 30초동안 94℃에서 30초동안 55℃ 및 30초동안 72℃에서 30 또는 35싸이클. 반응 후, 5 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 도 25에 결과를 나타낸다. 도 25는 ICAN 및 PCR에 따라 인간 게놈 DNA로부터 c-Ki-ras ICAN에 대하여 레인 1: 분자량 마커; 레인 2: 100ng의 주형; 레인 3: 10ng의 주형; 레인 4: 1ng의 주형; 레인 5: 주형 없음. PCR에 대하여 레인 1: 100ng의 주형; 레인 2: 10ng의 주형; 레인 3: 1ng의 주형.
도 25에 나타낸 바와 같이, 관심의 대상이 되는 증폭 산물은 1ng의 주형 DNAng를 사용한 ICAN 및 10ng의 주형 DNA를 사용항 30싸이클의 PCR에 대하여 관찰되었다. 1ng 내지 100ng의 주형을 사용하여 ICAN 및 PCR에 의해 수득된 증폭 산물의 양에 대한 비교 결과를 도30에 나타낸다. 도에서, 빗금친(shaded) 바는 30싸이클의 PCR의 결과를 도트 바는 ICAN에 대한 결과를 각각 나타낸다. 도 30에 나타낸 바와 같이 ICAN에 의해 수득한 증폭 산물의 양이 PCR에 의한 것보다 많음을 확인하였다.
(2) 혈액 샘플의 검출
항응고제로서 시트르산나트륨 또는 헤파린을 사용하여 건강한 개체로부터 회수된 100 ㎕의 혈액 샘플로부터 Dr. GENTLETM(Whole Blood)(Takara Shuzo)를 사용하 여 게놈 DNA를 제조하였다. 0.04 내지 5 ㎕의 혈액에 상응하는 제조된 DNA를 사용하여 상기 (1)에 기재된 바와 같이 ICAN에 의해 c-Ki-ras 유전자를 검출하였다. 또한, ICAN 및 PCR에 의해 DNA를 검출하는 감수성을 비교하기 위하여 0.04 내지 5 ㎕의 혈액에 상응하는 제조된 DNA를 사용하여 상기 (1)에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 c-Ki-ras 유전자를 검출하였다. 결과를 도 26에 나타낸다. 도 26은 ICAN 및 PCR에 의해 혈액 샘플로부터의 c-Ki-ras 유전자 검출 결과를 나타낸다. ICAN에 대하여 레인 1: 분자량 마커; 레인 2: 5 ㎕의 시트르산 처리된 혈액; 레인 3: 1 ㎕의 시트르산 처리된 혈액; 레인 4: 0.2 ㎕의 시트르산 처리된 혈액; 레인 5: 0.04 ㎕의 시트르산 처리된 혈액; 레인 6: 5 ㎕의 헤파린 처리된 혈액; 레인 7: 1 ㎕의 헤파린 처리된 혈액; 레인 8: 0.2 ㎕의 헤파린 처리된 혈액; 레인 9: 0.04 ㎕의 헤파린 처리된된 혈액. PCR에 대하여 레인 1: 분자량 마커; 레인 2: 5 ㎕의 시트르산 처리된 혈액 30싸이클; 레인 3: 1 ㎕의 시트르산 처리된 혈액 30싸이클; 레인 4: 0.2 ㎕의 시트르산 처리된 혈액 30싸이클; 레인 5: 0.04 ㎕의 시트르산 처리된 혈액 30싸이클; 레인 6: 5 ㎕의 시트르산 처리된 혈액 35싸이클; 레인 7: 1 ㎕의 시트르산 처리된 혈액 35싸이클; 레인 8: 0.2 ㎕의 시트르산 처리된 혈액 35싸이클; 레인 9: 0.04 ㎕의 시트르산 처리된 혈액 35싸이클; 레인 10: 5 ㎕의 헤파린 처리된 혈액 30싸이클; 레인 11: 1 ㎕의 헤파린 처리된 혈액 30싸이클; 레인 12: 0.2 ㎕의 헤파린 처리된 혈액 30싸이클; 레인 13: 0.04 ㎕의 헤파린 처리된 혈액 30싸이클; 레인 14: 5 ㎕의 헤파린 처리된 혈액 35싸이클; 레인 15: 1 ㎕의 헤파린 처리된 혈액 35싸이클; 레인 16: 0.2 ㎕의 헤파린 처리된 혈액 35싸이클; 레인 17: 0.04 ㎕의 헤 파린 처리된된 혈액 35싸이클.
도 26에 나타낸 바와 같이,, 관심의 대상이 되는 증폭 산물은 ICAN에 대한 어느 샘플 0.2 ㎕에 상응하는 게놈 DNA , 및 30싸이클의 PCR(시트라산 처리 또는 헤파린 처리)에 대한 어느 샘플 0.2 ㎕에 상응하는 게놈 DNA을 사용하여 각각 관찰되었다. 1ng 내지 100ng의 주형을 사용하여 ICAN 및 PCR에 의해 수득된 증폭 산물의 양에 대한 비교 결과를 도30에 나타낸다. 도에서, 빗금친 바는 30싸이클의 PCR의 결과를 도트 바는 ICAN에 대한 결과를 각각 나타낸다. 도 30에 나타낸 바와 같이 ICAN에 의해 수득한 증폭 산물의 양이 PCR에 의한 것보다 많음을 확인하였다.
실시예 29
Bca RNase HIII를 사용하여 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157 베로독소 2 (VT-2) 유전자 검출을 연구하였다. 장출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157를 노보바이신을 포함하는 mEC 배지에서 42℃에서 18시간동안 배양한 후, 멸균수중 0, 1, 10, 101, 102, 또는 103에 상응하는 희석액을 주혀으로서 제조하였다. 검출을 위해 서열번호 130 및 131에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 VT-2 IF4 및 VT-2 IR3을 합성하였다. 프라이머쌍을 사용하여 수득된 증폭 산물의 크기는 146bp였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 50pmol의 프라이머, 최종 농도 0.01%의 프로필렌디아민 및 온수-추출액중 하나를 포함하는 10 ㎕의 혼합물을 제조하였다. 혼합물을 Thermal Cycler Personal(Takara Shuzo)에서 2분동안 98℃에서 가열한 후, 1분동안 55℃에서 인큐베이션시키고 얼음상에 방치하였다. 최종 농도 34mM Tricine-수산화칼륨(pH 8.7), 10mM 염화칼륨, 10mM 황산암모늄, 0.01% 소 혈청 알부민(BSA), 1% 디메틸설폭시드(DMSO), 4mM 아세트산칼륨, 500μM 각 dNTPs, 5.5U BcaBEST DNA 폴리머라제 및 5.5U 참고 실시예 3(5)에 기술된 Bca RNase H를 혼합물에 가하여 멸균수로 최종 용량을 50 ㎕으로 하였다. 반응 혼합물을 55℃으로 세팅된 Thermal Cycler Personal상에 방치하고 60분동안 상기 온도에서 인큐베이션시켰다. 반응후, 3 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% NuSieve 3:1 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 27에 나타낸다. 도 27은 Bca RNase H를 사용한 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157 베로독소 2 (VT-2) 유전자 검출 결과를 보여준다. 레인 M: 분자량 마커(100 bp); 레인 N: 주형으로서 멸균수; 레인 1: 1개의 세포에 상응하는 주형; 레인 2: 10개의 세포에 상응하는 주형; 레인 3: 102개의 세포에 상응하는 주형; 레인 4: 103개의 세포에 상응하는 주형.
도 27에 나타낸 바와 같이 VT2 유전자는 ICAN에 따라 1개의 세포에 상응하는 온수-추출액을 사용하여 검출되었다. 이 결과를 실시예 9에서 기술된 PCR 및 E.Coli RNase H를 사용하여 ICAN에 따른 검출 반응과 일치하였다. 따라서 열내성 RNase H, Bca RNase HIII를 사용한 ICAN 또한 바이러스, 박테리움 등의 검출에 효과적이다는 것을 확인하였다.
실시예 30
스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 장관내 독소 A 유전자 검출을 연구하였다. 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 장관내 독소 A 유전자 부위의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 서열번호 136 및 137에 나타낸 프라이머 SEA-1 및 SEA-2를 합성하였다. 115pg 또는 1.15ng의 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(ATCC 기탁번호 13565)을부터 게놈 DNA 또는 음성 대조군을 위해 물, 50pmol의 각 프라이머, 0.5mM 각 dNTPs, 32mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 4.0mM 아세트산마그네슘, 0.01% 소 혈청 알부민(BSA), 1% 디메틸설폭시드(DMSO), 0.156μg의 Pfu RNase H 및 1U BcaBEST DNA 폴리머라제를 포함하는 50 ㎕의 혼합물을 Thermal Cycler에서 1시간동안 58℃에서 인큐베이션시켰다. 5 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 29에 나타낸다. 도 29는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 장관내독소 A 유전자에 대한 결과를 나타낸다. 레인 1:분자량 마커 (100 bp 레더); 레인 2: 음성 대조군 (멸균수); 레인 3: 115pg의 주형; 및 레인 4: 1.15의 주형.
도 29에 나타낸 바와 같이 관심의 대상이 되는 증폭 산물이 약 1.15의 주형을 사용하여 관찰되었다.
실시예 31
C형 간염 바이러스(HCV)의 검출을 연구하였다. 서열번호 138 및 139로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 HCV-F3 및 HCV-R1을 HCV의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 합성하였다. 주형 DNA를 하기와 같이 제조하였다. 간단하게, 건강한 개체 또는 HCV로 감염된 환자의 혈청 100 ㎕을부터 실시예 21에 기술된 바와 같이 제조된 RNA, 10mM Tris-하이드로클로라이드(pH 8.3), 5mM MgCl2, 1mM 각 dNTPs, 10pmol 무작위 9mers 및 10U 역전사효소 XL(Takara Shuzo)를 포함하는 4 ㎕의 혼합 물 30℃에서 10분, 42℃에서 1시간동안 인큐베이션시키고 Thermal Cycler(GeneAmp PCR System 9600, Applied Biosystems)를 사용하여 99℃에서 5분동안 가열하고 30분동안 가열하고 5분동안 99℃에서 가열하여 역전사 효소를 불활성화시켜 cDNA를 제조하였다.
1 ㎕의 cDAN 반응 혼합물 및 100pmol의 프라이머 HCV-F3 및 HCV-R1을 사용하는 것을 제외하고 실시예 13에 기술된 바와 같이 ICAN을 55℃에서 1시간동안 수행하였다. 반응 후, 2.5 ㎕의 각 반응 혼합물을 3% 아가로스겔사에서 전기영동시켰다. 결과를 도 31에 나타낸다. 도 31은 C형 간염 바이러스 검출의 전기영동 결과를 보여준다. 레인 1: 분자량 마커(100bp); 레인 2: 건강한 개첼로부터으 혈청으로부터 제조된 주형; 레인 3 내지 6: HCVㄹ 감염된 환자로부터 제조된 주형.
도 31에 나타낸 바와 같이 HCV는 특히 HCV로 감염된 환자로부터 혈청 샘플로부터 검출될 수 있다고 확인하였다.
실시예 32
본 발명의 증폭 방법을 연구하였다.
(1) 주형으로서 실시예2(2)에서 제조딘 pUC19-150 플라스미드 DNA 및 서열번호 35 및 36에 나타낸 프라이머 MCS-F 및 MCS-R을 사용하여 PCR을 수행하였다. 534bp의 PCR 증폭 단편을 Microcon-100 (Millipore)를 사용하여 반응 혼합물을 정제하여 수득하였다. 15ng의 PCR 단편 및 5'-말단에 인산화에 의해 [γ-32P]으로 표지된 서번호로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 30pmol 프라이머 MR2 및 5 ㎕까지 멸균증류수를 포함하는 반응 혼합물 및 추가로 서열번호 141로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 30pmol 프라이머 MR1을 포함하는 반응 혼합물을 제조하였다. 반응 혼합물을 98℃ 2분에서 열-변성시키고 55℃으로 냉각시켰다. 1U BcaBEST DNA 폴리머라제를 포함하는 20 ㎕의 반응 혼합물(42.5mM 34mM Tricine-수산화칼륨(pH 8.7), 12.5mM 염화칼륨, 10mM 황산암모늄, 0.0125% 소 혈청 알부민(BSA), 1.25% 디메틸설폭시드(DMSO), 5mM 아세트산마그네슘,0.625mM dNTPs)을 반응 혼합물에 가하였다. 생성된 혼합물을 55℃에서 15분동안 반응시켰다. 반응 후 2.5 ㎕의 반응 종결 용액(95% 포름아미드, 20mM EDTA, 0.05% 브로모페놀 블루, 0.5% 크실렌 시아놀)을 반응 혼합물 5 ㎕에 가하였다. 혼합물을 94℃에서 3분동안 열-변성시켰다. 1.6 ㎕의 각 반응 혼합물을 8M 우레아를 포함하는 6% 폴리아크릴마이드 겔상에서 전기영동시키고 BAS2000(Fujix)를 사용하여 판독하여 프라이머 MR1으로부터 신장된 산물을 검출하였다. 결과를 도 32A에 나타낸다. 도 32A에서 서열 래더는 인산화에 의해 [γ-32P]으로 표지된 프라이머 MF2를 사용하여 M13mp18 싱글 스트랜드 DNA(Takara Shuzo)를 서열화하여 제조하고 신장 산물의 길이 측정을 위해 사용되었다. 레인 1: 프라이머 MF2 및 MR1; 및 레인 2: MR1.
도 32A에 나타낸 바와 같이, 프라이머 MR1으로부터 주형의 말단으로 신장된 448bp의 밴드는 프라이머 MR1만을 주형에 가하여 신장 반응을 수행하였을 때 검출되었다. 한편, 추가로 프라이머 MF2를 가하여 상기 언급한 밴드외에 프라이머 MF2 및 MR1에 결합한 373bp의 밴드를 검출하였다. 따라서, BcaBEST DNA 폴리머라제의 작용에 의해 주형으로서 PCR-증폭된 단편을 사용하여 MR1 프라이머로부터의 신장은 주형으로서 프라이머 MF2ㄹ부터 신장된 스트랜드를 사용한 신장을 변환시키는 주형에 기인하여 변환되었다는 것을 확인하였다. 또한, 동일한 조건하에서 스트랜드 치환 활성을 갖는 중온성 DNA 폴리머라제로서 Klenow DNA 폴리머라제를 사용할 때 주형 변환이 관찰되었다. 한편, Takara Taq DNA 폴리머라제(Takara Shuzo) 또는 스트랜드 치환 활성이 없는 PyroBEST DNA 폴리머라제(Takara Shuzo)를 사용할 때 주형 변환은 관찰되지 않았다.
(2) 주형 DNA 스트랜드와 그에 어닐링된 프라이머를 사용하여 주형 스위치 반응을 연구하였다. 프라이머 MF2 및 MR1가 어닐링될 수 있는 DNA 단편을 하기와 같이 제조하였다. 주형으로서 플라스미드 pUC19 및 프라이머 MCSF 및 RV (Takara Shuzo) 또는 프라이머 M4 (Takara Shuzo) 및 MCSR를 사용하여 PCR을 수행하였다. 반응 혼합물을 Microcon-100을 사용하여 정제하여 PCR-증폭된 단편s MSCF-RV (236 bp) 및 M4-MCSR (271 bp)를 수득하였다. 프라이머 M4 및 RV에 결합한 부위는 두개의 PCR-증폭된 단편에도 공통적을 존재하였다.
이후, 주형 DNA 스트랜드와 그에 어닐링되는 프라이머가 서로 어닐링하지 않은 주형-프라이머 (1), 및 형 DNA 스트랜드와 그에 어닐링되는 프라이머가 서로 어닐링된 주형-프라이머 (2)를 하기와 같이 제조하였다.
(1) 30ng의 단편 MCSF-RV, 5'-말단에 인산화에 의해 [γ-32P]으로 표지된 40pmol 프라이머 MF2, 최종 농도 0.01%의 프로필렌디아민 및 5 ㎕까지 멸균증류수 를 포함하는 반응 혼합물, 및 30ng의 단편 M4-MCSR, 40pmol 프라이머 MR1, 최종 농도 0.01%의 프로필렌디아민 및 5 ㎕까지 멸균증류수를 포함하는 반응 혼합물을 각각 98℃ 2분에서 열-변성시키고 55℃으로 냉각시켰다. 2.5 ㎕의 각 반응 혼합물을 혼합하여 주형-프라이머를 제조하였다.
(2) 15ng의 단편 MCSF-RV, 15ng의 단편 M4-MCSR, 5'-말단에 인산화에 의해 [γ-32P]으로 표지된 40pmol 프라이머 MF2, 20pmol 프라이머 MR1, 최종 농도 0.01%의 프로필렌디아민 및 5 ㎕까지 멸균증류수를 포함하는 반응 혼합물을 각각 98℃ 2분에서 열-변성시키고 55℃으로 냉각시켰다. 2.5 ㎕의 각 반응 혼합물을 혼합하여 주형-프라이머를 제조하였다.
1U BcaBEST DNA 폴리머라제를 포함하는 20 ㎕의 반응 혼합물(42.5mM Tricine 완충액(pH 8.7), 12.5mM 염화칼륨, 12.5mM 황산암모늄, 0.0125% 소 혈청 알부민(BSA), 1.25% 디메틸설폭시드(DMSO), 5mM 아세트산마그네슘,0.625mM dNTPs)을 반응 혼합물에 가하였다. 생성된 혼합물을 주형-프라이머 반응 혼합물 5 ㎕에 가하였다. 반응 혼합물을 55℃에서 15분동안 반응시켰다. 반응 후 2.5 ㎕의 반응 종결 용액(95% 포름아미드, 20mM EDTA, 0.05% 브로모페놀 블루, 0.5% 크실렌 시아놀)을 반응 혼합물 5 ㎕에 가하였다. 혼합물을 94℃에서 3분동안 열-변성시켰다. 1.6 ㎕의 각 반응 혼합물을 8M 우레아를 포함하는 6% 폴리아크릴마이드 겔상에서 전기영동시키고 BAS2000(Fujix)를 사용하여 판독하여 프라이머 MF2으로부터 신장된 산물을 검출하였다. 결과를 도 32B에 나타낸다. 도 32B에서 서열 래더는 인산화에 의해 [γ-32P]으로표지된 프라이머 MR1을 사용하여 M13mp18 싱글 스트랜드 DNA(Takara Shuzo)를 서열화하여 제조하고 신장 산물의 길이를 측정하는데 사용되었다. 레인1 :서로 어닐링되지 않은 주형 DNA 스트랜드; 및 레인 2: 서로 어닐링된 주형 DNA 스트랜드.
도 32B에 나타낸 바와 같이. 프라이머 MF2로부터 주형의 말단으로 신장된 161bp의 밴드는 주형 DNA 스트랜드와 그에 어닐링화는 프라이머가 서로 어닐닐되지 않은 주형-프라이머에 대하여 검출되었다. 한편, 상기 기재한 밴드외에도 프라이머 MF2 및 MR1에 의해 결합된 223bp의 밴드는 주형 DNA 스트랜드와 그에 어닐링화는 프라이머가 서로 어닐링된 주형-프라이머에 대하여 검출되었다. 따라서, 주형 DNA 스트랜드와 그에 어닐링화는 프라이머가 서로 어닐링된 경우 주형 스위치 반응이 발생한다는 것을 확인하였다.
실시예 33
(1) 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 검출을 참고 실시예 7에 기술된 아르키오글루부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus) (Afu)으로부터의 RNase H를 사용하여 연구하였다. 프라이머 MTIS2F (서열번호 155) 및 MTIS2R (서열번호 156)를 기탁번호 AL123456하에 GeneBank에 등록된 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis) 게놈의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 합성하였다. 프라이머 부위를 포함하는 프라이머쌍에 의해 인접한 부위의 길이는 103 bp였다. 통상의 방법에 따라 주형으로서 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis) 게놈 DNA을 건성 BCG 백신 (Nippon BCG Seizo) 으로부터 추출하였다. 1 ㎕의 멸균수당 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg 또는 1fg의 게놈 DNA을 포함하는 용액을 제조하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 최종 농도 32mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 0.01% 소 혈청 알부민(BSA), 1% 디메틸설폭시드(DMSO), 500μM 각 dNTPs, 50pmol의 프라이머 MTIS2R, Afu로부터의 8.75U RNase H, 8U의 BcaBEST DNA 폴리머라제 및 1 ㎕의 주형중 하나를 혼합학 최종 용량을 멸균수로 50 ㎕으로 하였다. 반응 혼합물을 55℃으로 세팅된 Thermal Cycler Personal상에 방치하고 60분동안 상기 온도에서 인큐베이션시켰다. 반응후, 3 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% NuSieve 3:1 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다.
한편, 대조군으로서 PCR을 수행하였다. Rinsho Byori(the Japanese Journal of Clinical Patology), 43(9):941-947(1995))에 기술된 프라이머 MTIS PCR-F 및 MTIS PCR-R을 프라이멀서 사용하였다. 276bp의 증폭 산물을 프라이머쌍을 사용하여 수득한다. Ex Taq DNA 폴리머라제에 첨부된 안내 매뉴얼에 따라 10pmol의 각 프라이머를 사용하여 50 ㎕의 반응 혼합물을 제조하였다. 반응 혼합물을 thermal cycler에 방치하고 94℃ 30초, 50℃ 30초 및 72℃ 30초로 구성된 각 싸이클로 40싸이클. 반응 후, 반응후, 3 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다.
결과, 관심의 대상이 되는 증폭 산물은 100fg 의 주형을 사용하는 모든 경우에서 관찰되었다.
(2) 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii)(Pho)로부터의 RNase H 또는 Afu로부터의 RNase H를 사용하여 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia tracomatis)의 검출을 연구하였다. 프라이머 CT2F (서열번호 157) 및 CT2R (서열번호 158)를 기탁번호 X06707하에 GeneBank에 등록된 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia tracomatis) 플라스미드의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 합성하였다. 프라이머 부위를 포함하는 프라이머쌍에 의해 인접한 부위의 길이는 109 bp였다. 주형 DNA로서 샘플은 페놀-클로로포름 처리 및 에탄올 침전에 대한 사전 동의서을 받은 환자로부터 얻은 임상검체에 의해 제조하였다. 반응을 하기와 같이 제조하였다. 간단하게, 최종 농도 32mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 0.01% 소 혈청 알부민(BSA), 1% 디메틸설폭시드(DMSO), 4mM 아세트산마그네슘, 500μM 각 dNTPs, 50pmol의 프라이머 CT2F 및 CT2R, Pho로부터 46.4U RNase H,또는 Afu로부터 8.75U의 RNase H, 8U의 BcaBEST DNA 폴리머라제 및 1 ㎕의 샘플을 혼합하여 최종 용량을 멸균수로 50 ㎕으로 하였다. 반응 혼합물을 55℃으로 세팅된 Thermal Cycler Personal상에 방치하고 60분동안 상기 온도에서 인큐베이션시켰다. 반응후, 3 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과 관심의 대상이 되는 증폭 산물을 관찰하였다. 이 결과는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia tracomatis)가 본 발명의 방법을 Afu 또는 Pho 로부터 RNase H를 사용하여 관찰할 수 있음을 입증하였다.
(3) 또한, 상업적으로 이용할 수 있는 검출 장치에서 자기 비드를 사용하는 검출을 연구하였다. 간단하게 프라이멀서 바이오틴으로 5‘-말단에 표지된 상기(1) 에서 사용된 프라이머 MTIS2R 및 주형으로서 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis) 게놈 DNA를 사용하여 증폭 반응을 수행하였다. 생성된 증폭 단편을 30배, 300배 또는 3000배로 희석시키고 자동 검출 장치 Lumipuls (Fujirebio)에서 스트렙토아비딘-피복된 자기 비드(Pierce)를 사용하여 검출하였다.
고정된 100pmol 바이오틴을 결합시킬 수 있는 스트렙토아비딘을 갖는 자기 비드를 쿠베트의 제 1 레이어상에서 5분동안 바이오틴화딘 증폭 단편가 반응시켰다. 이어서 0.1 N NaOH를 가하였다. FITC-표지 프로브 MTISBF와의 하이브리드화를 5분동안 수행하였다. 세척후 POD-표지 항-FITC 항체를 가하였다. 5분동안 반응시키고 세척한 후, 발광 물질을 가하였다. 결과, 통상의 자동 검출 장치내에서 자기 비드를 사용하여 단시간(20분)동안 반-양적으로 검출을 수행할 수 있음을 보여준다. 광계수에 의해 발광 수준을 측정하여 검출을 수행하였다. 결과를 표 12에 나타낸다.
표 12
마이코박테리움 튜버큐로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 아플리콘 광계수 S/N 비
x 30 3.55 x 107 29.6
x 300 1.21 x 107 10.0
x 3000 0.21 x 107 1.75
0 0.12 x 107 -

표 12의 결가에서 검출을 통상의 플레이트 발관 방법의 것과 동일한 감수성을 수행하였음이 입증되었다.
(4) 하이브리드 크로마토그래피 방법을 상기 언급한 증폭된 단편을 검출하기 위한 방법으로서 연구하였다.
스트렙토아비딘 (Nacalai Tesque)을 니트로셀룰로오스 막에 고정시켰다. 물-흡수성 패드를 연겨시켜 하이브리드 크로마토그래피 스티립을 작제하였다. 스트립을 사용하여 하이브리드 크로마토그래피 방법에 대한 상기 (3)에서 사용된 증폭 단편을 검출하였다. 1-단계 TMB-Blotting (Pierce)를 사용하여 발색에 의해 검출을 수행하였다. 특히 증폭 단편을 포함하는 반응 혼합물을 니트로셀룰로오스 막상에서 전개시켰다. 이후, 0.1 N NaOH 용액, FITC-표지 프로브, 세척액 및 발색 용액의 순서대로 전개시켰다. 결과, 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis)-양성 샘플로부터 유래된 증폭 단편을 위해 블루 밴드를 검출하였다. 본 발명의 방법에 의해 나안으로 5 내지 10분후 결과를 본 발명으로 수득하기 때문에 본 발명은 신속 유전자 연구법으로서 유용하다고 입증되었다.
실시예 34
(1) 레더 밴드를 포함하는 증폭 산물의 서던 하이브리드 분석
일부 경우 3개의 관심의 대상이 되는 밴드외에 다수의 고분자 레더 밴드를 본 발명의 증폭 방법에서 관찰될 수 있다. 래더 밴드를 연구하였다. 장출혈성 E.Coli O-157를 표적으로서 선택하였다. ICAN에 대한 반응 조건 및 키메라성 프라이머, 주형 DNA를 실시예 9에 기술하였다. 반응 후, 5 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% NuSieve 3:1 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 37에 나타낸다. 도 37에서 레인이 하기에 대한 결과를 나타낸다. 레인 M: 100bp DNA 래더 마커; 레인 2: 1개의 세포에 상응하는 가열된 추출액; 레인 3: 10개의 세포에 상응하는 가열된 추출액; 레인 4: 100개의 세포에 상응하는 가열된 추출액; 레인 5: 1000개의 세포에 상응하는 가열된 추출액; 레인 6: 10000개의 세포에 상응하는 가열된 추출액; 및 레인 7: 100000개의 세포에 상응하는 가열된 추출액. 레더 밴드가 도 37에서와 같이 관찰디었다.
(2) 래더 증폭 단편의 분석
상기 (1)에서 수득한 래더 밴드의 뉴클레이티드 서열을 분석하였다. 간단하게 (1)에서 제조된 반응 혼합물 50㎖을 3% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 전기영동후 래더 밴드를 겔로부터 절단하였다. 증폭 DNA 단편을 EASYTRAP Ver.2(Takara Shuzo)를 사용하여 겔로부터 회수하였다. 회수한 증폭 단편을 DNA Blunting kit(Takara Shuzo)를 사용하여 말단을 둔화시켰다.
말단이 둔화된 DNA 단편을 DNA 결찰 키트(Takara Shuzo)를 사용하여 제한효소 HincII(Takara Shuzo)로 분해하여 벡터 pGEM-3Z (Promega)와 결찰시켰다. 결찰 혼합물으 사용하여 JM109 (Takara Shuzo)의 수용능력이 있는 세포로 형질전환시켰다. 형질전환 후 세포를 밤새도록 37℃에서 0.1 mM 앰피실린, 1 mM IPTG 및 0.02% X-gal를 포함하는 LB 아가상에서 배양하였다.
배양 후. 수개의 백색 콜로니를 플레이트로부터 선택하였다. 콜로니 PCRs를 프라이머 M13-M4 및 M13-RV(Takara Shuzo)를 사용하여 수행하여 인서트의 존재를 확인하였다. 인서트를 갖는 콜로니를 밤새도록 37℃에서 0.1 mM 앰피실린을 포함하는 LB 배지에서 진탕시키면서 배양하였다. 배양 후 플라스미드를 QIAGEN 플라스밈 드 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 세포로부터 정제하였다. 플라스미드의 HincII 사이트에서 클로닝된 단편 서열을 통상의 방법에 따라 프라이머 M13-M4 및 M13-RV를 사용하여 양 방향으로 분석하였다.
결과, 본 발명의 방법에 의해 수득된 레더 단편은 증폭시키고자 하는 부위가 반복된 구조를 갖는다고 입증되었다. 또한, 반복은 5‘로부터 3’으로 동일한 방향임을 확인하였다.
(3) 본 발명의 방법에서 형성된 관심의 대상이 되는 3개의 증폭 단편외에 래더 증폭 단편을 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis), HCV 또는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia tracomatis)에 대하여 연구하였다. 실시예 31에 기술된 바와 같은 조건하에 HCV를 검출하였다. 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis) 또는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia tracomatis)를 실시예 33에 기술된 바와 같은 조건하에 검출하였다. 생성된 레더 증편을 상기 (2)에 기술된 바와 같이 서브클로닝하고 서열화하였다.
결과, 본 발명의 방법에 의해 수득된 레더 단편은 증폭시키고자 하는 부위가 반복된 구조를 갖는다고 입증되었다. 또한, 반복은 5‘로부터 3’으로 동일한 방향임을 확인하였다.
실시예 35
(1) 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 대하여 본 발명의 검출방법을 연구하였다. 먼저, 프라이머 K-F-1033(60) (서열번호 159) 및 K-F-1133(62) (서열번호 160)를 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis) 게놈중 상대적으로 낮은 GC 함량을 갖는 부위를 증폭시키기 위하여 합성하였다. 실시예 33(1)에 기술된 바와 같은 100 fg 내지 10pg의 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis) 게놈 DNA를 포함하는 일련의 희석액을 주형으로서 사용하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 최종 농도 32mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 0.01% 소 혈청 알부민(BSA), 1% 디메틸설폭시드(DMSO), 4mM 아세트산마그네슘, 500μM 각 dNTPs, 50pmol의 프라이머 K-F-1033 및 K-F-1133(62), Pfu로부터의 9.735U의 RNase H 또는 Afu로부터의 4.375U의 RNase H, 2.75U의 BcaBEST DNA 폴리머라제 및 1 ㎕의 주형중 하나를 샘플을 혼합하여 최종 용량을 멸균수로 25 ㎕으로 하였다. 반응 혼합물을 55℃으로 세팅된 Thermal Cycler Personal상에 방치하고 60분동안 상기 온도에서 인큐베이션시켰다. 반응후, 3 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과 주형으로서 100 fg 내지 10pg의 게놈 DNA 및 RNase H를 사용하여 증폭 단편을 검출할 수 있음을 확인하였다.
(2) 상기 (1)에 기술된 방법을 높은 Tm값을 갖는 프라이머를 사용하여 연구하였다. 우선, 프라이머 K-F-1033(68) (서열번호 161) 및 K-F-1133(68) (서열번호 162)을 합성하였다. 반응 온도가 63℃인 것을 제외학 (1)에 기재된 바와 동일한 ㅈ건하에서 증폭 반응을 수행하였다. 반응 후 3 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 38에 나타낸다. 도 38은 Pfu로부터의 RNase H 또는 Afu로부터의 RNase H를 사용하여 증폭된 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis) 게놈의 전기영동 결과를 보여준다. 레인 1 내지 4 는 Pfu로부터의 RNase H를 사용하여 수득한 결과를 나타내고 주형 DNA의 양은 하기와 같다: 레인 1: 10pg; 레인 2: 1pg; 레인 3: 100fg; 레인 4; 음성 대조군. 레인 5 내지 8은 Afu로부터의 RNase H를 사용하여 수득한 결과를 나타내고 주형 DNA의 양은 하기와 같다: 레인 5 10pg; 레인 6: 1 pg; 레인 7: 100 fg; 및 레인 8: 음성 대조군. 레인 M은 100 bp DNA 레더 마커를 나타낸다.
도 38에 나타낸 바와 같이 100fg의 주형 DNA 및 RNase H를 사용하여 관심의 대상이 되는 증폭 단편을 검출할 수 있다는 것이 입증되었다. Afu로부터의 RNase H를 사용하였을 때 더욱 많은 증폭 산물을 수득된 것을 나타났다. 또한, Afu로부터의 RNase H를 사용하였을 때 더욱 안정적인 검출 감수성이 달성되었다는 것이 나타났다.
(3) 프라이머 K-F-1033(68) 및 K-F-1133(68)의 결합물 및 주형으로서 증폭시키고자 하는 부위를 포함하는 플라스미드를 사용하는 증폭을 연구하였다. 우선, 프라이머 F26 (서열번호 163) 및 R1310 (서열번호 164)를 순서대로 합성하여 증폭시키고자 하는 부위를 포함하는 플라스미드를 제조하였다. 프라이머 및 BCG 백신 균주를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이후 생성된 증폭 사물을 pT7-Blue-T 벡터 (Takara Shuzo)내로 삽입하여 플라스미드를 제조하였다. 반응 혼합물의 조성은 4 U의 BcDNA 폴리머라제를 사용한 것을 제외학 상기 (2)와 동일하였다. 결과, 1fg의 주형을 사용하여 검출할 수 있다는 것을 확인하였다..
(4) 관심의 대상이 되는 3개의 증폭 단편을 포함하는 래더 증폭 단편을 형성시키는 프라이머 MTIS2F 및 MTIS2R의 결합물을 사용할 때 얻은 검출 감수성은 관심 의 대상이 되는 3개의 증폭 단편을 얻는 프라이머 K-F-1033(68) 및 K-F-1133(68)의 결합물을 사용할 때 얻은 것과 비교하였다. 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis)을 표적으로서 사용하였다. 프라이머 MTIS2F 및 MTIS2R의 결합물을 사용하는 경우 실시예 33(2)에서와 같이 반응을 수행하거나 프라이머 K-F-1033(68) 및 K-F-1133(68)의 결합물을 사용하는 경우 상기 (2)에서와 같이 반응을 수행하였다. 결과, 동일한 검출 결과가 모든 경우에서 관찰되었다.
실시예 36
주형으로서 게놈 DNA의 변성을 포함하지 않는 본 발며의 증폭 방법을 연구하였다.
(1) 플라스미드 pDON-AI(Takara Shuzo)중 패키징 부위의 뉴클레오티드 서열에 따라 프라이머 pDON-AI-68-1 (서열번호 165) 및 pDON-AI-68-2 (서열번호 166)를 합성하였다.
(2) 10fg 또는 1pg의 pDON-AI를 포함하는 1 ㎕ 용액, 실시예 23에서 제조된 삽입된 pDON-AI를 갖는 NIH/3T3 세포로부터 유래된 게놈 DNA 1ng, 10ng, 또는 100ng를 포함하는 1 ㎕ 용액, 또는 음성 대조군으로서 1 ㎕의 물, 상기 (1)에 기술된 50pmol의 각 프라이머, 0.5mM dNTPs, 32mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 0.01% 소 혈청 알부민(BSA), 1% 디메틸설폭시드(DMSO), 4mM 아세트산마그네슘, Pfu로부터의 18.5U의 RNase H 및 4U의 BcaBEST DNA 폴리머라제 를 포함하는 총 용량 50 ㎕의 반응 혼합물을 제조하였다. 반응 혼합물을 Thermal Cycler에 놓고 1시간동안 64℃에서 인큐베이션시켰다. 반응후, 5 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켜 증폭 산물을 관찰하였다. 결과를 도 39에 나타낸다. 도 39에서 레인은 하기 주형에 대한 결과를 나타낸다: 레인 M: 100bp DNA 레더 마커; 레인 1: 음성 대조군; 레인 2: 삽입된 pDNA-AI DNA을 갖는 1ng의 게놈 DNA; 레인 3: 삽입된 pDNA-AI DNA을 갖는 10ng의 게놈 DNA; 레인 4: 삽입된 pDNA-AI DNA을 갖는 100ng의 게놈; DNA; 레인 5: 10fg의 pDNA-AI DNA; 및 레인 6: 1ng의 pDNA-AI DNA.
도 39에 나타낸 바와 같이, 특정 DNA 단편의 증폭은 pDON-AI 또는 삽입된 pDNA-AI DNA을 갖는 게놈 DNA에 대하여 관찰되었다. 따라서 게놈 DNA를 주형으로서 사용하는 경우에서 반응 전 주형으로서 DNA를 변성시키지 않고 관심의 대상이 되는 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 37
본 발명의 적합도(정확도)를 TaKaRa Ex Taq 폴리머라제 (Takara Shuzo)가 사용된 LA 기술을 사용하는 PCR의 것과 비교하였다. 우선, 주형으로서 플라스미드를 하기와 같이 제조하였다
특히, 서열번호167 내지 170로 나타낸 300bp로 구성된 각 부위를 인간 프로토-온코진, Wnt-5a 유전자 (GenBank 기탁번호 L20861), 리보좀 단백질 S5 유전자 (GenBank 기탁번호 XM_009371), 인간 NADH 유전자 (GenBank 기탁번호 NM_000903) 및 인간 프로토카드헤린 43 유전자 (GenBank 기탁번호 AU077347)으로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 이 경우, 프라이머의 5‘-말단에 제한효소 SfiI에 대한 사이트를 갖는 특정 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 반응 후 증폭 단편을 제한효소 SfiI (Takara Shuzo)로 분해하였다. pUC19 (Takara Shuzo)를 제한효소AflIII (NEB) 및 NdeI (Takara Shuzo)로 분해하고 아가로스 겔 전기영동시켰다. 약 2kbp의 단편을 겔로부터 절단하고 EASYTRAP (Takara Shuzo)을 사용하여 회수하였다. 서열번호 171의 서열을 갖는 DNA 및 그에 상보적인 DNA을 DNA 합성기를 사용하여 합성하였다. 이들 DNA를 열-변성시키고 서로 어닐링하여 더블-스트랜드 DNA를 형성하였다. 이 더블-스트랜드 DNA는 그의 말단에 제한효소 AflIII 및 NdeI에 대한 응집성 말단을 갖는다. 더블-스트랜드 합성 DNA를 DNA Ligation kit ver. 2 (Takara Shuzo)를 사용하여 pUC19를 제한효소로 분해하여 수득한 단편내로 삽입하였다. 생성된 플라스미드를 pIC62로 명명하였다. pIC62는 프라이머 ICAN2 (서열번호 172) 및 ICAN6 (서열번호 173)가 어닐링하는 서여 및 제한 효소 SfiI에 대한 사이트를 갖는다. 플라스미드 pIC62를 제한효소 SfiI로 분해하였다. 제한효소 SfiI로 분해된 상기 언급한 PCR-증폭된 단편을 Ligation kit ver. 2 (Takara Shuzo)를 사용하여 플라스미드와 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109 (Takara Shuzo)을 형질전환시켰다. 생성된 형질전환체를 배양하고, 삽입되는 약 300bp DNA를 갖는 플라스미드를 수득하고 삽입된 DNA의 서열을 동정하였다. 플라스미드를 실시예에서 주형으로서 사용하였다.
(2) ICAN 증폭 산물을 하기와 같이 제조하였다. 간단하게, 주형으로서 10ng의 프라스미드중 하나, 50pmol의 각 키메라성 프라이머 ICAN2(서열번호 172) 및 ICAN6(서열번호 173) 및 0.01% 프로필렌디아민을 포함하는 10 ㎕의 용액을 제조하 였다. 용액을 Thermal Cycler Personal에서 98℃에서 2분동안 변성시키고 1시간동안 60℃에서 인큐베이션시키고 얼음상에 이동시켰다. 이후 최종 농도 20mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 0.01% 소 혈청 알부민(BSA), 1% 디메틸설폭시드(DMSO), 4mM 아세트산마그네슘, 500μM 각 dNTPs, 30U E.Coli. RNase H, 및 5.5U의 BcaBEST DNA 폴리머라제을 가하여 최종 용량을 멸균수로 50 ㎕으로 하였다. 반응 혼합물을 60℃으로 세팅된 Thermal Cycler Personal상에 방치하고 60분동안 상기 온도에서 인큐베이션시켰다. 반응후, 반응 혼합물을 2.0% SeaKem GTG 아가로스 겔(Takara Shuzo)상에서 전기영동시켰다. 전기영동후 관심의 대상이 되는 증폭 산물에 대한 밴드를 아가로스 겔로부터 절단, SUPREC-01 (Takara Shuzo)를 사용하여 회수, 페놀-클로로포름을 처리 및 에탄올 침전하여 회수하였다.
(3) PCR 증폭 산물 TaKaRa Ex Taq DNA 폴리머라제를 사용하여 하기와 같이 제조하였다. 간단하게 주형으로서 10ng의 상기 언급한 플라스미드 및 10 pmol 의 각 DNA 프라이머 ICAN2 (서열번호 174) 및 ICAN6 (서열번호 175)를 사용하여 TaKaRa Ex Taq DNA 폴리머라제(Takara Shuzo)에 첨부된 안내 매뉴얼에 따라 반응 혼합물을 제조하였다. 반응 혼합물을 Thermal Cycler에 놓고 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 30초로 30싸이클로 반응시켰다. 반응 후 반응 혼합물을 상기 (2)에 기술된 바와 같이 아가로스 겔 전기영동시켰다. 관심의 대상이 되는 증폭 산물을 Microcon-100(Takara Shuzo)를 사용하여 회수, 페놀-클로로포름을 처리 및 에탄올 침전하여 회수하였다.
(4) 상기 (2) 및 (3)에서 수득한 증폭 산물을 하기와 같이 서브클로닝하였 다. 안내 매뉴얼에 따라 ICAN 증폭 산물 및 PCR 증폭 산물을 Perfectly Blunt Cloning kit (Takara Shuzo)을 사용하여 벡터 pT7 Blue (Takara Shuzo)내로 삽입하였다. 결찰 혼합물으 사용하여 NovaBlue Singles Competent Cell (Takara Shuzo)을 형질전환시켰다. 각 클론에 대하여 10개의 콜로니를 각 생성된 형질전환첼부터 선별하고 배양하여 약 0.4-kb의 삽입 DNA를 갖는 플라스미드를 수득하였다. 플라스미드에 삽입된 단편을 T7 프로모터 프라이머 (Takara Shuzo) 및 M3 프라이머 (Takara Shuzo)를 사용하여 서열화하였다.
총 약 16,000 염기를 상기 기재된 바와 같이 서열화하여 분석하였다. 결과, 하나의 돌연변이가 본 발명의 방법에 따라 증폭된 단편 및 TaKaRa Ex Taq DNA 폴리머라제를 사용하여 PCR에 의해 증폭된 단편 모두에 대하여 2500 염기에서 발견되었다. 따라서 본 발명의 방법의 적합도(정확도)가 높은 LA-PCR의 것과 동일하다는 것이 입증되었다.
실시예 38
(1) PCR에 의한 ICAN 반응을 위한 주형의 제조
더블-스트랜드 cDNA를 cDNA 합성 키트(Takara Shuzo)를 사용하여 마우스 뇌 (Origene)로부터 유래된 polyA+ RNA로부터 제조하였다. 주형으로서 더블-스트랜드 cDNA 및 서열번호176-189의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머의 결합물을사용하여 PCR 단편을 증폭시켰다. 단편을 TA 클로닝에 의해 pT7 Blue T-벡터 (Takara Shuzo)낼 삽입하여 플라스미드 클론을 수득하였다. 1 ㎕(1ng)의 플라스미드클론, 10pmol의 각 프라이머 MCS-F(서열번호 190) 및 MCS-R(서열번호 191), 1.25U의 Ex Taq(Takara Shuzo), 5 ㎕의 10 x Ex Taq 완충액(Takara Shuzo) 및 0.2mM 각 dNTPs를 포함하는 총 50 ㎕의 반응 혼합물을 Takara PCR Thermal Cycler Personal을 사용하여 하기와 같이 반응시켰다: 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분동안 30싸이클. 생성된 증폭 DNA 단편을 ICAN 반응을 위한 주형으로서 사용하였다.
(2) 주형으로서 PCR 산물을 사용하여 ICAN에 의해 DNA 단편 증폭
ICAN 반응을 아미노알릴 dUPT(Sigma)를 사용하여 수행하여 아미노 그룹을 ICAN 증폭 산물에 삽입시켰다. CAN 증폭 산물에 삽입되는 아미노 그룹의 비를 하기와 같은 ICAN 반응중 아미노알릴 dUPT의 양에 대한 dTTP의 양의 비를 변형하여 연구하였다:10 : 0, 9 : 1, 8 : 2, 7 : 3 및 6 : 4. 반응을 하기와 같이 수행하였다.
우선, 상기 (1)에서 제조된 1 ㎕의 PCR 반응 혼합물, 50pmol의 각 프라이머 F2N3(24)(서열번호 192) 및 MR1N3(24)(서열번호 193) 및 2 ㎕의 0.05% 프로필렌디아민 수용액을 포함하는 총 용량 10 ㎕의 용액을 98℃에서 2분, 이어서 65℃에서 30초동안 Takara PCR Thermal Cycler Persnoal에서 가열학 급속 냉각시켜 프라이머가 주형에 어닐링되도록 하였다. 0.625mM 각 dATP, dCTP 및 dGTP, 0.625mM dTTP + Aminoally dUPT 혼합물, 32mM HEPES-수산화카륨 완충액(pH 7.8), 5mM 아세트산마그네슘, 0.6U의 RNase H(Takara Shuzo) 및 2.75U BcaBEST DNA 폴리머라제를 포함하는 총 용량 40 ㎕의 반응 혼합물을 가열딘 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 1시간동안 65℃에서 Thermal Cycler에서 인큐베이션시켰다.
50 ㎕의 이소프로파놀 및 3 ㎕의 3M 아세트산나트륨 용액(pH 5.2)를 반응 혼 합무 50 ㎕에 가하였다. 반응 혼합물을 20분동안 -80℃에서 냉각시키고 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 200 ㎕의 70% 에탄올 용액을 가하였다. 상층액을 원심분리에 의해 제거하였다. 침전물을 공기 건조시켰다. 생성된 DNA를 물에 재용해시켰다. OD260/280를 측정하여 생성물의 양을 확인하였다.
(3) 아미노알릴 dUPT의 ICAN 증폭 산물로의 삽입 확인
아미노 그룹의 ICAN 산물로의 삽입을 ICAN 산물중 형광-표지 아미노 그룹에서 5-카복시플룽레세인 숙신이미딜 에스테르 (Molecular Probe)를 사용하여 확인하였다. 상기 언급한 DNA 용액을 희석하여 농도를 2μg/50 ㎕으로로 하였다. 10 ㎕의 1M 탄산나틂(pH 9.0)을 가하였다. 이후, N,N-디메티포름아미드중 4 ㎕의 10mM FITC(Nacalai Tesque) 용액을 가하였다. 상업적을 이용가능한 스핀 칼럼을 사용하여 과량의 FITC를 제거한 후, 10 ㎕의 반응 혼합물을 2.0% 아가로스 겔상에 적용하고 전기영동시켰다. 전기영동시킨 후, 형광 염료를 FM-BIO를 사용하여 검출하였다. 또한 ICAN-증폭 단편을 EtBr로 염색하여 검출하였다. 결과 아미노알릴 dUTP를 사용하여 ICAN을 수행하여 아미노 그룹이 ICAN 증폭 산물낼 삽입될 수 있음을 확인하였다. 또한 배합물로 증폭 산물에 대한 형광 표지 및 작용 그룹을 갖는 변형된 뉴클레오티드를 사용하여 검출 감수성이 증가될 수 있음을 확인하였다.
(4) 본 발명의 증폭 방법을 데옥시UTP를 사용하여 연구하였다. 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis)를 표적으로서 선택하였다. 우선, 프라이머 MTIS2F-16 (서열번호 194) 및 MTIS2R-ACC (서열번호 195)를 기탁번호 AL123456하에 GenBank에 등록된 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis) 게놈의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 합성하였다. 프라이머 부위를 포함하는 증폭되는 부위의 길이는 98 bp이다. 주형을 하기와 같이 제조하였다. 간단하게 프라이머 MTIS-PCR-F-2 (서열번호 196) 및 MTIS-PCR-R-2 (서열번호 197)를 사용하여 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis) 게놈을 PCR-증폭하여 수득된 산물을 pT7 Blue T-벡터 (Takara Shuzo)내로 DNA Ligation kit Ver. 2를 사용하여 삽입하였다. 결찰딘 플라스미드를 사용하여 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109를 형질전환시켰다. 생성된 형질전환체를 배양하여 삽입되는 약 400p를 갖는 플라스미드를 수득하였다. 1 ㎕의 플라스미드당 1000개의 카피를 포함하는 용액을 OD260을 측정하여 확인된 농도에 기초하여 제조하였다.
최종 농도 32mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 0.01% 소 혈청 알부민(BSA), 1% 디메틸설폭시드(DMSO), 4mM 아세트산마그네슘, 500μM 각 dATP, dCTP 및 dGTP, dTTP/dUTP 혼합물(500/0, 400/100, 300/200, 200/300, 100/400 또는 0/500μM), 50pmol 각 프라이머 MTIS 2F-16 및 MTIS 2R-AAC, Afu로부터의 8.75U의 RNase H, 8U의 BcaBEST DNA 폴리머라제 및 1 ㎕의 주형(1000개의 카피)를 혼합하여 최종 용량을 멸균수로 50 ㎕으로 하였다. 반응 혼합물을 60℃으로 세팅된 Thermal Cycler Personal상에 방치하고 60분동안 인큐베이션시켰다. 반응후, 3 ㎕의 각 반응 혼합물을 3% 아가로스 겔 상에서 전기영동시켰다.
결과 관심의 대상이 되는 증폭 산물을 각 dTTP/dUTP 비에 대하여 관찰하였 다. 이 결과에 기초하여 변형된 뉴클레오티드를 기질로서 본 발명의 방법에서 사용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 39
본 발명의 방법을 1단계 증폭 방법으로 적용하는 것을 연구하였다. HCV를 표적으로서 선택하였다.
(1) 트랜스크립트 RNA 제조
주형으로서 트랜스크립트 RNA를 제조하였다. 시약에 첨부된 안내서에 따라 TRIzol 시약(Life Technologies)를 사용하여 사전 동의서에 동의한 C형 간염 바이러스를 갖는 환자로부터 유래된 300 ㎕의 혈청으로부터 제조하고 연속하여 20 ㎕의 주사 용수(Otsuka Pharmaceutical)로 최종 희석하였다. RT-PCR을 상기 RNA 주형을 주형으로서 사용하여 수행하였다. 1단계 RNA PCR 키트(Takara Shuzo)에 첨부된 매뉴얼에 따라 2 ㎕의 RNA 샘플 및 20pmol의 각 프라이머 SP6-HCV(서열번호 198) 및 T7-HCV-R(서열번호 199)를 사용하여 50 ㎕의 반응 혼합물을 제조하였다. 반응 혼합물을 Thermal Cycler Personal상에 방치하고 하기와 같이 반응시켰다: 50ㅃㅇ에서 15분; 94℃에서 2분; 및 94℃에서 30초; 60℃에서 30초 및 72℃에서 30초에서 40 싸이클. 반응 후, 반응 혼합물을 2% SeaPlaque GTG 아가로스겔상에서 전기영동시켰다. 관심의 대상이 되는 350bp 증폭 산물을 겔로부터 절단하였다. DNA를 키트에 첨부된 안내서에 따라 EASYTRAP Ver. 2에 따라 회수하였다. 트랜스크립트 RNA를 주형으로서 회수된 DNA 및 Competive RNA 전시 키트(Takara Shuzo)를 사용하여 키트에 첨부된 안내서에 따라 합성하였다. 트랜스크립트 RNA를 주형으로 사용하여 1단계 RT-ICAN 연구하였다.
(2) 1단계 RT-ICAN 연구
상기 (2)에서 제조된 트랜스크립트 RNA의 농도를 OD260 값에 기초하여 측정하고 1 ㎕당 104, 105, 106 또는 107을 포함하는 희석액을 제조하였다. 최종 농도 32mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 0.01% 소 혈청 알부민(BSA), 1% 디메틸설폭시드(DMSO), 4mM 아세트산마그네슘, 500μM 각 dNTPs, 50pmol 각 프라이머 HCV-A S(서열번호 200) 및 HCV-A A(서열번호 201), Pfu로부터의 30U RNase H, 8U의 BcaBEST DNA 폴리머라제, 20U RNase 저해제, 0, 1, 2.5, 3 또는 5U의 AMV RTase XL(Takara Shuzo) 및 다양한 카피수의 트랜스크립트 RNA를 포함하는 희석액중 하나 1 ㎕을 포함하는 50 ㎕의 반응 혼합물을 제조하였다. 반응 혼합물을 60℃으로 세팅된 Thermal Cycler Personal상에 방치하고 60분동안 인큐베이션시켰다. 반응후, 2 ㎕의 각 반응 혼합물을 3% 아가로스 겔 상에서 전기영동시켰다.
결과 AMV RTase XL를 첨가하지 않은 경우 각 주형의 희석액의 사용으로 관심의 대상이 되는 증폭산물은 관찰되지 않았다. 한편, 107 카피(1U의 AMV RTase XL 첨가), 106 카피(2.5U의 AMV RTase XL 첨가), 106 카피(3U의 AMV RTase XL 첨가) 또는 106(5U의 AMV RTase XL 첨가)를 사용하여 관심의 대상이 되는 증폭 산물을 관찰하였다. 반응을 57℃에서 수행한 경우 105 카피를 포함하는 희석액 및 2.5U의 AMV RTase XL의 사용으로 관심의 대상이 되는 증폭산물으 관찰하였다. 또한 1U의 BcaBEST DNA 폴리머라제 및 10U Pfu로부터의 RNase H를 사용하였을 때 AMV RTase를 첨가한 경우에도 106 카피를 포함하는 희석액의 사용응로 관심의 대상이 되는 증폭 산물을 관찰하였다.
본 발명은 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 DNA 합성 반응에 의해 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열에서 특정 증폭에 적절한 부위를 증폭시키는 것을 포함하는 표적 핵산을 증폭시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 표적 핵산을 증폭시켜 수득한 표적 핵산으로부터 증폭된 단편을 검출하는 것을 포함하는 표적 핵산 검출 방법을 제공한다. 또한 본 발명의 증폭 방법은 핵산을 증폭시키는 또다른 방법 또는 핵산을 복제하는 방법과 결합하여 핵산을 생산하는 효과적인 방법에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 고도의 감수성으로 미생물 특히, 바이러스, 박테리움, 진균, 효모 등의 특정 검출 및 측량을 위한 표적 핵산 및 상기 방법을 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머을 검출하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 소량의 핵산을 검출하고 증폭시키는 자동화되고 고도로 통합된 시스템을 제공한다.
서열 목록
서열번호 1: 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터 RNaseHII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 BsuII-3.
서열번호 2: 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터 RNaseHII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 BsuII-6 .
서열번호 3: 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터 RNaseHII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 RNII-S1.
서열번호 4: 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터 RNaseHII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 RNII-S2.
서열번호 5: 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터 RNaseHII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 RNII-S5 .
서열번호 6: 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터 RNaseHII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 RNII-S6.
서열번호 7: 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터 RNaseHII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 RNII-Nde.
서열번호 8: 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터 RNaseHII 유전자중 ORF의 뉴클레오티드 서열.
서열번호 9: 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터 RNaseHII 아미노산 서열.
서열번호 10: 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터 RNaseHIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 BsuIII-1.
서열번호 11: 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터 RNaseHIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 BsuIII-3.
서열번호 12: 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터 RNaseHIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 BsuIII-6.
서열번호 13: 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터 RNaseHIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 BsuIII-8.
서열번호 14: 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터 RNaseHIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 RNIII-S3.
서열번호 15: 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터 RNaseHIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 BcaRNIII-3.
서열번호 16: 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터 RNaseHIII중 ORF의 뉴클레오티드 서열.
서열번호 17: 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터 RNaseHIII 아미노산 서열.
서열번호 18: 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터 RNaseHIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 BcaRNIIINde.
서열번호 19: PH1650 및 일부의 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) 게놈 서열 사이에 보존되는 뉴클레오티드 서열.
서열번호 20: 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터 RNaseHII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 1650Nde .
서열번호 21: 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터 RNaseHII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 1650Bam.
서열번호 22: 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터 RNaseHII중 ORF의 뉴클레오티드 서열.
서열번호 23: 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터 RNaseHII의 아미노산 서열.
서열번호 24: 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima)로부터 RNaseHII 활성을 갖는 폴립펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하는 PCR 프라이머 915-F1.
서열번호 25: 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima)로부터 RNaseHII 활성을 갖는 폴립펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하는 PCR 프라이머 915-F2.
서열번호 26: 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima)로부터 RNaseHII 활성을 갖는 폴립펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하는 PCR 프라이머 915-R1.
서열번호 27: 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima)로부터 RNaseHII 활성을 갖는 폴립펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하는 PCR 프라이머 915-R2.
서열번호 28: 플라스미드 pUC19의 일부를 증폭시키기 위한 pUC19 상부 150으로 명명되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 24 내지 25는 리보뉴클레오티드이고, 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 29: 플라스미드 pUC19의 일부를 증폭시키기 위한 MR1N3으로 명명되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 28 내지 30은 리보뉴클레오티드이고, 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 30: M13M4로 명명된 작제된 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 31: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 1-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 16내지 18은 리보뉴클레오티드이고, 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 32: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 1-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 15내지 17은 리보뉴클레오티드이고, 다른 뉴클레오 티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 33: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 2-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 16내지 18은 리보뉴클레오티드이고, 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 34: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 2-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 16내지 18은 리보뉴클레오티드이고, 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 35: 긴 DNA 단편을 증폭시키기 위한 MCR-F으로 명명되는 작제된 올리고 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 36: 긴 DNA 단편을 증폭시키기 위한 MCR-R으로 명명된 작제된 올리고 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 37: 긴 DNA 단편을 증폭시키기 위한 MF2N3(24)로 명명된 작제된 올리고 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 22내지 24는 리보뉴클레오티드이고, 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 38: 긴 DNA 단편을 증폭시키기 위한 MR1N3(24)로 명명된 작제된 올리고 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 22내지 24는 리보뉴클레오티드이고, 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 39: 람다 DNA의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티 드 프라이머. "뉴클레오티드 18내지 20은 리보뉴클레오티드이고, 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".
서열번호 40: 람다 DNA의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18내지 20은 리보뉴클레오티드이고, 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".
서열번호 41: 람다 DNA의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 42: 람다 DNA의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 43: 플라보박테리움(Flavobacterium) 종 DNA의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18내지 20은 리보뉴클레오티드이고, 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".
서열번호 44: 플라보박테리움(Flavobacterium) 종 DNA의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18내지 20은 리보뉴클레오티드이고, 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".
서열번호 45: 플라보박테리움(Flavobacterium) 종 DNA의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 46: 플라보박테리움(Flavobacterium) 종 DNA의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 47: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 2-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고, 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 48: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 2-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고, 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 49: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 2-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 50: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 2-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 51: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 2-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고, 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 52: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 2-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고, 다른 뉴클레오 티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 53: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 2-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고, 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 54: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 2-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 55: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 2-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 56: 람다 DNA의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고, 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".
서열번호 57: 비로이드 CSVd의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 58: 비로이드 CSVd의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 59: 비로이드 CSVd의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 16 내지 18은 리보뉴클레오티드이고, 다른 뉴클레 오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".
서열번호 60: 비로이드 CSVd의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고, 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".
서열번호 61: 플라보박테리움(Flavobacterium) 종 DNA의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고, 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 62: 플라보박테리움(Flavobacterium) 종 DNA의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고, 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 63: 플라보박테리움(Flavobacterium) 종 DNA의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고, 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 64: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 2-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 21은-뉴클레오티드 18은 이노신이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 65: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 2-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 21은-뉴클레오티드 17은 이노신이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 66: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 2-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 21은-뉴클레오티드 16은 이노신이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 67: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 2-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은-뉴클레오티드 17은 이노신이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 68: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 2-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은-뉴클레오티드 16은 이노신이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 69: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 2-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은-뉴클레오티드 15은 이노신이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 70: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 2-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 9 내지 11 및 19 내지 21은 뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 71: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 2-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 8 내지 10 및 18 내지 20은 뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 72: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 2-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 73: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 2-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 74: 마우스로부터 iNOS-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 75: 마우스로부터 iNOS-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 17 내지 19는 뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 76: 마우스로부터 iNOS-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 77: 마우스로부터 iNOS-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 78: GMO-PCR-F 20mer로 명명되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 79: GMO-PCR-R 20mer로 명명되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 80: GMO-S1 20mer로 명명되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 20은 뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 81: GMO-S2 20mer로 명명되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 20은 뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 82: GMO-A1 20mer로 명명되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 20은 뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 83: GMO-A2 20 mer로 명명되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 20은 뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 84: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 2-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오 티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 (알파-티오)리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 85: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 2-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 (알파-티오)리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 86: 마우스로부터 INOS-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 "뉴클레오티드 20 내지 22는 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 87: 마우스로부터 INOS-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 "뉴클레오티드 20 내지 22는 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 88: 마우스로부터 INOS-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 89: 마우스로부터 INOS-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 90: 람다 DNA의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머."뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 91: 람다 DNA의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴 클레오티드 프라이머."뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 92: 마우스로부터 INOS-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 "뉴클레오티드 21 내지 23는 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 93: 마우스로부터 INOS-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 "뉴클레오티드 20 내지 22는 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 94: pDON-AI DNA 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 "뉴클레오티드 17 내지 19는 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 95: pDON-AI DNA 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 96: HPV DNA 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 97: HPV DNA 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 98: HPV DNA 일부를 증폭시키는 DNA 단편을 검출하기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브.
서열번호 99: HCV 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 100: HCV 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 101: HCV 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 102: HCV 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 16 내지 18은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 103: HCV DNA 일부를 증폭시키는 DNA 단편을 검출하기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브.
서열번호 104: 아데노바이러스 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 105: 아데노바이러스 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 106: 아데노바이러스 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 107: 아데노바이러스 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 108: 아데노바이러스 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 109: 비로이드 CSVd 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 110: 비로이드 CSVd 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 111: pDON-AI DNA 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 112: pDON-AI DNA 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 113: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 1-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 114: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 1-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 115: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 1-코딩 서열의 일부를 증폭시키기는 DNA 단편을 검출하기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프로브.
서열번호 116: 클로스트리듐 보톨리늄(Clostridium botulinum)로부터 보톨리늄(Clostridium botulinum) 독소 A 코딩 서열 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 117: 클로스트리듐 보톨리늄(Clostridium botulinum)로부터 보톨리늄(Clostridium botulinum) 독소 A 코딩 서열 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 "뉴클레오티드 21내지 23은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 120: 비로이드 CSVd 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 121: 비로이드 CSVd 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 122: 비로이드 CSVd 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리 고뉴클레오티드 프라이머 "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 123: 비로이드 CSVd 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 124: 비로이드 CSVd 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 125: 비로이드 CSVd 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 126: c-ki-ras 온코진 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 127: c-ki-ras 온코진 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 128: c-ki-ras 온코진 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 129: c-ki-ras 온코진 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 130: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 1-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 131: 출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O-157로부터 베로독소 1-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 132: 마우스로부터 INOS-코딩 서열 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 133: 마우스로부터 INOS-코딩 서열 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 134: pUC19 상부 150로 명명된 플라스미드 pUC19 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 135: pUC19 하부 NN로 명명된 플라스미드 pUC19 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 136: SEA-1로 명명된 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 일부를 증폭시기키 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머."뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 137: SEA-2로 명명된 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 일부를 증폭시기키 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머."뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 138: HCV-F3로 명명된 HCV 일부를 증폭시기키 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머."뉴클레오티드 17 내지 19은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 139: HCV-R1로 명명된 HCV 일부를 증폭시기키 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머."뉴클레오티드 16 내지 18은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호 140: MF2로 명명된 pUC19 플라스미드 DNA일부를 증폭시기키 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 141: MR1로 명명된 pUC19 플라스미드 DNA일부를 증폭시기키 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 142: 아데노바이러스 일부를 증폭시기키 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 143: 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima)으로부터 RNaseHII 유전자중 ORF의 뉴클레오티드 서열.
서열번호 144: 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima)로부터 RNaseHII의 아미노산 서열
서열번호 145: 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii)로부터 PH1650 의 뉴클레오티드 서열.
서열번호 146: 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii) PCR 프라이머 PhoNde.
서열번호 147: 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii)로부터 RNaseHII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 PhoBam
서열번호 148: 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii)으로부터 RNaseHII 유전자중 ORF의 뉴클레오티드 서열.
서열번호 149: 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii)로부터 RNaseHII의 아미노산 서열.
서열번호 150: 아르키오글루부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)로부터 AF0621의 뉴클레오티드 서열.
서열번호 151: 아르키오글루부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)로부터 RNaseHII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머
서열번호 152: 아르키오글루부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)로부터 RNaseHII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 AfuBam
서열번호 153: 아르키오글루부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)으로부터 RNaseHII 유전자중 ORF의 뉴클레오티드 서열..
서열번호 154: 아르키오글루부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)로부터 RNase HII의 아미노산 서열.
서열번호 155: MTIS2F로 명명되는 마이코박테리움 튜버큐로시스 (Mycobacterium tuberculosis) DNA 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머."뉴클레오티드 16 내지 18은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".
서열번호 156: MTIS2R로 명명되는 마이코박테리움 튜버큐로시스 (Mycobacterium tuberculosis) DNA 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머."뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".
서열번호 157: CT2F로 명명되는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia tracomatis) 잠적플라스미드 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머."뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".
서열번호 158: CT2R 로 명명되는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia tracomatis) 잠적플라스미드 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머."뉴클레오티드 16 내지 18은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".
서열번호 159: K-F-1033(60)로 명명되는 마이코박테리움 튜버큐로시스 (Mycobacterium tuberculosis) DNA 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리 고뉴클레오티드 프라이머."뉴클레오티드 17 내지 19는 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".
서열번호 160: K-R-1133(62)로 명명되는 마이코박테리움 튜버큐로시스 (Mycobacterium tuberculosis) DNA 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머."뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".
서열번호 161: K-F-1033(68)로 명명되는 마이코박테리움 튜버큐로시스 (Mycobacterium tuberculosis) DNA 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머."뉴클레오티드 20 내지 22는 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".
서열번호 162: K-R-1133(68)로 명명되는 마이코박테리움 튜버큐로시스 (Mycobacterium tuberculosis) DNA 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머."뉴클레오티드 20 내지 22은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".
서열번호 163: F26로 명명되는 마이코박테리움 튜버큐로시스 (Mycobacterium tuberculosis) DNA 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 164: R1310로 명명되는 마이코박테리움 튜버큐로시스 (Mycobacterium tuberculosis) DNA 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 165: pDON-AI-68-1로 명명되는 pDON-AI 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머."뉴클레오티드 20 내지 22는 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".
서열번호 166: pDON-AI-68-2로 명명되는 pDON-AI 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머."뉴클레오티드 21 내지 23는 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".
서열번호 167: 호모 사피엔스(Homo sapiens) 프로토-온코진 Wn t-5a의 뉴클레오티드 서열
서열번호 168: 호모 사피엔스(Homo sapiens) 리보좀 단백질 S5의 뉴클레오티드 서열
서열번호 169: 호모 사피엔스(Homo sapiens) 디아포라제의 뉴클레오티드 서열
서열번호 170: 인간 프로토카드헤린의 뉴클레오티드 서열
서열번호 171: pIC62을 작제하기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드.
서열번호 172: ICAN2로 명명된 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 ."뉴클레오티드 19 내지 20는 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".
서열번호 173: ICAN6로 명명된 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머."뉴클레오티드 19 내지 20는 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".
서열번호 174: ICAN2 DNA로 명명된 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 175: ICAN6 DNA로 명명된 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 176: 마우스로부터 리보좀 단백질 S18-코딩 서열 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 177: 마우스로부터 리보좀 단백질 S18-코딩 서열 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 178: 마우스로부터 트랜스페린 수용체 (TFR)-코딩-서열 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 179: 마우스로부터 트랜스페린 수용체 (TFR)-코딩-서열 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 180: 마우스로부터 간질세포 유래 인자 4 (Sdf4)-코딩-서열 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 181: 마우스로부터 간질세포 유래 인자 4 (Sdf4)-코딩-서열 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 182: 마우스로부터 세포질성 베타-액틴 코딩-서열 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 183: 마우스로부터 세포질성 베타-액틴 코딩-서열 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 184: 마우스로부터 오르니틴 데카복실라제-코딩-서열 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 185: 마우스로부터 오르니틴 데카복실라제-코딩-서열 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 186: 마우스로부터 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 (HPRT)-코딩-서열 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 187: 마우스로부터 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 (HPRT)-코딩-서열 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 188: 마우스로부터 티로신 3-모노옥시게나제 코딩-서열 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 189: 마우스로부터 티로신 3-모노옥시게나제 코딩-서열 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 190: MCS-F로 명명된 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 191: MCS-R로 명명된 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 192: MF2N3(24)로 명명된 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 22 내지 24는 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".
서열번호 193: MR1N3(24)로 명명된 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 22 내지 24는 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".
서열번호 194: MTIS2F-16로 명명되는 마이코박테리움 튜버큐로시스 (Mycobacterium tuberculosis) DNA 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머."뉴클레오티드 14 내지 16은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".
서열번호 195: MTIS2R-ACC로 명명되는 마이코박테리움 튜버큐로시스 (Mycobacterium tuberculosis) DNA 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머."뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".
서열번호 196: MTIS-PCR-F-2로 명명되는 마이코박테리움 튜버큐로시스 (Mycobacterium tuberculosis) DNA 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 197: MTIS-PCR-R-2로 명명되는 마이코박테리움 튜버큐로시스 (Mycobacterium tuberculosis) DNA 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 198: SP6-HCV-F로 명명되는 HCV 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 199: SP6-HCV-R로 명명되는 HCV 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 200: HCV-A S로 명명되는 HCV 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머 "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".
서열번호 201: HCV-A A 로 명명되는 HCV 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머 "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".
<110> Takara Shuzo Co., Ltd. <120> A method for amplification of nucleic acids <130> 662757 <150> JP 2000-251981 <151> 2000-08-23 <150> JP 2000-284419 <151> 2000-09-19 <150> JP 2000-288750 <151> 2000-09-22 <150> JP 2001-104191 <151> 2001-04-03 <160> 201 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer BsuII-3 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax <400> 1 gtcgccagcg cagtnathyt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer BsuII-6 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax <400> 2 cggtccctcg tcacyttngc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer RNII-S1 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax <400> 3 cgcgcttttc cggcgtcagc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer RNII-S2 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax <400> 4 acggcgcacg cttcaatttg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer RNII-S5 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax <400> 5 acgcctattt gccggggctt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer RNII-S6 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax <400> 6 atgaccgacg cagcggcgat 20 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer RNII-Nde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax <400> 7 tagaagaggg agaggcatat gaagcggtat acggtgaaa 39 <210> 8 <211> 780 <212> DNA <213> Bucillus caldotenax <400> 8 atgaagcggt atacggtgaa agacattgaa gcgctgcttc cgaagcttgg cgcggacgac 60 ccgcgctggg agatgctgcg gcaggatgag cgaaaaagcg tgcaggcgct tcttgcccgt 120 tttgaaaggc agaaagcgcg ccggcacgcc atcgagcagc 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Arg Arg His Ala Ile Glu Gln Arg Trp Glu Glu Leu Met Arg 50 55 60 Tyr Glu Arg Glu Leu Tyr Ala Ala Gly Val Arg Arg Ile Ala Gly 65 70 75 Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Leu Ala Gly Pro Val Val Ala 80 85 90 Ala Ala Val Ile Leu Pro Lys Asp Ala Tyr Leu Pro Gly Leu Asp 95 100 105 Asp Ser Lys Arg Leu Thr Pro Glu Lys Arg Glu Ala Leu Phe Ala 110 115 120 Gln Ile Glu Ala Cys Ala Val Ala Ile Gly Ile Gly Ile Val Ser 125 130 135 Ala Ala Glu Ile Asp Glu Arg Asn Ile Tyr Glu Ala Thr Arg Gln 140 145 150 Ala Met Ala Lys Ala Val Asn Ala Leu Ser Pro Pro Pro Glu His 155 160 165 Leu Leu Val Asp Ala Met Ala Val Pro Cys Pro Leu Pro Gln Gln 170 175 180 Arg Leu Ile Lys Gly Asp Ala Asn Ser Ala Ser Ile Ala Ala Ala 185 190 195 Ser Val Ile Ala Lys Val Thr Arg Asp Arg Trp Met Lys Glu Leu 200 205 210 Asp Arg Arg Tyr Pro Gln Tyr Gly Phe Ala Arg His Met Gly Tyr 215 220 225 Gly Thr Pro Glu His Phe Glu Ala Ile Arg Arg Tyr Gly Val Thr 230 235 240 Pro Glu His Arg Arg Ser Phe Ala Pro Val Arg Glu Val Leu Lys 245 250 255 Ala Ser Glu Gln Leu 260 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer BsuIII-1 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax <400> 10 ggtaaggtct tgttycargg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer BsuIII-3 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax <400> 11 ggaaccggag attayttygg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer BsuIII-6 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax <400> 12 atgattgaag cagcngcnac 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer BsuIII-8 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax <400> 13 gtattggcga aatgnarytt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer RNIII-S3 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax <400> 14 cccgatcgtc gtcgccgccg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer BcaRNIII-3 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax <400> 15 gatacgtgga cactttccgc 20 <210> 16 <211> 915 <212> DNA <213> Bucillus caldotenax <400> 16 gtgattcaag ccgaccaaca gctgcttgac gccttgcgcg cccactacca agacgcctta 60 tccgaccggc ttccggctgg agcgttgttt gccgtcaagc gcccggatgt cgtcatcacc 120 gcctaccgct caggcaaagt gctgtttcaa gggaaagcgg cggagcaaga agcagcgaaa 180 tggatatcag gggcgagcgc ctcaaacgaa acagctgacc accagccgtc cgctttggca 240 gctcatcaac tcgggtctct ttccgccatc ggttccgatg aagtcggcac cggcgattat 300 ttcggcccga tcgtcgtcgc cgccgcctac gtggatcggc cgcatatcgc caaaatcgcg 360 gcgcttggcg tgaaagattc gaaacaattg aacgatgagg caatcaaacg gatcgccccc 420 gccatcatgg aaaccgtgcc gcatgcggtc accgtgttgg acaatgccga atacaaccgc 480 tggcagcgaa gcggcatgcc gcagacgaaa atgaaagcgc tccttcacaa ccggacgctc 540 gtgaaactcg ttgacgccat cgcgcccgcc gaaccagaag caatcatcat cgacgaattt 600 ttaaaacggg attcgtattt ccgttacctt tccgatgaag atcgcattat ccgcgagcgg 660 gtgcactgcc ttcccaaggc ggaaagtgtc cacgtatcag tcgccgccgc ctcgatcatc 720 gcccgctatg tgtttttaga ggagatggag caattatccc gcgccgtcgg cctcctgctt 780 ccaaaaggcg ccggcgccat tgtcgatgaa gccgcggcca acatcatccg cgcgcggggg 840 gcggaagcgc ttgagacatg cgccaagctt catttcgcca atacaaaaaa ggcgctggac 900 atcgccaaac gccgg 915 <210> 17 <211> 305 <212> PRT <213> Bucillus caldotenax <400> 17 Met Ile Gln Ala Asp Gln Gln Leu Leu Asp Ala Leu Arg Ala His 1 5 10 15 Tyr Gln Asp Ala Leu Ser Asp Arg Leu Pro Ala Gly Ala Leu Phe 20 25 30 Ala Val Lys Arg Pro Asp Val Val Ile Thr Ala Tyr Arg Ser Gly 35 40 45 Lys Val Leu Phe Gln Gly Lys Ala Ala Glu Gln Glu Ala Ala Lys 50 55 60 Trp Ile Ser Gly Ala Ser Ala Ser Asn Glu Thr Ala Asp His Gln 65 70 75 Pro Ser Ala Leu Ala Ala His Gln Leu Gly Ser Leu Ser Ala Ile 80 85 90 Gly Ser Asp Glu Val Gly Thr Gly Asp Tyr Phe Gly Pro Ile Val 95 100 105 Val Ala Ala Ala Tyr Val Asp Arg Pro His Ile Ala Lys Ile Ala 110 115 120 Ala Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Asn Asp Glu Ala Ile 125 130 135 Lys Arg Ile Ala Pro Ala Ile Met Glu Thr Val Pro His Ala Val 140 145 150 Thr Val Leu Asp Asn Ala Glu Tyr Asn Arg Trp Gln Arg Ser Gly 155 160 165 Met Pro Gln Thr Lys Met Lys Ala Leu Leu His Asn Arg Thr Leu 170 175 180 Val Lys Leu Val Asp Ala Ile Ala Pro Ala Glu Pro Glu Ala Ile 185 190 195 Ile Ile Asp Glu Phe Leu Lys Arg Asp Ser Tyr Phe Arg Tyr Leu 200 205 210 Ser Asp Glu Asp Arg Ile Ile Arg Glu Arg Val His Cys Leu Pro 215 220 225 Lys Ala Glu Ser Val His Val Ser Val Ala Ala Ala Ser Ile Ile 230 235 240 Ala Arg Tyr Val Phe Leu Glu Glu Met Glu Gln Leu Ser Arg Ala 245 250 255 Val Gly Leu Leu Leu Pro Lys Gly Ala Gly Ala Ile Val Asp Glu 260 265 270 Ala Ala Ala Asn Ile Ile Arg Ala Arg Gly Ala Glu Ala Leu Glu 275 280 285 Thr Cys Ala Lys Leu His Phe Ala Asn Thr Lys Lys Ala Leu Asp 290 295 300 Ile Ala Lys Arg Arg 305 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer BcaRNIIINde for amplifying a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax <400> 18 cgaacgttgt caaaccatat gattcaagcc gaccaacag 39 <210> 19 <211> 663 <212> DNA <213> Pyrococcus horikoshii <400> 19 atgaaggttg ctggagttga tgaagcgggg agggggccgg taattggccc gttagtaatt 60 ggagtagccg ttatagatga gaaaaatatt gagaggttac gtgacattgg ggttaaagac 120 tccaaacaat taactcctgg gcaacgtgaa aaactattta gcaaattaat agatatccta 180 gacgattatt atgttcttct cgttaccccc aaggaaatag atgagaggca tcattctatg 240 aatgaactag aagctgagaa attcgttgta gccttgaatt ctttaaggat caagccgcag 300 aagatatatg tggactctgc cgatgtagat cctaagaggt ttgctagtct aataaaggct 360 gggttgaaat atgaagccac ggttatcgcc gagcataaag ccgatgcaaa gtatgagata 420 gtatcggcag catcaataat tgcaaaggtc actagggata gagagataga gaagctaaag 480 caaaagtatg gggaatttgg ttctggctat ccgagtgatc cgagaactaa ggagtggctt 540 gaagaatatt acaaacaata tggtgacttt cctccaatag ttaggagaac ttgggaaacc 600 gctaggaaga tagaggaaag gtttagaaaa aatcagctaa cgcttgataa attccttaag 660 tga 663 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 1650Nde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus <400> 20 caggaggaga gacatatgaa aataggggga att 33 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 1650Bam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus <400> 21 gaaggttgtg gatccacttt ctaaggtttc tta 33 <210> 22 <211> 672 <212> DNA <213> Pyrococcus furiosus <400> 22 ATGAAAATAG GGGGAATTGA CGAAGCAGGA AGAGGACCAG CGATAGGGCC ATTAGTAGTA 60 GCTACTGTCG TCGTTGATGA GAAAAACATT GAGAAGCTCA GAAACATTGG AGTAAAAGAC 120 TCCAAACAAC TAACACCCCA TGAAAGGAAG AATTTATTTT CCCAGATAAC CTCAATAGCG 180 GATGATTACA AAATAGTGAT AGTATCCCCA GAAGAAATCG ACAATAGATC AGGAACAATG 240 AACGAGTTAG AGGTAGAGAA GTTTGCTCTC GCCTTAAATT CGCTTCAGAT AAAACCAGCT 300 CTTATATACG CTGATGCAGC GGATGTAGAT GCCAATAGAT TTGCAAGCTT GATAGAGAGA 360 AGACTCAATT ATAAGGCGAA GATTATTGCC GAACACAAGG CCGATGCAAA GTATCCAGTA 420 GTTTCAGCAG CTTCAATACT TGCAAAGGTT GTTAGGGATG AGGAAATTGA AAAATTAAAA 480 AAGCAATATG GAGACTTTGG CTCTGGGTAT CCAAGTGATC CAAAAACCAA GAAATGGCTT 540 GAAGAGTACT ACAAAAAACA CAACTCTTTC CCTCCAATAG TCAGACGAAC CTGGGAAACT 600 GTAAGAAAAA TAGAGGAAAG CATTAAAGCC AAAAAATCCC AGCTAACGCT TGATAAATTC 660 TTTAAGAAAC CT 672 <210> 23 <211> 224 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 23 Met Lys Ile Gly Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Ala Ile 1 5 10 15 Gly Pro Leu Val Val Ala Thr Val Val Val Asp Glu Lys Asn Ile 20 25 30 Glu Lys Leu Arg Asn Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr 35 40 45 Pro His Glu Arg Lys Asn Leu Phe Ser Gln Ile Thr Ser Ile Ala 50 55 60 Asp Asp Tyr Lys Ile Val Ile Val Ser Pro Glu Glu Ile Asp Asn 65 70 75 Arg Ser Gly Thr Met Asn Glu Leu Glu Val Glu Lys Phe Ala Leu 80 85 90 Ala Leu Asn Ser Leu Gln Ile Lys Pro Ala Leu Ile Tyr Ala Asp 95 100 105 Ala Ala Asp Val Asp Ala Asn Arg Phe Ala Ser Leu Ile Glu Arg 110 115 120 Arg Leu Asn Tyr Lys Ala Lys Ile Ile Ala Glu His Lys Ala Asp 125 130 135 Ala Lys Tyr Pro Val Val Ser Ala Ala Ser Ile Leu Ala Lys Val 140 145 150 Val Arg Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Lys Lys Gln Tyr Gly Asp 155 160 165 Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Lys Thr Lys Lys Trp Leu 170 175 180 Glu Glu Tyr Tyr Lys Lys His Asn Ser Phe Pro Pro Ile Val Arg 185 190 195 Arg Thr Trp Glu Thr Val Arg Lys Ile Glu Glu Ser Ile Lys Ala 200 205 210 Lys Lys Ser Gln Leu Thr Leu Asp Lys Phe Phe Lys Lys Pro 215 220 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 915-F1 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermotoga maritima <400> 24 aaaaagcttg ggaatagatg agctttac 28 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 915-F2 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermotoga maritima <400> 25 aaaccatggg aatagatgag ctttac 26 <210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 915-R1 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermotoga maritima <400> 26 aaatctagat cctcaacttt gtcgatgtg 29 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 915-R2 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermotoga maritima <400> 27 aatctagatt aaaaaagagg gagattatgg 30 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as pUC19 upper 150 to amplify a portion of plasmid pUC19. “nucleotides 24 to 25 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 28 ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtaug 25 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as MR1N3 to amplify a portion of plasmid pUC19. “nucleotides 28 to 30 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 29 tttacacttt atgcttccgg ctcgtatguu 30 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as M13M4 <400> 30 gttttcccag tcacgac 17 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 1-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157. “nucleotides 21 to 23 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 31 tgtcattcgc tctgcaatag gua 23 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 1-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157. “nucleotides 21 to 23 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 32 caccagacaa tgtaaccgct guu 23 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157. “nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 33 tactgggttt ttcttcggua 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157. “nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 34 atagacatca agccctcgua 20 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as MCR-F to amplify a long DNA fragment <400> 35 ccattcaggc tgcgcaactg tt 22 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as MCR-R to amplify a long DNA fragment <400> 36 tggcacgaca ggtttcccga ct 22 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as MF2N3(24) to amplify a long DNA fragment. “nucleotides 22 to 24 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 37 gctgcaaggc gattaagttg ggua 24 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as MR1N3(24) to amplify a long DNA fragment. “nucleotides 22 to 24 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 38 ctttatgctt ccggctcgta tguu 24 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of lambda DNA. “nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 39 cctttctctg tttttgtccg 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of lambda DNA. “nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 40 aagcacctca ttaccctugc 20 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of lambda DNA <400> 41 gggcggcgac ctcgcgggtt ttcg 24 <210> 42 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of lambda DNA <400> 42 gctgcttatg ctctataaag tagg 24 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of Flavobacterium species DNA. “nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 43 aggaatcttt atttaccaug 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of Flavobacterium species DNA. “nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 44 tggtgtttaa acttattgcg 20 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of Flavobacterium species DNA. <400> 45 ccatcagcta taaacacaaa cagc 24 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of Flavobacterium species DNA. <400> 46 tgttttgacc aaacatagta atgc 24 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157. “nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 47 tcgttaaata gtatacggac a 21 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157. “nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 48 tgctcaataa tcagacgaag 20 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157. <400> 49 aaatggggta ctgtgcctgt tact 24 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157. <400> 50 ctctgtatct gcctgaagcg taag 24 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157. “nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 51 tacctgggtt tttcttcggu a 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157. “nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 52 atagactttt cgacccaaca 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157. “nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 53 atagacatca agccctcgua 20 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157. <400> 54 tcgttaaata gtatacggac a 21 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157. <400> 55 atagacatca agccctcgta 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of lambda DNA. “nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 56 gaacaatgga agtcaacaaa 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of viroid CSVd. <400> 57 tacttgtggt tcctgtggtg 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of viroid CSVd. <400> 58 atactaaggt tccaagggct 20 <210> 59 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of viroid CSVd. “nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 59 ggaaacctgg aggaaguc 18 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of viroid CSVd. “nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 60 gtgaaaaccc tgtttaggau 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of Flavobacterium species DNA. “nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 61 acctagatat aagctctaca 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of Flavobacterium species DNA. “nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 62 aaatagatgt tttagcagag 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of Flavobacterium species DNA. “nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 63 atagataaaa aaaactccac 20 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157. “nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-nucloetide 18 is inosine-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 64 tcgttaaata gtatacgiac a 21 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157. “nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-nucleotide 17 is inosine other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 65 tcgttaaata gtatacigac a 21 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157. “nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-nucleotide 16 is inosine-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 66 tcgttaaata gtataiggac a 21 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157. “nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-nucleotide 17 is inosine-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 67 tgctcaataa tcagaciaag 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157. “nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-nucleotide 16 is inosine-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 68 tgctcaataa tcagaigaag 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157. “nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-nucleotide 15 is inosine-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 69 tgctcaataa tcagicgaag 20 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157. “nucleotides 9 to 11 and 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 70 tacctggguu uttcttcggu a 21 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157. “nucleotides 8 to 10 and 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 71 atagacauca agccctcgua 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157. “nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 72 gtcccctgag atatatguuc 20 <210> 73 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe to detect a DNA fragment amplifing a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157. <400> 73 ccaacaaagt tatgtctctt cgttaaatag 30 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of iNOS-encoding sequence from mouse. “nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 74 atgccattga gttcatcaac 20 <210> 75 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of iNOS-encoding sequence from mouse. “nucleotides 17 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 75 tcttggtggc aaagatgag 19 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of iNOS- encoding sequence from mouse. <400> 76 atgccattga gttcatcaac 20 <210> 77 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of iNOS- encoding sequence from mouse <400> 77 tcttggtggc aaagatgag 19 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as GMO-PCR-F 20mer <400> 78 atcgttgaag atgcctctgc 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed oligonucleotide primer designated as GMO-PCR-R 20mer <400> 79 tccgtatgat cgcgcgtcat 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as GMO-S1 20mer. “nucleotides 19 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 80 tttggagagg acacgctgac 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as GMO-S2 20mer. “nucleotides 19 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 81 ggacacgctg acaagctgac 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as GMO-A1 20mer. “nucleotides 19 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 82 ggctgtagcc actgatgcug 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as GMO-A2 20 mer. “nucleotides 19 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 83 ttccggaaag gccagaggau 20 <210> 84 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157. “nucleotides 18 to 20 are (alpha-thio)ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 84 tactgggtt tttcttcggu a 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157. “nucleotides 18 to 20 are (alpha-thio)ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 85 atagacatca agccctcgua 20 <210> 86 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of INOS-encoding sequence from mouse.“nucleotides 20 to 22 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 86 tcatgccatt gagttcatca ac 22 <210> 87 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of INOS-encoding sequence from mouse.“nucleotides 20 to 22 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 87 tggtaggttc ctgttgtttc ua 22 <210> 88 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of INOS- encoding sequence from mouse. <400> 88 tcatgccatt gagttcatca ac 22 <210> 89 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of INOS- encoding sequence from mouse. <400> 89 tggtaggttc ctgttgtttc ta 22 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of lambda DNA.“nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 90 ctgcgaggcg gtggcaaggg 20 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of lambda DNA.“nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 91 ctgcctcgct ggccgtgccg c 21 <210> 92 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of INOS-encoding sequence from mouse.“nucleotides 21 to 23 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 92 ctcatgccat tgagttcatc aac 23 <210> 93 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of INOS-encoding sequence from mouse.“nucleotides 20 to 22 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 93 gctggtaggt tcctgttgtu uc 22 <210> 94 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of pDON-AI DNA.“nucleotides 17 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 94 agctctgtat ctggcggac 19 <210> 95 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of pDON-AI DNA.“nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 95 gatcgggatt tttggactca g 21 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of HPV type16 DNA.“nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 96 caaaagagaa ctgcaatguu u 21 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of HPV type16 DNA.“nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 97 gttgcttgca gtacacacau u 21 <210> 98 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe to detect a DNA fragment amplifing a portion of HPV DNA. <400> 98 gaggacccac aggagcgacc cagaaag 27 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of HCV. <400> 99 cactccacca tgaatcactc 20 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of HCV. <400> 100 ggtgcacggt ctacgagacc 20 <210> 101 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of HCV.“nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 101 ctgtgaggaa ctactgtcuu c 21 <210> 102 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of HCV.“nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 102 gcagaccact atggcucu 18 <210> 103 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe to detect a DNA fragment amplifing portion of HCV. <400> 103 gtatgagtgt cgtgcagcct ccaggacccc 30 <210> 104 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of adenovirus.“nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 104 tgagacatat tatctgccac g 21 <210> 105 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of adenovirus.“nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 105 aaatggctag gaggtggaag a 21 <210> 106 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of adenovirus.“nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 106 ttatcagcca gtacctctuc g 21 <210> 107 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of adenovirus <400> 107 tgagacatat tatctgccac g 21 <210> 108 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of adenovirus. <400> 108 aaatggctag gaggtggaag a 21 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of viroid CSVd. <400> 109 ggggaaacct ggaggaagtc 20 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of viroid CSVd. <400> 110 cgggtagtag ccaaaggaag 20 <210> 111 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of pDON-AI DNA. <400> 111 agctctgtat ctggcggac 19 <210> 112 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of pDON-AI DNA. <400> 112 gatcgggatt tttggactca g 21 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of verotoxin-1 encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0- 157.“nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 113 ggggataatt tgtttgcagu 20 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of verotoxin-1 encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0- 157.“nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 114 tcgttcaaca ataagccgua 20 <210> 115 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe to detect a DNA fragment amplifying a portion of verotoxin-1 encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157. <400> 115 cgcccttcct ctggatctac ccctctgaca 30 <210> 116 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of botulinum toxin A encoding sequence from Clostridium botulinum.“nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 116 caccagaagc aaaacaaguu c 21 <210> 117 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of botulinum toxin A encoding sequence from Clostridium botulinum.“nucleotides 21 to 23 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 117 ctattgatgt taacaacatt cuu 23 <210> 118 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe to detect a DNA fragment amplifying a portion of botulinum toxin A encoding sequence from Clostridium botulinum. <400> 118 gggagttaca aaattatttg agagaattta 30 <210> 119 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of viroid CSVd.“nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 119 cacccttcct ttagtttccu u 21 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of viroid CSVd.“nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 120 cgttgaagct tcagttguuu 20 <210> 121 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe to detect a DNA fragment amplifying a portion of viroid CSVd. <400> 121 ccttcctctc ctggagaggt cttctgccct 30 <210> 122 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of viroid CSVd.“nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 122 cacccttcct ttagtttccu u 21 <210> 123 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of viroid CSVd.“nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 123 cgttgaagct tcagttgtuu c 21 <210> 124 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of viroid CSVd. <400> 124 cacccttcct ttagtttcct t 21 <210> 125 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of viroid CSVd. <400> 125 cgttgaagct tcagttgttt c 21 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of c- ki-ras oncogene.“nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 126 gactgaatat aaacttgugg 20 <210> 127 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of c- ki-ras oncogene.“nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 127 ctattgttgg atcatatucg 20 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of c-ki-ras oncogene. <400> 128 gactgaatat aaacttgtgg 20 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of c-ki-ras oncogene. <400> 129 ctattgttggatcatattcg 20 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of verotoxin-2 encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O- 157.“nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 130 gacttttcga cccaacaaag 20 <210> 131 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of verotoxin-2 encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O- 157.“nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 131 atatccacag caaaataacu 20 <210> 132 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of INOS- encoding sequence from mouse. <400> 132 cacaaggcca catcggattt c 21 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of INOS- encoding sequence from mouse. <400> 133 tgcataccac ttcaacccga g 21 <210> 134 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as pUC19 upper 150 to amplify a portion of plasmid pUC19. <400> 134 ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatg 25 <210> 135 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as pUC19 lower NN to amplify a portion of plasmid pUC19. <400> 135 gataacactg cggccaactt acttc 25 <210> 136 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as SEA-1 to amplify a portion of Staphylococcus aureus.“nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 136 tgtatgtatg gtggtgtaac g 21 <210> 137 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as SEA-2 to amplify a portion of Staphylococcus aureus.“nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 137 taaccgtttc caaaggtacu g 21 <210> 138 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as HCV-F3 to amplify a portion of HCV. “nucleotides 17 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 138 gcgtctagcc atggcguua 19 <210> 139 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as HCV-R1 to amplify a portion of HCV. “nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 139 gcagaccact atggcucu 18 <210> 140 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as MF2 to amplify a portion of pUC19 plasmid DNA. <400> 140 ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta 30 <210> 141 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as MR1 to amplify a portion of pUC19 plasmid DNA. <400> 141 tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt 30 <210> 142 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of adenovirus. <400> 142 ttatcagcca gtacctcttc g 21 <210> 143 <211> 714 <212> DNA <213> Thermotoga maritima <400> 143 atgggaatag atgagcttta caaaaaagag tttggaatcg tagcaggtgt ggatgaagcg 60 ggaagagggt gcctcgcagg tcccgttgtg gcggccgctg tcgttctgga aaaagaaata 120 gaaggaataa acgattcaaa acagctttcc cctgcgaaga gggaaagact tttagatgaa 180 ataatggaga aggcagcagt tgggttagga attgcgtctc cagaggaaat agatctctac 240 aacatattca atgccacaaa acttgctatg aatcgagcac tggagaacct gtctgtgaaa 300 ccatcatttg tactcgttga cgggaaagga atcgagttga gcgttcccgg tacatgctta 360 gtgaagggag accagaaaag caaattgata ggagcagctt ccattgttgc gaaggtcttc 420 agagatagat tgatgagcga gtttcacagg atgtatccac agttttcctt ccacaaacac 480 aaaggttacg ccacaaaaga acatctgaac gaaatcagaa agaacggagt tttaccaatc 540 caccggctga gttttgaacc tgttttagaa cttctgaccg atgatttgtt gagggagttc 600 ttcgaaaaag gcctcatctc cgaaaatcga ttcgaacgaa tattgaatct tctgggggcg 660 agaaaaagtg tggttttccg gaaagaaaga acaaaccata atctccctct tttt 714 <210> 144 <211> 238 <212> PRT <213> Thermotoga maritima <400> 144 Met Gly Ile Asp Glu Leu Tyr Lys Lys Glu Phe Gly Ile Val Ala 1 5 10 15 Gly Val Asp Glu Ala Gly Arg Gly Cys Leu Ala Gly Pro Val Val 20 25 30 Ala Ala Ala Val Val Leu Glu Lys Glu Ile Glu Gly Ile Asn Asp 35 40 45 Ser Lys Gln Leu Ser Pro Ala Lys Arg Glu Arg Leu Leu Asp Glu 50 55 60 Ile Met Glu Lys Ala Ala Val Gly Leu Gly Ile Ala Ser Pro Glu 65 70 75 Glu Ile Asp Leu Tyr Asn Ile Phe Asn Ala Thr Lys Leu Ala Met 80 85 90 Asn Arg Ala Leu Glu Asn Leu Ser Val Lys Pro Ser Phe Val Leu 95 100 105 Val Asp Gly Lys Gly Ile Glu Leu Ser Val Pro Gly Thr Cys Leu 110 115 120 Val Lys Gly Asp Gln Lys Ser Lys Leu Ile Gly Ala Ala Ser Ile 125 130 135 Val Ala Lys Val Phe Arg Asp Arg Leu Met Ser Glu Phe His Arg 140 145 150 Met Tyr Pro Gln Phe Ser Phe His Lys His Lys Gly Tyr Ala Thr 155 160 165 Lys Glu His Leu Asn Glu Ile Arg Lys Asn Gly Val Leu Pro Ile 170 175 180 His Arg Leu Ser Phe Glu Pro Val Leu Glu Leu Leu Thr Asp Asp 185 190 195 Leu Leu Arg Glu Phe Phe Glu Lys Gly Leu Ile Ser Glu Asn Arg 200 205 210 Phe Glu Arg Ile Leu Asn Leu Leu Gly Ala Arg Lys Ser Val Val 215 220 225 Phe Arg Lys Glu Arg Thr Asn His Asn Leu Pro Leu Phe 230 235 <210> 145 <211> 663 <212> DNA <213> Pyrococcus horikoshii <400> 145 atgaaggttg ctggagttga tgaagcgggg agggggccgg taattggccc gttagtaatt 60 ggagtagccg ttatagatga gaaaaatatt gagaggttac gtgacattgg ggttaaagac 120 tccaaacaat taactcctgg gcaacgtgaa aaactattta gcaaattaat agatatccta 180 gacgattatt atgttcttct cgttaccccc aaggaaatag atgagaggca tcattctatg 240 aatgaactag aagctgagaa attcgttgta gccttgaatt ctttaaggat caagccgcag 300 aagatatatg tggactctgc cgatgtagat cctaagaggt ttgctagtct aataaaggct 360 gggttgaaat atgaagccac ggttatcgcc gagcataaag ccgatgcaaa gtatgagata 420 gtatcggcag catcaataat tgcaaaggtc actagggata gagagataga gaagctaaag 480 caaaagtatg gggaatttgg ttctggctat ccgagtgatc cgagaactaa ggagtggctt 540 gaagaatatt acaaacaata tggtgacttt cctccaatag ttaggagaac ttgggaaacc 600 gctaggaaga tagaggaaag gtttagaaaa aatcagctaa cgcttgataa attccttaag 660 tga 663 <210> 146 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer PhoNde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus horikoshii <400> 146 aggaggaaaa tcatatgaag gttgctggag 30 <210> 147 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer PhoBam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus horikoshii <400> 147 ttacatgaag gatccaagat cacttaagga 30 <210> 148 <211> 663 <212> DNA <213> Pyrococcus horikoshii <400> 148 atgaaggttg ctggagttga tgaagcgggg agggggccgg taattggccc gttagtaatt 60 ggagtagccg ttatagatga gaaaaatatt gagaggttac gtgacattgg ggttaaagac 120 tccaaacaat taactcctgg gcaacgtgaa aaactattta gcaaattaat agatatccta 180 gacgattatt atgttcttct cgttaccccc aaggaaatag atgagaggca tcattctatg 240 aatgaactag aagctgagaa attcgttgta gccttgaatt ctttaaggat caagccgcag 300 aagatatatg tggactctgc cgatgtagat cctaagaggt ttgctagtct aataaaggct 360 gggttgaaat atgaagccac ggttatcgcc gagcataaag ccgatgcaaa gtatgagata 420 gtatcggcag catcaataat tgcaaaggtc actagggata gagagataga gaagctaaag 480 caaaagtatg gggaatttgg ttctggctat ccgagtgatc cgagaactaa ggagtggctt 540 gaagaatatt acaaacaata tggtgacttt cctccaatag ttaggagaac ttgggaaacc 600 gctaggaaga tagaggaaag gtttagaaaa aatcagctaa cgcttgataa attccttaag 660 tgatcttgga tcc 663 <210> 149 <211> 220 <212> PRT <213> Pyrococcus horikoshii <400> 149 Met Lys Val Ala Gly Val Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Val Ile 1 5 10 15 Gly Pro Leu Val Ile Gly Val Ala Val Ile Asp Glu Lys Asn Ile 20 25 30 Glu Arg Leu Arg Asp Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr 35 40 45 Pro Gly Gln Arg Glu Lys Leu Phe Ser Lys Leu Ile Asp Ile Leu 50 55 60 Asp Asp Tyr Tyr Val Leu Leu Val Thr Pro Lys Glu Ile Asp Glu 65 70 75 Arg His His Ser Met Asn Glu Leu Glu Ala Glu Lys Phe Val Val 80 85 90 Ala Leu Asn Ser Leu Arg Ile Lys Pro Gln Lys Ile Tyr Val Asp 95 100 105 Ser Ala Asp Val Asp Pro Lys Arg Phe Ala Ser Leu Ile Lys Ala 110 115 120 Gly Leu Lys Tyr Glu Ala Thr Val Ile Ala Glu His Lys Ala Asp 125 130 135 Ala Lys Tyr Glu Ile Val Ser Ala Ala Ser Ile Ile Ala Lys Val 140 145 150 Thr Arg Asp Arg Glu Ile Glu Lys Leu Lys Gln Lys Tyr Gly Glu 155 160 165 Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Arg Thr Lys Glu Trp Leu 170 175 180 Glu Glu Tyr Tyr Lys Gln Tyr Gly Asp Phe Pro Pro Ile Val Arg 185 190 195 Arg Thr Trp Glu Thr Ala Arg Lys Ile Glu Glu Arg Phe Arg Lys 200 205 210 Asn Gln Leu Thr Leu Asp Lys Phe Leu Lys 215 220 <210> 150 <211> 626 <212> DNA <213> Archaeoglobus fulgidus <400> 150 atgaaggcag gcatcgatga ggctggaaag ggctgcgtca tcggcccact ggttgttgca 60 ggagtggctt gcagcgatga ggataggctg agaaagcttg gtgtgaaaga ctccaaaaag 120 ctaagtcagg ggaggagaga ggaactagcc gaggaaataa ggaaaatctg cagaacggag 180 gttttgaaag tttctcccga aaatctcgac gaaaggatgg ctgctaaaac cataaacgag 240 attttgaagg agtgctacgc tgaaataatt ctcaggctga agccggaaat tgcttatgtt 300 gacagtcctg atgtgattcc cgagagactt tcgagggagc ttgaggagat tacggggttg 360 agagttgtgg ccgagcacaa ggcggacgag aagtatcccc tggtagctgc ggcttcaatc 420 atcgcaaagg tggaaaggga gcgggagatt gagaggctga aagaaaaatt cggggatttc 480 ggcagcggct atgcgagcga tccgaggaca agagaagtgc tgaaggagtg gatagcttca 540 ggcagaattc cgagctgcgt gagaatgcgc tggaagacgg tgtcaaatct gaggcagaag 600 acgcttgacg atttctaaac gaaacc 626 <210> 151 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer AfuNde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus <400> 151 aagctgggtt tcatatgaag gcaggcatcg 30 <210> 152 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer AfuBam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus <400> 152 tggtaataac ggatccgttt agaaatcgtc 30 <210> 153 <211> 638 <212> DNA <213> Archaeoglobus fulgidus <400> 153 catatgaagg caggcatcga tgaggctgga aagggctgcg tcatcggccc actggttgtt 60 gcaggagtgg cttgcagcga tgaggatagg ctgagaaagc ttggtgtgaa agactccaaa 120 aagctaagtc aggggaggag agaggaacta gccgaggaaa taaggaaaat ctgcagaacg 180 gaggttttga aagtttctcc cgaaaatctc gacgaaagga tggctgctaa aaccataaac 240 gagattttga aggagtgcta cgctgaaata attctcaggc tgaagccgga aattgcttat 300 gttgacagtc ctgatgtgat tcccgagaga ctttcgaggg agcttgagga gattacgggg 360 ttgagagttg tggccgagca caaggcggac gagaagtatc ccctggtagc tgcggcttca 420 atcatcgcaa aggtggaaag ggagcgggag attgagaggc tgaaagaaaa attcggggat 480 ttcggcagcg gctatgcgag cgatccgagg acaagagaag tgctgaagga gtggatagct 540 tcaggcagaa ttccgagctg cgtgagaatg cgctggaaga cggtgtcaaa tctgaggcag 600 aagacgcttg acgatttcta aacggatccc cgggtacc 638 <210> 154 <211> 205 <212> PRT <213> Archaeoglobus fulgidus <400> 154 Met Lys Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Lys Gly Cys Val Ile Gly 1 5 10 15 Pro Leu Val Val Ala Gly Val Ala Cys Ser Asp Glu Asp Arg Leu 20 25 30 Arg Lys Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Lys Leu Ser Gln Gly Arg 35 40 45 Arg Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ile Arg Lys Ile Cys Arg Thr Glu 50 55 60 Val Leu Lys Val Ser Pro Glu Asn Leu Asp Glu Arg Met Ala Ala 65 70 75 Lys Thr Ile Asn Glu Ile Leu Lys Glu Cys Tyr Ala Glu Ile Ile 80 85 90 Leu Arg Leu Lys Pro Glu Ile Ala Tyr Val Asp Ser Pro Asp Val 95 100 105 Ile Pro Glu Arg Leu Ser Arg Glu Leu Glu Glu Ile Thr Gly Leu 110 115 120 Arg Val Val Ala Glu HisLys Ala Asp Glu Lys Tyr Pro Leu Val 125 130 135 Ala Ala Ala Ser Ile Ile Ala Lys Val Glu Arg Glu Arg Glu Ile 140 145 150 Glu Arg Leu Lys Glu Lys Phe Gly Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Ala 155 160 165 Ser Asp Pro Arg Thr Arg Glu Val Leu Lys Glu Trp Ile Ala Ser 170 175 180 Gly Arg Ile Pro Ser Cys Val Arg Met Arg Trp Lys Thr Val Ser 185 190 195 Asn Leu Arg Gln Lys Thr Leu Asp Asp Phe 200 205 <210> 155 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as MTIS2F to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA.”nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides." <400> 155 tctcgtccag cgccgcuu 18 <210> 156 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as MTIS2R to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA.”nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides." <400> 156 gacaaaggcc acgtaggcga a 21 <210> 157 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as CT2F to amplify a portion of Chlamydia trachomatis cryptic plasmid DNA.”nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides." <400> 157 ctggatttat cggaaaccuu 20 <210> 158 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as CT2R to amplify a portion of Chlamydia trachomatis cryptic plasmid DNA.”nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides." <400> 158 aggcctctga aacgacuu 18 <210> 159 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as K-F- 1033(60) to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA.”nucleotides 17 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides." <400> 159 cacatcgatc cggttcagc 19 <210> 160 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as K-R- 1133(62) to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA.”nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides." <400> 160 tgatcgtctc ggctagtgca 20 <210> 161 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as K-F- 1033(68) to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA.”nucleotides 20 to 22 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides." <400> 161 gtacacatcg atccggttca gc 22 <210> 162 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as K-R- 1133(68) to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA.”nucleotides 20 to 22 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides." <400> 162 gttgatcgtc tcggctagtg ca 22 <210> 163 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as F26 to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA. <400> 163 ccggagactc cagttcttgg 20 <210> 164 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as R1310 to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA. <400> 164 gtctctggcg ttgagcgtag 20 <210> 165 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as pDON-AI- 68-1 to amplify a portion of pDON-AI.”nucleotides 20 to 22 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides." <400> 165 actagctctg tatctggcgg ac 22 <210> 166 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as pDON-AI- 68-2 to amplify a portion of pDON-AI.”nucleotides 21 to 23 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides." <400> 166 acgatcggga tttttggact cag 23 <210> 167 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens proto-oncogene Wnt-5a <400> 167 cactagattt tttgtttggg gaggttggct tgaacataaa tgaaatatcc tgtattttct 60 tagggatact tggttagtaa attataatag tagaaataat acatgaatcc cattcacagg 120 tttctcagcc caagcaacaa ggtaattgcg tgccattcag cactgcacca gagcagacaa 180 cctatttgag gaaaaacagt gaaatccacc ttcctcttca cactgagccc tctctgattc 240 ctccgtgttg tgatgtgatg ctggccacgt ttccaaacgg cagctccact gggtcccctt 300 <210> 168 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens ribosomal protein S5 <400> 168 cgccgagtga cagagacgct caggctgtgt tctcaggatg accgagtggg agacagcagc 60 accagcggtg gcagagaccc cagacatcaa gctctttggg aagtggagca ccgatgatgt 120 gcagatcaat gacatttccc tgcaggatta cattgcagtg aaggagaagt atgccaagta 180 cctccctcac agtgcagggc ggtatgccgc aaacgctttc cgcaaagctc agtgtcccat 240 tgtggagcgc ctcactaact ccatgatgat gcacggccgc aacaacggca agaagctcat 300 <210> 169 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens diaphorase <400> 169 tctatacaaa ttttcagaag gttattttct ttatcattgc taaactgatg acttaccatg 60 ggatggggtc cagtcccatg accttggggt acaattgtaa acctagagtt ttatcaactt 120 tggtgaacag ttttggcata atagtcaatt tctacttctg gaagtcatct cattccactg 180 ttggtattat ataattcaag gagaatatga taaaacactg ccctcttgtg gtgcattgaa 240 agaagagatg agaaatgatg aaaaggttgc ctgaaaaatg ggagacagcc tcttacttgc 300 <210> 170 <211> 300 <212> DNA <213> Human protocadherin <400> 170 agtctcttgg gatcccctaa ccagagcctt tttgccatag ggctgcacac tggtcaaatc 60 agtactgccc gtccagtcca agacacagat tcacccaggc agactctcac ggtcttgatc 120 aaagacaatg gggagccttc gctctccacc actgctaccc tcactgtgtc agtaaccgag 180 gactctcctg aagcccgagc cgagttcccc tctggctctg ccccccggga gcagaaaaaa 240 aatctcacct tttatctact tctttcccta atcctggttt ctgtggggtt tgtggtcaca 300 <210> 171 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide for making of pIC62. <400> 171 catgtacatc acagtagtcg ttcacagggt tttccggcca taatggcctt tcctgtgtgt 60 gtgctacagc tagtcagtca 80 <210> 172 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as ICAN2.”nucleotides 19 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides." <400> 172 actgactagc tgtagcacac 20 <210> 173 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as ICAN6.”nucleotides 19 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides." <400> 173 acatcacagt agtcgttcac 20 <210> 174 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as ICAN2 DNA.” <400> 174 actgactagc tgtagcacac 20 <210> 175 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as ICAN6 DNA. <400> 175 acatcacagt agtcgttcac 20 <210> 176 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of ribosomal protein S18-encoding sequence from mouse. <400> 176 gtctctagtg atccctgaga agt 23 <210> 177 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of ribosomal protein S18-encoding sequence from mouse. <400> 177 tggatacacc cacagttcgg ccc 23 <210> 178 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of transferrin receptor (TFR)-encoding sequence from mouse. <400> 178 ccgcgctccg acaagtagat gga 23 <210> 179 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of transferrin receptor (TFR)-encoding sequence from mouse. <400> 179 ccaaagagtg caaggtctgc ctc 23 <210> 180 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of stromal cell derived factor 4 (Sdf4)-encoding sequence from mouse. <400> 180 tctgatggat gcaaccgcta gac 23 <210> 181 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of stromal cell derived factor 4 (Sdf4)-encoding sequence from mouse. <400> 181 gaactcttca tgcacgttgc ggg 23 <210> 182 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of cytoplasmic beta-actin encoding sequence from mouse. <400> 182 tgatggtggg aatgggtcag aag 23 <210> 183 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of cytoplasmic beta-actin encoding sequence from mouse. <400> 183 agaagcactt gcggtgcacg atg 23 <210> 184 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of ornithine decarboxylase-encoding sequence from mouse. <400> 184 gatgaaagtc gccagagcac atc 23 <210> 185 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of ornithine decarboxylase-encoding sequence from mouse. <400> 185 ttgatcctag cagaagcaca ggc 23 <210> 186 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase (HPRT)-encoding sequence from mouse. <400> 186 ggacaggact gaaagacttg ctc 23 <210> 187 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase (HPRT)-encoding sequence from mouse. <400> 187 gtctggcctg tatccaacac ttc 23 <210> 188 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of tyrosine 3- monooxygenase encoding sequence from mouse. <400> 188 atgagctggt gcagaaggcc aag 23 <210> 189 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of tyrosine 3- monooxygenase encoding sequence from mouse. <400> 189 ttcccctcct tctcctgctt ctg 23 <210> 190 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as MCS-F. <400> 190 ccattcaggc tgcgcaatgt t 21 <210> 191 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as MCS-R <400> 191 tggcacgaca ggtttcccga ct 22 <210> 192 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as MF2N3(24). "nucleotides 22 to 24 are ribonucleoitdes-other nucleotides are deoxyribonucleotides." <400> 192 gctgcaaggc gattaagttg ggua 24 <210> 193 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as MR1N3(24). "nucleotides 22 to 24 are ribonucleoitdes-other nucleotides are deoxyribonucleotides." <400> 193 ctttatgctt ccggctcgta tguu 24 <210> 194 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as MTIS2F- 16 to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA.”nucleotides 14 to 16 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides." <400> 194 tcgtccagcg ccgcuu 16 <210> 195 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as MTIS2R- ACC to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA.”nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides." <400> 195 caaaggccac gtaggcgaac 20 <210> 196 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as MTIS-PCR-F-2 to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA. <400> 196 cgaccgcatc aaccgggagc 20 <210> 197 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as MTIS-PCR-R-2 to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA. <400> 197 cccaggatcc tgcgagcgta 20 <210> 198 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as SP6-HCV-F to amplify a portion of HCV. <400> 198 ccatttaggt gacactatag aatactgatg ggggcgacac tccac 45 <210> 199 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as SP6-HCV-R to amplify a portion of HCV <400> 199 agctctaata cgactcacta tagggtcgca agcaccctat caggc 45 <210> 200 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as HCV-A S to amplify a portion of HCV.”nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides." <400> 200 gggtcctttc ttggatcaac 20 <210> 201 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as HCV-A A to amplify a portion of HCV. ”nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides." <400> 201 gacccaacac tactcggcua 20 ６６２７５７ 1/96

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  138. (a) 주형으로서 핵산, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 주형 변환(switching) 반응을 수행하는 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 적어도 하나의 프라이머 및 RNase H를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하되, 상기 프라이머는 주형으로서 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적이고, 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 상기 뉴클레오티드 유사체는 데옥시이노신 뉴클레오티드, 데옥시우라실 뉴클레오티드 및 7-데아자-구아닌 뉴클레오티드로 구성된 그룹으로부터 선택되고, 상기 리보뉴클레오티드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
    (b) 충분한 시간동안 반응 혼합물을 인큐베이션시키고 주형 변환 반응을 수행하여 반응 산물을 생성시키는 것을 포함하는 핵산 증폭 방법.
  139. 제138항에 있어서, 반응 혼합물이 추가로 주형으로서 핵산의 상보적 스트랜드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 갖는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 방법.
  140. (a) 주형으로서 더블-스트랜드 핵산을 더블-스트랜드 핵산의 각 스트랜드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 두개의 프라이머 및 주형 변환 반응을 수행하는 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제로 처리하여 주형에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고 서로 어닐링하는 합성된 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산을 수득하되, 상기 각 프라이머는 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 상기 뉴클레오티드 유사체는 데옥시이노신 뉴클레오티드, 데옥시우라실 뉴클레오티드 및 7-데아자-구아닌 뉴클레오티드로 구성된 그룹으로부터 선택되고, 상기 리보뉴클레오티드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
    (b) 단계 (a)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산의 리보뉴클레오티드를 포함하는 사이트를 엔도뉴클레아제로 절단하고;
    (c) 단계 (b)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 각 프라이머 부위의 3'-말단으로부터, 주형 변환 반응을 수행하는 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 주형에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 신장시켜 스트랜드 치환시키고 서로 어닐링된 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산을 수득하는 것을 포함하는 것을 핵산 증폭 방법.
  141. (a) 주형으로서 더블-스트랜드 핵산을 더블-스트랜드 핵산의 각 스트랜드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 두개의 프라이머 및 주형 변환 반응을 수행하는 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제로 처리하여 주형에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고 서로 어닐링하는 합성된 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산을 수득하되, 상기 각 프라이머는 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 상기 뉴클레오티드 유사체는 데옥시이노신 뉴클레오티드, 데옥시우라실 뉴클레오티드 및 7-데아자-구아닌 뉴클레오티드로 구성된 그룹으로부터 선택되고, 상기 리보뉴클레오티드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
    (b) 단계 (a)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산의 리보뉴클레오티드를 포함하는 사이트를 엔도뉴클레아제로 절단하고;
    (c) 단계 (b)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 각 프라이머 부위의 3'-말단으로부터, 주형 변환 반응을 수행하는 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 주형에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 신장시켜 스트랜드 치환시키고 서로 어닐링된 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산 및 단계 (a)의 두개의 프라이머가 어닐링된 서로 어닐링된 주형으로 구성된 더블-스트랜드 핵산을 수득하고;
    (d) 단계 (c)에서 수득한 두개의 프라이머가 어닐링된 더블-스트랜드 핵산의 각 프라이머 부위의 3'-말단으로부터, 주형 변환 반응을 수행하는 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 주형에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 신장시켜 스트랜드 치환시키고 서로 어닐링된 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산 및 단계 (a)의 두개의 프라이머가 어닐링된 서로 어닐링된 주형으로 구성된 더블-스트랜드 핵산을 수득하고;
    (e) 단계 (d)에서 수득한 두개의 프라이머가 어닐링된 더블-스트랜드 핵산을 단계 (d)에서 다시 사용하는 것을 포함하는 핵산 증폭 방법.
  142. (a) 주형으로서 더블-스트랜드 핵산을 더블-스트랜드 핵산의 각 스트랜드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 두개의 프라이머 및 주형 변환 반응을 수행하는 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제로 처리하여 주형에 상보적인 프라이머-신장된 스트랜드를 합성하고 서로 어닐링하는 합성된 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산을 수득하되, 상기 각 프라이머는 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 상기 뉴클레오티드 유사체는 데옥시이노신 뉴클레오티드, 데옥시우라실 뉴클레오티드 및 7-데아자-구아닌 뉴클레오티드로 구성된 그룹으로부터 선택되고, 상기 리보뉴클레오티드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고;
    (b) 단계 (a)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산의 리보뉴클레오티드를 포함하는 사이트를 엔도뉴클레아제로 절단하고;
    (c) 단계 (b)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 각 프라이머 부위의 3'-말단으로부터, 주형 변환 반응을 수행하는 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 주형에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 신장시켜 스트랜드 치환시키고 서로 어닐링된 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산 및 단계 (a)의 두개의 프라이머가 어닐링된 서로 어닐링된 주형으로 구성된 더블-스트랜드 핵산을 수득하고;
    (d) 단계 (c)에서 수득한 두개의 프라이머가 어닐링된 더블-스트랜드 핵산의 각 프라이머 부위의 3'-말단으로부터, 주형 변환 반응을 수행하는 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 주형에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 신장시켜 스트랜드 치환시키고 주형 및 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산을 수득하고;
    (e) 단계 (d)에서 수득한 주형 및 프라이머-신장된 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산의 리보뉴클레오티드를 포함하는 사이트를 엔도뉴클레아제로 절단하고;
    (f) 단계 (e)에서 수득한 프라이머-신장된 스트랜드가 절단된 더블-스트랜드 핵산의 각 프라이머 부위의 3'-말단으로부터 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 주형에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 신장시켜 치환된 스트랜드를 합성하는 것을 포함하는 핵산 증폭 방법.
  143. 제 140항 내지 제 142항중 어느 한 항에 있어서, 엔도뉴클레아제가 엔도리보뉴클레아제인 방법.
  144. 제 143항에 있어서, 엔도리보뉴클레아제가 RNase H인 방법.
  145. 제138항에 있어서, RNase H가 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 RNase H, 써모토가(Thermotoga) 속 박테리움으로부터의 RNase H, 써무스(Thermus) 속 박테리움으로부터의 RNase H, 피로코쿠스(Pyrococcus) 속 박테리움으로부터의 RNase H, 아키오글루부스(Archaeoglobus) 속 박테리움으로부터의 RNase H 및 바실러스(Bacillus) 속 박테리움으로부터의 RNase H로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  146. 제138항 또는 제140항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭시키고자 하는 핵산 부위의 길이가 200bp 이하인 방법.
  147. 제138항 또는 제140항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 일반식으로 나타낸 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 방법:
    일반식: 5'-dNa-Nb-dNc-3'
    여기서 a: 11이상의 정수;
    b: 1이상의 정수;
    c: 0 내지 5;
    dN: 데옥시리보뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 또는 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체이되, 상기 뉴클레오티드 유사체는 데옥시이노신 뉴클레오티드, 데옥시우라실 뉴클레오티드 및 7-데아자-구아닌 뉴클레오티드로 구성된 그룹으로부터 선택되고;
    N: 변형되지 않은 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 또는 변형되지 않은 리보뉴클레오티드 및 변형된 리보뉴클레오티드,
    여기서, dNa중 하나 이상의 dNs는 N으로 대체될 수 있고, 3'-말단의 뉴클레오티드는 DNA 폴리머라제의 작용에 의한 3'-말단으로부터의 신장이 발생하지 않도록 변형될 수 있다.
  148. 제 147항에 있어서, c가 0인 방법.
  149. 제147항에 있어서, 뉴클레오티드 유사체가 데옥시리보이노신 뉴클레오티드 또는 데옥시리보우라실 뉴클레오티드이고 변형된 리보뉴클레오티드가 (α-S) 리보뉴클레오티드인 방법.
  150. 제138항 또는 제140항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 프라이머에 어닐링하는 것을 촉진시키는 물질을 포함하는 어닐링 용액중에서 주형으로서 핵산을 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 어닐링시키는 것을 포함하는 방법.
  151. 제150항에 있어서, 어닐링 용액이 스퍼미딘, 프로필렌디아민, 또는 스퍼미딘 및 프로필렌디아민를 포함하는 방법.
  152. 삭제
  153. 제138항 또는 제140항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 변환 반응을 수행하는 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제가 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 DNA 폴리머라제 I의 클레나우(Klenow) 단편, 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bst DNA 폴리머라제 및 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bca DNA 폴리머라제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  154. 제138항 또는 제140항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 변환 반응을 수행하는 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제가 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)로부터의 5'→3' 엑소뉴클레아제 결핍된 Bca DNA 폴리머라제이고 RNase H가 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 RNase H, 피로코쿠스(Pyrococcus) 속 박테리움으로부터의 RNase H, 및 아키오글루부스(Archaeoglobus) 속 박테리움으로부터의 RNase H로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  155. 제 154항에 있어서, RNase H가 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 RNase H I형, 또는 피로코쿠스(Pyrococcus) 또는 아키오글루부스(Archaeoglobus) 속 박테리움으로부터의 RNase H II형인 방법.
  156. 제138항 또는 제140항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 증폭 반응을 등온 조건하에 수행하는 방법.
  157. 제138항 또는 제140항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 주형에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 신장이 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 유사체의 존재하에 수행되고, 상기 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 유사체는 데옥시우리딘 트리포스페이트, 7-데아자-dGTP 및 dITP로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  158. 삭제
  159. 제144항에 있어서, RNase H가 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 RNase H, 써모토가(Thermotoga) 속 박테리움으로부터의 RNase H, 써무스(Thermus) 속 박테리움으로부터의 RNase H, 피로코쿠스(Pyrococcus) 속 박테리움으로부터의 RNase H, 아키오글루부스(Archaeoglobus) 속 박테리움으로부터의 RNase H 및 바실러스(Bacillus) 속 박테리움으로부터의 RNase H로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  160. 제138항에 있어서, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머가 하기 (a) 내지 (h)로 구성된 그룹 중에서 선택되는 방법:
    (a) 서열번호 31-34, 47, 48, 51-53, 64-72, 84, 85, 113, 114, 130 및 131로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 장출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)를 증폭하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머;
    (b) 서열번호 59, 60, 119, 120, 122 및 123으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 비로이드를 증폭하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머;
    (c) 서열번호 116 또는 117로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 클로스트리듐 보툴리늄(Clostridium botulinum)을 증폭하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머;
    (d) 서열번호 96 또는 97로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 유두종(papilloma) 바이러스를 증폭하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머;
    (e) 서열번호 101, 102, 138, 139, 200 및 201로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 C형 간염 바이러스를 증폭하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머;
    (f) 서열번호 136 또는 137로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 증폭하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머;
    (g) 서열번호 155, 156, 159-162, 194 및 195로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis)를 증폭하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머; 및
    (h) 서열번호 157 또는 158로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 클라미디아 (Chlamydia)를 증폭하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  161. 하기 (a) 내지 (e)로 구성된 그룹 중에서 선택되는 검출용 프로브를 사용하여 제160항의 방법에 의해 증폭된 표적 핵산을 검출하는 것을 포함하는 증폭된 표적 핵산 검출 방법:
    (a) 서열번호 73 또는 115로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 장출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)를 검출하기 위한 프로브;
    (b) 서열번호 121로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 비로이드를 검출하기 위한 프로브;
    (c) 서열번호 118로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 클로스트리듐 보톨리늄(Clostridium botulinum)을 검출하기 위한 프로브;
    (d) 서열번호 98로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 유두종(papilloma) 바이러스를 검출하기 위한 프로브; 및
    (e) 서열번호 103으로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 C형 간염 바이러스를 검출하기 위한 프로브.
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